FEHÉRJÉK GLIKOZILÁCIÓJÁNAK NYOMON KÖVETÉSE ÉS PEPTIDEK ANALITIKAI ELVÁLASZTÁSÁNAK VIZSGÁLATA KAPILLÁRIS ELEKTROFORETIKUS MÓDSZEREKKEL
Doktori (PhD) értekezés
Készítette
Olajos Marcell okleveles környezetmérnök
Témavezető
Dr. Hajós Péter egyetemi docens
Készült a Pannon Egyetem Kémiai és Környezettudományok Doktori Iskolája keretében
Pannon Egyetem Mérnöki Kar Analitikai Kémia Intézeti Tanszék 2010
Fehérjék glikozilációjának nyomon követése és peptidek analitikai elválasztásának vizsgálata kapilláris elektroforetikus módszerekkel Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta: Olajos Marcell okleveles környezetmérnök Készült a Pannon Egyetem Kémiai és Környezettudományok Doktori Iskolája keretében Témavezető: Dr. Hajós Péter Elfogadásra javaslom (igen / nem) (aláírás) A jelölt a doktori szigorlaton …......... %-ot ért el,
Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: …........................ …................. igen /nem ………………………. (aláírás) Bíráló neve: …........................ ….................) igen /nem ………………………. (aláírás) ***Bíráló neve: …........................ ….................) igen /nem ………………………. (aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján …..........%-ot ért el. Veszprém/Keszthely,
…………………………. a Bíráló Bizottság elnöke
A doktori (PhD) oklevél minősítése…................................. ………………………… Az EDT elnöke
III
Kivonat A szerző a dolgozat első részében a glikoproteinek szénhidrát alkotóinak vizsgálatára kidolgozott módszert ismerteti, mely érzékeny fluoreszcenciás detektálású kapilláris gél elektroforetikus analitikai elválasztáson alapszik, mely nagy áteresztőképességű multikapilláris
formátumban
is
kivitelezhető.
Értékelte
a
különböző
minta-előkészítési
módszereket, és hatékony eljárást dolgozott ki a fluoreszcens jelölőanyag nagy moláris feleslegének eltávolítására, mely elektrokinetikus injektálással történő mintabevitel során az elemzést jelentősen megnehezíti. A kidolgozott normál fázisú kromatográfiás módszer teljesen automatizálható. A komplex biológiai minták – mint a humán szérum – szabad cukortartalmának eltávolítását – mely a minták analízisét zavarja – ultraszűrés segítségével sikerült megoldani. Továbbá a jelölt glikánok szerkezetvizsgálatára illékony puffer rendszert dolgozott ki exoglikozidáz enzimemésztések kivitelezésére elektrokinetikus injektálású rendszerekhez. A dolgozat második részében a glikoproteinek szelektív izolálására és dúsítására kidolgozott, teljesen automatizált boronsav - lektin affinitás kromatográfiás módszert mutatja be a szerző. Részletesen ismerteti a módszer hatékonyságának vizsgálati eredményeit a hőmérséklet, mint meghatározó paraméter, változatásával. Majd az optimalizált módszer humán szérum glikoproteinek izolációjára került alkalmazásra, melynek eredményeit szintén bemutatja. Az affinitás kromatográfiával kombinált minta-előkészítési módszer alkalmasnak bizonyult kevert normál és prosztata karcinómás humán szérum glikozilációs profilja között különbségek kimutatására. A dolgozat harmadik részében a peptidek kapilláris zóna elektroforézises elválasztásainak modellezése területén elért eredményeit mutatja be. Ismerteti a modellezési megközelítéseket, újszerű paraméter vezérelt módszerrel, kiterjedt kísérleti adatbázisra épülve vizsgálja a különböző modellek predikciós teljesítményét. Ismerteti a szemi-empirikus és gépi intelligenciára épülő (mesterséges neurális hálózat) modellekkel elért eredményeket az elektroforetikus mobilitás szimulációjára, ahol utóbbiak kiváló predikciós hatékonyságát igazolta, rávilágítva az elektroforetikus mobilitás és a peptidek jellemzőinek és az elválasztás paramétereinek nem-lineáris összefüggéseire.
IV
Abstract Glycosylation profiling of proteins and modelling of analytical peptide separations by capillary electrophoretic methods In the first part of the work the method developed to study carbohydrate moieties of glycoproteins is discussed. The method is based on sensitive fluorescent detection and capillary gel electrophoretic analytical separation, also implemented in high-throughput multicapillary format. Various sample preparation methods for multi-capillary gel electrophoresis based glycane analysis to support electrokinetic injection are evaluated. Fully automated, effective normal phase chromatography based method was developed for the removal of the excess fluorescent labelling agent that biases the analysis. Problems associated with the high glucose content of such biological samples as normal human plasma were solved by applying ultra filtration. Finally, a volatile buffer system was developed for exoglycosidase based carbohydrate analysis. The second part of the treatise discusses the fully automated boronic acid - lectin affinity chromatography for the selective isolation and enrichment of glycoproteins. Temperature dependence of the method was investigated; the obtained results are discussed in detail. The sample preparation methodology combined with the optimized glycoaffinity chromatography was utilized for comparative human serum glycosylation profile analysis. By applying the work flow it was possible to comparatively profile glycane patterns of pooled prostate cancer patient serum to differentiate from the healthy serum. Finally, the third part of the thesis discusses new endeavours in modelling capillary zone electrophoretic peptide separations. Different models are critically evaluated based on their predictive performances according to a novel parameter driven approach. The results for simulation of the electrophoretic peptide mobilities obtained with the two variable semiempirical Offord-model and machine learning (artificial neural network) techniques are presented. The latter provided outstanding predictive performance, consolidating the conjectures on nonlinear relationships between peptide structural descriptors and their electrophoretic mobilities.
V
Kurzfassung Glykoprofilierung
von
Proteinen
und
Modellierung
von
analytischen
Peptid
Trennungen durch kapillarelektrophoretische Methoden Der erste Abschnitt dieser Arbeit beschreibt die Entwicklung einer Methode zur Untersuchung von Kohlenhydratresten auf Glykoproteinen. Die Vorgehensweise basiert auf hochsensibler Fluoreszenzdetektion und kapillargelelektrophoretischer Trennung, mitunter im Hochdurchsatzformat der Multikapillarelektrophorese.
Verschiedene Methoden der
Probenaufbereitung von Glykanen, welche eine elektrokinetische Injektion und die Trennung im Multikapillargelelektrophoreseformat erlauben, werden systematisch evaluiert. Ein vollautomatisiertes Verfahren basierend auf Normalphasen-Chromatographie wurde zur effektiven Entfernung des Überschusses an Fluoreszenzmarkierungreagenz entwickelt und somit die systematische Verzerrung der Analyse minimiert. Mit Hilfe von Ultra-Filtration konnte dem Problem von Glukoseüberschüssen in natürlichen Proben wie menschlichem Serum erfolgreich begegnet werden. Schließlich wurde ein flüchtiges Puffersystem entwickelt, welches die Analyse von Kohlenhydraten in Zusammenhang mit Exoglykosidasen ermöglicht. Im zweiten Teil der Arbeit wird die selektive Isolation und Anreicherung von Glykoproteinen mittels vollautomatisierter Boronsäure – Lektinaffinitätschromatographie diskutiert. Die Temperaturabhängigkeit der Methode wurde analysiert und die erzielten Ergebnisse detailliert vorgestellt. Probenaufbereitungsverfahren und optimierte Glykoaffinitätschromatographie wurden gemeinsam zur komparativen Analyse der Glykanprofile von menschlichem Blutserum
eingesetzt.
Glykosilierungsprofile
Unter aus
Verwendung Mischsera
dieses von
Arbeitsablaufes
gesunden
mit
konnten
die
denen
von
prostatakarzinomerkrankten Patienten verglichen und Unterschiede hervorgehoben werden. Der dritte Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit neuen Modellierungsansätzen von kapillarzonenelektrophoretischer Trennung von Peptiden. Unterschiedliche Modelle werden anhand ihrer
Präzision
und
Vorhersagekraft
kritisch
evaluiert.
Simulationsresultate
der
elektrophoretischen Mobilität von Modellpeptiden generiert durch den semi-empirischen 2Variablen Ansatz von Offord sowie künstliche neuronale Netze werden vorgestellt. Letztere erreichten eine außerordentliche Präzision und bestärkten somit die Annahmen über nicht-
VI
lineare Zusammenhänge zwischen Strukturdeskriptoren und elektrophoretischen Mobilitäten von Peptiden.
VII
Tartalomjegyzék Kivonat
IV
Abstract
V
Kurzfassung
VI
Rövidítések és jelölésjegyzék
1
Bevezetés
4
1 Irodalmi összefoglaló 1.1 Analitikai elválasztásokon alapuló glikán vizsgálatok fluoreszcens jelöléssel 1.1.1 A glikán analízis jelentősége 1.1.2 Elemzési módok 1.1.2.1 HPLC-fluoreszcencia 1.1.2.2 Kapilláris gél elektroforézis lézer indukált fluoreszcenciás detektálással (CGE-LIF) 1.1.3 Exoglikozidázok 1.2 Affinitás kromatográfiás állófázisok glikoproteinek tisztítására és elválasztására 1.2.1 Lektin immobilizálási technikák 1.2.1.1 Nem-kovalens immobilizálás 1.2.1.2 Kovalens immobilizálási technikák 1.2.2 Kromatográfiás alkalmazások 1.2.2.1 Sorozatos LAC 1.2.2.2 Multi-LAC 1.2.2.3 Monolitikus lektin affinitás oszlopok 1.2.2.4 Lektin affinitás alapú glikán profilozás 1.2.2.5 Elektroforetikus alkalmazások 1.2.3 Boronsav és más pszeudo-lektinek 1.3 Kapilláris zóna elektroforetikus peptid elválasztások modellezése 1.3.1 Szemi-empirikus modellek 1.3.1.1 A szemi-empirikus modellek hiányosságai 1.3.2 Többváltozós modellek 1.3.3 Gépi intelligencia módszerek 1.3.4 Következtetések
6 6 7 8 10 11 12 15 18 18 18 20 21 22 23 23 24 24 26 27 33 34 39 42
2 Kísérleti rész 2.1 Anyagok és módszerek komplex szénhidrátok gél elektroforézises elemzéséhez 2.1.1 Vegyszerek 2.1.2 Oligoszacharid mintaelőkészítés 2.1.3 Jelölési reakció 2.1.4 Deszialilációs eljárás 2.1.5 Mintatisztítás 2.1.6 Multikapilláris elektroforézis 2.2 Boronsav – lektin affinitás kromatográfia hőmérséklet függésének vizsgálata 2.2.1 Felhasznált vegyszerek 2.2.2 Boronsav, WGA és BLAC/WGA mikropreparatív glikoaffinitás kromatográfia 2.2.3 A minták RP-HPLC és MALDI-TOF-MS analízise 2.3 Mikroaffinitás kromatográfiás glikoziláció profilozáshoz felhasznált anyagok és módszerek
44 44 44 44 44 45 45 46 48 48 48 49
VIII
50
2.3.1 Felhasznált vegyszerek és minták 2.3.2 Kismolekulájú zavaró mátrix eltávolítása ultraszűréssel 2.3.3 BLAC/ConA glikoaffinitás eljárás 2.3.4 Az N-glikánok enzimatikus felszabadítása 2.3.5 Fluoroeszcens jelölés 2.3.6 Poszt-derivatizációs tisztítás 2.3.7 Komparatív glikán profilozás kapilláris gél elektroforézissel 2.4 CZE peptid mobilitások modellezéséhez felhasznált anyagok és módszerek 2.4.1 Vegyszerek 2.4.2 Készülékek, műszerek 2.4.3 Elválasztási körülmények 2.4.3.1 T-CORG elválasztási körülményei 2.4.3.2 CBGE-CORG elválasztási körülmények 2.4.4 Kísérleti értékelés 2.4.4.1 A minták szerkezeti jellemzőinek meghatározása 2.4.5 Modellezési módszerek 2.4.5.1 T-CORG modellezési fázis 2.4.5.2 CBGE-CORG modellezési fázis 2.4.5.3 A T-CORG és CBGE-CORG kísérleti adatbázisok egyesítése
50 50 51 51 52 52 52 53 54 54 55 55 56 57 58 59 60 62 62
3 Eredmények 3.1 Mintaelőkészítés komplex szénhidrátok multi-kapilláris gél elektroforézises elemzéséhez 3.1.1 A jelölőanyag feleslegének eltávolítása az analízist megelőzően 3.1.2 Humán szérum minták monoszacharid tartalmának eltávolítása 3.1.3 Illékony puffer rendszer exoglikozidáz emésztéshez 3.1.4 Következtetések 3.2 A boronsav - lektin affinitás kromatográfia (BLAC) hőmérsékletfüggése 3.2.1 Eredmények és diszkusszió 3.2.2 Következtetések 3.3 Mikropreparatív affinitás kromatográfiás glikoziláció profilozás 3.3.1.1 BLAC/ConA mikropreparatív glikoprotein dúsítás 3.3.1.2 Komparatív glikozilációs profil vizsgálat 3.3.2 Következtetések 3.4 Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus elválasztásoknál 3.4.1 Kísérleti eredmények 3.4.2 Statisztikai értékelés 3.4.3 Mintapeptidek töltésszámítása 3.4.4 Modellezési eredmények 3.4.4.1 T-CORG kísérleti adatbázis modellezési eredményei 3.4.4.2 CBGE-CORG kísérleti adatbázis modellezési eredményei 3.4.4.3 A CBGE-CORG és T-CORG adatbázisok egyesítése 3.4.5 Következtetések
64 64 64 66 68 69 71 71 76 78 79 81 83 84 84 85 87 91 91 94 95 96
4 Összefoglalás
98
Irodalomjegyzék
101
Tézispontok
i
Theses
iv
A szerző tudományos munkássága Publikációk
viii viii IX
Konferencia előadások Szóbeli előadások Poszterek Elismerések
ix ix x xi
Köszönetnyilvánítás
xii
X
1 Rövidítések és jelölésjegyzék
Rövidítések és jelölésjegyzék 2-AA AAL 2-AB ABS 2-AP %RSD AAA AGP AMF ANN ANTS APTS BA BGE BKF BLAC BP-ANN BTG CACN CBG CBGE CBGE-CORG CC CE CE-MS CGE CMeOH ConA CORG CTM CV CZE DDD DHB DMSO DSA DV E4-PHA EOF Err (W) ES,C ESI-MS FET FSCE Gal GDX-ANN GE GlcNAc GUH HILIC HM
2-amino-benzoesav Aleutra aurantia lektin 2-amino-benzamid (2-AA) Arthrobacter ureafaciens szialidáz 2-aminopiridin Százalékban kifejezett relatív standard deviáció Alanin aminosavakból álló tripeptid Alfa-1-savanyú glikoprotein Mandula alfa-fukozidáz Artificial neural network: mesterséges neurális hálózat 8-aminonaftalin-1,3,6-triszulfonsav 8-aminopirén-1,3,6-triszulfonsav Boronic acid: boronsav (m-aminofenil-boronsav) Background electrolyte: háttér elektrolit Szarvasmarha vese alfa-fukozidáz Boronsav - lektin affinitás kromatográfia Back propagation artificial neural network Szarvasmarha ivari béta-galaktozidáz Acetonitril koncentráció Kávébab alfa-galaktozidáz Háttér elektrolit koncentráció Kísérleti fázis: Puffer koncentráció – szerves oldószer koncentráció Charge center: töltésközéppont Capillary electrophoresis: kapilláris elektroforézis Tömegspektrometriával kapcsolt kapilláris elektroforézis Kapilláris gél elektroforézis Metanol koncentráció Concanavalin A: konkanavalin A (lektin) Szerves oldószer koncentráció Co-translational modification: ko-transzlációs módosulás Coefficient of variance: variációs együttható Capillary zone electrophoresis: kapilláris zóna elektroforézis Aszpargin sav aminosavakból álló tripeptid 2,5-dihidroxi-benzoesav Dimetil-szulfoxid (EOF marker) Datura stratmonium agglutinin Doppler sebesség mérés α-fetoprotein erythroagglutinating phytohemagglutinin Electroosmotic flow: elektroozmotikus áramlás Error function: hiba függvény Corrected steric substituent constant: korrigált sztérikus szubsztituens állandó Elektronspray ionizációjú tömegspektrometria Szarvasmarha magzati fetuin Free solution capillary electrophoresis: szabad oldat CE Galaktóz Gradient descent ANN using momentum and adaptive learning rate: momentumokat és adaptív tanulási arányú algoritmust használó ANN Gél elektroforézis N-acetil-glükózamin Streptococcus pneumoniae hexózaminidáz, rekombináns E. coli-ban Hidrofil interakciós kromatográfia Heurisztikus módszer
2 Rövidítések és jelölésjegyzék HPAEC-PAD Pulzáló amperometriás detektálású magas pH-jú anioncserés kromatográfia HPLC High performance liquid chromatography: nagyhatékonyságú folyadék kromatográfia i.d. Inner diameter: belső átmérő IgG Immunglobulin G JBM Kardbab mannozidáz KKK Lizin aminosavakból álló tripeptid LAC Lektin affinitás kromatográfia LAE Lektin affinitás elektroforézis Kapilláris effektív hossza (injektálástól a detektálás helyéig) LD LED Light emitting diode: fényemittáló dióda LIF Lézer indukált fluoreszcenciás detektálás LM Levenberg-Marquardt training algorithm ANN: Levenberg-Marquardt tanulási algoritmust használó ANN Kapilláris teljes hossza LT m Levenberg-Marquardt együttható M Moláris tömeg, molekulatömeg MAH Maackia amurensis hemagglutinin MALDI-TOF-MS Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry: mátrixszal segített lézer deszorpció ionizációs repülési idő tömegspektrometria Man Mannóz MEKC Micelláris elektrokinetikus kromatográfia MLR Multiple linear regression: többszörös lineáris regresszió MR Molar refractivity: moláris refrakció MS Tömegspektrometria n Aminosav alkotók száma N Elméleti tányérszám NAN1 Rekombináns szialidáz Neu5Ac N-acetil-neuraminsav NeuNAc N-acetil-neuraminsav NeuNGc N-glikolil-neuraminsav NP-HPLC Normál fázisú HPLC NMR Mag mágneses rezonancia spektroszkópia 90. percentilis P90 PE Papír elektroforézis pk Protonálódási állandó pK Disszociációs állandó PNGaseF Peptid-N-glikozidáz F enzim PTM Post-translational modification: poszt-transzlációs módosulás Q Effektív töltés QSPR Quantitative structure-property relationship: mennyiségi szerkezet-tulajdonság összefüggés R Stokes-féle hidrodinamikai sugár r² Korrelációs együttható RBF-ANN Radial basis function artificial neural network RNaseB Ribonukleáz B RP-HPLC Fordított fázisú HPLC SD Standard deviáció (rövidítés) SE Standard hiba SNA Sambucus nigra agglutinin SPG Streptococcus pneumoniae béta-galaktozidáz SSS Szerin aminosavakból álló tripeptid SVR Support vector regression t Migrációs idő T Hőmérséklet T-CORG Kísérleti fázis: Hőmérséklet – szerves oldószer koncentráció
3 Rövidítések és jelölésjegyzék tEOF TVSE U UEA-I v w WAX-HPLC WGA YYY ZE η µef σ
EOF marker migrációs ideje Two variable semi-empirical model: kétváltozós szemi-empirikus modell Alkalmazott feszültség Ulex europeaus I agglutinin Elektroforetikus migrációs sebesség Súlytényező (ANN csomópontjainál) Gyenge anion-cserélő HPLC Wheat germ agglutinin: búzacsíra agglutinin (lektin) Tirozin aminosavakból álló tripeptid Zóna elektroforézis Dinamikai viszkozitás Effektív elektroforetikus mobilitás Standard deviáció (jelölés)
4 Bevezetés „Mily boldog, ki a dolgok okát ismerni tanulta…” Vergilius: Georgica
Bevezetés Napjainkban a biológiai minták analízise érdekes kihívásokat és lehetőségeket kínál a tudomány és a technológia számára. A biológiai rendszerek komplex folyamatainak mélyreható megismeréséhez új módszerek és anyagok – melyek igen kis mintamennyiségek gyors, hatékony és megbízható analízisét biztosítani tudják – fejlesztése iránt folyamatos az igény. A XX. század második felében sikerült a teljes humán genomot feltérképezni. A nukleotid polimorfizmusok (mint SNP: egypontos nukleotid polimorfizmusok, singlenucleotide
polymorphism)
vizsgálatára
hatékony
automatizált
RFLP
(restrikciós
fragmenthossz-polimorfizmus, restriction fragment length polymorphism) vagy PCR (polimeráz-láncreakció, polymerase chain reaction) alapú elektroforetikus (lap gél elektroforézis vagy kapilláris gél elektroforézis) analitikai módszerek állnak rendelkezésre. A fehérje szintézis során a nukleotidok sorrendje egyértelműen meghatározza a képződő polipeptid lánc aminosav sorrendjét, ugyanakkor még mindig távol állunk attól, hogy a biológiai folyamatokat, azok összefüggéseit, rendszerüket teljes körűen ismerjük. A biológiai aktivitást számos tényező befolyásolja, ilyenek például a ko- és poszt-transzlációs módosulások, egyéb a szabályozásban részt vevő molekulák jelenléte. Az új, korszerű, nagyhatékonyságú bioanalitikai módszerek segítséget nyújthatnak az élő szervezeteket felépítő molekulák és azok komplex összefüggéseinek megismerésében, elvezetve a genomikai érából a proteomika és metabolomika korszakába, új perspektívákat nyitva a modern rendszerbiológia, élettudományok, biotechnológia és biofarmakológia előtt. Ugyanakkor a bioinformatika eszköztára nélkülözhetetlen az adatok feldolgozásához és összefüggéseik megértéséhez, interpretálásához. Munkám célja analitikai módszer kidolgozása volt fehérjék glikozilációjának vizsgálatára, elsősorban a komplexebb szerkezetű N-glikoziláció szénhidrát szerkezeteinek analízisére. A kidolgozott metodológia hatékony eszköz lehet a biotechnológia, biofarmakológia és a biomarker kutatások számára egyaránt. Megvizsgáltam továbbá a kapilláris zóna elektroforézises peptid elválasztások előrejelzésére szolgáló modelleket, abból a célból, hogy a nagyhatékonyságú elválasztások egyszerűen optimalizálhatóak, megbízhatóan tervezhetőek legyenek. Lehetővé téve fehérjék emésztményekből való bottom-up azonosítását on-line tömegspektrométerrel kapcsolva (peptide mass fingerprinting: a fehérjék azonosítása a peptidek tömegei alapján, ismert fehérje szekvenciákon vagy akár a genom nukleotid
5 Bevezetés sorrendjén alapuló adatbázisokkal korreláltatva). A módszer a hatékonyság (elméleti tányérszám) jelentős növelésével jó alternatívát kínálhat a széles körben alkalmazott fordított fázisú kromatográfiás (RP-HPLC-ESI-MS) módszerekkel szemben. A dolgozat első része a téma irodalmát ismerteti. Bemutatom a fehérjék glikozilációjának vizsgálatára alkalmazott ismert analitikai módszereket, a fontosabb eljárások kritikai értékelésével. Az érzékeny fluoreszcens detektálású módszerek értékelésére különös figyelmet szentelek. Részletesen ismertetem a glikoproteinek szelektív izolációjára és dúsítására szolgáló affinitás kromatográfia alapú módszereket is. Az irodalmi összefoglalás második felében a kapilláris zóna elektroforézisen alapuló peptid elválasztások területén kidolgozott modellezési metodológiákat tekintem át, melyeket a peptidek elektroforetikus mobilitásának becslésére alkalmaznak. Értékelem az egyes modelleket azok pontossága és megbízhatósága alapján. A dolgozat második felében bemutatom az alkalmazott módszertant, a glikoproteinek szénhidrát alkotóinak vizsgálataihoz felhasznált eszközöket és anyagokat, valamint a peptidek kapilláris elektroforézises elválasztásainak modellezésére kidolgozott újszerű paraméter vezérelt megközelítést. Majd az eredmények részletes bemutatása zárja a dolgozatot. Ismertetem a kidolgozott bioanalitikai módszerrel elért eredményeket, melyek a glikoproteinek szénhidrát alkotóinak hatékony elemzését teszik lehetővé, akár olyan komplex mintákból is, mint a humán szérum. Megvizsgálom a preparatív affinitás kromatográfiás glikoprotein izoláció hőmérséklet függését, hogy a komplex biológiai mintákból maximális kihozatallal kinyerhetőek legyenek a vizsgálat szempontjából fontos komponensek. Demonstrálom, hogy boronsav - lektin affinitás kromatográfiás glikoprotein dúsítással kombinálva a módszer hatékonysága (az azonosítható glikán szerkezetek száma és azok intenzitása) még tovább növelhető. Végül ismertetem a peptid elválasztások modellezésének eredményeit. Jól megválasztott minta peptidek felhasználásával, és az elválasztás körülményeinek szisztematikus változtatásával kiterjedt kísérleti adatbázist hoztunk létre. A kísérleti adatbázis alapján nem-lineáris modellezési technikák, mint a mesterséges neurális hálózatok, alkalmazásával sikerült megbízható modellt alkotni az elektroforetikus mobilitás előrejelzésére még az olyan komplex hatások esetén is, mint a háttér elektrolit szerves adalékanyag tartalma és az elválasztás hőmérséklete.
