BIOKATALITIKUS BAEYER-VILLIGER OXIDÁCIÓK

Pannon Egyetem Műszaki Informatikai Kar Nanotechnológia Tanszék

BIOKATALITIKUS BAEYER-VILLIGER OXIDÁCIÓK Doktori (PhD) értekezés

Készítette: Muskotál Adél Környezettudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Vonderviszt Ferenc egyetemi tanár

Veszprém 2008.

BIOKATALITIKUS BAEYER-VILLIGER OXIDÁCIÓK

Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében

Írta: Muskotál Adél

Készült a Pannon Egyetem Környezettudományok Doktori Iskolája keretében

Témavezető: Dr. Vonderviszt Ferenc Elfogadásra javaslom (igen / nem) ………………………. (aláírás) A jelölt a doktori szigorlaton …......... % -ot ért el,

Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom:

Bíráló neve: Skodáné dr. Földes Rita

igen /nem ………………………. (aláírás)

Bíráló neve: dr. Gál Péter

igen /nem ………………………. (aláírás)

A jelölt az értekezés nyilvános vitáján …..........% - ot ért el.

Veszprém, …………………………. a Bíráló Bizottság elnöke A doktori (PhD) oklevél minősítése…................................. ………………………… Az EDT elnöke

2

TARTALOMJEGYZÉK KÖSZÖETYILVÁÍTÁS

5

Kivonat Abstract Auszug

6 7 8

1. Bevezetés, célkitűzés

9

2. Irodalmi áttekintés

11

2.1. A Baeyer-Villiger monooxigenázok működése 2.1.1. Az enzim szerkezete és a katalízis 2.2. A ciklohexanon-monooxigenáz biokatalitikus alkalmazása 2.2.1. Hattagú, heteroatomot nem tartalmazó ketonok biotranszformációja 2.2.2. Hattagú, heteroatomot tartalmazó ketonok biotranszformációja 2.3. A szubsztrátumok előállításához szükséges reakciók irodalmi háttere 2.4. Izolált enzimek vagy élő sejtes rendszerek használata 2.5. Filamentáris enzimrendszerek 2.5.1. A flagellin és a flagelláris filamentum jellemzése 2.5.2. Flagelláris display-technológiák 2.5.3. A flagellin-enzim fúziós fehérjék létrehozása

11 13 16 17 20 23 26 27 27 29 29

3. Kísérleti rész

31

3.1. Felhasznált anyagok és módszerek 3.1.1. Cirkuláris dikroizmus 3.1.2. E.coli TOP10 kompetens sejt készítési eljárás 3.1.3. Salmonella SJW2536 elektrokompetens sejt készítési eljárás 3.2. Általános sémák 3.3. [4+3] cikloaddíció 3.3.1. Cu/Zn katalizátor és pirrol-1-karbonsav-metilészter (1c) előállítása 3.3.2. Általános módszer ultrahangos fürdőben kivitelezett reakciókhoz 3.3.2.a. 2,4-dibróm-biciklo [3,2,1] okt-6-én-3-on (2a) előállítása 3.3.2.b. 2,4-dibróm-8-oxabiciklo [3,2,1] okt-6-én-3-on (2b) előállítása 3.3.2.c. 2,4-dibróm-8-metoxikarbonil-8-azabiciklo [3,2,1] okt-6-én-3-on (2c) előállítása 3.4. Debrómozás 3.4.1. Általános módszer debrómozáshoz 3.4.1.a. Biciklo [3,2,1] okt-6-én-3-on (3a) előállítása 3.4.1.b. 8-oxabiciklo [3,2,1] okt-6-én-3-on (3b) előállítása 3.4.1.c. 8-metoxikarbonil-8-azabiciklo [3,2,1] okt-6-én-3-on (3c) előállítása 3.5. Gyűrűnyitási metatézisek 3.6. Katalitikus hidrogénezés 3.7. Általános módszer kémiai Baeyer-Villiger oxidációkhoz 3.8. Biológiai Baeyer-Villiger oxidációk 3.8.1. Biotranszformációk 3.8.2. Általános módszer a biotranszformációkhoz 3.8.2.a. 1,4-dioxepan-5-on előállítása 3.8.2.b. Cisz-2,7-dimetil-1,4-dioxepan-5-on előállítása

31 33 33 34 35 37 37 37 38 38

3

39 39 39 40 40 40 41 41 42 42 42 43 43 43

3.8.2.c. Cisz-2,7-dietil-1,4-dioxepan-5-on előállítása 3.8.2.d. Cisz-2,7-divinil-1,4-dioxepan-5-on előállítása 3.9. Flagellin-enzim fúziós fehérjék létrehozása 3.9.1. DS konstrukciók tervezése 3.9.2. DS konstrukciók előállítása 3.9.2.1. D3-deléciós plazmid 3.9.2.2. Fúziós DS konstrukciók 3.9.3. D3-deléciós flagellin fehérje 3.9.3.1. Fehérjetermeltetés 3.9.3.2. A D3-deléciós flagellin emésztési vizsgálata tripszinnel 3.9.3.3. Denaturációs hőmérséklet meghatározása CD-vel

44 44 45 45 47 47 49 51 51 52 52

4. Eredmények és következtetések

53

4.1. Szerves reakciók, szubsztrátumok előállítása 4.2. Biotranszformációk 4.3. Flagellin-enzim fúziós konstrukciók létrehozása 4.3.1. D3-deléciós flagellin előállítása 4.3.2. Flagellin-enzim DS konstrukciók létrehozása

53 57 61 61 68

Összefoglalás

71

Új tudományos eredmények Major results Mellékletek

73 75 77

1. Melléklet: Rövidítések jegyzéke 2. Melléklet: A reakciók adatai 3. Melléklet: Az előállított vegyületek MR-adatai

77 78 79

Irodalomjegyzék

84

4

KÖSZÖETYILVÁÍTÁS Mindenekelőtt hálás köszönetemet szeretném kifejezni témavezetőmnek, Dr. Vonderviszt Ferencnek, aki megismertette velem a molekuláris biológia tudományát, támogatott és tanácsaival segítette munkámat. Kutatómunkámban jelentős segítséget jelentett Dr. Marko D. Mihovilovic támogatása, aki a Bécsben eltöltött idő alatt irányította a munkámat. Külön köszönöm neki, hogy az Európai Unió Marie Curie ösztöndíján keresztül lehetőséget biztosított számomra a szakmai fejlődésre. Kutatásaim elvégzéséhez Dr. Mészáros Ernő, a Környezettudományok Doktori Iskola vezetője is hozzájárult. Fontos volt számomra, hogy folyamatosan kereste a lehetőséget kutatási témám befejezéséhez. A munkám alapját képező génsebészeti alaptechnikák elsajátításában Dr. Gál Pétert tekintem mesteremnek. Az Ő tanításait alkalmazom a munkám során. Tanácsai mindig hasznomra váltak. Külön köszönöm a bírálat során tett értékes megjegyzéseit. Köszönöm Skodáné Dr. Földes Rita bírálatát, lelkiismeretes és segítőkész munkájával nagymértékben hozzájárult disszertációm végleges formájához. Köszönöm Sebestyén Anettnek, hogy a hosszú évek alatt mindig készségesen segített és támogatott. Köszönet illeti Gugolya Zoltánt, aki a Fizika Tanszéken munkatársamként segítségemre volt. A Deák Ferenc Ösztöndíj megpályázásához és a disszertáció megírásához nyújtott önzetlen segítségéért és támogatásáért rendkívül hálás vagyok Dr. Seregélyes Csabának. Munkámat nagyban segítette Dr. Tóth Judit a disszertációm szerves kémiával kapcsolatos részéhez nyújtott konzultációjával. Több éves kutatómunkám befejezéséhez az Oktatási és Kulturális Minisztérium Deák Ferenc Ösztöndíja biztosította a hátteret. Köszönöm Dr. Friedler Ferencnek a Műszaki Informatikai Kar dékánjának, hogy támogatást nyújtott a disszertációm befejezéséhez. Hálával tartozom Radka Snajdrova, Florian Rudroff, Joanna Rydz, Krzysztof Kolodziejczyk és Radoslav Flasik szakmai és baráti segítségéért, valamint Parrag Tamásnak és Prettl Zsoltnak, hogy a disszertáció írása alatt megkönnyítették munkámat a laborban és Zsoltnak külön köszönöm az eredmények kiértékeléséhez nyújtott segítségét. Köszönöm a kitartó támogatást és bíztatást Családomnak, Barátaimnak és Férjemnek. 5

Kivonat Munkám célja volt, hogy egy egyszerű módszert dolgozzak ki karbo- és heterobiciklusos oktanonok előállítására és ezen molekulák gyűrűnyitási metatézisére gázhalmazállapotú olefin reakciópartnerek közreműködésével. Az így előállított ketonok enantioszelektív Baeyer-Villiger oxidációját rekombináns E. coli sejtekkel kiviteleztem. A munka másik részében génsebészeti eljárások segítségével eltávolítottam a bakteriális filamentum monomer fehérjéjének (flagellin) D3 doménjét abból a célból, hogy helyére különböző monooxigenáz enzimeket beépítve enzimaktivitással és polimerizációs képességgel rendelkező nanoszerkezeteket lehessen megalkotni. Eredményeim azt mutatják, hogy a β-cisz diszubsztituált heteroatomot is tartalmazó biciklusos molekulák előállításának ultrahangos módszere egyszerű és megfelelő hozamú eljárás az eddig nehezen preparálható ketonok előállítására. Ezekből a termékekből difunkcionált hattagú cikloketonokat sikerrel preparáltam gyűrűnyitási metatézissel. Kísérleteim során megállapítottam, hogy az előállított perhidro-piron molekulák alkalmasak sejtes biotranszformációkra, a várt termékek keletkeztek kiváló optikai tisztasággal. Igazoltam a korábbi hipotézist, miszerint a Baeyer-Villiger oxidációt katalizáló monooxigenáz enzimeket a katalizált reakcióik alapján két csoportba lehet osztani. A flagellin-enzim fúziós konstrukciók létrehozása érdekében megalkotott D3deléciós flagellin vizsgálataiból kiderült, hogy a mutáns fehérje ugyanolyan mennyiségben termelődött, mint a vad, és a mutáns filamentum stabilitása nagyon hasonló a természeteséhez. A D3-deléciós flagellinekből felépített filamentumok jó alapot nyújtanak a továbbfejlesztésre váró flagellin-enzim fúziós konstrukciók létrehozásához. Munkám során elkészítettem a flagellin-monooxigenáz DNS konstrukciókat.

6

Biocatalytic Baeyer-Villiger oxidations Abstract The aim of my study was to develop a simple method for preparing carbo- and heterobicyclic octanones and for ring opening metathesis of these molecules by means of gaseous olefinic reaction partners. The enantioselective Baeyer-Villiger oxidation of the formulated ketones was achieved by recombinant E. coli cells. In the other part of the investigation, the D3 domain of monomeric protein of bacterial filament was removed by genetic engineering in order to create nanostructures with enzyme activity and polimerization capacity after inserting in various monooxygenase enzymes. The ultrasonic protocol for synthetizing β-cis bicyclic molecules containing heteroatom, allows access to elusive and poorly described ketones without elaborate workup in yield comparable to previous methods. Difunctionalized sixmembered cycloketones were successfully prepared from these products by ring opening metathesis. I stated that the formulated perhydropyran-type ketones were suitable for whole-cell biotransformations, and the expected products were synthetized with excellent optical purities. The former hypothesis was confirmed that monooxygenases those catalyzing Baeyer-Villiger oxidation could be divided into two groups on the basis of catalyzed reactions. The investigations of D3 deleted flagellin, that was prepared to the flagellinenzyme fusion constructs, suggested that the mutant protein was produced in the same amount as the wild one, and the stability of the mutant filament was very similar to the natural one. The filaments built from the D3 deleted flagellins are suitable bases for producing the flagellin-enzyme fusion constructions, but they need further experiments. The flagellin-monooxygenase DNA constructs were prepared in this work as well.

7

Biokatalisierte Baeyer-Villiger Oxidationen Auszug Das Ziel meiner Arbeit war, eine einfache Methode zur Herstellung von karbo- und heterobicyclischen Oktanen und

zur ringöffnenden Metathese dieser Moleküle

auszuarbeiten, mit Hilfe von Olefinreaktionspartnern mit gasförmigem Aggregatzustand. Die enantionselektive Baeyer-Villiger Oxidation der so hergestellten Ketonen wurde mit rekombinanten E. Coli-Zellen durchgeführt. Im anderen Teil der Arbeit entfernte ich den D3-Domain des monomeren Eiweißes des bakteriellen Filamentums mit Hilfe genchirurgischer Verfahren, um an seine Stelle verschiedene monooxygenase Enzyme einbauend Nanostrukturen mit Enzymaktivität und Polimerisationsfähigkeit gestalten zu können. Meine Ergebnisse zeigen, daß die Ultraschallmethode bei der Herstellung der auch β-zis disubstituiertes Heteroatom enthaltenden bicyclischen Moleküle ein einfaches Verfahren mit entsprechendem Ertrag zur Herstellung der bisher schwer präparierbaren Ketonen ist. Aus diesen Produkten präparierte ich erfolgreich difunktionierte sechsgliedrige cyclische Ketonen mit ringöffnender Metathese. Im Laufe meiner Versuche stellte

ich

fest,

daß

die

hergestellten

Perhydropyron-

Moleküle

zu

Zellenbiotransformationen fähig sind, es entstanden die erwarteten Produkte mit ausgezeichneter optischer Reinheit. Ich bestätigte die frühere Hypothese, nach der die die Baeyer-Villiger- Oxidation katalisierenden monooxigenasen Enzyme aufgrund ihrer katalisierten Reaktionen in zwei Gruppen geteilt werden können. Aus der Untersuchung des im Interesse der Gestaltung der Flagellin-Enzym-Fusionskontruktionen hergestellten D3-Deletionsflagellins ging hervor, daß das mutante Eiweiß in derselben Menge produziert wurde, wie das wilde, und daß die Stabilität des mutanten Filamentums der des natürlichen ähnlich ist. Die aus den D3-Deletionsflagellinen aufgebauten Filamenten bilden eine gute Basis für die Produktion der Flagellin-Enzym-Fusionskonstruktionen, die aber noch weiterentwickelt werden sollen. Im Laufe meiner Arbeit stellte ich die FlagellinMonooxygenases-DNA- Konstruktionen her.

8

1. Bevezetés, célkitűzés A biokémiai rendszerekben rejlő lehetőségeket a kémiában már régen felismerték és alkalmazzák: mikrobiológiai, fermentációs módszerekkel biológiailag aktív vegyületeket állítanak elő vagy módosítanak. A hagyományos kémiai módszerek mellett napjainkban a környezetvédelem fontossága miatt fokozatosan előtérbe kerülnek a biokatalitikus eljárások mind laboratóriumi, mind ipari méretekben. A biokatalízis, biotranszformáció céljaira felhasználható rendszerek: enzimek, mikroorganizmusok számos előnyös tulajdonsággal rendelkeznek. Számtalan kémiai reakciónak megtalálható az enzimatikus megfelelője, így széles körben alkalmazhatóak a biokatalizátorok, melyeknek szelektivitása és hatékonysága vonzó lehet a szintetikus kémiában. Nem elhanyagolható az a tény sem, hogy az enzimek viszonylag enyhe körülmények között működnek, ez fontos lehet a szubsztrátum és a termék stabilitása szempontjából is. Mindemellett az enzimek királis katalizátorok, sok esetben elkerülhető velük a mérgező, vagy a környezetet súlyosan károsító melléktermékek képződése is. Napjainkban mikroorganizmusok egyszerű reagensként történő felhasználása is terjedőben van, elsősorban olyan enzimatikus folyamatok esetében, amikor az enzim izolált formában nem hozzáférhető, érzékeny, és a kívánt átalakítás multienzimatikus (Poppe et al., 1991). Királis laktonok, mint az enantioszelektív szintézisek értékes prekurzorainak környezetbarát előállítására hatékony módszert kínál a Baeyer-Villiger oxidáció, amellyel lehetőség nyílik szén-szén kötések felszakítására egy oxigénatom beékelődésével. Baktériumokból származó monooxigenáz enzimek képesek katalizálni a Baeyer-Villiger oxidációt. A monooxigenáz enzimcsaládba tartozó fehérjékkel végzett biotranszformációk széles

szubsztrátum-specificitást

és

jó

enantioszelektivitást

mutatnak.

Számos

természetben előforduló biológiailag aktív vegyület rendelkezik oxigén- és nitrogéntartalmú heterociklusos szerkezetekkel. A karbo- és heterobiciklusos ketonok Baeyer-Villiger oxidációja ígéretes, megfelelő optikai tisztaságú enantiomert tartalmazó intermediereket szolgáltatna a gyógyszerek szintéziséhez, de közvetlen biotranszformációja nem játszódik le a szintetikus kémiában felhasználható konverzióval (Taschner et al., 1992). Megoldást jelentene a gyűrűnyitás-biooxidáció-gyűrűzárás reakciók egymás utáni kivitelezése, hiszen így a szubsztrátum-hasznosítás szélesítésén túl jobb konverzió és enantioszelektivitás is elérhető lenne. Napjainkban egyre nagyobb az igény a sztereoizomerek - legfőképpen a királis anyagok adott enantiomerjének - tiszta formában történő szintézisére és az összetett, biológiailag aktív anyagok gazdaságos előállítására. A gyógyszer-piacon új termékként ma már csak tiszta enantiomer gyógyszer hatóanyag engedélyeztethető, és hasonló a helyzet a növényvédőszerek piacán is, hiszen ebben az esetben fontos környezetvédelmi szempont, hogy a nem hatásos enantiomert szennyezőanyagként ne juttassák ki a természetbe. A biológiai rendszerek molekuláris szintű megismerése, a génsebészet fejlődése kedvezően hatott a biotranszformáció felhasználási területeinek szélesedésére, hiszen a biokatalitikus 9

folyamatok fejlesztése mindinkább célzottá és tervezhetővé válik. Génsebészeti technikákat felhasználva monooxigenáz enzimek fúziós konstrukcióit kívánom létrehozni a polimerizációs képességgel rendelkező flagellin fehérjének, mint a baktériumok flagelláris filamentumait felépítő legfőbb alegységének a segítségével. A flagellin központi része, amely a filamentumok külső részét adja, nagyon variábilis, génsebészeti eszközökkel módosítható, az alegységek citoplazmából való kijutásának és a polimerizációs képességének károsodása nélkül. Célom a flagellin variábilis D3 doménjének lecserélése monooxigenáz enzimekre, és ezeknek a fúziós fehérjéknek (flagzim) a felhasználásával változatos filamentáris nanoszerkezetek létrehozása. Az in vivo flagelláris filamentumok felépülésének eredményeképpen a baktériumok felületén az adott enzim nagy sűrűségben fordulna elő. Ezek a génmódosított baktériumok hordozzák azt a lehetőséget, hogy újszerű mikrobiális biokatalizátorokként működjenek és közvetlenül alkalmazhatóak legyenek biokonverzióknál. Másrészt a tisztított flagzimek használhatóak lennének filamentáris nanoszerkezetek felépítésére, melyek felületén működőképes enzimek több ezer példánya lenne található. Munkám elsődleges célja, hogy gyűrűnyitási metatézist dolgozzak ki különböző heteroatomot is tartalmazó β- cisz biciklusos rendszerekre, majd vizsgáljam az ily módon előállított ketonok Baeyer-Villiger oxidációját rekombináns Escherichia coli sejtekkel. További feladatom a biotranszformációk során keletkező szimmetrikusan szubsztituált heterociklusos laktonok tisztítása, és a tiszta termékek enantiomer-tisztaságának jellemzése. A biotechnológiai folyamatok leegyszerűsítésének érdekében olyan flagellinenzim fúziós fehérje konstrukciók tervezése és előállítása a célom, amelyek enzimaktivitással és polimerizációs képességgel is rendelkeznek. Génsebészeti eljárások segítségével a flagellin variábilis D3 doménjét eltávolítva annak helyére különböző monooxigenázokat kívánok beépíteni.

10

2. Irodalmi áttekintés 2.1. A Baeyer-Villiger monooxigenázok működése A Baeyer-Villiger (BV) oxidációt 1899-ben Adolf Baeyer és Victor Villiger fedezte fel (Baeyer et al., 1899). A mechanizmust először Criegee (1948) írta le egy kétlépéses folyamattal (1. ábra), melynek első lépése a karbonilcsoport nukleofil támadása peroxiddal (I,II). Ez egy tetraéderes intermediert eredményez (III), amely átrendeződésen megy keresztül a megfelelő észter kialakulásáig (IV).

1. ábra: A Baeyer-Villiger oxidáció mechanizmusa (Criegee, 1948).

A Baeyer-Villiger reakció széles körben alkalmazott oxidálószerei: az m-klórperbenzoesav, a trifluor-peroxisav és a hidrogén-peroxid. Ezen persavak biokatalitikus megfelelői az oxigenáz enzimcsaládba tartozó monooxigenázok. A monooxigenázok különböző oxidációs reakciókat katalizálhatnak, mint pl. alifás és aromás alkoholok hidroxilezését, alkének epoxidációját, és Baeyer-Villiger transzformációkat. Az oxidáció típusa általában az enzim prosztetikus csoportjától függ: a citokróm P450 típusú fém-függő monooxigenázok hidroxilezést és epoxidációt, a flavin-függő enzimek a Baeyer-Villiger oxidációt katalizálják. A Baeyer-Villiger monooxigenázok (BVMO) általánosan elfogadott működése az Acinetobacter calcoaceticus baktérium ciklohexanon monooxigenáz (CHMO) enzimével kapcsolatos vizsgálatokon alapul. Ez az enzim egy flavin-adenindinukleotid (FAD) molekulával, mint prosztetikus csoporttal rendelkezik, emellett nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADPH)- és oxigén-függő. Walsh (1980) javasolt egy reakcióutat az oxidáció folyamatára (2. ábra).

