BEVEZETÉS A gyomor- és a hasnyálmirigyrákot gyakran csak az elorehaladott stádiumokban diagnosztizáljuk, ezért prognózisuk nagyon kedvezotlen. Nagy szükség van ezért olyan markerekre, melyekkel elérhetové válik a korai diagnózis és megbízható prognózis felállítása, és egyben terápiás célpontokként is szolgálnak. Ezeket a szempontokat tartottuk szem elott, amikor kutatásaink középpontjába a caveolin-1 (CAV-1), a szérum szolublis E-cadherin (E-cad) és a karbon-anhidráz IX (CA IX) fehérjéket állítottuk. A caveolák a sejtmembrán hólyagszeru betüremkedései, melyek számos jelátvivo folyamatban játszanak fontos szerepet. A CAV-1 a caveolák fo szerkezeti eleme, melynek tumor szuppresszor és tumor promoter funkciójáról is beszámoltak már. Gyomorrákban a CAV-1 expressziót korábban nem vizsgálták. Az E-cadherin, az ? - és ? -catenin alakítják ki együtt a cadherin -catenin komplexet, mely kritikus szerepet tölt be a sejtek közötti kapcsolódásban . Az E-cadherin és catenin
expresszió
csökkenése
vagy
kiesése
gyakori
jelenség
gyomorrákban . Az E-cadherin szolubilis formáját elozoleg a gyomorrák prognosztikus markerének találták. A karbon-anhidrázok a sav-bázis egyensúlyt és a légzést szabályozzák, és kulcsfontosságú a szerepük az epithelialis sejtek interakciójában és proliferációjában. A CA IX a daganatos hypoxia markere, me lynek fokozott expressziójáról számoltak be hypernephromában,
méhnyakrákban,
és
petefészekrákban.
Hasnyálmirigyákban nincs elegendo adatunk a CA IX expressziós mintázatáról.
1
CÉLKITUZÉSEK CAV-1 vizsgálat ? A CAV-1 mRNS kvantitatív meghatározása gyomorrákos mintákban és a kíséro ép gyomorszövetekben ? A gyomorrákban mért CAV-1 mRNS szintek és a klinikopatológiai faktorok (Laurén klasszifikáció, daganatos stádiumok, grading) összefüggéseinek vizsgálata ? A CAV-1 expresszió vizsgálata 5 gyomorrák sejtvonalon (AGS, KATO III, MKN 28, MKN 45, N87) ? A CAV-1 gén promoter régiójában a metiláltsági státusz feltérképezése gyomorrák sejtvonalakon ? A P132L mutáció analízise sejtvonalakon, gyomorrákos mintákban és a kíséro ép gyomorszövetekben ? A CAV-1 fehérje expressziós mintázata és a klinikopatológiai faktorok (Laurén klasszifikáció, daganatos stádiumok, grading) között fennálló korrelációk vizsgálata
E-cad vizsgálat ? A gyomorrákos betegek és a kontrollcsoport szolubilis E-cadherin szérumszintjeinek összehasonlítása ? A gyomorrákos betegek szolubilis E-cadherin szérumszintjei és a Laurén klasszifikáció, a daganat stádiuma és differenciáltsága között fennálló összefüggések vizsgálata ? A szolubilis E-cadherin szérumszint prognosztikus markerként való alkalmazásának feltérképezése
2
CA IX vizsgálat ? A CA IX expressziós mintázatának elemzése hasnyálmirigyrákos és a kíséro ép hasnyálmirigy-szövetet tartalmazó mintákban ? A CA IX expresszió immunhisztokémiai jellegzetességei és a klinikopatológiai faktorok (tumorstádium, grading), továbbá a
p53
expresszió és az ún. microvessel density (MVD) között fennálló korrelációk vizsgálata
? A CA IX gátlás, mint terápiás lehetoség felbecsülése 3 hasnyálmirigyrák-sejtvonal
acetazolamiddal
történo
inkubációja
alapján
MÓDSZEREK CAV-1 vizsgálat Sejtkultúrák
RT-PCR és real-time kvantitatív analízis
RFLP analízis
Western Blot analízis
Immunhisztokémia
E-cad study Enzyme-linked immuno-sorbent assay
CA IX study CA IX immunhisztokémia
p53 immunhisztokémia
Microvessel density
Western Blot analízis
RT-PCR és real-time kvantitatív analízis Sejtkultúrák kezelése acetazolamiddal
3
EREDMÉNYEK CAV-1 vizsgálat A CAV-1 mRNS expresszió ép gyomornyálkahártyában és gyomorrákban Kvantitatív PCR analízissel a vizsgált 19 mintában a CAV-1 mRNS szintek alacsonyabbak voltak gyomorrákban, mint az ép gyomornyálkahártyában.