6 Analitikai elválasztásokon alapuló glikán vizsgálatok fluoreszcens jelöléssel
1 Irodalmi összefoglaló 1.1 Analitikai elválasztásokon alapuló glikán vizsgálatok fluoreszcens jelöléssel A glikoproteinek szénhidrát alkotóinak sokoldalú biológiai szerepének megismerésére napjainkban egyre növekvő tudományos érdeklődés tapasztalható. A glikoproteinek mikroheterogenitásainak a biológiai felismerésben, receptor - ligandum kölcsönhatásokban vagy a sejt-sejt interakciókban, az immunogenitás modulálásában és a fehérjék harmadlagos és negyedleges szerkezetének kialakításában, valamint a bioaktivitás szabályozásában játszott szerepének megismerése különös jelentőséggel bír2. A biofarmakológia rekombináns glikoproteinek iránt támasztott igényei megkövetelik a nagy felbontású, reprodukálható analitikai módszerek kidolgozását a glikoziláció vizsgálatára. A biotechnológiai iparban a rekombináns glikoproteinek fermentációs folyamatának csekély megváltozása a glikoziláció jelentős megváltozásához vezethet, ami a termék farmakológiai alkalmazhatóságát is befolyásolja3. A humán vérkészítmények glikoprotein tartalmának vizsgálata, különösen a glikoziláció különböző megbetegedések következtében bekövetkező megváltozásának megértése, szintén nagy jelentőséggel bír, elsősorban a biomarker kutatás területén4. A glikoproteinek és/vagy glikopeptidek profiljának, szekvenciájának és kapcsolódásának részletes leírása a betegségekkel összefüggő elváltozások megismerése szempontjából kulcsfontosságú5. A fehérjék glikozilációjának megváltozása sok esetben közvetlen kapcsolatba hozható valamely betegséggel, sőt akár a betegség valamely stádiumával is. Az O-glikánok csonkolt formái, az N-glikánok elágazásainak számának növekedése, vagy a túlzott szialiláció, szulfatáció és fukoziláció egyaránt példák a szabálytalan glikozilációs mintázatokra, melyek feltehetőleg kóros elváltozásokkal állnak összefüggésben6. A glikoprotein analízis a biofarmakológiai ipar számára alapvető fontosságú, mivel a különböző
szerkezetű
glikánok
a
termék
hatékonyságát
és
biztonságát
egyaránt
befolyásolhatják. Ugyanakkor a felszabadított glikánok vizsgálata jelenti a legnagyobb kihívást, mivel természetüknél fogva igen komplex molekulák, nem tartalmaznak kromofór csoportokat és számos izomorf módosulatuk létezik (a kötések típusa és a monomer egységek pozícionális elhelyezkedése alapján). Sőt szinte minden glikoprotein különbözően glikozilált variánsok heterogén keverékéből áll, ezért a felszabadított glikánok számos eltérő szénhidrát
7 Irodalmi összefoglaló szerkezetet tartalmaznak. A vizsgálni kívánt különböző glikozilációk nagy komplexitása számos bioanalitikai eszköz alkalmazását követeli meg a glikoproteinek szénhidrát részleteinek jellemzésére2. E módszerek közül elsősorban a nagyhatékonyságú folyadék kromatográfiát
(HPLC)7-8,
tömegspektrometriát
10
(MS)9,
magmágneses
rezonancia
11
spektroszkópiát (NMR) , poliakrilamid gél elektroforézist (PAGE) , mátrix asszisztált lézer deszorpciós ionizációjú repülési idő tömegspektrometriát (MALDI-TOF-MS: matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry)12-13 és kapilláris elektroforézist (CE)14-17 vagy kapilláris izoelektromos fókuszálást (CIEF)18 érdemes kiemelni. A fenti módszerek némelyikének csatolt technikái, mint az LC-MS vagy CE-MS a szénhidrát analízis számára bíztató lehetőségeket kínálnak5,11,19. A normál fázisú (NP: normal phase) kromatográfia és a kapilláris gél elektroforézis (CGE) egyaránt kiváló szelektivitást kínál a fluoreszcens jelölésű glikánok analízisére. A normál fázisú kromatográfiás módszer érzékeny, megbízható, széles körben elfogadott és alkalmazott. A szerkezetek azonosítására relatív retenciós idejük alapján adatbázisok is rendelkezésre állnak. A lézer indukált fluoreszcenciás kapilláris gél elektroforézis (CGE-LIF) gyorsabb elemzést tesz lehetővé, mint a HPLC, azonban egyelőre megfelelő adatbázis nem áll rendelkezésre, amellyel a mobilitások alapján a szerkezet azonosítható lenne. Ezért az adatokat más analitikai technikák segítségével, mint a normál fázisú kromatográfia vagy tömegspektrometria, szükséges korreláltatni a módszerfejlesztés és validálás során.
1.1.1 A glikán analízis jelentősége A fehérje szintézis során a polipeptid lánc kialakulásával egyidejűleg (ko-transzlációs modifikáció, CTM: co-translational modification), illetve transzlációt követően (poszttranszlációs modifikáció, PTM: post-translational modification) a molekulák további szerkezeti átalakuláson mehetnek keresztül különböző módokon. Ezek a módosulások alapvető változásokat eredményeznek a fehérje tulajdonságaiban, ideértve az élettartamukat illetve biológiai receptor specifikusságukat. A biofarmakológiai termékek jelentős része glikoprotein (például az antitestek), ahol az előállítás üzemi körülményei (közeg, pH, hőmérséklet, … stb.) a glikozilációs mintázatot alapvetően befolyásolhatják, és ezáltal az igen fontos effektor funkciót (glikozilációs kötőhelyek borítottsága, elágazottság mértéke, szialiláció mértéke, kötések sorrendje, … stb.). Ennek következtében a végső termék hatékonysága, immunogenitása, lebomlási ideje is módosul. A biofarmakológiai vállalatok számára jogszabályi előírás a szénhidrát alkotók analízise egy-egy új termék bejegyzését
8 Analitikai elválasztásokon alapuló glikán vizsgálatok fluoreszcens jelöléssel megelőzően. A Nemzetközi Harmonizációs Konferencia (ICH: International Conference on Harmonization) előírásainak megfelelően a szerkezeti jellemzés részeként a szénhidrát szerkezet megadása is szükséges (ICH Függelék a Fizikai-kémiai Jellemzésről)20, melynek magában kell foglalnia a szénhidrát tartalom meghatározását (semleges cukrok, amino-cukrok és sziálsavak), a szénhidrát láncok szerkezetét, oligoszacharid mintázatot (antennás profilt) és a glikozilációs helyeket a polipeptid láncon, melyet a lehető legrészletesebben szükséges vizsgálni.
1.1.2 Elemzési módok Emlős sejtekben a glikoziláció kapcsán két gyakori modifikációt különböztetünk meg: az N-glikánokat (CTM), melyek az aszparagin (Asn) oldalláncok amin-nitrogénjén keresztül kapcsolódnak (Asn-X, ahol X nem prolin, treonin vagy szerin); illetve O-glikánokat (PTM), melyek a szerin (Ser), treonin (Thr), hidroxilizin és hidroxiprolin oldalláncain található hidroxil oxigén atomon keresztül kapcsolódhatnak. A tárgyalt módszerek alapvetően az Nglikánok analízisére szolgálnak, bár az O-glikoziláció vizsgálatára is alkalmasak ezek az analitikai technikák21. A glikoproteinek szénhidrát szerkezeteinek nagy komplexitása okán jellemzésükre általában számos bioanalitikai technika alkalmazása szükséges. E módszerek magukban foglalják az enzimreakciókat, kromatográfiát, tömegspektrometiát (MS), mag mágneses rezonancia spektroszkópiát (NMR), poliakrilamid lap gél elektroforézist (PAGE), nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás technikákat (HPLC), ideértve magas pH-jú anioncserélő kromatográfiát pulzáló amperometriás detektálással (HPAEC-PAD) és a kapilláris elektroforézist (CE)2,7,10,13,22-23. A fenti módszerek némelyikének csatolt technikái, mint az LC-MS vagy CE-MS a szénhidrát analízis számára bíztató lehetőségeket kínálnak5,11,19. A glikoproteinek, glikopeptidek és glikánok vizsgálatának jelentősebb analitikai módszereit az 1. ábra foglalja össze. Napjainkban a biofarmakológiai glikozilációs profilokat legáltalánosabban a glikánok fehérjevázról történő kémiai (például hidrazinolízis által) vagy enzimatikus (pl. peptid-Nglikozidáz F) lehasítását követően határozzák meg. Ezután a szabaddá tett glikánokat megtisztítják a nem-szénhidrát szennyező-komponensektől. A tömegspektrometria, mint a MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization) /SELDI (surface enhanced laser desorption/ionization)-TOF (time-of-flight) kombinációja ESI-MS (elektron spray ionizációs tömegspektrometria) technikával részletes szerkezeti információkat nyújthat rövid analízisidők mellett24-27. Ugyanakkor az MS adatok igen
9 Irodalmi összefoglaló összetettek lehetnek és megfelelő feldolgozásuk, interpretációjuk nagy szakértelmet és gyakorlatot igényel. Ráadásul, a tömegspektrometriás mennyiségi meghatározás nem mindig megbízható, és bizonyos minták esetében izobarikus (azonos molekulatömegű) glikánok átlapoló jelei is nehézségeket okozhatnak. E problémák többségét leküzdhetjük, ha a tömegspektrometriás vizsgálatokat elválasztás alapú elemzéssel, és a glikánok exoglikozidáz emésztéses fragmentációjával kombináljuk.
1. ábra: A glikoprotein-analízis leggyakoribb megközelítési módjai
Mivel a szénhidrátok nem tartalmaznak kromofór és/vagy fluorofór csoportokat/részeket, a nagy felbontású bioszeparációs technikáknál, mint a fordított fázisú HPLC (RP-HPLC) vagy CE, széles körben alkalmazott UV és fluoreszcens detektorok nem alkalmazhatóak az elválasztást megelőző derivatizálás nélkül. A HPLC nagyhatékonyságú anion-cserélő kromatográfiás oszlopokkal, pulzáló amperometriás detektálással (HPAEC-PAD: high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection) széles körben bevált módszer a biofarmakológiai glikán profilozásra. Általában jelöletlen vagy redukált glikánok vizsgálatára alkalmazzák, és igen jó elválasztást tesz lehetővé töltéssel nem rendelkező és anionos glikánok esetén egyaránt. Azonban az elmúlt évtized során sok glikoprofilozást végző laboratóriumban fluorofór jelölésű glikánok fluoreszcens detektálású
10 Analitikai elválasztásokon alapuló glikán vizsgálatok fluoreszcens jelöléssel HPLC analízisével váltották fel. Utóbbi jóval nagyobb érzékenységet biztosít, és különböző állófázisokkal kivitelezhető, ortogonális elválasztást is lehetővé tesz. A lézer indukált fluoreszcenciás detektálású kapilláris gél elektroforézis (CGE-LIF) jelentős potenciállal rendelkezik a glikán profilozás területén, és az elmúlt években egyre elterjedtebben alkalmazzák. Kapilláris elektroforézises analízishez leggyakrabban alkalmazott fluoreszcens jelölőanyagok a 8-aminonaftalin-1,3,6-triszufonsav (ANTS) és a 8-aminopirén1,3,6-triszulfonsav (APTS)15,28-30, melyek kiváló fluoreszcenciás tulajdonságokkal és a hatékony elválasztáshoz szükséges töltéssel egyaránt rendelkeznek. Így a jelölt szénhidrátok elemzése hagyományos kapilláris elektroforézis készülékkel31, kapilláris-sor elektroforézissel (capillary array electrophoresis)32 vagy mikrofluidikai (chip alapú) formában33 egyaránt elvégezhető. Sőt a Beckman Coulter (Fullerton, CA, USA) cég egy igen egyszerűen használható készletet is kifejlesztett a PA800 ProteomeLab™ készülékéhez. A kit 8aminopirén-1,3,6-triszulfonát (APTS) fluoreszcens jelölőanyagot, bevont (coated) kapillárist, gél elektrolitot és megfelelő standardokat egyaránt tartalmaz. A standardokat és a mintákhoz a módszereket előre elkészítve, az adatok kiértékelésére készen kapják a felhasználók. 1.1.2.1 HPLC-fluoreszcencia A szerkezetvizsgálat HPLC stratégiája a lehasított, fluoreszcens jelölésű glikánok a 2. ábra által bemutatott három különböző kromatográfiás eljárásra, illetve ezek kombinációira épül. A szerkezetvizsgálatok túlnyomó részében a normál fázisú (NP: normal phase) oszlopokat alkalmazzák hidrofil interakció folyadék kromatográfiás (HILIC: hydrophilic interaction liquid chromatography) módban. Ugyanakkor a módszer, előfrakcionálási lépésként, gyenge anion-cserélő (WAX: weak anion exchanger) kromatográfiával kombinálva (töltés alapján történő frakcionálással), vagy fordított fázisú (RP: reversed phase) kromatográfia segítségével, bizonyos kapcsolódási sorrendek megkülönböztetésére (kétágú N-acetilglükózamin (GlcNAc) azonosításával) is használható. Tehát, alapvetően a kérdéses minta komplexitása határozza meg a kiválasztott elemzési eljárást34.
2. ábra: A HPLC alapú glikán szekvenálási lehetőségek sematikus összefoglalása
11 Irodalmi összefoglaló Az ismeretlen minták kiértékeléséhez a relatív skálaként különböző polimerizáció fokú glükóz (NP), arabinóz (RP), vagy ismert töltésű glikánok (WAX) „létráját” futtatják meg. A standardok futtatása ugyanakkor a rendszer stabilitásának ellenőrzését is szolgálja egyben. Az analízis után a skáláról interpolálva minden egyes csúcshoz hozzárendelhetünk egy megfelelő glükóz egységet (GU), arabinóz egységet (AU) vagy töltés értéket. Ezeket az adatokat az adatbázisok35-37
értékeivel
összevetve
lehetőség
nyílik
a
potenciális
szerkezetek
meghatározására. A normál fázisú elválasztásokhoz amid oszlopokat használnak, melynek poláris funkciós csoportjai a cukrok hidroxil csoportjaival kölcsönhatásba lépnek. A mintákat nagy szerves oldószer tartalmú mozgófázissal viszik fel az oszlopra, ahol az állófázison adszorbeálódnak. Ezt követően vizes fázisú gradienssel kerülnek elúcióra hidrofilitásuk szerinti sorrendben. Ez azt jelenti, hogy általánosságban a nagyobb méretű oligoszacharidok nagyobb hidrofilitásúak, és nagyobb mennyiségű vizes fázist igényelnek az elúcióhoz. Ezt a módszert számos biológiai szempontból jelentős molekula jellemzésére sikerrel alkalmazták21,38-39. A vizsgálatok során leggyakrabban alkalmazott fluoreszcens jelölőanyagok a 2-amino-benzamid (2-AB), 2-aminobenzoesav (2-AA) és a 2-aminopiridin (2-AP), melyeket reduktív aminálással kapcsolnak a mintamolekulákhoz. 1.1.2.2 Kapilláris gél elektroforézis lézer indukált fluoreszcenciás detektálással (CGE-LIF) A lézer indukált fluoreszcenciás detektálású kapilláris gél elektroforetikus (CGE-LIF) oligoszacharid elválasztások gyors, hatékony analízist tesznek lehetővé, mely általában 15 percnél is rövidebb analízisidőt igényel. Leggyakrabban 8-aminopirén-1,3,6-triszulfonát fluoreszcens jelölést (λex: 455 nm) alkalmaznak reduktív aminálással az N-glikánok vizsgálatára. Az APTS jelölést számos publikációban sikeresen alkalmazták különböző oligoszacharidok CGE-LIF analízisére14-15,28,33,40-42. Az elválasztásokat gyakran semleges bevonatú (PVA coated, poli-vinil-alkohollal bevont) kapillárisokban kivitelezik az elektroozmotikus áramlás és a nem-specifikus fali interakciók visszaszorítása érdekében. A háttér elektrolit (BGE: background electrolyte) enyhén savas kémhatású (pH ~4,75) acetát puffer, mely 0,1% polietilén-oxid gélt is tartalmaz. Az oligoszacharidok a töltés-tömeg arányuknak megfelelően válnak el a rendszerben anódikus detektálással (fordított polaritás). A több savas csoportot tartalmazó molekulák rövidebb migrációs időket eredményeznek, ezért a migrációs idők változásai alapján a molekulában a sziálsavas csoportok száma könnyen monitorozható. A gél tartalmú futtató puffer szűrő hatásának köszönhetően tovább javítja az elválasztás
hatékonyságát.
Exoglikozidáz
emésztést
is
alkalmazva
a
szénhidrát
12 Analitikai elválasztásokon alapuló glikán vizsgálatok fluoreszcens jelöléssel szekvenáláshoz, fontos a maradék reagálatlan APTS eltávolítása az emésztés előtt, mivel bizonyos exoglikozidázok aktivitását gátolja, amire Callewaert és munkatársai ismertettek egy módszert41.
1.1.3 Exoglikozidázok
Az exoglikozidáz enzimek alkalmazása az oligoszacharidok szekvenciájának és
kapcsolódási
sorrendjének
megismerésére
elválasztás
és
tömegspektrometria
alapú
megközelítéssel egyaránt kézenfekvő módszer. Ezek az enzimek az oligoszacharid szerkezet jól meghatározott kötéseit hasítják szisztematikusan, ahogy a 3. ábra is mutatja (újranyomva 43
hivatkozásból). Az emésztetlen minta elemzését követően az egyes glikán szerkezeteket
különböző enzimek keverékeinek sorozatával progresszív módon lebontják. Minden egyes emésztési lépés végeztével a mintából az enzimeket eltávolítják, és a terméket újra elemzik. Az eredeti retenciós illetve migrációs időhöz képest a csúcs eltolódásából a szénhidrát szerkezete visszakövethető. A leggyakrabban alkalmazott exoglikozidázokat (3. ábra) az alábbi felsorolás tartalmazza: •
ABS (Arthrobacter ureafaciens szialidáz): α2-6, α2-3 és α2-8 kapcsolódású nemredukáló terminális savakat, N-acetil-neuraminsavat (NeuNAc) és N-glikolilneuraminsavat (NeuNGc) szabadítja fel.
