Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk

Lékařská fakulta Masarykovy univerzity v Brně

DISERTAČNÍ PRÁCE

Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk

MUDr. Evžen Trupar

BRNO, září 2009

Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma „Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk“ zpracoval sám s použitím pramenů citovaných v seznamu literatury.

Dále

prohlašuji,

že

mezi

mnou

a

výrobcem

fibrinového

lepidla

TISSUCOL KIT (Baxter AG, Vídeň), ani žádným z jeho dodavatelů není osobní, pracovní či jiný obdobný poměr. V Brně 16.9.2009

Evžen Trupar

1

Poděkování Děkuji všem, kteří mi pomohli tuto práci zrealizovat. Poděkování patří především mému školiteli prof. MUDr. P. Brychtovi, CSc. za námět a odborné vedení po celou dobu postgraduálního studia, jeho rady, připomínky a pomoc s realizací projektu. Dále pak prof. MUDr. D. Horkému, DrSc. a jeho týmu z Ústavu histologie a embryologie LF MU Brno za zpracování a histologické vyšetření bioptických vzorků a pomoc s jejich vyhodnocením. Paní J. Komárkové, laborantce Tkáňové banky FN Brno, která realizovala zpracování kožních vzorků v buněčné laboratoři a svými podněty inicializovala řadu dílčích vylepšení v praktické části projektu. V neposlední řadě také Dr. J. Staňkovi za financování praktické části projektu, MUDr. I. Menšíkovi, Ph.D. za připomínky a rady k vyhotovení disertační práce a své ženě.

2

Obsah ___________________________________________________________________________

Obsah Úvod ........................................................................................................................................... 3 Cíl práce ..................................................................................................................................... 5 1

Kůže – anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu .................................................................. 7 1.1

Kůže ........................................................................................................................... 7

1.1.1

Epidermis ........................................................................................................... 7

1.1.2

Dermis (corium, škára) ....................................................................................... 8

1.1.3

Podkožní vazivo (tela subcutanea, hypoderm, subcutis).................................. 10

1.1.4

Kožní přídatné orgány ...................................................................................... 11

1.2 2

3

4

5

Poruchy kožní pigmentace ............................................................................................... 16 2.1

Hyperpigmentace ..................................................................................................... 16

2.2

Hypopigmentace....................................................................................................... 19

Vitiligo ............................................................................................................................. 23 3.1

Definice, a patofyziologie ........................................................................................ 23

3.2

Klinické typy vitiliga ................................................................................................ 25

3.3

Histologický obraz vitiliga ....................................................................................... 26

3.4

Diferenciální diagnostika vitiliga ............................................................................. 26

3.5

Přehled terapie vitiliga ............................................................................................. 27

3.5.1

Kosmetická kamufláž achromických ploch ..................................................... 28

3.5.2

Depigmentace ................................................................................................... 30

3.5.3

Repigmentace ................................................................................................... 31

Lasery v medicíně ............................................................................................................ 39 4.1

Rozdělení laserů v medicíně .................................................................................... 44

4.2

CO2 laser .................................................................................................................. 45

4.3

Interakce laseru a tkání ............................................................................................. 46

Fibrinové lepidlo TISSUCOL KIT (Baxter AG) ............................................................ 51 5.1

6

Tvorba pigmentu a pigmentace kůže ....................................................................... 11

Kvalitativní a kvantitativní složení fibrinového lepidla ........................................... 52

Experimentální část práce - Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ................................................................................................................................ 54 6.1

Cíl práce ................................................................................................................... 54

6.2

Materiál a metodika .................................................................................................. 54

1

Obsah ___________________________________________________________________________ 6.3

Výsledky................................................................................................................... 62

6.3.1

Hojení odběrové plochy ................................................................................... 63

6.3.2

Hojení transplantované plochy ......................................................................... 64

6.3.3

Repigmentace ošetřených ploch ....................................................................... 68

6.3.4

Fotodokumentace pacientů s repigmentací ošetřených ploch .......................... 72

6.3.5

Mikroskopické vyšetření .................................................................................. 77

6.4

Výsledky dotazníkového šetření .............................................................................. 80

6.4.1

Výsledky dotazníkového šetření část 1.: .......................................................... 80

6.4.2

Výsledky dotazníkového šetření část 2.: .......................................................... 83

7

Diskuse ............................................................................................................................. 87

8

Shrnutí a závěr .................................................................................................................. 89

Souhrn ...................................................................................................................................... 91 Summary .................................................................................................................................. 94 Vysvětlivky zkratek použitých v textu ..................................................................................... 97 Seznam literatury...................................................................................................................... 98 Seznam příloh ......................................................................................................................... 107

2

Úvod ___________________________________________________________________________

Úvod Vitiligo je získané idiopatické onemocnění, které se u postižených osob projevuje tvorbou ostře ohraničených depigmentovaných ložisek na kůži a na slizničních přechodech v důsledku destrukce melanocytů produkujících pigment. Vyskytuje se celosvětově bez ohledu na etnickou příslušnost či pohlaví a může propuknout v jakémkoliv věku. Depigmentovaná (achromická) kožní ložiska pacientů s vitiligem jsou zpravidla přecitlivělá vůči slunečnímu záření, jiné funkční potíže onemocnění nepůsobí a má benigní charakter. Závažnost tohoto onemocnění spočívá především v jeho dopadu psychosociálním. Vitiligo stejně jako další typy leukodermy výrazným způsobem ovlivňuje kvalitu života postižených jedinců. Léze na viditelných místech kůže pacienty stigmatizují a psychicky traumatizují, nejvíce jsou to léze v oblasti obličeje, rukou a genitálu. Pacienti mají narušené interpersonální vztahy v osobním životě i v práci, trpí nízkým sebevědomím a malou sebeúctou (1, 2, 3). Terapeutické pokusy ovlivnit toto onemocnění jsou stejně staré jako zmínky o něm a lze je nalézt již 2200 let před naším letopočtem (4). Přestože se v poslední době stále častěji spekuluje o autoimunitní příčině onemocnění, podstata choroby zůstává nejasná a kauzální terapie není možná. Právě absence kauzální terapie vyústila v řadu terapeutických metod zahrnujících postupy konzervativní i chirurgické. Konzervativní terapie zahrnuje fyzikální fototerapii, lokální i systémové podávání kortikoidů, psoralenů, případně v kombinaci jako fotochemoterapii atd. Chirurgické postupy jsou založeny na obnovení melanocytů v okrscích kůže s chybějícím pigmentem přenosem autologních melanocytů. Přenáší se jednotlivé buňky, nebo tkáně (kůže v plné tloušťce, dermoepidermální štěpy, epidermis). Jednou ze stále málo rozšířených metod k léčbě vitiliga je buněčná terapie autologními nekultivovanými kožními buňkami. Buněčnou terapií se v obecné rovině nazývá postup, jehož cílem je opravit poškozené části těla / tkání zdravými buňkami. Tato léčba vychází z předpokladu, že dojde k plné integraci nově dodaných buněk do poškozené tkáně, včetně obnovení příslušné tkáňové funkce. V poslední době je termín buněčná terapie spojován a zaměňován především s terapií prostřednictvím ještě nediferencovaných, tzv. kmenových buněk – terapií kmenovými buňkami.

Kmenové

buňky

se

vyskytují

u

mnohobuněčných

organismů

a

jsou

charakterizovány 2 vlastnostmi: 1 - schopností sebereplikace mitotickým dělením beze změny svých vlastností a 2 - trvalou nebo dlouhodobou kapacitou diferencovat se do různých buněčných typů daného organismu (5, 6). Terapie kmenovými buňkami je úspěšně používána

3

Úvod ___________________________________________________________________________ řadu let k obnově imunitního systému pacientů po chemoterapii a je založena právě na jejich schopnosti diferenciace v cílový buněčný typ a tkáň. Pojem buněčná terapie zahrnuje rovněž terapii progenitorovými buňkami, které jsou schopné diferencovat se pouze v určité typy buněk, nebo terapii již plně diferencovanými buňkami (7). Každá buněčná terapie musí řešit minimálně 3 základní problémy spojené s touto specifickou technikou léčby: 1. zdroj buněk 2. média umožňující přechovávání, kultivaci a event. diferenciaci odebraných buněk 3. techniku implantace buněk do cílové tkáně Předmětem této práce je využití buněčné terapie k léčbě vitiliga. K buněčné terapii byly použity nekultivované autologní diferencované buňky – melanocyty. Zdrojem buněk byl autologní dermoepidermální štěp a implantace buněk byla realizována jejich kontaktem s obnaženou dermis v místě, kde mělo dojít k jejich integraci do tkáně.

4

Cíl práce ___________________________________________________________________________

Cíl práce Léčba vitiliga transplantací autologních melanocytů do depigmentovaných kožních ložisek se v různých podobách zkouší od roku 1987, kdy Lerner a spolupracovníci nakultivovali autologní melanocyty a injikovali je zpět do kůže pacientovi postiženému piebaldismem. Melanocyty se začlenily do bazální vrstvy kůže a začaly plnit svou funkci, což se projevilo obnovením kožního pigmentu (8). Tato forma buněčné terapie pak byla v různých modifikacích zkoušena a publikována řadou dalších autorů. Společným pojítkem všech prací na toto téma je přenos autologních melanocytů kultivovaných či nekultivovaných do achromických kožních ložisek (9). Tato léčba je v České republice, ale i v zahraničí, málo rozšířená. V České republice se touto terapií zabýval tým lékařů v rámci grantového úkolu č. 4741-3 Kožní kliniky FN Brno v letech 1998-2000 „Léčba vitiliga u dospělých osob transplantací autologních melanocytů“. Terapie byla prováděna dvěma způsoby: 1. implantací kultivovaných autologních melanocytů do kůže zařízením Dermojet a 2. aplikací roztoku s autologními melanocyty na achromickou kožní plochu připravenou k přijetí buněk dermabrazí epidermis. Obnažení dermis bylo prováděno vysokoobrátkovou frézou až po dermoepidermální junkční zónu (10, 11). Méně nákladnou alternativou je přenos autologních nekultivovaných melanocytů nebo směsi autologních kožních buněk do depigmentovaného kožního ložiska. Hlavním problémem při volné aplikaci roztoku buněk na dermabradovanou kožní plochu je udržení přenesených buněk v místě aplikace tak, aby se neztrácely v obvazovém materiálu před jejich integrací do kůže. Jednou z možností jak řešit tento problém je použití vhodného buněčného nosiče, který by zabránil úniku buněk mimo léčenou plochu a současně nebránil jejich průniku do tkáně. Hlavním cílem této práce bylo ověřit možnost použití autologních kožních buněk k léčbě vitiliga modifikovaným postupem s využitím CO2 laseru k ablaci epidermis v léčené oblasti a fibrinového lepidla Tissucol coby buněčného nosiče pro melanocyty. Dalším cílem pak bylo vyhodnotit úspěšnost léčby a stálost pigmentací s delším časovým odstupem v

případě

repigmentace.

Vzorem

k provedení

práce

byl

postup

publikovaný

Nanny van Geelovou a spolupracovníky použitý na 4 pacientech. K léčbě použili směs nekultivovaných autologních melanocytů a keratinocytů obohacenou o hyaluronovou kyselinu za účelem zvýšení viskozity roztoku a k dermabrazi v příjmové oblasti použili CO2 laser.

5

Cíl práce ___________________________________________________________________________ Výsledkem léčby byla 85-100 % pigmentace ošetřených ložisek u všech pacientů ve sledovaném období do 5 měsíců od zákroku (12). V teoretické části práce je stručně zrekapitulována fyziologie a anatomie kůže, tvorba kožního pigmentu, princip fungování laseru a jeho použití k ablaci epidermis a specifikace fibrinového lepidla Tissucol. S ohledem na zaměření práce je dále uveden stručný výčet nejčastějších poruch pigmentace kůže, podrobněji je popsáno vitiligo včetně současných možností léčby. V experimentální části práce jsou popsány materiál a metodika, operace, dosažené výsledky, diskuse a závěr.

6

Kůže – anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu ___________________________________________________________________________

1 Kůže – anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu 1.1 Kůže Kůže je zevní kryt lidského organismu a tvoří tak bariéru mezi zevním a vnitřním prostředím. Je to největší orgán těla, u dospělého člověka má plochu 1,6 -1,8 m2 a představuje asi 7 % z celkové tělesné hmotnosti (13). Zabraňuje poškození organismu mechanickými či chemickými vlivy, brání ztrátám tekutin, mikrobiální invazi, reguluje tělesnou teplotu a je zapojena

do

metabolických

a

imunitních

procesů

organismu.

Prostřednictvím

specializovaných buněk umožňuje vnímání teploty, doteku a bolesti. Z anatomického hlediska je kůže definována dvěma vrstvami, jsou to: epidermis (pokožka) a dermis (škára). S podkladem je kůže spojena podkožním vazivem (hypodermis, subcutis), některými autory přiřazovaným ke kůži, se kterou tvoří funkční celek. Součástí kůže jsou i mazové a potní žlázy, nehty a vlasy, tzv. kožní adnexa. 1.1.1

Epidermis Epidermis tvoří vícevrstevný dlaždicový rohovatějící epitel, nalézá se na povrchu kůže

a histologicky lze rozlišit 5 vrstev. Od dermis směrem k povrchu následují v pořadí: stratum basale, spinosum, granulosum, lucidum a corneum. Základními buňkami epidermis jsou buňky ektodermálního původu tzv. keratinocyty. V oblasti stratum basale a stratum spinosum vykazují keratinocyty vysokou mitotickou aktivitu. Pro svou proliferační aktivitu jsou tyto vrstvy označovány jako stratum germinativum (Malpighi). S pomocí cytoskeletu se keratinocyty posouvají během zrání směrem k povrchovějším vrstvám epidermis a nahrazují odloupané zrohovatělé keratinocyty (14). Stratum granulosum tvoří 3-5 vrstev buněk s centrálně uloženým jádrem, je to poslední vrstva keratinocytů, ve které ještě obsahují jádro. Buňky v této vrstvě obsahují granula keratohyalinu, jádro a organely jsou narušeny činností lyzosomů, až v buňkách zůstanou

kromě keratohyalinových granul jen svazky

keratinizovaných tonofilament. Stratum lucidum je tvořeno již odumřelými buňkami bez jader, zato bohatými na četná vlákna keratinu a tzv. eleidin – produkt transformace keratohyalinu. Stratum lucidum je identifikovatelné jen v pokožce chodidel a dlaní jako úzký eozinofilní proužek. Nejpovrchnější vrstvou je stratum corneum, tvoří ji mnoho vrstev pevně spojených, keratinizovaných, zcela zploštělých buněk. V nejpovrchnějších vrstvách se vytrácí

7

Kůže – anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu ___________________________________________________________________________ mezibuněčná spojení a keratinizované buňky se odlupují ve skupinách. Celý proces diferenciace od stratum bazale až po stratum corneum trvá 15 - 30 dní. Tloušťka pokožky na těle se pohybuje od 75 - 800 µm, přičemž nejsilnější je na chodidlech a dlaních. Mezi buňkami epidermis v germinativní vrstvě se nachází kromě keratinocytů i další typy buněk (15). Melanocyty – původem se řadí mezi buňky z neuroektodermu, produkují pigment melanin a do epidermis migrují během 2. měsíce embryonálního vývoje. Za fyziologických poměrů jsou přítomny ve stratum bazale a spinosum v počtu 1000-2000 na 1 mm2 kůže, tedy přibližně v poměru 1 melanocyt na 5-12 keratinocytů (16, 17). Hustota epidermálních melanocytů je různá na různých částech těla. V oblasti hlavy a předloktí je hustota přibližně 2000

melanocytů

na

mm2,

zatímco

na

zbytku

těla

je

hustota

přibližně

1000 melanocytů na mm2 (18). Langerhansovy buňky mají světlou cytoplasmu a nepravidelné laločnaté jádro, tvoří jen minimální subpopulaci buněk epidermis, derivují z mezenchymu kostní dřeně a účastní se imunitních reakcí kůže. Nachází se hlavně ve stratum spinosum, jejich nejdůležitější schopností je fagocytóza a schopnost předkládat antigeny a následně je transportovat do lymfatických uzlin. Hrají tak důležitou úlohu specifické T-buněčné odpovědi na antigen a jsou zodpovědné za kožní kontaktní hypersenzitivní reakce (např. kontaktní alergická dermatitis) (19). Merkelovy buňky jsou lokalizované výhradně ve stratum basale s dlouho nejasným původem. Mají světlou cytoplazmu a četné tmavé váčky, v nichž byla prokázána řada neuropeptidů. U člověka se nacházejí především ve hmatových lištách a jsou synapticky spojeny s terminálami senzitivních nervů. Nejnovější práce ukazují, že se jedná o deriváty neurální lišty a jsou považovány za sekundární smyslové buňky, slouží pravděpodobně jako mechanoreceptory. V kůži se vyskytují také neinervované buňky, které jsou podobné Merkelovým buňkám a pravděpodobně patří k difusnímu neuroendokrinnímu systému (20). Epidermis a dermis spojuje bazální membrána. Jedná se o acelulární strukturu tvořenou ze dvou vrstev: lamina basalis a lamina reticularis, přičemž laminu bazalis vytváří keratinocyty a laminu reticularis vytváří buňky pojiva. 1.1.2

Dermis (corium, škára) Dermis se skládá ze dvou vrstev: stratum papillare a reticulare. Podobně jako

epidermis kolísá její tloušťka na různých místech těla od 0,1 mm do 4 mm. Zatímco 8

Kůže – anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu ___________________________________________________________________________ od pokožky je dermis ostře oddělena bazální membránou, hranice s podkožním vazivem je neostrá. Stratum papillare tvoří výběžky (papilly), které vybíhají proti epidermis, a tím je hranice mezi oběma vrstvami nepravidelně zvlněná. Hustota, tvar a výška papil koria se na různých místech těla liší a souvisí s tloušťkou pokožky. Vyšší a štíhlejší papily jsou typické pro tlustou kůži, nízké a široké papily nalézáme v kůži tenké. Vlákna kolagenu III a elastinu tvoří prostorově neuspořádanou řídkou síť a do povrchních vrstev zasahují kolmo k povrchu kůže kotvící fibrily bazální membrány, které tak pevně pojí epidermis s dermis. Vazivo papil je bohatě vaskularizované, jemné kapilární kličky se dostávají k linii kontaktu epidermis-dermis a zajišťují tak výživu avaskulární epidermis a podílí se významně na termoregulaci těla. V jednotlivých papilách rovněž začínají lymfatické kapiláry, mechanoreceptory Meissnerova tělíska, Vaterova-Paciniho tělíska a tělíska Krauseho. V oblasti dlaňové strany ruky a na plantární straně nohy vybíhá stratum papillare oproti pokožce ve formě vazivových hran, které se označují jako koriové lišty. Každá z těchto koriových lišt nese dvojici menších koriových papil. Mezi tyto papily vklesává epidermis v podobě hřebenového vyklenutí, zvaného crista intermedia a do těchto do koria prominujících hřebenů vyúsťují vývody malých potních žláz.

Těmto koriovým lištám

na povrchu pokožky odpovídají hmatové lišty (cristae cutis), které jsou vzájemně odděleny rýhami (sulci cutis) a tvoří u každého jedince originální, v průběhu života neměnný reliéf, tzv. papilární linie – dermatoglyfy (15). Stratum reticulare pozvolna navazuje na stratum papillare a je vždy silnější než stratum papillare. Jedná se o kolagenní vazivo tvořené vlákny kolagenu I, III, V a elastinu, tvořící prostorovou síť připomínající proutěný koš. Amorfní složku v koriovém vazivu zastupuje zejména dermatan sulfát. Cévní zásobení je menší než v papilární dermis a v hlubších vrstvách přibývají adipocyty. V retikulární dermis jsou na některých místech těla přítomny i buňky hladké svaloviny, které kůží pohybují a mění její napětí či zvrásnění (např. scrotum, labia major, areola mammae) a další svalová vlákna vázaná na chlupové folikly (mm.arrectores)

působící

erekci

chlupů.

Další

složkou

retikulární

dermis

jsou

mechanoreceptory – Paciniho tělíska reagující na vibrace a tlak a Ruffiniho tělíska reagující na tah. Do škáry, zejména do stratum reticulare, jsou zasazeny přídatné kožní ústroje – vlasové folikuly, potní a mazové žlázy (21). Veškeré rezidentní buňky dermis jsou mezodermálního původu, vyjímku tvoří nervové buňky.

9

Kůže – anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu ___________________________________________________________________________ Fibroblasty - jsou dominantní buněčnou populací dermis a největší hustoty dosahují v papilární dermis. Mají převážně vřetenovitý tvar a syntetizují velké množství kvantitativně a kvalitativně odlišných proteinů, které do značné míry ovlivňují mechanické vlastnosti kůže. Jejich schopnost produkce a přestavby kolagenu je klíčová v procesu hojení kůže. Makrofágy – mononukleární fagocyty, efektorové buňky humorální imunity, jedná se o buňky předkládající antigeny, patřící mezi buňky s expresí antigenů II. třídy hlavního histokompatibilního komplexu (MHC-II) (21). T-lymfocyty – buňky imunitního systému, pravidelně bývají nalézány v blízkosti kožních přídatných orgánů a postkapilárních venul. Mastocyty – deriváty buněk kostní dřeně, jsou přítomny ve všech vrstvách dermis s maximem v blízkosti kožních adnex a v papilární dermis. Produkují řadu enzymů a chemotaktických mediátorů jako např. histamin, prostaglandiny, eozinofilní chemotaktický faktor, heparin, thromboxany atd., jsou součástí imunitního systému a zahajují anafylaktickou reakci (22). Dermální dendritické buňky – jejich funkce není spolehlivě objasněna, pravděpodobně se jedná o součást imunitního systému kůže, nejčastěji je nalézáme perivaskulárně (23). Pericyty – buňky s dlouhými cytoplazmatickými výběžky obklopují endoteliální buňky krevních kapilár, v cytoplazmě obsahují aktin, myosin a tropomyosin. Pravděpodobně jsou schopny kontrakce.

1.1.3

Podkožní vazivo (tela subcutanea, hypoderm, subcutis) Podkožní vazivo spojuje kůži s podkladem, kterým je dle lokalizace na těle buď svalová

fascie, periost nebo perichondrium. Hustota podkožního vaziva a jeho složení z kolagenu a adipocytů se liší v různých lokalitách na těle a ovlivňuje především kožní pohyblivost vůči spodině. Kůže je tak zvýšeně pohyblivá v místech s řídkým kolagenním vazivem v podkoží (víčka, penis) a méně pohyblivá až nepohyblivá v místech s podkožím z hustého kolagenního vaziva (nos, ušní boltce, labium minus). V síti kolagenního vaziva subcutis jsou rozloženy adipocyty, jejich množství je regionálně rozdílné a závisí na stavu výživy a pohlaví. Souvislé tukové polštáře podkoží se označují jako panniculus adiposus a mohou tvořit až několikacentimetrovou vrstvu. Slouží jako zásobárna energie a mají rovněž tepelně izolační funkci. Strana podkožního vaziva přivrácená k podkladu bývá zpravidla zahuštěna v souvislou vrstvu označovanou jako fascia superficialis (15).

10

Kůže – anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu ___________________________________________________________________________ 1.1.4

Kožní přídatné orgány Kožní přídatné orgány (kožní adnexa) tvoří nedílnou součást kůže, vesměs derivují

z epidermis a patří mezi ně ústroje rohového typu (vlasy, chlupy a nehty) a kožní žlázy (apokrinní, ekrinní, mazové žlázy a žláza mléčná). Jejich struktura a funkce s ohledem na zaměření práce nebude blíže popsána.

