AdnaTest ProstateCancerSelect

Verze 160331 CS

AdnaTest ProstateCancerSelect Obohacení nádorových buněk z krve pacientů s rakovinou prostaty pro analýzu genové exprese

Pro diagnostiku in vitro

Příručka

T-1-520

Obsah Informace pro objednávky ........................................................ 3 Účel .......................................................................................... 3 Zkratky a symboly .................................................................... 4 Patenty a registrované obchodní známky ................................ 4 Popis výrobku ........................................................................... 5 Obsah soupravy ....................................................................... 6 Další potřebný materiál ............................................................ 7 Skladování ............................................................................... 8 Informace o použití................................................................... 8 Varování a bezpečnostní opatření pro diagnostiku in vitro ....10 Protokol ..................................................................................11 A. Příprava kuliček ProstateSelect .....................................11 B. Výběr nádorových buněk ...............................................12 Charakteristiky funkčních vlastností.......................................14 Stručná příručka .....................................................................14

2

AdnaTest ProstateCancerSelect Verze 160331 CS

Informace pro objednávky Informace

o

objednávání

naleznete

na

www.qiagen.com

a

www.adnagen.com. Na jakékoli otázky o AdnaTest Vám navíc odpoví tým podpory QIAGEN Hannover ([email protected]).

Účel Test AdnaTest ProstateCancerSelect byl vyvinut pro obohacení cirkulujících nádorových buněk z periferní krve pacientů s rakovinou prostaty a je určen pro diagnostiku in vitro. Pro další analýzu genové exprese související s rakovinou prostaty se doporučuje test AdnaTest ProstateCancerDetect.


3

Zkratky a symboly AdnaMag-L

koncentrátor magnetických částic (-velký)

AdnaMag-S

koncentrátor magnetických částic (-malý)

bp

páry bází

cDNA

komplementární deoxyribonukleová kyselina

DNA

deoxyribonukleová kyselina

mRNA

mediátorová ribonukleová kyselina

PCR

polymerázová řetězová reakce

RNase

ribonukleáza

ot./min

otáčky za minutu

RT

reverzní transkripce datum použitelnosti omezení teploty katalogové číslo viz návod k použití výrobce diagnostický zdravotnický prostředek in vitro

Patenty a registrované obchodní známky Dynabeads®

je

registrovaná

obchodní

známka

Invitrogen a Life Technologies Corporation.

4


společností

Popis výrobku Test AdnaTest ProstateCancerSelect umožňuje imunomagnetické obohacování nádorových buněk pomocí epitelových a nádorových antigenů. Protilátky proti epitelovým a nádorovým antigenům jsou konjugovány na magnetické kuličky (Dynabeads®), což umožní označení nádorových buněk v periferní krvi. Označené buňky jsou extrahovány koncentrátorem magnetických částic (AdnaMag-L a AdnaMag-S) a následně lyzovány (obr. 1). Buněčný lyzát prochází další analýzou (doporučujeme pokračovat testem AdnaTest ProstateCancerDetect).

Kuličky ProstateSelect Inkubace

Buněčná lyze

Separace

RNA

AdnaTest ProstateCancerSelect

Purifikace mRNA pomocí magnetických kuliček potažených Oligo(dT)25

RNA

Krvinky Reverzní transkripce

RNA

Nádorové buňky

cDNA

Magnetické kuličky potažené protilátkou nebo Oligo(dT)25

AdnaTest ProstateCancerDetect

Obrázek 1.

Schematický přehled přípravy vzorku


5

Obsah soupravy Test AdnaTest ProstateCancerSelect obsahuje tyto součásti: Tabulka 1. Obsah soupravy Součást ProstateSelect Beads (Kuličky ProstateSelect) Lysis/Binding Buffer (Lytický/vazebný pufr)

6

Symbol

T-1-520 (12 testů)

1

1

2

1


Další potřebný materiál Vybavení: • Rotátor na 15ml a 1,5ml zkumavky • Koncentrátory magnetických částic AdnaMag-L (QIAGEN Hannover GmbH, kat. č. T-1-700) AdnaMag-S (QIAGEN Hannover GmbH, kat. č. T-1-800)

Materiál: • Sterilní 10ml skleněné nebo plastové pipety bez RNázy a pipetor • Sterilní 1,5ml reakční zkumavky bez RNázy (např. Sarstedt, kat. č. 72.690) • 15ml zkumavky (používejte sterilní polypropylenové zkumavky bez RNázy, např. Sarstedt, kat. č. 65.554.502) • Pipety a pipetovací špičky bez RNázy s aerosolovou bariérou vhodné k pipetování objemů 100 µl až 1000 µl • Ochranné rukavice, ochranné brýle

Činidla: • Fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS), pH 7,0–7,3 (např. Fisher, kat. č. VX14190169, D-PBS)


7

Skladování Test AdnaTest ProstateCancerSelect je nutné skladovat při 4–8 °C. Žádná součást se nesmí používat po uplynutí doby použitelnosti.