A P132L mutáció analízise Az Rsa-I és Nla -III enzimmel végzett emésztéssel nem tudtuk kimutatni a P132L mutációt sem a gyomorrákos mintákból, illetve a kíséro ép gyomorszövetekbol, sem a gyomorrákos sejtvonalakból származó cDNSekben.
A CAV-1 gén expressziója gyomorrákos sejtvonalakban Nem észleltünk érdemi különbséget az AGS, MKN 28 és N87 sejtvonalak mRNS szintjei között az 5-aza -2'-deoxycytidine kezelést követoen, tehát a CAV-1 gén promoter régiója nem hipermetilált.
CAV-1 fehérje expressziója ép gyomornyálkahártyában és gyomorrákban A CAV-1 24-kDa és 21-kDa nagyságú izoformját is ki tudtuk mutatni a vizsgált 3 mintában Western blot analízis segítségével.
Immunhisztokémia A non-epithelialis sejtkompart mentben gyenge CAV-1 expressziót találtunk 20/27 betegben, és mérsékelt CAV-1 expresziót a fennmaradó 7 betegben. A differenciálatlan daganatok túlnyomó többségében (15/17) alacsony (<10%), míg a jól-differenciált dagantokban alacsony és magas (10-50%) CAV-1
expressziót
észleltünk.
A
4
távoli
áttétet
adó
daganatok
mindegyikében alacsony CAV-1 expressziót detektáltunk. Nem volt kimuatható összefüggés a non-epithelialis sejtek CAV-1 expressziója és a daganat stádiuma, mérete, a nyirokcsómó érintettség, a távoli áttétek és a Laurén-féle klasszifikáció között.
E-cad vizsgálat A
solubilis
E-cad
szignifikánsan
szintek
logaritmikus
koncentrációinak
átlaga
magasabb volt a gyomorrákos betegekben, mint a
kontrollcsoportban (4.03? 0.32 vs. 3.86? 0.24, p<0.0001). A solubilis E-cad szintek logaritmikus koncentrációinak átlaga szignifikánsan magasabb volt az intestinális -, mint a diffúz-típusú gyomorrákban (4.07? 0.3 vs. 3.98?0.34, p=0.0494). Intestinális -típusú gyomorrákban a solubilis E-cad szintek logaritmikus koncentrációinak átlaga szignifikánsan magasabb volt a III-IV. stádiumban, mint az I-II. stádiumban (4.13?0.29 vs. 3.96?0.31, p=0.0234). Diffúz-típusú gyomorrákban a solubilis E-cad szintek logaritmikus koncentrációinak átlaga szignifikánsan magasabb volt a lokalizált, mint az áttétképzo gyomorrákban (4.15?0.3 vs. 3.95? 0.32, p=0.0139). Diffúz-típusú gyomorrákban az alacsony E-cad szérumszintek a távoli áttétekkel mutattak összefüggést, míg az intestinális -típusú gyomorrákban az alacsony E-cad szérumszintek a lokalizált gyomorrákra voltak jellemzoek (p=0.044).
CA IX vizsgálat CA IX expresszió hasnyálmirigyrákban CA
IX
immunreaktivitást
észleltünk. A daganatsejtek daganat
lokalizációjától,
16
(21%)
hasnyálmirigyrákos
mintában
CA IX immunreaktivitása független volt a stádiumától,
méretétol,
a
nyirokcsomó -
érintettségtol, a távoli áttétektol, és a daganatsejtek differenciáltságától.