•
NAN1 (rekombináns szialidáz): felszabadítja az α2-3 kapcsolódású nem-redukáló terminális sziálsav csoportokat (NeuNAc és NeuNGc).
•
AMF (mandula alfa-fukozidáz): α1-3 és α1-4 kapcsolódású nem-redukáló terminális fukóz csoportokat hasítja le. A belső (core) α1-6 kapcsolódású fukózt nem hasítja.
•
BKF (szarvasmarha vese alfa-fukozidáz): α1-2 és α1-6 kapcsolódású nem-redukáló terminális fukóz csoportokat hasítja le hatékonyabban, mint az α1-3 és α1-4 kötésű fukózt. A belső (core) α1-6 fukózt is felszabadítja.
•
BTG (szarvasmarha ivari béta-galaktozidáz): nem-redukáló terminális galaktóz β1-3 és β1-4 kötéseit hidrolizálja.
•
SPG (Streptococcus pneumoniae béta-galaktozidáz): nem-redukáló terminális galaktóz β1-4 kötéseit hidrolizálja.
•
CBG (kávébab alfa-galaktozidáz): α1-3 és α1-4 galaktózt hidrolizálja.
•
GUH (Streptococcus pneumoniae hexózaminidáz, rekombináns E. coli-ban): β-Nacetil-glükózamint (GlcNAc) szabadítja fel, de a β1-4 kötéssel mannózhoz kapcsolódó GlcNAc-t nem.
13 Irodalmi összefoglaló •
JBM (kardbab mannozidáz): α1-2, α1-3 és α1-6 kapcsolódású mannózt távolítja el.
3. ábra: Az általánosan alkalmazott exoglikozidáz enzimek hasítási helyei
Mind a normál fázisú HILIC, mind a CGE-LIF elválasztások kiváló felbontóképességgel rendelkeznek, ugyanakkor az analízis idő egy nagyságrenddel alacsonyabb a kapilláris elektroforetikus módszerrel, ahol 15 perc alatt kivitelezhetők az elválasztások szemben a 2-3 órás kromatográfiás futásokkal. Azonban a normál fázisú kromatográfiás elválasztás előnye, hogy nagyobb az érzékenysége és a dinamikus működési tartománya a módszernek, így a főés mellékkomponensek egyazon mintából jól detektálhatók. Rudd és munkatársai egy komparatív munka keretében értékelték a módszerek precizitását standard glükóz oligoszacharidok létráját használva mintaként43. Úgy találták, hogy mindkét módszer nagy pontosságú, a retenciós illetve migrációs idők mindkét esetben az elfogadhatónak mondható 2% alatti relatív standard deviáció (RSD) értékeket adtak. A mérések reprodukálhatósága glükóz egységekre normalizált migrációs/retenciós idők esetén 0,2 és 0,3% RSD értékeket eredményezett CGE-LIF illetve NP-HPLC módszerekkel, míg a normalizált csúcsterületek mindkét esetben 3% RSD értéket adtak. Az analitikai elválasztások érzékenység területén is kiválónak bizonyultak. A normál fázisú kromatográfia kimutathatósági határa (LOD: limit of detection) 7,8 ng/ml értéknek adódott, ahol a fő glikoformok még 3:1 jel-zaj aránnyal detektálhatóak, míg a mennyiségi meghatározás
határa
(LOQ:
limit
of
quantification)
26
ng/ml
értéket
adott.
Összehasonlításként, ugyanezek az adatok CGE-LIF analízis esetén 0,45 µg/ml (LOD) és 1,37 µg/ml (LOQ) értékre módosulnak. A CGE-LIF módszer legjelentősebb hátránya a NP-HPLC elválasztásokkal összevetve a némileg kisebb lineáris működési tartomány (1,4-2,5 µg/ml).
14 Analitikai elválasztásokon alapuló glikán vizsgálatok fluoreszcens jelöléssel Az elválasztási módszerekkel a glikánok szerkezetének meghatározására is lehetőség nyílik tisztított standardok alkalmazásával. Ugyan az összehasonlításhoz teljes glikán könyvtárra lenne szükség, hogy az összes lehetséges szerkezeti variánst figyelembe vegyük. NP-HPLC esetében adatbázisok segítséget nyújtanak ebben, így nem szükséges minden esetben a teljes könyvtár beszerzése, illetve megfuttatása a készüléken. Az ilyen adatbázisok összeállítása jelentős munkaigényű, és függ a rendszer stabilitásától. CGE-LIF analízisekhez napjainkban adatbázisok nem állnak rendelkezésre, így a migrációs tulajdonságokat tisztított standardok elektroferogramjai alapján vagy más analitikai módszerekkel (NP-HPLC, MS) korreláltatva van lehetőség kiértékelni. Ugyanakkor mindkét esetben, amennyiben lehetőség van rá, a szerkezetet több megközelítéssel is igazolni szükséges, pl. glükóz egységekből álló oligoszaccharid létrával és exoglikozidáz emésztéssel, valamint tömegspektrometriásan egyaránt. A CGE-LIF analízishez elméletileg akár 96 minta párhuzamos előkészítésére (96 well plate formátumban) is lehetőség van, és az elemzés során az injektálás is történhet a plate-ről. A legjobb eredmény elérése érdekében az APTS jelölési reakcióhoz, a reagenseket egész éjszakán át szükséges sötétben inkubálni reduktív atmoszférában. Ugyan a minták és a megfelelő emésztmények analíziséhez szükséges idő a 15 percet sem éri el általában, a jelölési és enzimemésztési lépések a teljes analízis időt két napra növelik (azonban akár 96 mintát is elemezhetünk ez idő alatt). Összegzésként elmondható, hogy az ismertetett analitikai elválasztások egyaránt alkalmasak komplex N-glikánok szénhidrát láncainak szerkezetvizsgálatára. A fluoreszcens detektálású HPLC módszer nagy érzékenységű, robosztus és megbízható eszköz a glikánok mélyreható szerkezeti jellemzésére. A rendelkezésre álló adatbázisok megkönnyítik a munkát, mivel nem szükséges nagyszámú standardot minden elemzés során megfuttatni a kiértékeléshez. Ugyanakkor a módszer igen időigényes, mivel egy-egy elválasztás több mint két órát vesz igénybe. Ezzel szemben a CGE-LIF igen hatékony, gyors analízist tesz lehetővé, gyakran 10 percnél is rövidebb elválasztásokkal. Ugyanakkor a fluoreszcens jelölés 10 órás inkubálást igényel a reakció tökéletes lejátszódásához. A módszer rutinszerű használatához szerkezet meghatározó adatbázis létrehozása és validálása is indokolt lenne, azonban egyelőre ilyen még nem áll rendelkezésre, ugyanakkor minden kétséget kizáróan a közeljövőben már ez a feladat is megoldódik. A CGE-LIF módszer reprodukálhatósága némileg jobb, azonban a lineáris működési tartománya szűkebb, mint a kromatográfiás módszeré. Mindkét módszer lehetővé teszi exoglikozidáz enzim emésztmények analízisét is.
15 Irodalmi összefoglaló
1.2 Affinitás kromatográfiás állófázisok glikoproteinek tisztítására és elválasztására Ismerve a növényi lektinek nagy specifikusságát, nem is lehet meglepő, hogy immobilizált formáik egyre elterjedtebbek a glikoproteinek analízisében. A gyakori lektin immobilizációs technikák a reverzibilis nem-kovalens kötésektől a különböző állófázisokhoz való kovalens kapcsolásokig terjednek. Ebben a fejezetben a lektinek immobilizálási technikáit tekintem át különböző állófázisokon, lektin affinitás kölcsönhatásokon alapuló kromatográfiás és elektroforetikus bioszeparációs módszerekhez. A glikánok a komplex sejtszerveződések közvetítői, melyek jellemzőek a sejt típusára és életszakaszára. Minden élő szervezet tartalmaz változatos szénhidrát szerkezetekkel borított sejteket44, ezért a glikoprotein-analízis a tudományos érdeklődés középpontjában áll. A lektinek nem-immun eredetű fehérje molekulák, melyek szénhidrátokkal specifikus kölcsönhatásokba lépnek anélkül, hogy módosítanák őket. A legtöbb lektin célzottan kapcsolódik a cukor egységekhez, mint az N-acetil-neuraminsav (NeuNAc), N-acetilglükózamin
(GlcNAc),
galaktóz,
fukóz
vagy
mannóz45.
A
növényi
magvakban
nagymennyiségű lektin található, ezért leggyakrabban innen izolálják őket. Feltételezhetőleg a csírázás folyamatában és a magok túlélésében egyaránt fontos szerepük van. Ugyancsak feltételezik, hogy a növényi sejtek felületén a glikoproteinek megkötésében is részt vesznek46. Továbbá állati szervezetekben is jelen vannak lektinek, melyek például a glikoproteinek kiválasztásának szabályozásában játszanak szerepet47. Sőt számos egyéb biológiai funkciót ellátnak a sejtadhézió szabályozásától, a glikoprotein szintézisen át, különböző vérfehérjék szintjének szabályozásáig48. Ugyancsak ismert, hogy a lektinek fontos szerepet töltenek be az immunrendszerben, mivel képesek felismerni a patogénekre jellemző szénhidrátokat49. A szénhidrát felismeréséhez általában megfelelő konformációra van szükség, és gyakran a szomszédos cukoregységek minősége is meghatározó a kölcsönhatás szempontjából. A legtöbb irodalmi forrás feltételezi, hogy a lektinek elsődlegesen monoszacharidokkal alakítanak
ki
kötéseket,
ugyanakkor
tudott,
hogy
összetett
szénhidrátokkal
egy
nagyságrenddel nagyobb affinitást mutatnak50. Gyakran fém-szénhidrát kölcsönhatások is fontos szerepet játszanak a lektinek megkötési folyamatában. Például a mannóz-kötő lektinek krisztallográfiás vizsgálatai kimutatták, hogy a szénhidrát megkötés csak Ca2+ ionok
16 Affinitás kromatográfiás állófázisok glikoproteinek tisztítására és elválasztására jelenlétében játszódik le, míg más típusú lektinek a megfelelő szubsztráttal fémionok hiányában is képesek reagálni51-52. A bioelválasztásoknál leggyakrabban használt lektinek összefoglalását az 1. táblázat tartalmazza53. Ahogy korábban is utaltam rá, lektinek nem kizárólag növényekben fordulnak elő. Néhány állati lektint már a növényi lektinek előtt felfedeztek, azonban ezeket szénhidrátkötő fehérjékként már jó ideje nem alkalmazzák54. Ahogy az 1. táblázatban is látható különböző glikoproteinek és glikopeptidek izolálásához a szénhidrátszerkezettől függően más-más lektinek használata javasolt. Például, a galektinek az N-acetil-laktózamin tartalmú szénhidrátokra specifikusak, melyek az N- és O-glikánokban egyaránt megtalálhatóak55, a földimogyoró agglutinin az O-glikánokra specifikus56, a konkanavalin A (ConA) az N-glikánok oligomannozil mintázatait ismeri fel57, míg az aleuriaaurantia lektin a fukóz tartalmú oligoszacharidok széles skálájához mutat affinitást58. A szénhidrátok felé mutatott nagy specifikusságuk miatt a növényi lektineket különböző glikánvegyületek – glikoproteinek, glikopeptidek, glikolipidek vagy szabad glikánok – tisztításánál előszeretettel alkalmazzák45. Nem kizárólag az széleskörűen alkalmazott egyféle lektinnel végzett affinitás kromatográfiát (LAC, single LAC) ismerjük59-60, hanem különböző lektinek kombinációit multi-LAC (MLAC)61 vagy sorozatos LAC1 formájában is kidolgozták, melyek különösen hasznosak hasonló méretű és töltésű, de eltérő szerkezetű glikánok komplex keverékeinek frakcionálására. Az általános eljárások során a megkötött glikánokat a lektin affinitás oszlopról az egyensúly haptén cukrokkal történő megbontásával eluálják. A LAC
nagyhatékonyságú
folyadékkromatográfiás
(HPLC)
módszerként
alkalmazva,
nagytisztaságú glikán-vegyületeket eredményez a további szerkezetvizsgálatokhoz50.
1. táblázat: A glikopeptidek és oligoszacharidok affinitás kromatográfiájában leggyakrabban használt lektinek Triviális rövidítés
Lektin forrása
Monoszacharid specifitás α-D-mannóz α-D-glükóz α-D-mannóz α-D-mannóz β-D-galaktóz N-acetil- β-D-galaktózamin
Haptén cukor
Megjegyzések a kötésről
α-metil-D-mannozid
Gyenge kötés biantennás glikopeptidekhez, erős a magas mannóz/hibrid típushoz
α-metil-D-mannozid α-metil-D-mannozid
Bi- és triantennás belső L-fukóz tartalmú glikopeptidek Bi- és triantennás belső fukóz tartalmú glikopeptidek
Laktóz
β(1→4) kötésű terminális galaktozil csoportokat tartalmazó glikopeptidek
Konkanavalin A ConA Borsó lektin Lencse lektin
Pisum sativum Lens culinaris
RCA-1
Ricinus communis
L4PHA leukoagglutinin E4PHA erytroagglutinin SNA LTA Lótusz lektin
Phaseolous vulgaris
β-D-galaktóz
Phaseolous vulgaris
β-D-galaktóz
UEA-I
Sambucus nigra Tetragonobulus pupureas Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia 1-34 Ulex europeaus I
β-D-galaktóz α-D-fukóz α-D-galaktóz N- α-acetil-D-galaktózamin α-D-fukóz
HPA
Helix pomatria
N- α-acetil-D-galaktózamin
Jacalin/Jackfruit lektin
Artocarpus integrioflia
α-D-galaktóz
α-D-metil-galaktozid
PNA Földimogyoró lektin
Arachis hypogaea
α-2-N-acetil-galaktózamin β-Gal(1→3)GalNAC
Galaktóz
AAL
Aleuria aurantia
α-D-fukóz
L-fukóz
MAH, MAA, MAL
Maackia amurensis
DSA, DSL
Datura stramonium
GS-I-B4
Canavalia ensiformis
Sziálsav, meghatározott triszacharidok N-acetil-glükózamin
N-acetil-Dgalaktózamin N-acetil-Dgalaktózamin Laktóz Fukóz
Tri- és tetraantennás glikopeptidek Bi- és triantennás glikopeptidek és oligoszacharidok Sziálsav tartalmú glikopeptidek NeuAc-α(2→6)Gal terminális szekvenciával A glikán külső részén fukózt tartalmazó glikopeptidek
Raffinóz
Terminális α-galaktozil csoportot tartalmazó oligoszacharidok
Fukóz N-acetil-Dgalaktózamin
Külső α-L-fukóz csoportot tartalmazó oligoszacharidok Terminális α-GalNAc tartalmú N- és O-kötésű oligoszacharidok nagy affinitással O-α-galaktozil kapcsolódású terminálist tartalmazó glikopeptidek és oligoszacharidok O-β-galaktozil kapcsolódású terminálist tartalmazó glikopeptidek és oligoszacharidok N-acetil-glükózaminhoz α1-6 vagy N-acetil-laktózaminhoz α1-3 kapcsolódású fukóz MAH II csak bizonyos sziálsavat vagy meghatározott triszacharid szerkezeteket tartalmazó szénhidrátokat köt Felismeri a β1-4 kötésű N-acetil-glükózamin oligomereket,
Laktóz Kitin hidrolizát
18 Affinitás kromatográfiás állófázisok glikoproteinek tisztítására és elválasztására
1.2.1 Lektin immobilizálási technikák
A lektinek különböző hordozón történő immobilizálása során olyan felületet alakítanak ki,
mely mind a lektin mind a hordozó anyag fizikai-kémiai jellemzőivel rendelkezik. A maximális stabilitás, és a mintafehérjék nem-specifikus kölcsönhatásainak minimalizálása érdekében ideális esetben a hidrofób kötőhelyeket nem tartalmazó, hidrofil jellegű felszínek az optimálisak. Egy másik szempont a lektin és az állófázis felületének összekapcsolását végző, úgy nevezett linker típusa. Jó linkerrel az immobilizált lektinek a természetes állapotukhoz hasonlóan viselkednek, azaz felismerik és megkötik a célmolekulákat, sztérikus gátlás nem lép fel. A különböző mátrixok jellemzéséről több áttekintő tudományos publikáció is készült62-63. 1.2.1.1 Nem-kovalens immobilizálás
A ConA reverzibilis csatolása hidrofób kölcsönhatással polymyxin B (egy dekapeptid)
felülethez egy jó példa a nem-kovalens lektin immobilizálásra64. Első lépésben a polymyxin B a primer amin csoportjain keresztül kovalens kötéssel egy felületi plazmon rezonanciás (SPR: surface plasmon resonance) érzékelő lemezre került rögzítésre. Az így létrejött felületi réteg képes spontán adszorbeálni a ConA molekulákat erős hidrofób kölcsönhatással (KD=1,9×10-10 M). Érdekes módon azt tapasztalták, hogy az így kapott állófázis nagyobb kötőkapacitással rendelkezik, mint a kovalensen immobilizált forma. A glikozilált lektin indirekt adszorpciója kovalensen kötött lektinekhez egy másik érdekes megközelítés a nem-kovalens immobilizálásra65. Griffonia simplicifolia lektint (GS-I-B4) az aszparaginen keresztül kapcsolódó magasabb rendű mannóz cukorláncaival kötöttek sepharose állófázisra kapcsolt ConA lektinhez, és így oligoszacharidokat választottak el αkötésű D-galaktóz csoportjaik mennyisége alapján. Az eredmények igazolták, hogy a lektin megőrizte glikán kötő képességét a gyors, kényelmes és kvantitatív immobilizálási módszerrel. Hasonló módszerrel immobilizáltak ConA-t fémes kölcsönhatásokkal réz(II)iminoecetsav állófázishoz66. 1.2.1.2 Kovalens immobilizálási technikák
Az immobilizált lektinek az affinitás alapú állófázisok kialakítására glikokonjugáltak67,
felszabadított glikánok68, glikopeptidek69, poliszacharidok, oldható sejtösszetevők, sőt egész sejtek elválasztására, izolálására egyaránt70 nagy potenciállal rendelkeznek. Ugyanakkor gyakran csak laboratóriumi méretekben sikerült a módszert kidolgozni, aminek az oka
19 Irodalmi összefoglaló elsősorban az agaróz hordozóban keresendő. Ez a legáltalánosabban használt hordozó a lektinek immobilizálására, azonban mind a kémiai, biológiai és mechanikai stabilitása korlátozott71. Egyre növekvő tudományos érdeklődés tapasztalható, az újszerű kovalens immobilizálási technikák iránt, melyek stabilabb hordozóra épülnek. A következőkben a különböző kovalens immobilizálási módszereket tekintem át. A lektin affinitás kromatográfiához, ahogy a publikációk nagy száma is tükrözi, leggyakrabban agarózon immobilizált lektineket használnak1,45,59-61,72-75. Annak ellenére, hogy az alapötlet – az agaróz mint hordozóanyag használata a lektin immobilizálására – azonos, számos különböző reaktív csoportot és kémiai módszert alkalmaznak a cél elérésére. Ennek eredményeként több megfelelő, megbízható aktivált hordozó és metodológia elérhető napjainkban, melyek nagy része könnyen kivitelezhető. Az egyik közkedvelt módszer a lektinek immobilizálására a lektinek amin csoportját használja ki. A kötést három módon lehet kialakítani: • A CNBr hordozó imidokarbonát csoportjának reagáltatása az amin csoporttal haptén cukor jelenlétében, ami a lektin szénhidrát-kötőhelyét megvédi76; •
N-hidroxi-szuccuinimid-észter reagáltatása az amin csoporttal76;
• Schiff-bázis képzés a formil- és amin csoportok közt, amit nátrium-cianoborohidriddel való redukálás követ, alkil-amidot képezve77. A legtöbb affinitás kromatográfiában használt lektin agaróz gélhez kötve napjainkban már kereskedelemből beszerezhető, és megfelelő oszlopba töltés után használatra kész. A szilika tresyl aktiválását már az 1980-as évek elején kidolgozták enzimek és affinitás ligandumok immobilizálására78, és mind a mai napig széles körben alkalmazzák lektinnel bevont szilika affinitás állófázisok kialakítására. Általában a szilikát szilanilálják 3merkaptopropil-trimetoxiszilánnal szobahőmérsékleten enyhe körülmények között. A tresylált szilikára a lektinek immobilizálását 4 órás óvatos keveréssel foszfát pufferben (pH 8,0) valósítják meg, amit Tris-HCl pufferrel (pH 8,0) a megmaradt szabad tresyl csoportok blokkolása követ, stabil oszlopot eredményezve. A lektinek felülethez való kapcsolására 1,1’-karbo-diimidazol derivatizált szilikát is alkalmaznak, mely egy ötlépéses protokollal valósítható meg. A glikoproteinek az aktivált szilikához igen jó hatékonysággal kapcsolhatók enyhe körülmények között79. Az elmúlt években a szilikán való lektin immobilizálási technikákat egyre növekvő a tudományos érdeklődés kísérte. A 3-merkaptopropil-trimetoxiszilánnal derivatizált szilika állófázisokra a fetuin izolálása magzati szarvasmarha szérumból búzacsíra agglutininnel
20 Affinitás kromatográfiás állófázisok glikoproteinek tisztítására és elválasztására (WGA: wheat-germ agglutinin), és a torma peroxidáz (horseradish peroxidase) tisztítása konkanavalin A (ConA: concanavalin A) felhasználásával egyaránt fontos alkalmazások71,80. A magas kihozatali arány és reprodukálhatóság igazolta a szilika alapú állófázisok alkalmazhatóságát LAC elválasztásoknál. Sikerrel
immobilizáltak
lektineket
kereskedelemben
beszerezhető
tresyl-tartalmú
polimereken – mint a Toyopearl AF-Tresyl 650M vagy a TSK gel tresyl-5PW – is, megfelelően
stabil
állófázist
eredményezve
nagyhatékonyságú
lektin
affinitás
kromatográfiához (HPLAC: high performance lectin affinity chromatography)81. Ricinus communis agglutininnel (RCA) sikeresen funkcionalizálták mind a Toyopearl, mind a TSK gel polimer alapú hordozókat. A kapott affinitás kromatográfiás állófázisokat aszialofetuin glikoprotein elválasztásával tesztelték, és az agaróz alapú állófázisokkal összehasonlítva kiváló kihozatalt és adszorpciós kapacitást tapasztaltak. A Toyopearl alapú állófázist alacsony nyomású, nagy specificitású affinitás kromatográfiás glikoprotein analízisre eredményesen használták. A hosszú távú stabilitási vizsgálatok azt mutatták, hogy egyik állófázis kapacitása sem mutatott érzékelhető változást, még 12 hónapos időtartam után sem82. Ugyancsak sikerrel immobilizáltak ConA és WGA lektineket glicidil-metakrilát polimer alapú monolitikus kapilláris oszlopokon nano affinitás folyadék kromatográfiás elválasztásokhoz83. A cellulózt szintén vizsgálták, mint lehetséges mátrixot ConA és WGA immobilizálására84. A lektineket Schiff-bázis képzéssel kapcsolták a hordozóhoz. A kötést közvetlenül a felülethez, illetve hosszú távtartó molekula (spacer: pentaetilén-hexamin) alkalmazásával egyaránt megvalósították. Utóbbi a kiterjedt (bulky) lektinek, mint a ConA, esetén bizonyult különösen előnyösnek. A WGA spacer molekula nélkül is hatékony affinitás kromatográfiás állófázist eredményezett.