11

2. ábra: A Baeyer-Villiger biokatalízis mechanizmusa (E: enzim) (Mihovilovic et al., 2002).

A biokatalízis folyamata a szorosan kötött FAD redukciójával kezdődik a NADPH segítségével. A következő lépés egy gyors oxidáció a molekuláris oxigénnel, melynek terméke a flavin–4a-peroxid anion. Ez az intermedier szolgál oxidáló molekulaként az ezt követő Baeyer-Villiger oxidációban. A flavin-4a-peroxid anion, amely elsőként keletkezett, szubsztrátum hiányában flavin-4a-hidroperoxid stabil molekulává alakul. Szubsztrátum jelenlétében a peroxid nukleofilként viselkedik, a szubsztrátum karbonilcsoportját támadja, kialakítva a „klasszikus” tetraéderes Criegee intermediert. Az intermedier átrendeződése után keletkezik a lakton és a 4a-hidroxiflavin. A katalitikus kör a víz eliminációjával, FAD keletkezésével, a termék leadásával zárul. A CHMO-k működési mechanizmusa modellként szolgál a többi BVMO enzim működésének értelmezéséhez, néhány különbséggel, amelyek lényeges mechanizmusbeli változást nem okoznak. Ilyen különbségek pl. hogy a FAD prosztetikus csoportot helyettesítheti flavin mononukleotid (FMN), és kofaktorként működhet a NADH is a NADPH mellett.

12

2.1.1. Az enzim szerkezete és a katalízis

Napjainkig számos Baeyer-Villiger monooxigenáz enzimet termeltettek és tisztítottak, de eddig csak egy enzimből, a fenilaceton-monooxigenázból (PAMO) sikerült olyan kristályokat előállítani, amelyek megfelelőek voltak röntgen-krisztallográfiás mérésekhez. Ez a 62 kDa-os, monomer fehérje a Thermobifida fusca termofil baktériumban a fenilacetont alakítja át fenilacetáttá. A PAMO aminosavsorrendje nagy homológiát mutat számos ismert és tanulmányozott Baeyer-Villiger monooxigenázzal, ezért is jelent előrelépést a PAMO háromdimenziós szerkezetének ismerete (Malito et al., 2004). A PAMO és a CHMO szekvencia-azonossága 40,3 %, ami lehetővé tette, hogy Bocola és munkatársai (2005) megalkossák a CHMO homológia modelljét, a PAMO háromdimenziós szerkezetét alapul véve (3. ábra).

3. ábra: A PAMO szerkezetének és a CHMO homológia-modelljének összehasonlítása (Bocola et al., 2005).

13

Mindkét fehérje a FAD-kötő és a NADP-kötő doménből áll, és mindegyik domén az általános dinukleotidkötő szerkezettel rendelkezik. A PAMO enzimen pontmutációkat végezve derítették fel a katalízishez nélkülözhetetlen aminosavakat. A kísérletek során derült fény a 337-es arginin központi szerepére is. A kristályos szerkezetben ez az arginin nem egy fix, meghatározott konformációban van, hanem két különböző állapotot képes felvenni. „Bekapcsolt” állapotban stabilizálja a flavin-peroxid intermediert a katalízis során, „kikapcsolt” állapotban helyet ad a nikotinamid gyűrűnek a kofaktor redukálásához. A katalízis során létrejövő konformáció-változások, a doménrotáció, a NADP nikotinamid gyűrűjének be/ki mozgásával és a vele egyidejűleg ellentétes, ki/be mozgást végző 337-es arginin oldallánc (ami szintén a NADP-kötő doménhez tartozik) mozgásával jön létre. A legszembetűnőbb különbség a PAMO és a CHMO modellek között az aktív centrum közelében található argininnel (PAMO-nál a 337. arginin, a CHMO-nál a 327.) kölcsönható hurokrégióban van (3. ábra), a PAMO esetében ez a hurokrégió tartalmaz egy, az arginin felé kinyúló részt (Ser-441- Ala-442- Leu-443), amely a CHMO esetében hiányzik. Bocola és munkatársai igazolták, hogy ez a kitüremkedő régió akadályozza meg a PAMO esetében (a CHMO-val ellentétben), a ciklusos szubsztrátumokat átalakítását, mivel ez a rész sztérikusan körülfogja a 337. arginint, és így nem jut elég hely a ciklusos vegyületekből keletkező intermedierek stabilizálására az enzimreakció során. A CHMO korábbi mutagenezis-vizsgálataiban már bebizonyosodott, hogy a 432. pozícióban lévő fenilalanin nagyon fontos az enzimműködés szempontjából. Ezen a helyen történt mutációt követően drámaian megváltozott a BV reakciók enantioszelektivitásának iránya és mértéke. A homológia modellből megállapítható, hogy a 432. fenilalanin a CHMO-ban megfelel a PAMO 443. leucinjának, ahol a hurokrégióban az arginin felé kidomborodó rész kezdődik. Ezt az ismeretet alapul véve sikerrel állítottak elő olyan mutáns PAMO enzimet, amely képes volt gyűrűs szubsztrátumot átalakítani, ezt úgy érték el, hogy az argininnel kölcsönható hurokrégióban lévő kinyúló részben egyedül a 443. leucint hagyták meg, a másik kettő aminosavat kivágták. Mutagenezis-vizsgálatokkal azt is megmutatták a PAMO esetében, hogy a 173. helyen lévő hisztidin aminosav elengedhetetlenül szükséges a katalízishez és a FAD-kötéshez. Ez a hisztidin a CHMO enzimben is szinte pontosan ugyanezen a helyen található. Megállapították, hogy a 173-as hisztidinnek a katalízis során a doménforgásokban, a konformáció-változásokban van főszerepe és nem a szubsztrátum megkötésében. Négy pontban foglalták össze a PAMO katalízisének molekuláris modelljét, ami a krisztallográfiai analízisen és a katalitikus reakció kinetikai adatain alapul, ezt a modellt egyúttal használhatjuk a CHMO esetében is annyi különbséggel, hogy a PAMO 337. 14

argininje a CHMO 327. argininjével állítható párhuzamba (4. ábra) (Malito et al., 2004): 1. A reakció a NADPH megkötésével kezdődik, amely így megfelelő helyzetbe kerül, hogy redukálja a flavint. Ekkor még a 337-es arginin „kikapcsolt” helyzetben van. 2. A redukált enzim reagál az oxigénnel és létrejön a flavin-peroxid intermedier. Ekkor a domén-forgás összekapcsoltan működik a 337-es arginin és a szomszédos oldalláncok konformáció-változásával, annak érdekében, hogy az arginin megfelelő közelségbe („bekapcsolt helyzet”) tudjon kerülni a peroxid intermedierhez, hogy stabilizálja azt. 3. A flavin oxidálja a bekötődött szubsztrátumot, a 337-es arginin részt vesz a Criegee intermedier stabilizálásában is, úgy, hogy a flavin peroxocsoportja kölcsönhatásba lép a szubsztrátummal. 4. Az enzim hármas komplexe (enzim/NADP+/termék) disszociál, és a terméket leadja. Ezzel a modellel az enzim működése molekuláris szinten is ismertté, érthetőbbé vált.

4. ábra: Sematikus ábra a katalízis során végbemenő konformáció-változásokról (E: enzim) (Malito et al., 2004).

15

2.2. A ciklohexanon-monooxigenáz biokatalitikus alkalmazása Az élőlényekben lejátszódó Baeyer-Villiger oxidációs lépések fontosak különböző természetes vegyületek szintézisekor, mint pl. az aflatoxinok előállítása a gombáknál, különféle toxinok a kagylóknál, illetve a növények esetében számos allergiát kiváltó vegyület keletkezésekor. Ezeken kívül baktériumfajoknál is megfigyelték a BaeyerVilliger oxidációt. Turtiff 1948-ban használt először élő sejteket a szteroidok „A” gyűrűjének Baeyer-Villiger oxidációjára, majd 1953-ban kettő kutatócsoport is foglalkozott a progeszteron, illetve a tesztoszteron oxidálásával BVMO-kat termelő sejtek segítségével (Mihovilovic et al., 2002). Mióta 1976-ban Donoghue és munkatársai (1976) tisztították és jellemezték az Acinetobacterből származó 61 kDa-os (542 aminosavból álló) monomer CHMO-t, azóta ez az enzim a legrészletesebben tanulmányozott BVMO. A CHMO enzim az Acinetobacterben a ciklohexanol lebontásában játszik szerepet (5. ábra).

5. ábra: A ciklohexanol biológiai lebontása (Mihovilovic et al., 2002).

Eredetileg a CHMO termelődését az Acinetobacter olyan tápoldatban való növesztésével érték el, amelyben egyedüli szénforrásként kizárólag ciklohexanol volt jelen. A CHMO génjét 1988-ban klónozták és szekvenálták, és mivel az Acinetobacter patogén, különböző expressziós rendszereket fejlesztettek ki egyszerűbb használatára, élesztő- és nempatogén baktériumfajokkal. A természetben betöltött szerepe mellett a BVMO alkalmas, amint az az eddigi kutatásokból kiderült, száznál is több különböző szubsztrátum átalakítására: prokirális ketonok oxidálására éppúgy, mint racém prekurzorok enantioszelektív lebontására (Donoghue et al., 1975; Iwaki et al., 1999; Cheng et al., 2000). Kísérleti úton az enzim aktív centrumának modelljét a szubsztrátum-specificitás, tér- és polaritás-szükségletek tanulmányozásával próbálják felállítani. Az itt bemutatásra kerülő biotranszformációkhoz – legyenek azok izolált enzimmel, vagy rekombináns sejtekkel (élesztő, vagy/és E. coli) végzett kísérletek – csak kis mennyiségű kiindulási vegyületet használtak, a terméket nem tisztították, a konverzió és enantioszelektivitás adatokat gázkromatográfiás mérésekkel 16

határozták meg. A táblázatokban „–” jellel jelöltem azokat az adatokat, ahol nem játszódott le a reakció, vagy amelyeket nem tudtak meghatározni, vagy a keletkezett molekula optikailag nem aktív. A biotranszformációk során keletkezett termékek számozása a 6. ábrán látható. A továbbiakban is az itt megadott számozások az érvényesek. A konverzió a reakció

során

a

kiindulási

anyag

átalakulása

%-ban,

ennek

meghatározása

gázkromatográfiával történt. Hozam a tisztítás utáni tiszta termék mólszáma és a kiindulási anyag mólszámának a hányadosa.

O 6

8

5

O

O 2 3

4 3 2

7 O 1

O

1 7 6

8

9

4

5

9

6. ábra: A keletkező laktonok számozása.

2.2.1. Hattagú, heteroatomot nem tartalmazó ketonok biotranszformációja

A CHMO enzim enantioszelektivitás-eredetének tanulmányozása érdekében összehasonlították a 4-mono, és 4, 4-diszubsztituált ketonok rekombináns sejtekkel végzett biotranszformációkból kapott eredményeit (7. ábra, 1. táblázat).

7. ábra: 4-mono, és 4, 4-diszubsztituált ketonok biotranszformációja.

Megfigyelték, hogy a metil- és etilcsoportokkal diszubsztituált szubsztrátumok térbelileg nem gátolták az enzim katalitikus képességét, spirogyűrűs rendszerek esetében is lejátszódott a reakció (1. táblázat).

17

R’

R’’

Konverzió (%)

Enantiomer felesleg (%)

Me

H

61

>98

Me

Me

61

-

Et

H

91

97

Et

Me

91

75

Et

Et

60

-

Ciklo-CH2CH2

74

-

Ciklo-OCH2CH2O

40

-

1. táblázat: 4-mono, és 4, 4-diszubsztituált ketonok biotranszformációinak eredményei (Mihovilovic et al., 2002).

A két különböző oldalláncot tartalmazó szubsztrátum esetében (R’=Et, R”=Me) a termék optikai tisztasága alacsonyabb lett, mint monoszubsztituált terméknél. A termodinamikailag kedvező konformáció esetében a 4-alkilcsoport ekvatoriális helyzetben van, így az ellentétes konformációk között jelentős az energiakülönbség. A szubsztituensek közelebbi azonossága miatt az energiakülönbség csökken, akár annyira, hogy a lehetséges Criegee intermedierek között elhanyagolható is lehet, aminek következményeként mindkettő szerkezet (enantiomer) kialakulhat a biotranszformáció során. Példaként megemlítem, hogy a metil- és etilcsoportokkal szubsztituált terméknél a kisebb enantiomer felesleg (ee.) az átmeneti állapotok közötti kis (1,2 kcal/mol) szabadenergia-különbséggel magyarázható. Izolált enzimekkel végzett kísérletekből kiderült (Schwarz-Linek et al., 2001), hogy diszubsztituált

ciklohexanonokat

szubsztrátumként

használva,

a

termék

enantioszelektivitása megfelelő volt, viszont a konverzió értéke az oldallánc helyzetétől nagymértékben függött (2. táblázat).

18

Szubsztrátum

Főtermék

Konverzió / enantiomer felesleg (% / %)

73 / 98

27 / >98

25 / >98

- / 48

2. táblázat: Ciklohexanonok biotranszformációinak eredményei az oldalláncok helyzetének függvényében (Mihovilovic et al., 2002).

A következő Baeyer-Villiger oxidációt Brevibacteriumból származó CHMO-val végezték cisz-3,5-dimetil-ciklohexanonon (8. ábra). O

O

O

8. ábra: A dimetil-ciklohexanon biotranszformációja.

Jellemzően egy baktériumban csak egy CHMO enzim van, de a Brevibacteriumban kettőt találtak. Amikor párhuzamosan végezték a biotranszformációkat ezzel a két enzimmel (3. táblázat), azt tapasztalták, hogy hozam és az enantioszelektivitás értékei nagyon hasonlóak, de amíg a Brevi I enzim a negatív előjelű optikai forgatóképességgel rendelkező terméket állította elő, addig a Brevi II épp az ellenkező enantiomert. Tehát 19

érdemes ennek a kettő enzimnek a működését tanulmányozni, hiszen azokkal akár elő lehetne állítani egy adott szubsztrátum kettő megfelelő tisztaságú enantiomerjét.

[α]D20 (CHCl3)

61

Enantiomer felesleg (%) 97

-10,7

Abszolút konfiguráció 4R, 6S

56

99

+9,6

4S, 6R

Enzim

Hozam (%)

Brevibacterium I Brevibacterium II

3. táblázat: Cisz-3,5-dimetil-ciklohexanon biotranszformációjának eredményei (Mihovilovic et al., 2003a).

2.2.2. Hattagú, karbociklusos és heteroatomot tartalmazó ketonok biotranszformációja

Walsh és munkatársai fedezték fel, hogy a CHMO képes heteroatomot tartalmazó molekulákat is oxidálni (Ryerson et al., 1982; Branchaud et al., 1985). A 4-szubsztituáltciklohexanon prekurzorok esetében a CHMO jó szelektivitást mutatott S laktonok előállításában (9. ábra és 4. táblázat). O

O

O

R R 9. ábra: 4-szubsztituált-ciklohexanonok biotranszformációja.

Az izolált enzimmel és a rekombináns sejtekkel végzett biotranszformációk mind a hozam, mind az enantioszelektivitás tekintetében általában összevethető eredményeket adtak (Stewart et al., 1996). Három szénatomos egyenes szénlánc esetében a szubsztrátum megfelelően illeszkedett az aktív centrumba, nagyobb oldalláncok esetében viszont (pl. butil) megfordult a reakció sztereoszelektivitása. Az enzim érzékeny a sztérikus gátlásokra, a terc-butil oldallánc esetében a térbeli nagyság maximumát meghaladta a szubsztrátum, amit a jelentősen lecsökkent hozam értéke mutat (4. táblázat). A CHMO jól tolerálja a különböző funkciós csoportokat, mint pl. a kettős kötéseket a szubsztituensben (Stewart et al., 1998), ezenkívül még metoxi- és halolaktonok előállítására is sikerrel alkalmazták (Taschner et al., 1988; Mihovilovic et al., 2001a).

20

R

Konfiguráció

H Me

S S

Konverzió / enantiomer felesleg (% / %) izolált enzimmel 80 / >98

Et

S

83 / >98

Pr Bu iPr tBu Allyl OMe Br I

S R S S S S S S

80 / >98 70 / 52 60 / >98 17 / >98 76 / 75 -

Konverzió / enantiomer felesleg (% / %) rekombináns sejttel 79 / - (élesztő) 83 / >98 (élesztő) 61 / >98 (E.coli) 74 / >98 (élesztő) 91 / 97 (E.coli) 63 / 92 (élesztő) 60 / >98 (élesztő) 62 / 95 (élesztő) 84 / 78 (E.coli) 63 / 97 (E.coli) 60 / 97 (E.coli)

4. táblázat: 4-szubsztituált-ciklohexanonok biotranszformációinak eredményei (Mihovilovic et al., 2002).

Walsh és munkatársai (Mihovilovic et al., 2001b összefoglaló cikkben) által CHMO-val végzett biotranszformációknál az első hattagú, heterociklusos szubsztrátum kenet tartalmazott. Napjainkra azonban már a heteroatomot tartalmazó szubsztrátumok száma kibővült például nitrogénatomot tartalmazó szubsztrátumokkal is (10. ábra, 5. táblázat). O

O

O

R

X

R

R

X

R

10. ábra: Heteroatomot tartalmazó hattagú gyűrűs molekulák biooxidációja.

21

X

R

Konverzió / enantiomer felesleg (% / %)

S

H

48 / -

NMe

H

50 / -

NCOMe

H

39 / -

NCOOMe

H

40 / -

O

H

79 / -

O

Me

79 / >99

5. táblázat: Heteroatomot tartalmazó szubsztrátumok biooxidációinak eredményei (Mihovilovic et al., 2002).

Szintén Acinetobacterből származó CHMO-val katalizált oxidáció során azt vizsgálták (Mihovilovic et al., 2003b) hattagú, oxigént tartalmazó rendszerekkel, hogy az enzim milyen oldallánc esetén képes még a katalízisre (6. táblázat).

Szubsztrátum

Hozam (%) 80

90

19

Termék csak nyomokban található

Termék nem keletkezik

6. táblázat: Pironok Baeyer-Villiger oxidációjának eredményei (Mihovilovic et al., 2003b).

22

A metil- és etil- oldalláncok esetén az oxidáció jó konverzióval játszódott le, míg npropilcsoport esetében alacsony volt az átalakítás. Izopropil- és butil- oldalláncokkal nem ment végbe számottevően a reakció, az oldalláncok már túl nagynak bizonyultak ahhoz, hogy az enzim aktív centrumában lejátszódjon a katalízis. Korábban Mihovilovic és munkatársai (2005) és Iwaki és munkatársai (2002) is vizsgálták különböző laktonok antipódjainak előállítását a BVMO enzimcsalád néhány képviselőjével. Ezekkel a kísérletekkel a CHMO és CPMO (ciklopentanon monooxigenáz) enzimek

sztereospecificitását

kutatták.

A

felhasznált

BVMO-k

a

következő

baktériumfajokból származtak: Acinetobacter, Arthrobacter, Brachymonas, Brevibacterium (I és II), Comamonas (CPMO), Rhodococcus (I és II). A kísérletek eredményeiből felállították azt a hipotézist, mely szerint a felhasznált BVMO-kat két csoportba lehet sorolni. A BVMO-k fő csoportjába tartozó enzimek (a CHMO típusúak) a vizsgált szubsztrátumokból az ellentétes optikai forgatóképeséggel rendelkező laktonokat állították elő, mint a CPMOComa és a CHMOBreviII. Ez az általános tendencia egyedül a CHMOBreviI enzimnél nem volt megfigyelhető, a sztereospecificitást illetően a CHMO típusúak közé tartozott, viszont nem alakított át olyan ketonokat, amit a csoport tagjai igen.

2.3. A szubsztrátumok előállításához szükséges reakciók irodalmi háttere A biciklusos rendszerek előállítása szempontjából a [4+3] cikloaddíció az érdeklődés középpontjában áll. Ezzel a reakcióval előállítható biciklo [3,2,1] ketonok értékes molekulák, hiszen ezek a vegyületek fontos építőkövek a szerves kémiában, és a farmakológiailag aktív molekulák széles skálájának prekurzorai (Hoffmann, 1984). Ebben a ciklizációban a perbróm-keton oxiallil vegyületet hoz létre. Az α-α’-dehidrohalogénezés az ikerionos oxiallil kation keletkezését idézi elő, amely elektrofilként viselkedik a cikloaddícióban. Az oxiallil kation elektrofil reakcióképességének felfedezése, és a keletkező heteroszubsztituált kationoknak három szénatomos komponensekként való felhasználása a cikloaddíciós reakciókban fontos újítást jelentenek (Fort, 1962). Nem szubsztituált enonok előállítása rendkívüli módon nehéz. Korábban publikált eredményekből kiderül, hogy oxigén-tartalmú biciklusos rendszerek – mint különböző természetes vegyületek prekurzorai – előállításához eddig toxikus (Noyori, 1979), pirofór (Carrel et al., 2000), drága (Sato et al., 1978) reagenseket, katalizátorokat használtak. Hoffmann (1984) furánt, 2-metoxi-allil-bromidot és katalizátorként ezüst-trifluóracetátot használt a biciklusos molekula előállítására (11. ábra). A ciklizációs reakciókban közvetlenül keletkező dibróm (vagy tribróm) intermedierek kevésbé stabilak, így nagy 23

gondot fordítottak ezek azonnali redukálására. O AgOCOCF3

OMe

O

+

Br O

11. ábra: Cikloaddíció ezüst-tartalmú katalizátorral (Hoffmann, 1984).

