AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAUN PACAR KUKU (Lawsonia inermis L.) DAN BIOAUTOGRAFI TERHADAP Bacillus subtilis DAN Shigella sonnei
NASKAH PUBLIKASI
Oleh : DYAH AYU NOVIA PRATIWI K100090124
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA SURAKARTA 2014
2
AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAUN PACAR KUKU (Lawsonia inermis L.) DAN BIOAUTOGRAFI TERHADAP Bacillus subtilis DAN Shigella sonnei ANTIBACTERIAL ACTIVITY ETHANOLIC EXTRACT OF PACAR KUKU LEAF (Lawsonia inermis L.) AND BIOAUTOGRAPHY AGAINST Bacillus subtilis AND Shigella sonnei Dyah Ayu Novia Pratiwi*, Ratna Yuliani Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta Jl. Ahmad Yani, Tromol Pos I, Pabelan Kartasura Surakarta 57102 *Email:
[email protected]
ABSTRAK Ekstrak daun pacar kuku (Lawsonia inermis L.) memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri Gram negatif maupun Gram positif. Daun pacar kuku mengandung lawson (2hidroksi, 1,4 naftokuinon), berbagai glikosida fenolik, flavonoid, kumarin, dan steroid (sitosterol), lemak, resin, dan henna-tanin. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun pacar kuku dan mengetahui golongan senyawa yang berpotensi sebagai antibakteri terhadap Bacillus subtilis dan Shigella sonnei. Ekstrasi daun pacar kuku dilakukan menggunakan metode maserasi dengan penyari etanol 70%. Uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol 70% daun pacar kuku menggunakan metode difusi (Kirby-Bauer) dengan mengukur diameter zona hambat yang terbentuk. Identifikasi senyawa menggunakan kromatografi lapis tipis dengan fase gerak kloroform:etanol (9:1) v/v dan fase diam silika GF254. Uji bioautografi kontak dilakukan untuk mengetahui senyawa yang memiliki aktivitas sebagai antibakteri. Hasil ekstraksi menghasilkan ekstrak kental berwarna coklat kemerahan dengan rendemen sebanyak 22,53%. Uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol 70% daun pacar kuku yang dilakukan terhadap Bacillus subtilis dan Shigella sonnei menunjukkan aktivitas antibakteri yang paling besar pada konsentrasi 4000 µg/disk dengan membentuk zona radikal masing-masing 9,3±0,3 mm dan 10,8±0,3 mm. Hasil analisis KLT dan bioautografi menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% daun pacar kuku mengandung senyawa fenol, kumarin, naftokinon, antrakinon, flavonoid, triterpenoid, dan steroid yang memiliki aktivitas antibakteri. Kata kunci : Pacar kuku (Lawsonia inermis L.), Bacillus subtilis, Shigella sonnei, antibakteri. ABSTRACT Henna leaf extract (Lawsonia inermis L.) have antibacterial activity against Gram negative and Gram positive bacteria. Henna leaves contain lawsone (2-hydroxy, 1,4 napthoquinone), various phenolic glycosides, flavonoids, coumarin, and steroids (sitosterol), fats, resins, and henna-tannins. The purpose of this study was to determine the antibacterial activity of the ethanol extract of leaves of henna and class of compounds that have antibacterial activity against Bacillus subtilis and Shigella sonnei. Henna leaves macerated with ethanol 70%. Antibacterial activity of the extract was tested with diffusion method (Kirby-Bauer) by measuring the diameter of inhibition zone. Identification of compounds was carried of by thin layer chromatography with a mobile phase of chloroform: ethanol (9:1) v/v and stationary phase of silica GF254. Contact bioautografi 1
test was performed to determine compounds that have antibacterial activity. Extraction yielded reddish brown viscous extract with a yield as 22.53%. Reset of antibacterial activity test of 70% ethanol extract of leaves of henna against Bacillus subtilis and Shigella sonnei showed that the greatest antibacterial activity is extract with concentration of 4000 ug/disk with diameter zone inhibition of 9.3±0.3 mm and 10.8±0.3 mm respectively. TLC analysis and bioautografi results showed that of leaves of henna contains phenolic compounds, coumarin, napthoquinone, anthraquinone, flavonoids, triterpenoids, and steroids that have antibacterial activity. Keywords : Henna (Lawsonia inermis L.), Bacillus subtilis, Shigella sonnei, antibacterial. PENDAHULUAN Tanaman herbal masih merupakan pilihan utama yang digunakan dalam pengobatan di beberapa belahan dunia (Al-Rubiay et al., 2008). Metabolit sekunder yang dihasilkan tanaman telah diakui memiliki banyak aktivitas farmakologi seperti tanaman