1.2 Tvorba pigmentu a pigmentace kůže Barva kůže je pro svou viditelnost jedním z nejdůležitějších znaků, který hodnotíme při posuzování vzhledu, zdraví a krásy člověka. Zahrnuje široké spektrum barevných odstínů od téměř bílé po tmavě hnědou a koreluje s klimatem, kontinenty a genetickými předpoklady v rámci lidské rasy. Výsledná barva kůže je dána kombinací pigmentů hemoglobinu, karotenu, melaninu a funkčním stavem organismu. Hemoglobin coby červené krevní barvivo nepatří mezi kožní pigmenty, ale ovlivňuje barvu kůže v závislosti na funkčním stavu krevních kapilár koria, v některých oblastech pak ovlivňuje barvu dominantně – červeň rtů. Dále může hemoglobin ovlivňovat zbarvení kůže nepřímo přes produkty svého odbourávání – hemosiderin a bilirubin. Karoten je zodpovědný za žlutou až oranžovou barvu a barevný tón kůže ovlivňuje pouze při excessivním příjmu v potravě. Nejdůležitějším mezi pigmenty, které se na výsledné barvě kůže podílejí, je melanin. Kožní pigment melanin hraje důležitou roli v ochraně kůže před škodlivými vlivy ultrafialového záření (dále jen UV záření). Dokáže UV záření absorbovat, pohlcovat volné chemické radikály produkované v cytoplasmě, chránit před různými typy ionizujícího záření. Melanin je syntetizován specializovanými buňkami epidermálními melanocyty a melanocyty vlasového folikulu. Epidermální a folikulární melanocyty tvoří dohromady asi 5 % z celkového počtu buněk v epidermis. Vývojově pocházejí z neurálních lišt, odkud proliferují jako melanoblasty a následně se diferencují v definitivní melanocyty (24). Výchozí látkou k syntéze kožního pigmentu melaninu je aminokyselina tyrosin (p-hydroxyfenylalanin) (25). Ta je metabolizována u lidí ve dva konečné produkty eumelanin (tmavohnědý a černý pigment) a feomelanin (světlý žlutočervený pigment) pomocí enzymu tyrosinázy. Tyto pigmenty jsou pak největší měrou zodpovědné za různou barvu kůže (černá, hnědá, žlutá).

11

Kůže – anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu ___________________________________________________________________________

Obr. 1 – syntéza kožního barviva – převzato a upraveno z knihy: MURRAY, R.K.; GRANNER, D.K.; MAYES, P.A.; et al., Harperova Biochemie, Nakladatelství a vydavatelství H&H 2002, ISBN 80-7319-013-3

Aby mohla syntéza pigmentu probíhat, musí být k dispozici tyrosin a musí být přítomen fenoloxidázový enzymový komplex, jehož syntézu obstarávají ribosomy drsného endoplazmatického retikula. Vytvořený pigment je z buněk vylučován formou granul, tzv. melanosomů, které vznikají odštěpováním z Golgiho aparátu. Melanosomy mají velikost 12

Kůže – anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu ___________________________________________________________________________ 200 x 900 nm a maturují přes několik morfologicky odlišitelných stádií. Dá se rozlišit stádium I (nepigmentované), stádium II (pruhované, elipsového tvaru, s přítomností uspořádaných fibril), stádium III (s depozity elektron densního materiálu), až stádium IV (bohaté na výsledný melanin). Melanosomy s hotovým pigmentem putují v melanocytech z buněčného těla do jejich výběžků. Transport melanosomů je zajišťován mikrotubuly cytoskeletu a dochází tak k nahromadění maturovaných melanosomů v hrotech výběžků. Vlastní přesun pigmentu z melanocytů do keratinocytů připomíná injekci, hovoříme o tzv. cytokrinní sekreci. Předpokládají se 4 mechanismy tohoto děje – viz obr. 2 (26, 27).

Obr. 2 - přesun melaninu do keratinocytů, převzato a upraveno z článku: LAM DO PHUONG UYEN; DUNG HOANG NGUYEN; EUN-KI KIM. Mechanism of Skin Pigmentation. Biotechnology and Bioprocess Engineering 2008, 13: 383-395

Mechanismus 1 – předpokládá, že hrot výběžku melanocytu je fagocytován keratinocytem. Mechanismus 2 – regulovaná exocytosa – membrána melanosomu fúzuje s plazmatickou membránou melanocytu a uvolní melanin do intercellulárního prostoru odkud je fagocytován keratinocytem. Mechanismus 3 – předpokládá přítomnost analogického tzv. „SNARE proteinu“ na povrchu melanocytu a keratinocytu. SNARE protein iniciuje přímou fúzi obou zevních membrán, vznikne tak kanál, kterým se dostanou melanosomy z melanocytu do keratinocytu. Mechanismus 4 – transport melanosomů do keratinocytů formou membránových vezikul.

13

Kůže – anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu ___________________________________________________________________________ Každý melanocyt je napojený přibližně na 30-40 okolních keratinocytů svými dendritickými výběžky. Celé takovéto uspořádání melanocytu a okolních keratinocytů se nazývá epidermální melaninová jednotka – viz obr. 3 (28).

Obr. 3 – epidermální melaninová jednotka, převzato a upraveno z článku: LAM DO PHUONG UYEN; DUNG HOANG NGUYEN; EUN-KI KIM. Mechanism of Skin Pigmentation. Biotechnology and Bioprocess Engineering 2008, 13: 383-395

V keratinocytech jsou melaninová zrna intracelulárně uložena ve formě pigmentových čepiček vždy mezi jádrem a stranou orientovanou ke kožnímu povrchu. Tímto způsobem je pigment melanin uložen v bazální vrstvě epidermis a chrání její germinativní vrstvy před UV zářením (24). Vlastní barvu kůže určuje hlavně melanogenní aktivita melanocytů, kvantita a druh produkovaných pigmentů, ale ne hustota melanocytů (29). Obecně množství melaninu v kůži je závislé na dědičných faktorech a na velikosti expozice UV záření. U ras s více pigmentovanou pokožkou je produkce melaninu větší, melanin nalézáme i v keratinocytech ve stratum spinosum a zbytky melaninu lze zastihnout i v odlupujících se šupinkách rohové vrstvy. Opotřebené melanocyty se postupně dostávají k povrchu epidermis a odlupují se

14

Kůže – anatomie, fyziologie, tvorba pigmentu ___________________________________________________________________________ společně s buňkami rohové vrstvy. Počet melanocytů je udržován jejich množením v aktivní fázi melanogeneze, je stejný u všech ras a obou pohlaví. Aktivita melanocytů, včetně specifických charakteristik melanosomů (velikost, tvar, typ a barva), aktivita enzymů podílejících se na syntéze melaninu a transfer pigmentu do keratinocytů – to vše je ovlivněno řadou faktorů. Faktory ovlivňující pigmentaci kůže lze rozdělit do 3 skupin: 1 – ultrafialové záření, 2 – léky, 3 – genetické faktory α-MSH (α-melanocyty stimulující hormon), ASP (agouti signální protein), β-FGF (Fibroblastový růstový faktor), ET-1 (endothelin-1) Na výsledném ztmavnutí epidermis vyvolaném UV zářením (opálení) se podílí: migrace melanocytů do povrchnějších vrstev, urychlení syntézy a předávání melaninu keratinocytům a tmavnutí melaninu, který je již v keratinocytech uložen (15, 30). Pigmentace způsobené UV zářením se dělí na okamžité ztmavnutí (IPD – immediate pigment darkening) a pozdní (DPD – delayed pigment darkening). Okamžité lze pozorovat během sekund po expozici UVA záření (vlnová délka 320-340 nm) a typicky mizí během 1-3 dní, je důsledkem oxidace v kůži již dříve vzniklého a dále existujícího melaninu. Pozdní ztmavnutí se objevuje za 2-3 dny po expozici UVB záření. Barva kůže se během života mění, je ovlivněna hustotou melanocytů, počtem, velikostí a rozptýlením melanosomů transportovaných do keratinocytů (31). Neméně důležitý je také poměr a množství jednotlivých typů melaninu v melanosomech. Takřka všichni novorozenci, včetně dětí u tmavých ras jsou po narození světlejší a kůže jim tmavne během prvního týdne života. Naproti tomu lze pozorovat redukci hustoty melanocytů v místech kožního povrchu chráněných před sluncem přibližně o 8-10 % každou dekádu života, kromě kůže genitálu (32).

15

Poruchy kožní pigmentace ___________________________________________________________________________

2 Poruchy kožní pigmentace Poruchy kožní pigmentace lze rozdělit do dvou skupin – na nadměrné pigmentace (hyperpigmentace) a na nedostatečné pigmentace (hypopigmentace). Obě skupiny zahrnují řadu chorob a posttraumatické stavy. Začlenění onemocnění projevujících se poruchou pigmentace do těchto dvou skupin je problematické, jelikož některá onemocnění se mohou projevit oběma formami v závislosti na typu kůže, expozici UV záření a dalších faktorech. Například po mechanickém povrchním poranění kůže či po popálení může dojít jak k hyper, tak k hypopigmentaci. Proto se tyto poruchy kožní pigmentace následkem termického traumatu někdy označují jako tzv. dyspigmentace po popálení. Tvář a další viditelná místa kožního povrchu znetvořená poruchou pigmentu mohou výrazně ovlivnit psychiku pacienta. Mají vliv na jeho sociální život, snižují výkonnost v práci či ve škole a snižují sebeúctu postižených (3).

2.1 Hyperpigmentace Poruchy kožní pigmentace ve smyslu zvýšené pigmentace se projevují v různých formách a jsou v populaci poměrně časté. Nejčastější hyperpigmentace v populaci jsou melasma, lentigo soláris / senilis a pozánětlivé hyperpigmentace. Za hyperpigmentaci jsou zodpovědné odlišné mechanismy, které se mohou projevit v úrovni epidermis, dermis nebo v obou. Hyperpigmentace vznikne buď jako důsledek zvýšení množství melaninu – tzv.

melanotická hyperpigmentace (zvýšená tvorba melaninu při normálním počtu

melanocytů). Nebo proliferací aktivních melanocytů – melanocytotická hyperpigmentace – (zvýšený počet melanocytů). Dalším mechanismem vzniku hyperpigmentace je přesun melaninu nebo v některých případech i melanocytů do dermis. Poslední možností je kombinace obou možností – tzv. smíšená pigmentace viz obr. 4. Většina hyperpigmentací patří do skupiny melanotických (33).

16

Poruchy kožní pigmentace ___________________________________________________________________________

Obr. 4 – histologický nález u různých forem hyperpigmentací, převzato a upraveno z článku: CAYCE, K.A.; MCMICHAEL, A.J.; FELDMAN, S.R. Hyperpigmentation: An Overview Of the Common Afflictions. Dermatology Nursing. 16(5):401-406, 413-416, October 2004

Melasma, Chloasma Jsou to získané pigmentované makuly lokalizované zpravidla symetricky v obličeji na čele, tváři, nad horním rtem a na nose. Mimo kosmetického defektu, nepůsobí žádné potíže. Mezi vyvolávající příčiny patří těhotenství (Chloasma uterinum), zvýšená hladina estrogenu a progesteronu např. při užívání hormonálních kontraceptiv, hepatální dysfunkce. Pigmentace jsou zesilovány slunečním zářením. Histologicky nacházíme hyperpigmentovanou bazální vrstvu epidermis s normálním nebo jen mírně zvýšeným počtem melanocytů. Různé množství pigmentu bývá přítomno i v papilární dermis (volný melanin, roztroušené melanofágy). U těhotných dochází vlivem hormonálních změn i k dalším změnám pigmentace - ztmavnutí pih, bradavek, rodidel, perianální oblasti a výskytu tzv. linea nigra – lineární, cca 1 cm široké pigmentace na ose symfýza – umbilikus - sternum. Lentigo solaris (lentigo senilis, jaterní skvrna) Pojem lentigo (lentigines) zahrnuje řadu podobných hyperpigmentových lézí jako lentigo simplex, nevus spilus a lentigo solaris. Jedná se o světle hnědé makuly velikosti několika

17

Poruchy kožní pigmentace ___________________________________________________________________________ milimetrů až centimetrů čtverečních, oválného i nepravidelného tvaru především u starších osob, často v kombinaci s dalšími známkami chronického poškození kůže UV-zářením. Příčinou je zvýšené množství melanocytů. U solárního lentiga je příčina ve zvýšené produkci melaninu. Pigmentace se vyskytují v lokalitách exponovaných slunci (obličej, ruce) a perzistují i pokud se zamezí dalšímu působení UV-záření, afekce jsou benigní. Pozánětlivá hyperpigmentace Získaná porucha pigmentace, která se projevuje tmavými makulami a skvrnami na kůži v místech předchozího zánětu kůže. Vytvoření pigmentace předchází alterace kůže mechanickým či termickým poraněním, alergickou reakcí, primárním zánětem kůže či iatrogenním zásahem. Jedná se o jednu z nejčastějších hyperpigmentací, může vzniknout u všech typů kůže, nejčastěji však u tmavších fototypů. K vytvoření pigmentací mohou vést záněty kůže vyvolané jak endogenně, tak exogenně, predominantně se tyto hyperpigmentace tvoří

u

pacientů

s atopickou

dermatitidou,

s

alergickou

kontaktní

dermatitidou,

s lupus erythematosus, s lichen planus, atd. (34). Jedná se o hyperpigmentace ze zvýšené melanogeneze spolu s akumulací melanofágů v horní části dermis – pozůstatek po destrukci bazální vrstvy v pozánětlivém terénu (35). Cafe-au-lait Název je odvozen od vzhledu makul světle hnědé barvy (francouzsky - káva s mlékem). Na kůži jsou patrny už od narození, nebo v časném dětství, obvykle do 2 let věku. Bývají přítomny až u 95 % pacientů s neurofibromatózou typu I, ale jsou přítomny i u pacientů bez neurofibromatózy (36). Pihy (ephelides) Klinicky se projevují jako malé hnědé makuly většinou menší než 5 mm s lokalizací v obličeji a na ramenou, častější výskyt je u světlovlasých a rusovlasých osob. Nejsou na kůži přítomny od narození, objevují se v prvních letech života, jejich množství a vzhled ovlivňuje expozice slunečnímu UV záření po níž tmavnou. V histologickém obraze je patrná hyperpigmentace bazální vrstvy epidermis při normálním počtu melanocytů.

18

Poruchy kožní pigmentace ___________________________________________________________________________ Hyperpigmentace vyvolané léky Tento typ hyperpigmentací není nijak výjimečný. Podílí se na všech poruchách pigmentace 10-20 %. Pigmentace mohou být způsobeny užíváním celé řady léků, nejčastěji vznikají při užívání amiodaronu, nesteroidních antiflogistik, antimalarik, antipsychotik, tetracyklinu, bleomycinu a těžkých kovů (37). Léky indukované pigmentace kůže mohou být výsledkem zvýšené syntézy melaninu, lipofuscinu, nebo depozit látek z léku v kůži (např. těžké kovy). Hyperpigmentace u systémových chorob Hyperpigmentace kůže mohou být součástí symptomů některých chorob, typické jsou například u syndromu gastrointestinální polypózy a Adissonovy choroby. Xeroderma Pigmentosum Jedná se o heterogenní skupinu autosomálně recesivních onemocnění charakterizovanou přecitlivělostí na UV záření, jejímž následkem je vznik kožních nádorů. Onemocnění se projevuje asi v polovině případů již od 18. měsíce věku tvorbou hyperpigmentových makulózních skvrn na částech těla exponovaných slunečním UV záření. Postupně vznikají hyperkeratózy, keratomy, fibromy a další benigní afekce s rozvojem kožní atrofie a následným vznikem hypopigmentovaných skvrn a mnohočetných kožních malignit

(mnohočetné spinocelulární a basocelulární karcinomy, a maligní melanom) (38). Incontinentia pigmenti (Bloch-Sulzberger syndrom) Jedná se o raritní dědičné onemocnění vázané na X chromozom, postihuje převážně ženy. Je charakterizováno ztrátou melaninu v epidermis a jeho kumulací v dermis (39).

2.2 Hypopigmentace Hypopigmentace je způsobena snížením počtu až vymizením melanocytů, nebo redukcí syntézy melaninu. V následujícím textu jsou stručně charakterizovány nejčastější typy leukodermu, podrobněji je s ohledem na zaměření práce specifikováno vitiligo. Albinismus

19

Poruchy kožní pigmentace ___________________________________________________________________________ Název je odvozen z latinského albus – bílý. Jedná se o kongenitální (autosomálně recesivní) deficit pigmentu melaninu v očích, kůži a ve vlasech. Postižení jedinci mají bílou až průsvitně vypadající kůži a trpí poruchami zraku (snížená zraková ostrost, nystagmus, myopie, astigmatismus, strabismus). Patofyziologicky jde o biochemickou poruchu syntézy melaninu způsobenou absencí fenoloxidázového komplexu, nebo neschopnost melanocytů střádat tyrosin. Klinicky rozlišujeme několik variant – parciální (hypomelanosa, částečný albinismus), nebo totální (amelanosa, úplný albinismus). Hovoříme také o okulárním (postiženy pouze oči), nebo okulokutánním albinismu (postižení očí i kůže). Dříve se albinismus klasifikoval na tyrosinaza pozitivní a negativní formu dle přítomnosti enzymu tyrozinázy, který hraje klíčovou roli v syntéze melaninu. Tato klasifikace je však z dnešního pohledu obsolentní, protože melanocyty nejsou schopny produkovat melanin i z řady jiných příčin (32). Piebaldismus Lokalizovaná forma albinismu, označovaná jako tzv. částečný albinismus. Jedná se autosomálně dominantní onemocnění. Nejčastěji se projevuje tvorbou bílých lézí uprostřed, nebo po stranách čela s ohraničeným depigmentovaným pramenem vlasů, ale léze se mohou tvořit i jinde na těle. Typická je přítomnost léze ve stejné lokalizaci během celého života, někdy i u ostatních členů rodiny (41). Poliosis (trichopoliosis) Získaná, ložisková ztráta vlasového pigmentu. Tato ohraničená ložiska bílých vlasů mohou vzniknout současně s jiným onemocněním, nalézáme je např. u vitiliga, ložiskové alopecie, nebo po zánětlivých procesech. Ztráta pigmentu může být trvalá nebo dočasná (např. po ložiskové alopecii). Mimo kosmetického defektu nečiní potíže (42). Hypomelanosis guttata Idiopatický benigní typ leukodermu s tvorbou ostře ohraničených, depigmentovaných makul velikosti kolem 5 mm v místech vystavených slunečnímu záření. Histologicky nalézáme snížené množství melanocytů i pigmentu. V patogenezi onemocnění hraje pravděpodobně klíčovou roli expozice UV záření (43).

20

Poruchy kožní pigmentace ___________________________________________________________________________ Pityriasis alba Dermatitida s projevy hypopigmentací kůže na horní části trupu s nejasnou etiologií, někdy spojovaná s přítomností atopické dermatitidy. Nejčastěji vzniká u dětí ve věku 3-16 let a většinou spontánně vymizí v dospělosti. Histologický nález

je nekonstantní - mírná

hyperkeratóza, s normálním nebo sníženým počtem melanocytů. Jedná se o redukci množství a velikosti melanosomů bez přerušení jejich transportu do keratinocytů (44). Makuly se často vyskytují i ve tváři, velikost lézí je přibližně 1-4 cm v průměru, barva makul je bílá až narůžovělá (45). Postinflamační leukoderma Depigmentovaná ložiska na kůži u pacientů s anamnézou prodělané dermatózy, nebo termického poranění (například po laserovém resurfacingu CO2 laserem). Lichen sclerosus et atrophicus Jedná se o chronickou dermatitidu, která se projevuje drobnými bílými plaky s epidermální atrofií, plaky spolu mohou postupně splývat. Zánět spolu s alterovanými fibroblasty v papilární dermis vede postupně k fibróze. Postihuje nejčastěji kůži genitálu, ale může se vyskytnout i jinde na těle, vyskytuje se u obou pohlaví, častěji u žen. Etiologie je neznámá, spekuluje se o genetické predispozici, infekci a autoimunitním postižení. Synonymem v případě postižení genitálu u mužů je balanitis xerotica obliterans, u žen craurosis vulvae, ložiska mohou přejít do spinocelulárního karcinomu, proto u postižených je nutná pravidelná observace a biopsie (46, 47). Achromický névus (naevus achromicus) Dobře ohraničené depigmentované ložisko, stabilní bez známek progrese, přítomné od narození s normálním nebo sníženým počtem melanocytů (48). Tinea versicolor (pityriasis versicolor) Jedná se o benigní kožní léze projevující se jako hypopigmentované nebo hyperpigmentované oválné makuly hrudníku a zad velikosti 0,5-2,5 cm. Původcem je mykotická infekce Malassezia furfur (synonyma: Pityrosporum ovale, Pityrosporum orbiculare) ve stratum corneum.

Malassezia

furfur

je

normálně

přítomna

na

kožním

povrchu

u 90-100 % dospělých. U pacientů s klinickými projevy lze zastihnout stádium hyfů i spór.

21

Poruchy kožní pigmentace ___________________________________________________________________________ Přechod ze saprofytismu do parazitismu iniciuje pravděpodobně imunosuprese, malnutrice, genetická predispozice a další faktory postižených, přesná příčina však není známá a větší část pacientů s klinickými projevy nemá imunologické postižení. Klinické projevy typu tvorby hypopigmentovaných makul jsou způsobeny inhibitory tyrosinasy, které kompetitivně inhibují enzymy melanocytů zodpovědné za tvorbu pigmentu. V případě hyperpigmentací indukují organismy zvětšování melanosomů produkovaných melanocyty v bazální vrstvě epidermis (49). U lidí se světlou kůží mají skvrny světle hnědou barvu, u lidí s tmavší barvou kůže jsou skvrny naopak světlejší než je barva kůže (50).

22

Vitiligo ___________________________________________________________________________

3 Vitiligo 3.1 Definice, a patofyziologie Vitiligo je získané onemocnění, které patří do skupiny chorob projevujících se hypopigmentací kůže. Vyznačuje se tvorbou ostře ohraničených bílých achromických ložisek přítomných na sliznicích, slizničních přechodech a na kůži. Prevalence onemocnění se celosvětově pohybuje okolo 1-2 % s regionálními rozdíly (0,14–8,8 %) (51). Postihuje všechny rasy a obě pohlaví, častěji se vyskytuje u žen a u řady nemocných lze nalézt familiární výskyt. Přibližně u 50 % pacientů se onemocnění projeví do 20 let věku a u 95 % pacientů vznikne do 40. roku života (52, 53). Etiologie tohoto onemocnění je složitá a dosud nebyla spolehlivě objasněna, o čemž svědčí množství teorií zaměřených na příčiny a způsoby destrukce melanocytů u vitiliga (54). Pro náhled na složitost etiologie uvádím stručný přehled nejčastěji publikovaných teorií: 1. Teorie dědičnosti Je založena na údajích o zvýšeném familiárním výskytu onemocnění, různé zdroje uvádí rodinnou vazbu v 6,25–38 % pacientů (55, 56, 57, 58). Teorii podporuje rovněž nález vitiliga u jednovaječných dvojčat (59). Dědičnost hraje v patogenezi vitiliga velmi pravděpodobně důležitou roli, nicméně genetická příčina prozatím nebyla identifikována. Existují však také studie na velkých souborech pacientů s vitiligem, které tyto údaje popírají (60). 2. Teorie autoimunity Předpokládá, že abnormalita v imunitním systému pacienta vyústí v destrukci melanocytů, všímá si asociace vitiliga s dalšími chorobami považovanými za autoimunitní, viz níže. Autoimunitní mechanismus způsobující destrukci melanocytů může být zprostředkován cytotoxickými T-lymfocyty, nebo cytotoxicky působícími protilátkami proti melanocytům. U pacientů s vitiligem byla v periferní krvi zjištěna vysoká hladina melanocyto-reaktivních cytotoxických T-lymfocytů a také korelace mezi perilezionální infiltrací T-buněk a ztrátou melanocytů.