Ezt a módszert továbbfejlesztve Hoffmann és munkatársa (2000) már a következő reakcióval állította elő furánból a terméket, tetrabróm-aceton, trietil-borát és aktivált cink alkalmazásával (12. ábra).

+

Br

Zn, B(OEt)3

Br Br

O

O

O

O

Br

Br

Br

+

Br O

O

Br

Br

12. ábra: Cikloaddíció aktivált cinkkel (Hoffmann et al., 2000).

Ezzel a 2,5 órás termikus eljárással a dibróm- és a tribróm-biciklusos molekula is keletkezett. A metanolban oldott intermediereket Cu/Zn katalizátor és ammónium-klorid segítségével redukálták -78 °C-on. Montana és munkatársa (2001) [4+3] cikloaddíciós reakciókon végeztek összehasonlító vizsgálatot termikus és szonokémiai feltételek mellett (13. ábra). Ultrahang használatával nagyon enyhe körülmények szükségesek a heterogén reakciókban (Bremner, 1994). O

O

z

Cu/Zn

+ X

Z=CH2, O, NCOOMe

X

X

O

X=Br, I

X

13. ábra: Cikloaddíció réz-cink katalizátorral (Montana, 2001).

Megállapították, hogy az ultrahang használatával jelentősen lerövidültek a reakcióidők: dibróm-aceton reakciópartnerrel 90 percre, dijód-acetonnal pedig 7 percre. Ezekből a kísérletekből az is kiderült, hogy a brómozott reakciópartnerrel lényegesen jobb hozam érhető el. A halogénezett intermedierek redukálása Fe2(CO)9 (80°C, 18 óra) vagy Cu/NaI (60°C, 4 óra) katalizátorokkal történt. Az előző cikkek alapján alkottam meg a nem szubsztituált enonok szintézisét ultrahangos módszerrel. 24

2005-ben a kémiai Nobel-díjat Yves Chauvin, Robert H. Grubbs és Richard R. Schrock tudósok kapták „a szerves szintézisekben alkalmazott olefin metatézis módszerének kifejlesztéséért”. Eredményeik lehetővé tették, hogy az olefin metatézis fontos és meghatározó módszerré váljon, és bekerüljön a szerves kémikusok eszköztárába. A díjazottak a metatézis mechanizmusának tisztázása mellett hatékony katalizátorokat is kifejlesztettek (többek között az általam is használt Grubbs, Ru-tartalmú katalizátorokat) ezeknek a reakcióknak a kivitelezéséhez. A katalitikus metatézissel a szintézisek lerövidülnek és kevesebb felesleges melléktermék keletkezik. Az olefin metatézis az egyetlen szénlánc rekonfigurációs reakció, amelyben a C-C kötések fémtartalmú karbénkomplexek jelenlétében átrendeződnek (Grubbs et al., 1998; Fürstner, 2000; Grubbs, 2003). Az elmúlt években a polimer kémiában kifejlesztettek egy sokoldalú, hatékony módszert: a gyűrűzárási metatézist, amely makrociklusok előállításához, számos természetes vegyület, és bioaktív termék szintézisére használható (Felpin et al., 2003; Ramachandran et al., 2003; Prunet, 2003; Fuerstner, 2003). Azonban a gyűrűnyitási metatézist (ROM), amely hasznos módszer lenne terminális diolefinek előállításához, és funkcionális gyűrűk szintéziséhez, mint komplementer reakciót eddig még nem dolgozták ki megfelelő alapossággal (Weeresakare et al., 2004; Connon et al., 2003; Hofle et al., 2003). Eddig gyűrűnyitási metatézist, csak „nagyon” feszített biciklusokkal, mint pl. norbornénekkel és ciklobutadiénekkel végeztek (Randall et al., 1995; Randall et al., 1997; Tallarico et al., 1997; Schneider et al., 1996). Wright és munkatársai (2001) biciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on

típusú molekulákon

végeztek már gyűrűnyitási reakciókat Ru-tartalmú katalizátorokkal (14. ábra), és Veldhuizen és munkatársai (2005) Ru- és Ag-tartalmú katalizátorokkal ill. Gillingham és munkatársai

(2004)

szerkezetileg

hasonló

vegyületekkel

tanulmányoztak

egy

aszimmetrikus gyűrűnyitási reakciót sztirollal és szintén Ru-tartalmú katalizátorokkal.

O

O

O O

R

R

14. ábra: Gyűrűnyitási reakció Wright (2001) alapján, R= Ph-, o-BrPh-, CH3(CH2)3-, BrCH2-, BrCH2CH2-, MeO2C-, EC-. A gyűrűnyitási metatéziseket tárgyaló irodalmakból kiderül az is, hogy gázhalmazállapotú olefineket használva, azok polimerizációja nem figyelhető meg a reakciók során. 25

2.4. Izolált enzimek vagy élő sejtes rendszerek használata A monooxigenáz enzimek használata a szintetikus kémiában a kofaktorok miatt bonyolult és drága. A FAD prosztetikus csoport általában szorosan kötődik az enzimhez és a katalitikus körben regenerálódik. A NADPH viszont az enzimatikus transzformáció során elfogy, így a költségtakarékos biotranszformáció eléréséhez a kofaktorokat vissza kell forgatni. Ennek a problémának a megoldására kettő lehetőség kínálkozik: izolált enzimek használata a kofaktorok regenerálásának megoldásával, vagy élő sejtes rendszerekkel végzett biotranszformációk. Izolált enzimek felhasználásakor a legjobb és a legszélesebb körben elterjedt módszer a NADH visszaforgatásához a formát-dehidrogenáz (FDH) enzim alkalmazásával, amely katalizálja a formát oxidációját szén-dioxiddá (Wichmann et al., 1981), a NADPH regenerálásához pedig a glükóz-6-foszfát (G6P)/glükóz-6-foszfát dehidrogenáz (G6PDH) rendszer lehet segítségünkre (Wong et al., 1981). Az élő sejtekkel végzett biokatalízis elegáns megoldást nyújt a kofaktorok problémájára, hiszen az élő organizmusok természetes visszaforgató rendszerrel rendelkeznek az összes szükséges faktorhoz. Mindemellett ebben az esetben elkerülhetők a bonyolult fehérjetisztítási eljárások, melyek izolált enzimek használatakor igencsak megnehezítik és megdrágítják a reakciót, és az enzim instabilitása sem korlátozza annak alkalmazhatóságát. A legtöbb esetben a sejtek könnyen növeszthetők és tárolhatók. Negatívumként viszont meg kell említeni egyrészt, hogy a mikroorganizmusokkal végzett reakciók esetében általában a termék kinyerése okozza a legfőbb gondot a híg, nagytömegű sejtet tartalmazó fermentléből, másrészt pedig az izolált enzimekkel szemben az egész sejtes rendszerek az enzimek sokaságát tartalmazzák, amelyek növelik a rendszer összetettségét. Ez a probléma kiiktatható, ha speciális génmanipulált rendszereket fejlesztünk ki.

26

2.5. Filamentáris enzimrendszerek 2.5.1. A flagellin és a flagelláris filamentum jellemzése

A flagellumok a baktériumok mozgásszervei. A bakteriális flagellum hosszú helikális filamentumai a sejtmembrán felszínén találhatóak és flagellin fehérjék (FliC) több tízezer példányából épülnek fel (Namba et al., 1997). A flagelláris filamentumok önszerveződő rendszerek, azaz megfelelő körülmények között a flagellin monomerek spontán képesek összeállni a natív filemantum szerkezetével megegyező filamentummá. A flagellin alegységek polimerizációja könnyen ellenőrizhető és a képződött filamentumok fizikai, kémiai hatásokkal és proteázokkal szemben ellenállóak, szerkezetét atomi szinten ismerjük (Samatey et al., 2001; Yonekura et al., 2003). A Salmonella typhimurium baktériumból származó flagellin 494 aminosavból áll. Különböző baktériumfajokból származó flagellinmolekulák aminosavsorrendjét összevetve nagyfokú homológia állapítható meg a terminális régiók esetében, - amely alatt Salmonella typhimurium esetében kb. 66 aminosavnyi N-terminális és 44 aminosavnyi C-terminális rész értendő -, azonban a fehérjék központi része nagyon variábilis (Wilson et al., 1994). Különböző eredetű flagellinek molekulatömege tág határok között változik (28-65 kDa), ezek a különbségek a központi rész eltérő méreteiből adódnak. A flagellin alegységek a sejt belsejében szintetizálódnak és a flagellum-specifikus exportapparátus segítségével jutnak el beépülési helyükre, a filamentum végére (Macnab 2004; Muskotál et al., 2006). A részlegesen kitekeredett monomerek feltételezhetően a flagellum keskeny központi csatornáján (25-30 Å) keresztül szállítódnak. Ismertté vált, hogy a konzerválódott N-terminális 22 aminosav hosszúságú szegmense szükséges ahhoz, hogy a flagelláris exportrendszer felismerje a szállítandó fehérjét (Végh et al., 2006; Gál et al., 2006). A konzerválódott terminális régióknak is fontos szerepük van a flagellin önszerveződésében (Vonderviszt et al., 1991), hiszen a polimerizálódás során α-helikális kötegekké rendeződve stabilizálódnak és így alkotják a filamentumok központi részét (Mimori-Kiyosue et al., 1997). A flagellin monomerek proteázokkal könnyen emészthetők, pl. tripszinnel is gyorsan megtörténik a rendezetlen terminális régiók eltávolítása és létrejön egy viszonylag stabil 40 kDa-os molekula, amely csak lassan emésztődik tovább egy 27 kDa-os molekulává. A polimerizáció során a rendezetlen terminális régiókból kialakult α-helikális kötegektől erősödik a szerkezet, így a filamentum már ellenálló a tripszinnel szemben is (Vonderviszt et al., 1989). 27

A flagellin alegységek 11 protofilamentumba rendeződve alkotják a flagelláris filamentumot, amelyben a monomerek erős kölcsönhatásban vannak egymással (15. ábra). Csak a flagellin alegységek konzerválódott terminális régiói vesznek részt a filamentum felépítésében, a variábilis központi részük a D3 domént alkotja, amely a filamentum felszínén helyezkedik el (16. ábra).

15. ábra: A flagellin alegységek 11 protofilamentumba rendeződve építik fel a flagelláris filamentumok szerkezetét. (Samatey, et al., 2001).

(a) D

(b)

D

16. ábra: (a) A flagellin alegységek szerkezete. (b) A flagellin alegységek elhelyezkedése a flagelláris filamentumokban. (Yonekura et al., 2003). 28

A D3 domén nem lép kölcsönhatásba a szomszédos alegységekkel és nincs lényeges szerepe a filamentáris szerkezetek felépítésében (12. ábra). A D3 domén a génsebészeti eljárások célpontja lehet, mivel könnyen módosítható a flagellin alegységek önszerveződésének és szállítódásának károsodása nélkül.

2.5.2. Flagelláris display-technológiák Kuwajima (1988) már 1988-ban állított elő olyan E.coli flagellin mutánsokat, amelyeknek variábilis központi részén végeztek deléciókat. A legkisebb deléciós mutáns csupán az N-terminális 193 és a C-terminális 117 aminosavát tartalmazta. Azóta a flagellin központi variábilis régiója jelenti a célpozíciót az idegen eredetű fehérjék génjeinek beillesztéséhez, hogy így azok megjelenhessenek a flagellumok felületén. A flagelláris displayt leggyakrabban az új rekombináns vakcinákkal kapcsolatos kutatásokban használják (Luna et al., 1997), emellett random peptid könyvtárak tesztelésére is alkalmazható, a fág-display technika egyik alternatívájaként. Lu és munkatársai (1995) létrehoztak egy olyan fúziós fehérjét, amelyben az E. coli thioredoxinjának teljes génjét építették be a flagellin gén cserélhető régiójába. Ezaki és munkatársai (Ezaki et al., 1998) szintén E. coli sejtek felszínére juttattak ki eltérő hatékonysággal rekombináns fehérjéket a flagellin gén segítségével. A fúziós fehérjék felszínre jutása az inszert nagyságától és szekvenciabeli helyétől függött, ezeken kívül még számos fel nem derített tényező is áll ennek hátterében.

2.5.3. A flagellin-enzim fúziós fehérjék létrehozása A flagelláris display esetében demonstrálták, hogy a flagellin variábilis részének nagy fragmentumai eltávolíthatóak és idegen peptideket vagy fehérjéket lehet beültetni erre a helyre úgy, hogy azokat az E. coli vagy a Salmonella baktériumok termeljék (Luna et al., 1997; Lu et al., 1995; Ezaki et al., 1998). Ezeknél az első próbálkozásoknál az eltávolított régiókat véletlenszerűen választották ki nagyfelbontású szerkezeti információk hiányában. 2001-ben viszont sikerült a Salmonella typhimurium flagelláris filamentumának atomi szerkezetét meghatározni (Samatey et al., 2001). Ennek alapján a Salmonella typhimurium flagellinjének egy szerkezetileg független régióját lehet módosítani, amely pontosan a D3 domén, a 190-284. aminosavig terjedő rész. Ezt a régiót kívánom lecserélni monooxigenáz enzimek (CHMO és CPMO) génjeire. A flagellin-enzim fúziós fehérjék egyik lehetséges nagy előnye az lenne, hogy 29

különböző filamentáris szerkezetek létrehozására felhasználhatók. A polimerizációs folyamat precíz ellenőrzésével a szükséges méretű filamentumok (0,1µm-20 µm) előállíthatók, amelyek az alegységek ezreit tartalmazzák. Monomer flagellinek oldatában a filamentumképződés elindítható precipitálószerek mint pl. ammónium-szulfát felhasználásával, vagy rövid filamentumok, mint magok, hozzáadásával (Asakura, 1970). Már az egyféle fúziós fehérjéből előállított filamentáris

szerkezetek is szolgálhatnak néhány előnnyel:

ezeknek a

filamentumoknak a felületén nagyon nagy sűrűségben lennének jelen a katalitikus egységek, jellemzően 5 nm-es távolságban egymástól. A filamentáris szerkezetekben az alegységeknek azonos a lokális környezete. Szobahőmérséklethez közeli hőmérsékleten a flagelláris filamentumok hosszú időn át stabilak, és ellenállóak a proteázokkal szemben. Az egyetlen tény, ami veszélyezteti épségüket, az a filamentumok végein található alegységek lassú depolimerizációja, ami alacsony ionerősség mellett következik be. Amennyiben a flagellinenzim fúziós fehérjék képesek lennének exportálódni és filamentumot formálni a baktérium felületén, ezzel egyidejűleg a felületen enzimek nagy mennyiségben jelennének meg. Ezek a baktériumok, mint új mikrobiális biokatalizátorok hatékonyan alkalmazhatóak lennének biokonverziók esetében. Az ilyen felületek létrehozása egy egyszerű módja a rögzített enzimek előállításának és ez a módszer a gyakorlatban megszüntetné az enzimtisztítás szükségességét. Az előzőekben említett eljárásnak viszont vannak nyilvánvaló korlátozó tényezői, mint pl. a vizes közeg és a fiziológiai körülmények szükségessége. Ennek az egyfajta enzimet tartalmazó nanoszerkezetnek is több előnye van a már ismert rendszerekhez képest. Segítségével létrehozhatunk például olyan baktériumokat, amelynek a felszínén biokatalízisre képes filamentumok nőnek, és a reakció végeztével ezek a struktúrák könnyen eltávolíthatók, mivel az enzim fúziós fehérjeként vesz részt a flagellumok kialakításában, nem önmagában van jelen a katalízis során. Az ilyen filamentáris multienzim-szerkezetek a következő előnyökkel rendelkeznének

a

különböző

biotechnológiai

alkalmazásokban:

hordozók

nélkül

alkalmazhatók, könnyen elválaszthatók a terméktől centrifugálással vagy ultraszűréssel, amely összehasonlítva a manapság használatos biokatalitikus enzimreakciókkal, elegáns és egyszerű megoldást jelentene, és használhatóak olyan körülmények között is, ami az élő sejtekre ártalmas lehet. A jövőben érdemes lenne továbbfejleszteni a filamentáris enzimszerkezeteket kapcsolt reakciókat katalizáló enzimek használatával, vagy az egyéni enzimeket a kofaktor-regeneráló enzimek együttes alkalmazásával. Ezen az irányvonalon elindulva a molekuláris biológia és biotechnológia modern eszközeivel olyan enantioszelektív és környezetbarát eljárásokat lehet kidolgozni a későbbiekben, amelyek a szerves vegyipari és gyógyszeripari alkalmazások alapját képezhetik. 30

3. Kísérleti rész A különböző alfejezetekben az azonos típusú reakciók kivitelezéséhez szükséges összetevők előállítását tárgyalom, megadok egy általános eljárást a reakciók elvégzéséhez, majd egy–egy adott molekula előállításához szükséges vegyszereket, azok mennyiségét, illetve a körülményeket ismertetem. A vegyületek előállításánál részletesen csak azt a reakciót fejtem ki, amellyel a legjobb kitermelést értem el. A biciklusos vegyületek előállítására szolgáló ultrahangos fürdőben kivitelezett

[4+3] cikloaddíciós reakcióval, majd az így kapott termékek debrómozásával állítottam elő a biciklusos molekulákat. Ezt követően a biciklusos vegyületek gázhalmazállapotú olefinekkel kivitelezett gyűrűnyitási metatézisei következnek. Ezzel a reakcióval előállított molekulákat vagy tisztítás után közvetlenül felhasználtam a biotranszformációkhoz, vagy katalitikus hidrogénezésnek vetettem alá, és ezután került sor a mikrobiális Baeyer-Villiger oxidációra. A biológiai oxidációk kontrolljaként elvégeztem a kémiai Baeyer-Villiger oxidációkat is, a kapott termékek NMR (magmágnes-rezonancia) és gázkromatográfiás (GC) adatait felhasználtam a biotranszformációkkal előállított termékek azonosítására. A kémiai Baeyer-Villiger oxidációkat részletesen nem kívánom kifejteni, csak az általános módszert írom le. Ebben a fejezetben a biológiai oxidációk kivitelezését is tárgyalom, a lejátszódott biooxidációk adatait táblázatba foglalva az Eredmények és következtetések című fejezetben adom meg. Az Eredmények és következtetések című fejezetben részletesen nem tárgyalt reakciók eredményei, a keletkezett termékek analitikai adatai a mellékletben találhatók.

3.1. Felhasznált anyagok és módszerek A munkám során felhasznált szerves oldószereket használat előtt desztilláltam. Az ultrahangos reakciók során Bandelin Sonorex super RK102H ultrahangos fürdőt használtam. A termékek tisztítását szilikagél 60 (40-63 µm, Merck) töltettel kiviteleztem. A GC vizsgálatok ThermoQuest Trace GC 2000 készülékkel készültek, DB5 (30 mm x 0.32 mm ID) és BGB 175 (30 mm x0,25 mm ID, 0,25 µm film) oszlopokkal. Az enantiomer felesleget (e.e.) a királis oszlopon végzett GC adatokból határoztam meg. Az NMR spektrumok felvétele CDCl3 oldószerben, Me4Si belső standarddal, Bruker AC 200 (200 MHz) és Bruker Avance Ultrashield 400 (400 MHz) spektrométeren történt. A fajlagos optikai forgatóképességet ([α]D20, 20°C-on, a nátrium D vonalára, 589 nm-re 31

vonatkoztatva) Perkin Elmer Polarimeter 241 műszerrel határoztam meg a következő összefüggést használva: [α ]D = 20

100 ⋅ α ; α:: a polariméterrel mért érték, a polarizációs sík c ⋅l

elforgatásának szöge [°]; c: koncentráció [g/100 mL]; l: az oldat rétegvastagsága [dm]. Reakcióim kivitelezése során vékonyréteg kromatográfiát használtam a konverziók ellenőrzéséhez. A biotranszformációk során felhasznált E. coli expressziós rendszereket Dr. Pierre E. Rouviere (E.I. Dupont Company) –től, és Prof. Margaret M. Kayser (University of New Brunswick) –től kaptam. A BVMO géneket tartalmazó plazmidokkal transzformált E. coli DH5α baktériumokat ampicillin tartalmú Luria-Bertani (LB) táptalajon növesztettem –80 °C-on

tárolt

glicerines

kultúrákból,

a

reakciókhoz

a

táptalajról

különálló

baktériumtelepeket választottam ki. A flagellin-enzim fúziós fehérjék létrehozásához a pKOT-1 plazmidot használtam, melyet a Magyar Tudományos Akadémia (MTA) Szegedi Biológiai Központ (SZBK) Enzimológiai Intézete bocsátott rendelkezésemre. Ez a plazmid pBR322 alapú, a flagellin promóterét és génjét EcoRI helyen tartalmazza. Az Acinetobacter CHMO génjét a pDR01 és a Comamonas CPMO génjét a pDR05 plazmidokból PCR-eztem (PCR: polimeráz láncreakció), amelyeket a Bécsi Műszaki Egyetemről Dr. Marko D. Mihovilovic felajánlásával használok. Plazmidok megsokszorozására minden esetben E. coli TOP10 sejteket alkalmaztam. A plazmidok tisztításához Omega E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit II-t (általában 10 ml baktériumkultúrából preparáltam plazmidot és 50 µl steril deszt. vízzel eluáltam), PCR termékek gélből izolálásához és DNS fragmentumok emésztése után Promega Wizard SV PCR-Clean-up kitet használtam. A DNS-eket a New England Biolabs Inc. restrikciós endonukleázaival emésztettem, az emésztésekhez az enzimeknek megfelelő standard protkollokat alkalmaztam, a PCR reakciókat KOD polimerázzal végeztem. A PCR-ekhez és a szekvenáltatáshoz felhasznált primereket a MTA SZBK Nukleinsav Szintézis Laboratóriumából rendeltem. A ligálásokhoz a Fermentas Rapid DNA Ligation Kit-jét használtam az ajánlott előirattal. Az emésztett plazmid defoszforilálására SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase, Promega) enzimet alkalmaztam az enzimhez tartozó leírás alapján. A DNS fragmentumok detektálására és izolálására agaróz gélelektroforézist végeztem. A DNS konstrukciók szekvenálását az MTA SZBK Szekvenáló Laborjában végezték. Az elkészült plazmidokat fehérjetermeltetés érdekében Salmonella SJW2536 flagellin-deficiens baktériumokba elektroporáltam. A baktériumok úszóképességét sötétlátóterű mikroszkóppal (Olympus BX FLA, UPlan FI 40x/0,75 objektívvel) és Malapaka és munkatársai (2007) által leírt motilitás teszttel vizsgáltam. A fehérjeminták

32

töményítéséhez Microcon oszlopot (30000 MWCO, Millipore, Bedford, MA, USA) használtam. A fehérjéket SDS (Sodium dodecylsulfate) gélelektroforézissel detektáltam, a fehérjekoncentrációkat Unicam Helios α fotométer segítségével határoztam meg a 280nmen mért értékekből a fehérjék extinkciós koefficienseit felhasználva (Ɛ280=17880 M-1cm-1 a vad flagellin esetében és Ɛ280=10430 M-1cm-1 a D3-deléciós flagellin esetében (EXPASY)). A vad flagellin és a D3-deléciós flagellin preparálását Vonderviszt és munkatársai (1989) alapján kiviteleztem. Cirkuláris dikroizmus (CD) mérésekhez a MTA SZBK Enzimológiai Intézetében lévő Jasco-720 spektropolarimétert használtam.