pacar kuku (Lawsonia inermis L.) (Rahmoun et al., 2013). Penyakit yang sering diobati dengan tanaman herbal salah satunya adalah infeksi yang disebabkan oleh bakteri (Borade et al., 2011). Dua bakteri yang dapat menyebabkan penyakit antara lain Bacillus subtilis dan Shigella sonnei. Bacillus subtilis adalah bakteri yang mengkontaminasi makanan sehingga dapat menyebabkan keracunan makanan (Constantin et al, 2008). Shigella sonnei merupakan bakteri Gram negatif penyebab utama penyakit diare dan Shigellosis (Ranjbar et al., 2008). Alcoba-florez et al. (2005) mengungkapkan bahwa 69% dari semua infeksi dan 61% kematian yang terkait Shigella sp. terjadi pada anak usia < 5 tahun. Ekstrak metanol, ekstrak air, dan ekstrak kloroform daun pacar kuku dapat menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan Pseudomonas aeruginosa (Saadabi, 2007). Ekstrak air dan ekstrak alkohol daun pacar kuku terbukti memiliki aktivitas antibakteri dengan KHM (Kadar Hambat Minimum) 8–64 mg/mL terhadap Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococus faecalis and Pseudomonus aeruginosa (Al-kurashy et al., 2011). Daun pacar kuku mengandung pewarna utama lawson (2-hidroksi, 1,4 naftokuinon) dengan konsentrasi 1,0–1,4% (Jiny et al., 2010), flavonoid, kumarin, dan steroid (Rajwar & Khatri, 2011). Skrining fitokimia yang dilakukan Raja et al. (2013) terhadap ekstrak daun pacar kuku menemukan kandungan senyawa glikosida, fitosterol, steroid, tannin, dan flavonoid. Berdasarkan penelitian tersebut dilakukan pengujian ekstrak etanol daun pacar kuku terhadap bakteri Bacillus subtilis dan Shigella sonnei, serta uji bioautografi untuk mengetahui golongan senyawa aktif yang bertanggung jawab sebagai antibakteri. 2
METODE PENELITIAN 1.
Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat gelas (Pyrex), alat timbang
(Ohaus), blender (Miyako), vacuum rotary evaporator (Heidolph), lampu spiritus/bunsen, mikropipet (Socorex), autoklaf (My Life), shaker incubator (New Brunswick), oven (Memmert), Laminar Air Flow (Astari Niagara), inkubator (Memmert), lampu UV 256 nm dan 366 nm, mikroskop (Olympus), bejana kromatografi dan tutup bejana (Pyrex). 2.
Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri Bacillus subtilis dan
Shigella sonnei yang diperoleh dari Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta; daun pacar kuku yang diperoleh dari Desa Tinapan, Kecamatan Todanan, Kabupaten Blora, Jawa Tengah; disk kloramfenikol; etanol 70%; akuades; media Mueller Hinton (MH) (Oxoid), Brain Heart Infussion (BHI) (Oxoid), Kligler Iron Agar (KIA) (Oxoid), Lysine Iron Agar (LIA) (Oxoid), Motility Indole Ornithine (MIO) (BD), Simmon’s sitrat (Oxoid); cat Gram A, cat Gram B, cat Gram C, cat Gram D; DMSO (dimetilsulfooxide) 100%; blue tips, yellow tips; silika gel GF254, pereaksi deteksi KLT (sitroborat, FeCl3, KOH 10% dalam etanol, dan Liebermann-Burchard). 3.
Jalannya Penelitian
a.
Determinasi Tanaman Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Biologi, Fakultas Keguruan dan
Ilmu Pendidikan Biologi, Universitas Muhammadiyah Surakarta dengan mempelajari morfologi tumbuhan pacar kuku kemudian dibandingkan dengan tumbuhan yang sudah dikenal identitasnya menggunakan kunci determinasi atau mencocokkannya dengan buku acuan. b. Ekstraksi Serbuk daun pacar kuku ditimbang sebanyak 500 gram, kemudian dimaserasi dengan direndam dalam etanol 70% sebanyak 3750 mL selama 5 hari dan diaduk secara berkala. Hasil rendaman disaring dengan corong Buchner dan kertas saring, kemudian ampasnya diremaserasi selama 5 hari. Hasil maserasi diuapkan dengan evaporator rotary pada suhu 50°C. Ekstrak kental daun pacar kuku dihasilkan dari penguapkan di atas penangas air pada suhu ≤ 60°C. Hasil ekstraksi ditempatkan dalam wadah tertutup dan disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 4°C. 3
c.
Identifikasi Bakteri uji Identifikasi bakteri dilakukan dengan cara pengecatan Gram (Gram A, B, C, dan D)
dan uji biokimiawi. Bakteri Bacillus subtilis diidentifikasi dengan media KIA, LIA, Simmon’s sitrat, dan uji katalase. Bakteri Shigella sonnei diidentifikasi dengan media KIA, LIA, dan MIO. d. Pembuatan Stok dan Seri Konsentrasi Stok 40% dibuat dengan menimbang 400 mg ekstrak kental daun pacar kuku kemudian ditambah pelarut DMSO 100% sampai 1 mL. Dari larutan stok dibuat seri konsentrasi 20%, 10%, dan 5% menggunakan metode pengenceran. e.
Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Difusi Kirby-Bauer Bakteri diambil 200 µL dari suspensi bakteri 1,5 x 108 CFU/mL, diratakan pada media
MH dengan spreader glass steril, kemudian dibiarkan selama 10 menit. Larutan stok ekstrak etanol daun pacar kuku konsentrasi 40%, 20%, 10%, dan 10% diambil sebanyak 10µL, kemudian dimasukkan pada disk steril ukuran 6 mm sehingga setiap disk mengandung ekstrak sebesar 4000, 2000, 1000, dan 500 µg. Disk kloramfenikol (kontrol positif), disk ekstrak etanol daun pacar kuku, dan disk DMSO (kontrol negatif) diletakkan pada media sambil ditekan perlahan dan diberi jarak antara satu disk dengan disk yang lain. Kultur diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37°C, setelah itu diameter zona hambat yang terbentuk diukur. f.
Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Fase diam silika gel GF254 terlebih dahulu dipanaskan pada suhu 105ºC–110ºC selama
1 jam. Ekstrak etanol daun pacar kuku konsentrasi 20% ditotolkan sebanyak ±7 µL pada fase diam, kemudian dielusi dengan fase gerak kloroform : etanol (9 : 1). Plat KLT yang sudah dielusi dideteksi pada sinar UV 254 nm dan UV 366 nm. Bercak diidentifikasi dengan pereaksi semprot KOH 10% dalam etanol (Naftokuinon dan kumarin), FeCl3 (fenol),
pereaksi
semprot
sitroborat
(flavonoid),
Liebermann-Buchard
(triterpenoid/steroid). g.
Uji Bioautografi Lempeng plat KLT yang sudah dielusi diangin-anginkan, kemudian diletakkan dan
ditekan perlahan pada media MH yang telah diinokulasi bakteri dan dibiarkan selama 20 menit, kemudian plat KLT diangkat. Media diinkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam dan diamati zona jernih yang muncul serta dihitung Rf yang dimiliki zona jernih tersebut.
4
HASIL DAN PEMBAHASAN 1.
Determinasi Tanaman Determinasi tanaman dilakukan untuk menetapkan kebenaran tanaman yang
digunakan dalam penelitian. Hal ini dilakukan untuk menghindari kesalahan terhadap tanaman yang digunakan. Hasil determinasi berdasarkan literatur yang digunakan menunjukkan bahwa tanaman yang diidentifikasi adalah benar tanaman Lawsonia inermis Linn (Pacar kuku). 2.
Ekstraksi Ekstraksi daun pacar kuku dilakukan dengan metode maserasi. Metode maserasi
digunakan karena menggunakan peralatan yang sederhana sehingga dapat diterapkan di semua laboratorium, pengerjaan yang mudah, dan tidak merusak senyawa yang tidak tahan terhadap pemanasan. Pelarut etanol 70% dapat menarik senyawa-senyawa polar yang terkandung dalam daun pacar kuku seperti alkaloid, kuinon, terpenoid sampai senyawa nonpolar seperti beberapa golongan flavonoid, dan triterpen (Harborne, 1996; Hidayatulla et al., 2011). Hasil ekstraksi dari 500 gram daun pacar kuku dengan 3750 mL penyari etanol 70% menghasilkan rendemen sebanyak 22,53%. Rendemen yang dihasilkan adalah ekstrak kental berwarna coklat kemerahan. 3.
Identifikasi Bakteri Hasil pengecatan yang diamati dengan mikroskop perbesaran 1000 x menunjukkan
bahwa Bacillus subtilis adalah bakteri berbentuk batang, berwarna ungu, dan berpasangan atau tunggal. Sedangkan Shigella sonnei adalah bakteri berbentuk batang pendek, bergerombol dan susunannya tidak beraturan (Tabel 1). Hasil pengecatan Gram terhadap Bacillus subtilis dan Shigella sonnei menunjukkan sesuai teori bahwa Bacillus subtilis adalah bakteri Gram positif, berbentuk batang, dan memiliki susunan berpasangan atau tunggal. Sedangkan Shigella sonnei adalah bakteri Gram negatif, berbentuk batang, dan memiliki susunan yang bergerombol atau tidak beraturan (Dwipayana & Ariesyadi, 2009; Jawetz et al., 2005; Radji, 2011). Uji biokimia terhadap Bacillus subtilis menggunakan media KIA, MIO, Simmon’s sitrat, dan uji katalase. Sedangkan Shigella sonnei diuji menggunakan media KIA, LIA, dan MIO. Berdasarkan hasil uji biokimia terhadap bakteri Bacillus subtilis pada media KIA memperlihatkan bagian miring berwarna merah dan bagian tegak berwarna kuning yang menunjukkan Bacillus subtilis dapat memfermentasi glukosa tetapi tidak