Oproti zdravým jedincům byly v séru nemocných s vitiligem zastiženy

specifické protilátky proti povrchovým antigenům melanocytů, proti buňkám nadledvin, parietálním buňkám a také protilátky proti tyrozináze. Titr protilátek proti melanocytům koreluje zpravidla s rozsahem depigmentací a aktivitou choroby (61). Tyto nálezy svědčí o významné roli buněčné autoimunity v patogenezi vitiliga (62). 23

Vitiligo ___________________________________________________________________________ 3. Teorie autotoxická (oxidačního stresu, autodestrukční) Tato teorie předpokládá, že melanocyty destruují samy sebe produkcí prekurzorů, nebo metabolitů melanogeneze, které jsou toxické pro melanocyty. Jedná se o toxicitu vysoce reaktivních volných radikálů, vznikajících v průběhu melanogeneze, které se lokalizují na membráně melanocytů. Teorii podporuje nález zvýšené aktivity melanocytů, která je možnou příčinou jejich vlastní destrukce a porušené rovnováhy oxidačního a antioxidačního systému (zvýšená hladina volných kyslíkových radikálů a snížená hladina antioxidantů) pacientů s vitiligem (63, 64). 4. Teorie konvergenční Tato teorie zahrnuje kombinaci všech uvedených teorií. Předpokládá, že vitiligo vzniká u pacientů geneticky predisponovaných s poruchou autoimunity, vlivem stresu, akumulací toxinů, po prodělané infekci, mutací, apod. Poskytuje tak vysvětlení podle různých typů onemocnění (63, 65). 5. Teorie neurální Tato teorie předpokládá přítomnost určitých neurochemických mediátorů toxických pro melanocyty, které jsou uvolňovány na koncích nervových vláken. Teorie se hodí především pro segmentální typ vitiliga. V achromických ložiscích předpokládá destrukci melanocytů jejich těsným kontaktem s periferním nervovým zakončením. Teorii rovněž podporuje výskyt vitiliga u pacientů s neurologickými poruchami, u dětí po prodělané virové encefalitidě a u pacientů s poraněním periferních nervů (66, 67). 6. Teorie stresová Tato teorie staví na údajích pacientů o prožité stresové situaci, která předcházela vzniku vitiliga cca 1-3 měsíce. Stresově se přitom mohou uplatnit různé fyzikální inzulty – mechanické poranění, nadměrné vystavení UV záření (například spálení u moře), porod, prodělané onemocnění a psychické trauma. V diferenciální diagnostice k rozpoznání vitiliga od ostatních chorob projevujících se okrskovou depigmentací kůže pomůže znalost některých okolností, jsou to: přítomnost vitiliga v rodině

24

Vitiligo ___________________________________________________________________________ spálení sluncem, nebo jiné kožní trauma v místě výskytu depigmentace během posledních 2-3 měsíců před vznikem depigmentace předčasné šednutí vlasů (před 35 rokem života) stres, nebo jiné fyzické onemocnění předcházející vzniku achromických ložisek (63) Důležitým faktorem je rovněž přecitlivělost vůči UV záření a autoimunitní onemocnění u pacienta nebo někoho v rodině. O vazbě na imunitní systém svědčí souběžná přítomnost některých autoimunitních chorob u řady pacientů s vitiligem. Mezi často se vyskytující choroby u pacientů s vitiligem patří: Hashimotova thyreoiditis, Gravesova choroba, Addisonova choroba, diabetes mellitus typ I i II, alopecia areata, perniciozní anemie, Bowelova choroba, psoriáza, systémový lupus erythematodes, sklerodermie, myasthenia gravis, autoimunní polyglandulární syndrom - typ 1 a další (68).

3.2 Klinické typy vitiliga Dle rozsahu a topografického rozmístění jednotlivých nepigmentovaných ploch se vitiligo klasifikuje na několik typů. I. Lokalizované vitiligo (postižení do 20 % kožního povrchu) 1. Fokální vitiligo: s postižením kůže v rozsahu menším než 5 % povrchu s jedním nebo více ložisky, které nemají dermatomální distribuci 2. Segmentální vitiligo: jedno nebo více ložisek s asymetrickou lokalizací respektující dermatomální oblasti, léze nepřesahují střední čáru postiženého segmentu 3. Slizniční vitiligo: postihuje pouze sliznici genitálu a dutiny ústní II. Generalizované vitiligo 1. Akrofaciální vitiligo: zasahuje obličej okolo očí a úst a distální části končetin na dorsech rukou a nohou 2. Vulgární vitiligo: bilaterálně symetrická depigmentovaná ložiska postihující více než 5 % povrchu typicky nad klouby, v inguinách a na trupu

25

Vitiligo ___________________________________________________________________________ 3. Smíšené vitiligo: kombinace předcházejících forem, tedy formy akrofaciální + vulgární nebo segmentální + akrofaciální či vulgární III. Univerzální vitiligo (postihuje více než 80 % kožního povrchu) Pacient je téměř depigmentován (1, 24).

3.3 Histologický obraz vitiliga V histologických preparátech připravených z

kůže nepigmentovaných ložisek

nacházíme zřetelně zbytnělé stratum corneum, vymizení melanocytů s částečnou nebo úplnou ztrátou melaninu, což potvrzují histochemické reakce s monoklonálními a polyklonálními protilátkami proti melanocytům. Dále pak pozorujeme vakuolizaci buněk bazální vrstvy a normální, nebo zvýšený počet Langerhansových buněk. Horní část dermis bývá nekonstantně prostoupena lymfocytárním infiltrátem s převahou T-buněk, které bývají často lokalizovány perivaskulárně. Naproti tomu ve vzorcích kůže z okrajů vitiliginozních ložisek nalézáme abnormální keratinocyty a degenerované melanocyty s cytoplazmatickou vakuolizací, tukovou degenerací a pyknózou (69,70).

3.4 Diferenciální diagnostika vitiliga V diferenciální diagnostice je potřeba odlišit vitiligo od dalších onemocnění projevujících se tvorbou bílých ložisek na kůži. Při vyšetření pacienta je potřeba zaměřit se na pečlivou anamnézu (okolnosti vzniku léze, přítomnost u pokrevných příbuzných, další choroby pac., atd.). Pomůže i rozložení achromických ložisek na těle (unilateralita, bilateralita, symetrie) (70). Pityriasis alba – lokalizace depigmentací je na horní části trupu, může vzniknout po ekzému, ale etiologie je nejasná, histologický nález je nekonstantní – mírná hyperkeratóza, počet melanocytů je normální, jedná se o redukci množství melaninu. Pityriasis versicolor - mykologické vyšetření prokáže hyfy a spóry 26

Vitiligo ___________________________________________________________________________ Nepigmentované léze u lepry – achromická ložiska přítomná na kůži u pacientů postižených leprou vykazují ztrátu citlivosti. Psoritická leukoderma – mimo achromických lézí má pacient anamnézu psoriázy Postinflamační leukoderma – pacient má anamnézu prodělané dermatózy Sklerodermie – kůže vykazuje lokální zatvrdnutí, před vypadnutím pigmentu je okrsek zpravidla tmavší nebo načervenalý Lichen sclerosus et atrophicus – plaky vznikají často splynutím z malých ložisek, mají porcelánově bílou barvu, často je postižen genitál Achromický névus (Nevus achromicus) – dobře ohraničené depigmentované ložisko stabilní bez známek progrese, přítomné od narození, s normálním nebo sníženým počtem melanocytů

3.5 Přehled terapie vitiliga Historie léčby vitiliga je dle dochovaných záznamů stará přibližně 4000 let, za tu dobu byla vyzkoušena celá řada léčebných metod k obnově kožní pigmentace (24). Získaná depigmentace je nápadná a s jejím popisem se setkáváme u řady autorů. Byla opakovaně popsána lékaři Orientu, v bibli, koránu a jinde. Název vitiligo pochází pravděpodobně od Celsa z Říma. Sociální stigmatizace nemocných je tradičně vyšší u tmavších etnik, což například v indii podporovaly náboženské texty stavící nemocné s vitiligem do roviny s nemocnými postiženými leprou, která může mít podobný klinický obraz na kůži, proto byly dříve obě choroby často zaměňovány (71). Jelikož se jedná o idiopatické onemocnění, kauzální léčba v současné době není možná a žádná z dnes užívaných terapií vitiliga nedosahuje předvídatelně dobrých výsledků u všech pacientů. Navíc i po úspěšné terapii s repigmentací achromických lézí není zaručena stabilita repigmentací a u některých pacientů dochází k relapsu onemocnění (72). Proto někteří lékaři pacientům léčení vůbec nedoporučují (73). Léčba vitiliga zpravidla sleduje dva cíle: 1. obnovení přirozené ochrany kůže proti UV záření a 2. kosmetické hledisko. Obnovení ochranné funkce kůže je často přehlíženo i postiženými, jelikož se zpravidla velmi účinně chrání před UV zářením hlavně z důvodu menší nápadnosti achromických ploch v kontrastu s málo pigmentovanou neopálenou kůží. Ke zlepšení vzhledu kůže pacienta vedou 3 cesty:

27

Vitiligo ___________________________________________________________________________ A. kosmetická kamufláž achromických ložisek B. depigmentace kůže na zbytku těla C. repigmentace achromických ložisek Při výběru způsobu terapie záleží především na rozsahu onemocnění, lokalizaci achromických ploch a dalších faktorech, jako jsou věk pacienta, kožní fototyp, předchozí terapeutické pokusy, apod. 3.5.1

Kosmetická kamufláž achromických ploch Kamufláž achromických ploch není terapií v pravém slova smyslu, přispívá však

ke zlepšení psychiky a psychosociálního cítění pacientů a má přímý dopad na kvalitu života nemocných, jak dokládá několik prací zabývajících se touto problematikou (74, 75, 76). K objektivizaci a srovnání dopadu kožních chorob na kvalitu života lze použít Dermatology Life Quality Index (DLQI) (77). Tento index se stanovuje na základě dotazníku vyplněného pacienty. Zvláště na viditelných místech nekrytých oděvem jako jsou tvář a ruce je kamufláž ploch pro většinu pacientů nepostradatelná. Provádí se makeupem, samoopalovacími krémy nebo permanentní tetováží. Tetováž / mikropigmentace je velmi stará metoda. Rozlišujeme medicínskou tetováž, kosmetickou (permanentní make-up) a ornamentální tetováž. Medicínská tetováž u vitiliga je vhodná zvláště pro velmi malé, dlouhodobě stabilní a přitom nápadné léze například v oblasti rtů či prsních dvorců. Výhodou je zejména trvalý efekt bez vedlejších účinků. Na některých pracovištích je toto tetování nabízeno přímo ve zdravotnických zařízeních profesionálními tetovacími přístroji. Ošetření se provádí zpravidla v lokálním znecitlivění, požadovaná barva je docílená mícháním základních pigmentů (78, 79, 80). Tetovat lze i sliznice a slizniční přechody, v některých případech je nutno tetováž po čase opakovat, tetováž sliznic bývá většinou trvalá (81, 82).

Obr. 5 - tetováž stav před a 2 roky po, převzato a upraveno z článku: SINGH, A.K.; KARKI, D. Micropigmentation: Tattooing for the treatment of lip vitiligo, Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery, In Press, Corrected Proof, Available online 28 May 2009, ISSN 1748-6815

28

Vitiligo ___________________________________________________________________________ Kamufláž makeupem poskytuje při správném použití výborné výsledky, vyžaduje však nácvik správné techniky ze strany pacienta. Nejčastěji se používá v obličeji a na dorzech rukou, problémem jsou místa vyššího tření v ohybových rýhách na krku a zápěstí a volba adekvátního barevného odstínu make-upu. Ve světě existuje řada firem vyrábějící voděodolný klinický make-up určený pro pacienty s vitiligem. Jsou to: Covermark™ (Covermark, Northvale,

New

Jersey),

Dermablend™

(Dermablend,

Ridgefiled,

New

Jersey),

Dermacolor™ (Dermacolor, Charles H Fox, Londýn, Velká Británie), Keromask™ (Christy, Londýn, Velká Británie), Veil Cover™ (Thomas Blake Cosmetics, Durham, Velká Británie), Perfect Cover™ (Shiseido, Tokyo, Japonsko) a další.

Každý produkt má své výhody

i nevýhody a jejich srovnání je problematické. Pacientům se zpravidla doporučuje vyzkoušet několik produktů i s ohledem na různé barevné odstíny a vybrat produkt, který nejvíce vyhovuje ve spolupráci se specialistou na danou problematiku (83).

Obr. 6 – kamufláž voděodolným make-upem, na snímcích je zachycen stav před a po kamufláži, převzato a upraveno z článku: TANIOKA, M.; MIYACHI, Y. Camouflage for vitiligo, Dermatologic Therapy 2009; 1 (22): 90-93, Wiley Periodicals, Inc.

29

Vitiligo ___________________________________________________________________________ Samoopalovací krémy jsou mezi pacienty velmi oblíbené, výsledné zbarvení kůže se dá sice obtížně odhadnout a zpravidla nekoresponduje přesně s barvou pigmentovaného okolí a vydrží 3-4 dny. Při aplikaci je třeba pečlivě aplikovat pouze na povrch achromické léze, při přesahu do pigmentované plochy kamufláž ztrácí smysl. Při opakovaném použití pro dosažení tmavšího odstínu je nutná pauza mezi jednotlivým nanesením látky na kůži cca 5 hod. Většina samoopalovacích krémů je na bázi dihydroxyacetonu, na kůži zanechává nahnědlé zbarvení (84).

3.5.2

Depigmentace Depigmentace se provádí v případě, že achromické plochy postihují více než 80 %

povrchu pacienta. Jedná se vždy o závažné rozhodnutí bez možnosti návratu, proto je potřeba tuto léčebnou modalitu vždy dobře uvážit. Úspěšná depigmentace určitě prospěje psychickému stavu pacienta, problémem je ale ztráta ochranné funkce kůže. Vysoká citlivost vůči UV záření představuje pro pacienta nutnost striktní ochrany před jeho účinky do konce života. Léčba se provádí pomocí melanocytotoxických látek – hydrochinonů. Zpravidla se začíná s denní aplikací na testovací plošku, s vlastní terapií se pak pokračuje v případě, že se při aplikaci na testovací plošku nevyskytly nežádoucí vedlejší účinky a pacient snáší depigmentaci dobře. Celková doba terapie závisí na rozsahu zbývajících pigmentovaných ploch a k celkové depigmentaci bývá zpravidla zapotřebí 6 měsíců až 2 roky (1). Používané bělicí přípravky: a) 20 % monobenzyl ether hydrochinon b) kyselina retinová c) kyselina retinová + hydrochinon d) fenolové sloučeniny e) kyselina azelainová f) kyselina kojová

30

Vitiligo ___________________________________________________________________________ 3.5.3

Repigmentace Repigmentační terapie zahrnuje postupy konzervativní a chirurgické. Obecně lze říci,

že konzervativní léčba má přednost před chirurgickou a má jí vždy předcházet. Repigmentace při léčbě je možná díky produkci pigmentu melanocyty, které se do postižených ložisek při konzervativní terapii mohou dostat ze 3 zdrojů: a) vlasová jednotka – okolí folliklu b) zbývající melanocyty v achromické lézi c) okraj achromické léze

3.5.3.1 Konzervativní terapie Konzervativní terapii lze rozdělit na: a) lokální, b) systémovou, c) fyzikální. a) lokální terapie: Kortikosteroidy - aplikují se na postiženou plochu zevně nebo přímo intradermálně. Jedná se zpravidla o terapii první volby především na lokalizované formy vitiliga. Pro riziko sekundárního poškození kůže charakteru dermoepidermální atrofie v místě aplikace se v případě neúspěchu doporučuje léčbu po 3 měsících ukončit. Lokální takrolismus a pimekrolismus - topická aplikace imunosupresivních látek, původně vyvíjených na léčbu zánětlivých kožních stavů jako psoriasa, pyoderma gangrenosum a alopecia areata. Takrolismus je makrolidové imunosupresivum pocházející z houby Streptomyces tsukubaensis, v medicíně se užívá perorálně k profylaxi rejekce ledvin a jater u pacientů transplantaci (85). Takrolismus a pimekrolismus inhibuje transkripci a uvolňování T-buněčných cytokinů (64, 86).

b) systémová terapie: Kortikosteroidy – aplikují se perorálně, nebo intramuskulárně, léčba se opírá o autoimunitní teorii vzniku vitiliga

31

Vitiligo ___________________________________________________________________________ Betakaroteny – jsou doporučovány především u akrální formy vitiliga v dávce 3x25 mg po dobu 6-10 týdnů. Ukládáním karotenázy ve stratum corneum epidermis dochází k žlutooranžovému zbarvení kůže. c) fyzikální terapie: Fototerapie – systémová fototerapie je dle některých autorů v počátečních fázích, či u lokalizované formy onemocnění účinná až v 70 % (87). Léčba se zpravidla provádí 2-3x týdně po dobu nejméně 4 měsíců, ale nikdy ne v po sobě jdoucích dnech, k léčbě se používá: UVA záření UVB úzkopásmové záření (311 nm) UVB širokopásmové záření (280-320 nm) Pro dobré klinické výsledky se v dnešní době preferuje úzkopásmové UVB záření. Tato terapie může být použita i u těhotných či kojících žen a u dětí a měla by být terapií první volby. Alternativou systémové fototerapie je UVB úzkopásmová mikrofototerapie zaměřená pouze na achromickou lézi. Užívá se u lokalizovaných forem vitiliga, záření z trubice je směrováno na lézi optickým vláknem (88). Fotochemoterapie (PUVA terapie) – jde o překvapivě starou metodu léčby. První zmínky pochází ze 13. století z oblasti nilské delty. Egypťané zde užívali extrakt z rostliny Ammi majus Linnaeus, který obsahuje psoraleny. Nemocní užívali tento extrakt denně po dobu 15 dní a současně se vystavovali slunečnímu záření. Mezi další rostliny obsahující psoraleny patří Ficus hispida a Psoralea caryofolia, o nichž jsou zmínky v indické literatuře. V moderní medicíně pravděpodobně poprvé použil psoraleny v kombinaci se světelným zářením k léčbě vitiliga El Mofty v roce 1948 (69). Psoraleny vstupují do interakce s dvojvláknovou DNA – při současném působení UV záření inhibují DNA, nepřímo snižují RNA a proteinovou syntézu. Předpokládá se, že repigmentace je navozená imunologicky snížením potenciálu pro tvorbu protilátek proti melanocytům, zvýšením aktvity tyrozinázy a zvětšením velikosti melanosomů. Nejlepších výsledků dosahuje PUVA terapie na tváři, trupu a proximálních částech končetin, nejvíce rezistentní k léčbě jsou dorsa rukou a nohou. PUVA terapie se provádí 2-3x týdně po mnoho měsíců a repigmentace se objevují v léčené ploše perifollikulárně. Celkové množství terapeutických sezení nutných k repigmentaci u PUVA terapie bývá 50-300. Před zahájením léčby by pacient měl podstoupit vyšetření zraku

32

Vitiligo ___________________________________________________________________________ a biochemický screening se zaměřením na funkci jater a ledvin, tato vyšetření by se měla opakovat v průběhu léčby každých 6 měsíců. PUVA terapie je doporučována především u pacientů s rozsáhlým postižením u vulgární formy vitiliga, přesto úspěšnost léčby dle mnoha prací je jen lehce nad 50 % (89, 90, 91). Některé práce poukazují, že až 75 % pacientů po PUVA terapii má relaps onemocnění během 1-2 let po ukončení terapie (72). Systémová PUVA – je indikována u pacientů s generalizovanou formou vitiliga, 8-methoxypsoralen se podává v dávce 0,5 mg/kg váhy 1,5-2 hod před aplikací UVA záření. UVA záření se aplikuje 2-3x týdně, počáteční dávka 1-2 J/cm2 se zvyšuje postupně o 0,25 J/cm2. Lokální PUVA - je indikována u pacientů s postižením do 20 % kožního povrchu. Lokálně se aplikuje na depigmentované plochy roztok 0,05-0,1 % 8-methoxypsoralenu s následným ozařováním UVA zářením. Doporučuje se počáteční dávka 1-3J/cm2 po dobu 30 sekund 2-3x týdně s postupným zvyšováním po 15-30 sekundách, event. i se zvyšováním koncentrace roztoku. Variantou lokální PUVA terapie je koupelová PUVA, kdy jsou psoraleny přidány do vodní lázně, ve které je pacient ponořen 15 minut před aplikací UVA záření, které se aplikuje na ještě mokrý kožní povrch (92). KUVA

(Khellin

+

UVA)

–

k aplikaci

UVA

záření

se

podává

Khellin

(dimethoxymethylfuranochromon z extraktu rostliny Ammi visnaga, stejně jako psoraleny patří mezi furokumariny) (69, 93), oproti PUVA terapii by nemělo docházet ke vzniku fototoxického erytému. PAUVA (Phenylalanin + UVA) – podává se fenylalanin v dávce 50-200 mg/kg hmotnosti se současnou aplikací UVA záření 3x týdně. PUVASOL – jedná se o alternativní postup pro pacienty, u nichž je kontraindikována PUVA terapie. Podává se Trioxsalen (trimethylpsoralen – extrakt z rostliny Psoralea corylifolia, patří mezi psoraleny a působí fotosenzibilizaci (94)) v dávce 10 mg/kg hmotnosti 2-3x týdně se současnou expozicí slunečnímu záření s počáteční expozicí 5-10 min, kterou je možno postupně zvyšovat až do 2 hodin.

33

Vitiligo ___________________________________________________________________________ Laserová terapie – provádí se excimerovým laserem, který produkuje monochromatické záření o vlnové délce 308 nm. Tato terapie je efektivní u stabilních lokalizovaných lézí vitiliga nebo u forem postihujících maximálně 30 % povrchu těla. Léze jsou léčeny 2x týdně a průměrně je potřeba 24-48 terapeutických sezení. Někteří autoři uvádí úspěšnou kombinaci s lokálním takrolismem i v terapii u UV záření rezistentních forem vitiliga (95). 3.5.3.2 Chirurgická terapie Principem všech postupů chirurgické terapie vitiliga je transplantace autologních melanocytů do achromických lézí. Jednotlivé postupy se liší v přípravě recipientní achromické plochy, ve způsobu odběru melanocytů a jejich dalším zpracováním před vlastní transplantací. V současné době jsou definována obecná kritéria doporučovaná při výběru pacientů vhodných pro chirurgickou léčbu vitiliga (1, 86): a) pacienti nereagující na konzervativní terapii b) pacienti s lézemi stabilními nejméně 1 rok na ploše do 30 % tělesného povrchu c) pacienti bez známek hojení hypertrofickou nebo keloidní jizvou v osobní anamnéze d) pozitivní minigraft test (96, 97) e) pacienti bez přítomnosti Koebnerova fenoménu (vznik ložiskové depigmentace v místě předchozího poranění kůže) f) pacienti starší 12 let Limitem chirurgických metod je rovněž rozsah léčených achromických ploch. V jednom sezení se doporučuje léčit plochy maximálně do 200 cm2 s ohledem na nutnost zachování přijatelné velikosti donorského místa (98). U pacientů s větším rozsahem stabilních achromických lézí refrakterních ke konzervativní terapii je k repigmentaci všech lézí nutná expanze melanocytů kultivací, jak bude uvedeno dále.