5
A CA IX fehérje expressziója ép és daganatos hasnyálmirigy-szövetben A CA IX 54-kDa és 58-kDa nagyságú izoformját is ki tudtuk mutatni a vizsgált mintákban Western blot analízis segítségével.
A CA IX mRNS expressziója ép és daganatos hasnyálmirigy-szövetben Nem találtunk érdemi különbséget az ép és daganatos hasnyálmirigyszövetek mRNS expressziója között.
p53 expresszió p53 expressziót a hasnyálmirigyrákos minták sejtmagjainak 35% -ában (27 beteg) igazoltunk. A p53 fehérje expressziója szignifikánsan gyakoribb volt a differenciálatlan, mint a jól-differenciált hasnyálmirigyrákos betegekben (p=0.0323). Nem találtunk összefüggést a p53 expresszió és a CA IX expresszió, illetve a klinikopatológiai tényezok között.
Microvessel density A hasnyálmirigyrákos mintákban az átlagos MVD 5.98 ér/mm2 volt (1.6-14 ér/mm2 ). A medián MVD 5.4 ér/mm2 volt. Az MVD független volt a CA IX immunreaktivitástól, a p53 expressziótól, a daganat lokalizációjától és stádiumától,
a
nyirokcsomó
érintettségtol,
a
távoli
áttétektol,
a
daganatsejtek differenciáltságától, a betegek nemétol és életkorától.
Hasnyálmirigyrákos sejtvonalak proliferációjának gátlása acetazolamiddal Három hasnyálmirigyrákos inkubáltunk
acetazolamiddal.
sejtvonalat A
sejtek
(AsPC-1, PaCa-2, DNS
analízise
PANC-1) alapján
az
acetazolamiddal kezelt AsPC-1 és PANC-1 sejtvonalakban a kezeletlen
6
sejtvonalakhoz képest szignifikáns sejtproliferáció-gátlás következett be (p=0.03, ill. p<0.05).
KÖVETKEZTETÉSEK CAV-1 vizsgálat ? Gyomorrákban, az ép gyomorszövethez képest, a caveolin-1 mRNS expresszió lecsökkent. ? Gyomorrákban a caveolin-1 gén promoter régiója nem hipermetilált. ? A P132L mutáció sem a gyomorrákos sejtvonalakban, sem a gyomorrákos szövetmintákban nem mutatható ki. ? Gyomorrákban,
az
ép
gyomorszövethez
képest,
a
caveolin-1
immunreaktivitás jelentosen lecsökkent, és túlnyomóan a nonepithelialis sejtekre korlátozódik. ? A
caveolin-1
expresszió
nem
mutat
összefüggést
a
Laurén
klasszifikációval, a daganat stádiumával, a daganat méretével és a nyirokcsomó érintettséggel. ? A caveolin-1 expresszió intenzívebb a jól-differenciált gyomorrákban, mint a differenciálatlan és/vagy áttétképzo gyomorrákban.
E-cad vizsgálat ? A
szolubilis
E-cadherin
szérum-koncentrációk
szignifikánsan
magasabbak gyomorrákos betegekben, mint a kontrollokban. ? A
szolubilis
E-cadherin
szérum-koncentrációk
szignifikánsan
magasabbak a gyomorrák intestinális -típusában, mint a diffúz-típusban. ? A gyomorrák intestinális -típusában a szolubilis E-cadherin szérumkoncentrációk magasabbak az elorehaladott stádiumokban, mint a korai stádiumokban.
7
? A gyomorrák diffúz-típusában a szolubilis E-cadherin szérumkoncentrációk
alacsonyabbak
az
elorehaladott,
áttétképzo
stádiumokban, mint a korai stádiumokban.