1.2.2 Kromatográfiás alkalmazások
A lektin affinitás kromatográfia (LAC) alapelve, amint a 4. ábra is szemlélteti, hasonló az
egyéb
affinitás
kromatográfiás
technikákhoz.
Fehérjekeveréket
választanak
el
kromatográfiásan immobilizált lektin mátrixszal, ami a megfelelő cukorszerkezettel rendelkező glikoproteineket felismeri, míg a többi fehérje megkötődés nélkül elhagyja az oszlopot. A mosást alkalmas mosó pufferrel folytatják, amíg az oszlopról fehérje már nem távozik. Ezt megfelelő detektálási módszerrel (általában UV-Vis vagy fluoreszcencia) monitorozzák. Az adszorbeált glikoproteineket az oszlopról jól megválasztott mozgófázissal, mely leggyakrabban a haptén cukor oldata, eluálják.
21 Irodalmi összefoglaló Az 1990-es években az egyszerű (single) LAC technikát alkalmazták leginkább a glikoproteinek tisztítására. A jól ismert lektint, a ConA-t, használták széles körben a magasabb mannóz szerkezeteket tartalmazó
glikánvegyületek
kromatográfiájához
83,85
affinitás
. Az Artocarpus integrifolia
lektint, vagy közismertebb nevén Jacalint elsősorban O-glikánok izolálására alkalmazzák. A Maackia amurensis hemagglutinin (MAH) fő alkalmazási területei a meghatározott triszacharid szerkezeteket tartalmazó
vegyületek
és
sziálsav
tartalmú
glikoproteinek izolálása86. 1.2.2.1 Sorozatos LAC
A glikánvegyületek elválasztásának hatékonysága
növelése érdekében dolgozták ki a sorozatos lektin 4. ábra: A lektin affinitás kromatográfia (LAC) sémája
affinitás kromatográfiát (SLAC: serial LAC). Endo és munkatársai radioaktív N-glikánokat választottak el,
melyeket hidrazinolízissel szabadítottak fel és nátrium-ciano-borohidriddel redukáltak. A módszert az 5. ábra szemlélteti1. Első lépésben a felszabadított oligoszacharidok keverékének három frakcióját választották el ConA oszlopon. Az első frakciót, mely az N-acetilglükózaminon elágazást nem tartalmazó bi-antennás komplex cukrokból állt, 5 mM koncentrációjú αmetil-glükopiranózzal eluálták (a nyíl az 5. ábra felső kromatogramján). A magasabb mannóz szerkezeteket tartalmazó második frakciót 200 mM koncentrációjú α-metil-mannopiranózzal eluálták (b nyíl az 5. ábra felső kromatogramján). A többi oligoszacharidot a retenciót nem szenvedő frakció tartalmazta (flow through, az első csúcs a kromatogramon). A második affinitás lépést az első frakció esetében
5. ábra: Tríciummal jelölt oligoszacharidok keverékének sorozatos lektin affinitás kromatográfiája1
22 Affinitás kromatográfiás állófázisok glikoproteinek tisztítására és elválasztására alkalmazták. Ezt a frakciót Aleurta aurantia lektin (AAL) Sepharose oszlopra vitték fel, és fukózzal eluálták (c nyíl a 5. ábra jobb középső kromatogramján) a fukozilált szerkezeteket. A retenciót nem szenvedő frakció a nem-fukozilált oligoszacharidokat tartalmazta. A ConA oszlophoz nem kötődő oligoszacharidokat Phytohaemagglutinin E 4 (E4-PHA) oszlopon frakcionálták. Sőt az oszlophoz nem kötődő, tri-antennás komplex cukor izomereket Datura stratmonium agglutinin (DSA) oszlopra is felvitték, és 1% N-acetil-glükózamin oligomerekkel eluálták (d nyíl az 5. ábra bal oldali, alsó kromatogramján)1. A sorozatos LAC koncepcióját komplex glikoproteomikai platformjukhoz, amit szialilált fehérje glikoformok komparatív analízisére dolgoztak ki, Regnier és munkatársai is alkalmazták87. A komplex protokoll tripszin emésztés, sorozatos LAC, belső (internal) standarddal történő kvantifikálás, valamint peptid-N-glikozidáz F (PNGase F) emészéssel deglikozilált peptidek fordított fázisú kromatográfiás (RP-HPLC) frakcionálásának és tandem tömegspektrometriás (MS/MS) peptidszekvenálásnak a kombinációja. A sorozatos LAC-hoz a szerzők Sambucus nigra agglutinin (SNA) és ConA oszlopokat használtak. Novotny és munkatársai szilika alapú sorozatos LAC technikát alkalmaztak mikrooszlopok formájában vérszérum glikoproteinek szelektív dúsítására5. A biológiai folyadékok nagy térfogata a vizsgálatokhoz így lényegesen csökkenthető, a lehetséges mintaveszteségek minimalizálhatók. A különböző glikoproteinek szelektív dúsításához négy különböző lektint tartalmazó szilika állófázist használtak, ezek a ConA, SNA-I, UEA-I és PHA-L voltak. Mikrokromatográfiás sorozatos LAC glikoprotein dúsítási technikájuk nagy előnye a közvetlen
kompatibilitása
kapilláris
folyadékkromatográfiával
és
tandem
tömegspektrometriával (µLC-MS/MS). 1.2.2.2 Multi-LAC
Az átfogó vizsgálatok, azt mutatják, hogy az N- és O-glikánok reprezentálják a teljes
humán szérum fehérje összetételét. A reprezentatív különbségek vizsgálatára Hancock és kollégái kidolgozták az úgy nevezett multi-lektin affinitás kromatográfiát (MLAC) agarózon immobilizált ConA, WGA és Jacalin lektinek felhasználásával. A szérum minták glikozilációs mintázatainak változásait a fehérjék szabályozott elúciójával monitorozták, specifikus haptének alkalmazásával. Az eluált fehérjék triptikus emésztményeit LC-MS/MS analízisnek vetették alá. Módszerük reprodukálhatónak és glikoprotein-specifikusnak bizonyult, ami a proteomikai vizsgálatok széles dinamikus tartományát lefedi61. A szerzők neuramindáz és fukozidáz enzimekkel kezelt humán szérum minták változásainak vizsgálatára is alkalmaztak MLAC oszlopot. Elképzelésük a kezeletlen és
23 Irodalmi összefoglaló módosított humán szérum glikoproteinek összehasonlításán alapult. Az MLAC oszloppal való izolálás lehetővé tette az enzimekkel kezelt glikoproteinek eloszlásának eltolódásának vizsgálatát. Érzékeny módszert eredményezett a humán szérum glikoproteinek sziálsav és fukóz tartalmának változásainak értékelésére72. 1.2.2.3 Monolitikus lektin affinitás oszlopok
A közelmúltban El Rassi és kollégái lektinekkel borított felszínű monolitikus kapilláris
kromatográfiás oszlopokat ismertettek83. ConA-t és WGA-t immobilizáltak két különböző polimeren. Poli-glicidil-metakrilát és etilén-dimetakrilát kopolimert, valamint poli-glicidilmetakrilát, etilén-dimetakrilát és 2-metakriloxi-etil-trimetil-ammónium klorid kopolimerét használták hordozóként, hogy semleges és kationos makropórusos polimer mátrixokat kapjanak. Mindkét immobilizált lektinekkel funkcionalizált monolit erős affinitást mutatott a megfelelő cukor szekvenciát tartalmazó glikoproteinek és oligoszaccharid láncok felé. A semleges, lektinnel borított metakrilát oszlopok ellenállása nyomással vezérelt áramlással szemben nagyobbnak adódott. Az erős affinitás kötés (KD = 10-3 – 10-5) következtében híg minták (~10-8 M) viszonylag nagy térfogatainak injektálására is lehetőség nyílt, így dúsítva majd izolálva a glikánvegyületeket. Ezeket a monolit oszlopokat kétdimenziós elválasztási technika első dimenziójaként alkalmazták, fordított fázisú nanoLC-vel kombinálva. 1.2.2.4 Lektin affinitás alapú glikán profilozás
Hirabayashi és munkatársai kidolgoztak egy lektin affinitáson alapuló glikán profilozási
stratégiát, amit Glyco-catch módszernek neveztek el88-89. A módszerük az következő ötlépéses eljáráson alapul: •
LAC: különböző lektin oszlopok használatával, egyszerű vagy sorozatos technikával, a különböző szénhidrátokat tartalmazó glikoproteinek izolálására.
•
Proteáz
emésztés:
az
izolált
glikoproteinek
glikopeptideket
eredményező
Achromaobacter proteáz enzimes emésztése (lizin specifikus enzim kielégítő hasítási hatékonysággal). •
Második LAC: a cél-glikopeptidek megkötése az első lépésben használt lektin oszloppal.
•
Az izolált glikopeptidek HPLC tisztítása
•
Szekvencia elemzés: disszociációs állandó meghatározás90 és frontális affinitás kromatográfia91.
24 Affinitás kromatográfiás állófázisok glikoproteinek tisztítására és elválasztására 1.2.2.5 Elektroforetikus alkalmazások
A lektin borítású állófázisok kromatográfiás alkalmazásai mellett affinitás elektroforetikus
elválasztások is ismertek. Különböző szénhidrát-szerkezetű α-fetoprotein glikoformok elemzésére alkalmaztak lektin affinitás elektroforézist (LAE)92. A szérum α-fetoproteint különböző karcinómás betegek mintáiból nyerték. A mintákat kétdimenziós LAE, illetve LAC-val csatolt LAE technikákkal vizsgálták. Az α-fetoprotein több mint 10 glikoformját sikerült azonosítani és jellemezni a módszerrel. Ugyanez a kutatócsoport mélyrehatóan vizsgálta a LAE technikát, és bemutatták a lektin-gradiens gél affinitás elektroforézist
93
immuno-enzimatikus detektálással kemilumineszcenciás amplifikációval94. Az α-fetoprotein erythroagglutinating phytohemagglutinin (E4PHA) elválasztásánál a lektin nem csak a specifikus csoportokat ismerte fel, mint az α-L-fukóz vagy β-D-galaktóz, de a teljes oligoszacharid szerkezeteket is, a harmadlagos szerkezet alapján eltérő affinitásokat eredményezve. Az α-fetoprotein egyetlen cukorláncot tartalmaz95, ami a glikoprotein analízisét leegyszerűsíti, mivel viszonylag egyértelműen feleltethetőek meg egymásnak az egyes glikoformok sávjai és a fehérje ismert szénhidrát szerkezetei.
1.2.3 Boronsav és más pszeudo-lektinek
Mivel a cisz-vicinális hidroxil csoportokat tartalmazó szerkezetekkel kötést létesítenek, a
boronsavak pszeudo-lektinnek tekinthetők. Korai munkájukban Hageman és munkatársai vizsgálták a boronsav mátrixok tulajdonságait és alkalmazhatóságát glikoproteinek affinitás kromatográfiájában96. Liang és kollégái boronsavat használtak glikozilált és nem glikozilált borjú alfa-krisztallin elválasztására Glyco Gel B affinitás kromatográfiával97. Arra következtettek, hogy a glikoziláció következtében a borjú alfa-krisztallin harmadlagos szerkezete megbomlik, részlegesen letekeredik, és így elősegíti a szulfhidril oxidációt. Li és munkatársai neoglikoproteineket választottak el nem glikozilált vegyületektől98. A szerzők Tris-HCl puffert használtak árnyékolásként (shielding) a kromatográfiás lépés alatt, ami hatékonynak bizonyult a glikoprotein-boronát kölcsönhatások kiküszöbölésére, míg a szénhidrát-boronát kölcsönhatást csak kissé befolyásolta. Egy másik munka új típusú boronsavval funkcionalizált töltetet ismertet nagyhatékonyságú affinitás kromatográfiához99. A hidrofil, ellenálló, porózus polimer részecskékkel glikált fehérjék, mint a glikált albumin diabéteszes szérum mintákban, mennyiségi analízisét végezték.
25 Irodalmi összefoglaló A lektinek helyettesítésére a fenil-boronsav tartalmú vízoldható polimerek és kismolekulák, mint affinitás ligandumok a magasabb mannóz szerkezetek megkötésére, érdekes szintetikus megközelítést jelentenek. Palanisamy és kollégái a glikoproteinek mannóz csoportjaira szelektív affinitás ligandumot szintetizáltak szilárd fázisú kombinatorikus kémián alapulva, a természetes fehérje-szénhidrát kölcsönhatások modellezésével100. Az 5aminoindánnal bisz-szubsztituált triazin vázból álló 18/18 jelölésű ligandum szelektívnek bizonyult a glükóz oxidáz megkötésére. Az adszorbeált enzimet a 18/18 borítású agaróz gélről 0,5M koncentrációjú α-D-metil-mannozidázzal mennyiségileg eluálták. A szacharid oldatok retenciós időinek összehasonlítása az α-D-mannóz, mannobióz és mannán esetén jelentős visszatartást mutatott, míg az α-L-fukóz kivételével más szacharidoknál nem volt értékelhető retenció. A közelmúltban Hyun és munkatársai állítottak elő csápszerű peptid dimereket, melyek affinitást mutattak a szénhidrátokhoz. E mesterséges lektineknél tapasztalt specifikusság meghaladta a természetes lektinekét, amiből arra következtettek, hogy ezek az anyagok hasznos eszközök lehetnek a sejtfelszíni szénhidrátok terminális monoszacharidjainak megváltozásának detektálására101.
26 Kapilláris zóna elektroforetikus peptid elválasztások modellezése
1.3 Kapilláris zóna elektroforetikus peptid elválasztások modellezése A kapilláris elektroforézis módszerfejlesztés, biológiai mintákból származó nagyszámú peptid analízisére és azonosítására, bonyolult és időigényes feladat. Megfelelő matematikai modell alkalmazásával az ehhez szükséges hosszú idő lerövidíthető, ugyanakkor javítható az elválasztás hatékonysága és felbontása102. Egy ilyen munka első lépése a matematikai modell kidolgozása a minták elektroforetikus viselkedésének előrejelzésére. Kapilláris elektroforézis esetén alapvető az elektroforetikus mobilitás előrejelzésére a mennyiségi szerkezettulajdonság összefüggés (QSPR: quantitative structure-property relationship) ismerete, ami megkönnyíti az elválasztás hosszú és fárasztó kísérleti optimalizálását. A QSPR vizsgálatoknál matematikai összefüggéseket keresnek valamely tulajdonság (mint például az elektroforetikus mobilitás) és egy vagy több szerkezeti jellemző (structural descriptor; mint például töltés vagy méret) közt abból a célból, hogy leírják, miként határozzák meg e szerkezeti jellemzők az adott tulajdonságot. A fő nehézség, amely ezzel a megközelítéssel jelentkezik, az alkalmas modellezési módszer kiválasztása és a molekuláris szerkezet leírása a megfelelő molekuláris jellemzőkkel103. Kapilláris elektroforézis alapú peptidelválasztások esetén kézenfekvőnek tűnik az elektroforetikus mobilitás becslése olyan molekuláris jellemzőkből, mint az elsődleges szerkezet (primary structure). Korábban számos olyan elméleti prediktív modellt dolgoztak ki, melyek a peptidek fizikai-kémiai tulajdonságaival teremtenek közvetlen kapcsolatot104. Ezek a modellek mind levezethetők Stokes törvényéből (Stokes’ law), és jellemzőjük, hogy az elektroforetikus mobilitás a Q / R hányadossal áll kapcsolatban, ahol Q a peptid töltése, R pedig a Stokes-féle rádiusza105-106. Az összefüggést a peptidek effektív mobilitása és valódi töltésük (actual charge), méretük (relatív molekulatömeggel megadva) és alakjuk közt először Offord írta le 1966-ban105-106. További prediktív modelleket dolgoztak ki Grossman és munkatársai 1989-ben 107, Compton 1991-ben108, valamint Cifuentes és Poppe 1994-ben102. A fent említett modellek többsége a töltést ( Q ) az aminosavak ionizálható csoportjainak disszociációs állandóiból számítja, és R a peptidek molekulatömegével ( M ) függ össze. Azok a megfontolások, hogy a peptidek mobilitásának változását kizárólag két molekuláris jellemző – a töltés és a méret – alapján vizsgálják, némi következetlenségre, ellentmondásra vezetnek az irodalomban. A töltésszámítás alapvetően a Henderson-Hasselbach egyenlet
27 Irodalmi összefoglaló alapján történik, azonban ez bizonyos hatásokat – mint az elektrosztatikus töltésszupresszió vagy a töltéseloszlás – csak részben vagy egyáltalán nem vesz számításba. A fő különbség az említett modellek közt, az R és M kapcsolatának eltérő jellemzéséből adódik109. Ezek a modellek mind szemi-empirikus alapúak, változó kísérleti körülményekkel (diverz peptidméret, töltéseloszlás, háttér elektrolit ionerősség)110. Ebből a részben empirikus megközelítésből adódóan, e modellek alkalmazási területe elméletileg is korlátozott, a korreláció megalkotásához alkalmazott kísérleti peptidekhez való hasonlóság és a modellhez használt puffer rendszer alapján, ami megakadályozza, hogy általánosan elfogadhatónak tekinthessük őket111. Xin és munkatársai nemrégiben egy érdekes, az empirikus alaptól eltávolodó módszert mutattak be112. Egy az elektro-hidrodinamikus elméleten alapuló, ezért kísérleti mérésektől független, „gyöngy modell”-t (bead-model) alkottak gyengén töltött peptidek vizsgálatára. Összefoglalva megállapítható, hogy az Offord-modellel gyakran sikerült kielégítő korrelációt elérni106,113-117. Azonban az Offord-modell legnagyobb hiányossága, hogy a peptideknek mindössze két fizikai-kémiai tulajdonságát veszi figyelembe, nevezetesen a töltésüket és relatív molekulatömegüket. A peptidek elektroforetikus mobilitása minden bizonnyal nem jósolható kellő pontossággal minden peptid kategóriában QSPR modellekkel, kizárólag Q és M jellemzők alapján116,118. A kétváltozós szemi-empirikus QSPR modellek e problémájának leküzdésére alapvetően két stratégiát alkalmaznak. Egyrészt újabb releváns paramétereket vezettek be a QSPR modellbe115-116, másrészt nem-lineáris modellezési módszerekkel próbálkoztak, mint a mesterséges neurális hálózatok (ANN: artificial neural network), abból a célból, hogy pontosabb és robosztusabb modelleket kapjanak103,114,118-120. Az ANN sikeres alkalmazása QSPR modellek kidolgozására igazolni látszik a feltételezett nem-lineáris összefüggést a peptidek jellemzői és elektroforetikus mobilitása között.