I. postupy bez separace kožních buněk – kožní štěpy split-thickness skin grafts (transplantace dermoepidermálních štěpů) Jedná se o přenos tenkých dermoepidermálních štěpů o tloušťce 0,1–0,2 mm odebraných dermatomem. Příjmovou achromickou plochu je nutné zbavit epidermis, to se zpravidla

34

Vitiligo ___________________________________________________________________________ provádí dermabrazí, nebo ablací laserem. Tato metoda se doporučuje u pacientů s výskytem achromických lézí do maximálně cca 150 cm2. Jako komplikace bývá uváděna světlejší barva ošetřené plochy způsobená pravděpodobně menším množstvím melanocytů v přeneseném štěpu a pozánětlivá hypo- nebo hyperpigmentace odběrové plochy (1). punch grafting (transplantace štěpů kůže v plné tloušťce) Přenos okrsků kůže v plné tloušťce o průměru 3 mm odebraných nástrojem pro punch biopsii. Přenáší se pigmentované kožní štěpy do achromických lézí. V oblasti recipientní plochy se okrsky kůže implantují do otvorů stejného nebo lépe o 0,5 mm menšího průměru vytvořených opět mechanicky ve vzdálenosti 4-8 mm mezi sebou. Obvyklou komplikací je tzv. „cobblestone effect“, tedy hrbolatý povrch v místě přenesených okrsků kůže připomínající dlažební kostky (1, 99). Zvláště nepříjemně je tato komplikace vnímána pacienty na pohmat a v obličeji. Výskyt této komplikace lze omezit vytvořením hlubších otvorů v recipientní oblasti asi o 1mm než je tloušťka štěpu jak uvádí Boersma nebo dlahováním silikonovou ploténkou v pooperačním období (100). mini punch grafting (transplantace miništěpů kůže v plné tloušťce) Postup je stejný jako u punch graftů, okrsky kůže jsou však menší, mají průměr 1-2,5 mm a tloušťku 0,6–0,8 mm. Otvory v kůži v příjmové oblasti lze pro malé rozměry vytvořit jak mechanicky puncherem, tak i Erbium-YAG laserem (101). V lokalitách jako jsou rty, prsní dvorec apod. je zajištění imobilizace štěpů po zákroku velmi obtížné, v těchto případech se dá k fixaci štěpů použít tkáňové lepidlo(102). suction blister grafting (transplantace epidermis získané uměle vytvořeným puchýřem) Principem metody, kterou publikoval Falabella (103), je přenos epidermis z uměle vytvořeného puchýře, který se v donorské oblasti vytvoří podtlakem nebo aplikací tekutého dusíku na kožní povrch. Výhodou metody je odtržení epidermis přesně v místě dermoepidermální junkce. Recipientní plocha se pro přijetí štěpu připravuje dermabrazí, laserovou ablací (CO2,

nebo Erbium-YAG laserem) nebo opět vytvořením puchýře

a odtržením epidermis. Nevýhodou metody je častá přechodná hyperpigmentace donorské i recipientní oblasti.

35

Vitiligo ___________________________________________________________________________ hair follicle grafting (transplantace vlasových folikulů) Jedná se o přenos vlasových folikulů. Metoda využívá přirozený rezervoár melanocytů v oblasti vlasového folikulu. Při tomto postupu se zpravidla odebírá okrsek kůže z temporální oblasti (cca 1x3 cm), ze kterého se připraví jednotlivé vlasové folikuly podobně jako při transplantaci vlasů. Rozdíl je pouze v tom, že spodní třetina vlasu včetně vlasového bulbu se odstraní. Dále je postup podobný jako při transplantaci vlasů u alopecie. Do jednotlivých otvorů v recipientní oblasti se implantují připravené štěpy. Pigmentace lze pozorovat přibližně za 2 měsíce, melanocyty migrují radiálně z místa implantace (104). Výhodou všech těchto metod je především možnost provedení zákroku ambulantně a bez návaznosti na buněčnou laboratoř.

II. postupy se separací kožních buněk po odběru – buněčné štěpy Výchozím pojítkem všech těchto postupů je enzymatické rozvolnění vzorku pigmentované kůže na jednotlivé kožní buňky. Toho se docílí mechanickým rozrušením kožního vzorku (rozstříhá se nůžkami) a trypsinem. Trypsinací se získá směs kožních buněk. V dalším zpracování lze tyto postupy dále rozdělit na postupy s kultivací melanocytů a na postupy bez kultivace melanocytů. Hlavní nevýhodou a tedy i překážkou většího rozšíření těchto postupů je nezbytná návaznost na buněčnou laboratoř a do jisté míry i finanční náročnost. přenos kultivovaných melanocytů Kultivaci lidských buněk zavedli do klinické praxe v roce 1975 Rheinwald a Green (105), kteří použili kultivované keratinocyty k léčbě středně hlubokých popálenin. Od té doby se kultivace lidských buněk stala rutinně užívanou metodou v klinické praxi. Expanzí počtu melanocytů

kultivací lze ošetřit rozsáhlejší plochy. Čas potřebný

k expanzi melanocytů je zpravidla okolo 4 týdnů. Metodu odběru a následné kultivace odebraných melanocytů vypracoval a publikoval v roce 1987 Lerner a spolupracovníci. Nakultivované melanocyty injikovali do achromických lézí, kde se začlenily do bazální vrstvy a začaly tvořit pigment. Výsledkem byla repigmentace ošetřených ložisek s barvou blížící se barvě okolní zdravé kůže (8). Postup úspěšně použili 36

Vitiligo ___________________________________________________________________________ a publikovali v roce 1993 i Olsson a Juhlin ze Švédska (106). Modifikovaný postup s užitím Erbium-YAG laseru pro ablaci epidermis z recipientní plochy publikoval v roce 1998 i tým Kaufmanna z Německa, jako buněčný nosič pro kultivované melanocyty použili vstřebatelnou ®

matrix na bázi kyseliny hyaluronové - Laserskin

(107). Úspěšnou transplantaci

kultivovaných autologních melanocytů u recipientní plochy připravené CO2 laserem publikoval v roce 2004 i tým Chena z Taiwanu (108). V České republice byl použit modifikovaný postup týmem lékařů Kožní kliniky Fakultní nemocnice Brno, kteří kultivované autologní melanocyty implantovali do achromických lézí tlakovým zařízením Dermojet (11, 109). Jiný postup použil tým Arenbergera z Prahy, který na dermabradovanou kožní plochu aplikoval směs autologních melanocytů a keratinocytů kultivovaných na acelulární prasečí dermis (110). Pravděpodobně první komerčně dostupný produkt využívající tento postup je MelanoSeedTM (Bio Tissue Technologies AG, Freiburg, Německo). Melanocyty se získávají ze vzorku kůže v plné tloušťce, kultivace probíhá 28 dní a suspenze kultivovaných melanocytů ve fibrinu se aplikuje na plochu připravenou dermabrazí (98). přenos nekultivovaných melanocytů Jednodušším a finančně méně nákladným postupem je transplantace separovaných nekultivovaných melanocytů ve směsi s dalšími kožními buňkami. Odebraný vzorek kůže, nebo dermoepidermálního štěpu je trypsinací rozvolněn na jednotlivé kožní buňky bez následné selekce melanocytů. Pacient pak dostává směs autologních kožních buněk v roztoku, resp. s buněčným nosičem. Modifikace této metody se liší dle jednotlivých pracovišť, kde se postup používá. V roce 1992 Gauthier a Surleve-Bazeille (Bordeaux, Francie) popsali přenos směsi nekultivovaných melanocytů a keratinocytů do puchýřů připravených v místě recipientní plochy tekutým dusíkem (111). Jako donorskou oblast zvolili skalp a proceduru prováděli ve dvou dnech. V roce 2001 Nanny Van Gellová a spolupracovníci (Ghent, Belgie) publikovali přenos směsi nekultivovaných melanocytů a keratinocytů u čtyřech pacientů. Recipientní plocha byla připravena laserovou dermabrazí CO2 laserem, směs buněk obohatili kyselinou hyaluronovou za účelem dosažení větší viskozity aplikovaného roztoku (12). Soubor 184

pacientů ošetřených touto modifikovanou metodou publikoval v roce 2003

Sanjeev V. Mulekar z Indie (9). Léčbu provedl u pacientů s fokálním, segmentálním a generalizovaným vitiligem s lézemi stabilními 6 měsíců na maximálně 30 % povrchu těla.

37

Vitiligo ___________________________________________________________________________ Jako donorskou oblast pro odběr dermoepidermálního štěpu použil hýždě, velikost štěpu byla přibližně 1/10 velikosti plochy ošetřované léze. Recipientní achromické plochy připravil před vlastním přenosem buněk dermabrazí a aplikovanou suspenzi buněk kryl kolagenem a transparentním krytím.

38

Lasery v medicíně ___________________________________________________________________________

4 Lasery v medicíně Pro pochopení použití laseru v medicíně je potřeba alespoň stručně ozřejmit některé základní pojmy. Slovo laser je akronym z anglických slov a vyjadřuje vlastní podstatu - Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation (zesílení světla pomocí vynucené / stimulované emise záření). České pojmenování laseru je „kvantový generátor světla“, v praxi se ale nepoužívá. V moderní fyzice se hovoří o tzv. duálním charakteru světla. Na světlo

(v širším smyslu slova na záření) je nutné nahlížet současně jako na elektromagnetické vlnění (mluvíme o vlnovém charakteru světla) i jako na proud částic (korpuskulární charakter světla). Na částicové úrovni vzniká světelné záření přechodem atomů z excitovaného do normálního stavu. Při tomto ději negativně nabité elektrony obíhající po kruhových drahách okolo atomového jádra přejdou z vnějšího na vnitřní okruh a při tomto přemístění uvolní určité kvantum světla – foton, ve kterém je jejich přebývající energie. Tato spontánní emise se děje stále u všech molekul. Podmínkou tohoto vyzařování je v první fázi příjem energie odpovídající tomuto záření z vnějšku. Atom, který přijme energii, díky níž přesune obíhající elektrony na vyšší energetickou úroveň (dráhu vzdálenější od jádra) nazýváme excitovaný atom. V excitovaném stavu setrvávají atomy jen velmi krátkou dobu a energie uvolněná při přesunu elektronů na nižší orbity může být vydávána různými způsoby: jako elektromagnetické vlnění ve formě fotonů, nebo neradiačními přeměnami formou tepla či mechanickými nárazy. Řada atomů má elektrony v excitovaném stavu a pokud se objeví foton, jehož energie odpovídá energii mezi stavy elektronových drah atomu, vyvolá tento foton přestup elektronu z vyšší na energeticky nižší dráhu a vyzáří přitom další foton. Tento sekundární foton má stejnou energii jako foton původní a oba jsou dokonale synchronizovány. Tento proces může pokračovat i u dalších atomů v látce a hovoříme o stimulované emisi záření (112). Od normálního světla se laserové světlo liší svou organizovaností – je monochromatické (jednobarevné), koherentní (uspořádané) a má malou divergenci (rozbíhavost) viz obr 7.

39

Lasery v medicíně ___________________________________________________________________________

Obr. 7 – srovnání běžného a laserového světla: běžné světlo je rozptýlené, zatímco laserové světlo nediverguje

Monochromatičnost – je dána skutečností, že všechny svazky laserových paprsků mají stejnou vlnovou délku a tím i stejnou frekvenci a stejné množství energie. Naproti tomu běžné světlo má vlnové délky všech barev. Vlnová délka laseru je závislá na použitém aktivním prostředí a na mechanismu stimulace. Výběr určitých vlnových délek se provádí soustavou zrcadel v rezonátoru. Koherence – jedná se o paralelní průběh světelných vln. Fáze i amplituda laserového záření setrvávají rovnoměrné i na velké vzdálenosti. Čím lepší je koherence, tím je vyšší kvalita laserového záření.

Obr. 8 - srovnání běžného a laserového světla: běžné světlo má různé frekvence, zatímco laserové světlo má fixní frekvenci a je koherentní, převzato a upraveno z knihy: ACHAUER, B.M.; et al. Plastic Surgery Indications, Operations, and Outcomes, Mosby; 1 edition 2000, Volume I. , p 183-193, ISBN-10: 0815110197

40

Lasery v medicíně ___________________________________________________________________________ Kolimace, směr paprsku – svazky laserového záření jsou úzké a nerozptylující se jako běžné světlo. Směr svazku laserového záření se udržuje i na velkou vzdálenost. Laser obecně je tedy zdroj koherentního elektromagnetického záření nejčastěji ve viditelné, ultrafialové nebo v infračervené oblasti spektra, využívající jevu stimulované emise záření aktivních částic (atomů, molekul, iontů, elektronů) buzených vnějším zdrojem energie. Jednoduše řečeno jedná se o zařízení, které přeměňuje dodávanou energii na laserové světlo. Každý laser se skládá ze tří základních komponent: 1. aktivní prostředí - pevná látka s příměsemi (krystal, sklo, polovodič), kapalina, plyn nebo směs plynů (CO2, He + Ne) 2. optický rezonátor - je tvořen obvykle zrcadly, mřížkami, světlovodem. V rezonátoru je umístěn pár zrcadel na dvou protilehlých stěnách aktivního prostředí a odráží uvolněné fotony, čímž dochází k zesilování efektu indukované emise fotonů. 3. zdroj budící energie / budící systém - proud elektronů, výbojky, jiné lasery, chemická reakce – dodává energii do optického rezonátoru s laserovým médiem

Obr. 9 - základní komponenty laseru – budící systém, aktivní prostředí a optický rezonátor

Laserový paprsek vzniká stimulací aktivního prostředí zdrojem budící energie. Čerpací (budící) záření podněcuje emisi v aktivním prostředí, které je ohraničeno rovnoběžnými 41

Lasery v medicíně ___________________________________________________________________________ zrcadly A a B, kde zrcadlo B je částečně propustné. Po vybuzení stimulované emise dochází k odrazu světla mezi zrcadly, mnohonásobnému průchodu záření aktivním prostředím a tím zvyšování jeho intenzity. Po dosažení dostatečného stupně intenzity uniká přes polopropustné zrcadlo koherentní laserový paprsek. Elektromagnetické spektrum Elektromagnetické spektrum má rozsah od gama záření po rádiové vlny. Viditelná část světla zahrnuje pouze malou část spektra o vlnových délkách 385-760 nm. Laserové záření se skládá z paprsků vlnových délek od rentgenového po infračervené spektrum. Lasery emitující záření pod viditelnou oblastí spektra se označují též jako tzv. studené lasery (např. excimerový laser) a primárně působí především kontrolované poškození tkáně na atomární úrovni podobně jako ionizující záření. Naproti tomu lasery emitující záření ve viditelné, nebo infračervené oblasti primárně působí na tkáň termálními účinky.

Obr. 10 – elektromagnetické spektrum

Terapeutické použití laserů závisí na velikosti energie dodané do tkáně a tzv. módu, jakým byla energie dodána. Velikost energie se udává v joulech (J) a je vyjádřením schopnosti konat práci. Výkon vyjadřuje množství práce vykonané za jednotku času a udává se ve watech (W). Hustota výkonu a hustota energie udává dávku na ozařovací bod W/cm2, J/cm2. Hustota energie v ozařované tkáni je důležitá pro vlastní biologické účinky laserového záření. Změnou velikosti ozařované oblasti (spotu laseru) dochází ke změnám hustoty dodané energie. Při zmenšení ozařované oblasti (zmenšením laserového spotu) se hustota energie zvýší a naopak zvětšením spotu dojde ke snížení hustoty energie.

42

Lasery v medicíně ___________________________________________________________________________ Modulace laserového paprsku Laserový paprsek můžeme aplikovat na tkáň v různých režimech. Hovoříme o kontinuální, nebo v přerušované formě v modulačních frekvencích. Intermitentního (přerušovaného) módu je dosaženo zapínáním a vypínáním laserového paprsku v určité frekvenci. V kontinuálním módu (CW – continuous wave) opouští laserový paprsek nepřetržitě rezonátor přes polopropustné zrcadlo, jedná se o nepřerušovaný paprsek světla bez pulsů. V případě zablokování cesty paprsku záklopkou, která se intermitentně uvolňuje hovoříme o tzv. pulsním módu – laserový paprsek je dodáván formou jednotlivých pulsů. Další možností je dodávka energie v tzv. Q-switch módu, kdy je laserový paprsek v pulsním módu dodáván v extrémně krátkých časech, řádově v nano, nebo pikosekundách. Posledním režimem je tzv. superpulsní mód, ve kterém při amplifikaci dochází k rychlému a prudkému nárůstu energie, která je následně uvolněna v krátkém časovém intervalu (113).

Obr. 11 – časové režimy dodávky laserové energie (pracovní mody laserů), převzato a upraveno z knihy: ACHAUER, B.M. et al. Plastic Surgery Indications, Operations, and Outcomes, Mosby; 1 edition 2000, Volume I. , p 183-193, ISBN-10: 0815110197

43

Lasery v medicíně ___________________________________________________________________________

4.1 Rozdělení laserů v medicíně Lasery používané v medicíně lze rozdělit podle aktivního prostředí, časového režimu provozu laseru, výkonu či podle typu ošetřovaných lézí. Podle aktivního prostředí: pevnolátkové lasery polovodičové lasery plynové lasery kapalinové lasery plazmové lasery lasery s volnými elektrony Podle časového režimu: kontinuální lasery impulzní lasery kvazi kontinuální lasery Podle výkonu: nízkovýkonné (neinvazivní, biostimulační) lasery vysokovýkonné (invazivní, operační) lasery Podle typu ošetřované léze: lasery pro terapii cévních lézí lasery pro terapii tetováží a kožních pigmentových lézí vaporizační lasery k odstraňování nežádoucích lézí lasery pro odstraňování nežádoucího ochlupení lasery a přístroje na léčbu akné lasery na fotorejuvenaci (omlazení pleti) Využití laserů v medicíně začalo koncem roku 1961, kdy byl rubínový laser poprvé využit při operaci sítnice Cambellem v USA. V roce 1963 Mester v Budapešti studoval účinky laserového světla na tkáně a zjistil urychlení růstu kožních buněk při ozařování

44

Lasery v medicíně ___________________________________________________________________________ malými dávkami energie. Postupně byla zkoumána interakce různých typů laserů s živou tkání a byly vyděleny dvě základní skupiny laserů užívaných v medicíně: operační (invazivní) a biostimulační (neinvazivní). Mezi biostimulační lasery řadíme přístroje s výkonem do 500 mW. Při vyšším výkonu laserového záření mizí stimulační odpověď buněk. Biostimulační lasery podle druhu zdroje dělíme na polovodičové a plynné (helium-neonové). Nejčastější indikace k použití biostimulačního laseru jsou: špatně se hojící rány, bércové vředy, jizvy, proleženiny, opary, bolesti po prodělaném pásovém oparu, akné, apod. (114). Z invazivních laserů se v medicíně v současné době používají především: KTP laser (kalium-titan-fosfátový) s využitím k odstraňování kožních afekcí, vaskulárních lézí a tetováže, Neodym:YAG laser (yttrium-aluminium-garnet) k léčbě vaskulárních lézí i kožních tumorů, Erbium:YAG laser – k povrchní ablaci epidermis, Pulsní barevný laser napájený světelnou lampou – k odstraňování vaskulárních lézí, CO2 laser – jako chirurgický nástroj, k odstraňovní kožních afekcí, k resurfacingu kůže a další.

4.2 CO2 laser CO2 laser emituje světlo v neviditelné oblasti spektra, má vlnovou délku 10600 nm, aktivním prostředím je směs plynů zpravidla ve složení CO2 (10-20 %), N2 (10-20 %), H2 nebo Xe (jen několik málo procent), He (zbývající část směsi plynů) (115). Energie CO2 laseru je při interakci s tkání selektivně absorbována vodou, tato absorbce vede k prudkému vysušení tkáně a její přeměnu v suchou substanci. S ohledem na fakt, že při použití CO2 laseru se laserová energie nechává působit v extrémně krátkých časech (obvykle méně než 1ms), je vaporizovaná vrstva na povrchu relativně ostře ohraničena od spodní, termicky nepoškozené vrstvy (doba působení je kratší než tzv. termální relaxační čas kůže). Hloubku průniku CO2 laseru do tkáně lze korigovat velikostí energie, její hustotou a dobou působení pulsu. Použitím vysokých dávek energie, úzkého paprsku (spotu) a krátkých časů docílíme řezu tkáně. Změnou šířky paprsku (laserového spotu) jeho zvětšením / defokusací se energie rozdělí na větší plochu a docílíme ablaci tkáně a koagulaci. Toho se využívá u tzv. resurfacingu kůže, což je výraz pro ablaci a dermabrazi současně. Jedná se o specifický druh ošetření používaný zejména v estetické chirurgii za účelem eliminace vrásek a pigmentových nepravidelností kůže. CO2 laser v pulsním módu tedy umožňuje velmi přesně kontrolovanou vaporizaci horních vrstev pokožky do hloubky cca 30 μm. Účinky této laserové dermabraze jsou dobře zdokumentovány řadou prací

45

Lasery v medicíně ___________________________________________________________________________ a histologickými nálezy. Hloubku ablace lze prohloubit dvojnásobnou aplikací laseru do stejného místa po snesení suché substance na povrchu po prvním ošetření. Jedna dávka laseru na kožní povrch (jedno ošetření) se v anglické literatuře označuje jako pass (bez českého ekvivalentu) a zpravidla nepostačuje k průniku do papilární dermis, k tomu je potřeba tzv. druhý pass, další dávky pak prohlubují obnažení dermis až do retikulární vrstvy. Aby mohlo dojít ke zhojení plochy ze spodiny je potřeba nepřekračovat úroveň retikulární dermis, ošetřená plocha má tedy charakter popáleniny II.stupně. Ke zhojení ad integrum dojde epitelizací ze zbytků bazální membrány v ploše v časovém horizontu 7-10 dní. Hojení plochy po laserovém resurfacingu prochází přes stejné fáze jako u jiného poranění, během hojení lze tedy pozorovat obvyklé fáze hojení, jsou to: inflamatorní fáze – vazodilatace, uvolnění cytokinů, migrace buněk, cca 3-10 dní proliferativní fáze - probíhá od 2-10 dne, dochází k proliferaci a migraci fibroblastů, keratinocytů a k reepitelizaci remodelační fáze – od 2-3 týdne, dochází k přestavbě a vyzrávání kolagenu, trvá několik měsíců Současně s přeepitelizováním epidermis dojde k remodelaci kolagenu v dermis, což vede ke zlepšení kožního reliéfu eliminací mělkých a středně hlubokých vrásek. Nevýhodou je přechodný erytém ošetřené plochy, který v některých případech přetrvává 3-6 měsíců. Erytém je projevem doznívající remodelační fáze zánětlivé reakce po laserovém ošetření. Ablace epidermis CO2 laserem v pulsním modu byla použita k obnažení dermis v souboru pacientů prezentovaných v této práci.

4.3 Interakce laseru a tkání Při dopadu laserového záření na povrch tkání dochází ve vzájemné interakci k několika dějům v závislosti na výkonu paprsku, délce působení a vlnové délce. Po dopadu laserového paprsku na živou tkáň mohou nastat 4 možné děje: odraz paprsku, průchod paprsku tkání, rozptyl a absorpce paprsku ve tkáni viz obr. 12.

46

Lasery v medicíně ___________________________________________________________________________

Obr. 12 – interakce laserového paprsku a tkáně, po dopadu nastane jedna ze 4 možností: odraz, rozptyl, průchod, nebo absorpce paprsku (převzato a upraveno z ACHAUER, B.M. Plastic Surgery Indications, Operations, and Outcomes, Mosby; 1 edition 2000, Volume I. , p 183-193, ISBN-10: 0815110197)

Důsledkem interakce laserového záření a tkáně jsou termální, mechanické a chemické změny ve tkáni. V souvislosti s těmito změnami rozlišujeme některé pojmy. Po absorpci paprsku tkání dochází primárně k termálním účinkům. Na rozdílné absorpci při průchodu paprsku tkání se významně podílejí tři složky: voda, hemoglobin a melanin, tzv. chromofory. Za chromofor je považována taková tkáňová struktura, kterou je laserové záření nejvíce absorbováno. Chromofory jsou však schopny pohltit jen záření o určité vlnové délce, čemuž odpovídá jejich absorpční spektrum. Míra absorpce záření tkání tedy ukazuje afinitu tkáně k danému laserovému záření / vlnové délce.