5
memfermentasi laktosa, tidak memproduksi gas dan H2S dengan ditunjukkan tidak terbentuknya gelembung udara dan warna hitam pada media. Tabel 1. Hasil Pengecatan Gram terhadap bakteri Shigella sonnei dan Bacillus subtilis Bakteri
Pengamatan
Pustaka
Keterangan
(Dwipayana & Ariesyadi, 2009; Jawetz et al., 2005; Radji, 2011). Bentuk
Warna
Bentuk
Warna
Bacillus subtilis
Batang, berpasangan/tunggal
Ungu
Batang, berpasangan/tunggal
Ungu
Gram positif
Shigella Sonnei
Batang, tidak beraturan
Merah
Batang, bergerombol atau tidak beraturan
Merah
Gram negatif
Hasil identifikasi menggunakan media Simmon’s sitrat menunjukkan bagian miring berwarna biru yang menunjukkan Bacillus subtilis dapat menghidrolisis sitrat. Hasil identifikasi menggunakan media MIO menunjukkan bahwa Bacillus subtilis termasuk bakteri yang dapat bergerak dengan ditunjukkan adanya kekeruhan dan tidak adanya bekas tusukan pada media. Selain itu Bacillus subtilis dapat mendekarboksilasi ornitin yang ditunjukkan dengan warna media yang tetap berwarna ungu tetapi tidak memproduksi indol dengan tidak terbentuknya cincin berwarna merah ketika ditetesi dengan pereaksi Kovac. Pada uji katalase terbentuk gelembung udara setelah ditetesi larutan hidrogen peroksida pada kultur Bacillus subtilis. Hal ini menunjukkan bahwa Bacillus subtilis dapat mendetoksifikasi hidrogen peroksida. Berdasarkan hasil uji biokimia terhadap bakteri Shigella sonnei pada media KIA menunjukkan bagian miring berwarna merah dan bagian tegak berwarna kuning. Hal ini menunjukkan bahwa Shigella sonnei dapat memfermentasi glukosa tetapi tidak dapat memfermentasi laktosa. Sedangkan tidak terbentuknya gelembung udara, dan warna hitam pada media menunjukkan bahwa Shigella sonnei tidak memproduksi gas dan H2S. Identifikasi menggunakan media LIA menunjukkan bagian miring berwarna ungu, bagian tegak barwarna kuning, tidak terbentuk gelembung udara, dan warna hitam pada dasar media. Hal ini menunjukkan bahwa Shigella sonnei kurang mendekarboksilasi lisin, tidak memproduksi gas dan H2S. Sedangkan identifikasi menggunakan media MIO menunjukkan pertumbuhan bakteri hanya di sepanjang tusukan ketika diinokulasi, adanya perubahan warna pada media dari ungu menjadi kuning-ungu memudar, dan tidak terbentuk cincin berwarna merah setelah ditetesi pereaksi Kovac. Hal ini menunjukkan bahwa Shigella sonnei termasuk bakteri yang non motil atau tidak dapat bergerak, dapat 6
mendekarboksilasi ornitin, dan tidak memproduksi indol. Hasil uji biokimia menunjukkan bahwa bakteri yang diidentifikasi adalah benar Bacillus subtilis dan Shigella sonnei (DIFCO & BBL, 2013; Hart & Shears, 1997; Koplan et al., 1999). 4.
Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Pacar Kuku Uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun pacar kuku terhadap bakteri Bacillus
subtilis dan Shigella sonnei dengan menggunakan metode difusi Kirby-Bauer. Parameter yang diamati adalah diameter zona hambat rata-rata yang terbentuk disekitar disk, kemudian ditentukan zona radikal dan zona irradikal. Seri konsentrasi ekstrak etanol daun pacar kuku diresapkan ke dalam disk berukuran 6 mm sebanyak 10 µL, sehingga masingmasing disk mengandung ekstrak berturut-turut sebesar 4000, 2000, 1000, dan 500 µg. Kloramfenikol dipilih sebagai kontrol positif dan DMSO (Dimethyl sulfoxide) 100% dipilih sebagai kontrol negatif. Tabel 2. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Pacar Kuku terhadap Bakteri Bacillus subtilis dan Shigella sonnei Bahan uji dan Diameter Zona Hambat (mm) Bakteri
Ekstrak etanol daun pacar kuku 500µg/disk
Ekstrak etanol daun pacar kuku 1000µg/disk
Ekstrak etanol daun pacar kuku 2000µg/disk
Ekstrak etanol daun pacar kuku 4000µg/disk
DMSO 100 %
Kloramfenikol 30 µg
Bacillus subtilis
6,0±0
6,0±0
7,8±0,3
9,3±0,3
6,0±0
20±0
Shigella sonnei
6,0±0
6,0±0
8±0