Informace o použití V případě vnějšího poškození obalu soupravy nebo jednotlivých součástí kontaktujte prosím Technické služby společnosti QIAGEN (kontaktní informace naleznete na www.qiagen.com). Test musí provádět pouze personál vyškolený v technikách molekulární biologie. Příprava vzorku: • Krevní vzorky je nutné odebrat před použitím terapeutických látek. Test AdnaTest nepoužívejte dříve než 7 dní po posledním léčebném zásahu! • Odběr krve: K odběru nejméně 5 ml plné krve používejte výhradně zkumavky na odběr krve AdnaCollect (kat. č. T-1-600, QIAGEN Hannover GmbH) nebo zkumavky na odběr krve s antikoagulantem EDTA (např. S Monovette® Kalium EDTA, Sarstedt; BD Vacutainer® K3EDTA, Becton Dickinson). Heparin a citrát se nesmí používat. • Krev je nutné okamžitě uchovat při 4–8 °C.

8


• Vzorky je nutné zpracovat co nejdříve. Při použití standardních EDTA zkumavek do 4 hodin a při použití zkumavek AdnaCollect do 24 hodin. • Nesmí dojít k hemolýze krve.

Manipulace: • Kuličky ProstateSelect 1 obsahují jako ochrannou látku azid sodný. Azid sodný je cytotoxický a proto je nutné ho odstranit před použitím kuliček. • Všechny součásti a další činidla od jiných dodavatelů je nutné uchovávat podle jejich pokynů. Platí bezpečnostní pokyny příslušných výrobců. • Aby nedošlo ke kontaminaci DNA, RNA a RNázou, používejte ochranné rukavice. • Kuličky ProstateSelect rozdělte na alikvotní podíly, aby nedošlo ke kontaminaci. Test se musí provést v daném pořadí a časy a teploty inkubace musí odpovídat všem specifikacím. • Jestliže při obohacování buněk dojde k aglutinaci kuliček, vzorky zlikvidujte. • Aby nedošlo ke zkřížené kontaminaci, proveďte zpracování vzorků včetně reverzní transkripce a následnou analýzu amplifikovaných PCR produktů v oddělených místnostech, pokud je to možné. • Použití výrobků jiných než doporučených dodavatelů může mít za následek horší výsledky. AdnaTest ProstateCancerSelect Verze 160331 CS

9

Varování a bezpečnostní opatření pro diagnostiku in vitro Při práci s chemikáliemi vždy používejte vhodný laboratorní pracovní oděv, jednorázově použitelné rukavice a ochranné brýle. Bližší informace

jsou

uvedeny

v příslušných

bezpečnostních

listech (SDS). Jsou k dispozici také online v PDF formátu na stránkách www.qiagen.com/safety, kde můžete najít, přečíst a vytisknout bezpečností listy všech souprav a součástí souprav QIAGEN. Vzorky

a

odpad

z analýzy

zlikvidujte

v souladu

bezpečnostními předpisy.

10


s místními

Protokol A. Příprava kuliček ProstateSelect Před použitím je nutné promytím kuliček ProstateSelect odstranit azid sodný: 1.

Důkladným

pipetováním

resuspendujte

kuličky

Prostate-

Select 1; nevortexujte! 2.

Vypočtěte objem kuliček ProstateSelect 1 nutný pro všechny zpracované vzorky (100 µl na vzorek) a přeneste vypočtený objem do 1,5ml reakční zkumavky. Jestliže zpracováváte více než 10 vzorků, použijte další 1,5ml reakční zkumavky.

3.

Vložte zkumavku do AdnaMag-S.

4.

Po 1 minutě odstraňte supernatant pomocí pipety. Při každém postupu je důležité: Při odstraňování supernatantu se nedotýkejte kuliček!

5.

Promývání a. Z AdnaMag-S vyjměte magnetický posuvník. b. Přidejte 1 ml PBS a opakovaným pipetováním resuspendujte kuličky. c. Vložte magnetický posuvník zpět do AdnaMag-S. d. Po 1 minutě zcela odstraňte supernatant pomocí pipety. Opakujte dvakrát (celkem tři promytí).

6.

Vyjměte zkumavku z AdnaMag-S a resuspendujte kuličky v PBS na původní objem (100 µl na vzorek). AdnaTest ProstateCancerSelect Verze 160331 CS

11

B. Výběr nádorových buněk 1.

Napipetujte 5 ml vzorku krve do 15ml zkumavky. (Používejte pouze schválené zkumavky na odběr krve, viz strana 8.)

2.

Pipetováním důkladně resuspendujte kuličky ProstateSelect (připravené v kroku A6) a 100 µl těchto kuliček přidejte do každého vzorku krve.

3.

Pomalu otáčejte zkumavkami (asi 5 ot./min) po dobu 30 minut při teplotě laboratoře na zařízení, které umožňuje jak naklánění, tak otáčení.

4.

Vložte zkumavky do AdnaMag-L bez magnetického posuvníku. Mávnutím AdnaMag-L směrem dolů uvolněte kapky krve zachycené ve víčku.

5.

Vložte magnetický posuvník a inkubujte zkumavky v AdnaMagL po dobu 3 minuty při teplotě laboratoře.

6.

