!"#$#%&'#()##*+&,-"#(./0-1&233(4#(5678$#."9&
,-"#(./0-11#%&0#))#%&"-*#%&31&0#"&=#)6#4&$-%&& •!>-"#(*#(6%=+&& •!(6338>-"#(5E6$#(6%=+&& •!>-"#(*>-%G"#6"&#%&& •!>-"#(*>-86"#6"9&& '33(&4#&"--*E6"3#H#%6%=&=#)(E6*#%&>#&)#8#64&#%&1-..#%&4-"&$#($38=#%.&"3#9&&
:*&."-&06#(&%6#"&%-;#%.&2<'+&;--(&%-;#%.&4#&=#5-;#%867*#&>-"#()#0##(4#(.9& ,-"&=-&6*&$#("#88#%?& @!&-/0"#(=(3%4&$-%&;3%6"3(6%=&433(&>-"#(./0-11#%+&>--(3;&43#%&>#&>A"B& @!&433(*67*&%--(&#C2D?&*-%.#%+&--%4-/0".1E%"#%&#%&>#%.#%&
F&
J;&0#"&)#8#64&"#&*E%%#%&;-*#%&#%&"#&#$-8E#(#%&6.&#(&*#%%6.&%346=9&J;&4#&7E6."#& 6%H3(;-G#&"#&$#(*(67=#%&"#%&)#03#$#&$-%&4#&*#%%6.3%">6**#86%=&>3(4#%&#(+&;644#8.& ;3%6"3(6%=+&=#=#$#%.&$-%&0#"&>-"#(.K."##;&$#(5-;#849&& ,#&53#*#%&4--()67&."##4.&%--(&##%&43#8;-G=#&6%5#"&$-%&;#G%=#%9&L#%&;34#8&4-"& 4--()67&0#81"&56#&7#&06#(+&4#&;3%6"3(6%=./K/8E.9&
I&
C#&;3%6"3(6%=&)67&>-"#()#0##(4#(.&6.&31&"#&4#8#%&6%&4(6#&033H4=(3#1#%?& >&-4)2'3?$-'$)*-'3$%&'()&*('+?&>-"&6.&4#&"3#."-%4&$-%&0#"&>-"#(.K."##;+&03#& 3%">6**#8"&4#5#&"3#."-%4&56/0&3$#(&4#&7-(#%&0##%B&C6"&6.&%6#"&1#(.#&(#=E86#(#& ;3%6"3(6%=9&J3*&$33(&-4@03/&$(-=#%&3H&3%4#(53#*.$(-=#%&>3(4"&#(&--%& "3#."-%4;3%6"3(6%=&=#4--%9&!"#$%&'($)*+(,$-(.*(/&(012(.'(/.-(,$-&#).34$$5(&'(%$$-( /&6&(788#9.-:;(8<+(,$$#(4&=(.>(%#8-&(58//&#>#9.?&#*(.'(5.@'(,$-&#*A*-&&5:B(
M674#%.&0#"&433(831#%&$-%&4#&;3%6"3(6%=/K/8E.&4#&$38=#%4#&$(-=#%?& @1-*2:&'-.-$%&'()&*('+?&;3%6"3(6%=&"#%&)#03#$#&$-%&0#"&)67."E(#%&$-%&31#(-G3%##8& )#0##(&!,$-(%&=&9#-(&#($)*(.>('9(/&(.')$$-(8?&'(/#$$.:B&
N3$#%--%&4#&/6(*#8+&31&0#"&%6$#-E&$-%&)#8#64?&>-"&>68&0#"&>-"#(./0-1&)#(#6*#%&3H& *E%%#%&)#."E(#%B& O678&%--(&6%H3(;-G#)#03#P#?&,-"&;3#"#%&>#&4--($33(&>#"#%B& N83*7#&6%H3(;-G#)#03#P#?&,#8*#&6%H3(;-G#&0#))#%&>#&4-%&%346=B& O678&%--(&;3%6"3(6%=.."(-"#=6#?&,-"&;3#"#%&>#&4-%&;#"#%&#%&;#"&>#8*#&"#/0%6#*& ;3#"&4-"B&Q4--(&56"&4#&86%*&%--(&#C2DR9&
AB-5)%&'()&*('+?&;3%6"3(6%=&$-%&#T#/"#%&$-%&;--"(#=#8#%&!4&&C(/&(%&'85&'( 5$$-#&%&)(,&)(4&-(&D&3-(/$-(.>(&#(7$'(7&#,$34E&:B9& !3;;6=#&;#G%=#%&--%&4#&"3#."-%4&$-%&0#"&>-"#(.K."##;&567%&>#U#867*&$#(186/0"& QVW,&XYX@>#"R+&-%4#(#&;#G%=#%&Q3%4#(."#E%#%4&--%&0#"&>-"#()#0##(R&0#))#%&>#& ;##(&$(670#64&6%9&&
!"#$%&'()&*('+$,-./$&/$0-122.3-$%&'()&*('+4)-56'(-7-'$,(8'$'&&()$--'$3&-.$&1$,(569$ %22*$2.:83$--'$%(33-.$&%$--'$;*22+$)-$0-2')<&&*3-'=$
S&
Z&
C#&;#G%=#%&46#&%E&=#4--%&>3(4#%+&>3(4#%&5[&=#4--%&4-"&4#&$#(5-;#84#&=#=#$#%.& 31&53$##8&;3=#867*&$(-=#%&-%">33(4&=#$#%9&&
,#&43#%&-88#(8#6&;#G%=#%&--%&>-"#(."-%4#%+&4#)6#"#%&#%&/0#;6#+&;--(&4--(&567%&>#& $-%4--=&%-"EE(867*&%6#"&$33(9&