1.3.1 Szemi-empirikus modellek
Bár a többváltozós modellek (1.3.2 fejezet) egy része is szemi-empirikusnak tekinthető,
ebben a fejezetben kizárólag a kétváltozós szemi-empirikus modellek kerülnek bemutatásra. Az összefüggést a peptidek effektív elektroforetikus mobilitása ( µef ) és tényleges töltésük, relatív molekulatömeggel kifejezett méretük és a peptidlánc alakja (konformációja) közt jó ideje vizsgálják105. Egy töltött részecske elektroforetikus mobilitása Stokes törvénye alapján a következőképpen adható meg:
28 Kapilláris zóna elektroforetikus peptid elválasztások modellezése
µef =
Q
(1)
6πη R
ahol η a közeg dinamikai viszkozitása. Offord
próbálkozott
elsőként
kisméretű
peptidekre
alkalmazható
fundamentális
elekroforetikus modell megalkotásával. A modellezés során a peptideket tömör, gömbszerű részecskéknek tételezte fel106. Modellje az elektroforetikus mobilitás és a peptidek molekulatömege közt teremtett összefüggést, feltételezve, hogy az elektroforézis során a peptid molekula gömbszerű, állandó sűrűségű testként viselkedik. Ezért sugara V következésképpen M
1
3
1
3
–
– értékével arányos (ahol V a molekula térfogata, M pedig a
tömege). Stokes törvényének megfelelően a peptidre ható súrlódási erő arányos R értékével, és így szükségszerűen M moláris tömeget ( M )
1
3
értékével is arányosnak kell lennie110. Első közelítésként a
a molekuláris térfogattal ( 4 π R 3 ) arányosnak tekintve az 3
elektroforetikus mobilitás a következőképpen fejezhető ki:
µef = k
Q M
1
(2) 3
ahol k egy, kísérleti körülményektől függő, empirikus állandó. Offord feltételezte továbbá, hogy az elektroforézis során migráló peptidre ható súrlódási erő az ellentétes töltésű, ionos hidrát-burkának köszönhető, mely az oldószer ellenáramát okozza a migráló molekula közvetlen környezetében106. Más szavakkal, a visszatartó erő a molekula környezetében a folyadékréteg kis elemei közt fellépő nyírás eredménye. Így ez az erő a molekula felszínének ( R 2 ) függvénye, és ezért M
2
3
értékével arányos110. Offord papír
zóna elektroforetikus peptidelválasztások alapján az elektroforetikus mobilitás leírására a következő összefüggést vezette le:
µef = k
Q M
2
(3) 3
Ezzel szemben a szintetikus polimerek vizsgálatai121 azt mutatták, hogy egy polimer forgási sugara (radius of gyration) a monomer egységek számának négyzetgyökével arányos megszorozva a monomeregység hosszával. Így a súrlódási erő M arányosnak:
1
2
értékével adódik
29 Irodalmi összefoglaló
µef = k
Q M
1
(4) 2
Egy, a polimerek szemi-empirikus modelljével analóg egyenletet mutattak be Kim et al., akik enzimatikus fehérje emésztményekből nyert peptideket vizsgáltak122:
µef = k
Q M 0,56
(5)
Stokes és Offord-modelljeit Compton egyesítette, javasolva a mobilitás molekulatömeg1
függésének
M
1
1
és 3
M
2
közötti folytonos függvénnyel való megadását, a protein 3
molekulatömegének és az elektrolit ionerősségének függvényében108: Q
µef = k1 k2 M
1
3
+ k3 M
2
(6) 3
ahol k1 , k2 és k3 a peptid karakterisztikájától és a kísérleti körülményektől függő empirikus állandók. Grossman és munkatársai az oldatban a peptideket klasszikus lineáris polimereknek tekintve, méretüket az aminosavak számával (n) kifejezve alkották meg szemi-empirikus modelljüket107.
Logaritmikus
töltésfüggést
alkalmaztak,
hogy
a
töltött
csoportok
elektrosztatikus kölcsönhatásait kompenzálják, ami különösen erősen töltött peptidek esetén bír megnövekedett jelentőséggel107,113. A következő összefüggést vezették le az effektív mobilitás töltés- és méretfüggésének leírására:
µef = k
ln ( Q + 1) n 0,43
(7)
Cifuentes és Poppe Grossman klasszikus lineáris modelljét fejlesztették tovább102. Megtartották a logaritmikus töltésfüggési tagot, de az aminosavak száma helyett a molekulatömeget, mint a peptid méretét jobban jellemző paramétert, alkalmazták:
µef = k1
ln (1 + k2Q ) M 0,411
(8)
Adamson és Reynolds a molekulatömeg kitevőjét 0, 435 (9) értékre módosítva használták ugyanezt a modellt110,123. Az összefüggés eltérő leírásainak ellenére megállapítható, hogy a peptidek mobilitása egyenesen arányos a töltésükkel, és fordított arányosság áll fenn a tömegük 1
3
és 1
2
közé
30 Kapilláris zóna elektroforetikus peptid elválasztások modellezése eső hatványával. A kisméretű peptidek kompakt szerkezetű (tight coil) egyszerű szerves ionokként viselkednek, ezért mobilitásuk M
−1
3
hatvánnyal arányos. Míg a hosszabb
peptidláncok kevésbé szabályos, véletlenszerű spirál (random coil) formáját feltételezve, a mobilitásuk M
−1
3
és M
−1
2
lineáris kombinációjával arányosan fejezhető ki (az oldatban
felvett valódi alakját, valamint az elektrosztatikus és egyéb kölcsönhatásokat tekintve ideális geometriájú véletlenszerű spirál esetén). Hosszú, denaturált polipeptidek és fehérjék lineáris láncot alkothatnak, melyek elektroforetikus mobilitása közvetlenül M értékével áll fordított arányban105. Számos publikáció született inkonzisztens következtetésekkel a fent ismertetett szemiempirikus modellek hatékonyságáról. Az Offord-modell kapilláris zóna elektroforézisnél (CZE) való alkalmazhatóságát először Nyberg és munkatársai értékelték124. Rickard et al. jelentős korrelációt (r 2 = 0,948) tapasztaltak µef és
Q M
2
közt egy 33 peptidből és 10 3
fehérjéből álló adathalmazon117. Issaq és munkatársai a pH, puffer adalékok és a hőmérséklet hatásait vizsgálták kisméretű peptidek esetén125. Azonos mértékben töltött polialaninek sorozatával érték el a legjobb korrelációt az elektroforetikus mobilitás és
Q M
Grossman et al. kiváló korrelációt igazoltak µef és
2
közt. Másrészt 3
ln ( Q + 1) közt, egy 40 peptidre kiterjedő n 0,43
vizsgálatban107. Hilser és munkatársai ugyancsak kiváló eredményeket (r = 0,908) adtak közre126 a Grossman-modell felhasználásával 18 triptikus emésztmény peptidfragmentum vizsgálatával, melyek 2-21 aminosavból álltak, és a töltésük 0,31 és -2,39 közt változott. Adamson és Reynolds valamivel jobb korrelációt értek el (r = 0,978) ugyanarra az
ln (1 + Q ) adathalmazra egy pontosított modellt µef = használva110. Cifuentes és Poppe az 0,435 M egyik legjobb illeszkedést érték el a µef értékét
1758 ⋅ ln (1 + 0, 297Q ) kifejezéssel leíró M 0,411
módosított Grossman-modelljükkel, 2-30 aminosavból álló, 0,75-8 töltéssel rendelkező peptidekkel kapott kísérleti adatokra102. Később Sanz-Nebot et al. még jobb korrelációt kaptak logaritmikus töltésfüggő modellek bevezetésével, mely a töltésszupressziós hatásokat is képes volt kompenzálni127. Másrészről Chen és munkatársai kiváló korrelációt kaptak
Q M
1
2
összefüggéssel kifejezve µef értékét128. Egy évtizeddel később Kim et al. számos szemi-
31 Irodalmi összefoglaló empirikus modellt vizsgáltak egy 18 standard peptidből álló mintán, pozitív töltésű bevont kapillárissal,
kapilláris
elektroforézissel
online
kapcsolt
elektrospay
ionizációs
tömegspektrometriás (CE-ESI-MS) detektálással122. A legjobb korrelációt az elektroforetikus mobilitás versus
Q összefüggéssel kapták különböző töltésű (0,26-6,62) és méretű (1-10 M 0,56
aminosav) peptidekre. Ezzel szemben, Gaus és munkatársai arra a következtetésre jutottak, hogy 14 különböző 6 körüli töltéssel rendelkező, 16-18 polimerizáció fokú peptidből álló kísérleti adathalmazukat sem az Offord-, sem a Grossman-modell nem írta le megfelelően 129. Survay et al. figyelemre méltó korrelációt értek el mind az Offord (r 2 ≥ 0,996) , mind a Grossman (r 2 ≥ 0,996) modellekkel oligoglicinek és oligoalaninek (2-6 aminosavból álló oligomerek) elválasztásánál130. Arra következtettek, hogy – mivel a kitevők széles skálája alkalmazható az adatok precíz leírására – a kétváltozós szemi-empirikus modellek egyike sem tekinthető kizárólagosan alkalmazhatónak a peptidmobilitás modellezésére. A 2. táblázat foglalja össze a kétváltozós szemi-empirikus modelleket ismertető publikációkat, feltüntetve a CE módját, az alkalmazott puffer pH értékét, a minta komplexitását, az aminosavak számát (n) , az alkalmazott peptidek töltését (Q) és a szerzők által javasolt modelleket. Függetlenül a publikációk eltéréseitől, látszólag az Offord-modell106 gyakrabban eredményez jó egyezést, mint bármelyik másik szemi-empirikus modell, különösen változatos peptidek adataira alkalmazva111,113-117,125,131-132. A közelmúltban Tessier és kollégái öt szemiempirikus modellt vizsgáltak111 a peptidmobilitást a töltés és méret hányadosával korreláltatva, 64 oligopeptidből álló adathalmazra, melyek 2-14 aminosavból álltak, és töltésük 0,29-től 6,74-ig változott. Ugyan egyik modell sem eredményezett tökéletes illeszkedést a kísérleti adatokra, a legjobb korrelációs együtthatót az Offord-modell eredményezte. Janini és munkatársai 58 peptidet vizsgáltak, melyek mérete 2-től 39 aminosav egységig változott, töltésük pedig 0,65-7,82 között116. Még újabb Khaledi és kollégáinak munkája, akik 125 standard, 2-14 aminosavból álló peptidet elemeztek114. Mindkét tanulmány kísérleti
adatokat
használt
az
ismert
szemi-empirikus
modellek
értékelésére,
az
elektroforetikus mobilitás és a töltés-méret hányadosa közti korrelációt vizsgálva. Érdekes módon újfent az Offord-modell nyújtotta a legjobb egyezést a számított és a kísérleti µef értékek közt114,116.
32 Kapilláris zóna elektroforetikus peptid elválasztások modellezése
2. táblázat: A kétváltozós szemi-empirikus modellek összefoglalása Irodalom
Móda
Adamson 133
HPCE
⅔; ln/n
(Review)
⅓; ½; ⅔; ln/M; ln/n
110
Adamson Basak
131
DV
Chen 128
8,77
FSCE
Minták
n
Q
Modellekb
51
⅔
37
½
Castagnola
134
CZE
2-12
6
4-5
⅔; ln/n
Castagnola
135
⅔
CZE
2-4,25
21
4-16
Cifuentes
102
CZE
2-11
58
2-30
Compton
108
CZE
2-8
1
132
Cross Gaus
129
Grossman Hilser
107
126
Issaq 125 Jalali-Heravi
114
Jalali-Heravi
118
-0,99-8,0
⅔; ⅓+⅔; ln/M; ln/n ⅓+⅔
CZE
2,5
22
3-39
1,33-14,28
⅓; ⅔; ln/n
CZE, MEKC
2,5; 7
14
16-18
~6,0
⅔; ln/n
FSCE
2,5
40
3-39
0,33-14,0
ln/n
CZE
2,5
18
2-21
0,31-2,39
⅔; ln/n
CE, CZE
2,5-7
6
9
CZE
2,5
125
107
⅔
2-14
0,74-5,84
⅓; ½; ⅔; ln/M
CZE
2,5
102
2-42
0,65-16,0
⅔
Janini
116
CZE
2,5
58
2-39
0,65-7,82
⅓; ½; ⅔; ln/n
Janini
115
CZE
2,5
102
2-42
0,65-16,0
⅔
CE-MS
2,7
18
1-10
0,26-6,62
½; ⅓; ⅔; 0,56; ln/M(0,435); ln/n
CZE
2,5
64
2-39
0,65-7,82
⅔
Kim
122
Metral et al.
136
124
Nyberg
Rickard
117
Sanz-Nebot Solinova
123
115
⅔
CZE
Offord 106
a
pH
137
PE
6,5
CZE
2,35-8,15
CZE
4
⅔ ⅔
43 8
0,99-2,98
⅓; ½; ⅔; ln/M(⅓, ½, ⅔); ln/n
-2-0,77
⅓; ½; ⅔; 0,56; ln/M; ln/n
CZE
2,25-8,1
20
2-10
Survay
130
CZE
2,51-4,15
10
2-6
Tessier
111
CE-MS
2,75
64
2-14
⅔; ln/n 0,29-6,74
⅓; ½; ⅔; ln/M; ln/n
Nagyhatékonyságú CE (HPCE), micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC), Doppler sebességmérés (DV), szabad oldat CE (FSCE), CE-tömegspektrometria (CE-MS), papír elektroforézis (PE) b Modellek: ⅓ eq. (2) ½ eq. (4)121 ⅔ eq. (3)106 0,56 eq. (5)122 ⅓+⅔ eq. (6)108 ln/n eq. (7)107 ln/M eq. (8)102 ln/M(0,435) eq. (9)110 ln/M(⅓, ½, ⅔) eq. (8)137 M ⅓, ½ és ⅔ kitevőivel
33 Irodalmi összefoglaló
1.3.1.1 A szemi-empirikus modellek hiányosságai
A nagyszámú elektroforetikus peptidmobilitás számítási próbálkozás102,106-108,110,122 dacára,
egy univerzálisan minden peptidkategóriára alkalmazható, robosztus modell e paraméter pontos becslésére, mely csak a töltés és méret egy-egy jellemzőjére épül, még mindig nem létezik114,116,118,138. Ahogy az előző fejezetben bemutattam, Janini et al.116 és Jalali-Heravi et al.114 figyelemreméltóan sokszínű peptid adathalmazt használtak az elektroforetikus mobilitás töltéstől és mérettől való függésének vizsgálatára. Mindkét tanulmányban az Offordegyenlet106 nyújtotta a számított és a kísérleti µef értékek közt a legjobb korrelációt az adathalmaz legtöbb peptidjére, ami alól csak az erősen töltött és hidrofób molekulák képeztek kivételt. Tulajdonképpen a bemutatott modellek kizárólag a peptidek méretére és töltésére összpontosítanak. Következésképp a modellek teljesítménye nyilvánvalóan az ismert elsődleges szekvencia és a két peptidjellemző közötti összefüggés választásától függ. Tehát e két paraméter meghatározásának pontosságát úgy kell értékelni, hogy szem előtt tartjuk, hogy az elektroforetikus mobilitás csupán két peptidjellemzővel történő leírása nem feltétlenül kielégítő, így e modellek hiányosságait okozhatja111,114. Annak érdekében, hogy a peptidminták töltését precízen meghatározzuk, a peptidet alkotó aminosavak disszociációs állandóit (pK) nagy pontossággal ismernünk kell139. A gyakorlatban az aminosavak ionizálható funkciós csoportjairól hozzáférhető pK értékeket alkalmazzák minden peptidhez függetlenül az összetételüktől, illetve szekvenciájuktól. Ez minden bizonnyal a peptid töltésének hibás becsléséhez vezet, mivel az aminosav oldalláncok ionizációját egy adott környezetben a szomszédos csoportok elektrosztatikus és sztérikus hatásai is befolyásolják117. A peptidekben a sztérikus és elektrosztatikus hatások főleg az összetételtől és az aminosav sorrendtől függenek, így a módszer a pK meghatározás és ezáltal az ezt követő töltésszámítás során egyaránt hibát okozhat114. Sőt, ahogy Cross és Granham megállapították, a töltéseloszlás az egyik fő tényező, mely szerepet játszik a peptidek és feltehetőleg minden vizes oldatban elektromigráló komponens mobilitásában138. Ahogy korábban leírtam, gyakran a molekulatömeget használják a peptidek méretének jellemzésére. Ugyan a molekulatömeg pontos hatása az elektroforetikus mobilitásra még nem ismert, mivel az elektroforetikus mobilitás molekulatömeg-függése az irodalomban némileg ellentmondásos. Compton megmutatta, hogy a kis molekulák mobilitása kis ionerősségű
34 Kapilláris zóna elektroforetikus peptid elválasztások modellezése 1
pufferekben
M
1
-nal áll szoros összefüggésben108. Másrészt a nagyméretű molekulák 3
1
mobilitása nagy ionerősségű pufferben
M
1
puffer ionerősség mellett
M
1
2
-nal korrelál. Közepes méretű molekulák és 3
összefüggés mutatkozik114. Egy másik figyelembe veendő 2
tényező, mely a peptid méretének meghatározása, és az ezen alapuló mobilitás becslés során hibák forrása lehet, a minta hidratációja138. Janini és munkatársai mutatták meg, hogy a peptid hidrofobititását a kétváltozós modellek nem veszik figyelembe, így részben ez felelős a mobilitás gyenge előrejelzéséért115. A peptid hidrodinamikus térfogatának és alakjának alkalmazását javasolták a molekulatömeg helyett Piaggio et al., hogy a peptid súrlódási együtthatóját meghatározzák, és releváns alternatívát nyújtsanak, mely segíthet CZE eredményekből nyert információk alapján a hidratációs jelenséget interpretálni140. Végül szeretném hangsúlyozni, hogy az általános feltételezés az elektroforetikus mobilitás töltés-méret aránnyal való kapcsolatáról általában a lehetséges nem-lineáris összefüggést teljes mértékben figyelmen kívül hagyja. Ezzel a problémával Cross és Garnham is szembesültek138, és így arra következtettek, hogy az Offord-egyenlet106 nem megfelelő modell a különböző méretű, töltésű vagy hidrofobitású peptidek széles skálájának elektroforetikus mobilitásának leírására. Azért, hogy a hagyományos szemi-empirikus modellek említett hiányosságaival megbirkózzunk két stratégia alkalmazása merült fel napjainkban a peptidek elektroforetikus mobilitásának precízebb előrejelzésére: •
A
kétváltozós
QSPR
figyelembevételével
a
modellek modellek
kiterjesztése, prediktív
további
teljesítményének
peptidparaméterek növelésére,
alkalmazhatósági tartományuk kiterjesztésére az összes különböző peptidcsoportra
és 114-
115,118,136
;
•
Nem-lineáris modellezési módszerek – mint a mesterséges neurális hálózatok – használata, precízebb és robosztusabb QSPR modellek kidolgozásához103,114,118,120.
1.3.2 Többváltozós modellek
Annak érdekében, hogy az Offord-modellből származó hiányosságokat kiküszöböljék,
Metral el al. egy új megközelítést vizsgáltak136, hogy további fizikai jellemzőket vegyenek számításba, melyeket a kétváltozós modellek figyelmen kívül hagynak. Modelljükben a
35 Irodalmi összefoglaló peptidek elektroforetikus mobilitását négy fizikai paraméter függvényének szorzataként fejezték ki:
µ = l ( L)q (Q) w(W )c(CC )
(10)
ahol L a peptid hossza az aminosavak számával megadva, W a peptid szélessége az oldalláncok átlagos molekulatömegével kifejezve, és CC (charge center) a töltésközéppont tömegközépponthoz viszonyított relatív helyzetét jelöli. A tömeget kétdimenziós változóvá alakítva lehetőség nyílik a peptidek közti különbségek jobb leírására, és így nagyobb peptidhalmazok kezelésére. Összesen 64, különböző fizikai paraméterrel rendelkező peptidet vizsgáltak, melyek töltése 0,65-től 7,82-ig, méretük 2-től 39 aminosavig terjedt. A kísérleti eredményeket, azaz peptidmobilitásokat, 10% poliakrilamiddal bevont kapillárisokkal, 50 mM koncentrációjú foszfát pufferrel (pH 2,5) nyerték. Az UV detektálás 200 nm hullámhosszon történt. Az elválasztásokat 22°C hőmérsékleten végezték. Ebben az esetben a publikált eredmények alapján végzet ismételt számításaink141, hogy az Offord-modellt alkalmazzuk a teljes adathalmazra, elég gyenge korrelációt (r 2 = 0, 728) eredményeztek a kísérleti mobilitásokkal. Ugyanakkor a négy legnagyobb töltésű peptid kihagyásával, melyek a linearitástól különösen nagy eltérést mutattak, az Offord-modell teljesítménye jelentősen javult (r 2 = 0,931) . Összehasonlítva a kísérleti adatokat a többváltozós modellel kapott mobilitás értékekkel, a korreláció tovább javult (r 2 = 0,980) . A szerzők által alkalmazott eljárás teljesen empirikus természetű, és nem tükröz elméleti megfontolásokat. Megmutatták, hogy egy peptid elektroforetikus mobilitását lényegében a töltés, az aminosav alkotók száma, átlagos tömege és a töltés középpontjának helye befolyásolja. A módszer szimulált és kísérleti értékek eltérésével mért sikere, kizárólag a nagyszámú, eltérő töltésű és méretű peptid elektroforetikus mobilitásának mérésének pontosságán múlik. Így fontos észrevenni, hogy szemben a kétváltozós modellekkel, a töltés értékek pontos meghatározása nem nélkülözhetetlen ehhez a megközelítéshez, amíg a töltésszámításhoz alkalmazott módszer következet. Metral és munkatársai módszerét136 Jalali-Heravi et al.118 kifogásolták, állítva, hogy ugyan megfelelő korrelációs értékeket kaptak, azonban minden a modellben megjelenő függvény adatfüggő volt. Janini és munkatársai az imént ismertetett modell136 módosított verzióját mutatták be. Egy újabb számítógépes többváltozós modellt alkottak a peptidek elektroforetikus mobilitásának előrejelzésére, azok aminosav-összetevőinek ismert fizikai-kémiai tulajdonságaira építve. A modelljüket fehérje emésztmények CZE peptidtérképeinek szimulációjára alkalmazták115.