10,8±0,3
6,0±0
15±0
Keterangan : diameter zona hambat sudah termasuk diameter disk (6 mm)
Hasil pengujian menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun pacar kuku memiliki aktivitas antibakteri terhadap Bacillus subtilis dan Shigella sonnei. Hal ini dibuktikan adanya zona hambat pada pengujian terhadap Bacillus subtilis dan Shigella sonnei. Penghambatan
terbesar
ditunjukkan
terhadap Shigella sonnei
pada konsentrasi
4000µg/disk dengan diameter zona hambat rata-rata 10,8±0,3 mm. Pada konsentrasi yang sama yaitu 4000µg/disk diameter zona hambat terhadap Bacillus subtilis hanya 9,3±0,3 mm. Penghambatan terkecil ditunjukkan pada konsentrasi 2000µg/disk terhadap Bacillus subtilis dengan diameter rata-rata 7,8±0,3 mm. Uji pada konsentrasi yang sama yaitu 2000µg/disk terhadap Shigella sonnei menunjukkan diameter zona hambat 8±0 mm. Pada konsentrasi yang lebih kecil yaitu 1000µg/disk dan 500µg/disk tidak menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap Bacillus subtilis dan Shigella sonnei (Tabel 2). Menurut Das & Mondal (2012) ekstrak etanol daun pacar kuku bersifat bakterisida (membunuh bakteri) terhadap bakteri yang diujikan. Hal ini sejalan dengan hasil uji antibakteri terhadap 7
Bacillus subtilis dan Shigella sonnei yang menunjukkan adanya zona radikal yaitu zona jernih disekitar disk yang tidak ditemukan pertumbuhan bakteri. Ekstrak etanol daun pacar kuku memiliki aktivitas yang lebih besar terhadap Shigella sonnei jika dibandingkan dengan Bacillus subtilis. Hal ini disebabkan perbedaan komponen dan susunan dinding sel bakteri Gram positif (Bacillus subtilis) dan Gram negatif (Shigella sonnei). Dinding sel bakteri Gram positif memiliki struktur peptidoglikan berlapis tunggal dan mempunyai kandungan lipid yang rendah yaitu berkisar 1–4% (Pelczar & Chan, 1988). Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang bersifat lebih polar sehingga akan sulit ditembus oleh senyawa antibakteri yang bersifat non polar. Sedangkan dinding sel bakteri Gram negatif memiliki susunan dinding sel yang lebih komplek yang memiliki kandungan lipid yang lebih tinggi yaitu 11–22% dan akan lebih bersifat non polar sehingga akan lebih mudah ditembus oleh senyawa antibakteri yang bersifat non polar (Hidayathulla et al., 2001; Jawetz et al., 2001; Pelczar & Chan, 1988). Selain itu Bacillus subtilis dapat memproduksi kapsul asam D-glutamat yang mengelilingi sel dan melindungi bakteri dari pengaruh lingkungan yang membahayakan, seperti antibakteri. Sehingga Bacillus subtilis lebih tahan terhadap senyawa antibakteri (Pratiwi, 2008). Ekstrak metanol daun pacar kuku memiliki aktivitas antibakteri terhadap Bacillus subtilis dan Pseudomonas aeruginosa dengan masing-masing diameter zona hambat 14 mm dan 16 mm konsentrasi 10mg/sumuran (Saadabi, 2007). Hasil penelitian tersebut sama dengan hasil uji antibakteri ekstrak etanol 70% daun pacar kuku terhadap Bacillus subtilis dan Shigella sonnei jika dilihat dari kemampuan antibakteri yang lebih besar terhadap bakteri Gram negatif daripada bakteri Gram positif. Perbedaan besarnya diameter zona hambat uji aktivitas antibakteri dari masing-masing ekstrak daun pacar kuku salah satunya disebabkan cairan penyari yang digunakan untuk ekstraksi daun pacar kuku berbeda. Cairan penyari mempengaruhi banyak atau sedikitnya kandungan senyawa dalam ekstrak daun pacar kuku yang memiliki aktivitas antibakteri (Kawo & Kwa, 2011). Selain itu faktor yang mempengaruhi ukuran daya hambat pada metode difusi cakram adalah kepekaan inokulum, waktu inkubasi, ketebalan media agar, pengaturan jarak cakram, dan komposisi media (WHO, 2003 cit Darsana, 2012). Pada percobaan yang dilakukan Saadabi (2007) media yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri adalah nutrient broth, sedangkan pada uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol 70% daun pacar kuku menggunakan media Mueller Hinton. 8
5.