N#8-%=(67*#&-.1#/"#%&6%&0#"&(#/0"#(4##8&$-%&4#&)#8#64./K/8E.&Q;3%6"3(6%=."(-"#=6#R?& •!*3."#%& •!1#(.3%#8#&6%5#"& •!433(8331G74& •!>#U#867*#.#%&--%&;3%6"3(6%=&
'-%E6"&#/383=6./0#&*>-86"#6"&0#))#%&>#&0#"&3$#(&HK18+&;-HK+&;-H-&#%&$6.9&'-%&4#5#& =(3#1#%&#%&.33("#%&)6%%#%&4#5#&=(3#1#%&*E%%#%&$#(./0688#%4#&=#=#$#%.&>3(4#%& $#(5-;#84+&)$&$#(.1(#646%=+&--%"-88#%+&$#(03E46%=#%&Q=#;##%./0-11#%R+&)63;-..-&#%& $33(&$6.&)$&33*&$6"-86"#6"9&&
\&
D8.&%6#E>#&"#/0%6#*#%&3%5#&$(-=#%&*E%%#%&)#-%">33(4#%&31&##%&;-%6#(&46#& .86;;#(+&.%#88#(+&*3("#(&3H&=3#4*31#(&*E%%#%+&4-%&86="&#(&##%&;336#&*-%.9&C#&"#/0%6#*& 6.&%E&-8&3(*-5)$(',-)022*=$C&&*0--.3-'? LT#/";3%6"3(6%=?&>#(*"&##%&;6=(-G#$33(56#%6%=&$33(&)#1--84#&$6..#%B !1#/6^#*#&3%4#(53#*.$(-=#%&)67$&$33(&XYX@>#"?&*3;"&=(3"#&;344#(*(E61#(& >#8&3H&%6#"&$33(B
&
&
]&
`#"&*-%&567%&4-"&-8.&7#&##%&%6#E>#&"#/0%6#*&6%5#"&3;&##%&)#1--84#&$(--=&"#& )#-%">33(4#%+&4-"&7#&4-%&%3=&."##4.&-%4#(#&"#/0%6#*#%&;3#"&6%5#U#%&3;&4#&3$#(6=#& $(-=#%&"#&)#-%">33(4#%9&a#$38=&6.&4-"&#(&4-%&#b"(-&*3."#%&=#;--*"&;3#"#%&>3(4#%9&
&
,-"&)#"(#P&>#U#867*#.#%?&46#&;3=#%&)#."&"#(&46./E..6#&=#."#84&>3(4#%9&`#"&=--"& "#%&.83U#&%6#"&3;&4#&;3%6"3(6%=&5#8H+&;--(&3;&0#"&43#8;-G=&)#-%">33(4#%&$-%&##%& )#1--84#&$(--=9&C-"&=#84"&4E.&33*&$33(&4#&>#"=#$#(9&N#8#64.)#c%$83#46%=& %3345-*#867*9& 26#E>#&"#/0%6#*#%&;3#"#%&$3843#%&--%&8-%4#867*#&(6/0"867%#%9&JH&#(&;3#"#%&%6#E>#& ."-%4--(4#%&*3;#%d&4#%*&--%&4#&*311#86%=&"E..#%&!MJ,D@0-%4)3#*&`K4(3)6383=6#& #%&4#&VW,@;--"8-U#%9&e--(&33*&46#&567%&4K%-;6./0&8##("&4#&-H=#831#%&1--(&7--(9&
_&
f&
e3=#867*0#4#%&46#&>#&>688#%&56#%d&##%&$388#46=#&$6.."-%4.31%-;#&g&VW,@ )#33(4#86%=d&$#(.1(#646%=&$-%&$6..#%+&;--(&33*&-%4#(#&=(3#1#%&-8.&-;^)6#h%&#%& #b3"#%&Q)67$33()##84&(6$6#(*(##P#%Rd&999&& V3("3;?&.8E6"&--%&)67&3%5#&6%H3(;-G#)#03#P#9& J%5#&>#%.?&=#5-;#%867*#&3%">6**#86%=&433(&#C2D@163%6#(.&$-%&1(6;#(.&#%& 1(3"3/388#%&#%&53&*3;#%&"3"&."-%4--(46.-G#9&V#%%6.E6">6..#86%=&"E..#%&6%."-%G#.&46#& %E&;#"&#C2D&>#(*#%+&867*"&Q"#R&)#1#(*"9&C##8&7#&*#%%6.+&534-"&0#"%41(34E/"&."#(*#(& >3(4"&#%&.%#88#(&6%5#")--(9& DH>67*#%&$-%&0E646=#&."-%4--(4#%&;-=d&;3=#867*&*-%&#C2D&53%4#(&4#&*>-%G^/#(6%=& $-%&)#."-%4./0-i%=#%&##%&)#"#(+&$388#46=#(&)##84&$-%&4#&$6.."-%4&=#$#%9&C-%& ;3#"#%&>#&4--(&$33(&31#%&."--%&#%&53&%346=&;--"8-U#%&$33(&--%1-..#%9&L%6=#& *>-%G^/#(6%=+&#$#%"E##8&-8.&$#(03E46%=&"E..#%&.33("#%&6.&#/0"#(&>#8&=#>#%."9&
j&
!"#$%#%!$&'
RAVON Reptielen Amfibieën Vissen Onderzoek Nederland
Environmental DNA RAVON & SPYGEN Vlinderstichting, Zoogdiervereniging en FLORON
!!