Obr. 13 – absorpční spektrum chromoforů kůže: melaninu, oxyhemoglobinu a vody (převzato a upraveno z: ACHAUER, B.M. Plastic Surgery Indications, Operations, and Outcomes, Mosby; 1 edition 2000, Volume I., p 183-193, ISBN-10: 0815110197)

47

Lasery v medicíně ___________________________________________________________________________ Termální změny: Rozsah termálních účinků závisí na absorpci záření a difuzi tepla do přilehlého okolí, vyzářená laserová energie se mění v tepelnou. Prohřátím tkáně lze dosánout koagulace, nebo odpaření tkáně (vaporizaci). Klíčovými faktory určujícími rozsah termálních účinků na tkáň jsou hustota energie, trvání laserového pulsu a tepelná vodivost. Čím je vlnová délka laseru kratší, tím je menší hloubka průniku do tkání, ale větší koncentrace energie v místě působení. V místě působení laseru vznikají různé termické zóny tkáňových škod od reverzibilních po ireverzibilní viz obr. 14. vaporizace – odpaření tkáně – dojde k němu v případě lokálního zvýšení teploty tkáně na 100oC, toho se využívá především k incizi fotokoagulace – bílkovinný rozpad a zastavení krvácení

Obr. 14 - zóny termálního poškození v místě působení laseru na tkáň (převzato a upraveno z: ACHAUER, B.M. Plastic Surgery Indications, Operations, and Outcomes, Mosby; 1 edition 2000, Volume I. , p 183-193, ISBN-10: 0815110197

48

Lasery v medicíně ___________________________________________________________________________

Obr. 15 - účinky laseru s ohledem na hustotu absorbovaného záření a dobu působení (převzato a upraveno z: JAVŮREK, J. Fototerapie biolaserem - léčebná metoda budoucnosti, Grada 1995, ISBN 80-7169-046-5)

Mechanické změny: Fotomechanický efekt je dán energií laseru. Jestliže trvání laserového pulsu je kratší než termální relaxační čas cílové tkáně, dojde k tzv. termoelastické expanzi. Termální relaxační čas je definován jako čas potřebný k tomu, aby tkáň absorbovala a přenesla termální energii záření specifické vlnové délky. kavitace / fotodisrupce (roztržení) – účinkem laseru dojde k prudkému ohřátí až na 10000 oC s uvolněním vodní páry a plynů (CO2), které výrazně zvýší tlak s výsledným roztržením a devastací zasažené tkáně, v místě působení se tak vytvoří konusovitý kráter Fotochemické změny: selektivní fototermolýza – jedná se o preferenční absorpci elektromagnetického záření ve tkáni (chromoforu) bez nežádoucího termického poškození okolní tkáně. fotochemická interakce – je navozena lasery vlnové délky v oblasti ultrafialového, či viditelného spektra. Dojde-li k uvolnění energie později než se v ozářeném místě zvýší teplota, vyvolá laser fotochemickou interakcí biologickou změnu 49

Lasery v medicíně ___________________________________________________________________________ fotochemická ablace – neobvykle čistý řez umožněný excimerovým laserem, účinku je dosaženo kombinací fotochemického postižení, vysokou povrchovou teplotou a vlnovou délkou, využití je především v oftalmologii ke korekci refrakčních vad (116)

50

Fibrinové lepidlo TISSUCOL KIT (Baxter AG) ___________________________________________________________________________

5 Fibrinové lepidlo TISSUCOL KIT (Baxter AG) Tissucol kit je dvousložkové fibrinové lepidlo. Obsahuje lyofilizovaný prášek Tissucol, který se rozpouští s roztokem aprotininu, čímž vzniká roztok TISSUCOL (složka 1) a dále obsahuje lyofilizovaný trombinový prášek, který se rozpouští s roztokem dihydrátu chloridu vápenatého, čímž vzniká roztok trombinu (složka 2). Jakmile jsou připraveny roztoky TISSUCOL (složka 1) a roztok trombinu (složka 2) v lahvičkách, je možno je smísit a aplikovat na povrchy tkání. Při smísení se vytvoří bílá elastická sraženina připomínající gel / želé. Sraženina vytvořená přípravkem TISSUCOL KIT je velmi podobná krevní sraženině. To znamená, že se rozpustí přirozenou cestou a nezanechává žádné zbytky. K prodloužení životnosti sraženiny se přidává hovězí aprotinin, aby se zabránilo jejímu předčasnému rozpuštění. TISSUCOL KIT obsahuje dva proteiny, které vyvolají srážení krve fibrinogen a trombin, oba se získávají ze směsné lidské plazmy. V okamžiku, kdy dojde ke kontaktu složek tkáňového lepidla, se ihned nastartuje proces polymerace (přeměna fibrinogenu na fibrin a jeho stabilizace). Polymerace má za následek ztuhnutí tkáňového lepidla v řádu sekund.

Obr. 16 – schéma použití tkáňového lepidla Tissucol (převzato z webové stránky http://www.baxter.cz/produkty/biofarmaceutika/vpois/letaky/dokumenty/tissucol_pil.pdf)

51

Fibrinové lepidlo TISSUCOL KIT (Baxter AG) ___________________________________________________________________________

Obr. 17 – dostupná balení tkáňového lepidla Tissucol (převzato z webové stránky http://www.baxter.cz/produkty/biofarmaceutika/vpois/letaky/dokumenty/tissucol_pil.pdf)

Toto fibrinové lepidlo je vyráběno k použití v těchto indikacích: • ke zlepšení hemostázy (zástavy krvácení) • jako tkáňové lepidlo ke zlepšení utěsnění nebo k podpoře sutur u různých chirurgických výkonů včetně vaskulárních a gastrointestinálních anastomóz • jako tkáňové lepidlo ke zlepšení pojivosti oddělených tkání (např. neštěpených transplantátů, štěpů, tkáňových transplantátů)

5.1 Kvalitativní a kvantitativní složení fibrinového lepidla Jedno balení přípravku TISSUCOL KIT obsahuje 5 lahviček s těmito látkami: 1) prášek TISSUCOL pro přípravu lepícího proteinového roztoku Humánní, ošetřený parou , po rozpuštění prášku obsahuje 1 ml roztoku TISSUCOL: proteinum humanum 100-130 mg, proteinum coagulabilis 75-115 mg, z toho fibrinogenum 70-110 mg a plasmafibronectinum 2-9 mg, factor coagulationis XIII 10-50 U2, plasminogenum 40-120 μg 2) aprotinin, rozpouštědlo pro prášek TISSUCOL Aprotininum, bovinum 3000 KIU/ml3 3) thrombin 4, prášek pro přípravu roztoku thrombinu Humánní, ošetřený parou, 1 ml rozpuštěného roztoku obsahuje: thrombinum humanum 4 IU4

52

Fibrinové lepidlo TISSUCOL KIT (Baxter AG) ___________________________________________________________________________ 4) thrombin 500, prášek pro přípravu roztoku thrombinu Humánní, ošetřený parou, 1 ml rozpuštěného roztoku obsahuje: thrombinum humanum 500 IU4 5) calcii chloridum dihydricum, rozpouštědlo pro přípravu roztoku thrombinu Calcii chloridum dihydricum 40 μmol/ml (4,4 mg/l) a pomocné látky

S ohledem na bovinní složky přípravku je potřeba před použitím u pacienta zjistit případné alergie. Informace zde použité byly převzaty z příbalového letáku (117).

53

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________

6 Experimentální část práce - Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk 6.1 Cíl práce Hlavním cílem práce bylo ověřit: - použitelnost autologních kožních buněk k léčbě vitiliga v kombinaci s ablací epidermis v léčené oblasti CO2 laserem - úspěšnost této terapie z pohledu stálosti repigmentace s časovým odstupem Vedlejším cílem práce bylo zjistit: - zda lze fibrinové lepidlo použít jako buněčný nosič pro transplantaci směsi kožních buněk u chirurgické léčby vitiliga

6.2 Materiál a metodika Pacienti Studie byla před svým zahájením schválena Etickou komisí FN Brno. Všichni zúčastnění pacienti byli seznámeni s obsahem studie a svůj souhlas se zařazením do studie potvrdili podpisem informovaného souhlasu, který byl rovněž schválen Etickou komisí FN Brno. Před zahájením léčby byli všichni pacienti standardně fyzikálně vyšetřeni a byla jim odebrána anamnéza s ohledem na dosavadní léčbu vitiliga (v kolika letech vznikla první léze, dosavadní terapie, problémy s kožním hojením, přítomnost vitiliga v rodině, onemocnění často asociovaná s vitiligem, atd.). Do studie byli zařazeni pacienti splňující tato kritéria: 1. pacienti s anamnézou neúspěšné konzervativní terapie 2. pacienti s vitiligem stabilním po dobu nejméně jednoho roku 3. pacienti bez anamnézy Kobnerova fenoménu (depigmentace po povrchním poranění kůže) 4. pacienti bez anamnézy hojení hypertrofickou či keloidní jizvou 5. pacienti starší 12 let 6. ženy ve studii nesměly být těhotné či kojící

54

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________ Charakteristika souboru pacientů: Ve studii bylo celkem 13 pacientů ve věku od 15 do 36 let. Celkem 10 žen a 3 muži. Průměrná doba vzniku vitiliga u pacientů v souboru byla v 10,2 letech. Nejmladší pacient měl 15 let, nejstarší 36 let, průměrný věk pacientů v souboru byl 26,8 let. Největší ošetřená jednotlivá léze měla velikost 42,7 cm2, nejmenší 0,8 cm2. U 2 pacientů byla ošetřena 1 léze, u 6 pacientů 2 léze a u 3 pacientů 3 léze a u 2 pacientů 4 léze. U 9 pacientů se jednalo o bilaterální typ vitiliga, u 4 pacientů o unilaterální rozložení lézí. Celkový přehled pacientů včetně velikosti a topografické lokalizace ošetřených lézí poskytuje tabulka 1.

pohlaví, pac věk

typ vitiligo vitiliga od unilat (let) / bilat

lokalizace a velikost (cm2) léčené plochy plocha 1

cm2

plocha 2

cm2

plocha 3

cm2

plocha 4

cm2

dist. předloktí vlevo

3,5

dist. předloktí vlevo

0,9

záda

0,6

1

žena, 29

9

B

pravý loket

22,8

levý loket

24,1

2

muž, 15

10

U

záda

11,8

záda

2,1

3

žena, 26

9

B

pravé koleno

9,3

levé koleno

12,1

4

žena, 18

10

B

prox. předloktí vlevo

10,1

prox. předloktí vlevo

4,4

5

žena, 26

13

B

pravé koleno 42,7

6

žena, 22

8

B

levé koleno

13,2 koleno vlevo

1,9

7

muž, 31

15

B

pravý loket

37,2

levý loket

28,8

8

žena, 29

14

U

břicho

1,0

záda

1,1

záda

0,8

9

žena, 24

10

B

prox. bérec vlevo

4,9

dist. bérec vlevo

4,4

pravý bérec

8,1

10

muž, 36

8

U

pravé koleno

9,6

pravý kotník

6,4

pravé koleno

8,4

11

žena, 31

3

U

sakrum

5,4

bérec vlevo

8,4

břicho

5,4

12

žena, 33

11

B

13

žena, 29

13

B

dorsum p. ruky

8,4

pravé koleno 41,5 dorsum p. ruky

3,2

Tab 1 – charakteristika pacientů ve studii

55

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________ Operace Zákrok byl proveden u všech pacientů během jednoho dne a skládal se ze tří na sebe navazujících kroků: krok 1 – odběr dermoepidermálního štěpu, krok 2 – zpracování štěpu v buněčné laboratoři, krok 3 – transplantace kožních buněk. krok 1 – odběr dermoepidermálního štěpu S ohledem na možné riziko depigmentace, či hyperpigmentace místa odběru byla jako donorská oblast u všech pacientů zvolena zadní strana stehna pod gluteofemorální rýhou nebo hýždě.

Podmínkou

byla

normální

pigmentace

kůže

v místě

odběru.

Odběr

dermoepidermálního štěpu byl u všech pacientů proveden v lokální anestezii 1 % Trimekainem (Mesocain 1%, Zentiva a.s.) elektrodermatomem (Zimmer). Velikost odebraného štěpu u všech pacientů byla 20-25 cm2, tloušťka štěpu byla 0,6–0,8 mm. Odběrová plocha byla po odběru kryta mastným tylem (Sanavel) a sterilním mulem, nebo neadherentním krytím Melolin (Smith & Nephew) a ponechána bez převazu do úplného zhojení. Dermoepidermální štěp byl bezprostředně po odběru uložen do transportního média MEM (Biotech a.s.) ve sterilní nádobě a transportován do buněčné laboratoře k dalšímu zpracování.

Současně se vzorkem kůže byla do laboratoře odeslána průhledná fólie se

zakresleným obrysem achromické plochy plánované k transplantaci. Obrys achromické plochy byl zakreslen permanentním fixem na nesterilní průsvitnou fólii běžně dostupnou pro kancelářské potřeby viz následující fotodokumentace.

Obr. 18 - zakreslení obrysu achromické plochy

Obr. 19 - zakreslený obrys achromické plochy na fólii

56

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________

Obr. 20 - lokální anestezie odběrové plochy

Obr. 21 – odběr dermoepidermálního štěpu

Obr. 22 - odběrová plocha po odběru

Obr. 23 - odebraný dermoepidermální štěp

krok 2 – zpracování štěpu v buněčné laboratoři Směs

autologních

kožních

buněk

byla

připravována

z odebraného

dermoepidermálního štěpu ve Tkáňové bance FN Brno. Odebraný štěp byl za aseptických podmínek v laminárním boxu třídy A mechanicky a následně enzymaticky rozvolněn trypsinem (Trypsin 0,25 %, PAN Biotech GmbH). Pro rozvolnění štěpu bylo potřeba trypsinaci opakovat v průměru 5x za stálého míchání v inkubátoru při teplotě 36,6 oC. Výsledkem tohoto procesu byl roztok obsahující jednotlivé kožní buňky. Získaná směs kožních buněk byla smísena s fibrinovým lepidlem Tissucol® (Baxter AG) a před ztuhnutím byla rozprostřena do požadovaného tvaru podle nákresu achromické plochy. Pro snadnější manipulaci a fixaci na těle pacienta byla u posledních 3 pacientů směs ponechána ke ztuhnutí na sterilní textilii. Celý proces separace kožních buněk trval přibližně 5 hodin.

57

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________

Obr. 24 - laminární box třídy A detail

Obr. 25 – mechanické rozvolnění štěpu

Obr. 26 - detail na mechanicky rozvolněný štěp

Obr. 27 – trypsinace v inkubátoru

Obr. 28 - výsledný produkt - směs buněk v Tissucolu

Obr. 29 - výsledný produkt - směs buněk v Tissucolu

58

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________

3 – transplantace kožních buněk Pro malý kontrast mezi pigmentovanou a nepigmentovanou kůží některých pacientů byl před vlastní ablací epidermis vyznačen obrys achromické léze na kůži permanentním fixem. Obnažení dermis v příjmové oblasti bylo u všech pacientů provedeno ablací epidermis CO2 laserem (Sharplan 40 C) v lokální anestezii 1 % Trimekainem (Mesocain 1%, Zentiva a.s.). Bylo použito obvyklé nastavení laseru pro resurfacing obličeje – 2 x pass 9,33 J/cm2, 14 W. Druhá dávka laseru (pass) byla aplikována na léčenou kožní plochu po setření suché substance po prvním ošetření s částečnou defokusací paprsku. Výsledná suchá substance po laserovém resurfacingu byla z kožního povrchu setřena tampónem s antiseptickým roztokem BETADINE® roztok (EGIS Pharmaceuticals Ltd., nebo Octenisept® (farblos Schülke & Mayr GmbH) a na takto připravenou achromickou plochu byla aplikována připravená směs autologních kožních buněk v Tissucolu. U pacientů, kde byla směs buněk připravena

na

sterilní

textilii,

byla

textilie

fixována

ke

kůži

několika

stehy

Prolenem 5/0 (Ethicon). U ostatních pacientů bez tohoto vylepšení byl přes směs kožních buněk v Tissucolu rozprostřen mastný tyl (Sanavel), který byl rovněž v několika okrajových bodech fixován ke kůži stehy. Jako další vrstva krytí rány byly u jedenácti pacientů použity sterilní čtverce zvlhčené Ringerovým roztokem, nebo neadherentí krytí TenderWet 24 (Hartmann). Vlhké čtverce nebo krytí TenderWet pacienti měnili v intervalu 24 hod, ke zvlhčení obvazového materiálu používali Ringerův roztok. U dvou pacientů byla zatransplantovaná plocha kryta transparentním obvazem s vysokým obsahem vody Hydrosorb (Hartmann). Toto krytí pacienti ponechali do první kontroly bez převazu. Poslední fixační vrstvu v případě ošetření lézí na končetinách tvořil elastický obvaz vázaný s lehkým stupněm komprese od distálního konce končetiny. Kontrola pacientů byla prováděna po 7 a 14 dnech od zákroku, pacienti byli instruováni kontaktovat lékaře při jakýchkoliv potížích souvisejících s léčbou.

59

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________

Obr. 30 - ablace epidermis CO2 laserem

Obr. 31 – olupující se suchá substance (termicky destruovaná vrstva kůže) na povrchu

60

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________

Obr. 32 - aplikace suspenze buněk v tissucolu na obnaženou dermis

Obr. 33 - suspenze buněk v Tissucolu ztuhlá na sterilní textilii, fixace ke kůži stehy

61

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________ Hodnocení repigmentací Stupeň repigmentace byl hodnocen škálou 1-5: 1 excelentní (repigmentace na 95-100 % povrchu ošetřené léze) 2 dobrá (repigmentace na 65-94 % povrchu ošetřené léze) 3 částečná (repigmentace na 20-64 % povrchu ošetřené léze) 4 špatná (repigmentace na 1-19 % povrchu ošetřené léze) 5 žádná (repigmentace na 0 % povrchu ošetřené léze)

6.3 Výsledky Pacienti byli zváni na kontrolu za 7 a 14 dní a za 4-6 měsíců po zákroku ke zhodnocení výsledků terapie. Část pacientů se navíc dostavila ke kontrole i s delším časovým odstupem. U některých pacientů bylo ošetřeno více menších lokalit současně - viz charakteristika souboru pacientů. S ohledem na topografickou lokalizaci lézí byla nejčastěji ošetřenou lokalitou kolena a trup. Ve vztahu úspěšnosti repigmentací k lokalitě byla léčba nejvíce úspěšná v oblasti loktů a kotníků viz graf 1.

Topografie všech ošetřených a repigmentovaných lokalit

1 1

kotník

1

bérec

1

kolena

lokalita

2

repigmentovaných

0

ruce

1

0

předloktí

5

celkem

1 2 2

loket 1

trup 0

1

3 2

3

4

5

6

počet pacientů

Graf 1 – topografické rozložení všech ošetřených a repigmentovaných lokalit v souboru pacientů

62

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________ 6.3.1

Hojení odběrové plochy Odběrová plocha byla zhojena u všech pacientů epitelizací ze spodiny bez komplikací

během 12-15 dnů od odběru dermoepidermálního štěpu. U všech pacientů byla zhojená odběrová plocha první 3-4 měsíce narůžovělá a do jednoho roku od odběru byla odběrová plocha prakticky nerozeznatelná od okolí u 11 pacientů, u 1 pacienta došlo k přechodné hyperpigmentaci odběrové plochy a u 1 pacientky došlo k trvalé depigmentaci odběrové plochy, viz obr. 34-36.

Obr. 34 - zhojená odběrová plocha : A - mírný erytém 4 měsíce po zhojení, B - rok po zákroku již odběrová plocha není patrná

Obr. 35 - trvalá depigmentace po odběru štěpu

Obr. 36 - přechodná hyperpigmentace po odběru štěpu

63

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________ 6.3.2

Hojení transplantované plochy Hojení transplantované plochy probíhalo zcela bez komplikací u 11 pacientů ze 13

zúčastněných ve studii, u zbývajících 2 pacientů bylo hojení komplikováno lehkou inflamací. Všichni pacienti s nekomplikovaným průběhem měli transplantovanou plochu krytou vlhkými čtverci, nebo krytím TenderWet (Hartmann). Při kontrole po týdnu od zákroku byla transplantovaná plocha kryta suchou krustou ze zbytků fibrinového lepidla, při kontrole za další týden byla plocha již přeepitelizovaná s ojedinělými krustami. Pigmentace byly spolehlivě patrny nejdříve za 5-6 týdnů od zákroku. Průběh hojení lze pozorovat na sekvenci snímků (obr. 37–44), která je pro názornost vybrána u jednoho pacienta na stejném místě. Jedná se o lézi v oblasti pravého lokte u jednoho z prvních ošetřených pacientů v souboru, odstup mezi operací a finálním snímkem je 74 měsíců. Fotografie zachycují stav před ošetřením (obr. 37), bezprostředně po ablaci epidermis CO2 laserem (obr. 38), bezprostředně po transplantaci buněk (obr. 39), první, druhý a třetí týden po ošetření (obr. 40-42). Na obrázcích 43 a 44 je tatáž plocha po delší době od zákroku.

Obr. 37 - achromická plocha pravého lokte

Obr. 38 – stav bezprostředně po ablaci epidermis

64

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________

Obr. 39 - stav bezprostředně po transplantaci buněk

Obr. 40 – stejná plocha týden po zákroku

Obr. 41 – stejná plocha 2 týdny po zákroku

Obr. 42 – stejná plocha 3 týdny po zákroku

65

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________

Obr. 43 - stejná plocha 38 měsíců po zákroku

Obr. 44 – stejná plocha 74 měsíců po zákroku

Léčená plocha měla po 14 dnech u všech pacientů růžovou až načervenalou barvu, u prvních pacientů byl okraj plochy ohraničen bílým achromickým lemem. Tento lem byl patrný tehdy, pokud byla ablace epidermis provedena exaktně v achromické ploše. Při resurfacingu s přesahem do pigmentované kůže tento lem nevznikal.

Obr. 45 – achromická plocha v oblasti kolene 14 dní po ablaci epidermis CO2 laserem a transplantaci autologních melanocytů, v okraji patrný achromický lem

66

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________ U dvou pacientů ve studii byl ke krytí transplantované plochy použit transparentní hydrokoloidní obvaz Hydrosorb (Hartmann). Tento kryt byl použit ve snaze zlepšit komfort pacientů v pooperačním období, aby nebylo nutné léčené plochy převazovat. V obou případech došlo lokálně k lehké inflamaci všech léčených ploch s následnou pozánětlivou hyperpigmentací ve všech ložiscích. Jelikož byl pooperační průběh u obou pacientů shodný, tedy s lokální inflamací, u dalších pacientů již toto krytí použito nebylo. U jednoho z těchto pacientů došlo k hyperpigmentaci ložisek v těsné blízkosti plochy repigmentované stejnou terapií před šesti měsíci, ale s použitím

krytu TenderWet. Průběh hojení s následnou

hyperpigmentací je vidět v časové posloupnosti na obr. 46-49.

Obr. 46 – achromická ložiska pravého kolene v okolí repigmentované plochy (ohraničené modře)

Obr. 47 – hydrokoloidní krytí

Obr. 48 - nález týden po zákroku, léčená ložiska s lehkou inflamací

Obr. 49 – pozánětlivá hyperpigmentace

67

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________ 6.3.3

Repigmentace ošetřených ploch S ohledem na erytém běžně přítomný po každém resurfacingu CO2 laserem bylo

hodnocení časných známek repigmentace velmi problematické jak je patrno na obr. 50-54. Na ztíženém hodnocení se podílela i skutečnost, že většina nemocných s vitiligem se účinně chrání před UV zářením a mají velmi světlou kůži

Obr. 50 - achromické léze kolene před ošetřením

Obr. 51 – stejná oblast týden po ošetření

Obr. 52 - stejná oblast 4 měsíce po ošetření

Obr. 53 - stejná oblast 62 měsíců po ošetření

68

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________ Na sekvenci obrázků 50-53 je v časové posloupnosti zachycena léčená léze u pacientky v oblasti kolene. Počáteční snímek dokumentuje nález před zákrokem, obr. 51 nález při nekomplikovaném způsobu hojení týden po zákroku, obr. 52 pak stejnou oblast 4 měsíce po zákroku se zřetelně patrným lehkým erytémem a výsledný nález 62 měsíců po ošetření. Jiným příkladem obtížně hodnotitelných výsledků v prvních měsících po ošetření je u pacienta na obr. 54.