3.1.1. Cirkuláris dikroizmus

A Cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia a polarizált fény és egy optikailag aktív anyag (esetemben fehérje) kölcsönhatásán alapulnak, a fehérjeoldat elforgatja a rajta keresztülbocsátott polarizált fény síkját. A CD spektroszkópiával gyorsan nyerhetünk információt a fehérjék szerkezetéről. A távoli ultraibolya tartományban (180-260nm) felvett CD spektrumból következtethetünk a másodlagos szerkezeti elemek (α-hélix, βlemez, rendezetlen/random coil láncok) meglétére, illetve ezek arányára a fehérje térszerkezetében, míg a közeli UV tartomány (260-320 nm) az aromás oldalláncokról, azok egymáshoz viszonyított térbeli orientációjáról, vagyis a harmadlagos szerkezetről ad információt. A műszer felhasználható fehérjék különböző környezeti behatások (pl.: pH változás, hődenaturáció) során bekövetkező konformációs változások nyomon követésére is (http://esr.elte.hu/~noemi/labor/cd/cd.html). Munkám során fehérjék denaturációs hőmérsékletének meghatározására alkalmaztam.

A CD mérésekből kapott görbék

inflexiós pontjainak meghatározása Qtiplot program felhasználatával készült.

3.1.2. E.coli TOP10 kompetens sejt készítési eljárás

20 ml folyadék tápoldatba 50 µl előző éjjel 1 telepről felnövesztett baktériumkultúrát oltottam és felnövesztettem 37 ̊C-on, míg a 600 nm-en mért abszorbanciája elérte a 0,6-ot (kb. 3-4 óra). A sejteket 4 ̊C-on 4000 rpm-mel 10 percig centrifugáltam, innentől a baktériumcsapadékot a preparálás során jégen tartottam. Először 10 ml 0,1M MgCl2-vel óvatosan mostam a csapadékot, majd ismét kiülepítettem a sejteket, és másodszor 700 µl 0,1M CaCl2-be vettem fel. A sejtszuszpenziót 1 órán keresztül inkubáltam jégen, ezután az elkészült kompetens sejtekből 200 µl-t használtam transzformálásra. A kompetens sejtet a transzformálni kívánt plazmiddal jégen inkubáltam 33

1 órán át, majd 2 perc hősokk következett 42 ̊C-on. Ezt követően ismét lehűtöttem a sejteket és 800 µl folyékony LB tápoldatot adtam hozzá, amiben 37 ̊C-on 45 percig növesztettem. Ezután a transzformált sejteket kikentem a megfelelő antibiotikumot tartalmazó táptalajra.

3.1.3. Salmonella SJW2536 elektrokompetens sejt készítési eljárás

200 ml folyadék tápoldatot beoltottam 1 ml előző éjjel 1 telepről felnövesztett 20 ml-es starterkultúrából és növesztettem 37 ̊C-on, míg a 600 nm-en mért abszorbanciája elérte a 1,0-t (kb. 3 óra). Centrifugálás előtt a kultúrát 5 percig jégen inkubáltam, majd 4 ̊Con 4000 rpm-mel 10 percig fugáltam. A felülúszót leöntöttem, és a csapadékot 40 ml 4 ̊Cos steril 15%-os glicerinnel felszuszpendáltam. Ezt követően ismét centrifugáltam, és megismételtem az előző mosási lépést. A harmadik centrifugálást követően 20 ml 4 ̊C-os steril 15%-os glicerinnel mostam a csapadékot, majd ismét centrifugáltam. A csapadékot 800 µl 4 ̊C-os steril 15%-os glicerinbe vettem fel, és 40 µl-ként szétosztottam steril eppendorf csövekbe. Az így elkészített elektrokompetens sejtek -80 ̊C-on tárolhatók a felhasználásig. Az elektroporálást 3 kV-tal kiviteleztem 1-2 µl plazmid és 40 µl elektrokompetens sejt felhasználásával. Ezt követően 500 µl folyékony LB-ben növesztettem az elektroporált sejteket 37 ̊C-on 1 órán keresztül, majd kikentem a sejtszuszpenziót a megfelelő antibiotikumot tartalmazó táptalajra.

34

3.2. Általános sémák

O

+

Br

Br Br

Br

O

+

O

Br

X

Br Br

Br

Br

2 O Br

+ N

N

H

COOMe

O

Br Br

Br

Br

X=CH2 (a) X=O (b) X=NCOOMe (c) X

1c

3 O

O 4a

O 4b O 3a O 4c

35

O

O O

O

O

5d

6d

O

O O

O

O

5e

6e

O

O

O

O

O

O

5f

6f

O

O

O

4f

O O

O

6'f

3b

O

O 4g

O

O 4h

O 4i

O N 4j

COOMe

O

N-COOMe

N 4k

COOMe 3c

O

N COOMe

36

3.3. [4+3] cikloaddíció 3.3.1. Cu/Zn katalizátor és pirrol-1-karbonsav-metilészter (1c) előállítása

A cikloaddícióhoz felhasznált katalizátort LeGoff (1964) módszere szerint készítettem. 2,42 g réz-acetátot 100 ml tömény ecetsavban oldottam és refluxhűtővel hűtöttem. 60 g cinkport lassan hozzáadagoltam az oldathoz keverés mellett. További 5 perc reflux után az elegyet lehűtöttem szobahőmérsékletűre. A csapadékot szűréssel összegyűjtöttem, dietil-éterrel mostam, és vákuummal szárítottam. A Cu/Zn katalizátort argon atmoszféra alatt tároltam. A 3c molekula szintéziséhez először a pirrol-1-karbonsav-metilésztert állítottam elő (amelyet majd a cikloaddíciós reakcióban használtam fel): BuLi N

ClCOOMe

N 1c

H

COOMe

A reakciót Hodge és munkatársa (1963) leírása szerint kiviteleztem. 55 ml (2,367M, 1ekv.) n-butil-lítiumot csepegtetve hozzáadtam a 165ml dietil-éterben lévő 8,73 g (130,1 mmol, 1 ekv.) desztillált pirrolhoz kevertetés közben -40 °C-on argon atmoszféra alatt. Ezután a reakcióelegyet hagytam felmelegedni 0 °C-ra, és 12,3 g (130,1 mmol, 1 ekv.) metil-klórformátot tartalmazó 30 ml dietil-étert adtam hozzá. 4 órányi reflux után a keletkezett lítiumsót kiszűrtem, és a szűrletet telített NaHCO3 oldattal mostam. A szerves fázist vízmentes Na2SO4-tal szárítottam, a szárítószer kiszűrését követően a dietil-étert vákuumbepárlóval eltávolítottam. A terméket Kugelrohr desztillációval tisztítottam.

3.3.2. Általános módszer ultrahangos fürdőben kivitelezett reakciókhoz

X

O Br

Br Br

+

Br

Cu/Zn

X

Br

X=CH2 (a) X=O (b) X=NCOOMe (c)

O Br 2

A Zn vagy a Cu/Zn katalizátor és az acetonitril jéggel hűtött elegyéhez (30 %-os szuszpenzió) acetonitrilben oldott tetrabróm-acetont (TBA, 1 ekv., 40 %-os oldat) adtam. 37

(A Zn katalizátort a reakció előtt egy csepp dibróm-metánnal aktiváltam.). Ezután ezt a reakcióelegyet tartalmazó lombikot ultrahangos fürdőbe merítettem és elkezdtem szonikálni, végül frissen desztillált diént (3-15 ekv.) adtam az elegyhez. A reakciót GC-vel követtem nyomon, és víz (55 ekv.) hozzáadásával állítottam le. Az elegyet leszűrtem, és a vizes fázist dietil-éterrel háromszor extraháltam. A szerves fázist vízmentes Na2SO4-tal szárítottam, rotációs vákuumbepárlóval töményítettem (<30 °C-os vízfürdőben). A nyersterméket tisztítás nélkül használtam fel a következő debrómozási lépésben.

3.3.2.a. 2,4-dibróm-biciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on (2a) előállítása O Br

Br Br

Br

Zn

+

MeCN

Br

O

2a Br

A reakciót az általános ultrahangos módszer szerint kiviteleztem. Egy csepp dibróm-metánt adtam az acetonitril és az 1,97 g cinkpor (3 ekv., 30 %-os szuszpenzió), elegyéhez nitrogén atmoszféra alatt, majd hozzáadtam acetonitrilben oldott 3,8 g tetrabróm-acetont (10,06 mmol, 1 ekv.), végül a frissen desztillált 4,16 ml (5 ekv.) ciklopentadiént. 1 óra szonikálás után állítottam le a reakciót 10 ml (55 ekv.) vízzel. Az extrakció

előtt

a

csapadékot

leszűrtem,

dietil-éterrel

extraháltam,

a

terméket

betöményítettem és tisztítás nélkül használtam fel a debrómozásban.

3.3.2.b. 2,4-dibróm-8-oxabiciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on (2b) előállítása O O

O

Br

Br Br

Br

Cu/Zn

+

MeCN

Br

2b Br

O

A reakciót az általános eljárás alapján kiviteleztem. 1,97 g (3 ekv.) Cu/Zn katalizátor és acetonitril elegyéhez 3,8 g (10,06 mmol) TBA-t adtam, majd elkezdtem szonikálni. Végül 7,33 ml (10 ekv.) furánt adtam a reakcióelegyhez. 1 óra alatt játszódott le a reakció, amit 10 ml (55 ekv.) vízzel állítottam le. A szerves fázist szűrés után dietiléterrel extraháltam, majd vákuumbepárlóval betöményítettem.

38

3.3.2.c. 2,4-dibróm-8-metoxikarbonil-8-azabiciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on (2c) előállítása O Br

Br Br

+

Br

N COOMe Br

Zn N

MeCN

COOMe

2c Br

O

A reakciót az általános leirat szerint kiviteleztem. 1,4 g (3,7 mmol) TBA-t használtam fel 1,2 g (5 ekv.) cinkporral és 1,39 g 1c vegyülettel acetonitril oldószerben. 2 óra elteltével 3,7 ml (55 ekv.) vízzel állítottam le a reakciót. Szűrés után a vizes fázist háromszor extraháltam dietil-éterrel. 30 °C hőmérsékletű vízfürdőben vákuumbepárlóval betöményítettem a terméket, amit tisztítás nélkül használtam fel a következő debrómozási lépésben.

3.4. Debrómozás 3.4.1. Általános módszer debrómozáshoz X Br

2

O

X Cu/Zn X= CH2, O, NCOOMe 3

Br

O

A metanolban oldott dibróm intermedier 10 %-át cseppenként a frissen preparált Cu/Zn (10 ekv.) katalizátort tartalmazó ammónium-klorid metanolos oldatához (25 %) adagoltam –80 °C-on keverés közben. A reakcióelegyet 15 percig kevertettem ezen a hőmérsékleten, majd az intermediert továbbadagoltam, ügyelve arra, hogy a hőmérséklet ne emelkedjen –10 °C fölé. Miután az összes intermediert a lombikba csepegtettem, szobahőmérsékleten folytattam a keverést 2-12 órán keresztül, a GC eredmény függvényében. Az elegyet szűrtem, a csapadékot mostam dietil-éterrel, majd eltávolítottam a szerves oldószert. A bepárlás utáni maradékot kevés dietil-éter és telített NaHCO3 elegyében oldottam. A keletkezett csapadékot szűréssel eltávolítottam, és a vizes fázist háromszor extraháltam dietil-éterrel. Az egyesített szerves fázisokat nátrium-szulfáton szárítottam, szűrtem és vákuumbepárlóval töményítettem (<30 °C-os vízfürdőben).

39

3.4.1.a. Biciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on (3a) előállítása

2a Br

Br

Cu/Zn

O

MeOH

O

3a

A ciklizációban keletkezett 2,76 g 2a terméket használtam fel az általános debrómozási módszer alapján 20 ml metanolban oldva, 5,56 g (10 ekv.) Cu/Zn katalizátorral 30 ml NH4Cl metanolos (25 %) oldatában. 12 óra keverés után, a reakcióelegyet szűrtem, a csapadékot dietil-éterrel átöblítettem, a szerves szűrletet betöményítettem, majd mostam telített NaHCO3 oldattal és dietil-éterrel. A vizes fázist extraháltam dietil-éterrel, nátrium-szulfáttal szárítottam, szűrtem és vákuumbepárlóval betöményítettem.

3.4.1.b. 8-oxabiciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on (3b) előállítása O

2b Br

O

Br

Cu/Zn

O

MeOH

O

3b

Az általános debrómozás módszere szerint kiviteleztem a reakciót, 5,56 g (10 ekv.) Cu/Zn katalizátorral. 1 óra keverés után GC-vel teljes konverzió volt kimutatható. Ekkor a reakcióelegyet leszűrtem, a metanolos szűrletet betöményítettem, majd mostam telített NaHCO3 oldattal és dietil-éterrel. A vizes fázist háromszor extraháltam dietil-éterrel, nátrium-szulfáttal szárítottam, szűrtem és vákuumbepárlóval betöményítettem.

3.4.1.c. 8-metoxikarbonil-8-azabiciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on (3c) előállítása N COOMe Br

2c Br

O

N COOMe Cu/Zn MeOH 3c

O

A ciklizációval előállított 2c terméket alakítottam tovább az általános módszer alapján 2,41 g Cu/Zn katalizátorral. 12 óra kevertetés után az elegyet leszűrtem, a terméket 40

betöményítettem, mostam telített NaHCO3 oldattal és dietil-éterrel. A vizes fázist háromszor

extraháltam

dietil-éterrel,

nátrium-szulfáttal

szárítottam,

szűrtem

és

vákuumbepárlóval betöményítettem.

3.5. Gyűrűnyitási metatézisek O

O

X X

R

R

R= H, CH3, CH2CH3 X= CH2, O, NCOOMe

A bicikloketont (1 ekv., 100 mg) diklórmetánban feloldottam, és felette a lombikban átbuborékoltattam egy ballonból az olefint. Az 1 mol% katalizátort (Grubbs I vagy Grubbs II) szintén diklórmetánban (2 ml) oldottam, és beinjektáltam a reakcióelegybe. A reakció során 3 óránként cseréltem az olefines ballont. A konverziót GC-vel ellenőriztem. Az egyensúly elérésekor etil-vinil-étert adtam feleslegben az elegyhez, és 30 percig kevertettem. Az oldószert vákuumbepárlóval eltávolítottam, és a terméket oszlopkromatográfiával tisztítottam (LP/EtOAc=40/1). A 3c biciklo vegyületből nem sikerült előállítanom a várt 4i, 4j, 4k molekulákat ld. Eredmények és következtetések c. fejezet.

3.6. Katalitikus hidrogénezés 4f katalitikus hidrogénezésével állítottam elő az 5f molekulát. 4f-t etil-acetátban oldottam és 5 m% Pd/aktívszén katalizátorral Parr apparátusban 70 psi hidrogén nyomás alatt egy éjszakán át kevertem. A teljes konverziót GC-vel ellenőriztem, majd az elegyet szűrtem, a csapadékot etil-acetáttal mostam, végül a terméket betöményítettem.

41

3.7. Általános módszer kémiai Baeyer-Villiger oxidációkhoz Az oxidálni kívánt ketont metilén-kloridban oldottam (10 % oldat) és m-CPBS-t (meta-klór-perbenzoesav, 5-10 ekv.) adtam hozzá. A reakcióelegyet szonikáltam. A konverziót GC-vel ellenőriztem. A teljes konverzió után trietil-amint (5 ekv.) adtam az elegyhez, hogy a még megmaradt m-CPBS-sel vízoldható csapadékot hozzon létre. 30 perc múlva az elegyet telített NaHCO3 oldattal mostam, és háromszor extraháltam metilénkloriddal, az egyesített szerves fázisokat nátrium-szulfáton szárítottam, szűrtem, és vákuumbepárlóval töményítettem. A kémiai Baeyer-Villiger oxidációkból kapott termékek NMR és GC adatait használtam fel a biotranszformációkkal előállított termékek azonosítására.

3.8. Biológiai Baeyer-Villiger oxidációk 3.8.1. Biotranszformációk

A mikroorganizmusok az összes szükséges kofaktor forrásaként szolgálnak. Munkám során genetikailag módosított Escherichia coli kultúrákat használtam a biotranszformációkhoz, amelyek különböző BVMO géneket tartalmaztak overexpressziós vektorban. A gének a következő baktérium-fajokból származtak: Acinetobacter sp. NCIMB 9871 (CHMOAcineto) Brevibacterium HCU (CHMOBreviI és CHMOBreviII) Comamonas sp. NCIMB9872 (CPMOComa, ciklopentanon monooxigenáz) Acidovorax sp. (CHMOAcido) Arthrobacter sp. BP (CHMOArthro) Rhodococcus sp. Phi1 (CHMORhodoI) Rhodococcus sp. Phi2 (CHMORhodoII) Escherichia coli DH5α baktériumot használtam az enzimek termeltetésére és közvetlenül a biotranszformációra. Ennek a baktériumnak a genomjában található a T7RNS polimeráz génje, amely a lacUV5 promóter ellenőrzése alatt van. Ennek az aktív polimeráznak a termelődését a baktérium-kultúrához IPTG-t adva lehet indukálni. A T7RNS polimeráz felismeri a T7 promóter szekvenciát az enzim génje előtt, és elkezdődik a gén transzkripciója, amelynek az eredménye a nagy mennyiségben termelődő enzim (esetemben CHMO vagy CPMO). 42

3.8.2. Általános módszer a biotranszformációkhoz

A biotranszformációkat minden esetben 24 ºC-on, 250 ml LB tápoldatot és 200µg/ml ampicillint tartalmazó Erlenmeyer lombikokban végeztem egy éjszakán át, amelyeket előzőleg 2,5 ml overnight baktériumkultúrával oltottam be. 2 óra növesztés után a kívánt CHMO termelést 0,025 mM végkoncentrációjú IPTG (iso-propil-β-D-1 tiogalaktopiranozid) hozzáadásával indukáltam. Ekkor adtam a tápoldathoz a 100mg oxidálni kívánt kiindulási vegyületet is. A teljes konverzió általában 1 nap alatt ment végbe.

Néhány

esetben

1

ekvivalens

mennyiségű

β-ciklodextrint

adtam

a

biotranszformációk során a tápoldathoz, hogy megnöveljem a konverziót, hiszen az a szubsztrátum oldékonyságát növeli, a szubsztrátum sejtmembránon keresztüli könnyebb bejutását lehetővé teszi, és a toxicitását is lecsökkenti az élő sejtre nézve. A biotranszformációk végén a baktériumokat centrifugálással elválasztottam (4000rpm, 20 perc). A felülúszót háromszor extraháltam metilén-kloriddal, vagy kloroformmal. Ha nehezen ülepedő emulzió jött létre, akkor hyflo-n keresztül átszűrtem az elegyet. A szerves fázist nátrium-szulfáton szárítottam, szűrtem és vákuumbepárlóval töményítettem.

3.8.2.a. 1,4-dioxepan-5-on előállítása

O

O O

O 5d

O 6d

100 mg (1 mmol) 5d molekulát (Sigma-tól vásároltam) alakítottam át a nyolc rekombináns baktériummal β-ciklodextrin nélkül az általános biotranszformációs eljárás szerint, majd oszlopkromatográfiával tisztítottam.

3.8.2.b. Cisz-2,7-dimetil-1,4-dioxepan-5-on előállítása O

O

O

O 6e

O 5e

100 mg (0,78 mmol) 5e vegyületet (Birgit Grötzl-től kaptam) használtam fel szubsztrátumként a nyolcféle enzimmel végzett biotranszformációkhoz, β-ciklodextrin (1 43

ekv.) felhasználásával. A terméket oszlopkromatográfiával tisztítottam.