28 professionals
!!
2000 vrijwilligers
!!
Non profit
Jelger Herder
•!
Amersfoort, 27 november 2013
Alle inkomsten op projectbasis
Doel: het duurzaam behouden van onze reptielen, amfibieën en vissen. 2/17
Sinds 2011 samenwerking met SPYGEN
Samenwerking op eDNA gebied
SEH Congres 2009 in Turkije ontmoet.
Samenwerking in Nederland
!!
Toonaangevend lab op gebied eDNA
!!
Uitvinders eDNA
!!
Jarenlange ervaring
!!
Speciaal lab
!!
Speciale protocollen
!!
Wetenschappelijke insteek
!!
Kennis ecologie en verspreiding
!!
Pilot studies
!!
Ontwikkeling monstermethodiek
!!
DNA voor referentiedatabases (ook voor Naturalis!)
!!
Ervaring met grote projecten
Waterschappen Samenwerking Internationaal
3/17
4/17
Kennis delen !!
Ficetola - Taberlet
Kwaliteit ! eerst pilot studie dan toepassen
Publicaties (10+) !!
Dejean et al., 2011
!!
5/17
Phillip Francis Thomsen
Presentaties (15+)
!!
College eDNA
!!
Website
Herder et al., 2012
Dejean et al., 2012
Herder et al., 2013
-!
Nationaal: STOWA, Waterschappen, VOFF, RAVON, RWS, TAUW, Symposium Ecologica etc.
-!
Internationaal: Symposium eDNA Brussel en SEH Hongarije
-!
!!
Primerontwikkeling •!
In silico (bioinformatisch)
•!
In vitro (op weefsel in lab)
•!
In situ (in het veld)
Testen in het veld: •!
8 locaties waar de soort zeker voorkomt (verschillende habitats)
•!
4 locaties waar de soort zeker niet voorkomt (controle!)
www.environmental-dna.nl 6/17
$'
!"#$%#%!$&'
Kwaliteit ! eerst pilot studie dan toepassen !!
Trefkans grote modderkruiper (in pilot studie 87,5%)
!!
Vervolgonderzoeken bevestigden deze trefkans (honderden locaties bemonsterd inmiddels)
!!
Trefkans veel hoger dan met electrovissen
Kwaliteit ! eerst pilot studie dan toepassen !!
Habitatkennis cruciaal voor succes eDNA
!!
2.5 x meer positieven bij inschatting geschikt vs matig geschikt.
Herder et al., 2013 - Visionair
7/17
8/17
Ervaring RAVON ! soortgerichte aanpak
Ervaring RAVON ! soortgerichte aanpak
Vissen:
Zoogdieren:
Vissen:
•! Grote modderkruiper
•! Noordse woelmuis •! Waterspitsmuis
•! Grote modderkruiper
Amfibieën:
Libellen:
•! •! •! •!
•! Groene glazenmaker •! Gevlekte witsnuitlibel
Kamsalamander Knoflookpad Amerikaanse brulkikker Italiaanse kamsalamander
Invasieve kreeften Amfibieën: •! •! •! •!
Zoogdieren:
Nog veel meer•!
Kamsalamander Knoflookpad Amerikaanse brulkikker Italiaanse kamsalamander
Noordse woelmuis •! Waterspitsmuis
Drijvende waterweegbree Libellen: •! Groene glazenmaker •! Gevlekte witsnuitlibel
Zwemmersjeuk (Trichobilharzia)
9/17
10/17
Ervaring ! Soortgroepgerichte aanpak
11/17
!!
Universele primer voor soortgroep
!!
Al het DNA van 1 soortgroep vermeerdert in de PCR
!!
Al het vermeerderde DNA uitlezen met Next Generation Sequencing
!!
Op de computer een match maken met database
Ervaring ! Soortgroepgerichte aanpak !!
Reeds succesvol getest door SPYGEN in Frankrijk •!
Amfibieën in poelen: met eDNA zelfde of meer soorten dan traditioneel.
•!
Vissen in de Rhône: met eDNA 23 soorten tegen 19 soorten met elektrovissen.
12/17
%'
!"#$%#%!$&'
Pilot studie in Nederland – eDNA KRW !!
Vergelijking eDNA (Next Generation Sequencing) met KRW bemonsteringen •!
!!
Ervaring
20 locaties verspreid over NL
Sinds 2011 in Nederland rond 1000 locaties onderzocht met eDNA!
!!
SPYGEN en LECA langer bezig en nog veel meer locaties onderzocht
Vergelijking uitkomsten: •!
Hoofddoel: soorten
•!
Subdoel: verkenning relatie eDNA - dichtheid
13/17
14/17
Conclusie uit rapport Bijkerk et al. 2013. !!