CA IX vizsgálat ? Karbon-anhidráz IX expresszió a hasnyálmirigyrákos betegeknek csak egy kisebb csoportjában mutatható ki. ? Hasnyálmirigyrákban a karbon-anhidráz IX immunreaktivitás független a
tumor
lokalizációjától,
a
tumor
stádiumától,
a
tumor
differenciáltságától, a p53 expressziótól és az MVD-tol. ? Az acetazolamiddal történo inkubáció a sejtproliferáció szignifikáns gátlásához vezetett az AsPC-1 és a PANC-1 hasnyálmirigyrákos sejtvonalakban.
8
ÖSSZEFOGLALÁS A caveolin-1 expressziója alacsonyabb gyomorrákban, mint az ép gyomorszövetekben, és gyakoribb a jól-differenciált daganatokban, mint a rosszul
differenciált
és
áttétképzo
daganatokban.
Ezek
alapján
gyomorrákban a caveolin-1 valószínuleg tumor szupresszor szerepet tölt be. A
szolubilis
E-cadherin
szérumszintje
szignifikánsan
magasabb
gyomorrákos betegekben az egészséges kontrollokhoz képest, illetve az intestinalis típusú gyomorrákban, a diffúz típusú gyomorrákos esetekhez képest. A daganatos progresszióval az E-cadherin szérumszintek az intestinalis típusban egyenes, a diffúz típusban fordított arányosságban állnak, ezért a szolublis E-cadherin szérumszint az intestinalis típusú gyomorrák prognosztikus markereként értékelheto. A karbon anhidráz IX expressziója a hasnyálmirigyrákos esetek csak egy kisebb csoportjában mutatható ki és független a klinikopatológiai paraméterektol, a p53 expressziótól és a kisér-suruségtol. A hasnyálmirigyrákos sejtvonalak acetazolamiddal
történo
inkubációja
a
sejtproliferáció
szignifikáns
gátlásához vezet, ezért a karbon-anhidráz bénítók adása a karbon-anhidráz IX-et expresszáló hasnyálmirigyrákok kezelésének egyik jövobeli formája lehet.
9
AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZO KÖZLEMÉNYEK 1.
2.
3.
4.
5.
6.
Juhasz M, Nitsche B, Malfertheiner P, Ebert MP. Implications of growth factor alterations in the treatment of pancreatic cancer. Mol Cancer. 2003 Jan 7;2(1):5. Juhasz M, Ebert MP, Schulz HU, Rocken C, Molnar B, Tulassay Z, Malfertheiner P. Dual role of serum soluble E-cadherin as a biological marker of metastatic development in gastric cancer. Scand J Gastroenterol. 2003 Aug;38(8):850-5. IF: 1.847 Juhasz M, Chen J, Tulassay Z, Malfertheiner P, Ebert MP. Expression of caveolin-1 in gastrointestinal and extraintestinal cancers. J Cancer Res Clin Oncol. 2003 Sep;129(9):493-7. IF: 2.197 Juhasz M, Chen J, Lendeckel U, Kellner U, Kasper HU, Tulassay Z, Pastorekova S, Malfertheiner P, Ebert MPA. Expression of Carbonic Anhydrase IX in Human Pancreatic Cancer. Aliment Pharmacol Ther 2003 Oct;18(8):837-846. IF: 2.98 Juhasz M, Herszenyi L, Tulassay Z, Malfertheiner P, Ebert MP. Helicobater pylori and molecular mechanisms of gastric carcinogenesis: targets for prevention and therapy. Expert Rev Anticancer Ther. 2004 Feb; 4(1):97-103 Juhász M, Vértesaljai M, Herszényi L, Malfertheiner P, Ebert MP, Tulassay Zs. A caveolin-1 gén szerepe a carcinogenesisben. Orvosi Hetilap (közlésre elküldve)
EGYÉB KÖZLEMÉNYEK 1. 2.
3.
4. 5.
6. 7.