3.8.2.c. Cisz-2,7-dietil-1,4-dioxepan-5-on előállítása O

O

O

O

O

5f

6f

99 mg (0,63 mmol) 5f molekulát transzformáltam CHMOAcineto enzimmel,

β-

ciklodextrin (1 ekv.) jelenlétében. A terméket Kugelrohr desztillációval tisztítottam. A másik hét BVMO-val munkatársaim végezték a vizsgálatokat.

3.8.2.d. Cisz-2,7-divinil-1,4-dioxepan-5-on előállítása

O

O

O

O

O

4f

6'f

100 mg (0,66 mmol) 4f vegyülettel végeztem a biotranszformációt a nyolc rekombináns baktériummal β-ciklodextrin (1 ekv.) felhasználásával. A terméket oszlopkromatográfiával tisztítottam.

44

3.9. Flagellin-enzim fúziós fehérjék létrehozása

3.9.1. DS konstrukciók tervezése

A Salmonella typhimurium flagellinjének (FliC) egy szerkezetileg független régióját, a D3 domént (191-284. aminosavig terjedő rész) kívánom lecserélni monooxigenáz enzimek (CHMOAcineto és CPMOComa) génjeire. Első lépésként a D3deléciós mutánst állítottam elő úgy, hogy a teljes D3 domént eltávolítottam a fliC génből, és helyére egy rövid oligonukleotid szakaszt (linkert) illesztettem be. A linker tervezésekor figyelembe kellett vennem, hogy olyan aminosavakat kódoló nukleotidokkal alakítsak ki vágóhelyet a pKOT-1 plazmidban, amelyek a flagellin szerkezetét valószínűleg nem, vagy csak kis mértékben változtatják meg és emellett olyan restrikciós endonukleázt kellett választanom, ami nem hasítja az eredeti pKOT-1 plazmidot. Így esett a választás a PmeI enzimre. Tehát a D3 domén helyére beépített linker a következő aminosavakat tartalmazta a 190. és a 285. aminosavat is beleértve: GGLNSAA. A glicin kis méretéből adódóan lehetőséget biztosít a peptidlánc flexibilitására, a leucin és az alanin hidrofóbok lévén erősítik a kompakt szerkezetet, α-hélix kedvelő aminosavak. Az aszparagin adott aminosav volt a PmeI vágóhelyet kódoló nukleotidok miatt, a szerinnel együtt poláros aminosavak. Az előzőek alapján megtervezett és előállított D3-deléciós konstrukciót a soron következő kísérletekben használtam fel, mint a heterogén DNS szekvencia alapját. Azokat a flagellin szekvenciarégiókat,

amelyek

szükségesek

és

elégségesek

a

flagellinfehérjék

célbajuttatásához, a filamentumok végéhez való transzportálásához, nem módosítottam. Ez remélhetőleg azt eredményezi, hogy a rekombináns flagellin molekula - mivel megmarad az a képessége, hogy a sejt felszínén kifejeződjön - mint a flagelláris filamentumot felépítő alegység - könnyen izolálható és tisztítható lesz. A 17. ábrán részletesen láthatóak DNS-szinten a D3-deléciós illetve a fúziós konstrukciók kivitelezésének részlépései. A flagellin fehérje promóterét és génjét tartalmazó pKOT-1 plazmidból először AatII enzimmel kivágtam a flagellin génjét, az előtte lévő génszabályozó szakasszal, a promóterrel együtt, ezt jelzi az ábrán az AatII restrikciós endonukleáz vágóhelyei közötti kisebb fragmentum. Ezen a lineáris DNSszakaszon végeztem a későbbiekben a változtatásokat annak érdekében, hogy a flagellinből a D3 domén génszakaszát el tudjam távolítani. Polimeráz láncreakció (PCR) segítségével PmeI restrikciós vágóhelyet építettem be a D3-deléciós flagellin mutánsba, aminek segítségével lehet bejuttatni a mutáns flagellin génbe a fúzionáltatni kívánt enzim génjét. Ezután a D3 nélküli (deléciós) flagellin DNS-szakaszt visszaépítettem az üres plazmidba, 45

így létrejött a D3-deléciós flagellin mutánst tartalmazó plazmid, amely a későbbiekben használható volt arra, hogy a PmeI restrikciós vágóhelyre, a D3 domén helyére beültessek monooxigenáz enzimet. Ehhez az kellett, hogy a monooxigenázok génjét tartalmazó plazmid segítségével úgy sokszorozzam meg a CHMO és CPMO génjét PCR-rel, hogy annak a két végén PmeI restrikciós vágóhelyek legyenek. A monooxigenáz gének beültetését úgy végeztem el, hogy PmeI restrikciós enzimmel emésztettem a megsokszorozott monooxigenáz géneket és a létrehozott mutáns flagellint tartalmazó plazmidot, majd összekeverve ezt a két komponenst, ligáz enzim segítségével, összeépítettem.

17. ábra: A flagellin-enzim fúziós DES-konstrukció létrehozásának részlépései. 46

A rekombináns plazmidokat elektroporálással juttattam be a fehérje termeltetésére használandó SJW2536-os flagellin-deficiens baktériumokba. Vizsgáltam, hogy a fúziós fehérjék exportálódnak-e a flagelláris exportrendszeren keresztül, és filamentumot formálnak-e a baktérium felszínén, vagy a citoplazmában akkumulálódnak. Ennek megállapítására sötétlátóterű mikroszkóp, motilitás teszt és SDS gélelektroforézis szükséges. Ha a fúziós fehérjék a flagelláris exportrendszer segítségével szállítódva flagelláris filamentumokat hoznak létre, akkor könnyedén leválaszthatóak a sejtről mechanikus erő hatására, centrifugálással izolálhatók és hő hatására monomerizálhatók. Remélhetőleg a fúziós fehérjék polimerizációs képessége lehetővé teszi a könnyű tisztítást a polimerizáció és depolimerizáció egymás utáni többszöri kivitelezésével. A tisztított flagzimek feltekeredését kalorimetriai és spektroszkópiai mérésekkel lehet ellenőrizni, a katalitikus aktivitást pedig standard enzimvizsgálatokkal.

3.9.2. DS konstrukciók előállítása

3.9.2.1. D3-deléciós plazmid

A DNS munkát a pKOT-1 plazmid AatII restrikciós endonukleázzal történő emésztésével kezdtem (későbbiekben jelölése: pKOT-1/AatII). Ennek az enzimnek kettő vágóhelye van ezen a plazmidon, így azt kettő lineáris fragmentumra vágja (2kb és 5kb). A kisebbik fragmentum tartalmazza a flagellin promóterét és génjét, ami templátként szolgál a PCR reakcióhoz. Az AatII-es emésztési elegyet 37 ̊C-on 1,5 órán keresztül inkubáltam, majd 65 ̊C-on 20 percig inaktiváltam az enzimet, ezután gélből izoláltam mindkettő fragmentumot. A kisebb fragmentum felhasználását az előzőekben említettem. Az 5kb-os fragmentumot előkészítettem a későbbi ligáláshoz, hiszen az AatII vágóhelyeken illesztem vissza a módosított flagellint. A plazmidot először defoszforiláltam SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) enzimmel, mely a DNS 5’ végén lévő foszfátcsoportot távolítja el, ennek következtében a fragmentum két vége nem tud kialakítani foszfodiészter kötést egymással, így meg lehet akadályozni, hogy a későbbi ligálás során ez a DNS önmagába kapcsolódjon össze. A defoszforilálás reakcióelegyét 37 ̊C-on 30 percen keresztül inkubáltam. Ezután 65 ̊C-on 15 percig inaktiváltam az enzimet, majd Wizard oszlopon tisztítottam, és 35 µl steril deszt. vízzel eluáltam.

47

PCR reakcióval hoztam létre a D3-deléciós inszertet négy primer segítségével. A flagellin N-terminálisának (az első AatII helytől, ami a promóterben van) PCR-ezésére használtam a Del1AatIIfor (5’-CCACCTGACGTCTAAGAAACCATT- 3’) primert, amely

az

AatII

helyet

tartalmazta

és

a

Del1PmeIrev

(5’-

AGAGTTTAAACCTCCTGTAACAGTTGCAGCCGTATCG- 3’) primert, ami a PmeI helyet. A C-terminális (a második AatII vágóhelyig, ami a FliC gén utáni terminátor régióban van) felerősítésére a Del1PmeIfor (5’- TAT GGTAla TTALeu AACAsn TCTSer GCAAla GCAAla AATGCTGATTTGACAGAGG-3’) primert (alsó indexben a inzercióban kódolt aminosavakat tüntettem fel), amely a PmeI helyet tartalmazta és a Del1AatII2rev (5’-CCACCTGACGTCACCTCCGGGC-3’) primert az AatII vágóhellyel. A reakció templátjaként a pKOT-1 plazmid AatII-vel történő emésztéséből izolált kisebb fragmentum szolgált, amelyből úgy sokszoroztam meg az előbb említett primerekkel a flagellin elejét és végét, hogy a középső részét, a D3 domént nem tartalmazta. A flagellin N-terminálisának (Del1AatIIfor és Del1PmeIrev primerekkel) és C-terminálisának (Del1PmeIfor és Del1AatII2rev primerekkel) PCR-ezését a következő összeméréssel és programmal kiviteleztem: 25,8 µl steril deszt. víz

95 °C 2 perc

5 µl 10x KOD puffer

95 °C 20 sec (s)

3 µl 25 mM MgSO4

60 °C 10 s

5 µl 2 mM dNTP

70 °C 15 s 20 ciklus

5 µl 10 pmol/ µl forward primer

70 °C 10 perc

5 µl 10 pmol/ µl reverse primer

4 °C 2 perc

1,2 µl ~50 ng/µl pKOT-1 1 µl 1 U/ µl KOD Mindkét PCR-ből 4-4 adaggal készítettem, gélből izoláltam és 50 µl steril deszt. vízzel eluáltam. Ezt követően a tiszta termékeket emésztettem AatII-vel és PmeI-gyel a ligálás előkészítésének érdekében. Az emésztési elegyet (egyszerre mindkét enzimmel) 37 °C-on 1 órán keresztül inkubáltam, majd 65 °C-on 20 percig inaktiváltam az enzimeket. Ezt követően az emésztett DNS-t Wizard oszlopon tisztítottam és 35 µl steril deszt. vízzel eluáltam. Az így előkészített fragmentumokat ligáltam össze egymással és a pKOT-1 plazmid AatII enzimmel emésztett nagy fragmentumával. A ligálás előtt agaróz gélen megfuttattam a DNS mintákat, hogy megtudjam mennyi az egymáshoz viszonyított mennyiségük, milyen összeméréssel kivitelezzem a ligálást. Ez alapján a ligálási elegyhez a következő mennyiségben mértem össze az összetevőket: 1 µl 60 ng/µl flagellin Nterminális PCR termék, 1 µl 50 ng/µl flagellin C-terminális PCR termék, 1 µl 20 ng/µl 48

pKOT-1/AatII nagy fragmentum, 2 µl 5x ligáz puffer, 4 µl Steril deszt. víz, 1 µl ligáz. A ligálási reakciót 22 °C-on 10 percen keresztül inkubáltam, majd jégre tettem és a 10 µl ligálási eleggyel transzformáltam 200 µl E.coli TOP10 kompetens sejtet. A sejteket ampicillin tartalmú LB (LBAmp) táptalajra kikentem és 20 órán keresztül növesztettem 37 °C-on. A felnőtt telepeket leoltottam 4-4 ml folyékony LBAmp-ba és felnövesztés után (37 °C overnight) ezekből a baktériumkultúrákból plazmidot preparáltam. A rekombináns plazmidok ellenőrzését PmeI és EcoRI enzimeket használva végeztem el, az emésztett mintákat 1%-os agaróz gélen futtattam. A PmeI-es emésztés annak a megállapítására szolgált, hogy a módosított plazmid valóban tartalmazta-e a beépített PmeI vágóhelyet. Az EcoRI-es emésztésnek pedig az eredeti pKOT-1 kontrollhoz viszonyított méretcsökkenést kellett mutatnia, mivel a plazmidból kivágott inszertnek a D3 méretével (285 bp) kisebbnek kellett lennie. Így választottam ki azokat a D3-deléciós plazmidokat, amelyeket további ellenőrzés érdekében elküldtem szekvenáltatni. Az így előállított D3-deléciós flagellint tartalmazó pKOT-1 plazmidot használtam a flagellin-CHMO és flagellin-CPMO DNS konstrukciók létrehozására a beépített PmeI restrikciós endonukleáz vágóhely segítségével.

3.9.2.2. Fúziós DS konstrukciók

Először a D3-deléciós plazmidba beépíteni kívánt CHMOAcineto és CPMOComa gént sokszoroztam meg PCR segítségével. Ehhez templátként a pDR01 és pDR05 plazmidokat használtam fel, melyeket a biotranszformációk során is alkalmaztam transzformált E.coli sejtek felhasználásával. Első körben a PCR-hez primereket kellett tervezni.

A

CHMO

génhez

(1620

bp)

a

CHMOPmeIforw

(5’-

AGAAGTTTAAACATACATATGTCACAAAAAATGGA -3’) és CHMOPmeIrev (5’TATGGTTTAAACCTTGCTTGATATCTGAACGTTGT -3’) primereket, a CPMO génhez

(1650

bp)

pedig

a

CPMOPmeIforw

(5’-

ACAAGTTTAAACATACATATGACCACCATGACCAC -3’) és CPMOPmeI rev (5’TCAAGTTTAAACGCGAGAAGCCTGCATATCCT

-3’)

primereket

alkalmaztam,

melyek tartalmazták a PmeI restrikciós hasítóhelyet is. CHMOAcineto génhez a következő összemérést és programot használtam a PCR során:

49

25 µl steril deszt. víz

95 °C 2 perc

5 µl 10x KOD puffer

95 °C 20 sec (s)

3 µl 25 mM MgSO4

48 °C 10 s

5 µl 2 mM dNTP

70 °C 40 s 20 ciklus

5 µl 10 pmol/ µl CHMO PmeIforw primer

70 °C 10 perc

5 µl 10 pmol/ µl CHMO PmeIrev primer

4 °C 2 perc

2 µl ~50 ng/µl pDR01 1 µl 1 U/ µl KOD

A CPMOComa PCR-ezéséhez az alábbiakat: 25 µl steril deszt. víz

95 °C 2 perc

5 µl 10x KOD puffer

95 °C 20 sec (s)

3 µl 25 mM MgSO4

59 °C 10 s

5 µl 2 mM dNTP

70 °C 40 s 20 ciklus

5 µl 10 pmol/ µl CPMO PmeIforw primer

70 °C 10 perc

5 µl 10 pmol/ µl CPMO PmeIrev primer

4 °C 2 perc

2 µl ~50 ng/µl pDR05 1 µl 1 U/ µl KOD A PCR-ek után a termékeket 1%-os agaróz gélből izoláltam, a CPMO esetében egyszerre 4 adag PCR-t, a CHMO esetében pedig 8 adaggal, mert jóval kevesebb terméket kaptam a reakció során. Az DNS-eket az oszlopról 45 µl steril deszt. vízzel eluáltam, majd emésztettem PmeI-gyel. Ezzel egyidejűleg a D3-deléciós pKOT-1 plazmidot is előkészítettem a ligáláshoz, emésztettem PmeI enzimmel, majd defoszforiláltam SAP enzimmel. A standard ligálási protokoll alapján ligáltam össze a D3-deléciós plazmidot a CHMO-val és a CPMO-val. Az összemérés a következő volt: 2 µl 12 ng/µl D3-deléciós plazmid/PmeI+SAP, 3 µl 80 ng/µl CHMO/PmeI, 4 µl 5x ligáz puffer, 10 µl steril deszt. víz, 1 µl ligáz. Az összemérés CPMO inszerttel is hasonló volt. A ligálási elegyekkel (10-10 µlrel) E.coli TOP10 kompetens sejteket transzformáltam. A felnőtt telepeket leoltottam 4-4 ml folyékony LBAmp tápoldatba, ezekből a kultúrákból preparáltam plazmidot. A ligálás eredményességét először PmeI enzimes emésztéssel ellenőriztem, hiszen így 2 lineáris fragmentumra kellett bontania a plazmidomat, a nagyobb az inszert nélküli D3-deléciós plazmid, a kisebb a CHMO vagy a CPMO génje. Ezt követően orientációellenőrzés érdekében HindIII-as emésztést is végeztem azokkal a plazmidokkal, amelyekben valóban benne volt az inszert. Az orientációellenőrzésre azért volt szükség, mert csak 1 restrikciós 50

endonukleázt, a PmeI-t használtam fel a fúziós konstrukciók létrehozására, így az inszertek fordítva is beépülhettek a D3-deléciós plazmidba. Azért a HindIII enzimet választottam erre a célra, mert a pKOT-1 plazmidban csak 1 vágóhelye van, valamint az enzimek génjeiben is van 1- 1. Tehát szintén 2 lineáris fragmentumot kellett kapnom, melyek a jó orientációjú CHMO-s konstrukció esetében: 6072 bp és 1480 bp méretűek. Ha a CHMO fordítva épült be, akkor 5802 bp és 1750 bp nagyságúra változnak a fragmentumok. A CPMO-s konstrukció esetében jó irányú beépüléssel: 5184 bp és 2389 bp-os DNS-eket, míg rossz orientáció esetében: 6711 bp és 862 bp nagyságú lineáris fragmentumokat kell kapni a HindIII-as emésztés után. Ezek a méretbeli különbségek jól ellenőrizhetők agaróz gélen.

3.9.3. D3-deléciós flagellin fehérje 3.9.3.1. Fehérjetermeltetés Szekvenáltatás után a hibátlan D3-deléciós plazmidot elektroporáltam Salmonella SJW2536-os elektrokompetens sejtekbe. Ez a Salmonella egy flagellin-deficiens baktérium. Ennek a baktériumnak csak a flagellin génjét távolították el, minden más génje megmaradt, így ha egy olyan plazmidot juttatok bele, amely flagellint kódol, akkor a flagellinek az exportcsatornán átjutva a baktérium felszínén filamentumot hoznak létre és így a nem úszó deficiens baktériumból úszó baktérium lesz. A transzformált baktériumok úszóképességét sötétlátóterű mikroszkóppal, motilitás teszttel és közvetetten SDS gélelektroforézissel vizsgáltam. Ezekhez a vizsgálatokhoz kontroll baktériumokat használtam, melyekhez hasonlítottam a D3-deléciós flagellinnel rendelkező baktérium viselkedését.

A

pozitív

kontroll

a

pKOT-1-gyel

elektroporált

SJW2536-os

baktériumkultúra, a negatív kontrollt pedig a plazmidot nem tartalmazó SJW2536-os baktériumkultúra jelentette. Sötétlátóterű mikroszkóp használatával tudtam összehasonlítani a baktériumok úszását, illetve a preparálás során a kialakult filamentáris kötegek milyenségét. A motilitás agarra oltott baktériumokat 37 °C-on növesztettem egy éjszakán keresztül, majd lemértem a felnőtt telepek nagyságát. A motilitás teszthez felhasznált baktériumkultúrát úgy állítottam elő, hogy 37 °C-on egy éjszakán keresztül tápoldatban felnövesztettem azt a kultúrát, amiből 10 µl-t oltottam be 4 ml LB-be és ezt növesztettem egészen addig, míg 600 nm-en az abszorbanciája 0,6 körüli érték lett. A vizsgálni kívánt baktériumokat azonos abszorbanciaértékig

növesztettem,

hogy

a

motilitás

teszt

eredménye

valóban

összehasonlítható legyen. Az SDS gélt a következő mintaelőkészítés után használtam 51

annak érdekében, hogy megállapítsam, hogy a baktériumok valóban létrehoznak-e filamentumot a baktériumok felszínén a D3-deléciós flagellinből. 1 ml overnight baktériumkultúrát 60 °C-on 10 percig melegítettem, majd 13 000 rpm-mel 10 percen keresztül centrifugáltam a sejteket. Így az ülepítés után a felülúszóban csak azok a monomer flagellinek voltak, amelyek a sejt felszínén kialakították a filamentumot. Az SDS gélre való felvitel előtt ezeket a felülúszókat töményítettem 1 ml-ről kb. 100 µl-re, és ennek 20 µl-éhez adtam 10 µl mintapuffert és ebből 10 µl-t vittem fel a 12,5%-os gélre. A fehérjetisztítást háromszori depolimerizációs-polimerizációs lépéssel valósítottam meg 3 M ammónium-szulfát oldatot használva, amit 0,8 M végkoncentrációban adagoltam a fehérjeoldatomhoz mindig azonos fehérjekoncentráció mellett, majd szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül inkubáltam. A képződött filamentumokat 40 000 rpm-en 1 órán keresztül centrifugáltam, a filamentumcsapadékot +4 °C-on tároltam. A monomerizálást 10 perc 70 °Con történő inkubálással valósítottam meg, amelyet 40 000 rpm-en 1 órás centrifugálás követett, így lehetséges a fehérje mellett lévő szennyezők eltávolítása, hiszen a monomer flagellin a felülúszóban marad.

3.9.3.2. A D3-deléciós flagellin emésztési vizsgálata tripszinnel Párhuzamosan végeztem a vad flagellin és a D3-deléciós flagellin emésztését. A filamentum és a monomer formában lévő minták koncentrációja 0,9 mg/ml-es volt, 20mM foszfát, 150 mM NaCl pH 7,0 puffer használatával. A mintákhoz 300:1 (fehérje:tripszin) tömegarányban adtam a tripszint. Meghatározott időközönként mintát vettem az emésztésekből analízis céljából. 20 µl tripszines mintához 10 µl mintapuffert adtam és 95 °C-on 3 percig melegítettem, így állítottam le az emésztést. Ezekből a mintákból futtattam 10 µl-t 12,5%-os SDS gélen.