Voorstellen uit rapport Bijkerk et al. 2013.
De betrouwbaarheid van de methode is nog onvoldoende bekend !!
!!
Niet bekend hoe bemonstering op te zetten om detectiekans te realiseren.
Deze conclusie delen wij niet!
15/17
Onderzoek optimale bemonsterinspanning ! Modelonderzoek •!
In onze ogen te complex / ambitieus voor vissen
•!
Beter om te kiezen voor praktische aanpak: testen in het veld •!
eDNA scoort reeds aantoonbaar beter dan conventioneel!
•!
Onderzoek doen naar invloed van losse factoren
16/17
Zijn er nog vragen?
Voorstellen uit rapport Bijkerk et al. 2013. !!
???? ?
Ontwikkeling primers ! genereren soortenlijsten
•!
Niet: voor 70 vissoorten primers te ontwikkelen en los •! Niet praktisch: –! 70 losse analyses " arbeidsintensief + duur –! Multiplexing (meerdere primers samen) te complex! –! Primerontwikkeling onderschat –! Selectief (dus onverwachte soorten mis je!)
•!
Wel: Universele primer en Next Generation Sequencing •! •! •! •!
17/17
!!
Benut al het DNA uit het monster Werkt blind " dus ook onverwachte soorten Informatie over aantallen DNA kopieën " relatie naar dichtheden Rapport zegt te duur (2375 euro) " werkelijk kosten ~ 350 euro!
www.environmental-dna.nl 18/17
&'
Bridging science to practice
eDNA methodiek voor inventarisatie van aquatische biodiversiteit “
05-12-2013
DNA technieken beschikbaar voor praktische toepassing !! Moleculair biologische methoden voor bewaking drinkwaterkwaliteit •! Ziekteverwekkers van fecale herkomst •! Schadelijke micro-organismen die zich in water kunnen vermeerderen
!! Source tracking van fecale verontreinigingen !! Monitoren van microbiologische zwemwaterkwaliteit
Microbiologische meetmethoden voor beoordeling microbiologische kwaliteit drinkwater
•!
Cyanobacteriën of blauwalgen
•!
E.coli en enterococcen
“Source-tracking” van fecale verontreinigingen Toepassing zwemwater
!! Routinematige kwaliteitscontrole
Beheer zwemwater (RWS):
!! Onderzoek: risico’s beter leren kennen
!! Locaties met regelmatig hoge concentraties E. coli/
•! Ook organismen die met “klassieke” methoden niet aantoonbaar zijn
!! Risico beoordeling !! Optimalisatie zuiveringsprocessen
enterococcen !! Verbeteren kwaliteit is noodzakelijk !! Oorzaak? •! Gerichte maatregelen •! Kwaliteitsverbetering
DNA detectie van potentieel toxische blauwalgen In opdracht van RWS
Monitoren van beschermde en invasieve soorten met eDNA, pilot 2013 Samen met Bureau Waardenburg en Waterschap Rivierenland
!! Kwantitatieve detectie van de (meest voorkomende) potentieel toxische blauwalgen
Grote Modderkruiper
Kamsalamander
Exotische zoetwaterkreeften
!! qPCR met interne controle
(Misgurnus fossilis)
(Triturus cristatus)
(Astacidae and Cambaridae)
!! Routinematige toepassing
© KWR Watercycle Research Institute
1
Bridging science to practice
Inventarisatiemethoden op basis van eDNA !! Specifieke detectiemethoden door kwantitatieve eDNA detectie •! Soort, groep, geslacht specifiek •! Kwantitatief en zeer snel resultaat
!! Generieke inventarisatie met behulp van metabarcodinganalyse •! Groep specifiek •! Identificatie van soorten op basis van “next generation sequencing”
05-12-2013
eDNA voor aquatische biodiversiteit, TKI 2014-15 Samen met Naturalis, RoyalHaskoningDHV, BaseClear, Koeman & Bijkerk, Hogeschool Leiden !! Verzamelen van barcodes !! Ontwerp eDNA methoden !! Generieke methoden !! Specifieke methoden
!! Metabarcoding sequence analysis !! Vertaalslag naar praktijk
Kennishiaten eDNA voor aquatische biodiversiteit !! Optimalisatie en standaardisatie waterbemonstering •! Detectiekans •! Afhankelijk van doelsoort •! Aantal, poolen, volume
!! Stabiliteit en verspreiding eDNA in het milieu •! O.a. in vitro studies met verschillende modelorganismen
!! Standaardisatie eDNA analyse •! Robuuste methode geschikt voor routinematige toepassing inclusief controles •! Werkvoorschriften en protocollen van doelsoorten
!! Relatie DNA kopieën en abundantie (enige analogie met cyanobacteriën)
© KWR Watercycle Research Institute
2
!"#$%#%!$&'
2,'',289'<,+:)=,'>'%'?/4,6'
$@'G,+'6,<,6'7/6'=,';/+,-<)64+,-4H' =,+,BI,D/64',6'0,<)64+,-56144+-/+,15,'
2,'+),3/44561'7/6',289'56':,+';/+,-0,:,,-' ()*+,-'./+0,-1'
%@'2,'<)A,B*A/5-,'/6/AC4,' #':,+')3;,-D,6'7/6':,+',289'=/+' 56'=,';/+,-<)64+,-4'//6;,E51'54F' +,6,56=,'=),A4))-+,6'//6'+,' D*66,6'+)6,6'
G*5=51,')6+;5DD,A561,6'>'S),
•! •! •! •! •!