Juhász M, Somogyi A. A diabeteses gastroparesis jellemzoi és kezelési lehetoségei. Diabetologia Hungarica 1999.december, VII/4, 225-230. Juhász M, Prónai L, Zágoni T, Németh A, Herszényi L, Schandl L, Tulassay Zs. A Helicobacter pylori-fertozést kimutató eljárások összehasonlítása. Orvosi Hetilap 2000. 141(17), 911-914. Juhász M, Zágoni T, Herszényi L, Kovács Cs, Horváth Gy, Nemetz A, Tulassay Zs. Coeliakia post partum megjelenése. Magyar Belorvosi Archivum 2000; 53:93-97. Herszényi L, Juhász M. A laktulóz szerepe a klinikai és háziorvosi gyakorlatban. Háziorvosi Továbbképzo Szemle 5: 272-275 (2000) Juhász M, Zágoni T, Tóth M, Tulassay Zs. A coeliakia napjainkban: a bovülo ismeretek áttekintése. Orvosi Hetilap 2000. 141(48), 25832593. Herszényi L, Juhász M. Helicobacter pylori negatív gastroduodenalis fekélyek. Háziorvosi Továbbképzo Szemle 6: 37-40 (2001) Juhász M. Ha a dyspepsiás betegnek hyperthyreosisa is van. Praxis 2001. 7. 13-18.
10
8.
Juhász M, Herszényi L, Prónai L, Zágoni T, Tulassay Zs. A funkcionális bélbetegségek tüneteinek változása negatív eredményu colonoscopia után. Magyar Belorvosi Archivum 2001; 54:117-120. 9. Juhász M, Herszényi L. Irritábilis bél szindróma. Háziorvos Továbbképzo Szemle 2001. november VI.évfolyam 5.szám: 278-281. 10. Herszényi L, Juhász M. A nyelocsoreflux-betegség (GERD) diagnózisa, kezelése és az éjszakai saváttörés jelensége. Családorvosi Fórum 2002/10. 9-14. 11. Herszényi L, Juhász M. A funkcionális dyspepsia kezelésének gyakorlati szempontjai. Hippocrates V/6, 2003. nov.-dec./10. 352-357.
ELOADÁSOK, ABSZTRAKTOK 1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Juhász M, Prónai L, Zágoni T, Németh A, Herszényi L, Schandl L, Tulassay Z. Comparison of five different methods in the detection of Helicobacter pylori infection. Z Gastroenterol 1999; 37: 424. Herszényi L, Prónai L, Juhász M, Tulassay Z. Comparison of a shortterm and a seven days lansoprazole based triple therapy for Helicobacter pylori infection. Z Gastroenterol 2000; 38: 408 Juhász M, Zágoni T, Németh A, Prónai L, Herszényi L, Rácz K, Tulassay Z. Serum levels of amylase and ?-crosslaps and their correlation before and after endoscopic retrograde cholangio pancreatography. Z Gastroenterol 2000; 38: 410. Tóth M, Molnár E, Miheller P, Zágoni T, Nemetz A, Németh A, Juhász M, Kovács Á, Tulassay Z. Bone mineral density measurements in patients with ulcerative colitis. Z Gastroenterol 2000; 38: 428. Molnár E, Tóth M, Zágoni T, Juhász M, Nemetz A, Kovács Á, Prónai L, Tulassay Z. Bone mineral density measurements in patients with Crohn’s disease. Gastroenterology 2000; 118 (suppl.2.): A1358, 6184 Herszenyi L, Pronai L, Juhasz M, Tulassay Z. Evaluation of a shortterm and a seven days lansoprazole based triple therapy in the treatment of Helicobacter pylori infection. Gut 2000; 47 (Suppl III), A127, P397 Herszenyi L, Pronai L, Juhasz M, Tulassay Z. Comparison of an ultrashort-term and a standard seven days lansoprazole based triple therapy in the treatment of Helicobacter pylori infection. Gastroenterology 2001; 120 (suppl.1.): A586, 2979 Juhász M, Herszényi L, Prónai L, Tulassay Z. Significant increase in the incidence of Helicobacter pylori negative gastroduodenal ulcers in the last 5 years. Z Gastroenterol 2001; 39: 398, 074