Analisis Kromatografi Lapis Tipis Analisis kromatografi lapis tipis dilakukan untuk mengetahui kandungan senyawa
ekstrak etanol 70% daun pacar kuku. Fase gerak yang digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak adalah kloroform : etanol (9 : 1) v/v dan fase diam yang digunakan adalah silika GF254. Ekstrak daun pacar kuku yang ditotolkan pada plat silika menggunakan konsentrasi 40% dan penotolan dilakukan menggunakan pipa kapiler. Tabel 3. Hasil KLT ekstrak etanol 70% daun pacar kuku dengan fase gerak kloroform:etanol (9:1) v/v dengan jarak pengembangan 5 cm Rf
Bercak Sebelum Di semprot Sinar UV (nm)
Deteksi Pereaksi Semprot KOH 10% dalam etanolik Vis UV 366nm − −
254
366
0,22
−
−
0,34
−
−
−
0,48
Pem
−
0,54
Pem
F.Hi-Bi
FeCl3
Sitroborat
LB
Vis
UV 366nm
UV 366nm
−
−
F.Kuning
−
−
−
F.Kuning
Kuning
Pem
Hitam
F.Ku-Hi
F.Hijau
Merah
F.Biru
−
F.Biru
F.Merah
Golongan senyawa
0,64
Pem
−
−
−
−
−
F.Hijau
Sterol jenuh/triterpen jenuh Sterol jenuh/ triterpen jenuh Naftokinon, Fenol, Flavonoid, Steroid Antrakinon, Triterpenoid, Kumarin Steroid
0,68
Pem
F.Hi-Bu
−
−
−
F.Kuning
F.Biru
Flavonoid, Steroid
F.Coklat
Kumarin
0,74
Pem
F.Hi-Bi
−
F.Biru
−
−
0,82
Pem
F.Hi-Ku
−
−
−
F.Biru
−
−
0,88
Pem
−
−
−
F.Biru
−
−
0,96
−
Merah muda F.Hi-Ku
−
−
−
F.Biru
−
−
Keterangan
Pem : Pemadaman LB : Lieberman-Burchard F: Fluoresensi Vis: Visual
Hi-Bi: Hijau kebiruan Hi-Ku: Hijau Kekuningan Ku-Cok: Kuning kecoklatan Ku-Hi: Kuning kehijauan
Senyawa naftokuinon dan senyawa kumarin dideteksi dengan pereaksi semprot KOH 10% dalam etanol. Pengamatan secara visual yang menunjukkan warna kuning, orange, dan coklat-violet adalah senyawa derivat naftokuinon (Kotakemori & Okada, 1966). Sedangkan pengamatan secara visual berwarna merah adalah antrakinon. Pengamatan pada UV366nm berfluoresensi biru adalah senyawa kumarin (Wagner & Bladt, 1996). Senyawa fenol dideteksi dengan pereaksi semprot FeCl3 dan secara visual menunjukkan warna hijau, merah, ungu, biru, atau hitam yang kuat (Harborne, 1996). Senyawa flavonoid dideteksi pereaksi semprot sitroborat. Pengamatan dilakukan setelah plat yang sudah disemprot dipanaskan selama 5-10menit pada suhu 100°C berfluoresensi hijau-kuning pada UV366 (Alam et al., 2012). Pereaksi Liebermann-Buchard digunakan untuk mengidentifikasi 9
senyawa triterpenoid, steroid, dan sterol jenuh/triterpen jenuh. Pengamatan dilakukan setelah plat KLT yang sudah disemprot dipanaskan selama 5–10 menit pada suhu 100°C. Pengamatan dilakukan pada UV366 senyawa triterpenoid akan berfluoresensi merah, pink, atau ungu. Senyawa steroid akan berfluoresensi biru atau biru-hijau. Sedangkan senyawa sterol jenuh/ triterpen jenuh akan berfluoresensi kuning pucat (Farnsworth, 1966). Berdasarkan uji KLT dan identifikasi dengan beberapa pereaksi semprot dapat diketahui bahwa ekstrak etanol 70% daun pacar kuku mengandung senyawa antrakinon, naftokinon, fenol, flavonoid, kumarin, triterpenoid, steroid, dan sterol jenuh/ triterpen jenuh. 6.
Uji Bioautografi Metode bioautografi yang digunakan dalam penelitian ini adalah bioautografi kontak
yaitu dengan cara meletakkan plat KLT yang sudah dielusi fase gerak pada media yang sudah diinokulasi dengan bakteri uji. Senyawa yang mempunyai aktivitas antibakteri ditandai dengan zona jernih yang tidak ditumbuhi bakteri. Berdasarkan hasil bioautografi terhadap bakteri Bacillus subtilis terlihat zona jernih pada Rf 0,48; 0,54; 0,64; dan 0,96. Sedangkan pada bakteri Shigella sonnei terlihat zona jernih pada Rf 0,54; 0,64; 0,74; dan 0,96. Menurut hasil identifikasi senyawa menggunakan pereaksi semprot Rf 0,48 mengandung senyawa naftokinon, fenol, flavonoid, steroid. Pada Rf 0,54 teridentifikasi adanya senyawa antrakinon, triterpenoid, kumarin. Kemudian pada Rf 0,64 teridentifikasi senyawa steroid, pada Rf 0,74 teridentifikasi adanya senyawa kumarin. Senyawa pada Rf 0,96 yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap Bacillus subtilis dan Shigella sonnei adalah senyawa yang memiliki gugus karbonil, fenolik, atau gugus lain yang setidaknya memiliki 2 ikatan rangkap terkonjugasi dan memiliki gugus kromofor yang terikat oleh ausokrom (-OH, -O, -NH2, -OCH3) (Gandjar & Rohman, 2012; Wagner et al., 1984 cit Iriani et al., 2011) tetapi belum teridentifikasi pada analisis KLT dengan pereaksi semprot yang digunakan. Mekanisme antibakteri senyawa fenol dan kumarin adalah masuk kedalam sel bakteri dengan cara memutuskan ikatan peptidoglikan pada dinding sel dan merusak ikatan hidrofobik dari membran sel. Sehingga terjadi perubahan permeabilitas dinding sel yang akan menghambat pertumbuhan sel atau matinya sel (Pelczar & Chan, 1988; Pepeljnjak et al., 2005 cit Suliantari dkk, 2008). Senyawa naftokinon dan antrakinon termasuk senyawa fenolik sehingga mekanisme sebagai antibakteri mirip dengan mekanisme senyawa fenolik yaitu mendenaturasi protein (Fitri, 2005 cit Kaneswari et al., 2013). Senyawa steroid 10
memiliki aktivitas antibakteri dengan mengikat membran lipid bakteri sehingga menyebabkan kebocoran pada liposom (penyusun dinding sel bakteri) (Shihabudeen, 2010). Mekanisme antibakteri senyawa flavonoid adalah dapat berinteraksi dengan struktur protein di dalam dinding sitoplasma bakteri yang menyebabkan rusaknya permeabilitas dinding sel bakteri. Selain itu gugus hidroksi yang terdapat pada flavonoid menyebabkan perubahan komponen organik dan transport nutrisi yang berefek toksik pada bakteri (Sabir, 2005). Senyawa triterpenoid memiliki aktivitas antibakteri dengan merusak membran sel bakteri karena senyawa triterpenoid bersifat lipofilik. Sehingga dapat melisiskan membran sel dan koagulasi sitoplasma dari sel bakteri (Cowan, 1999). Berdasarkan uji bioautografi senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri dalam ekstrak etanol 70% daun pacar kuku terhadap Bacillus subtilis dan Shigella sonnei adalah antrakinon, naftokinon, flavonoid, triterpenoid, steroid, dan kumarin.