J54H' 9
•! R/B-)?/*6/'' OS(TF'8/+*-/A54'UVF'T)C/A'G/4D)6561F'U/4,BA,/-F'WXYF'G)1,4B:))A' Z,5=,6Q@'
2,+,BI,D/64'>'(//-'54'=5,'7/6'/_/6D,A5ND`'
G*5=51,')6+;5DD,A561,6' •! W\6'289'?-/1<,6+[<)A,B**A'56';/+,-<)64+,-'54'/A'7)A=),6=,')<'56':,+' A/0'=,'//6;,E51:,5='7/6'=,'4))-+'//6'+,'+)6,6@'' •! 2,'D/64')<',,6')-1/654<,'//6'+,'+)6,6'54'=//-<,,'1,A5ND'//6'=,'D/64' )<',,6'4+*DN,'289'56':,+';/+,-<)64+,-'+,'D-5N1,6H'=,'=,+,BI,D/64' •! 2,'=,+,BI,D/64'D*66,6';,'0,]67A),=,6'#'0,<)64+,-56144+-/+,15,^' #! J)A*<,' #! T*5<+,A5ND,'7,-=,A561'
2,',289'<,+:)=,'>',,6'7))-0,,A='
a7,-'=,E,'?/B+)-,6'>',6'=*4'=,+,BI,D/64'#';,+,6';,':,,A';,5651b' G),'D*66,6';,'=/6',,6'0,+-)*;0/-,'0,<)64+,-56144+-/+,15,' :/6+,-,6`'
$'
!"#$%#%!$&'
2,',289'<,+:)=,'>',,6'7))-0,,A='
2,',289'<,+:)=,'>',,6'7))-0,,A=' U,<)64+,-56144+-/+,15,'7/6'1-))+' 0,A/61d'
!"#$%%&'"(")# •! c,7),A51,-'=/6'B)67,6I)6,A,' <,+:)=,6'O<,+'6/<,'E,A=E/<,',6[ )?'<),5A5ND'+,'567,6+/-54,-,6'4))-+,6QH'
•! 85,+'4,A,BI,?H'
*+,',-"#."/%&./%0,)-")# •! a67)A=),6=,'D,6654')7,-' ?/B+)-,6'=5,'=,+,BI,D/64' 0,3/A,6H' •! U,+-)*;0//-:,5='7/6'=,' <,+:)=,'54')67)A=),6=,'0,D,6=@'
!"#"!12#0".3%'"#4,"'.#$"("# 5"&65"78"$")9## 0::&#"�%".#)%-#$""(#%)'"&;%"/# -"'::)#<%&'")=#
2,'<)65+)-5614=),A,6'
,289',6'=,'<)65+)-5614=),A,6'
>=! ?%"6.:)'#")#.&")'#0%),.%&,)-#
?%"6.:)'#")#.&")'#0%),.%&,)-# cA)0/A,'0,))-=,A561',6'A/61,'+,-<5N6'+-,6='
cA)0/A,'0,))-=,A561',6'A/61,'+,-<5N6'+-,6=' ,B)A)15,'#'?C+)3A/6D+)6F'?C+)0,6+:)4F'
,B)A)15,'#'?C+)3A/6D+)6F'?C+)0,6+:)4F'
4))-+,64/<,64+,AA561F'/0*6=/6I,',6'A,,e5N='
B=! 1:.+&:@CCC#")#D*E#
H%-"(,I/3"'")#"!12# •! Y))-+,64/<,64+,AA561'>'//67*AA,6=,'<)65+)-561'+07'E,A=E/<,',6' <),5A5ND'+,'7/61,6'4))-+,6@'' 8)6#=,4+-*BI,?'O)-1/654<,',6':/05+/+QH' S/6'5D'/AA,';/+,-,6';)-=,6'+),1,3/4+H' 2,+,BI,D/64')6E,D,-H'
F=! G<"0<:."&#
•! 90*6=/6I,'>'56'=,'+),D)<4+H'
@=! A5"&:8%)"("#0%),.%&,)-# R,,-'1,-5B:+,-,'<)65+)-561'6/'+-,f,6'7/6''65,+'/AA,' 3/-/<,+,-4':),7,6'1,<,+,6'+,';)-=,6'
•! Z,,e5N=40,3/A561'>'65,+'<)1,A5NDH'
,289',6'=,'<)65+)-5614=),A,6'
,289',6'=,'<)65+)-5614=),A,6'
A5"&:8%)"("#0%),.%&,)-# R,,-'1,-5B:+,-,'<)65+)-561'6/'+-,f,6'7/6''65,+'/AA,' 3/-/<,+,-4':),7,6'1,<,+,6'+,';)-=,6@'
1:.+&:@CCC#")#D*E# X64+/6=:)*=561'43,B5K,D,':/05+/gC3,6',6'4))-+,6@' J))-D)<,6'7,-46533,-561@'
H%-"(,I/3"'")#"!12# •! U,3/A,6'//6;,E51:,5='7/6',,6')?'<,,-=,-,'4))-+,6@' c,7),A51:,5=H' 85,+#4,A,BI,?H' 8)6#=,4+-*BI,?'O)-1/654<,',6':/05+/+QH' S/6'5D'/AA,';/+,-,6';)-=,6'+),1,3/4+H' 2,+,BI,D/64')6E,D,-H'
H%-"(,I/3"'")#"!12# •! U,3/A,6'//6;,E51:,5='7/6',,6')?'<,,-=,-,'4))-+,6H' c,7),A51:,5=H' 85,+#4,A,BI,?H' 8)6#=,4+-*BI,?'O)-1/654<,',6':/05+/+QH' S/6'5D'/AA,';/+,-,6';)-=,6'+),1,3/4+H' 2,+,BI,D/64')6E,D,-H'
•! 9?;,E51:,5='65,+'<,+'E,D,-:,5='+,'0,3/A,6@'
•! T575,-3-5DOA/-7,6Q'>'B)66,BI,'+*44,6'E),+',6'
%'
!"#$%#%!$&'
,289',6'=,'<)65+)-5614=),A,6'
h),D)<4I1')6=,-E),D'
G<"0<:."&# G)1,'D;/A5+,5+4,54,6'57<'7)AD41,E)6=:,5='
1::&# •! X6E5B:+'56'=,+,BI,D/64H#
H%-"(,I/3"'")#"!12# •! 9/6+)6,6'7/6'+)P54B:,'0A/*;/A1,6'O74@'65,+#+)P54B:,Q' •! "#$%&'($)&*#+$*.OE;,<<,-4N,*DQ@'