36 Kapilláris zóna elektroforetikus peptid elválasztások modellezése Összehasonlítva előző modelljükkel116, több peptidet építettek be az alap mintahalmazba, és egy számítógépes algoritmust vettek igénybe, mely az ismeretlen peptidek fizikai paramétereit a peptidhalmazban legközelebbi szomszédjaikéból extrapolálva adta meg, a pontosabb mobilitás becslés érdekében. E modell feltételezi, hogy az elektroforetikus mobilitás három függvény szorzatával kifejezhető, melyek a peptid töltésének (Q) , hosszának ( N ) és szélességének (W ) hatását tükrözik:
µ = n( N )q(Q) w(W )
(11)
Az egyenlet által leírt modell változatos peptidek halmazának elektroforetikus mobilitásainak pontos kísérleti mérésén alapszik. A CZE elválasztásokat 22°C-on, 50 mM koncentrációjú foszfát pufferrel (pH 2,5) kivitelezték. Egy 102 peptidből – melyek méret (242 aminosav) és töltés (0,65-16) szerint széles skálán változtak – álló halmaz akkurátus méréseit végezték el 10% lineáris poliakrilamiddal bevont kapillárisban. A többváltozós számítógépes modell minden peptidkategóriában jelentős
előrejelzési
(r 2 = 0,98)
az
javulást
eredményezett
Offord-modellel
összevetve
(r 2 = 0,90) , beleértve az erősen töltött és hidrofób típusokat is. A modell proteomikai vizsgálatoknál való
alkalmazhatóságát
glukagon
és
lóból
származó citokróm C emésztmények elméleti peptidtérképeinek
szimulálásán
keresztül
szemléltették. Az elektroforetikus mobilitásokat migrációs
időkké
alakították,
és
a
CZE
elektroferogramokat Gauss görbékkel szimulálták. A glukagon kísérleti eredménye megdöbbentő egyezést mutatott a szimulált elektroferogrammal 6. ábra: Glukagon Glu-C endoproteináz emésztményének kísérleti és szimulált elektroferogramjai (µef cm2V-1s-1 egységben)115
(6. ábra). A citokróm C esetében érdekes hasonlóságokat
értek
ugyan
el,
de
az
elektroferogramok a közvetlen megfeleltetést nem tették lehetővé. Ugyanakkor ismét észre kell venni, hogy ez a modell is teljes mértékben empirikus, és semmilyen elméleti összefüggést nem tartalmaz136. 2005-ös publikációjukban118 Jalali-Heravi és munkatársai a Janini-féle megközelítést kritizálták. Rámutattak, hogy a modell sikere a nagyszámú peptid elektroforetikus
37 Irodalmi összefoglaló mobilitásának kísérleti mérési pontosságán múlik. Más szóval, a modelljük a legközelebbi szomszéd (closest neighbour) algoritmuson alapszik, így nem lehet megfelelően robosztus. Jalali-Heravi és munkatársai nemrég egy újabb többváltozós modellt dolgoztak ki, hogy a töltés és méret mellett, további szerkezeti jellemzők kapilláris zóna elektroforetikus mobilitásra kifejtett hatásait is megértsék114,118. Kiterjedt, 125 peptidre épülő adathalmazt generáltak. A peptidek mérete 2-től 14 aminosavig változott, töltésük pedig 0,734-től 5,843ig. A peptidek elektroforetikus mobilitását bevonatlan kvarc (bare fused silica) kapillárissal CZE módban mérték, 2,5-ös pH-jú, 50 mM koncentrációjú foszfát puffert alkalmazva. A detektálás 214 nm hullámhosszon történt, és az elválasztásokat 37°C-on végezték. Egy többszörös lineáris regressziós (MLR: multiple linear regression) eljárást alkalmaztak a QSPR modellben szereplő további peptidjellemzők kiválasztásához, melyekkel az Offord-féle töltés-tömeg arányt kifejező tag kiegészíthető. A legjobb modellt egy lépésenkénti (stepwise) MLR módszerrel érték el, mely az Offord-féle tagot különböző peptid jellemzőkkel, r2 és F statisztikákon, valamint standard hibán (SE) alapulva, kombinálta: Q
µ =p
M
2
3
+ e∑ Es ,c + m∑ MR
(12)
ahol Es ,c (corrected steric substituent constant) a sztérikus hatásokat magába foglaló korrigált sztérikus szubsztituens állandó, és MR (molar refractivity) a moláris refrakció, mely a molekula térfogatával (azaz molekuláris testességgel, kompaktsággal; molecular bulkiness) áll szoros kapcsolatban. Az MLR-val számított elektroforetikus mobilitásokat az adathalmazzal összevetve a
korreláció
javulását
(r 2 = 0,895)
tapasztalták
az egyszerű Offord-
összefüggéshez képest (r 2 = 0,878) . Az MLR modell egyértelműen túlbecsülte az arginin, hisztidin és lizin tartalmú peptidek elektroforetikus mobilitásait (ezek az aminosavak extra töltést adnak a peptidnek). Ezért Jelali-Heravi és munkatársai feltételezték, hogy az erősen töltött peptidek mobilitásának nem-lineáris viselkedése okán, a lineáris modellek minden bizonnyal nem képesek a mobilitások pontos becslésére114. Egy következő munkájukban118 Jalali-Heravi et al. az imént hivatkozott MLR alapú többváltozós modelljüket114 ((12) egyenlet) alkalmazták a Janini és kollégái által vizsgált adathalmazra115, így lehetővé téve a két bemutatott többváltozós lineáris modell közvetlen összehasonlítását. Az MLR alapú modell elfogadható korrelációt adott a számított és a kísérleti elektroforetikus mobilitás értékek között (r 2 = 0,93) , és az Offord-modellhez (r 2 = 0,90) képest is javulást eredményezett. Janini et al. a teljes adathalmazon jobb
38 Kapilláris zóna elektroforetikus peptid elválasztások modellezése illeszkedést értek el többváltozós modelljükkel (r 2 = 0,98) 115. Amikor a teljes adathalmaz egy 24 erősen töltött és hidrofób peptidből álló részét vizsgálták, az MLR alapú és a Janiniféle többváltozós modellek teljesítménye közti különbség még hangsúlyosabb lett, r 2 = 0,91 és r 2 = 0,98 korrelációs együtthatókat eredményezve. Ma és kollégái bemutattak egy modellt, melyet több peptidjellemző heurisztikus módszerrel (HM) történő szisztematikus vizsgálatával építettek fel103. Két különböző, korábban Janini116 és Jalali-Heravi114 által publikált, adathalmazt vizsgáltak a QSPR módszerük alkalmazhatóságának igazolására. A 125, 2-14 aminosavból álló, 2,5-ös pH-n bevonatlan kvarc (bare fused silica) kapillárisban mért peptid mobilitást tartalmazó, 1. adathalmaz a
114
hivatkozásból származott. A 2. adathalmazt, mely 58, 2-39 aminosavból
felépülő, peptidből állt, melyeket 2,5 pH-n 10% poliakrilamiddal bevont kapillárisban futtattak, a 116 hivatkozásból vették át. Annak érdekében, hogy az Offord-féle töltés-tömeg tag mellett az elektroforetikus mobilitást befolyásoló további peptidjellemzőket találjanak, megrajzolták a peptidek háromdimenziós szerkezetét, és a CODESSA szoftvercsomagba (University of Florida,FL, USA) importálták142. 38 topológiai és 38 szerkezeti jellemzőt tartalmazó könyvtárból a HM alkalmazásával alapvető és reprezentatív paramétereket választottak ki mindkét adathalmazra, majd felépítették a lineáris modellt. A kiválasztott Q
jellemzők között a
M
2
hányados, a Wiener index (W ) , az oxigén atomok relatív száma 3
( RNO) és a nitrogén atomok relatív száma ( RNN ) szerepeltek. Az Offord-féle tag volt a
modell legmeghatározóbb tényezője, W a hidrodinamikai súrlódást, RNO és RNN (hidrogénhíd akceptorok) az oldószerrel való hidrogénkötések kialakításának képességét képviselték. A szerzők a következő lineáris modelleket javasolták: = µ 994,1
Q M
2
− 5, 06 ⋅105W − 45,8 RNO + 52, 7 RNN
(13)
3
az 1. adathalmazra, és = µ 594,32
Q M
2
− 7, 09 ⋅10−7 W
(14)
3
a 2. adathalmazra. Megfelelő egyezést értek el a becsült és a kísérleti elektroforetikus mobilitás értékek között mindkét
adathalmazon
Megállapítható,
hogy
(1. az
adathalmaz: Offord-féle
r 2 = 0,947 ; tömeg-töltés
2.
adathalmaz:
hányados
r 2 = 0,967 ).
CODESSA-számított
39 Irodalmi összefoglaló jellemzőkkel142 egyesítve megfelelően veszi számításba a mintapeptidek szerkezeti jellegzetességeit. A 3. táblázatban szemléltetem az ismertetett többváltozós modelleket. A táblázatban a CE módja, a mintapeptidek száma, az peptideket felépítő aminosavak száma, töltések és a kapott korrelációs együtthatók egyaránt megtalálhatók. 3. táblázat: Többváltozós modellek összehasonlítása Hivatkozás Jalali-Heravi et al.
114
Jalali-Heravi et al.
118
Janini et al. Ma et al.
115
103
Metral et al.
136
Mód
Minták
n
Q
r²
CZE
125
2-14
0,74-5,84
0,895
2-42
0,65-16,0
0,93
2-42
0,65-16,0
0,98
2-14, 2-39
0,7-5,8, 0,6-7,8
0,947, 0,967
2-39
0,65-7,82
0,98
115
CZE
102
CZE
102 114
CZE
125
CZE
64
, 58
116
Általánosságban elmondható, hogy a két- és a többváltozós modellezési technikáknak egyaránt korlátozott a képessége a különböző lehetséges nem-linearitások leírására, különösen olyan esetekben, ahol a jellemzők közti kölcsönhatásokkal is számolni kell. Ezért, nagyobb modellezési pontosságot igénylő feladatok esetén generikusabb nem-lineáris modellezési eszközök – mint a mesterséges neurális hálózatok (ANN: artificial neural network) – alkalmazása indokolt.
1.3.3 Gépi intelligencia módszerek
Napjainkban a CZE területén számos gépi intelligencia algoritmust (machine learning
algorithm) alkalmaztak sikerrel mennyiségi szerkezet-mobilitás összefüggés (QSMR: quantitative structure mobility relationship) modellek megalkotására103,114,118,120. Ezek a technikák
számos
rendelkeznek,
előnyös
melyek
az
tulajdonsággal elektroforetikus
mobilitás modellezésnél kiaknázhatók. Ilyenek többek közt az öntanuló képesség (selflearning ability) és a komplex adathalmazok leírásának képessége az őket meghatározó jelenségek részletes ismerete nélkül. A 7. ábra egy
tipikus
mesterséges
neurális
hálózat
7. ábra: Mesterséges neurális hálózat sematikus felépítése
40 Kapilláris zóna elektroforetikus peptid elválasztások modellezése (ANN: artificial neural network) sematikus felépítését mutatja. A következőkben tárgyalt gépi intelligencia módszerek elméletének részletes megismerésére kiterjedt irodalom áll rendelkezésre143-144. Jalali-Heravi és kollégái az elektroforetikus mobilitás lineáris/nem-lineáris természetének felderítésére alkották meg ANN modelljüket114. Ez volt a témában az első beszámoló ilyen jellegű modellezési megközelítés alkalmazásáról. Ahogy az előző (1.3.2) fejezetben az általuk alkalmazott kísérleti összeállítással együtt részletesebben ismertettem, az Offord-féle töltéstömeg hányadosra épülő többváltozós QSPR-t dolgoztak ki, kiegészítve a korrigált sztérikus szubsztituens állandóval és a moláris refrakcióval. Az MLR alapú modell az egyszerű Offordmodellel szemben megnövekedett prediktív képességet mutatott. Ezen felül egy hibridmódszert is kidolgoztak az elektroforetikus mobilitás nem-lineáris jellegének vizsgálatára, mely az MLR alapú többváltozós modellt mesterséges neurális hálózattal kombinálta (MLR-ANN). A többváltozós modell három paraméterét használták inputnak a 34-1 struktúrájú BP-ANN (back propagation artificial neural network) modelljükhöz. Az ANN számított mobilitások a modell prediktív képességének jelentős javulását mutatták (r 2 = 0,93 , SE ≈ 2,5) mind az Offord-modellel (r 2 = 0,878) , mind az MLR alapú modellel (r 2 = 0,895 , SE ≈ 3,3) összevetve. Ez különösen szembetűnő volt az erősen töltött – arginin, hisztidin és lizin tartalmú – peptidek esetében. A korreláció javulása a BP-ANN alkalmazásával megmutatta, hogy a számított mobilitások eltéréseinek az erősen töltött peptidek esetén nem a pontatlan töltésszámítás az oka102,116, hanem nyilvánvalóan a töltésmobilitás összefüggések nem-lineáris jellege. Későbbi munkájuk során Jalali-Heravi et al. ANN modelljük robosztusságát értékelték118 összehasonlítva a Janini és munkatársai által kidolgozott többváltozós modellel115, és vizsgálták a modell alkalmazhatóságát peptidtérképek szimulációjára. Előző cikkükkel114 szemben, ez a munka egy 102 peptidből álló adathalmazra115 épült, mely nagyobb méretű és hidrofobitású, valamint erősen töltött peptideket is tartalmazott. Ismét alkalmazták a korábban ismertetett MLR alapú modellt114 a szóban forgó adathalmaz elektroforetikus mobilitásainak előrejelzésre. Ezen felül az MLR modell három paraméterét inputnak használva generáltak egy 3-3-1 struktúrájú BP-ANN modellt is. A BP-ANN modell jobb prediktív teljesítménye (r 2 = 0,97) az MLR modellel összehasonlítva (r 2 = 0,93) igazolta az elektroforetikus mobilitás nem-lineáris természetéről alkotott feltevésüket. E modell nagyobb robosztusságot mutatott CZE mobilitások előrejelzésében, változatos mintahalmazra, különböző kísérleti körülmények között, mint az MLR alapú. A teljes adathalmazból kiválasztott erősen töltött és
41 Irodalmi összefoglaló hidrofób peptidek részhalmazára alkalmazva a modelleket, az eredmények meggyőzően mutatták a többváltozós115 (r 2 = 0,98) és az ANN (r 2 = 0,99) modellek prediktív képességének jelentős javulását az MLR alapú ( r 2 = 0,91 ) és Offord-féle ( r 2 = 0,91 ) modellekkel szemben. Ugyan a Janini és kollégái által kidolgozott többváltozós és az ANN modellek közt a korrelációs együtthatókban jelentős eltérések nem voltak tapasztalhatók, utóbbi valamivel kisebb standard hibát és relatív standard deviációt mutatott. Melittin, glukagon és lóból származó citokróm C endoproteináz enzim emésztmények elválasztásainak szimulációjánál mind az ANN, mind a Janini-féle többváltozós modell jó peptidtérkép előrejelzést tett lehetővé. Egy másik megközelítést az peptidek elektroforetikus mobilitásának előrejelzésére Ma és munkatársai adtak közre103, lineáris heurisztikus módszerük (HM) és egy nem-lineáris RBFANN (radial basis function artificial neural network) felhasználásával. Ahogy az 1.3.2 fejezetben részletezésre került, két különböző adathalmazt vizsgáltak (1. adathalmaz hivatkozásból, 2. adathalmaz
116
114
hivatkozásból), és az elektroforetikus mobilitást befolyásoló
további jellemzőket heurisztikus módszer alkalmazásával azonosították. A
Q M
2
kifejezés, a 3
Wiener index, az oxigén és nitrogén atomok relatív száma lettek a kiválasztott jellemzők. E jellemzők alapján mindkét adathalmazra többváltozós modelleket alkottak. Még pontosabb modell elérése céljából a többváltozós modell kidolgozása után, ugyanezen jellemzők alapján egy RBF-ANN alapú nem-lineáris modellt is alkottak, hogy a molekuláris szerkezet és a mobilitás összefüggéseit jobban megértsék. A peptidek elektroforetikus mobilitását a nemlineáris RBF-ANN modell az 1. adathalmazra (r 2 = 0,972) és a 2. adathalmazra (r 2 = 0,973) egyaránt nagy pontossággal előre jelezte. Sőt a nem-lineáris modell jobb egyezést mutatott a kísérleti adatokkal, mint a korábban bemutatott többváltozós modell. Megvizsgálva a két különböző, változatos mérettartományú adathalmazt, a QSPR módszer hatékony CZE peptidmobilitás
előrejelzési
eszköznek
bizonyult,
különösen
az
általánosítás
és
alkalmazhatóság szempontjából. Yu és Cheng QSPR modellek kidolgozására három gépi intelligencia módszer (BP-ANN, RBF-ANN és SVR: support vector regression) alkalmazását kísérelték meg a peptidek CZE mobilitásának becslésére120. Munkájuk során 102 peptidből álló adathalmaz eredményeit használták a 115 hivatkozásból, melyek 2-42 aminosavból épültek fel, és töltésük 0,65-tő 16-ig változott. A Jalali-Heravi és munkatársai által használt szerkezeti paramétereket114 (Offordféle tagot, korrigált sztérikus szubsztituens állandót és moláris refrakciót) alkalmazták a
42 Kapilláris zóna elektroforetikus peptid elválasztások modellezése hálózatok inputjaiként, az outputok pedig a peptidek mobilitásai voltak. Emellett a három fenti paraméter felhasználásával egy lineáris modellt is kidolgoztak, hogy a lineáris és nemlineáris eljárásokat összehasonlíthassák. Az SVR módszerrel kapott eredmény (r 2 = 0,978) igen közel esett a másik két nem-lineáris modellezéssel elérthez (BP-ANN: r 2 = 0,972 , RBFANN: r 2 = 0,977 ). Ezek a gépi intelligencia módszerek jóval pontosabb becslést tettek lehetővé, mint az MLR alapú modell (r 2 = 0,912) . Ez a megfigyelés még inkább igazolja a peptidek elektroforetikus mobilitásának feltételezett nem-lineáris természetét. Bár a BP-ANN, RBF-ANN és SVR alapú QSPR modellek pontossága igen közel volt egymáshoz, a három modell megbízhatósága némi eltérést mutatott. Az RBF-ANN és SVR módszerek jobb számítási hatékonysága és nagyobb megbízhatósága miatt, ezek jóval alkalmasabbnak bizonyultak a QSPR modellezésre, mint a BP-ANN módszer. A 4. táblázat foglalja össze a gépi intelligencia modellezési megközelítéseket, feltüntetve az alkalmazott algoritmust, a minták és aminosav összetevőik számát, a minták töltését és a modellek korrelációs együtthatóit. 4. táblázat: Gépi intelligencia módszerek összefoglalása Hivatkozás Jalali-Heravi et al.
114
Jalali-Heravi et al.
118
Ma et al.
103
Yu and Cheng
Módszer
Minták
n
Q
r²
BP-ANN
125
2-14
0,74-584
0,93
2-42
0,65-16
0,97
2-14, 2-39
0,7-5,8, 0,65-7,82
0,972, 0,973
2-42
0,65-16
0,979, 0,975, 0,978
BP-ANN RBF-ANN
120
BP-, RBF-ANN, SVR
115
102
114
125
, 58
102
115
116
1.3.4 Következtetések
Az adekvát összefüggés meghatározása a peptidek elektroforetikus mobilitása és töltöttségi
állapotuk, méretük (hidrodinamikai sugárral, moláris tömeggel vagy aminosavak számával megadva) és alakjuk (az oligo- és polipeptid láncok konformációja) közt kapilláris elektroforézisnél továbbra is kihívást jelentő feladat145. A hagyományos szemi-empirikus QSPR modellek hiányosságainak kezelésére kétféle stratégia ismert napjainkban. Az egyik a kétváltozós modellek kibővítése további peptid paraméterek beépítésével, a modell leíróképességének növelése, és a működési tartomány kiterjesztése céljából minden peptidcsoportra. A másik a nem-lineáris modellezési technikák – mint a mesterséges neurális hálózatok – segítségével pontosabb és robosztusabb QSPR modellek létrehozása. A modellezési kutatások hosszú távú kilátásai bíztatónak tűnnek. A számítógépes szimulációs eszközök, mint a SPPMCE146, PeakMaster147 vagy a Simul5148 egyre jobban használhatóak az CE elválasztásokhoz az optimális háttér elektrolit (BGE) meghatározására, így csökkentve
43 Irodalmi összefoglaló kísérleti optimalizálás idő- és munkaigényét. Sőt a peptidek elektroforetikus mobilitásának precíz becslésének, és peptidtérkép adatbázisok létrehozásának lehetősége a jelen proteomikai kutatások számára is kecsegtető.
44 Anyagok és módszerek komplex szénhidrátok gél elektroforézises elemzéséhez
2 Kísérleti rész 2.1 Anyagok és módszerek komplex szénhidrátok gél elektroforézises elemzéséhez 2.1.1 Vegyszerek
Ribonukleáz B, fetuin (szarvasmarha magzatból), aszialofetuin, α-1-savanyú-glikoprotein
és immunglobulin G (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) glikoproteineket HPLC tisztaságú vízben (Sigma-Aldrich) oldottunk fel, 10 mg/ml végkoncentrációban. A kevert (pooled) humán szérum minták a Dunn Labortechnik-től (Asbach, Németország) származtak. A 8aminopirén-1,3,6-triszulfonsav (APTS), ecetsav, 1 M NaBH3CN tetrahidrofuránban, acetonitril és trifluor-ecetesav a Sigma-Aldrich-tól származtak. A standardként felhasznált M040 maltodextrin létra a Grain Processing Corporation (Muscatine, IA, USA) terméke.