KESIMPULAN DAN SARAN a.
Kesimpulan Ekstrak etanol 70 % daun pacar kuku memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri
Bcillus subtilis dan Shigella sonnei pada konsentrasi 2000 µg/disk dan 4000 µg/disk. Senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri pada ekstrak etanol 70% daun pacar kuku adalah senyawa antrakinon, naftokinon, fenol, kumarin, triterpenoid, steroid, sterol jenuh/triterpen jenuh, dan flavonoid. b. Saran Perlu dilakukan fraksinasi dan isolasi dari senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun pacar kuku dan dilakukan optimasi fase gerak yang lebih maksimal terhadap ekstrak etanol daun pacar kuku. Selain itu perlu dilakukan identifikasi senyawa yang terkandung dalam ekstrak etanol 70% daun pacar kuku dengan pereaksi semprot yang lebih banyak untuk mengetahui senyawa-senyawa yang belum teridentifikasi. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan metode dilusi untuk mencari KHM (Kadar Hambat Minimum) dan KBM (Kadar Bunuh Minimum) dari ekstrak daun pacar kuku. DAFTAR PUSTAKA Alam, G., Mufidah, Massi, N., Kurnia, R.T.F., Rahim, A. & Usmar, 2012, Skrining Komponen Kimia dan Uji Aktivitas Mukolitik Ekstrak Rimpang Bangle (Zingiber purpureum Roxb.) Terhadap Mukosa Usus Sapi secara In vitro, Majalah Farmasi dan Farmakologi, 16 (3), 123-126.
11
Alcoba-Flozen, J., Perez-Roth, E., Gonzalez-Linares, S. & Mendez-Alvarez, M., 2005, Outbreak of Shigella sonnei in Rural Hotel in Lagomera, Canary Insland, Spain, International Microbiology, 8, 133-136. Al-Kurashy, H.M.K., Al-windy, S.A. & Al-buhadilly, A.K., 2011, Evaluation the Antibacterial Activity of Lawsonia inermis: In vitro Study, Iraqi Journal of Science, 52 (1), 16-19. Al-Rubiay, K.K., Jaber, N.N., Al-Mhaawe B.H. & Alrubaiy, L.K., 2008, Antimicrobial Efficacy of Henna Extracts, Oman Medical Journal, 23 (4), 253-256. Apetroaie-Constantin, C., Mikkola, R., Andersson, M.A., Teplova, V., Suominen, I. & Johansson, T., et al, 2009, Bacillus subtilis and B. mojavensis strains Connected to Food Poisoning Produce The Heat Stable Toxin Amylosin, Journal of Applied Microbiology, 1976-1985. Borade, A.S., Kale, B.N. & Shete, R.V., 2011, A Phytopharmacological Review on Lawsonia inermis (Linn.), International Journal of Pharmacy & Life Sciences, 2, 536-541. Cowan, M. M., 1999, Plants products as antimicrobial agents, Clinical Microbiology Reviews, 12 (4), 564-582. Darsana, I.G.O., 2012, Potensi Daun Binahong (Anredera Cordifolia (Tenore) Steenis) dalam Menghambat Pertumbuhan Bakteri Escherichia Coli secara In Vitro, Indonesia Medicus Veterinus, 1 (3), 337 – 351. Das, P.K. & Mondal, A.K., 2012, Studies on Traditional ‘Mehendi’ used as Herbal Colour with Special References to its Antimicrobial Activity and Pigment Profile by TLC, International Journal of Science and Nature, 3 (4), 799-804. DIFCO & BBL, 2013, Motility Indole Ornithine Medium, (www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/Difco_BBL/27350.pdf diakses tanggal 20 desember 2013). Dwipayana & Ariesyadi, H.W., 2009, Identifikasi Keberagaman Bakteri pada Lumpur Hasil Pengolahan Limbah Cat dengan Tehnik Konvensional, Bandung, ITB. Farnsworth, N.R., 1966, Biological and Phytochemical Screening of Plants, Journal of Pharmaceutical Sciences, 55 (3), 225-269. Gandjar, I.G. & Rohman, A., 2012, Analisis Obat secara Spektroskopi dan Kromatografi, 70-72, Yogyakarta, Pustaka Pelajar. Harborne, J. B., 1987, Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Bandung, Penerbit ITB. Hart, T. & Shears, P., 1997, Mokrobiologi Kedokteran, diterjemahkan oleh Pratama, F.E., & Kumala, P., EGC, Jakarta. 12