3.9.3.3. Denaturációs hőmérséklet meghatározása CD-vel A vad és D3-deléciós flagellin mintákat ugyanolyan körülmények között háromszori polimerizáltatással tisztítottam. A CD mérés előtt az 1 mg/ml-es flagellinoldatokat 0,8 M végkoncentrációjú szilárd ammónium-szulfáthoz pipettáztam, majd szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül polimerizáltattam. A filamentumcsapadékot háromszor mostam 20mM foszfát, 150 mM NaCl pH 7,0 pufferben (a mosással távolítottam el a maradék ammóniumszulfátot teljesen a csapadékból), a hígításhoz is ezt a puffert használtam. A mérések során 0,1 mg/ml koncentrációjú fehérjeoldatokat vizsgáltam 1 cm-es küvettában, 20-70 ̊C-ig fűtöttem (100 ̊C/óra) és 222 nm-en detektáltam. 52

4. Eredmények és következtetések

4.1. Szerves reakciók, szubsztrátumok előállítása A karbo- és heterociklusos hattagú rendszerek fontos szubsztrátumok, melyekből biooxidatív úton értékes aszimmetrikus molekulák állíthatók elő. A fermentálható prekurzorok szerkezeti összetettségének növelése érdekében meg kellett alkotni egy gyors és hatékony módszert a karbo- és heterociklusos rendszerek létrehozására. Elsőként összegyűjtöttem azokat a vegyületeket (ciklopentadién, furán és pirrol-1-karbonsavmetilészter), amelyek alkalmas prekurzorok lehetnek cisz-3,5-diszubsztituált cikloketonok előállítására. A bejuttatásra váró olefinkötés a szubsztrátumok oldalláncaiban funkcionális bázisként szolgálhatna a későbbi biotranszformációkban, hiszen a C=C kettőskötés inert a mikrobiális Baeyer-Villiger oxidációkban (Mihovilovic et al., 2003b). A biciklusos rendszerek 4 molekulákká történő átalakításához terminális alkéneket használtam az újonnan kidolgozott gyűrűnyitási metatézisek során. Munkám célja, hogy kifejlesszek egy hatékony és egyszerű módszert a 3 biciklo molekulák preparálására, és tanulmányozzam ezeknek a biciklusoknak a gyűrűnyitási metatézisben várható viselkedését gázhalmazállapotú olefinekkel a 4-es szerkezetek előállításához.

A

kísérleteket

először

a

ciklizációs

reakciók

körülményeinek

megválasztásával kezdtem tetrabróm-acetont használva (18. ábra, 7. táblázat). A táblázatban feltüntetett hozamok a ciklizációs és a debrómozási részlépés utáni értékek.

X

O Br

Br Br

+

Br

Cu/Zn

X

Br

1

X Br O Br 2

O

X=CH2 (a) X=O (b) X=NCOOMe (c)

Br 2

X Cu/Zn X=CH2 (a) X=O (b) X=NCOOMe (c)

18. ábra: Ciklizáció és debrómozás

53

O 3

(ekv.)

a

Szonikálás

katalizátor

dién X

(ekv.)

hőmérséklet

időtartama

termék

hozama

Cu/Zn

1a (15 ekv.)

CH2

1a (3 ekv.)

CH2

1a (5 ekv.)

CH2

1b (4.1 ekv.)

O

1b (10 ekv.)

O

1b (10 ekv.)

O

1c (3 ekv.)

NCOOMe

(3.1 ekv.)

-20 °C

1 óra

3a

30 % a

5 °C

1 óra

3a

40 % a

szobahőn

1 óra

3a

62 % a

szobahőn

1 óra

3b

50 % a

szobahőn

1 óra

3b

60 % a

szobahőn

5 óra

3b

40 % a

szobahőn

2 óra

3c

45 % a

Cu/Zn (3.1 ekv.) Zn (3 ekv.) Zn (3 ekv.) Cu/Zn (3 ekv.) Cu/Zn (20 ekv.) Zn (5 ekv.)

feldolgozás után, tisztasága 95%-os (GC-vel) 7. táblázat: Ultrahangos fürdőben kivitelezett ciklizációs reakciók körülményei

Mivel a 2 dibróm intermedier kevésbé stabil, a ciklizáció nyerstermékét a feldolgozás után azonnal redukáltam Cu/Zn katalizátorral (NH4Cl metanolos oldatában) (Hoffmann et al., 2000). Montana és munkatársa (2001) az oxiallil vegyület előállításához is Cu/Zn katalizátort használtak, azonban kísérleteim során már –20°C-on megfigyeltem a ciklopentadién (1a) dimerizációját, amely 5°C felett dominánssá vált, így a 3a termék előállítása egyik esetben sem volt kielégítő. Ez arra ösztönzött, hogy Hoffmann és munkatársainak (2000) módszere alapján a kevésbé aktív Zn port használjam. Ezzel a módszerrel nagyon sikeresen ment végbe a reakció, kevesebb mint 5 % ciklopentadiéndimer keletkezett a konverzió során. A reakció ultrahangos fürdőben 1 óra alatt lejátszódott szobahőmérsékleten. A Cu/Zn katalizált debrómozás után a 3a terméket 62%-os hozammal izoláltam. Az ultrahangos fürdőben cinkkel kivitelezett [4+3] cikloaddíciós eljárást sikeresen alkalmaztam 1c és furán (1b) reakciójára. A 3b oxabicikloketont dehalogénezés után, további tisztítás nélkül 50%-os hozammal izoláltam. Ezzel az eljárással a 3b vegyületet meglehetősen egyszerűbben állítottam elő ugyanolyan hozammal mint az 54

irodalomban fellelhető eredmények. Cu/Zn katalizátorral végzett ciklizációval még jobb eredményeket tudtam elérni furán esetében. A 3b nyerstermék >95%-os tisztasággal jött létre (GC) a debrómozás után, további tisztítás nélkül. Ultrahangos fürdőben Cu/Zn katalizátor használatakor in situ debrómozást is tapasztaltam, pl. a 2b dibróm intermedier nyers keverékének analizálásakor egy kevés dehalogénezett 3b termék is kimutatható volt, amely klasszikus termikus reakcióknál nem figyelhető meg. A 3b termék szintézisénél azt is tapasztaltam, hogy több Cu/Zn használata és a meghosszabbított időtartamú szonikálás nem okozott nagyobb konverziót a kétlépéses folyamat során. Az 1c aktivált pirrolszármazékot is sikerült megfelelő hozammal átalakítani a kívánt 3c azabicikloketonná. Miután kidolgoztam egy egyszerű eljárást biciklusos vegyületek (3) előállítására, ezeknek az előállított molekuláknak a viselkedését vizsgáltam gyűrűnyitási metatézisekben (19. ábra, 8. táblázat). Wright és munkatársai (2001) munkáiban megtalálhatóak a 3 biciklo rendszereken végzett transzformációk, munkámban gázhalmazállapotú olefinekkel végeztem ezeket a reakciókat. Az említett irodalmakból az már kiderült, hogy gyűrűnyitási metatézisekben a gázhalmazállapotú olefinek polimerizáció nélkül használhatóak partnerként.

O

O

X X

R

R

19. ábra: A gyűrűnyitási metatézis (a táblázatban található jelölésekhez). A reakciók során az olefinnel feltöltött ballon a reakcióelegyhez volt csatlakoztatva. Először az oldószert telítettem az olefinnel, ezután adtam hozzá az elegyhez a katalizátort. Ha a reakció során az elegyen keresztül buborékoltattam az olefint, az nem okozott konverziónövekedést, ez inkább az etilén oligomerizálódásának kedvezett. A 20. ábrán ballon használatával, illetve állandó buborékoltatással kapott konverziót ábrázoltam az idő függvényében.

55

Biciklus

X

R

3a

CH2

H

26 h

Grubbs I (1mol%)

75 %

4a

50 %

n.a.c

3a

CH2

CH3

75 min

Grubbs I (1mol%)

95 %

4b

40 %

3.6:1

3a

CH2

CH2CH3 60 min

Grubbs I (1mol%)

95 %

4c

65 %

6.3:1

3b

O

H

26 h

Grubbs I (1mol%)

75 %

4d

43 %

n.a.

3b

O

CH3

4h

Grubbs I (1mol%)

86 %

4e

40 %

3.6:1

3b

O

CH2CH3

1h

Grubbs I (1mol%)

87 %

4f

42 %

8.5:1

3c

NCOOMe

H

29 h

Grubbs II (2mol%)

0%

4g

n.r.b

n.a.

3c

NCOOMe

CH3

29 h

Grubbs II (2mol%)

0%

4h

n.r.

n.a.

3c

NCOOMe

CH2CH3

27 h

Grubbs II (2mol%)

0%

4i

n.r.

n.a.

reakció idő

katalizátor konverzió

termék

hozama

(a) kromatográfiás tisztítás utáni hozam; (b) nincs reakció; (c) nem alkalmazható 8. táblázat: Gyűrűnyitási metatézisek eredményeinek összefoglalása

100

konverzió [%]

80 60 40 20 0 0

100

200 idő [perc]

300

400

20. ábra: Etilén adagolás a reakció során ballonnal [
], ill. állandó buborékoltatással [].

56

E/Z arány

Propilénnel és butilénnel dolgozva egy általános tulajdonságot tapasztaltam. A kettős kötés szubsztitúciója megnövelte az olefinen az elektronsűrűséget, amely a reakcióidő megrövidülését, és magasabb konverzióértéket eredményezett. Grubbs II katalizátor használata gázhalmazállapotú alkén partnerekkel nem vezetett rövidebb reakcióidő eléréséhez. Minden transzformációnál egy egyensúly kialakulását figyeltem meg a biciklo vegyület és a diolefin között. A reakcióknál először mindig Grubbs I katalizátort használtam, azokban az esetekben, amikor nem játszódott le megfelelően a reakció, akkor a Grubbs II katalizátorral is megpróbáltam kivitelezni a reakciót. A gázhalmazállapotú reakciópartnerek használatakor a reakcióképesség az alkén kettős kötésének elektronsűrűségétől függött: a konverziót szignifikánsan fokozni lehetett elektrondonor szubsztituens jelenlétével. Az ilyen reakciók mindegyike 75% feletti konverzióval játszódott le és a termékeket megfelelő hozammal izoláltam. A reakciók végén etil-vinil-étert adtam a reakcióelegyekhez, hogy a feldolgozás során végbemenő gyűrűzáródást minimalizáljam. Az aszimmetrikusan szubsztituált termékeknél különböző E/Z arányok voltak megfigyelhetőek. A heteroatomot nem tartalmazó biciklusos molekulákon gázhalmazállapotú olefinekkel kivitelezett sikeres reakciók után a heterociklusos biciklo vegyületek 3b és 3c viselkedését tanulmányoztam gyűrűnyitási metatézisekben. A 3b oxigén-tartalmú rendszer hasonlóan viselkedett mint a 3a karbociklusos prekurzor. Az olefinekkel végzett transzformációk a várt termékeket eredményezték. Az egyensúlyi konverziók és az E/Z arányok is hasonlóak a karbociklusos vegyületekéhez. Azonban a 3c metil-karbamát esetében a ROM nem játszódott le gázhalmazállapotú olefinekkel, sem Grubbs I, sem Grubbs II katalizátor jelenlétében. A reakciók során a várt termékek nem képződtek, csak a

3c kiindulási anyagot nyertem vissza mindegyik esetben. Korábban Neipp és munkatársai (2002) is hasonló eredményeket kaptak, amikor a védett nitrogén heteroatomot tartalmazó vegyületekkel próbáltak gyűrűzárási reakciókat végezni.

4.2. Biotranszformációk

Az

előállított

perhidro-piron

molekulák

alkalmasnak

bizonyultak

sejtes

biotranszformációkra. A feltételezett (Mihovilovic et al., 2005; Iwaki et al., 2002) két enzimcsoport prototípus enzimei a CHMOAcineto és CPMOComa, a két csoport között átmenetet képező CHMOBreviI-gyel együtt a várt biooxidációs termékeket adták. A táblázatban szereplő eredmények az általam végzett biotranszformációkból származnak (21. ábra, 9. táblázat). 57

O

O

O

R

O

R

O

R

R

21. ábra: Biotranszformációk a táblázatban található jelölésekhez.

Szubsztr.

R

termék

enzim

Hozam (%)

e.e. (%)

CHMOAcineto CHMORhodoI CHMORhodoII CHMOAcido CHMOArthro CPMOComa CHMOBreviII CHMOBreviI CHMOAcineto CHMORhodoI CHMORhodoII CHMOAcido CHMOArthro CPMOComa CHMOBreviII CHMOBreviI

79 38 51 41 40 75 76 80 52 43 45 42

nyomokban

> 99,5 > 99 92 > 99 > 99 -

6f

CHMOAcineto

90

> 99,5

6’f

CHMOAcineto CHMORhodoI CHMORhodoII CHMOAcido CHMOArthro CPMOComa CHMOBreviII CHMOBreviI

40 24 25 22 20 64

> 99 98 99 98 98 98

5d

H

6d

5e

Me

6e

Et

5f

CH=CH2

4f

-

-

9. táblázat: Az elvégzett biotranszformációk eredményei.

A

táblázatban

munkatársaimmal

feltüntetett

különböző

szubsztrátumok

térigényű

mellett

oldalláncokkal

a

laborban

szubsztituált

dolgozó prokirális

szubsztrátumokat állítottunk elő a BVMO-k szubsztrátum-hasznosításának tanulmányozása 58

érdekében. A CHMO-típusú enzimek legfeljebb 3 szénatom hosszúságú oldallánc esetében alakították át a vizsgált molekulákat általában kiváló optikai tisztasággal. Az általam felhasznált

biokatalizátorok

nagy

enantioszelektivitását

demonstráltam

a

divinil

szubsztrátum szelektív laktonizálásával is, az olefin funkcióscsoport oxidálása nélkül. A lineárisan 3 szénatom hosszú oldallánc képviseli a határt az enzim aktív centrumának hozzáférését illetően, munkatársaim eredményeiből derült ki, hogy az i-propil vagy annál hosszabb szubsztituenssel már nem, vagy csak alacsony hozammal valósult meg a katalízis. Ezeknél a kísérleteknél a szubsztrátum nagysága meghaladta az enzim által tolerált térbeli nagyságot (Mihovilovic et al., 2008). A CHMOAcineto enzim, erős katalitikus képességével és változatos szubsztrátumok átalakításával, a szintetikus kémiában jól alkalmazható. Ezt a tényt igazolva kísérleteimben is mindegyik esetben a CHMOAcineto eredményezte a legjobb hozam és e.e. értékeket, az ugyanebbe a csoportba tartozó enzimek eredményei minimális eltéréseket mutattak a sztereoszelektivitást illetően. Ezekkel az eredményekkel ellentétben kísérleteim során a CPMO csoport két képviselője - a CPMOComa és a CHMOBreviII – nem alakította át a szubsztituált

perhidro-4-piron

molekulákat.

Hasonló

viselkedést

tapasztaltam

a

CHMOBreviI-nél is, azonban GC-vel a szubsztituált lakton termékeket nyomokban ki lehetett mutatni. Figyelemre méltó kivételt találtam a divinil vegyület átalakítása során, ugyanis azt a CHMOBreviI enzim nagyon jó hozammal és optikai tisztasággal alakította át. Taschner és Black (1988) az általam előállított biooxidációs termékekhez nagyon hasonló oxepan-2-on karboxil analóggal dolgoztak, aminek kísérletileg meghatározták az abszolút konfigurációját. Feltételezve ugyanazt a konfigurációt a két lakton között, amit az optikai forgatóképesség megegyező előjele is megerősít, és figyelembe véve a KahnIngold-Prelog szabályból eredő prioritásváltozásokat, a heterociklusos termékeimre a (2S, 7R) abszolút konfigurációt adom meg (22. ábra). O

O O

(S)

O (R)

(R)

(S) O

22. ábra: Taschner és Black (1988) vegyülete és az általam előállított dioxepanon abszolút konfigurációja.

Összegezve a BVMO-kal

kivitelezett

biotranszformációs

kísérleteimet,

a

biooxidációk kettő sztereogén centrumot hoztak létre és egy enantiomert eredményeztek 59

nagy optikai tisztasággal mindegyik esetben, amikor az enzimek aktív centrumainak térbeli korlátai lehetővé tették a reakciót. A CHMO- és CPMO- típusú enzimek szignifikánsan eltérő szubsztrátum profilja perhidro-piron szerkezeti egységet tartalmazó heterociklusos ketonok biotranszformációját illetően tovább erősítette a korábbi hipotézist a BVMO-k két különböző enzimcsoportjáról (Mihovilovic et al., 2005; Iwaki et al., 2002). Ezzel a szubsztrátum osztállyal a felhasznált enzimek nem állítottak elő enantiokomplementer lakton termékeket, még a CHMOBreviII enzim sem eredményezte a + enantiomert, míg a dimetil-ciklohexanonnal vizsgált biotranszformáció során igen (Mihovilovic et al., 2003). Ez a tény a nagyon polarizált heterociklusos ketonok eltérő fizikai-kémiai tulajdonságainak köszönhető, a korábban tanulmányozott nyilvánvalóan jobban lipofil tulajdonságú karbociklusos szubsztrátumokhoz képest. A heteroatom jelenléte, mint erős elektrondonor központ, okozhatja a BVMO aktív centrumában a szubsztrátum orientációjának megváltozását a heteroatomot nem tartalmazó gyűrűvel rendelkező vegyületekkel ellentétben. Ezért nehéz meghatározni vagy megjósolni a szubsztrátum vagy a Criegee intermedierek pozícióját és konfigurációját, ehhez hozzá járul az is, hogy az általam felhasznált enzimek pontos szerkezetét még nem ismerjük. A kristályosított PAMO enzim áll a legközelebbi rokonságban a CHMO-val, és az elkészített homológia modellből (Bocola et al., 2005) eredő konformációváltozásokat, amelyek a katalízis során végbemennek, a gyakorlatban is igazolni kell. Emellet a CHMO „szuper-szubsztrátum” modelljének megalkotásán is sokan fáradoznak, hogy a számítógépes modellen alapuló feltételezett enzimszerkezettel összehasonlítva még pontosabb képünk legyen az enzimek működéséről.

60

4.3. Flagellin-enzim fúziós konstrukciók létrehozása 4.3.1. D3-deléciós flagellin előállítása A D3-deléciós plazmid előállításához a pKOT-1 plazmidot emésztettem AatII-vel. Az alábbi gélfényképen (23. ábra) látható, hogy kettő lineáris fragmentumra vágta a plazmidot. Így jött létre a pKOT-1 nagy fragmentuma, amelyet defoszforilálva közvetlenül felhasználtam a későbbi ligáláshoz, és a kis fragmentuma, amelyet a PCR-ekhez használtam fel templátként.

23. ábra: pKOT-1 emésztése AatII restrikciós endonukleázzal 1%-os agaróz gélen. A második zsebben a standard sávjai a következők: 10 kbp, 8 kbp, 6 kbp, 5 kbp, 4 kbp, 3,5 kbp, 3 kbp, 2,5 kbp, 2 kbp, 1,5 kbp, 1 kbp, 750bp, 500 bp, 250 bp.

A PCR eredményeként az alábbi gélen megfuttatott termékek keletkeztek (24. ábra).

24. ábra: Az 1. zseb: flagellin E-terminálisának (D3 nélküli) tisztítás nélküli PCR terméke, 2. zseb: flagellin C-terminálisának (D3 nélküli) tisztítás nélküli PCR terméke, 3. zseb: az előző gélen is látható standard.

61

A PCR termékek gélből történő izolálása és AatII-vel és PmeI-gyel történő emésztése után gélt futtattam a fragmentumokról, így nyertem információt a ligáláshoz szükséges plazmid-inszert arányokról (25. ábra).

25. ábra: A fragmentumok ligálás előtti mennyiségei. 1. zseb: flagellin E-terminálisa, 2. zseb: flagellin C-terminálisa, 3. zseb: pKOT-1/AatII+SAP nagy fragmentum.

A ligálás utáni transzformálás telepeiből 6-ot kiválasztottam és plazmidot preparáltam belőlük, majd ellenőrző emésztést végeztem. Először PmeI-gyel emésztettem. Az alábbi gélen látható, hogy a 2., 4. és 5. zsebben lévő plazmid linearizálódott, a 7. zsebben lévő minta a pKOT-1/PmeI emésztés, amit kontrollnak szántam, hiszen az eredeti pKOT-1-ben nincs PmeI hasítóhely (26. ábra).

26. ábra: A D3-deléciós plazmidok ellenőrzése PmeI-gyel.

A plazmidokat további ellenőrzés érdekében EcoRI-gyel is emésztettem. Az alábbi gélen sorrendben ugyanazok a plazmidok láthatók, mint az előzőn, a 7. zsebben a pKOT1/EcoRI emésztést, mint kontrollt, melynek kisebb fragmentumának méretéhez viszonyítottam az emésztett DNS-eket. A jó D3-deléciós plazmidban a kisebb EcoRI-es fragmentum 285 bp-ral kisebb kell, hogy legyen mint a pKOT-1- é, hiszen már nincs benne a D3 domén. Az előző gél alapján jónak vélt plazmidokból csupán a 2. plazmid az, ami az EcoRI emésztést követően jó sávot ad, összehasonlítva a 7. zsebben lévő pKOT-1 kontrollal látható az alsó fragmentumok közötti méretkülönbség (27. ábra).

62

27. ábra: A D3-deléciós plazmidok ellenőrzése EcoRI-gyel (standard ugyanaz mint az előzőekben).