2.1.2 Oligoszacharid mintaelőkészítés
A glikoproteineket (0,1 mg 10 µl vízben feloldva) 1 µl denaturáló puffer (Endoglycosidase
buffer pack, New England BioLabs, Ipswich, MA, USA) hozzáadása után 100 °C-on 10 percig denaturáltuk. Ezt a lépést peptid-N-glikozidáz F (PNGaseF, Sigma-Aldrich) emésztés követte 2 egység enzim (50 egység enzim 50 µl HPLC tisztaságú vízben feloldva) felhasználásával, 25 µl teljes reakciótérfogatban (2,5 µl G7 és 2,5 µl NP40 puffer oldatokat tartalmazott a New England BioLabs Endoglycosidase puffer készletből), 37 °C-on 120 percig inkubálva. A deglikozilált fehérjéket jégfürdőn háromszoros térfogatú (75 µl) előhűtött etanol (LC-MS tisztaságú, Sigma-Aldrich) hozzáadásával precipitáltattuk, amit 10 perces centrifugálás követett 11000 rpm fordulaton (Labofuge 400R, Heraeus, Osterode, Németország).
2.1.3 Jelölési reakció
A centrifugálás után a glikánokat tartalmazó tiszta felülúszókat óvatosan 0,2 ml-es PCR
csövekbe vittük át, és ezek centrifugális vákuum bepárlóban (Savant Instruments Inc., Farmingdale, NY, USA) beszárítottuk. Ezután reduktív aminálási reakcióval a végeztük a glikánok fluoreszcens jelölését, 1 µl 15 (V/V)% ecetsavban oldott, 0.2 M koncentrációjú 8-
45 Kísérleti rész aminopirén-1,3,6-triszulfonát (~0,1 mg/µl APTS) és 1 µl tetrahidrofuránban oldott 1 M koncentrációjú NaBH3CN hozzáadásával15. A jelölési reakciót 55°C-on 2 órán keresztül, vagy sziálsavat tartalmazó szerkezetek (fetuin és humán szérum minták) esetén 37 ºC-on éjszakán át, inkubáltuk. A reakciót 100 µl víz hozzáadásával a reakcióelegyhez állítottuk le.
2.1.4 Deszialilációs eljárás
A sziálsav csoportok eltávolítását a magzati szarvasmarha fetuinból neuraminidáz enzim
(type VI from Clostridium perfringens, Sigma-Aldrich) emésztéssel végeztük. Az emésztést 0,1 M koncentrációjú illékony karbonát, formiát és acetát pufferben (pH 5,5-re beállítva NH4OH-dal való titrálással) kiviteleztük. Az exoglikozidáz emésztés reakciópufferében oldottuk fel az enzimatikusan felszabadított magzati szarvasmarha fetuin glikánjait és 3,4 mU neuraminidáz enzimet. A reakció elegyet éjszakán át 37 ºC-on inkubáltuk, majd jégfürdőben tízszeres mennyiségű HPLC tisztaságú víz hozzáadásával állítottuk le. Ezután a mintákat az illékony pufferkomponensek eltávolítása céljából beszárítottuk a centrifugális vákuum bepárló készülékben (Savant).
2.1.5 Mintatisztítás
A reagálatlan jelölőanyag (APTS) eltávolítására az analízist megelőzően három módszert
próbáltunk ki. Ezeket az alábbiakban ismertetem. • MultiScreen szűrőplate: MultiScreen szűrőplate-be (Millipore, Bedford, MA, USA) töltöttünk 100 µl Sephadex G10 méretkizárásos kromatográfiás állófázist (SigmaAldrich), amit 100 µl APTS jelölési reakcióelegy tisztítására alkalmaztunk. A szűrést és méretkizárásos tisztítást Hettich 30RF centrifugában (Tutlingen, Németország) 2500 rpm fordulaton 15 perces centrifugálással végeztük. • G10 PhyTip: Az APTS feleslegének eltávolítását Sephadex G10 állófázissal töltött 200 ml térfogatú kromatográfiás pipettahegyekkel (PhyTip®, PhyNexus Inc., San José, CA, USA) is kiviteleztük 12-csatornás pipettával szerelt automata PhyNexus robot alkalmazásával. A PhyTip pipettahegyek 160 µl Sephadex G10 állófázist tartalmaztak. A kondicionáláshoz és elúcióhoz 50 (V/V)% acetonitrilt használtunk. • DPA-6S PhyTip: 10 µl DPA-6S normál fázisú kromatográfiás mikrokolonnákat hidrofil interakció kromatográfiás (HILIC) módban alkalmaztuk. 100 µl mintát 900 µl acetonitril hozzáadásával higítottunk a tisztítás előtt. A mosási ciklusoknál 95 (V/V)% acetonitrilt használtunk, az elúció 20 (V/V)% acetonitrillel történt. Nyolc
46 Anyagok és módszerek komplex szénhidrátok gél elektroforézises elemzéséhez pipettázási ciklussal került a minta fluoreszcensen jelölt szénhidráttartalma megkötésre, 24 mosási ciklus követte, négyszer 1,0 ml 95 (V/V)% acetonitril alkalmazásával (6-6 pipettázási ciklus minden aliquote-tal). A megkötött molekulákat 350 µl 20 (V/V)% acetonitrillel eluáltuk. A humán szérum minták szabad cukortartalma a jelölt glikánok analízisét zavarja. Ezért a vércukor eltávolítására az alábbi módszereket értékeltük: • Fordított fázisú pipetta hegyek: 5 μl C-18 fordított fázisú kromatográfiás gyantát tartalmazó, 200μl térfogatú pipetta hegyeket (PhyNexus) használtunk a humán szérum minták glükóztartalmának eltávolítására. A kromatográfiás pipetta hegyeket 1 (V/V)% trifluor-ecetsav (TFA) tartalmú acetonitrillel kondicionáltuk. 1 (V/V)% TFA tartalmú LC-MS tisztaságú vizet használtunk a mosási lépéseknél, és 1 (V/V)% TFA tartalmú 50 (V/V)% acetonitrilt az elúciónál. • Ultraszűrés: A humán szérum kis molekulatömegű összetevőinek eltávolítására 3 és 10 kDa pórusméretű Microcon (MilliporeBedford, MA, USA) centrifugális (Labofuge 400R centrifuge, Heraeus) ultraszűrési eljárást is alkalmaztunk. A cellulóz membránszűrő eszközöket 500 μl 0,1 M koncentrációjú NaOH oldattal majd 500μ l HPLC tisztaságú vízzel mostuk. A szérumot pipettával a membránra vittük, a centrifugális erő hatására az oldószer és a kisméretű molekulák átjutottak a membránon, amit három mosási lépés követett 150-150 μl HPLC tisztaságú vízzel. Majd a membránról a glikoproteineket az ultraszűrő eszköz fejjel lefelé fordításával egy steril Eppendorf csőbe nyertük vissza centrifugálással. A kihozatal maximalizálása érdekében a visszanyerési lépést négyszer megismételtük a membrán 10-10 μl HPLC tisztaságú vízzel történő mosása után.
2.1.6 Multikapilláris elektroforézis
A jelölt és megtisztított mintákat HPLC tisztaságú vízzel tízszeres térfogatra hígítva
CarbCE multikapilláris elektroforézis rendszerrel (eGene, Irvine, CA, USA) analizáltuk 12csatornás gél cartridge (GCK-CARB, eGene) használatával. A rendszer fényforrásként kék fényt emittáló diódákat (LED: light emitting diode; csúcs hullámhossz: 460-470 nm) használ. Az emittált fluoreszcens fény detektálása fotodiódákkal történik 520 nm-es hullámhosszúságú szűrővel. Az elválasztásokat 20 μm belső átmérőjű, 10 cm-es (12 kapilláris sorozat) vagy 30 cm-es (4 kapilláris sorozat) effektív hosszúságú kapillárisokban végeztük. A kapillárisokat polietilén-oxid tartalmú; acetát pufferrel (CARB Separation Solution, eGene) töltötte fel az
47 Kísérleti rész automata analizátor. A minták injektálása 20 másodpercig alkalmazott 2 kV feszültséggel elektrokinetikusan történt. Az elválasztásokat különböző feszültségekkel (2-8 kV) végeztük.
Boronsav - lektin affinitás kromatográfia hőmérséklet függésének vizsgálata
48
2.2 Boronsav - lektin affinitás kromatográfia hőmérséklet függésének vizsgálata 2.2.1 Felhasznált vegyszerek
A tripszin inhibitor (III. típus tojásfehérjéből, ami 15,5 (m/m)% lizozim szennyezést
tartalmazott), ribonukleáz B (szarvasmarha hasnyálmirigyből; ≥50 Kunitz egység/mg fehérje) és mioglobin (ló szívből, sómentes liofilizált por) fehérje standardokat a Sigma-Aldrichtól
szereztük be. A pufferekhez taurin, CaCl2, MnCl2, MgCl2 NaN3 és foszforsav (SigmaAldrich) kerültek felhasználásra, míg az eluensekhez LC-MS tisztaságú acetonitrilt, HPLC tisztaságú vizet, trifluor-ecetsavat (mind Sigma-Aldrich) és sósavat (Merck, Haar, Németország) használtunk.
2.2.2 Boronsav, WGA és BLAC/WGA mikropreparatív glikoaffinitás kromatográfia Három különböző affinitás mikrokolonnát használtunk a kísérletekhez: •
5 µl m-aminofenil-boronsavval (boronsav) derivatizált agaróz állófázis;
•
5 µl búzacsíra agglutinin (WGA) borítású agaróz állófázis;
•
2,5 µl agarózon immobilizált boronsav és 2,5 µl agarózon immobilizált WGA keveréke (BLAC/WGA).
Az affinitás kromatográfiás állófázisok 200 µl térfogatú pipetta hegyekbe lettek töltve (PhyTip®, PhyNexus Inc., San José, CA, USA). A mikrokolonnákat integrált, programozható 96 lyukú lemez (96 well plate) hűtő illetve fűtő egységet tartalmazó sokcsatornás automata pipettával (Rainin, Oakland, CA, USA) szerelt automata robottal (PhyNexus) alkalmaztuk. A pipetta áramlási sebességét 250 µl/perc értékre állítottuk a PhyNexus Controller szoftverrel. A mikrokolonnákat 4 °C-on glicerinben tároltuk, és minta szennyeződését elkerülendő, csak egyszer használtuk. Az affinitás kromatográfiás állófázisokat vízzel majd 20 mM koncentrációjú, 2,85-ös pHjú foszfát pufferrel mostuk a glicerin eltávolítása érdekében, majd ismét vizes mosási lépés következett. A mosási lépésekhez 10-10 pipettázási ciklust alkalmaztunk. Ezután az oszlopokat 3×10 pipettázási ciklussal kondicionáltuk megkötő pufferrel (BLAC binding buffer: 50 mM taurin, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, 20 mM MgCl2, 0,05 (m/m) % NaN3, pH
49 Kísérleti rész 8,7). A megkötési lépést 100 µl mintaoldatot és 100 µl megkötő puffer keverékéből 50 ciklussal kiviteleztük. A mintaoldat 10 mg/ml koncentrációjú fehérjeoldatok keverékéből állt; azaz 33 µl 10 mg/ml tripszin inhibitort (boronsav specifikus), 33 µl 10 mg/ml ribonukleáz B-t (WGA specifikus) és 33 µl 10 mg/ml mioglobint (negatív kontroll) tartalmazott53,149. A nem kötődő fehérjéket 2×10 ciklussal mostuk le az oszlopról, 100-100 µl megkötő puffert használva. Végül 100 µl 0,1 M koncentrációjú sósav oldattal eluáltuk a megkötött fehérjéket (20 pipettázási ciklussal), amit vagy azonnal analizáltunk vagy -80 °C-on tároltuk.
2.2.3 A minták RP-HPLC és MALDI-TOF-MS analízise
Transgenomic típusú HPLC készüléket (Omaha, NE, USA) használtunk, UV-Vis
detektálással (214 nm), Zorbax Eclipse XDB-C18 fordított fázisú kromatográfiás oszloppal (250×4,6 mm, 5 µm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Az injektált mintatérfogat 70 µl volt. A mozgófázis 0,05 (V/V)% trifluor-ecetsav tartalmú víz és acetonitril volt. Az elemzés során gradiens elúciót alkalmaztunk 20-60 (V/V)% acetonitrillel 17 perc alatt 1 ml/perc térfogatárammal. A PeakFit (ver4.12, SeaSolve Software Inc., San José, CA) szoftvert használtunk a kromatogramok kiértékeléséhez. Alapvonal-korrekció után exponenciálisan módosított Gauss görbéket (EMG) illesztettünk a kromatográfiás csúcsokra a csúcsterületek alapján történő mennyiségi meghatározásokhoz150-151. A kromatográfiásan elválasztott frakciókat összegyűjtöttük, és MALDI-TOF-MS (Ultraflex III TOF-TOF mass spectrometer, Brucker Daltonics, Bréma, Németország) analízist is végeztünk. Szinapinsavat, α-ciano-4-hidroxi-fahéjsavat és 2,5-dihidroxibenzoesavat (DHB) használtunk mátrixként. A mátrixanyagokat a Sigma-Aldrichtól szereztük be. A lézer beállításai a következők voltak: 500 lövés és 30-50% intenzitás.
50 Mikroaffinitás kromatográfiás glikoziláció profilozáshoz felhasznált anyagok és módszerek
2.3 Mikroaffinitás kromatográfiás glikoziláció profilozáshoz felhasznált anyagok és módszerek 2.3.1 Felhasznált vegyszerek és minták
A 1200 µl térfogatú, 10 µl DPA-6S normál fázisú poliamid állófázist tartalmazó és a 200
µl térfogatú, 5 µl agarózon immobilizált boronsavat és konkanavalin A-t (BLAC/ConA) tartalmazó kromatográfiás pipetta hegyeket az igényeink alapján a PhyNexus Inc. egyedileg bocsátotta rendelkezésre, melyekre a továbbiakban PhyTip-ként hivatkozok (PhyNexus Inc., San José, CA, USA). A 2-amino-2-hidroximetil-propán-1,3-diol (TRIS) a Fluka-tól (Buchs, Switzerland) származott, míg az 8-aminopirén-1,3,6-triszulfonsav (APTS), ecetsav, NaBH3CN (1 M tetrahidrofuránban), trifluor-ecetsav, taurin, nátrium-klorid, magnézium-
klorid, mangán-klorid-tetrahidrát, nátrium-azid, kálcium-klorid, peptid-N-glikozidáz F (PNGaseF) és etanol a Sigma-Aldrich-tól (St. Louis, MO, USA) kerültek beszerzésre. A Microcon ultraszűrő eszközök (0,5 ml, 3 kDa pórusméret) a Millipore cég (Bedford, MA, USA) termékei. A denaturáló, G7 és NP-40 reakció pufferek az endoglikozidáz puffer készlet részei (Endoglycosidase buffer kit, New England BioLabs, Ipswich, MA, USA). Sósav oldatot a Merck-től (Haar, Germany) rendeltük. A kevert normál szérum mintákat a Dunn Labortechnik-től (Asbach, Germany) sikerült beszerezni. A prosztatarákos szérum mintákat a páciensek hozzájárulásával a budapesti Semmelweiss Egyetem Központi Laboratóriuma bocsátotta rendelkezésünkre.
2.3.2 Kismolekulájú zavaró mátrix eltávolítása ultraszűréssel
A humán szérum kis molekulatömegű összetevői, elsősorban glükóz tartalma, 3 kDa
pórusméretű
Microcon
centrifugális
ultraszűrő
eszközök
felhasználásával
kerültek
eltávolításra 13000 rpm fordulat 45 percig történő alkalmazásával a szűréshez (Labofuge 400R
centrifuga,
Heraeus,
Osterode,
Németország).
A
cellulóz
szűrőmembrán
kondicionálását, az ultraszűrést és a makromolekulák visszanyerését a 2.1.5 fejezetben leírtak szerint végeztük.
51 Kísérleti rész
2.3.3 BLAC/ConA glikoaffinitás eljárás
2,5 µl agarózhoz kötött konkanavalin A és 2,5 µl m-aminofenil-boronsavval
funkcionalizált agaróz gyöngyöket (BLAC/ConA) tartalmazó állófázisokkal töltött 200 µl térfogatú PhyTip kromatográfiás pipetta hegyeket alkalmaztunk automata 12-csatornás pipettával (Rainin, Oakland, CA, USA) felszerelt programozható robottal (PhyNexus). A pipetta áramlási sebessége 250 µl/min értékre került beállításra PhyNexus Conroller szoftver segítségével. A pipetta hegyeket 4°C-on glicerinben tároltuk, és a minta „carry-over” által történő szennyeződésének kiküszöbölése érdekében egyszer használtuk. A glikoprotein megkötést megelőzően a BLAC/ConA mikropreparatív eszközöket a glicerin eltávolítása céljából 100 µl vízzel mostuk át149. Ezt egy további mosólépés követte 100 µl 20 mM koncentrációjú foszfát pufferrel (pH 2,85), majd ismét 100 µl nagytisztaságú vízzel. Az összes felsorolt lépés tíz-tíz pipettázási ciklus kivitelezésével történt. Ezután a BLAC/ConA hegyek kondicionálása következett 3×10 ciklussal 100-100 µl friss BLAC/ConA megkötő pufferrel (50 mM taurin, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, 20 mM MgCl2, 0,05 (m/m)% NaN3, pH 8,7). A mosást és kondicionálást követően a BLAC/ConA mikropreparatív kolonnákat a glikoproteinek affinitás alapú megkötésére használtuk 100 µl BLAC/ConA megkötő pufferhez adott 100 µl humán szérumból. A megkötési lépés 50 pipettázási ciklusból állt. A megkötési lépést a nem-specifikusan adszorbeált fehérjék eltávolítása követte három lépésben 20-20 ciklussal 100-100 µl BLAC/ConA megkötő pufferrel. Végül a megkötött glikoproteineket 100 µl 0,1 M koncentrációjú sósav oldattal eluáltuk 20 pipettázási ciklussal. Az így izolált glikoproteinek azonnali felhasználásra vagy a felhasználásig −20 °C-on tárolásra kerültek.
2.3.4 Az N-glikánok enzimatikus felszabadítása
A tisztított és izolált glikoproteineket tartalmazó oldatokat SpeedVac vákuum
centrifugában (Savant Instruments, Farmingdale, NY, USA) beszárítottuk és 10 µl HPLC tisztaságú vízben feloldottuk. Majd 1 µl denaturáló puffer (Endoglycosidase buffer kit, New England BioLabs) hozzáadása után 10 percig 100 °C-on inkubáltuk. A glikoproteinekhez 3 U PNGaseF (1 U/µl koncentrációjú) enzimet adtunk, mellyel az N-glikánok felszabadítását 25 µl reakciótérfogatban (2,5 µl G7 és 2,5 µl NP40 puffert az Endoglycosidase buffer kit-ből és további 6 µl HPLC tisztaságú vizet hozzáadva) 37 °C-on 2 órás inkubálással kiviteleztük14. A deglikozilált fehérjéket ezután háromszoros térfogatú előhűtött etanol hozzáadásával
52 Mikroaffinitás kromatográfiás glikoziláció profilozáshoz felhasznált anyagok és módszerek jégfürdőn kicsaptuk az oldatból, és 11000 rpm fordulaton 10 percig centrifugálva (Labofuge 400R, Heraeus) az oldott szénhidrátoktól elválasztottuk.
2.3.5 Fluoreszcens jelölés
A glikánokat tartalmazó felülúszókat SpeedVac vákuum centrifugában (Savant
Instruments) 0,2 ml térfogatú PCR-csövekben beszárítottuk. A mintákat reduktív aminálási reakcióval jelöltük meg 1 µl 15 (V/V)% ecetsavban oldott 0,2 M koncentrációjú 8aminopirén-1,3,6-triszulfonsav (APTS) és 1 µl tetrahidrofuránban oldott 1 M koncentrációjú NaBH3CN hozzáadását követően 37°C-on egész éjszakán át inkubálva. A reakciót 100 µl víz hozzáadásával állítottuk le.
2.3.6 Poszt-derivatizációs tisztítás
1200 µl térfogatú 10 μl DPA-6S normál fázisú kromatográfiás állófázist tartalmazó pipetta
hegyekkel (PhyNexus) tisztítottuk meg a jelölt mintákat a szabad, reagálatlan jelölőanyag
feleslegétől. 100 μl mintát 900 μl acetonitrillel hígítottuk fel a tisztítási eljárást megelőzően. A mosási lépéseket 95 (V/V)% acetonitrillel, az elúciót pedig 20 (V/V)% acetonitrillel végeztük. Az automata robot áramlási sebességét 1,2 ml/perc értékre állítottuk be, és 8 pipettázási ciklus alkalmazása után a megkötési lépésben három mosási lépést iktattunk be 1-1 ml 95 (V/V)% acetonitrillel, mindhárom lépésben 8-8 pipettázási ciklust kivitelezve. Végül megkötött APTS jelölt oligoszacharidokat 350 μl térfogatú 20 (V/V)% acetonitrillel eluáltuk.