Hidayathulla, S., Chandra, K. & Candrashekar, K.R., 2001, Phytochemical Evaluation and Antibacterial Activity of Pteropermum difersifolium Blume, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3 (2), 165-167. Jawetz, E., Melnick, J.L. & Adelberg, E. A., 2001, Mikrobiologi Kedokteran, edisi XXII, diterjemahkan oleh Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga, Jakarta, Penerbit Salemba Medika. Jawetz, E., Melnick, J.L. & Adelberg, E.A., 2005, Mikrobiologi Kedoteran, diterjemahkan oleh Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga, 233-235 & 363-364, Jakarta, Salemba Medika. Jiny, V.K., Shilvipriya, K.S., Resmi S. & Jolly, C.I., 2010, Lawsonia Inermis (Henna): A Natural Dye of Various Therapeutic Uses, 1 (1). Kaneswari, M.S., Mahatmi, H. & Besung, I.N.K., 2013, Perasan Daun Mengkudu (Morinda citrifolia) Menghambat Pertumbuhan Bakteri Escherichia coli secara In Vitro, Indonesia Medicus Veterinus, 2(2), 216 – 224. Kawo, A.H. & Kwa, A.M., 2011, Phytochemical Screening and Antibacterial Activity of The Aqueous Extracts and Fractions of Ethanolic Extracts of Lawsonia inermis leaf, International Research Journal of Microbiology, 2 (12), 510-516. Koplan, J.P., Hughes, J.M., Cohen, M.L. & Samba, E.M., 1999, Laboratory Methods for the Diagnosis of Epidemic Dysentery and Cholera, Centers for Disease Control and Prevention Atlanta, Georgia. Kotakemori, M. & Okada, K., 1966, Thin-Layer Chromatography of Same Substituted Naphthoquinones, Agr. Biol. Chem., 30 (9), 935-936. Pelczar, M.J. & Chan, E.C.S., 1988, Dasar-Dasar Mikrobiologi, Jakarta, Penerbit Universitas Indonesia. Pratiwi, S.T., 2008, Mikrobiologi Farmasi, Jakarta, Airlangga. Radji, M., 2011, Buku Ajar Mikrobiologi Panduan Mahasiswa Farmasi dan Kedokteran, 95 & 96, Jakarta, EGC. Rahmoun, N.M., Boucherit-Atmani, Z., Benabdallah, M., Boucherit, K., Villemin, D. & Choukchou, B.N., 2013, Antimicrobial Activities of the Henna Extract and Some Synthetic Naphthoquinones Derivatives, American Journal of Medical and Biological Research, 1 (1), 16-22. Raja, W., Ovais, M. & Dubey, A., 2013, Phytochemical Screening and Antibacterial Activity of Lawsonia inermis Leaf Extract, International Journal of Microbiological Research, 4 (1), 33-36. Rajwar, S. & Kantri, P., 2011, Pharmacognostic & Phitochemical Studies on Various Plant Parts of Lawsonia inermis (Henna), Asian Journal of Pharmaceutical Sciences and Clinical Research, 1(3), 22-40. 13
Ranjbar, R., Dallal, M.M.S., Talebi, M. & Pourshafie, M.R., 2008, Increased Isolation and Characterization of Shigella sonnei Obtained from Hospitalized Children in Tehran, Iran, Journal Health Popular Nutrition, 26 (4), 426-430. Saadabi, M.A.A., 2007, Evaluation of Lawsonia inermis Linn. (Sudanese Henna) Leaf Extracts as an Antimicrobial Agent, Reseacrh Journal of Biological Sciences, 2 (4), 419-423. Sabir, A., 2005, Aktivitas Antibakteri Flavonoid Propolis Trigona sp Terhadap Bakteri Streptococcus mutans (in vitro), Majalah Kedokteran Gigi, 38(3), 135-141. Shihabudeen, H.M.S. & Priscilla, D.H., 2010, Antimicrobial Activity and Phytochemical Analysis of Selected Indian Folk Medicinal Plants, International Journal of Pharma Sciences and Researc, 1 (10), 430-434. Suliantari, Jenie, B.S.L., Suhartono, M.T. & Apriantono, A., 2008, Aktivitas Antibakteri Ekstrak Sirh Hijau (Piper bittle L.) Terhadap Bakteri Patogen Pangan, Jurnal Teknologi dan Industri Pangan, 19 (1), 1-7. Wagner, H. & Bladt, S., 1996, Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas, second edition, 197 & 275, New York, Springer.
14