Az

emésztéseket

követően

a 2.

zsebben

futtatott

plazmidot elküldtem

szekvenáltatni. Annak érdekében, hogy az egész mutáns flagellin génről információkat nyerjek, négy primerrel szekvenáltattam meg ezt a plazmidot, és bebizonyosodott, hogy valóban egy hibátlan D3-deléciós flagellin plazmid. Ezt követően került sor a fehérjetermelésre, amihez Salmonella SJW2536 flagellindeficiens baktériumokat használtam fel. Első megközelítésben arra voltam kíváncsi, hogy a D3-deléciós flagellinből kialakulnak-e filamentumok. Ennek vizsgálatára szolgált a sötétlátóterű mikroszkóp, a motilitás teszt és az SDS gél. Mindegyik vizsgálati módszernél kontroll mintákat is használtam, és azokhoz viszonyítottam a mutáns baktérium viselkedését. Mikroszkópos vizsgálattal megállapítottam, hogy a pozitív kontrollhoz képest (pKOT-1-gyel elektroporált SJW2536) a D3-deléciós flagellinnel rendelkező baktériumok meglehetősen jól úsztak D3 domén nélkül is, mozgásuk hasonló volt. A negatív kontroll, az SJW2536 baktériumok egy kicsit mocorogtak, pörögtek, de nem úsztak. A motilitás teszttel számszerűsíthetők az eredmények, és így jobban összehasonlíthatók, ugyanis az overnight növesztett telepek a híg motilitás agaron a baktériumok mozgásképességétől függően különböző nagyságúak. Mindegyik baktériumnál 3 párhuzamos telepet vizsgálva a következő eredményeket kaptam (10. táblázat):

63

Plazmid/baktérium

Telepek átmérői (cm)

Átmérők átlaga (cm)

pKOT-1/SJW2536

2,6

2,7

2,7

2,67

D3-deléciós/SJW2536

1,7

1,7

1,8

1,73

-/SJW2536

0,3

0,3

0,3

0,3

10. táblázat: Motilitás teszt eredményei.

A Kísérleti rész 3.9.3.1. pontjában leírt módon készítettem az SDS gélre a mintákat annak érdekében, hogy csak a baktériumok felszínén található fehérjékről, a filamentum létezéséről kapjak információt. Az alábbi gél alapján is elmondható, hogy a baktérium a D3-deléciós plazmidból ugyanolyan mennyiségben termeli a mutáns flagellint mint az eredeti pKOT-1-ből (28. ábra). A korábbi feltevésemet igazolva valóban nem zavarja a D3 domén hiánya a baktériumot a filamentumképzésben sem.

28. ábra: D3-deléciós (42 kDa) és vad flagellin (51kDa) minták hőkezelt töményített felülúszókból, standard sávjai: 66 kDa, 45 kDa, 36 kDa.

Ezeket a vizsgálatokat követően párhuzamosan végeztem a vad Salmonella typhimurium flagellinjének preparálását nagy mennyiségben a D3-deléciós flagellinnel, az irodalomban fellelhető módszer alapján (Vonderviszt et al., 1989). Összehasonlítható mennyiségben sikerült termeltetnem a vad és mutáns fehérjéket, 2 liter tápoldatból vad flagellin esetében 51,4 mg-ot, míg a D3-deléciós mutánsból 58,9 mg-ot preparáltam azonos körülmények mellett. Ami még látványosabb volt a preparálás során, az a helikális filamentumkötegek mikroszkópos képe, amelyek méret és milyenség alapján nagyon hasonlóak (29. ábra).

64

a,

b,

29. ábra: a, vad; b, D3-deléciós helikális kötegek (baktériumokkal) a preparáláskor.

A preparálás során a tisztítást a flagellinek későbbi vizsgálataihoz háromszor ismételt monomerizáció-polimerizáció egymás utáni kivitelezésével valósítottam meg. A következő gélen látható (30. ábra), hogy megfelelően tiszta fehérjemintákat lehet előállítani ezzel a módszerrel.

30. ábra: 1. zseb: D3-deléciós flagellin 2. polimerizálás előtt, 2. zseb: 3. polimerizálás előtt, 3. zseb: 3. polimerizáció után. 4-6. zseb: vad flagellin minták esetében ugyanaz mint a D3-deléciós mintáknál.

A D3-deléciós fehérje emésztési térképét vizsgáltam tripszinnel filamentum és monomer formában is, összehasonlítva a vad fehérje viselkedésével. A 31. ábrán megfigyelhető, hogy filamentum formában egyik esetben sem volt emésztődés tripszinnel, 65

még 3 hét elteltével sem, ami a rendezetlen terminális régiók filamentumképződés során végbemenő stabilizálódásának tudható be. Ezeket a tripszines vizsgálatokat párhuzamosan végeztem a monomer flagellinével ugyanabból a tripszin törzsoldatból dolgozva.

a,

b,

31. ábra: Filamentumok emésztése tripszinnel, mintavételek különböző időpontokban; a, vad minták: 0 perc (’), 5’, 10’, 20’, 60’, 90’, 3 hét; b, D3-deléciós minták: 0’, 5’, 10’, 20’, 60’, 90’, 3 hét.

A monomer formában történt D3-deléciós mutáns emésztése során megfigyeltem, hogy hasonló emésztési sávokkal jellemezhető mint a vad flagellin, figyelembe véve azt a különbséget, hogy a mutáns fehérje D3 domént nem tartalmaz (32. ábra).

a,

b,

32. ábra: Monomerek emésztése tripszinnel, mintavételek különböző időpontokban, az 1. zsebekben használt standard: 66 kDa, 45 kDa, 36 kDa, 29 kDa, 24 kDa; a, vad minták: 0’, 1’, 5’, 10’, 30’, 120’,240’, 20 h, 2 nap; b, D3-deléciós minták: 0’, 1’, 5’, 10’, 30’, 120’, 240’, 20 h.

A mutáns flagellin esetében is először a rendezetlen terminális régiók emésztődnek el gyorsan. A D3-deléciós és a vad monomer esetében is egyformán kb. 10 percre volt 66

szüksége a tripszinnek, hogy a rendezetlen terminális régiókat eltávolítsa. Ezután míg a vad flagellin esetében egy kb. 40 kDa-os fragmentum marad vissza, addig a D3-deléciós esetében kb. 31 kDa molekulatömegű, melyek már sokkal lassabban emésztődnek el. A mutáns esetében a viszonylag stabil 31 kDa-os fragmentumot kb. 110 perc alatt emészti el a tripszin. A CD mérések görbéit (33. ábra) kiértékelve, a kapott inflexiós pontok adják meg a fehérjék olvadáspontját. Ezek alapján az olvadáspontok a következő értékeknek adódtak: D3-deléciós filamentum:

52,32 ± 0,05 °C

Vad filamentum:

54,16 ± 0,04 °C

D3-deléciós flagellin

39,7 ± 0,18 °C

Vad flagellin

47,44 ±0,13 °C

0 -20 CD (mdeg)

-40 -60 Pme2fila

-80

vadfila

-100 -120 -140 -160 20

30

40

50

60

70

CD (mdeg)

Hőmérséklet (°C)

0 -10 -20 -30 -40 -50 -60 -70 -80 -90 -100

Pme2monomer vadmonomer

20

30

40

50

60

70

Hőmérséklet (°C)

33. ábra: CD mérések (Pme2: D3-deléciós flagellin). 67

Az előállított D3-deléciós filamentum olvadáspontja 2 °C-kal alacsonyabbnak adódott, mint a vad filamentum esetében. Tehát a mutáns flagellinekből felépülő polimer stabilitása kis mértékben eltér az eredetitől. A különbség kis mértéke magyarázható azzal a ténnyel, hogy a monomerként rendezetlen terminális régiók α-helikális kötegekké összeállva stabilizálják a filamentum szerkezetét, és a deléciós konstrukció kialakítása során azokat nem módosítottam. A filamentum stabilitásáról kapott eredmény megerősít abban, hogy a D3 domén helyére tervezett linkert a célkitűzésnek megfelelően terveztem meg. Monomerek esetében viszont ez a különbség jóval nagyobbnak adódott, ami várható volt, hiszen a flagellinek esetében a terminális régiók rendezetlenek, és csak a flagellin középső részének van meghatározott stabil szerkezete. Mivel a flagellin közepéről távolítottam el a D3 domént (kb. 9 kDa), így míg a rendezetlen régiók változatlanul megmaradtak, addig a szerkezettel rendelkező részek mennyisége lecsökkent. Ez szemléletesen érzékelhető a korábban bemutatott D3-deléciós flagellin tripszines emésztéséből (28. ábra), hiszen a tripszinnek sokkal kevesebb idő kellett a mutáns monomer teljes elemésztéséhez a vadhoz képest azt is figyelembe véve, hogy a rendezetlen régiókat ugyanannyi idő alatt távolította el mindkét fehérje esetében.

4.3.2. Flagellin-enzim DS konstrukciók létrehozása

A CHMO és CPMO gének PCR-ezése után előkészítettem a fragmentumokat és a D3-deléciós plazmidot a ligáláshoz. A DNS-eket emésztettem PmeI-gyel, a plazmidot defoszforiláltam. Az alábbi (34. ábra) gélen látható a ligálás előtti állapot, a plazmidinszert arányok vizsgálatához.

34. ábra: Ligálás előtt; 1. zseb: D3-deléciós plazmid/PmeI+SAP, 2. zseb: CPMO inszert, 3. zseb: CHMO inszert, 4. zseb: standard (10 kbp, 8 kbp, 6 kbp, 5 kbp, 4 kbp, 3,5 kbp, 3 kbp, 2,5 kbp, 2 kbp, 1,5 kbp, 1 kbp, 750bp, 500 bp, 250 bp). 68

Mindegyik ligálásból 5-5 telepem nőtt fel, ezekből preparáltam plazmidot és emésztéssel ellenőriztem a ligálás sikerességét. Először PmeI-gyel emésztettem, így lett látható, hogy az inszert valóban beépült-e a D3-deléciós plazmidba, kontrollként az üres D3-deléciós plazmidot használtam (35. ábra).

35. ábra: 1-5. zseb: D3-deléciós-CHMO plazmidok, 6. zseb: D3-deléciós plazmid/PmeI, 711. zseb: D3-deléciós-CPMO plazmidok

Ez alapján megállapítható, hogy a CHMO plazmidok közül a 3., 4. és 5. plazmidban volt benne az inszert, a CPMO plazmidok közül pedig az 1., 2., 3. és 5. plazmidokban. Ezután csak a jónak vélt plazmidokkal végeztem el az orientációellenőrzést. A korábban leírtak (3.9.2.2. fejezetben) alapján a HindIII restrikciós enzim mindkét konstrukcióhoz megfelelőnek bizonyult az orientációellenőrzéshez. A CHMO esetében, ha a kisebb fragmentum 240 bp-ral kisebb, akkor van jó orientációban a gén a plazmidban. A CPMO esetében pedig 1540 bp-ral nagyobb a kisebb fragmentum jó orientáció esetén (36. ábra). Ezeknek a méreteknek természetesen csak egymáshoz viszonyítva van értelmük.

36. ábra: Orientációellenőrzés HindIII-mal: 1-3. zseb: CHMO konstrukciók, 4. zseb: D3deléciós plazmid, 5-8. zseb: CPMO konstrukciók.

69

Ezek alapján az előző gélen az 1. zsebben futott D3-deléciós-CHMO plazmidot és a 6. zsebben lévő D3-deléciós-CPMO plazmidot mondhatom sikeres fúziós plazmidoknak. Viszont annak érdekében, hogy pontosabb információt kapjak a plazmidok hibátlanságáról, szekvenáltatás is szükséges. Jelenleg a szekvenáltatás és a fehérjék termeltetése folyamatban van.

70

Összefoglalás Kifejlesztettem egy kényelmes és egyszerű módszert karbo- és heterociklusos biciklo [3,2,1] oktanonok előállítására ultrahangos fürdő segítségével. Ehhez a eljáráshoz csak aktivált cinket, rezet és kereskedelmi forgalomban kapható vegyszereket használtam. Ezzel a kétlépéses folyamattal bonyolult feldolgozás nélkül állítottam elő nehezen preparálható 3a, 3b, 3c ketonokat a preparatív kémiában felhasználható hozammal. Ezzel a módszerrel akár grammnyi mennyiségeket is elő lehet állítani. Ezután a gyors, egyszerű módszer után, amellyel a híd-típusú biciklusokat előállítottam, kifejlesztettem egy diasztereoszelektív reakcióutat, amelyet a difunkcionált hattagú cikloketonok (4a, 4b, 4c,

4f, 4g, 4h) előállítására alkalmaztam. Ez az eljárás a gyűrűnyitási metatézis, amelyet gázhalmazállapotú olefinek közreműködésével végeztem. A gyűrűnyitási reakció az enantioszelektív Baeyer-Villiger oxidáció tanulmányozásához szükséges prekurzorok előállítása miatt volt fontos a munkám során. Kísérleteim során megállapítottam, hogy az előállított perhidro-piron molekulák alkalmasak a sejtes biotranszformációk vizsgálatára, a biooxidációk során a várt termékek keletkeztek. A CHMO-típusú enzimek aktív centrumainak hozzáférését illetően a vizsgált három szénatom hosszúságú oldallánc képviselte a határt, hosszabb szubsztituensek esetében nem játszódott le a katalízis. A perhidro-piron-típusú molekulákkal végzett kísérleteimben a CHMOAcineto eredményezte a legjobb hozam és e.e. értékeket. Figyelemre méltó, hogy a divinil vegyület biotranszformációja során a CHMOBreviI enzimmel értem el a legjobb hozamot kiváló optikai tisztasággal. Az irodalomban fellelhető hasonló szerkezetű molekulák eredményeit felhasználva, és a prioritásváltozásokat figyelembe véve megállapítottam a heterociklusos termékeimre a (2S, 7R) abszolút konfigurációt. A szekvenciahomológia és a katalizált reakciók alapján korábban feltett hipotézist kísérleteimmel igazoltam, miszerint az általam is felhasznált BVMO-kat 2 csoportba lehet osztani. A CHMO csoportba tartoznak a CHMOAcineto, CHMORhodoI, CHMORhodoII, CHMOAcido, CHMOArthro enzimek. A CPMO csoportba pedig a CPMOComa és CHMOBreviII enzimek tartoznak. Eredményeim alapján azt is bizonyítottam, hogy a CHMOBreviI enzim egyik csoportba sem sorolható, egy extrém esetet képvisel, átmenetet képezve a különböző biokatalitikus viselkedésformák között. A flagellin-enzim fúziós konstrukciók létrehozásának érdekében először a D3deléciós flagellin mutánst állítottam elő, hiszen az eltávolított D3 domén helyére kívántam beépíteni a CHMO és CPMO enzimeket. A létrehozott D3-deléciós plazmid fehérjetermelési tulajdonságait meghatároztam. A mutáns baktériumok a vadhoz képest 71

kissé elmaradó úszási képességét sötétlátóterű mikroszkóppal és motilitás teszttel vizsgáltam. Elmondható, hogy a mutáns flagellint ugyanolyan mennyiségben termeli a Salmonella baktérium mint az eredeti vad flagellint, és a preparálás során kialakult helikális kötegek mikroszkópos képe nagyon hasonló. A termeltetett D3-deléciós fehérjét polimer és monomer formában jellemeztem tripszines emésztési vizsgálatokkal és CD-vel meghatározott olvadáspontokkal. Ezt követően előállítottam a flagellin-CHMO és flagellin-CPMO DNS-konstrukciókat.

72

Új tudományos eredmények

1. Kifejlesztettem egy egyszerű és hatékony módszert heteroatomot is tartalmazó βcisz biciklusos rendszerek előállítására. Ezzel a kétlépéses folyamattal (ciklizáció és debrómozás) bonyolult feldolgozás nélkül, megfelelő hozammal preparáltam a biciklo-oktanonokat. Ez a módszer grammnyi mennyiségek előállítására is lehetőséget nyújt.

2. Az általam előállított biciklusos rendszerekre megalkottam egy gyűrűnyitási reakciót

gázhalmazállapotú

olefinek

felhasználásával.

Ezzel

a reakcióval

difunkcionált ciklohexanonokat és perhidro-pironokat állítottam elő.

3. Megállapítottam, hogy az előállított perhidro-piron molekulák alkalmasak sejtes biotranszformációk tanulmányozására. A keletkezett laktonok tisztítására módszert dolgoztam

ki.

Az

általam

felhasznált

hét

baktériumfajból

származó

monooxigenázok közül szinte mindegyik esetben a legjobb hozammal és kiváló optikai tisztasággal a CHMOAcineto enzim katalizálta a laktonok keletkezését. A divinil szubsztrátumot a CHMOBreviI enzim alakította át a legjobb hozammal és megfelelő enantiomer-tisztasággal.

4. Megállapítottam a baktériumokkal előállított szubsztituált dioxepanon tiszta enantiomer termékeimre a (2S, 7R) abszolút konfigurációt.

5. Biotranszformációimmal igazoltam a korábban felállított hipotézist, hogy a BaeyerVilliger monooxigenáz enzimek kettő csoportra oszthatók a katalizált reakcióik alapján. Ebből következik az alábbi csoportosítás: CHMO csoport: CHMOAcineto, CHMORhodoI, CHMORhodoII, CHMOAcido, CHMOArthro CPMO csoport: CPMOComa és CHMOBreviII Bizonyítottam, hogy a CHMOBreviI enzim egyik csoportba sem sorolható, egy extrém

esetet

képvisel,

átmenetet

viselkedésformák között.

73

képezve

a

különböző

biokatalitikus

6. A biotechnológiai folyamatok leegyszerűsítésének érdekében megterveztem és létrehoztam a flagellin-CHMOAcineto és a flagellin-CPMOComa DNS-konstrukciókat, melyeknek alapját a génsebészeti eljárással előállított D3-deléciós flagellin plazmid képezi.

7. A D3-deléciós flagellin fehérjével kapcsolatos vizsgálataimból megállapítottam, hogy a D3 domén eltávolítása nem befolyásolta számottevően a baktériumok úszási képességét és a filamentumok stabilitását. A mutáns flagellint ugyanolyan mennyiségben termeli a Salmonella baktérium mint az eredeti vad flagellint. A filamentumok olvadáspontja csupán 2 °C-kal volt alacsonyabb, mint a vad fehérje esetében. A D3-deléciós filamentum proteázokkal szemben hosszú időn át stabil maradt. A mutáns flagellinekből felépített filamentumok jó alapot adnak a továbbfejlesztésre váró enzimaktivitással és polimerizációs képességgel is rendelkező nanoszerkezetek létrehozásához.

74

Major results

1. A simple and efficient method was developed to prepare β-cis bicyclic systems containing also heteroatoms. In this two-step process (cyclization and debromination) the bicyclic octanones were prepared with appropriate yield without any complicated work-up and this method is scalable to gram-quantities.

2. A ring opening reaction was developed for the bicyclic systems prepared by using gaseous olefinic reaction partners. Difunctionalized cyclohexanones and perhydropyranones were synthesized by this reaction.

3. It was established that the perhydropyran-type ketones prepared are suitable for the investigation of whole-cell biotransformations. A protokol was worked out for the purification of lactones formed. Almost in all of the cases among the monooxygenases derived from the seven bacterium species used the CHMOAcineto enzyme catalyzed the formation of lactones with the best yield and excellent optical purity. The CHMOBreviI enzyme transformed the divinyl substrate with best yield and appropriate enantiomer purity.

4. The (2S,7R) absolute configuration

was determined for the pure products of

disubstituted dioxepanon enantiomer.

5. The hypothesis, that is the Baeyer-Villiger monooxygenases can be divided into the following two groups on the basis of catalyzed reactions, was confirmed by my biotransformations: CHMO group: CHMOAcineto, CHMORhodoI, CHMORhodoII, CHMOAcido, CHMOArthro CPMO group: CPMOComa és CHMOBreviII It was confirmed that the CHMOBreviI enzyme could not be classified into either of the groups, however, it was an extreme transition between the different biocatalytic forms.

75

6. I planned and achieved the flagellin-CHMOAcineto and the flagellin-CPMOComa DNA constructions for the sake of the simplicity of biotechnological processes which were based on the D3 deletion plasmid synthesized by genetic engineering.

7. It was established in the investigations of D3 deletion flagellin protein that the removing of the D3 domain did not influence significantly the swimming capability of bacteria and the stability of filaments. The Salmonella bacteria produced the same amount of mutant flagellin as that of the wild one. The melting point of filaments was lower only by 2 ºC than that of the wild protein. D3 deletion filament remained stable against proteases for a long time. For further development of this system, the filaments built from mutant flagellins give suitable basis for creating nanostructures having enzyme activity and polimerization ability.