!%"(' •! S)4+,6,iB5L6+,'0,<)64+,-56144+-/+,15,'=5,',,6'0,3//A=,'0,+-)*;0//-:,5=' -,/A54,,-+H' •! Y+/6=//-=54,-,6'>'4))-+F':/05+/gC3,H' •! W,6'1),=,';,+,64B:/33,A5ND,'0/454'7))-':,+'1,0-*5D'7/6'=,',289'<,+:)=,H' *%"# •! R)=,A'=543,-45,<)=,A'>';,AD,'?/B+)-,6'E5N6'7/6'0,A/61`' •! J))-'7,-4B:5AA,6=,'4))-+,6')-1/654<,6F'4+-)<,6=,',6'4+/16/6+,';/+,-,6' •! WP3,-5<,6+,,AF'56':,+'7,A=',6'56':,+'A/0' •! J/A5=,-,6'*5+D)<4+,6'<)=,A)6=,-E),DH' •! U,3/A,6'563*+3/-/<,+,-4'7))-':,+'<)=,A'Oj*PF'/k-//D46,A:,5=F',+B@Q'
"#$%&'($)&*#+$*'
&'
05-12-2013
Environmental DNA en monitoring Ontwikkelingen IMARES
Monitoring !!
Internationale ei-surveys om paaibestand te bepalen van makreel/horsmakreel/haring
!!
Invasieve soorten
Hilde van Pelt-Heerschap
- Mosseltransport - Ballastwater
!!
Monitoring programma ’s - Aanwijzing Natura 2000 gebieden o.g.v. aanwezige soorten - KRW- eisen goede waterkwaliteit
Surveys eieren van makreel/horsmakreel en haring
-
-! -!
Invasieve soorten Mosselzaad transport -! eDNA (ook vroege ontwikkelings-stadia) - levend/dood
Gelijktijdige moleculaire identificatie Bepaling relatieve biomassa--gebaseerd op het aantal kopieen van de “moleculaire barcode” per cel.
Natura 2000 gebieden/ KRW Tot nu toe gebaseerd op taxonomische identificatie van soorten in de sediment fractie > 0.5 mm. Ontwikkeling metabarcoding: 1. Splitsing sediment fractie: groter dan 0.5 mm en kleiner dan 0.5 mm 2. DNA isolatie en amplificatie van de moleculaire barcode 3. Sequencing (25 miljoen sequenties per run) 4. Data analyse
Ballast water
1
05-12-2013
Verdere ontwikkelingen 1.! 2.! 3.! 4.! 5.!
Uitbreiding moleculaire databases Bepaling abundantie o.g.v. biomassa Bepaling levend versus dood Ontwikkeling primers voor bepaalde groepen VALIDATIE
2
Huidige en toekomstige activiteiten Alterra
eDNA en monitoring door waterschappen Huidige activiteiten en toekomstvisie van Alterra
Aanvullende validatie voor reeds beschikbare eDNA-merkers:
Arjen de Groot
- Knoflookpad
Dierecologie, Alterra – Wageningen UR
- Grote modderkruiper
Ontwikkeling van eDNA-merkers voor relevante soorten: 2013:
invasieve en inheemse rivierkreeften
2014:
kenmerkende libellen, kokerjuffers
Methodologie op basis van qPCR-reactie
Optimalisatie van bemonsteringsprotocollen
STOWA, 27 november 2013
eDNA onderzoek bij Alterra - WUR
Rivierkreeften in Nederland
Moleculaire en ecologische expertise onder één dak:
Vroegtijdige opsporing invasieve rivierkreeften voorkomt:
Moleculair laboratorium, gespecialiseerd in analyse van DNA met matige kwaliteit en kwantiteit
Schade aan ecosystemen (verlaagde KRW-scores)
- keutels, haren, eischalen
ł Schade aan oever- / aquatische vegetatie
- eDNA in bodem- en watermonsters
ł Vertroebeling ł Predatie en concurrentie
Praktijkgerichte ecologische expertise voor aquatische flora en fauna - ecologische doelen en monitoringseisen voor de KRW
Mogelijke schade aan infrastructuur
ł Ondergraven van oevers en slootkanten
- beleidsplannen voor bedreigde en invasieve soorten
Bemonstering en inventarisatie door ervaren veldmedewerkers
Eigen proefsloten, kunstbeken, etc.