11
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
Horvát-Karajz K, Juhász M, Herszényi L, Prónai L, Zágoni T, Tulassay Z. Functional bowel symptoms improve in patients following negative colonoscopy. Z Gastroenterol 2001; 39: 395, 061 Miheller P, Tóth M, Molnár E, Zágoni T, Juhász M, Kovács Á, Tulassay Z. Bone mineral density measurements in patients with Crohn‘s disease. Z Gastroenterol 2001; 39: 407, 110 Juhász M, Herszényi L, Tulassay Z. Increasing incidence of Helicobacter pylori negative ulcers between 1995 and 2000. Gut 2001; 49 (Suppl. No. II.), A64, 11/14 Juhász M, Herszényi L, Zágoni T, Németh A, Prónai L, Rácz K, Tulassay Z. Correlation of serum levels of ? -crosslaps with amylase in patients after ERCP. Endoscopy 2001; 33 (Suppl I), No.1056 Juhász M, Herszényi L, Tulassay Z. Significant increase in the incidence of Helicobacter pylori negative gastroduodenal ulcers in the last 5-year period. Gut 2001; 49 (Suppl III), No. 1040 Tóth M, Miheller P, Zágoni T, Nemetz A, Prónai L, Herszényi L, Juhász M, Kovács A, Tulassay Z. Bone mineral density measured by dual X-ray absoprtiometry and quantitative ultrasonography in patients with ulcerative colitis. Am J Gastroenterol 2001; 96 S311, No. 987 Frigyik A, Juhász M, Herszényi L, Németh A, Zágoni T, Prónai L, Molnár B, Tulassay Z. Risk factors for the development of gastric intestinal metaplasia. Z Gastroenterol 2002; 40: 333, 18 Juhász M, Zágoni T, Sípos F, Péter Z, Tóth M, Tulassay Z. Endoscopic picture of the postbulbar duodenum in dermatitis herpetiformis. Z Gastroenterol 2002; 40: 339, 46 Juhász M, Chen J, Lendeckel U, Kellner U, Kasper HU, Tulassay Z, Pastorekova S, Malfertheiner P, Ebert MPA. Expression of Carbonic Anhydrase IX Protein in Human Pancreatic Cancer”. Z Gastroenterol 2003; 41: 442, 49 Juhasz M, Kellner U, Tulassay Z, Malfertheiner P, Ebert M. Expression of Carbonic Anhydrase IX Protein in Human Pancreatic Cancer. Gastroenterology 2003; 124 (suppl.): M1317, A351 Juhasz M, Chen J, Hoffmann J, Roecken C, Tulassay Z, Malfertheiner P, Ebert M. Differential Expression of Caveolin-1 in Gastric Cancer Cells and Adjacent Stromal Tissue. Gastroenterology 2003; 124 (suppl.): S1274, A186 Juhasz M, Schulz HU, Roecken C, Molnar B, Tulassay Z, Malfertheiner P, Ebert M. Dual Role of Serum Soluble E-cadherin as an Indicator of Metastatic Development in Gastric Cancer. Gastroenterology 2003; 124 (suppl.): T1713, A553
12
21. Wex T, Peitz U, Juhasz M, Vieth M, Tulassay Z, Ebert MPA, Malfertheiner P. CDX-1 and CDX-2 are differentially expressed in cardia mucosa of patients with Barrett-Esophagus and cardia inflammation. Gut 2003; 52 (Suppl. VI), A6-7 22. Juhasz M, Wex T, Peitz U, Vieth M, Tulassay Z, Ebert MPA, Malfertheiner P. CDX-1 and CDX-2 are differentially expressed in the formation of the columnar-lined epithelium without and with intestinal metaplasia (Barrett-Esophagus). Helicobacter 2003; 8: 339, 437, 12.06 23. Juhasz M, Peitz U, Vieth M, Tulassay Z, Ebert M, Malfertheiner P. CDX-1 and CDX-2 are differentially expressed in cardia mucosa and columnar-lined epithelium of patients with Barrett's-esophagus. Gastroenterology 2004, in progress
13