76

Mellékletek 1. Melléklet: Rövidítések jegyzéke Amp: ampicillin bp: bázispár BV: Baeyer-Villiger BVMO: Baeyer-Villiger monooxigenáz CD: cirkuláris dikroizmus CHMO: ciklohexanon monooxigenáz CPMO: ciklopentanon monooxigenáz FAD: flavin-adenin-dinukleotid FDH: formát-dehidrogenáz FMN: flavin mononukleotid FliC: flagellin GC: gázkromatográfia G6P: glükóz-6-foszfát G6PDH: glükóz-6-foszfát dehidrogenáz IPTG: izo-propil-β-D-1 tiogalaktopiranozid LB: Luria-Bertani LBAmp: ampicillint tartalmazó LB mCPBS: meta-klór perbenzoesav NADH: nikotinamid-adenin-dinukleotid NADPH: nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát NMR: magmágnes-rezonancia PAMO: fenilaceton-monooxigenáz PCR: polimeráz láncreakció ROM: gyűrűnyitási metatézis SAP: Shrimp Alkaline Phosphatase SDS: nátrium-dodecil szulfát TBA: tetrabróm-aceton

77

2. Melléklet: A reakciók adatai Kiindulási vegyület, mennyiség

Termék Termék tisztítása Hozam/mennyiség

Pirrol 8,73 g

1c

KRD

Termék jellemzői

74,5 %/12,12 g

Színtelen folyadék

130,1 mmol TBA

3a

-*

62 %**/0,8 g

Halványsárga kristály Op. 36-38 °C

3b

-*

60 %**/0,75 g

Színtelen kristály Op. 36-38 °C

3c

-*

45 %**/0,3 g

Sárga olaj

4a

Szilikagél PE/EtOAc=40/1

50 %/62 mg

Színtelen olaj

4b

Szilikagél PE/EtOAc=40/1

40 %/52 mg

Világosbarna olaj

4c

Szilikagél PE/EtOAc=40/1

65 %/85 mg

Világosbarna olaj

3b 100 mg 0,806 mmol

4f

Szilikagél PE/EtOAc=40/1

43 %/52 mg

Színtelen olaj

3b 100 mg 0,806 mmol

4g

Szilikagél PE/EtOAc=40/1

40 %/53 mg

Világosbarna olaj

4h

Szilikagél PE/EtOAc=40/1

42 %/60 mg

Világosbarna olaj

5f

-

87 %/446 mg

Szürke olaj

3,8 g 10 mmol TBA 3,8 g 10 mmol TBA 1,4 g 3,7 mmol

3a 100 mg 0,819 mmol

3a 100 mg 0,819 mmol

3a 100 mg 0,819 mmol

3b 100 mg 0,806 mmol 4f 500 mg 3,29 mmol

78

Kiindulási TerTermék vegyület, mék Termék tisztítása Hozam/mennyiség jellemzői mennyiség 5d Szilikagél 100 mg 79 %/92 mg*** Színtelen olaj 6d PE/EtOAc=2/1 1 mmol Szilikagél 5e PE/EtOAc=5/1, 80 %/90 mg*** Színtelen olaj 100 mg 6e 1/1, 1/3 0,78 mmol KRD 5f 98-102 °C/ 90 %/89 mg*** Színtelen olaj 99 mg 6f 0,07mbar 0,63 mmol 4f Szilikagél 100 mg 40 %/42 mg*** Világosbarna olaj 6’f PE/EtOAc=20/1 0,66 mmol TBA: tetrabróm-aceton, KRD: Kugelrohr desztilláció, PE: petroléter, EtOAc: etil-acetát, *tisztítás nélkül > 95 % tisztaságú, **ciklizáció és debrómozás után, ***CHMOAcineto enzimmel

3. Melléklet: Az előállított vegyületek MR-adatai Pirrol-1-karbonsav-metilészter (1c) Hozam: 12,12 g (74,5 %) színtelen folyadék f.p.: 25-40 ºC /nagy vákuum MW: 125,13 1

H-NMR (CDCl3): 3.95 (s, 3H, -OMe), 6.25 (t, J=2.3Hz, 2H, H3/4), 7.25 (t, J=2.3Hz, 2H,

H2/5) 13

C-NMR (CDCl3): 55.3(q, OMe), 111.8 (d, C3/4), 119.4 (d, C2/5), 150.3 (s, C=O)

2,4-dibróm-biciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on (2a) Hozam: 11,5 g (98 %) narancs olaj (tisztítás nélkül) MW: 279,96 1

H-NMR (CDCl3): 2.10 (d, 1H, H8a), 2.30-2.40 (m, 1H, H8b), 3.25-3.30 (m, 2H, H1/5),

4.85 (d, 2H, H2/4), 6.30 (s, 2H, H6/7) 13

C-NMR (CDCl3): 43.3 (t, C8), 48.8 (d, C1/5), 59.1 (d, C2/4), 136.3 (d, C6/7), 192.4 (s,

C3)

79

2,4-dibróm-8-oxabiciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on (2b) Hozam: 11,09 g (99 %) barna olaj (tisztítás nélkül) MW: 281,94 1

H-NMR (CDCl3): 4.80 (d, J=4.7Hz, 2H, H2/4), 5.15 (d, J=4.7Hz, 2H, H1/5), 6.60 (s, 2H,

H6/7) 13

C-NMR (CDCl3): 55.7 (d, C2/4), 82.7 (d, C1/5), 134.0 (d, C6/7), 189.4 (s, C3)

Biciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on (3a) Hozam: 2,48 g (48,6 %) narancs olaj (két lépés együttes hozama) MW: 122,17 1

H-NMR (CDCl3): 1.75 (d, 1H, H8a), 2.00-2.18 (m, 1H, H8b), 2.28-2.55 (m, 4H, H2/4), 2.91

(s, 2H, H1/5), 6.00 (s, 2H, H6/7) 13

C-NMR (CDCl3): 38.3 (t, C8), 41.8 (d, C1/5), 46.4 (t, C2/4), 135.5 (d, C6/7), 210.4 (s, C3)

8-oxabiciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on (3b) Hozam: 1,82 g (37,4 %) narancs olaj (két lépés együttes hozama) MW: 124,14 1

H-NMR (CDCl3): 2.30 (d, J=16Hz, 2H, H2eq/H4eq), 2.80 (dd, J=16Hz, J=5Hz, 2H,

H2ax/H4ax), 5.05 (d, J=5Hz, 2H, H1/5), 6.20 (s, 2H, H6/7) 13

C-NMR (CDCl3): 46.6 (t, C2/4), 77.1 (d, C1/5), 133.3 (d, C6/7), 205.2 (s, C3)

8-metoxikarbonil-8-azabiciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on (3c) Hozam: 490 mg (22 %) narancs olaj (két lépés együttes hozama) MW: 181,19 1

H-NMR (CDCl3): 2.35 (d, J=16Hz, 2H, H2eq/H4eq), 2.60-2.80 (m, 2H, H2ax/H4ax), 3.75 (s,

3H, -OCH3), 4.80-4.90 (m, 2H, H1/5), 6.25 (s, 2H, H6/7) 13

C-NMR (CDCl3): 45.6 (t, C2/4), 52.6 (q, -OCH3), 56.0 (d, C1/5), 113.7 (d, C6/7), 153.1 (s, -

NCOO-), 205.4 (s, C3)

Cisz-3,5-divinil-ciklohexan-1-on (4a) Hozam: 62 mg (50 %) színtelen olaj 1

H-NMR (200 MHz, CDCl3): 1.11-1.40 (m, 1H), 1.85-2.20 (m, 3H), 2.28-2.50 (m, 4H), 4.98-

5.05 (m, 4H), 5.62-5.83 (m, 2H) 13

C-NMR (50 MHz, CDCl3): 37.4 (t), 41.3 (d), 46.5 (t), 113.7 (t), 141.1 (d), 209.9 (s). 80

Cisz-3-propenil-5-vinil-ciklohexan-1-on (4b) Hozam: 52 mg (40 %) világosbarna olaj 1

H-NMR (200 MHz, CDCl3): E/Z-izomerek: 1.20-1.30 (m, 1H), 1.59 (d, J = 5.5Hz, 3H),

1.85-2.37 (m, 7H), 4.91-5.00 (m, 2H), 5.05-5.50 (m, 2H), 5.64-5.80 (m, 1H) 13

C-NMR (50 MHz, CDCl3): E-izomer: 17.8 (q), 38.0 (t), 40.6 (d), 41.3 (d), 46.5 (t), 47.2

(t), 113.5 (t), 124.2 (d), 134.0 (d), 141.2 (d), 210.3 (s); Z-izomer: 12.9 (q), 35.8 (d), 37.8 (t), 41.5 (d), 46.5 (t), 47.3 (t), 113.6 (t), 124.3 (d), 133.3 (d), 141.2 (d), 210.1 (s).

Cisz-3-propenil-5-butenil-ciklohexan-1-on (4c) Hozam: 85 mg (65 %) világosbarna olaj 1

H-NMR (200 MHz, CDCl3): E/Z-izomerek: 0.97 (t, J = 7.5Hz, 3H), 1.16-1.42 (m, 2H),

1.85-2.60 (m, 8H), 4.97-5.07 (m, 2H), 5.55-5.71 (m, 2H), 5.72 – 5.88 (m, 1H) 13

C-NMR (50 MHz, CDCl3): E-izomer: 13.7 (q), 25.4 (t), 38.1 (t), 41.3 (d), 41,5 (d), 46.5

(t), 47.3 (t), 113.5 (t), 131.8 (d), 141.2 (d), 210.4 (s); Z-izomer: 14.4 (q), 20.8 (t), 29.2 (t), 36.1 (d), 41.5 (d), 46.5 (t), 47.5 (t), 113.5 (t), 131.9 (d), 141.2 (d), 210.4 (s).

Cisz-2,6-divinil-perhidro-4-piron (4f) Hozam: 52 mg (43 %) színtelen olaj 1

H-NMR (200 MHz, CDCl3): 2.31-2.51 (m, 4H), 4.13-4.23 (m, 2H), 5.18-5.38 (m, 4H),

5.86-6.02 (m, 2H) 13

C-NMR (50 MHz, CDCl3): 47.2 (t), 77.2 (d), 116.2 (t), 137.0 (d), 205.9 (s).

Cisz-2-vinil-6-propenil-perhidro-4-piron (4g) Hozam: 53 mg (40 %) világosbarna olaj 1

H-NMR (200 MHz, CDCl3): E/Z-izomerek: 1.73 (d, 3H), 2.37-2.42 (m, 4H), 4.07-4.20 (m,

2H), 5.18-5.36 (m, 2H), 5.52-6.02 (m, 3H) 13

C-NMR (50 MHz, CDCl3): 17.7 (q), 47.3 (t), 47.7 (t), 77.3 (d), 116.4 (t), 128.7 (d), 130.2

(d), 137.0 (d), 206.2 (s).

81

Cisz-2-vinil-6-butenil-perhidro-4-piron (4h) Hozam: 60 mg (42 %) világosbarna olaj 1

H-NMR (200 MHz, CDCl3): E/Z-izomerek: 1.01 (t, 3H), 2.09 (q, 2H), 2.37-2.42 (m, 4H),

4.11-4.18 (m, 2H), 5.18-5.37 (m, 2H), 5.49-6.02 (m, 3H) 13

C-NMR (50 MHz, CDCl3): 13.0 (q), 25.1 (t), 47.3 (t), 47.9 (t), 77.3 (d), 77.5 (d), 128.0

(d), 135.0 (d), 137.1 (d), 206.2 (s).

1,4-dioxepan-5-on (6d) Biooxidáció terméke 1

H-NMR (CDCl3): 2.82-2.87 (m, 2H, H3), 3.75-3.86 (m, 4H, H4/6), 4.23-4.26 (m, 2H, H7)

13

C-NMR (CDCl3): 39.97 (C3), 65.41, 71.02, 71.42 (C 4/6/7), 174.89 (C2)

Cisz-2,7-dimetil-1,4-dioxepan-5-on (6e) Biooxidáció terméke 1

H-NMR (CDCl3): 1.18-1.21 (d, 3H, -CH3), 1.27-1.30 (d, 3H, -CH3), 2.64-2.99 (m, 2H,

H3), 3.41-3.71 (m, 1H, H6), 3.81-3.99 (m, 1H, H4), 4.00-4.26(dd, 2H, H7) 13

C-NMR (CDCl3): 18.19 (C8), 22.73 (C9), 45.27 (C3), 70.62 (C4), 74.06 (C7), 75.16

(C6), 173.32 (C2)

Cisz-2,7- dietil-1,4-dioxepan-5-on (6f) Biooxidáció terméke 1

H NMR (CDCl3): 0.99 (t, J=9Hz, 3H), 1.00 (t, J=9Hz, 3H), 1.40-1.75 (m, 4H), 2.69 (dd,

J=16Hz, J~1Hz, 1H), 2.90 (dd, J=16Hz, J=10Hz, 1H), 3.50-3.67 (m, 2H), 4.08 (dd, J=13Hz, J~1Hz, 1H), 4.21 (dd, J=13Hz, J=6Hz, 1H)

13

C NMR (CDCl3): 9.8 (q), 9.9 (q), 25.5 (t), 30.0 (t), 43.8 (t), 73.4 (t), 75.5 (d), 80.3 (d),

173.6 (s);

82

Cisz-2,7-divinil-1,4-dioxepan-5-on (6’f) Biooxidáció terméke 1

H-NMR (CDCl3): 2.73-3.00 (m, 2H, H3), 4.05-4.32(m, 4H, H4/6/7), 5.12-5,44(m, 4H,

H8/11), 5.64-5.89(m, 2H, H9/10) 13

C-NMR (CDCl3): 44.03 (C3), 71.80 (C7), 74.33, 79.41 (C 4/6), 117.91, 116.17 (C 8/11),

137.06, 132.99 (C 9/10), 172.58 (C 2)

83

Irodalomjegyzék Asakura, S.; Adv. Biophys. 1970, 1, 99-155. Baeyer, A., Villiger,V.; Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1899 32, 3625-3633. Bocola, M., Schulz, F., Leca, F., Vogel, A., Fraaije, M. W., Reetz, M. T.;. Adv. Synth. Catal. 2005, 347, 979-986. Branchaud, B. P., Walsh, C. T.; J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 2153-2161. Bremner, D. H.; Ultrason. Sonochem. 1994, 1, 119. Carrel, F., Vogel, P.; Tetrahedron Asymm. 2000, 11, 4661. Cheng, Q., Thomas, S. M., Kostichka, K., Valentine, J. R., Eagarajan, V.; J. Bacteriol. 2000, 182, 4744-4751. Connon, S. J., Blechert, S.; Angew. Chem., 2003, 42, 1900. Criegee, R.; Justus Liebigs Ann. Chem. 1948, 560, 127-141. Donoghue, E. A., Eorris, D. B., Trudgill, P. W.; Eur. J. Biochem. 1976, 63, 175-192. Donoghue, E. A., Trudgill, P. W.; Eur. J. Biochem. 1975, 60, 1-7. Ezaki, S., Tsukio, M., Takagi, M., Imanaka, T.; J. Ferm. Bioeng. 1998, 5, 500-503. Felpin, F. X. Lebreton; J. Eur. J. Org. Chem. 2003, 3693. Fort, A.W. J.; Am. Chem. Soc. 1962, 84, 4979. Fuerstner, A.; Actualite Chim., 2003, 4-5, 57. Fürstner, A.; Angew. Chem. 2000, 112, 3140. Gál, P., Végh, B., Závodszky, P. and Vonderviszt, F.; Eat. Biotech. 2006, 24, 900-901. Gillingham, D.G., Kataoka, O., Garber, S.B., Hoveyda, A.H.; J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 12288-12290. Grubbs, R. H., Chang, S;. Tetrahedron 1998, 54, 4413. Grubbs, R.H.; in Handbook of Metathesis, Wiley-VCH, Weinheim, 2003, 1,2. Hodge, P., Rickards, R. W.; J. Chem. Soc. 1963, 2543-2545. Hoffmann, H.M.R.; Angew. Chem. 1984, 86, 29. Hoffmann, H.M.R., Kim, H.; Eur. J. Org. Chem. 2000, 2195. Hofle, G., Glaser, E., Leibold, T., Karama, U., Sasse, F., Steinmetz, H.; Pure Appl. Chem. 2003, 75, 167. Iwaki, H., Hasegawa, Y., Teraoka, M., Tokuyama, T., Bergeron, H., Lau, P. C. K.; Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65, 5158-5162. Iwaki, H., Hasegawa, Y., Lau, P. C. K, Wang, S., Kayser, M.M.; Appl. Environ. Microbiol, 2002, 68, 5681-5684. Kuwajima, G. J. Bacteriol. 1988, 170, 3305-3309. LeGoff, E.; J. Org. Chem. 1964, 29, 2048-2050. 84

Lu, Z., Murray, K.S., Cleave, V.V., LaVallie, E.R., Stahl, M.L.,

McCoy, J.M.;

Biotechnology 1995, 13, 366-372. Luna, M.G., Martins, M.M., Eewton, S.M.C., Costa, S.O.P., Almeida, D.F. and Ferreira, L.C.S.; Res. Micr. 1997, 148, 3, 217-228. Macnab, R.M.; Biochim. Biophys. Acta 2004, 1694, 207-217. Malapaka, R. R. V., Adebayo, L. O., Tripp, B. C.; J. Mol. Biol. 2007, 365, 1102-1116. Malito, E., Alfieri, A., Fraaije, M. W., Mattevi, A.; Proc. Eat. Ac. Sci. USA, 2004, 101, 36, 13157-13162. Mihovilovic, M. D., Chen, G., Wang, S., Kyte, B., Rochon, F., Kayser, M. M., Stewart, J. D; J. Org. Chem. 2001a, 66, 733-738. Mihovilovic, M. D., Müller, B., Kayser, M. M., Stewart, J. D., Fröhlich, J., Stanetty, P,. Spreitzer, H. ; J. Mol. Catal, B: Enyzm. 2001b, 11, 349-353. Mihovilovic, M. D., Müller, B., Stanetty, P.; Eur. J. Org. Chem. 2002, 3711-3730 Mihovilovic, M. D., Rudroff, F., Muller, B., Stanetty, P.; Bioorg. Med. Chem. Letters 2003a, 13, 1479-1482. Mihovilovic, M. D., Rudroff, F., Kandioller, W., Grötzl, B., Stanetty, P., Spreitzer, H.; Synlett 2003b, 13, 1973-1976. Mihovilovic, M. D., Rudroff, F., Grötzl, B., Kapitan, P., Snajdrova, R., Rydz, J., Mach, R.; Angew. Chem. Int. Ed., 2005, 44, 3609-3613. M. D. Mihovilovic, B. Grötzl, W. Kandioller, A. Muskotál, R. Snajdrova, F. Rudroff, H. Spreitzer, Chem. Biodiv. 2008, 5, 490-498. Mimori-Kiyosue, Y., Vonderviszt, F. and Eamba, K.; J.Mol.Biol. 1997, 270, 222-237. Montana, A. M., Grima, P. M.; Tetrahedron Lett. 2001, 42, 7809. Muskotál A., Király R., Sebestyén A., Gugolya Z., Végh B.M., Vonderviszt F., FEBS Letters 2006, 580, 3916-3920. Eamba K., Vonderviszt F.; Quart. Rev. Biophys. 1997,30, 1-65. Eeipp C. E., Martin, S. F.; Tetrahedron Letters 2002, 43, 1779-1782. Eoyori, R.; Acc. Chem. Res. 1979, 12, 61. Poppe László, Eovák László: Biokatalízis a szintetikus kémiában, A kémia újabb eredményei 73. Kötet, Akadémiai Kiadó Budapest, 1991 Prunet, J.; Angew. Chem. 2003, 42, 2826. Ramachandran, P. V., Reddy, M. V. R., Brown, H. C.; Pure and Applied Chem. 2003, 75, 1263. Randall, M. L., Tallarico, J. A., Snapper, M. L. J.; Am. Chem. Soc. 1995, 117, 9610. Randall, M. L., Tallarico, J. A., Snapper, M. L. J.; Am. Chem. Soc. 1997, 119, 1478. 85

Ryerson, C. C. , Ballou, D. P., Walsh, C.; Biochemistry 1982, 21, 2644-2655. Samatey, F.A., Imada, K., Eagashima, S., Vonderviszt, F., Kumasaka, T., Yamamoto, M., Eamba, K.; Eature 2001, 410, 331-337. Sato, T., Eoyori, R.; Bull. Chem. Soc. Jap. 1978, 51, 2745. Schneider, M. F.; Blechert, S. Angew. Chem. 1996, 108, 479. Schwarz-Linek, U., Krödel, A., Ludwig, F.-A., Schulze, A., Rissom, S., Kragl, U., Tishkov, V. I., Vogel, M.; Synthesis 2001, 947-951. Stewart, J. D., Reed, K. W., Kayser, M. M.; J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1996, 755-757. Stewart, J. D., Reed, K. W., Martinez, C. A., Zhu, J., Chen, G., Kayser, M. M.; J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 3541-3548. Tallarico, J. A., Bonitatebus, P. J., Snapper, M. L. J.; Am. Chem. Soc. 1997, 119, 7157. Taschner, M. J., Black, D. J.; J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 6892-6893. Taschner, M. J, Peddad L.; J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1992, 1384-1385. Van Veldhuizen, J.J., Campbell, J.E., Giudici, R.E., Hoveyda, A.H.; J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6877-6882. Végh, B.M., Gál, P., Dobó, J., Závodszky, P. and Vonderviszt, F.; Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006, 345, 93-98. Vonderviszt F., Kanto S., Aizawa S., Eamba K.; J. Mol. Biol. 1989, 209, 127-133. Vonderviszt, F., Aizawa, S.-I. and Eamba, K.; J. Mol. Biol. 1991, 221, 1461-1474. Walsh, C.; Acc. Chem. Res. 1980, 13, 148-155. Weeresakare, G. M., Liu, Z., Rainier, J. D.; Org. Letters 2004, 6, 1625. Wichmann, R., Wandrey, C., Bückmann, A. F., Kula, M.-R.; Biotechnol. Bioeng. 1981, 23, 2789-2802. Wilson, D.R. and Beveridge, T.J.; Can. J. Microbiol.1994, 39, 67-71. Wong, C.-H., Whitesides, G. M. J.; Am. Chem. Soc. 1981, 103, 4890-99. Wright, D. L., Usher, L. C., Estrella-Jimenez, M.; Org. Lett. 2001, 3, 4275. Yonekura, K., Maki-Yonekura, S. and Eamba, K.; Eature 2003, 424, 643-650. http://esr.elte.hu/~noemi/labor/cd/cd.html

86