Obr. 54 – pac. s mírným erytémem ošetřené plochy 3 měsíce po zákroku s obtížně hodnotitelným stupněm pigmentace. Přestože počáteční erytém navozuje iluzi pigmentace, s delším časovým odstupem se ukázalo, že k pigmentaci nedošlo.

Ke spolehlivě rozlišitelné repigmentaci došlo u 5 pacientů ze 13 pacientů ve studii, což představuje úspěšnost 38 % ve sledovaném období do 6 měsíců od zákroku. Průměrná doba, kdy bylo možné spolehlivě odlišit pigmentace od erytému v léčené oblasti u těch pacientů, kde k pigmentaci došlo, byla 5,4 týdnů od zákroku. Nejdříve byly pigmentace patrné za 4 a nejpozději za 8 týdnů, viz graf 2.

69

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________ Výskyt prvních pigmentací v týdnech od zákroku 5

4

pacient

4

5

3

8

2

týdny od zákroku

4

1

6 0

2

4

6

8

10

týdny od zákroku

Graf 2 – výskyt prvních známek repigmentace v týdnech od zákroku u úspěšně léčených pacientů v souboru

Úplná repigmentace (v 95-100 % léčené plochy) byla dosažena u dvou pacientů, jeden z nich měl s tímto výsledkem ošetřeny tři léze ve dvou dobách. Dobrá repigmentace (v 65-94 % léčené plochy) byla dosažena u jednoho pacienta a částečná repigmentace (v 20-64 % léčené plochy) byla dosažena u dvou pacientů v souboru. U zbývajících osmi pacientů po odeznění erytému repigmentace ploch nebyla patrná, viz graf 3 a tabulka 2.

Stupeň repigmentace u pacientů ve studii do 6 měsíců od zákroku 2 (15%)

1 (8%)

excelentní (95-100%) dobrá (65-94%) částečná (20-64%)

2 (15%) 8 (62%)

špatná (1-19%) žádná

0 (0%)

Graf 3 – stupeň repigmentace ošetřených lézí u všech pacientů v souboru

70

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________

Tab 2 – přehled všech pacientů, léčených ploch a stupně repigmentací v % (úspěšně léčení pacienti jsou vyznačeni oranžovou barvou)

Fototerapii, která je pro stimulaci melanogeneze důležitá, podstoupili po zákroku pouze 4 pacienti převážně z důvodů nedostupnosti této terapie v místě bydliště. Zajímavý je fakt, že u 3 z těchto 4 pacientů, kteří fototerapii postoupili, došlo k repigmentaci ošetřených lézí.

71

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________ 6.3.4

Fotodokumentace pacientů s repigmentací ošetřených ploch Následující sekvence snímků zachycuje léčené léze pacientů, u kterých došlo

k pigmentaci. U všech těchto pacientů jsou seřazeny vedle sebe snímky před léčbou a po léčbě s uvedením časového odstupu a s hodnocením repigmentace dle škály užité ve studii. V záhlaví je vždy uveden věk a pohlaví pacientů. Pacient 1 (žena, 29 let) Hodnocení repigmentace 6 měsíců od zákroku: částečná > 20-64 %

Obr. 55 – pravý loket před a 5 měsíců po zákroku

Obr. 56 – levý loket před a 5 měsíců po zákroku

72

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________ Pacient 2 (muž, 31 let) Hodnocení repigmentace 6 měsíců od zákroku: částečná > 20-64 %

Obr. 57 – pravý loket před a 74 měsíců po zákroku

Obr. 58 – levý loket před a 74 měsíců po zákroku

73

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________ Pacient 3 (žena, 29 let) Hodnocení repigmentace 6 měsíců od zákroku: excelentní > 95-100 %

Obr. 59 – léze pod umbilikem před a 10 měsíců po zákroku

Obr. 60 – léze na zádech před a 10 měsíců po zákroku

Obr. 61 – léze na zádech před a 10 měsíců po zákroku

74

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________ Pacient 4 (žena, 24 let)

Hodnocení repigmentace 6 měsíců od zákroku: dobrá > 65-94 %

Obr. 62 - léze na přední straně pravého bérce před a 4 měsíce po zákroku

Obr. 63 - léze na přední straně levého bérce před a 4 měsíce po zákroku

75

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________ Pacient 5 (muž, 36 let) Hodnocení repigmentace 6 měsíců od zákroku: excelentní > 95-100 %

Obr. 64 – achromická léze pravého kolene stav před a 8 měsíců po zákroku

Obr. 65 – stejná léze jako na obr 64, ošetření zbývajících achromických plošek v okolí s hyperpigmentací 5 měsíců po další etapě ošetření

Obr. 66 – výsledný stav před a 76 měsíců po terapii, hyperpigmentace se ztratila, barva připomíná barvu okolí, dokonce došlo k pigmentaci kožního ochlupení

76

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________

Obr. 67 – léze v oblasti kotníku pravé nohy před a 5 měsíců po zákroku

6.3.5

Mikroskopické vyšetření Během zpracování dermoepidermálního štěpu bylo provedeno mikroskopické

vyšetření směsi kožních buněk a buněk v Tissucolu pomocí nativní mikroskopie. U dvou pacientů po úspěšné repigmentaci byl k histologickému vyšetření odebrán bioptický vzorek z repigmentované léze a následně vyšetřen pomocí světelné a elektronové mikroskopie. Vyšetřením byla ověřena normální stavba kůže v místě terapie po zhojení a přítomnost melanocytů produkujících pigment, viz následující snímky s komentářem.

Obr. 68 A, B – separované buňky ve fibrinovém lepidle Tissucol. Jelikož se nachází volně v tekutém prostředí zaujímají nejvýhodnější tvar – tvar koule. Nativní mikroskopie zvětšení 100x

77

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________

Obr. 69 - směs separovaných kožních buněk po trypsinaci před smísením s fibrinový lepidlem. V cytoplazmě některých hvězdicovitých buněk lze identifikovat pigmentová zrna. Nativní mikroskopie, zvětšení 150x.

Obr. 70 - histologické vyšetření biopsie kůže z úspěšně repigmentované léze pacienta s vitiligem, na přehledném zvětšení je patrna normální stavba kůže. Barvení hematoxylin-eosin, zvětšení 120x

78

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________

Obr. 71 – Transmisní elektronová mikroskopie kožní biopsie repigmentované léze pacienta s vitiligem. Na snímku je zachycena skupina melanocytů s jádry, v cytoplazmě svazky tonofilament, četná granula pigmentu. Buněčná membrána vybíhá v četné, často prstovité výběžky, zvětšení 4000x.

Obr. 72 – Transmisní elektronová mikroskopie kožní biopsie repigmentované plochy: v cytoplazmě jsou četné svazky příčně i podélně orientovaných tonofilament, mezi nimi malé mitochondrie, četné volné ribosomy, nákroj jádra, zvětšení 8000x.

79

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________

6.4 Výsledky dotazníkového šetření S časovým odstupem čtyř až šesti let po transplantaci nekultivovanými autologními keratinocyty byli pacienti zapojení ve studii kontaktováni a obesláni dotazníkem ke zjištění dlouhodobých výsledků repigmentace. Ze 13 pacientů zúčastněných ve studii se nepodařilo navázat kontakt se 2 pacienty trvale žijícími mimo ČR. Dotazník pro pacienty byl vypracován v pilotní verzi a vyplněn při ambulantní kontrole s jedním z pacientů ze studie, jeho připomínky byly použity k přepracování dotazníku tak, aby byl pro laiky srozumitelný a snadno vyplnitelný. Dotazník měl dvě části, první byla zaměřena na anamnestická data pacientů s ohledem na různé teorie příčin vzniku vitiliga (hereditární zátěž, autoimunitní poruchy, stres iniciující vznik vitiliga apod.). Druhá část byla zaměřena na zhodnocení podstoupené chirurgické terapie a jejího výsledku s časovým odstupem. Součástí dotazníku byla i průhledná fólie k zakreslení obrysu léčené plochy v případě, že nedošlo k pigmentaci, nebo pokud plocha znovu depigmentovala. Celý dotazník včetně návodu na zakreslení plochy je v příloze této práce, výsledky dotazníkového šetření jsou v následujícím textu. 6.4.1

Výsledky dotazníkového šetření část 1.:

1.Výskyt vitiliga u prarodičů Ve sledovaném souboru respondentů neměl vitiligo nikdo z prarodičů. 2. Výskyt vitiliga u rodičů Výskyt vitiliga byl zaznamenán u otce jedné respondentky, všichni ostatní respondenti měli negativní rodinnou anamnézu na výskyt vitiliga. 3. Výskyt vitiliga u sourozenců Všichni respondenti měli zdravé sourozence. 4. Máte některé z těchto onemocnění? Atopický ekzém – ne u všech respondentů Porucha funkce štítné žlázy – ano u čtyřech respondentů, z toho se u dvou jednalo o hypofunkci a u dvou o hyperfunkci Anemie – ano u dvou respondentů Diabetes mellitus – ne u všech respondentů

80

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________ Adisonova choroba – ne u všech respondentů Alergie – nějaký druh alergie byl zaznamenán u čtyřech respondentů Výskyt onemocnění u pacientů s vitiligem atopický ekzém

11

Adisonova choroba

11

cukrovka (diabetes)

11

snížené množství červených krvinek (anémie)

2

ano ne

9

porucha funkce štítné žlázy

4

7

alergie

4

7

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Graf 4 – přehled sledovaných onemocnění asociovaných s výskytem vitiliga u pacientů v souboru

5. Byl(a) jste vyšetřen(a) na přítomnost protilátek proti buňkám tvořících kožní pigment (melanocytům)? ne - u všech respondentů 6. Předcházelo vzniku vitiliga nějaké onemocnění? Dva respondenti uvedli ano, u jednoho se jednalo o spálu, u dalšího o opakované angíny.

Předcházelo vzniku vitiliga nějaké onemocnění?

2 18%

ano ne

9 82%

Graf 5 – výskyt onemocnění předcházejících vzniku vitiliga u pacientů v souboru

81

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________ 7. Předcházel vzniku vitiliga psychický, nebo fyzický stres? (pokud ano popište druh stresu např. úmrtí blízké osoby, rozvod rodičů, extrémní fyzická zátěž při atletických závodech, spálení kůže u moře apod.) Mimo jednu respondentku, která dává vznik vitiliga do souvislosti se stresem při rozvodu rodičů (vitiligo od 3 let věku) odpověděli všichni respondenti ne. 8. Vyberte prosím Váš kožní fototyp dle popisu. Ve skupině respondentů převládal fototyp II. a III. typu: fototyp I. – 0, fototyp II. - 5, fototyp III. - 5 a fototyp IV. – 1 pacient.

Rozložení fototypu u všech pacientů 6 5

počet pacientů

5

5 fototyp I.

4

fototyp II.

3

fototyp III.

2 1

1 0

fototyp IV.

0 fototyp I.

fototyp II.

fototyp III.

fototyp IV.

Graf 6 – zastoupení kožních fototypů u pacientů v souboru

Vztaženo na úspěšnost léčby byl fototyp u 5 respondentů s úspěšnou repigmentací po léčbě zastoupen s touto četností: 1 repigmentovaný pacient měl fototyp II., ostatní 4 repigmentovaní pacienti měli fototyp III.

82

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________

Rozložení fototypu u pacientů s úspěšnou repigmentací 5 4

počet pacientů

4

fototyp I.

3

fototyp II. fototyp III.

2 1 0

fototyp IV.

1 0 fototyp I.

0 fototyp II.

fototyp III.

fototyp IV.

Graf 7 – zastoupení kožních fototypů ve skupině pacientů, u kterých došlo po léčbě k pigmentaci

9. Pracujete s toxickými látkami? Kromě jedné pacientky, která udávala blíže nespecifikovanou zátěž toxickými látkami v práci v minulosti, byla odpověd negativní u všech respondentů jak v minulosti, tak v současnosti. Pacientka, která uvedla kontakt s toxickými látkami v bývalé práci, měla vitiligo od 3 let věku, takže rovněž bez souvislostí.

6.4.2

Výsledky dotazníkového šetření část 2.:

1. Stupeň repigmentace léčených ploch 4 roky od zákroku K hodnocení repigmentací byla použita stejná škála, jako při hodnocení 6 měsíců od zákroku. Stupeň repigmentace hodnotili pacienti dle popsané škály odhadem. Tyto dlouhodobé výsledky u všech 11 pacientů shrnuje graf 7. Z šetření vyplynulo, že pigmentace nejsou stabilní v čase. U dvou pacientek došlo k částečné depigmentaci původně repigmentovaných ploch po terapii: u jedné pacientky z plochy repigmentované na 95-100 % na 1-19 % povrchu a u další pacientky z repigmentace na 20-64 % povrchu léze na 1-19 %, viz graf 8. Ke spontánní repigmentaci nedošlo u žádného z pacientů. U pacienta, kde bylo zhojení ploch komplikováno pozánětlivou hyperpigmentací došlo ke sjednocení barvy s barvou okolní kůže.

83

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________

Stupeň repigmentace u pacientů ve studii po čtyřech a více letech od zákroku

2 (18%) excelentní (95-100%)

0 (0%)

dobrá (65-94%)

1 (9%)

částečná (20-64%) špatná (1-19%)

6 (55%)

žádná 2 (18%)

Graf 7 – stupeň repigmentace ploch s odstupem několika let

Stabilita repigmentací po 4 letech

dosažený stupeň repigmentace

100% 90% 80% 70% 60%

po 0,5 roce

50%

po 4 letech

40% 30% 20% 10% 0% 1

2

3

4

5

pacient

Graf 8 - Porovnání stupně repigmentace léčených ploch u pěti úspěšně léčených pacientů ukazuje opětovnou depigmentaci u dvou pacientů

2. Pokud léčené plochy zpigmentovaly, došlo k jejich opětovné depigmentaci? U dvou pacientek po přechozí repigmentaci došlo k opětovné částečné depigmentaci léčených ploch za 10 a 12 měsíců od zákroku viz graf 8.

84

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________ 3. Došlo po operaci k vytvoření nových lézí vitiliga někde na těle? U tří pacientů došlo k vytvoření nových lézí, nové léze byly u dvou z těchto pacientů difuzně po těle u jedné pacientky v podpaží.

Výskyt nových lézí po zákroku

ano 3

0%

ne 8

20%

40%

60%

80%

100%

Graf 9 - 3 pacienti z 11 uvedli po ošetření aktivaci onemocnění a výskyt nových lézí jinde na těle

4. Změnily se po zákroku neoperované léze vitiliga někde na těle? Dva pacienti udali zhoršení ostatních lézí, ostatní nepozorovali zhoršení ani zlepšení lézí jinde na těle.

Pooperační změny neoperovaných lézí vitiliga

0 0%

2 18% ano, zlepšení ano, zhoršení ne

9 82%

Graf 9 - po ošetření došlo ke zhoršení ostatních lézí na těle u 2 pacientů, zlepšení nedošlo u žádného z pacientů

85

Experimentální část práce – Chirurgická terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk ___________________________________________________________________________ 5. Jak ovlivnila operace Váš sociální život, nebo psychickou kvalitu života? Šest pacientů neudalo žádnou změnu - přitom z těchto šesti pacientů byla léčba v ošetřených lézích u dvou úspěšná, jeden pacient uvedl částečné zlepšení (repigmentace obou loktů), dva pacienti se stupněm repigmetnace 95-100 % uvedli výrazné zlepšení. 6. Změnilo se Vaše používání krémů s UV filtrem po operaci? Osm pacientů uvedlo stejné návyky, dva pacienti začali používat více UV protektivních přípravků. 7.Prodělal(a) jste po zákroku nějaké závažné onemocnění? Pokud ano jaké? Jedna pacientka uvedla operaci štítné žlázy pro tyreotoxikózu, ostatní pacienti žádné vážné onemocnění neuvedli. 8. Doporučil(a) byste vyzkoušet chirurgickou terapii jiným pacientům s vitiligem? Osm pacientů by léčbu doporučilo, dva ne. U obou pacientů, kteří by léčbu nedoporučili došlo po ošetření lézí k výskytu nových lézí. Třetí pacient, u kterého došlo po ošetření k výskytu nových lézí by léčbu přesto doporučil s komentářem – pokud to někomu může pomoci.

86

Diskuse ___________________________________________________________________________

7 Diskuse Chirurgická léčba vitiliga je obtížná a její úspěch nelze spolehlivě předvídat. Příčina je ve skryté podstatě a komplexnosti onemocnění, takže se většina terapeutických zásahů omezuje jen na projevy onemocnění - ložiskové depigmentace.

V řadě terapeutických

možností stojí chirurgická terapie až na posledním místě a měla by ji vždy předcházet neúspěšná terapie konzervativní. Chirurgická terapie zahrnuje řadu použitelných postupů, jejichž společným pojítkem je přenos autologních melanocytů do achromických kožních ložisek. Výběr chirurgické metody by měl respektovat rozsah a topografickou lokalizaci lézí, dosavadní terapeutickou historii pacienta. Dalšími faktory jsou materiální a personální možnosti pracoviště, na kterém je pacient léčen. Zvláště postupy vyžadující separaci kožních buněk a event. expanzi autologních melanocytů kultivací vyžadují specializované vybavení buněčné laboratoře a erudovaný personál se zkušenostmi v tkáňovém bankovnictví. Na chirurgickou terapii nejlépe reagují pacienti s unilaterálním (segmentálním) typem vitiliga (118), v prezentovaném souboru pacientů se však tato zkušenost nepotvrdila. Úspěšnost terapie u pacientů s bilaterálním (generalizovaným) typem vitiliga, byť stabilním, je obecně nižší, uvádí se asi 50 % úspěšnost (96, 119, 120). Stran úspěšnosti chirurgické terapie s ohledem na topografické umístění achromických lézí nejhůře repigmentují akrální části těla, místa nad klouby, oční víčka, rty, kožní záhyby, genitál a dorsa rukou a nohou (120). Tento poznatek vzhledem k malému počtu pacientů v souboru nelze ani povrdit, ani vyvrátit. Obecně nejdůležitějším předpokladem úspěšné chirurgické terapie vitiliga je stabilita onemocnění. Pro stabilitu onemocnění svědčí především unilateralita onemocnění, léze bez známek progrese za poslední dva roky, spontánní repigmentace, pozitivní minigraft test a absence koebnerizace (výpadek pigmentu po poranění). Tyto známky stability onemocnění jsou dnes již obecně přijímány jako vstupní kriteria k chirurgické léčbě a byly stanoveny na základě empirických zkušeností s chirurgickými postupy. Výběr pacienta vhodného k terapii vyřazením pacientů s nestabilní formou vitiliga je mnohdy obtížný. Pacienti hnaní touhou po odstranění lézí uvádí někdy i úmyslně stabilitu onemocnění, aby nebyli lékařem k léčbě odmítnuti. V tomto ohledu by měl pomoci zvláště minigraft test (120) v současnosti doporučovaný jako rutinní začátek jakékoliv chirurgické terapie vitiliga. V době realizace této práce na něj nebyl kladen takový důraz a tento test v léčeném souboru pacientů proveden nebyl. Je pravděpodobné, že striktní provedení minigraft testu u všech pacientů by vedlo k lepší selekci pacientů a větší úspěšnosti chirurgické terapie v souboru.

87

Diskuse ___________________________________________________________________________ I úspěšná léčba a repigmentace kožních ložisek nemusí být pacientem přijata kladně. Repigmentovaný okrsek kůže bývá při bližším zkoumání zpravidla částečně odlišitelný od okolní zdravé kůže a sjednocení vzhledu může trvat řadu let. Pacientova očekávání je tedy nutno vždy konfrontovat s touto realitou, protože většina pacientů staví do popředí kosmetické hledisko a ne ochranu před vlivy UV záření. Stejně tak je potřeba upozornit pacienty před zahájením léčby, že i úspěšná repigmentace nemusí být trvalá a v případě reaktivace onemocnění může dojít k nové depigmentaci (119, 121), což se potvrdilo v prezentovaném souboru pacientů při dlouhodobém sledování. Za zamyšlení a další zkoumání stojí určitě výběr vhodného krytí rány, respektive finálního produktu zpracování autologních kožních buněk (fibrinového lepidla obsahujícího kožní buňky na dermabradované kožní ploše). Jak bylo uvedeno ve

výsledcích,

změnou

krytí došlo k hyperpigmentaci všech léčených ploch (celkem 4 plochy) u 2 pacientů, u kterých byla tato změna provedena. Tyto hyperpigmentace kosmeticky stejně rušivé jako hypopigmentace se s odstupem několika let barevně takřka sjednotily s barvou okolní kůže. Nabízí se otázka, zda tuto náhodně objevenou zkušenost neověřit na dalších pacientech a naopak nevyužít ve prospěch pacientů. Svou roli v pozadí těchto hyperpigmentací pravděpodobně hraje lehká inflamace, která hojení u obou pacientů provázela. Otázkou je, nakolik k hyperpigmentaci přispěla i možná menší ztráta přenesených buněk do obvazového materiálu a nakolik je tato zkušenost dílem náhody. Samotná inflamace bez dodání melanocytů k pigmentaci nevede, což prokázal Naeyaert a spolupracovníci v randomizované, dvojitě slepé studii (122). Důležitá je i následná fototerapie po provedení zákroku. Z výsledků dosažených v prezentovaném souboru pacientů se zdá, že fototerapie sehrála ve stimulaci repigmentace ošetřených ploch významnou roli. Celkem podstoupili fototerapii 4 ze 13 ošetřených pacientů a u 3 z těchto 4 pacientů došlo k repigmentaci. Fototerapii po tomto druhu ošetření lze tedy doporučit jako součást léčebného postupu. Využití fibrinového lepidla Tissucol jako buněčného nosiče lze nalézt u rekonstrukcí defektů kloubní chrupavky, kde je Tissucol využíván obdobným způsobem k uchování vitálních kultivovaných chondrocytů před jejich vhojením do defektu. Obecně lze říci, že zkušenosti s použitím Tissucolu coby buněčného nosiče v publikacích zabývajících se touto problematikou (123, 124) jsou podobné jako jsou zkušenosti s jeho použitím v této práci.

