BAB III BAHAN DAN CARA KERJA. Penelitian dilakukan di Laboratorium Institute of Human Virology and

23

BAB III BAHAN DAN CARA KERJA

A. LOKASI DAN WAKTU PENELITIAN

Penelitian dilakukan di Laboratorium Institute of Human Virology and Cancer Biology of the University of Indonesia (IHVCB-UI), Jl. Salemba 4, Gedung IASTH UI lantai 8 selama 12 bulan (Oktober 2007--September 2008).

B. BAHAN

1. Sampel

Sampel yang digunakan adalah antigen virus influenza A/chicken/Indonesia/2005 (H5N1); A/chicken/Indonesia/2006 (H5N1); A/chicken/Indonesia/2007 (H5N1); A/Indonesia/2007 (H3N2); A/Indonesia/2007 (H1N1); antigen bakteri S. pneumonia, N. meningitidis, dan H. influenzae. Sampel yang digunakan diperoleh dari Balai Penelitian Veterinair, Bogor.

2. Bahan dan reagen

Tabung PCR [Axygen], tabung Eppendorf mastermix 1,5 ml [Axygen], pippetor tips (10 µl, 20 µl, 100 µl, 1.000 µl) [Axygen], dan disposable gloves.

Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008

24

10X PCR buffer [Qiagen], 5X Q-Solution [Qiagen], 25 mM MgCl2 [Qiagen], 10 mM deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) mix [Qiagen], 5 unit/µl enzim Hot-Star Taq DNA polimerase [Qiagen], distilled water [Qiagen], 10 mmol primer (NIF 64, NIF 306, NIF 600, NIF 757 (forward), dan NIR 320, NIR 537, NIR 774, NIR 975 (reverse), cDNA avian influenza, cDNA S. pneumonia, cDNA N. meningitidis, cDNA H. influenzae, DNA marker 100 bp [New England BioLabs, Inc.], sterile milli Q water [Hartech], 30% acrylamide mix [Promega], 10% ammonium persulfate (APS) [Merck], N,N,N’,N’tetrametiletilenadiamina (TEMED) [Promega], tris-borat asam etilendiamintetraasetat (TBE) 10X, EtBr [Promega], loading dye 6X [Promega], 1X buffer TBE, dan tris-asam etilendiamintetraasetat (TE).

C. PERALATAN Alat- alat yang digunakan meliputi mikropipet (2--20 µl; 20--200 µl; 100--1.000 µl) [Gilson dan Bio Rad], vortex [Heidolph], DNA thermal cycler engine [PTC-200 DNA engine cycler], aparatus elektroforesis (chamber, tray, comb, dan power supply) [Bio Rad], rak tabung, centrifuge [Heidolph], lemari es 4° C dan freezer -20° C [Goldstar dan Daichi], parafilm, sumber sinar UV [Uvitec], gel doc [Bio Rad], dan spektrofotometer [Ultrospec 2000].


25

D. CARA KERJA

Sintesis cDNA yang digunakan sebagai cetakan DNA pada uji sensitivitas dan spesifisitas PCR dilakukan dengan teknik RT-PCR menggunakan enzim omniscript reverse transcriptase dan RNA virus influenza A/chicken/Indonesia/2006 (H5N1). Reaksi amplifikasi cDNA untuk uji sensitivitas dan spesifisitas PCR dilakukan dengan teknik Hot-Star PCR menggunakan enzim Hot-Star Taq DNA polymerase. Produk PCR yang dihasilkan divisualisasikan dengan elektroforesis gel poliakrilamida 12%. Skema kerja penelitian secara umum dapat dilihat pada Gambar 7.

1. Sintesis cDNA

Sintesis cDNA dilakukan dengan menggunakan enzim omniscript reverse transcriptase menurut Qiagen (2004: 12--13). Bahan yang digunakan untuk membuat campuran reaksi (RT-PCR buffer, dNTP mix, ddH2O, RNAse inhibitor, random primers, enzim omniscript reverse transcriptase, dan cetakan RNA ) dimasukkan secara berurutan ke dalam tabung mastermix. Komposisi campuran reaksi dapat dilihat pada Lampiran 1. Prosedur kerja dilakukan sesuai prosedur standar PCR. Suhu yang digunakan untuk reaksi adalah 37º C selama 60 menit, dan 95º C selama 5 menit.


26

2. Purifikasi cDNA

Purifikasi cDNA dilakukan menggunakan metode purifikasi hasil PCR menurut Qiagen (2002: 18). Sebanyak 20 µl cDNA ditambahkan dengan 100 µl buffer PB, kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit. Sisa buffer PB yang terdapat pada kolom penampung dibuang. Sebanyak 300 µl buffer PE ditambahkan ke dalam kolom dan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit. Sisa buffer PE pada kolom penampung dibuang dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit untuk menghilangkan sisa etanol. Kolom dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5 ml baru dan steril. Sebanyak 50 µl buffer 1/3 TE (Tris-EDTA) dimasukkan ke dalam kolom untuk elusi cDNA, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit.