Roessink et al. 2009, Alterra-rapport 1923 Roessink et al. 2010, Alterra-rapport 2052 Foto’s: Fabrice Ottburg
eDNA onderzoek bij Alterra: praktijkgericht Ontwikkeling eDNA-technieken gericht op ondersteuning van de monitoringstaken van waterbeheerders en natuurbeheerders
Focus op detectie van beleidsrelevante soorten / soortsgroepen: ł Verkenning aanwezigheid van kwetsbare soorten voorafgaand aan werkzaamheden
ł (Prestatie)monitoring voor terugkeer kenmerkende soorten KRW na herstelwerkzaamheden
ł Vroegtijdige opsporing van soorten die KRW-doelstellingen negatief kunnen beïnvloeden (invasieve exoten)
Methodeontwikkeling voor rivierkreeften Ontwikkeling van twee early-warning tools:
A) B)
Een soort-specifieke test voor de Rode Amerikaanse rivierkreeft Een brede test voor de in Nederland voorkomende rivierkreeften
Doorlopen stappen:
• Rode Am. rivierkreeft
(Procambarus clarkii)
• specifieke Gestreeptemerker Am. rivierkreeft 1. Ontwerpen van voldoende • Marmerkreeft 2. Optimalisatie qPCR-reactie
• Geknobbelde Am. rivierkreeft 3. Tests op andere kreeftachtigen Æ vals-positieven uitsluiten(Orconectes virilis) • Gevlekte Am. rivierkreeft 4. Tests op veldmonsters met bekende aan/afwezigheid (Orconectes limosus) • Californische rivierkreeft
Aandacht voor praktische inzetbaarheid methode
(Procambarus acutus)
(Procambarus fallax)
• Turkse rivierkreeft
(Pacifastacus leniusculus)
(Astacus leptodactylus)
• Europese rivierkreeft
(Astacus astacus)
Rivierkreeften aangetoond in veldmonsters Rode Amerikaanse rivierkreeft
Nu: verificatie via DNA sequencing
Naardermeer (ven)
Richting een breder toepasbare methode Speerpunten voor grotere toepasbaarheid door waterschappen: 1. Detectiekans: wat vertelt een positief of negatief resultaat? - over welk watervolume kunnen uitspraken worden gedaan? - invloed van verschillen in hydrologie en waterchemie?
Loosdrecht (meer) Maarsseveen (sloot) Waddinxveen (sloot)
Europese rivierkreeft Sinderhoeve (proefsloot)
2. Gestandaardiseerde protocollen voor bemonstering en analyse - Replicatie, volume en spreiding van monsters - Wijze van bemonstering en DNA extractie - Replicatie van PCR-reacties, en definitie positieve score
Geknobbelde Am. rivierkreeft Kamerik (sloot) Gestreepte Am. rivierkreeft Alblasserwaard (sloot)
3. Meer zicht op mogelijkheden voor kwantitatieve analyse 4. Meer zicht op mogelijkheden voor diversiteitscreening (metabarcoding)
Turkse rivierkreeft Kerkrade (meer)
Onderzoeksbehoefte A. Effect van studiesoort en condities op hoeveelheid DNA in monster
Vele parameters m.b.t. hydrologie, DNA-specificaties en dierecologie Modelstudie waardevol, mits gericht op kwalitatieve uitspraken:
ł relatieve belang van parameters ł optimale monsterstrategie
Parameters staven met experimenten in lab, proefsloten en veld
B. Effect van watercondities op DNA-detectie in het monster
Inhiberende stoffen en DNA-verzadiging kunnen de gemeten eDNA-concentratie beïnvloeden
Dit heeft gevolgen voor de optimale monsterstrategie (wel of niet monsters samenvoegen?)