88

Shrnutí a závěr ___________________________________________________________________________

8 Shrnutí a závěr V klinické studii byla zkoumána použitelnost modifikovaného postupu chirurgické terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk, úspěšnost terapie a stálost pigmentací s delším časovým odstupem v případě repigmentace. Jednalo se o kombinaci transplantace autologních, trypsinací separovaných nekultivovaných kožních buněk ve fibrinovém lepidle Tissucol a ablaci epidermis v léčené oblasti CO2 laserem. Byla ověřena praktická použitelnost Tissucolu jako buněčného nosiče k uchování vitálních kožních buněk, popsán a vyzkoušen způsob, kterým lze léčbu u pacientů realizovat v ambulantním režimu ošetřování. Bylo ověřeno, že fibrinové lepidlo lze použít jako buněčný nosič pro suspenzi separovaných kožních buněk u chirurgické léčby vitiliga. Suspenze kožních buněk získaná trypsinací pigmentovaného vzorku kůže smísená s fibrinový lepidlem Tissucol svou soudržností snadno vymezuje prostor, ve kterém je směs buněk potřeba dočasně udržet. Současně nebrání integraci buněk do dermabradované kožní plochy ani přeepitelizování obnažené dermis. Manipulace se suspenzí buněk ve fibrinovém lepidle Tissucol je snadná, výhodou je jednoduché přizpůsobení do potřebného tvaru a možnost fixace ke kůži v léčené lokalitě při jejím zapracování na sterilní textilii. Histologické vyšetření bioptických vzorků z úspěšně léčených repigmentovaných ploch prokázalo fyziologickou stavbu kůže a přítomnost melanocytů s granuly pigmentu. Úspěšnost chirurgické terapie vitiliga je obtížně předvídatelná, v souboru pacientů ve studii byla terapie úspěšná u 38 % pacientů v období do 6 měsíců od zákroku. U 2 pacientů bylo dosaženo pigmentace na 95 - 100 % léčené plochy, u 1 pacienta na 65 - 94 % léčené plochy a u 2 pacientů na 20 – 64 % léčené plochy. U zbývajících 8 pacientů k pigmentaci ošetřené plochy nedošlo. I přes úspěšnou repigmentaci achromických ploch po zákroku nemusí být pigmentace trvalé. S odstupem let může onemocnění přejít do aktivní fáze a může dojít k depigmentaci již repigmentovaných ploch a rozšíření stávajících lézí, přestože bývá uváděna relativní stabilita repigmentací (119, 121). U 40% úspěšně léčených pacientů ve studii došlo k aktivaci onemocnění a částečné depigmentaci repigmentovaných ploch při sledování v období 4 - 6 let od operace. Pečlivá selekce pacientů dle dnes již empiricky ověřených vstupních kriterií pro chirurgickou terapii a zvláště minigraft test mohou pomoci vybrat pacienty s větší šancí na úspěšnou repigmentaci. Repigmentace v ošetřených lézích lze pozorovat nejdříve za 5-6 týdnů po ošetření. S ohledem na dočasný erytém po laserovém resurfacingu je hodnocení pigmentací někdy obtížné, proto je s definitivním vyhodnocením léčby vhodné vyčkat 4-6 měsíců. Přestože je soubor pacientů

89

Shrnutí a závěr ___________________________________________________________________________ v provedené studii malý, zdá se, že fototerapie po zákroku zvyšuje šanci na repigmentaci léčených ploch. U pacientů, u kterých bylo léčeno více ploch současně nebo ve dvou dobách, byla úspěšnost léčby ve všech léčených lokalitách stejná, z toho lze usoudit, že klíčovým faktorem k úspěšné repigmentaci u zkoumaného způsobu terapie je reálná aktivita onemocnění. Chirurgická

terapie

přenosem

nekultivovaných

autologních

kožních

buněk

ve fibrinovém lepidle Tissucol do achromických kožních lézí dermabradovaných CO2 laserem je metoda použitelná v klinické praxi u pacientů se stabilní formou vitiliga, vhodná spíše pro lokalizované formy vitiliga menšího rozsahu.

90

Souhrn ___________________________________________________________________________

Souhrn Vitiligo je získané onemocnění neznámé etiologie, u kterého dochází k vymizení pigmentových buněk – melanocytů z kůže, což má za následek tvorbu ostře ohraničených, depigmentovaných ložisek na kůži a slizničních přechodech. Depigmentovaná (achromická) ložiska mají různou velikost a tvar, bývají přecitlivělá vůči slunečnímu záření a mohou se měnit v průběhu pacientova života. Onemocnění se vyskytuje celosvětově s prevalencí okolo 1-2 % s lokálními rozdíly bez ohledu na pohlaví, věk či rasovou příslušnost. Etiologie tohoto onemocnění je složitá a nebyla dosud spolehlivě objasněna, spekuluje se o genetických vlivech, autoimunitě, neurologických faktorech, toxických metabolitech a dalších příčinách. Přestože achromická ložiska postrádají přirozenou ochranu kožního pigmentu vůči slunečnímu záření, má onemocnění zpravidla benigní charakter a jeho význam spočívá hlavně ve stigmatizaci a ve vážných psychosociálních problémech pacientů v každodenním životě. Pacienti trpí sníženým sebevědomím, sociální izolovaností, narušením interpersonálních vztahů v práci a v soukromém životě. Protože kauzální terapie není dostupná, terapeutické zásahy jsou cíleny na zastavení progrese onemocnění a repigmentaci achromických ploch. V současnosti je dostupná konzervativní a chirurgická terapie. Konzervativní terapie je metodou první volby a zahrnuje lokální i systémovou léčbu kortikoidy, systémovou léčbu cyklosporiny, vitamíny, fyzikální fototerapii UVA a UVB zářením, fotochemoterapii a kombinované terapie (lokálně aplikovaná steroidní externa + UVA záření). Chirurgická terapie vitiliga by měla být použita až po neúspěšném vyčerpání konzervativních možností léčby. Principem všech metod chirurgické terapie vitiliga je transplantace autologních melanocytů ve formě jednotlivých buněk, nebo tkání, či jejich částí do achromických kožních ložisek. Jedná se o transplantace okrsků kůže v plné tloušťce různé velikosti (tzv. punch grafting, minipunchgrafting), transplantace dermoepidermálních štěpů, transplantace epidermis, vlasových foliklů, směsi nekultivovaných kožních buněk separovaných

trypsinací,

nekultivovaných.

či

transplantaci

pouze

melanocytů

kultivovaných,

nebo

Uvedené metody mají porovnatelné výsledky, poslední jmenované,

založené na transplantaci jednotlivých buněk, spadají mezi tzv. buněčné terapie. Jsou náročnější na provedení a personálně-technické vybavení, vyžadují erudovaný personál se zkušenostmi v tkáňovém bankovnictví a příslušné technické zázemí, proto jsou celosvětově málo rozšířené. Přestože byla publikována řada technik buněčné terapie vitiliga,

91

Souhrn ___________________________________________________________________________ dosud neexistuje „univerzálně oblíbená“ technika, jednotlivé modifikace mají své výhody a nevýhody. Cílem této práce bylo ověřit klinickou studií použitelnost modifikovaného postupu chirurgické terapie vitiliga přenosem autologních kožních buněk, úspěšnost terapie a stálost pigmentací s delším časovým odstupem v případě repigmentace. Jednalo se o kombinaci transplantace autologních, trypsinací separovaných nekultivovaných kožních buněk ve fibrinovém lepidle Tissucol a ablaci epidermis v léčené oblasti CO2 laserem.Ve studii bylo celkem 13 pacientů ve věku od 15 do 36 let. Celkem 10 žen a 3 muži. Průměrná doba vzniku vitiliga u pacientů v souboru byla v 10,2 letech. Nejmladší pacient měl 15 let, nejstarší 36 let, průměrný věk pacientů v souboru byl 26,8 let. Největší ošetřená jednotlivá léze měla velikost 42,7 cm2, nejmenší 0,8 cm2. Všichni pacienti zůčastnění ve studii měli anamnézu neúspěšné konzervativní terapie, vstupní podmínkou k terapii byla stabilita onemocnění po dobu nejméně 1 roku a absence koebnerizace (výpadku pigmentu po poranění). Zákrok byl prováděn ambulantně v lokální anestezii během jednoho dne a skládal se ze tří na sebe navazujících kroků: 1) odběru dermoepidermálního štěpu, 2) zpracování štěpu v buněčné laboratoři, 3) transplantace kožních buněk. Odběr dermoepidermálního štěpu z místa zachovalé kožní pigmentace byl u všech pacientů proveden elektrodermatomem z oblasti hýždí, nebo ze zadní strany stehna. Dermoepidermální štěp byl následně mechanicky a trypsinací rozvolněn na směs jednotlivých kožních buněk, která byla smísena s fibrinovým lepidlem Tissucol, které sloužilo jako buněčný nosič. Směs buněk v Tissucolu byla aplikována na achromické kožní léze zbavené epidermis pomocí CO2 laseru. Pacienti byli kontrolováni v intervalech za 7 a 14 dní a za 4 - 6 měsíců po zákroku ke zhodnocení výsledků terapie. Hojení odběrových i transplantovaných ploch probíhalo u všech pacientů bez větších komplikací, obě místa byla kompletně přeepitelizována do 2 týdnů od operace. Pigmentace byly spolehlivě rozeznatelné nejdříve za 5 - 6 týdnů od zákroku, hodnocení do značné míry komplikoval erytém přítomný po ablaci epidermis CO2 laserem. Terapie ve studii byla úspěšná u 38 % pacientů v období do 6 měsíců od operace. U 2 pacientů bylo dosaženo pigmentace na 95 - 100 % léčené plochy, u 1 pacienta na 65 - 94 % léčené plochy a u 2 pacientů na 20 – 64 % léčené plochy. U zbývajících 8 pacientů k pigmentaci ošetřené plochy nedošlo. V dlouhodobém sledování 4 - 6 let od zákroku došlo u 2 z původně úspěšně léčených pacientů k částečné depigmentaci. Klinickou studií byla ověřena použitelnost fibrinového lepidla Tissucol coby buněčného nosiče pro suspenzi separovaných kožních buněk u chirurgické léčby vitiliga. Tissucol svou soudržností vymezuje prostor, ve kterém je

92

Souhrn ___________________________________________________________________________ směs buněk potřeba dočasně udržet a současně nebrání integraci transplantovaných buněk do dermabradované kožní plochy ani přeepitelizování obnažené dermis. Histologické vyšetření bioptických vzorků z úspěšně léčených repigmentovaných ploch prokázalo v souladu s klinickým obrazem fyziologickou stavbu kůže a přítomnost melanocytů s granuly pigmentu. Pacienty je před léčbou nutné upozornit na fakt, že terapie není kauzální a případný dobrý výsledek nemusí být trvalý. Dojde-li k aktivaci onemocnění, mohou repigmentované plochy znovu depigmentovat. Pečlivá selekce pacientů, dle dnes již empiricky ověřených vstupních kriterií pro chirurgickou terapii vitiliga může pomoci vybrat pacienty s větší šancí na úspěšnou repigmentaci. Jsou to tato kritéria: pacienti nereagující na konzervativní terapii, pacienti s lézemi stabilními nejméně 1 rok na ploše do 30 % tělesného povrchu, pacienti bez známek hojení hypertrofickou nebo keloidní jizvou v anamnéze, pacienti s absencí koebnerizace (ztráta pigmentu po poranění), a zejména pacienti s pozitivním minigraft testem (repigmentace v okolí 4 - 5 punch graftů pigmentované kůže 1 - 2 mm v průměru do achromického ložiska). Chirurgická

terapie

přenosem

nekultivovaných

autologních

kožních

buněk

ve fibrinovém lepidle Tissucol do achromických kožních lézí dermabradovaných CO2 laserem je metoda použitelná v klinické praxi u pacientů se stabilní formou vitiliga, vhodná spíše pro lokalizované formy vitiliga menšího rozsahu.

93

Summary ___________________________________________________________________________

Summary Vitiligo is an idiopathic acquired skin disorder caused by the disappearance of pigment cells – melanocytes from skin that causes the rise of well defined white patches on the skin and mucous membranes. Depigmented (achromic) lesions are of various size and shape and they are more sensitive to sunburn and can change during patient´s life. The disease occurs worldwide in about 1-2 % of the population with regional diferences, regardless of gender, age or race. Etiology of this disease is complex and unknown to these days, but it might involve the impact of genetic factors, autoimmunity, neurologic factors, toxic metabolites and other causes. Even though the achromic leasion are without natural protection of skin pigment against the sun radiation, this disease is of

benign character. Its

importance is

in stigmatization of patients and serious psychosocial problems in patient´s daily life. Since a casual treatment is not available, current modalities are aimed at stopping progression and repigmentation of achromic leasion. Conservative (medical) and surgical treatment of vitiligo is available today. Conservative treatment is the method of first choice and includes several therapeutic options, for example: local and systemic corticosteroids treatment, systemic cyclosporine treatment, phototherapy by UVA and UVB radiation, photochemotherapy and combined therapy (local aplication of steroides + UVA phototerapy). Surgical treatment should be performed on patients after conservative treatment has failed. All techniques of surgical treatment are based on autologous melanocytes grafting. Separated skin cells, skin tissues or part of skin tissue can be grafted into achromic skin leasions. It is grafting of fulllthickness skin grafts (punch grafting or minipunchgrafting), grafting of splitthickness skin grafts, grafting of epidemis, hair follicle grafting, grafting of noncultured skin cells separated by trypsinization, or grafting of melanocytes cultured or noncultured only. All of these methods give comparable results, the last method is based on separating of skin cells grafting and it belongs to so-called cellular therapy. These methods are more difficult and they require technical equipment and personal educated in tissue banking. Due to those facts, this cellular treatment is not so common worldwide. Even though many techniques of cellular therapy of vitiligo were published, there isn´t a „universally favourite“

technique. Each published technique has its advantages and

disadvantages. The aim of this work was to verify modificated surgical treatment of vitiligo by autologous skin cells grafting by clinical study and evaluate the effectiveness of this treatment

94

Summary ___________________________________________________________________________ and long-lasting results (stability of repigmentation). It was a combination of autologous skin cells grafting separated by trypsinization in tissue glue Tissucol and removal of the epidermis in the CO2 laser treated area. There were 13 patients in this study aged between 15–36 years, 10 women and 3 men. The average age of vitiligo onset by patients in the study was in 10.2 years. The youngest patient was 15 and the oldest patient was 36 years old, the avarage age of patients in study was 26.8 years. The largest treated skin leasion was 42.7 cm2, and the smallest leasion was 0.8 cm2. All the patients in the study had had an unsuccesfull medical treatment history. The including criteria for patients were: stable vitiligo for more than 1 year and absence of Koebner phenomenon (loss of pigment after skin trauma). The operation was performed on patients in local anesthesia in one day, and was composed of 3 steps: 1) takiing of pigmented splitthickness skin graft, 2) processing of skin in tissue bank, 3) grafting of skin cells. The taking of split thickness skin graft was performed by electrodermatom from pigmented skin on buttock, or posterior thigh in all patients. Splitthickness skin graft was incubated in trypsin to seaparate the skin cells and after that the fibrin glue Tissucol was added into this mixture of separated skin cells. The suspension of skin cells in Tissucol was applied onto achromic skin leasion previously dermabraded by CO2 laser. Patients were checked on after 7 and again in 14 days and after 4-6 months after surgery to evaluate the treatment. The healing of grafted and donor sites were without serious trouble with all patients, both sites were completely healed

in 2 weeks after surgery.

The pigmentation of skin was clearly visible first after 5-6 weeks after surgery. The evaluating of repigmentation was complicated by erythema of skin caused by a CO2 laser that had been previously used. In the clinical study the treatment was successful with 38 % of all patients in a period of 6 months after surgery. The repigmentation up to 95-100 % was observed on 2 patients, repigmentation up to 65-94 % was observed on 1 patient and the repigmentation up to 20-64 % on 2 patients. There was no sign of repigmentation of treated lesions on the 8 other patients in the study. Previously successfuly repigmented area of skin partial loss of pigment on 2 patients in the long-term follow-up (4-6 years after surgery). The useability of fibrin glue Tissucol like a cellular carier for separated skin cells for surgical treatment of vitiligo was confirmed by clinical study. The fibrin glue Tissucol by his cohesion limited space for skin cells in which the cells should stay and currently don´t blockade the integration of grafted cells in to the skin and reepithelization of denuded dermis. It is important to inform patients before they undergo the treatment, that this therapy is not causal and that the possible repigmentation after therapy may by not be everlasting.

95

Summary ___________________________________________________________________________ If the disease becomes active in the future, the repigmented skin can be depigmented again. The careful selection of patients by todayś empirically verified entrance criteria for surgical treatment of vitiligo can aid in choosing the best candidates for this treatment. The criteria is as it follows: patients nonresponsive to medical therapy, patients with stable vitiligo for more than 1 year with depigmented leasions of maximum 30 % of total body surface, patients with no tendency for scar or keloid formation, patient with absence of Koebner phenomenon (loss of pigment after skin trauma) and the most important thing is a positive minigraft test (repigmentation of depigmented skin after 4-5 punch graft of pigmented skin 1-2 mm in diameter grafted in to depigmented area). Surgical treatment of vitiligo by grafting of autologous noncultured skin cells in fibrin glue Tissucol in to achromic skin leasion previously dermabraded by CO2 laser is an efficient method for patients with stable form of vitiligo,suitable mainly for

the localised

and the forms of vitiligo which aren´t widely spread.

96

Vysvětlivky ___________________________________________________________________________

Vysvětlivky zkratek použitých v textu ASP

Agouti signální protein

DLQI

Dermatologický index kvality života

DNA

Deoxyribonukleová kyselina

DPD

Pozdní ztmavnutí

ET-1

Endothelin-1

IPD

Okamžité ztmavnutí

MEM

Minimální esenciální médium

MHC-II

Třída II hlavního histokompatibilního komplexu

PAUVA

Fotochemoterapie (kombinace fenylalanin a ultrafialové záření typ A)

PUVA

Fotochemoterapie (kombinace psoralen a ultrafialové záření typ A)

PUVASOL

Terapie psoraleny a současná expozice slunečnímu záření

RNA

Ribonukleová kyselina

SNARE

Akronym z anglického soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein receptor

UV

Ultrafialové

UVA

Ultrafialové záření typ A

UVB

Ultrafialové záření typ B

UVC

Ultrafialové záření typ C

α-MSH

α-melanocyty stimulující hormon

β-FGF

Fibroblastový růstový faktor

97

Seznam literatury ___________________________________________________________________________

Seznam literatury 1

NJOO, M.D.; WESTERHOF, W. Vitiligo Pathogenesis and Treatment. Am J Clin Dermatol 2001; 2 (3):167-181

2

DRAKE, L.A.; DINEHART, S.M.; FARMER, E.R.; et al. Guidelines of care for vitiligo. American Academy of Dermatology. Journal of the American Academy of Dermatology 1996; 35(4):620-6.

3

ANDERSON, R.T.; RAJAGOPALAN, R. Defelopment and validation of a quality of life instrument for cutaneous diseases. Journal of the American Academy of Dermatology 1997; 37, 41-50.

4

SEHGAL, V, N; SRIVASTAVA, G. Vitiligo: Compendium of clinico-epidemiological features. Indian J Dermatol Venereol Leprol 2007;73(3):149-56

5

StemCell, Project Under NAIP, Faqs [online]. 2009 [cit. 2009-08-07]. Dostupný z WWW:

6

Stem Cell Basics: What are the unique properties of all stem cells? . In Stem Cell Information [World Wide Web site]. Bethesda, MD: National Institutes of Health, U.S. Department of Health and Human Services, 2009 [cit. 2009-07-10] Dostupný z WWW:

7

Wikipedia contributors, 'Stem cell', Wikipedia, The Free Encyclopedia [online]. , 200906-28 [cit. 2009-07-10]. Dostupný z WWW:

8

LERNER, A.B.; HALABAN, R.; KLAUS, S.N.; et al. Transplantation of human melanocytes. J Invest Dermatol 1987; 89(3): 219-224

9

MULEKAR, S.V. Melanocyte-keratinocyte cell transplantation for stable vitiligo. International Journal of Dermatology 2003; 42, 132-136

10

RULCOVÁ, J.; POSPÍŠILOVÁ, A.; VLAŠÍN, Z. Předběžné výsledky šetření a léčby tranpslantací autologních melanocytů u skupiny 43 nemocných vitiligem. Československá dermatologie, Česká republika, Praha, . ISSN 0009-0514, 2001, vol. 76, no. 4, s. 178-182.

11

POSPÍŠILOVÁ, A; RULCOVÁ, J; VLAŠÍN, Z; a spol. Léčba vitiliga transplantací autologních melanocytů. Derma 3.tisícročia, Slovenská republika, Bratislava, I, 2p. 512. ISSN 1335-7913. 2001. NK4741, research and development project.

12

GEEL, N.; ONGEANE, K.; DE MIL, M.; et al. Modified technique of autologous noncultured epidermal cell transplantation for repigmenting vitiligo: A pilot study. Dermatol Surg 2001; 27: 873-876.

98

Seznam literatury ___________________________________________________________________________ 13

Wikipedie: Otevřená encyklopedie: Kůže [online]. c2009 [cit 2009-07-10]. Dostupný z WWW:

14

LAVKER, R.M.; SUN, T.T. Heterogeneity in epidermal basal keratinocytes: morphological and functional correlations. Science. 1982 Mar 5;215(4537):1239-41

15

ČECH, S. MedAtlas [online]. 2.1. Brno : Lékařská fakulta, Masarykova univerzita Brno, 2006 [cit. 2009-02-11]. Available from www:

16

KLIKA, E.; et al. Histologie. 1st ed. Avicenum, 1986., Kožní systém, p. 480-483.

17

Wikipedia contributors, 'Melanocyte', Wikipedia, The Free Encyclopedia, 2009 [cit 2009-07-10]. Dostupný z WWW:

18

LAM DO PHUONG UYEN; DUNG HOANG NGUYEN; EUN-KI KIM. Mechanism of Skin Pigmentation. Biotechnology and Bioprocess Engineering 2008, 13: 383-395

19

WOLFF, K.; STINGL, G. The Langerhans cell. J Invest Dermatol. 1983 Jun;80 Suppl:17s-21s

20

HALATA, Z.; GRIM, M.; BAUMANN, K.I. Merkelova buňka: morfologie, vývojový původ, funkce. Čas. Lék. čes., 142, 2003, No. 1, pp. 4-9.

21

GARTNER, L.P.; HIATT, J.L. Color textbook of histology, 2nd ed. Philadelphia: W.B. Saunders, 2001

22

LORENTZ, A.; SCHUPPAN, D.; GEBERT, A.; et al. Regulatory effects of stem cell factor and interleukin-4 on adhesion of human mast cells to extracellular matrix proteins. Blood. 2002 Feb 1;99(3):966-72

23

SONTHEIMER, R.D.; MATSUBARA, T.; SEELIG, L.L. A macrophage phenotype for a constitutive, class II antigen-expressing, human dermal perivascular dendritic cell. J Invest Dermatol. 1989 Jul;93(1):154-9

24

POSPÍŠILOVÁ, A.; RULCOVÁ, J.; VLAŠÍN, Z.; et al. Konzervativní a chirurgická léčba vitiliga. Derma 3. tisícročia, 2001, roč. 1, č. 1, s. 16-19.

25

MURRAY, R.K.; GRANNER, D.K.; MAYES, P.A.; et al., Harperova Biochemie, Nakladatelství a vydavatelství H&H 2002, ISBN 80-7319-013-3

26

BOSSCHE, K.; NAEYAERT, J. M.; LAMBERT, J. The quest for the mechanism of melanin transfer.Traffic (2006) 7: 769-778.

27

SCOTT, G.; LEOPARDI, S.; PRINTUP, S.; et al. Filopodia are conduits for melanosome transfer to keratinocytes. J. Cell Sci. (2002) 115: 1441-1451.

99

Seznam literatury ___________________________________________________________________________ 28

JIMBOW, K.; QUEVEDO, J.R.; FITZPATRICK, T.B.; et al. Some aspects of melanin biology: 1950-1975. J. Invest. Dermatol. (1976) 67: 72-89.

29

BOLOGNIA, J.L.; PAWELEK, J. M. Biology of hypopigmentation. J. Am. Acad. Dermatol. (1988) 19: 217-255.

30

CHAKRABORTY, A.K.; FUNASAKA, Y.; SLOMINSKI, A.; et al. UV lights and MSH receptors. Ann. N. Y. Acad. Sci. (1999) 885: 100-116.

31

SOLANO, F.; BRIGANTI, S.; PICARDO, M.; et al. Hypopigmenting agents: an updated review on biological, chemical and clinical aspects. Pigment Cell Res., 2006, 19: 550-571.

32

SZABO, G. The regional anatomy of the human integument with special reference to the distribution of hair follicles, sweat glands and melanocytes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (1967) B 252: 447-485.

33

CAYCE, K.A.; MCMICHAEL, A.J.; FELDMAN, S.R. Hyperpigmentation: An Overview Of the Common Afflictions. Dermatology Nursing. 16(5):401-406, 413-416, October 2004

34

SORIANO, T.; GRIMES, P.E. Post-Inflammatory Hyperpigmentation, Color Atlas of Chemical Peels 2006, Part III page 177, ISBN 978-3-540-21279-9

35

TOMITA, Y.; MEDA, K.; TAGAMI, H. Mechanisms for hyperpigmentation in postinflammatory pigmentation, urticaria pigmentosa and sunburn. Dermatologica (1989) 179 (Suppl.1) 49-53

36

ABELIOVICH, D.; GELMAN-KOHAN, Z.; SILVERSTEIN, S.; et al. Familial cafe au lait spots: a variant of neurofibromatosis type 1. J Med Genet. Dec 1995;32(12):985-6.