3. Pengukuran konsentrasi cetakan cDNA Pengukuran konsentrasi cDNA dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer menurut Sambrook & Russell (2001: 6.11). Sebanyak 16 µl cDNA ditambahkan ke dalam 384 µl buffer 1/3 TE (pengenceran 25 kali). Blanko yang digunakan adalah 200 µl buffer 1/3 TE. Konsentrasi cDNA ditentukan dengan mengukur nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Nilai konsentrasi cDNA yang diperoleh


27

kemudian dicatat. Kadar kemurnian cDNA ditentukan dengan menghitung rasio nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.

4. Optimasi PCR

Optimasi PCR dilakukan dengan menggunakan teknik Hot-Star PCR berdasarkan metode Qiagen (2005: 17--21). Bahan yang digunakan untuk membuat campuran reaksi (PCR buffer, Q-solution, dNTP mix, MgCl2, ddH2O, dan primer dimasukkan secara berurutan ke dalam tabung mastermix. Komposisi campuran reaksi dibuat sesuai prosedur IHVCB (Widyaningtyas, komunikasi pribadi, 25 Oktober 2007). Prosedur kerja optimasi PCR dilakukan sesuai prosedur standar PCR, menggunakan metode gradien suhu annealing. Suhu dan siklus reaksi diatur, program siklus PCR diisi dengan tahap initial activation pada suhu 95ο C, selama 15 menit. Tahap denaturasi pada suhu 94ο C, selama 30 detik. Tahap annealing pada suhu sekitar 50--68ο C, selama 1 menit. Tahap polimerisasi pada suhu 72ο C, selama 1 menit. Tahap denaturasi sampai tahap polimerisasi diulangi sebanyak 34 kali, setelah itu ditambahkan tahap final extension pada suhu 72ο C, selama 10 menit.

5. Uji spesifisitas PCR Uji spesifisitas PCR dilakukan sesuai dengan metode Payungporn dkk. (2006: 145) dan Lisa dkk. (2006: 2). Setiap pasangan primer dalam


28

campuran reaksi PCR dicampurkan dengan cDNA virus influenza A/chicken/Indonesia/2005 (H5N1); A/chicken/Indonesia/2006 (H5N1); A/chicken/Indonesia/2007 (H5N1); A/Indonesia/2007 (H3N2); A/Indonesia/2007 (H1N1) masing-masing dalam tabung reaksi terpisah. Uji reaksi silang dilakukan menggunakan cDNA bakteri S. pneumonia, N. meningitidis, dan H. influenzae yang ditambahkan ke dalam campuran reaksi, masing-masing dalam tabung reaksi terpisah. Prosedur kerja dilakukan sesuai prosedur standar PCR. Kondisi reaksi amplifikasi masingmasing pasangan primer disesuaikan dengan hasil optimasi PCR. Komposisi campuran reaksi dapat dilihat pada Lampiran 2.

6. Uji sensitivitas PCR Uji sensitivitas PCR dilakukan sesuai dengan metode Pan dkk. (2001: 134). Sebanyak 16 µl cDNA ditambahkan ke dalam 384 µl larutan buffer 1/3 TE. Konsentrasi cDNA diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Pengenceran bertahap dilakukan terhadap cDNA tersebut dengan nilai konsentrasi 0,1 pg/µl, 1 pg/µl, 0,01 ng/µl, 0,1 ng/µl, 1 ng/µl, dan 10 ng/µl. Setiap pasangan primer dicampurkan dengan masing-masing cetakan DNA yang telah diencerkan dan dilakukan reaksi amplifikasi menggunakan prosedur yang sama dengan tahap optimasi PCR. Kondisi amplifikasi disesuaikan dengan hasil optimasi PCR masing-masing pasangan primer. Komposisi reagen yang digunakan dapat dilihat pada Lampiran 3.


29

7. Elektroforesis gel poliakrilamida Visualisasi produk hasil amplifikasi dilakukan dengan elektroforesis dan teknik polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) menurut Sambrook & Russell (2001: 6.6--6.8). Pembuatan gel poliakrilamida 12% dilakukan dengan cara mencampurkan 3 ml acrylamide mix dengan 6 ml sterile milli Q water, kemudian 0,75 ml 10X TBE, 85 µl 10% APS, dan 8,5 µl TEMED. Campuran dimasukkan dengan konfigurasi vertikal. Prosedur kerja dilakukan sesuai prosedur standar elektroforesis. Tegangan yang digunakan sebesar 120 V, waktu running selama 60 menit, dan kuat arus yang digunakan sebesar 400 mA. Pewarnaan pita DNA dilakukan dengan EtBr 1 µl/ml.

.


BAB III BAHAN DAN CARA KERJA. Penelitian dilakukan di Laboratorium Institute of Human Virology and

Recommend Documents