Foto: Fabrice Ottburg
Knoflookpad als onderzoeksmodel
Met dank aan:
Ivo Laros
In samenwerking met adviesbureau Natuurbalans Kweek van larven en herintroductie in verlaten poelen
Jan Bovenschen
Experimenteel onderzoek in 2013/2014 aan:
ł eDNA-afgifte door verschillende levenstadia (ei, larve, adult) ł Opbouw en afbraak eDNA-concentratie in water ł Ruimtelijke verspreiding
Ivo Roessink Fabrice Ottburg Ben Crombaghs Jouke van der Zee
Vragen:
[email protected] / 0317-485926
$(67(&7(008*&,0-9877(6-&!:6;<8='&,;&<(-&>(28(?&1@0&(AB%&
!"#$%&&'()*+%(*#,-.*+""/*0"('1"/'()*+%(*2%1#/"/)%('&0#(
3"41#/*5%16#/)* 7#89"*3%88%%/1* !"#$%&%'()*+,,)-&./&0,1('2()&.345&
$(67(&7(008*&,0-9877(6-&!:6;<8='&,;&<(-&>(28(?&1@0&(AB%&
$(67(&7(008*&,0-9877(6-&!:6;<8='&,;&<(-&>(28(?&1@0&(AB%& A(&-9((&'((*-&2(6,1(0?(&(AB%&-(D<0,6,>8(O0&P8K0F&&
C,,)9@@)?(0&@@0&(AB%&?(-(DE(-(D<0,6,>8(F&& G!&!;(D8H(7I&>(1,(68>&(0&2(-),=92@@)&J)(;)(*(0-@E(1(&9(()>@1(&1@0&?(&9()7(68K7<(8?L& 5QR&S&4T5U&9(66&VWXY&
G!&M(-@@62@@)& G!&!0(66(&2(*D<872@@)<(8?&1@0&?@-@& G!&N,>(68K7<(8?&-,-&79@0E-@E(1(&2(;@680>(0&
$(67(&7(008*&,0-9877(6-&!:6;<8='&,;&<(-&>(28(?&1@0&(AB%& A(&-9((&'((*-&2(6,1(0?(&(AB%&-(D<0,6,>8(O0&P8K0F&&
5QR&S&4T5U&9(66&VWXY&
N(-@2@)D,?80>&
N,>(68K7<(?(0&(0&2(;()780>(0&
:;<*/ =>:? 2#88*@5AB*
C#1%6%/9"D'()*
C,,)?(6(0F& G!&Z(()&*;(D8H(7& & && G!&[8-()*-&>(1,(68>& G!&\,>(&2(-),=92@@)<(8?& G!&!0(6& G!&],(?7,,;& G!&^9@0E-@E(1(&2(;@680>(0&JVWXYL& G!&_0&((0&)=0&@66(&*,,)-(0&
C,,)?(6(0F& G!&Z(()&*;(D8H(7& G!&N80?()&>(1,(68>&& G!&^,)-()&,0-9877(680>*-)@K(D-& G!&%@0-,0(0&,01()9@D<-(&*,,)-(0& G!&_0&((0&)=0&@66(&*,,)-(0&
B@?(6(0F& G!&%66((0&>(*(6(D-(()?(&*,,)-(0&9,)?(0& &&&@@0>(-,,0?&
B@?(6(0F& G!�?()*0((=9&(`(D-&& G!&N@E>(&2(-),=92@@)<(8?& G!&")@@>& G!&A==)& G!&]((0&79@0E-@E(1(&2(;@680>(0&
1
N,>(68K7<(?(0&(0&2(;()780>(0&
(AB%&'(-<,?(*&,0-9877(6-&?,,)&!:6;<8='&N,6(D=6@8)&aD,6,>:&&
:;<*S&=>:? 2#88*@5AB**
C#1%6%/9"D'()*
C,,)?(6(0F& G!&Z(()&*;(D8H(7& & && G!&[8-()*-&>(1,(68>& G!&\,>(&2(-),=92@@)<(8?& G!&!0(6& G!&],(?7,,;& G!&^9@0E-@E(1(&2(;@680>(0&JVWXYL& G!&_0&((0&)=0&@66(&*,,)-(0&
C,,)?(6(0F& G!&Z(()&*;(D8H(7& G!&N80?()&>(1,(68>&& G!&^,)-()&,0-9877(680>*-)@K(D-& G!&%@0-,0(0&,01()9@D<-(&*,,)-(0& G!&_0&((0&)=0&@66(&*,,)-(0&
B@?(6(0F& G!&%66((0&>(*(6(D-(()?(&*,,)-(0&9,)?(0& &&&@@0>(-,,0?&
B@?(6(0F& G!�?()*0((=9&(`(D-&& G!&N@E>(&2(-),=92@@)<(8?& G!&")@@>& G!&A==)&& G!&]((0&79@0E-@E(1(&2(;@680>(0&
G!&5QR&9(66&WXY&(0&VWXY&-(D<08(7(0&J80&7@@)-&2)(0>(0&18*;,;=6@E(*Lb& G!&\@;6,-:;(&2(;@680>(0&'(-&(AB%&J!"#$%&"#$L& G!&WXY&?(-(DE(&'(-<,?(&1,,)&'()*+",)&+$(-)$% G!&N(-@2@)D,?80>b&& G!&M6@=9@6>(0&?(-(DE(b& b&_0&,0-9877(680>&
M(*-(&7(=*&1,,)&',08-,)80>&1@0&18**(0&
%@0*6=8E0>&,;&',08-,)80>*?,(6(0&1@0&9@-()*D<@;;(0&&
A(&2(6@0>)8K7*-(&(AB%&,0-9877(680>(0&1,,)&9@-()*D<@;;(0&
•! Kostenefficiënte technologieën ontwikkelen voor afzonderlijke soorten organismen
G!&!,,)-(0*@'(0*-(6680>&& G!&%@0-@66(0& & & G!&c(0>-(76@**(0&J6((d8K?L& G!&C8-@68-(8-& & &
&!% &!& &"& &"&
•! Standaardisaties ontwikkelen voor de methode(s) zodat de resultaten onderling vergelijkbaar zijn •! Kwantitatieve bepalingen ontwikkelen van middels qPCR
JN(- *;(D8HD8-(8-I&>(1,(68><(8?I&*0(6<(8?&(0&2(-),=92@@)&@6*&=8->@0>*;=0-L
2