37

ANNE, L.; JOHN, T. Adverse Drug Reactions. 2nd ed. Pharmaceutical Press, (2006) London, UK.

38

KLEIBL, Z. Xeroderma pigmentosum (XP). [online]. , 28.07.2002 [cit. 2008-10-28]. Available from www:

39

CHANG, C.H. Incontinentia Pigmenti. [online]. , Apr 6, 2007 [cit. 2009-02-11]. Available from www:

40

Wikipedia contributors, 'Albinism', Wikipedia, The Free Encyclopedia [online]., 2009 [cit 2009-06-15]. Dostupný z WWW:

41

JANJUA, S.A.; KHACHEMOUNE, A.; GULDBAKKE, K.K. Piebaldism: a case report and a concise review of the literature. Cutis; Cutaneous Medicine For The Practitioner 80, no. 5 (November 2007): 411-414.

100

Seznam literatury ___________________________________________________________________________ 42

BERNSTEIN, H.H. General Medical Questions. [online]. , Sep 26, 2004 [cit. 2009-0123]. Available from www:

43

WHITE, S.W.; GORMAN, C.R. Idiopathic Guttate Hypomelanosis. [online]. , Jan 12, 2007 [cit. 2008-10-29]. Available from www:

44

CROWE, M.A. Pityriasis Alba. [online]. , Oct 8, 2009 [cit. 2009-09-10]. Available from www:

45

RASHID, R.M.; MILLER, A.C. Pityriasis Alba. [online]. , Jun 11, 2009 [cit. 2009-0801]. Available from www:

46

PUGLIESE, J.M.; MOREY, A.F.; PETERSON, A.C. Lichen Sclerosus: Review of the Literature and Current Recommendations for Management. J Urol (2007) 178 (6): 2268-2276.

47

YESUDIAN, P.D.; SUGUNENDRAN, H.; BATES, C.M. et al. Lichen sclerosus. Int J STD AIDS (2005)16 (7): 465-473.

48

FEIT, J., et al. Atlas dermatopatologie [online]. , 2009 [cit. 2009-02-16]. Available from www:

49

BURKHART, C.G.; GOTTWALD, L. Tinea Versicolor. [online]. , Sep 25, 2009 [cit. 2009-09-26]. Available from www:

50

Wikipedia contributors, 'Tinea versicolor', Wikipedia, The Free Encyclopedia, 2009 [cit 2009-08-10], Available from www:

51

MOSHER, D.B.; FITZPATRICK, T.B.; ORTONNE J.P.; et al. Disorders of pigmentation. In: Fitzpatrick TB, Freedberg IM, editors. Fitzpatrick's dermatology in general medicine. 5th ed. New York: McGraw-Hill, Health Professions Division, 1999:945-55

52

MAJUMDER, P.; NORDLUND, J.; NARTH, S. Pattern of familial aggregation of vitiligo. Arch. Dermatos. 129, s.994-998

53

JIMBOW, K. Vitiligo therapeutic advances. Dermatol Clin. 1998;16:399-407.

54

GRIMES, P.: Vitiligo: a new classification and therapy. Br. J. Dermatos. 113, 1977, s 47-52

55

LERNER, A. Vitiligo. J Invest Dermatol 1959; 32: 285-310

101

Seznam literatury ___________________________________________________________________________ 56

BHATIA, P.S.; MOHAN, L.; PANDLEY, N.; et al. Genetic nature of vitiligo. J Dermatol Sci 1992; 4: 180-4

57

SCHALLREUTER, K.U.; LEMKE, R.; BRANDT, O.; et al. Vitiligo and other diseases: koexistence or true association? Hamburg study on 321 patients. Dermatology 1994; 188:269-75

58

KIM, S.M.; CHUNG, H.S.; HANN, S.K. The genetics of vitiligo in Korean patients. Int J Dermatol 1998; 38: 908-10

59

MOHR, J. Vitiligo in a pair of monoovular twins. Acta Genet Stat Med 2: 1951; 252-5

60

NARTH, S.K.; MAJUMDER, P.P.; NORDLUND, J.J. Genetic epidemiology of vitiligo: multilocus recessivity crossvalidated. Am J Genet, 1994, 55, p. 981-990.

61

CUI, J.; ARITA, Y.; BYSTRYN, J.C.; Cytolytic antibodies to melanocytes in vitiligo. J Incest Dermatol 1993; 100: 812-5

62

PARK, Y.K.J.; KIM, N.S.; HANN, S.K.; et al. Identification of autoantibody to melanocytes and characterization of vitiligo patients. J Dermatol Sci, 1996, 11, p. 111120.

63

POSPÍŠILOVÁ, A.; VLAŠÍN, Z.; RULCOVÁ, J. Vitiligo - etiologie, klinický obraz a současné možnosti léčby. Česko-slovenská dermatologie, 2001, roč. 76, č. 1, s. 43-48.

64

TRAVIS, L.B.; Weinberg, J.M.; SILVERBERG, N.B. Successful Treatment of Vitiligo With 0.1% Tacrolimus. Ointment Arch Dermatol. 2003;139(5):571-574.

65

LE POOLE, I.C.; DAS, P.K.; VAN DEN WIJNGAARD, R.M.; et al. Review of the etiopathomechanism of vitiligo: a convergence theory. Exp Dermatol 1993; 2:145-53

66

LERNER, A.B.; SNELL, R.S.; CHANCO-TURNER, M.L.; et al. Vitiligo and sympathectomy. The effect of sympathectomy and alpha-melanocyte stimulating hormone. Arch Dermatos 1966; 94: 269-78

67

NELHAUS, G. Acquired unilateral vitiligo and poliosis of the head and subacute encephalitis with partial recovery. Neurology 1970; 20: 965-74

68

GROYSMAN, V.; SAMI, N. Vitiligo. [online]. , Aug 8, 2008 [cit. 2009-02-12]. Available from www: <emedicine.medscape.com/article/1068962-overview>

69

ARENBERGER, P. Vitiligo. Seznam zpracovaných standardů oboru Dermatovenerologie [online]. , 2009 [cit. 2009-08-01]. Available from www:

70

GROYSMAN, V.; NAVEED, S. Vitiligo: Differential Diagnoses & Workup. [online]. , Aug 8, 2008 [cit. 2009-08-01]. Available from www:

102

Seznam literatury ___________________________________________________________________________ 71

MILLINGTON, G.W.M.; LEVELL, N.J. Vitiligo: the historical curse of depigmentation. International Journal of Dermatology. 46(9):990-995, September 2007.

72

SHAFFRALI, F.C.; GAWKRODGER, D.J. Management of vitiligo. Clin Exp Dermatol. 2000;25:575-579.

73

NJOO, M.D.; BOSSUYT, P.M.; WESTERHOF, W. Management of vitiligo: results of a questionaire among dermatologists in the Netherlands. Int J Dermatol. 1999;38:866872.

74

ONGENAE, K.; DIERCKXSENS, L.; BROCHEZ, L.; et al. Quality of life and stigmatization profile in a cohort of vitiligo patients and effect of the use of camouflage. Dermatology 2005: 210: 279-285.

75

BOEHNCKE, W.H.; OCHSENDORF, F.; PAESLACK, I.; et al. Decorative cosmetics improve the equality of life in patients with disfiguring skin diseases. Eur J Dermatol 2002: 12: 577-580.

76

HOLME, S.A.; BEATTIE, P.E.; FLEMING, C.J. Cosmetic camouflage advice improves quality of life. Br J Dermatol 2002: 147: 946-949.

77

FINLAY, A.Y.; KHAN, G.K.: Dermatology Life Quality Index (DLQI) : a simple practical measure for routine clinical use; Clinical and Experimental Dermatology 1994; 19: 210-216

78

VASSILEVA, S.; HRISTAKIEVA, E. Medical applications of tattooing, Clinics in Dermatology, Volume 25, Issue 4, July-August 2007, Pages 367-374, ISSN 0738-081X, DOI:10.1016/j.clindermatol.2007.05.014.http://www.sciencedirect.com/science/article/ B6T5G-4PD0CGN-5/2/dfa4d8f44a5ff23b5ef756b1c482c803)

79

SINGH, A.K.; KARKI, D. Micropigmentation: Tattooing for the treatment of lip vitiligo, Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery, In Press, Corrected Proof, Available online 28 May 2009, ISSN 1748-6815, DOI:0.1016/j.bjps.2009.03.013. (http://www.sciencedirect.com/science/article/B7XNJ4WD11703/2/1f19bb364c76e945 0e53d5d53238a422)

80

HALDER, R.M.; PHAM, H.N.; BREADON, J.Y.; et al. Micropigmentation for the treatment of vitiligo. Dermatol Surg Oncol 1989 Oct;15:1092e8.

81

MAHAJAN, B.B.; GARG, G.; GUPTA, R.R. Evaluation of cosmetic tattooing in localized stable vitiligo, J Dermatol 29 (2002), pp. 726-730.

82

CENTER, J.M.; MANCINI, S.; BAKER, G.I.; et al. Management of gingival vitiligo with the use of a tattoo technique, J Periodontol 69 (1998), pp. 724-728.

83

TANIOKA, M.; MIYACHI, Y. Camouflage for vitiligo, Dermatologic Therapy 2009; 1 (22): 90-93, Wiley Periodicals, Inc.

84

LOTTI, T.; HERCOGOVÁ, J. Vitiligo Problems and Solutions. 1st ed. New York : Marcel Dekker Inc., 2004. , p. 348-349. ISBN 0-8247-4305-9. 103

Seznam literatury ___________________________________________________________________________ 85

ZABAWSKI, E.J.; COSTNER, M.; COHEN, J.B.; et al. Tacrolimus: pharmacology and therapeutic uses in dermatology. Int J Dermatol. 2000;39:721-727.

86

HARTMANN, A.; BRÖCKER, E.; BECKER, J.C.; Hypopigmentary Skin Disorders Current Treatment Options and Future Directions. Drugs 2004; 64 (1): 89-107

87

MATZ, H.; TUR, E. Vitiligo. Curr Probl Dermatol. 2007;35:78-102.

88

MENCHINI, G.; LOTTI, T.; TSOURELI-NIKITA, E. UV-B narrowband micro phototherapy. In: Lotti T, Hercogova J, eds. Vitiligo: Problems and Solutions. New York, NY: Marcel Dekker; 2004:323-34.

89

CHUAN, M.T.; TSAI, Y.J.; WU, M.C. Effectiveness of psoralen photochemotherapy for vitiligo. J Formos Med Assoc. 1999;98:335-340.

90

WILDFANG, I.L.; JACOBSEN, F.K.; THESTRUP-PEDERSEN, K. PUVA treatment of vitiligo: a retrospective study of 59 patients. Acta Derm Venereol. 1992;72:305-306.

91

AL-ABOOSI, M.M.; AJAM, Z.A. Oral photochemotherapy in vitiligo: follow-up, patient compliance. Int J Dermatol. 1995;34:206-208.

92

Medical and physical treatments Systemic and local PUVA-therapy. [online]. , 2009 [cit. 2009-08-28]. Available from www:

93

Wikipedia contributors. Khellin [online]. Wikipedia, The Free Encyclopedia; 2009 [cit 2009-08-28]. Available from:

94

Wikipedia contributors. Trioxsalen [online]. Wikipedia, The Free Encyclopedia; 2009 [cit 2009-08-28]. Available from:

95

PASSERON, T.; OSTOVARI, N.; ZAKARIA, W.; et al. Topical tacrolimus and the 308-nm excimer laser: a synergistic combination for the treatment of vitiligo. Arch Dermatol. Sep 2004;140(9):1065-9.

95

LOTTI, T.; PRIGNANO, F.; BUGGIANI, G. New and experimental treatments of vitiligo and other hypomelanoses. Dermatol Clin. Jul 2007;25(3):393-400, ix.

96

FALABELLA, R.; ARRUNATEGUI, A.; BARONA, M.I.; et al. The minigrafting test for vitiligo: detection of stable lesions for melanocyte transplantation. J Am Acad Dermatol 1995; 32: 228-32

97

WESTERHOF, W.; BOERSMA, B. The minigrafting test for vitiligo: detection of stable lesions for melanocyte transplantation. J Am Acad Dermatol 1995; 33: 1061-2

98

WESTERHOF, W.; LÖNTZ, W.; VANSCHEIDT, W.; et al. Vitiligo: news in surgical treatment. European Academy of Dermatology and Venereology JEADV (2001) 15, 510511 104

Seznam literatury ___________________________________________________________________________ 99

BOERSMA, B.R.; WESTERHOF, W.; BOS, J.D. Repigmentation in vitiligo vulgaris by autologous minigrafting: results in nineteen patients. J Am Acad Dermatol 1995; 33:990-5

100 AGARWAL, U.S.; JAIN, D.; GULATI, R.; et al. Silicone Gel Sheet Dressings for Prevention of Post-Minigraft Cobblestoning in Vitiligo. Dermatol Surg 1999; 25:102104 101 SACHDEV, M.; SHANKAR, D.S. Dermatologic surgery: pulsed erbium:YAG laserassisted autologous epidermal punch grafting in vitiligo. Int J Dermatol 2000; 39 (11): 868-71 102 GHORPADE, A. Use of tissue glue for punch grafting in vitiligo - A preliminary report. Indian J Dermatol Venereol Leprol 2004;70:159-61. 103 FALABELLA, R. Epidermal grafting: an original technique and its application in achromic and granulating areas. Arch Dermatol 1971; 107: 592-600 104 SARDI, J.R. Surgical Treatment for Vitiligo Through Hair Follicle Grafting: How to Make it Easy. Dermatol Surg 2001; 27:685-686 105 RHEINWALD, J.G.; GREEN, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell 1975; 6 (3): 331-43 106 OLSSON, M.J.; JUHLIN, L. Repigmentation of vitiligo by transplantation of cultured autologous melanocytes. Acta Dermatol Venerol (Stock) 1993; 73: 49-51. 107 KAUFMANN, R.; GREINER, D.; KIPPENBER,G.S. et al. Grafting of in vitro cultured melanocytes onto laser-ablated lesions in vitiligo. Acta Derm Venereol (Stockh)1998; 78: 136-138. 108 CHEN, Y.F.; YANG, P.Y.; HU, D.N. et al. Treatment of vitiligo by transplantation of cultured pure melanocyte suspension: Analysis of 120 cases. J Am Acad Dermatol 2004 Jul;51(1 Pt 1):68-74 109 VLAŠÍN, Z.; POSPÍŠILOVÁ, A.; RULCOVÁ, J.; et al. Rozšíření možnosti léčby vitiliga transplantací autologních melanocytů jejich injektáží zařízením Dermojet. Česko-slovenská dermatologie, Česká republika, Praha, 76, 5p. 246-247. ISSN 00090514. 2001. NK4741, research and development project. 110 ARENBERGER, P.; BROZ, L.; VESELÝ, P.; et al. Tissue-engineered skin in the treatment of vitiligo lesions. Folia biologica. 01/02/2000; 46(4):157-60. ISSN: 00155500 111 GAUTHIER, Y.; SURLVE-BAZEILLE, J.E. Autologous grafting with noncultured melanocytes: a simplified method for treatment of depigmented lesions. J Am Acad Dermatol 1992; 26:191-194.

105

Seznam literatury ___________________________________________________________________________ 112 JAVŮREK, J. Fototerapie biolaserem - léčebná metoda budoucnosti, Grada 1995. ISBN 80-7169-046-5 113 ACHAUER, B.M.; et al. Plastic Surgery Indications, Operations, and Outcomes, Mosby; 1 edition 2000, Volume I. , p 183-193, ISBN-10: 0815110197 114 CHALUPECKÁ, J. Možnosti využití laserů v dermatologii, Dermatol. praxi 2008; 2(2): 96-99 115 Wikipedia contributors. Carbon dioxide laser [online]. Wikipedia, The Free Encyclopedia; 2009 [cit 2009-03-24]. Available from: 116 BRYCHTA, P.; STANEK, J. et al., Laserová estetická chirurgie, Galén, 2000, ISBN 807262-082-7 117 BAXTER. PŘÍBALOVÁ INFORMACE. [online]., 2004 [cit. 2009-08-04]. Available from www: 118 FALABELLA, R. Surgical therapies for vitiligo. In: Hann SK, Nordlund JJ, editors. Vitiligo. Oxford (UK): Blackwell Science; 2000. p. 193-200 119 MULEKAR, S.V. Melanocyte-keratinocyte cell transplantation for stable vitiligo. Int. J Dermatol 2003; 42:132-6 120 FALABELLA, R. Surgical Approaches for Stable Vitiligo, Dermatol Surg 2005; 31:1277-1284 121 KAHN, A.M. Surgical Treatment of Vitiligo. Dermatol Surg 1999; 25:669–671 122 NAEYAERT, J.M.; GEEL, N.; ONGENAE, K. IL-38 Surgical treatment of vitiligo. Pigment Cell Res. 2003 Oct;16(5):590-1. 123 VIŠŇA, P.; PAŠA, L.; ADLER, J.; et al. Terapie hlubokých chondrálních defektů kolena pomocí autologních kultivovaných chondrocytů na nosiči - příprava chondrograftu. Act Chir. orthop. Traum. čech., 70: 350-355, 2003. 124 FOLVARSKÝ, J.; DĚDEK, T.; DOBEŠ, D.; et al. Chondrografty na bázi fibrinového lepidla Tissucol - Kit Immuno jako nová možnost léčby defektů kloubních ploch - popis metody. Vojenské zdravotnické listy, roč. 72, č. 6, 2003, s. 253-256

106

Seznam příloh ___________________________________________________________________________

Seznam příloh Příloha 1: Dotazník pro pacienty s vitiligem ve studii Příloha 2: Návod na zakreslení aktuální velikosti plochy bez kožního pigmentu léčené v minulosti chirurgicky.

107

Příloha 1 – Dotazník pro pacienty s vitiligem ve studii ___________________________________________________________________________

Dotazník pro pacienty s vitiligem Datum vyplnění dotazníku:_________________ Datum zákroku: __________________ jméno a příjmení:________________________________________________________ telefon:________________________ email:__________________________ adresa:___________________________________________________________________ Zaškrtněte prosím vyhovující odpovědi. 1. výskyt vitiliga u prarodičů: rodina otce: babička: ano ne nevím děda: ano ne nevím rodina matky: babička: ano děda: ano

ne ne

2. výskyt vitiliga u rodičů: otec: ano ne matka: ano ne

nevím nevím

nevím nevím

3. Máte sourozence? ne ano výskyt vitiliga u sourozenců:

ano

ne

4. Máte některé z těchto onemocnění? atopický ekzém: ano ne porucha funkce štítné žlázy: ano snížená funkce ano zvýšená funkce ne nevím, nebyl(a) jsem vyšetřen(a) snížené množství červených krvinek (anémie): ano ne nevím, nebyl(a) jsem vyšetřen(a) cukrovka (diabetes): ano ne nevím, nebyl(a) jsem vyšetřen(a) Adisonova choroba: ne ano nevím, nebyl(a) jsem vyšetřen(a) alergie: ne nemám žádné alergické projevy ano mám alergii na:_____________________________________________________

-1-

Příloha 1 – Dotazník pro pacienty s vitiligem ve studii ___________________________________________________________________________ 5. Byl(a) jste vyšetřen(a) na přítomnost protilátek proti buňkám tvořících kožní pigment (melanocytům)? ne ano

mám protilátky

nemám protilátky

6. Předcházelo vzniku vitiliga nějaké onemocnění?: ne ano jaké?__________________________________________________________

7. Předcházel vzniku vitiliga psychický, nebo fyzický stres? ne ano jaký? (popište prosím druh stresu např. úmrtí blízké osoby, rozvod rodičů, extrémní fyzická zátěž při atletických závodech, porod, spálení kůže u moře, apod.) ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________

8. Vyberte prosím Váš kožní fototyp dle popisu: Barva Vašich očí:

_________________

fototyp I. velmi citlivá pokožka (velmi světlá pleť, světlé nebo rezavé vlasy většinou modré oči na slunci pleť nikdy nezhnědne - maximálně zčervená, bezpečná doba pobytu na přímém slunci je 5-10 minut, prsní bradavky velmi světlé) fototyp II. citlivá pokožka (světlá pleť, světlé vlasy, modré či zelené oči, častý výskyt pih na pokožce, při opalování se často spálím a zhnědnu jen málo, bezpečná doba pobytu na slunci je 10-20 minut, prsní bradavky světlé) fototyp III. normálně citlivá pokožka (lehce tónovaná pleť, hnědé a tmavě plavé vlasy, pleť na sluníčku zhnědne a spálí se zřídka, bezpečná doba pobytu na přímém slunci je 20-30 minut, prsní bradavky tmavší) fototyp IV. pleť odolná vůči slunci (snědá pleť, tmavé vlasy, tmavé oči, kůže na slunci snadno zhnědne a téměř nikdy se nespálí, bezpečná doba pobytu na přímém slunci je až 45 minut, prsní bradavky tmavé)

9. Pracujete s toxickými látkami? ano ne ano v minulosti

-2-

Příloha 1 – Dotazník pro pacienty s vitiligem ve studii ___________________________________________________________________________

Vaše zkušenost s chirurgickou terapií vitiliga 1. Vyznačte ošetřenou lokalitu a výsledky repigmentace - obnovení pigmentu v ošetřené lézi (vyznačte všechny ošetřené lokality): Lokalita:

obličej ruce

krk

trup

paže

stehna

třísla

kolena

loket bérec

předloktí noha

Stupeň repigmentace léčených ploch dnes, známkujte jako ve škole. 1 2 3 4 5

excelentní (95-100% repigmentace) dobrá (65-94% repigmentace) částečná (20-64% repigmentace) špatná (1-19% repigmentace) žádná (0% repigmentace)

2. Pokud léčené plochy zpigmentovaly, došlo k jejich opětovné depigmentaci? ne ano zdepigmentovaly částečně ano zdepigmentovaly úplně plochy zdepigmentovaly přibližně za ____________měsíců od zákroku 3. Došlo po operaci k vytvoření nových lézí vitiliga někde na těle? ne ano lokalita: ______________________________________________________ 4. Změnily se po operaci neoperované léze vitiliga jinde po těle? ne, ostatní ložiska jsou beze změn ano zlepšily se ano zhoršily se 5. Jak ovlivnila operace Váš sociální život, nebo psychickou kvalitu života? výrazně se zlepšil částečně se zlepšil beze změn zhoršil se 6. Změnilo se Vaše používání krémů s UV filtrem po operaci? méně často beze změn častěji 7. Prodělal(a) jste po zákroku nějaké závažné onemocnění? Pokud ano jaké? ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________ 8. Doporučil(a) by jste vyzkoušet chirurgickou terapii jiným pacientům s vitiligem? ano ne

-3-

Příloha 1 – Dotazník pro pacienty s vitiligem ve studii ___________________________________________________________________________ Zakreslete prosím rozsah a výskyt Vašich lézí, uveďte prosím i rozměry v cm:

-4-

Příloha 2 – Návod na zakreslení plochy ___________________________________________________________________________ Návod na zakreslení aktuální velikosti plochy bez kožního pigmentu léčené v minulosti chirurgicky. Pro obkreslení kontury kožní léze bez pigmentu budete potřebovat pomoc druhé osoby a nejlépe nesmazatelný fix (označení permanent, textil, CD, apod.) Před vlastním obkreslením obrysu kožní plochy bez pigmentu je vhodné vyznačit si okraje přímo na kůži, protože přiložením průhledné folie se okraj nepigmentované plochy někdy špatně odhaduje, zvláště v případě málo pigmentované kůže v okolí. Viz obrázek:

Přitiskněte prosím průhlednou folii na kůži v místě léčené kožní skvrny. Přidržujte folii na kůži, poproste druhou osobu o zakreslení lihovým fixem. Obkreslete okraje kožní skvrny bez pigmentu v případě že nezpigmentovala, nebo v případě, že se rozpadla na menší plošky, či znovu ztratila pigment. Viz obrázek:

Popište místo obkreslené léze přímo na folii (např. pravé koleno, levé předloktí, apod.)