Mezitím

vytemperujte

lytický/vazebný

pufr 2

na

teplotu

laboratoře. Poznámka: Zkontrolujte, zda lytický/vazebný pufr neobsahuje žádné usazeniny. Jestliže pozorujete usazeniny, vytemperujte pufr na teplotu laboratoře a míchejte jej, dokud se usazeniny zcela nerozpustí.

7.

10ml pipetou zcela odstraňte krevní supernatant, aniž byste se dotkli kuliček.

8.

Promývání a. b.

12

Z AdnaMag-L vyjměte magnetický posuvník. Přidejte 5 ml PBS, uzavřete zkumavky a opatrným protřepáním AdnaMag-L 5krát tam a zpět resuspendujte komplexy magnetických kuliček s buňkami.


Mávnutím AdnaMag-L se zkumavkami dvakrát směrem dolů uvolněte kapky zachycené ve víčku. d. Vložte magnetický posuvník do AdnaMag-L a inkubujte 1 minutu při teplotě laboratoře. e. Pipetou zcela odstraňte supernatant. Opakujte dvakrát (celkem tři promytí). c.

9.

Z AdnaMag-L vyjměte magnetický posuvník.

10. Resuspendujte komplexy magnetických kuliček s buňkami v 1 ml PBS a přeneste každý vzorek do 1,5ml reakční zkumavky. 11. Vložte reakční zkumavky do AdnaMag-S s magnetickým posuvníkem. Poznámka: Magnetický posuvník je možné do AdnaMag-S vložit dvěma způsoby. Vždy vkládejte posuvník bílým plastovým filmem směrem dopředu, aby magnety byly blízko reakčních zkumavek.

12. Po 1 minutě pipetou zcela odstraňte supernatant, optimálně proběhla následná buněčná lyze.

aby

13. Z AdnaMag-S vyjměte magnetický posuvník. 14. Do

každé

reakční

zkumavky

přidejte

200 µl

lytického/

vazebného pufru 2 (vytemperovaného na teplotu laboratoře). Nejméně 5krát pipetujte, aby došlo k resuspendaci. 15. Vložte magnetický posuvník do AdnaMag-S a inkubujte 1 minutu. 16. Přeneste supernatanty (buněčné lyzáty) do nových 1,5ml reakčních zkumavek. 17. Zlikvidujte zkumavky s kuličkami.


13

18. Okamžitě pokračujte s izolací mRNA (test AdnaTest ProstateCancerDetect) nebo uchovejte buněčné lyzáty při max. –20 °C nejdéle 2 týdny.

Charakteristiky funkčních vlastností Funkční

vlastnosti

testu

AdnaTest

ProstateCancerSelect

viz

www.qiagen.com/HB-2100-D01.

Stručná příručka AdnaTest ProstateCancerSelect Součásti

ProstateSelect Beads (Kuličky ProstateSelect) Lysis/Binding Buffer (Lytický/vazebný pufr)

Pro každý vzorek potřebujete

1

2

• • • •

5 ml plné krve (podrobnosti viz s. 8) 1× 15ml zkumavka 2× 1,5ml reakční zkumavky 10ml skleněné nebo plastové pipety (bez RNázy) a pipetor • 100–1000µl pipety a špičky (bez RNázy)

Protokol • Důkladně resuspendujte kuličky ProstateSelect 1 a přeneste 100 µl pro každý krevní vzorek do 1,5ml reakční zkumavky. • Promyjte kuličky ProstateSelect pomocí 3× 1 ml PBS.

14


• Resuspendujte kuličky ProstateSelect ve 100 µl PBS pro každý krevní vzorek. • Přeneste 5 ml plné krve do 15ml zkumavky. • Přidejte 100 µl promytých kuliček ProstateSelect do každého vzorku krve. • Inkubujte 30 minut při teplotě laboratoře při naklánění a rotaci při přibližně 5 ot./min. • Vložte zkumavku na 3 minuty do AdnaMag-L a separujte kuličky. Mávnutím AdnaMag-L směrem dolů uvolněte kapky krve zachycené ve víčku. • Odstraňte krevní supernatant. • Promyjte kuličky pomocí 3× 5 ml PBS. • Resuspendujte kuličky v 1 ml PBS a přeneste je do nové 1,5ml reakční zkumavky. • Separujte kuličky v AdnaMag-S a odstraňte supernatant. • Pipetováním alespoň 5krát resuspendujte kuličky ve 200 µl lytického/vazebného pufru 2. • Umístěte reakční zkumavky do AdnaMag-S supernatant do nové reakční zkumavky.

a

přeneste

Okamžitě pokračujte testem AdnaTest ProstateCancerDetect nebo můžete zkumavky uchovat při max. –20 °C nejdéle 2 týdny.


15

HB-2099-CS-001#

QIAGEN GmbH QIAGEN Strasse 1 D-40724 Hilden NĚMECKO Telefonická podpora Telefon:

+49 (0) 511 72 59 50 - 50

Fax:

+49 (0) 511 72 59 50 - 40

E-mail:

[email protected]

Internet:

www.adnagen.com a www.qiagen.com

AdnaTest ProstateCancerSelect

Recommend Documents