2.3.7 Komparatív glikán profilozás kapilláris gél elektroforézissel
A tisztított APTS jelölt glikán mintákat tízszeres hígításban (HPLC tisztaságú vízzel)
CarbCE multikapilláris elektroforézis készülékkel (eGene, Irvine, CA, USA) elemeztük. A háttér elektrolit polietilén-oxid (7000 kDa) tartalmú 25 mM koncentrációjú acetát puffer volt (pH 4,75)16-17. Kék fényt emittáló dióda (LED, emissziós csúcs hullámhossz: 460-470 nm) fényforrással történt az gerjesztés, az emittált fluoreszcens fény detektálása fotodiódákkal 520 nm-es szűrővel történt. Az elválasztásokat 4-csatornás multikapilláris (20 μm belső átmérőjű) cartridge alkalmazásával végeztük 30 cm effektív elválasztási hosszal. A mintabevitel elektrokinetikus injektálással 2 kV feszültség 20 másodpercig történő alkalmazásával lett kivitelezve. Az elválasztásokat 2-8 kV alkalmazott feszültségekkel végeztük.
53 Kísérleti rész
2.4 CZE peptid mobilitások modellezéséhez felhasznált anyagok és módszerek Munkám kisméretű peptidek kapilláris zóna elektroforetikus mobilitásra vonatkozó szerkezet-mobilitás összefüggéseinek vizsgálatára terjedt ki, az elválasztási körülmények szisztematikus változtatásával. Öt különböző, az elválasztást befolyásoló tényezőt, nevezetesen a hőmérsékletet (T [°C]), az alkalmazott feszültséget (U [kV]), a háttér elektrolit (BGE: background electrolyte) koncentrációját (CBGE [mM]) és a szerves adalékanyagok – mint az acetonitril (CACN [(V/V)%]) és metanol (CMeOH [(V/V)%]) – koncentrációját (CORG), választottuk ki elméleti megfontolások alapján, hogy az elektroforetikus migrációs tulajdonságokat befolyásoló különböző hatások széles skáláját lefedjék. Az öt változó CZE elválasztási paraméter hatásának vizsgálata részletes kísérleti tervezést tett szükségessé, annak érdekében, hogy a kísérletek számát sikerüljön ésszerű korlátok között tartani anélkül, hogy az egyes paraméterek hatásait szem elől tévesztenénk. Minden egyes paraméterhez nagyjából öt különböző értékre volt szükség, hogy a kapott adatpontokra görbét illesztve a hatás természete értékelhető legyen. Így, az összes lehetséges eset (paraméterkombináció) számbavétele az említett öt paraméterhez, több mint 3100 kísérleti elválasztást eredményez. Sőt, figyelembe véve, hogy a reprodukálhatóság biztosításának érdekében minden elválasztásról indokolt három ismétlést kivitelezni, ez a szám tovább nő, 9000-et is meghaladva. Ezek a tények magától értetődően indokolták a bemutatott, alapvetően paraméter vezérelt megközelítés leszűkítését korlátozott számú peptidmintára. Mindazonáltal a mintákat gondosan kellett kiválasztani, hogy a különböző jellegű aminosavakat (apoláris, poláris, kationos, anionos és aromás jellegű oldalláncok) jól reprezentálják. Az ismertetett körülmények vizsgálatához szükséges kísérletek hatalmas mennyisége a mérési pontok számának jelentős csökkentését tette szükségessé. Ezért két elkülönülő kísérleti tervet dolgoztunk ki. Így az első fázisban vizsgált független paraméterek a második kísérleti fázisból kihagyhatóvá váltak. Ezen felül külön figyelmet fordíthattunk két, egymással összefüggő, az elválasztást jelentősen befolyásoló tényezőre, nevezetesen a CBGE-CORG és TCORG, melyek különös jelentőséggel bírnak. A peptidmobilitás-modellezés irodalmának összefoglalása (1.3 fejezet; publikálva:
141
)
alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a korábbi munkák sem a szerves puffer
54 CZE peptid mobilitások modellezéséhez felhasznált anyagok és módszerek adalékok, sem az elektrolit koncentrációjának, sem pedig az elválasztás hőmérsékletének hatásait nem vizsgálták, annak ellenére, hogy ezeket a peptidanalízist jelentősen befolyásoló tényezőknek tekintik. Erre vonatkozólag a CBGE-CORG és a T-CORG komplex hatását vizsgálva – ahol különösen az utóbbi tarthat számot kiemelt érdeklődésre – egy további előremutató lépést sikerült tenni. Következtetésként elmondható, hogy a kísérleti fázisokat különböző, többnyire független paraméterek változtatásával terveztük meg, különös hangsúllyal CBGE-CORG és T-CORG hatásaira. A két jól elkülönülő kísérleti fázis így kerül jelölésre a továbbiakban is. Utolsó lépésként a két modellezési fázisban kapott adatokat és információkat megfelelő illesztést (közös paraméterek) alkalmazva egyesíteni kellett, lehetővé téve a még komplexebb elválasztási paraméterfüggés vizsgálatát.
2.4.1 Vegyszerek Homogén aminosav-összetételű tripeptid mintákat alkalmaztunk a kísérletekhez. Az alanin (AAA), lizin (KKK) és tirozin (YYY) aminosavakból felépülő tripeptidek a Sigma-Aldrichtól (St. Louis, MO, USA) kerültek beszerzésre. Az aszparginsav (DDD) és szerin (SSS) tripeptidjeit a Bachem Holding AG-tól (Bubendorf, Svájc) rendeltük. Az elektroozmotikus áramlás (EOF: electoosmotic flow) jelzésére szolgáló EOF markerként 0,01 (V/V)% dimetilszulfoxidot (DMSO; Sigma-Aldrich) alkalmaztunk. A kapilláris kondicionálásához és a futtató pufferek pH-jának beállítására sósavat (Sigma-Aldrich) és nátrium-hidroxidot (Merck, Darmstadt, Németország) használtunk. A háttér elektrolitok pufferkomponenseként foszforsavat (Sigma-Aldrich), szerves adalékanyagként metanolt és acetonitrilt (Riedel-de Haen AG, Buch, Svájc) használtunk. Minden oldatot HPLC tisztaságú vízzel (Sigma-Aldrich) és kizárólag analitikai tisztaságú vegyszerekkel készítettünk.
2.4.2 Készülékek, műszerek Minden kísérleti elválasztást 50 µm belső, 360 µm külső átmérőjű bevonatlan kvarc kapillárisban (bare fused silica capillary Polymicro Technologies, Tucson, AZ, USA), Beckman P/ACE MDQ kapilláris elektroforézis készüléken (Beckman Coultier, Fullerton, CA, USA) kiviteleztünk. A kapillárisok teljes hossza 40 cm, effektív elválasztási hossza az injektálástól a detektorig 10 cm volt. A detektálás 214 nm hullámhosszon történt. Az elválasztás hőmérsékletét 20-40°C között 5°C-onkénti lépésekkel változtattuk a T-CORG fázisban, míg a CBGE-CORG kísérleti tervet állandó 25°C hőmérsékleten kiviteleztük.
55 Kísérleti rész
2.4.3 Elválasztási körülmények Az összeállított kísérleti terv kivitelezését megelőzően, a kísérleti reprodukálhatóság biztosításának érdekében, a megfelelő kapilláris kondicionálási módszer kidolgozása elengedhetetlen. Ez az időigényes feladat hosszas gyakorlati tesztelést igényelt a kiválasztott kapillárissal és pufferrel. A cél a leghatékonyabb kondicionálási módszer megtalálása, azaz különböző oldatokkal meghatározott ideig való mosás, a kapilláris belső falának tisztítására, az elektromos kettősréteg kialakítására, és ezáltal az ismételhető elválasztási környezet biztosítására. A végső kondicionálási módszert, mely vizes és nátrium-hidroxidos (1M) mosások sorozatát tartalmazza, a 8. ábra szemlélteti.
8. ábra: Kapilláris kondicionálás módszere (Beckman 32 Karat szoftver)
A kapilláris kondicionálással ellentétben, az elválasztási körülmények némileg eltérőek a két kísérleti fázisnál, ezért külön bekezdésekben kerülnek bemutatásra. 2.4.3.1 T-CORG elválasztási körülményei
A tripeptidek elektroforetikus tulajdonságainak vizsgálatára a méréseket 20, 25, 30, 35 és
40°C-on, foszforsavból készített 7,5-ös pH-jú pufferekkel végeztük. A futtató pufferek koncentrációja 30 mM volt, és öt különböző mennyiségű szerves adalékot (0, 5, 10, 15 és 20 (V/V)% MeOH) tartalmaztak. Két eltérő feszültség, 12 és 16 kV, alkalmazása mellett
kiviteleztük az elválasztásokat. A vizsgált tripeptideket úgy választottuk ki, hogy az öt fő aminosav karakterisztikát – apoláris (alanin tripeptid), poláris (szerin tripeptid), savas (aszparginsav tripeptid), bázikus (lizin tripeptid) és aromás (tirozin tripeptid) – képviseljék. Minden tripeptidet öt különböző pufferrel, két eltérő elektromos térerő hatására, öt különböző hőmérsékleten futtattunk meg, 50 kísérletet eredményezve tripeptid mintánként. A minták nyomás (1 psi 4 másodpercig) hatására kerültek a kapillárisba injektálásra. Minden kísérleti ponton három ismételt futtatást kiviteleztünk. A kapillárist minden ilyen tripla mérés között vízzel és 1 M NaOH-dal kondicionáltuk (lásd 8. ábra). A kapilláris minden
56 CZE peptid mobilitások modellezéséhez felhasznált anyagok és módszerek egyes mérés előtt a háttér elektrolittal került nyomás hatására (10 psi 5 percig) átmosásra. A tripeptidek mobilitásának kiszámításához minden mérés során referencia EOF marker is injektálásra került. Az elválasztási módszert – 12 kV feszültség hatására 40°C-on történő elválasztás esetén – részletesen, lépésenként az 5. táblázat szemlélteti. Az elválasztás időtartamára külön figyelmet kellett fordítani, mivel ez jelentős eltéréseket mutat a különböző futások közt, és nehezen látható előre. Bár a futási idő becslését a rutin segíti, legtöbb esetben kísérletileg kellett meghatározni minden paraméter-kombinációhoz, hogy minden injektált minta ésszerű mérési idő mellett detektálásra kerüljön. 5. táblázat: T-CORG elválasztási módszer 40°C-on 12 kV-tal Esemény
Értéke
Kapilláris hőmérséklet
40°C
Mosás – Nyomás
10,0 psi
Várakozás Injektálás – Nyomás
1,0 psi
Várakozás Injektálás – Nyomás
1,0 psi
Várakozás Szeparálás – Feszültség
12 kV
Időtartam
Megjegyzés Kapilláris temperálása
5,00 min
Pufferes mosás
1,00 min
Hőmérséklet stabilizálása
4,0 sec
EOF marker injektálása
0,05 min
Kapilláris külsejének vizes mosása
4,0 sec
Minta injektálása
0,05 min
Kapilláris külsejének vizes mosása
8,00 min
Elválasztás (változó időtartam)
Stop Data
2.4.3.2 CBGE-CORG elválasztási körülmények
Ebben a kísérleti fázisban öt különböző mennyiségű szerves adalékot tartalmazó (0, 10 és
20 (V/V)% MeOH és ACN), és öt eltérő koncentrációjú (10-50 mM) 7,5-ös pH-jú pufferrel,
négy eltérő elektromos térerőség (100, 200, 300, 400 V/cm) hatására végeztük az elválasztásokat. A T-CORG kísérleti fázisban alkalmazott öt, különböző oldallánc karakterisztikájú aminosavból felépülő, tripeptid mintát használtuk ebben a kísérleti fázisban is. Minden tripeptidet 25 különböző összetételű pufferrel, négy eltérő elektromos tér hatására analizáltunk, 100 kísérletet eredményezve tripeptidenként. Az injektálás 1 psi nyomás négy másodperces alkalmazásával történt. A reprodukálhatóság biztosítása érdekében három párhuzamos mérést kiviteleztünk. A kapillárist minden tripla mérés között kondicionáltuk (lásd 8. ábra). Az injektálások előtt a kapilláris a megfelelő pufferrel került átmosásra (10 psi, 5 min). Referencia EOF markerként DMSO-t injektáltunk (10 psi, 4 sec), a tripeptidek mobilitásainak számításához.
57 Kísérleti rész
2.4.4 Kísérleti értékelés Az elektroforetikus mobilitásokat a detektált migrációs időkből az alábbi egyenlet alapján számítottuk:
v E
µi = i =
vi ⋅ LT LD LT 1 1 = − U U ti t EOF
[cm 2 ⋅ V −1 ⋅ s −1 ]
(15)
ahol ν i az i-edik mintakomponens lineáris sebessége a kapillárisban, E az elektromos térerősség, LT a kapilláris teljes hossza, U az alkalmazott feszültség, LD a kapilláris effektív hossza (az injektálástól a detektálásig), ti az i-edik mintakomponens migrációs ideje és t EOF az EOF marker migrációs ideje. A kísérleti reprodukálhatóság értékelésére, illetve az esetleges eltérések azonosítására statisztikai analízist végeztünk. Minden mérési tripletre kiszámítottuk a standard deviációkat (SD; σ), és összehasonlítottuk minden különálló mintacsoport esetén, azaz minden mintára (AAA, DDD, KKK, SSS, YYY) egy-egy csoportértéket kaptunk. Minden a csoport 90. percentilisét (P90) meghaladó értéknél újra megvizsgáltuk. Egyedi eltérések esetén a migrációs időket ellenőriztük, és amennyiben megfelelőnek bizonyultak, a kiugró futás értékét eltávolítottuk az adattripletből. Súlyosabb esetekben, amikor egyetlen kiugró kísérleti elválasztás eltávolítása nem eredményezett alacsonyabb SD értéket, a teljes mérési triplet megismétlésre került. A különböző minták reprodukálhatósági eltéréseinek értékelése, vagy a migráció mobilitási pontossággal való összevetése érdekében az eloszlás normalizált mérőszámára volt szükség. A variációs együttható (CV, coefficient of variation) és a relatív standard deviáció (%RSD) megfeleltek e feltételnek. A CV a standard deviáció és az átlag hányadosával adható meg:
CV =
σ
(16)
x
ahol σ a standard deviáció és x az átlagérték. A %RSD értéke százalékban kerül kifejezésre és a variációs együttható abszolút értékeként definiálható:
%RSD =
σ ⋅100 x
(17)
A %RSD értékét minden mintacsoportban, a migrációs időkre és a mobilitás értékekre egyaránt, kiszámítottuk a kapott értékek összehasonlítása érdekében.
58 CZE peptid mobilitások modellezéséhez felhasznált anyagok és módszerek 2.4.4.1 A minták szerkezeti jellemzőinek meghatározása
Láthattuk a 1.3 fejezetben, hogy a QSPR modellek kidolgozásához nélkülözhetetlen a
peptidek molekulaméretének (leggyakrabban molekulatömeggel kifejezve), és az adott pH-jú pufferben a töltésének az ismerete. A mintapeptidek méretének jellemzésére a molekulatömeg, mint szerkezeti jellemző választása kézenfekvő. A vizsgált peptidek molekulatömegeit az aminosav alkotóik molekulatömegeiből számítottuk: M =
n
∑ M − ( n − 1) ⋅ M i
i =1
H 2O
(18)
ahol M a peptid minta molekulatömege, n az aminosav alkotók száma, M i az i-edik aminosav molekulatömege és
M H 2O
a peptid kötés kialakulása során kilépő víz
molekulatömege. A szakirodalomban leggyakrabban a Henderson-Hasselbach egyenlet ((19),(20) és (21) egyenletek) alapján számítják a töltést111,152. Itt a peptid effektív (nettó) töltése a polipeptid lánc ionizálható csoportjainak egymástól független töltéseinek összegeként adódik: Pt = ∑ j
1 + 10
Nt = ∑ i
10(
1 ( pH − pK j )
(19)
pH − pKi )
1 + 10(
pH − pKi )
Q= Pt − N t
(20)
(21)
ahol Q a molekula töltése, Pt a pozitív töltések összege a molekulában, N t a negatív töltések összege, pK j a j-edik aminosav savas funkciós csoportjának disszociációs állandójának negatív tízes alapú logaritmusa, pK i az i-edik aminosav bázisos csoportjának disszociációs állandójának negatív tízes alapú logaritmusa. A töltés az aminosav-szekvenciából kerül kiszámításra, az ionizálható csoportok disszociációs állandóinak ismeretében105. Általában adott aminosav ionizálható funkciós csoportjának disszociációs állandóját a peptid felépítésétől függetlenül konstans értéknek tekintik. Ugyanakkor a valóságban, különösen kisméretű peptidek esetén, az ionizálható funkciós csoportok nem függetlenek egymástól. A pK értékek nem csak az aminosavak minőségétől, hanem azok a peptid láncon való sztérikus elhelyezkedésétől is függenek105. A mintapeptidek töltéseinek számításához ezeket a megfontolásokat is igyekeztünk figyelembe
59 Kísérleti rész venni, hogy megfelelően precíz értékeket kapjunk. Ezért Mathematica7 (Wolfram Research Inc, Champaign, IL, USA) szoftver felhasználásával több számítási módszert is alkalmaztunk az irodalmi eredményekre alapozva111,153. A peptidek pK értékeinek meghatározásához Pallas 3.5.1.1 pKalc (CompuDrug International Inc, Sedona, AZ, USA) szoftvert használtuk, mely a molekula szerkezeti képletéből nagy pontossággal képes becsülni, és számos esetben (a szoftver adatbázisában megtalálható molekuláknál) a számított értékek kísérleti titrálásokkal meghatározott értékekkel is validálhatók.
2.4.5 Modellezési módszerek Átfogó irodalmi kutatómunkát végeztünk a molekuláris szerkezet, a CZE elválasztási paraméterek és az elektroforetikus mobilitás összefüggésék jellemzésére (az 1.3 fejezet foglalja össze, publikálva:
141
). Az összefüggés modellezésére a kétváltozós szemi-empirikus
(TVSE: two variable semi empirical) és a mesterséges neurális hálózat megközelítést egyaránt megvizsgáltuk. A szemi-empirikus modellek közül egyértelműen az Offord-modell ((3) egyenlet106) korrelációja bizonyult a legjobbnak az előtanulmányok alapján, ezért ezt választottuk, hogy a kísérleti adathalmazra megvizsgáljuk. Az ANN modellekkel szemben, melyeknél az inputok száma gyakorlatilag korlátlan lehet, az Offord-modell mindössze két paramétert – a töltés ( Q ) és molekulatömeg ( M ) – tartalmaz. Így az Offord-modellel történő mobilitás-számításhoz, minden egyéb elválasztási paramétertől függetlenül, kizárólag a (3) egyenlet két input változójára van szükség. Ezzel szemben az ANN modellekhez minden további rendelkezésre álló paraméter – CMeOH, U, Q, M a T-CORG, illetve CBGE, CACN, CMeOH, U, Q, M a CBGE-CORG kísérleti fázisban – is alkalmazható bemenetként. A két kísérleti adatbázis egyesítésére is lehetőség van a közös input paraméterek (T, CBGE, CACN, CMeOH, U, Q, és M) alapján. Az ANN modellek inputjait és jellemzőit a 6. táblázat foglalja össze. Az input mátrix egy kivonatára (egy-egy kísérleti körülménnyel mintapeptidenként) a (22) egyenlet mutat példát: CBGE C ACN CMeOH inputokCBGE= _ CORG = U Q M
20 30 40 50 10 10 0 20 0 0 0 0 10 0 20 12 8 4 4 16 2, 0 −1, 003 5, 0 2,998 1,992 231, 25 363, 28 402, 61 279, 25 507,52
(22)
60 CZE peptid mobilitások modellezéséhez felhasznált anyagok és módszerek A TVSE és az ANN modellekkel egyaránt a megadott inputparaméterek alapján történik a mobilitás értékek meghatározása. Eltérően az Offord-modelltől, az ellenőrzött tanulású (supervised training) ANN metodológia a kalibrációhoz további adatokat igényel, ami az egyes inputvektorokhoz tartozó célértékeket jelenti. A (23) egyenlet a (22) inputmátrixhoz tartozó célvektor, azaz az adott elválasztási körülmény mellett a megfelelő peptidekre kapott mobilitás értékek. célokCBGE _ CORG = ( µ EXP ) = (1, 06 ⋅10−4
4,30 ⋅10−4 1, 28 ⋅10−4 1,59 ⋅10−4
8,89 ⋅10−5 ) (23)
Az ANN inputok és célok mátrixait egy Java program segítségével építettük fel, ami egy MSc diplomamunka154 keretében került megírásra. Minden kísérleti mobilitás értéket fel kellett dolgozni, összegyűjteni a megfelelő elválasztási paraméterekkel együtt, és beírni az input- és célmátrixok megfelelő helyeire. 6. táblázat: ANN modelljellemzők
Input vektorok száma Input paraméterek
T-CORG
CBGE-CORG
Egyesített
710
1783
2493
T, CMeOH, U, Q, M
CBGE, CACN, CMeOH, U, Q, M
T, CBGE, CACN, CMeOH, U, Q, M
Input réteg csomópontjai
5
6
7
Rejtett csomópontok
8
8
10
Output réteg csomópontjai
1
1
1
Mint korábban jeleztem, a közvetlen összehasonlíthatóság és az eredmények kritikai értékelése érdekében, az Offord-féle TVSE és több ANN modellt is alkalmaztunk a kísérletileg kapott adatbázisokra (T-CORG, CBGE-CORG). Emellett a T-CORG adathalmazon két eltérő ANN tanulási (training) algoritmust is megvizsgáltunk, teljesítményük és CZE mobilitás modellezésre való alkalmazhatóságuk alapján. Majd a TVSE és az ANN módszerek legalkalmasabbikát a két adathalmaz uniójára is alkalmaztuk. A modellalkotás módszertanát az alábbiakban kísérleti adathalmazonkénti bontásban ismertetem részletesebben. 2.4.5.1 T-CORG modellezési fázis
A T-CORG adathalmazra három különböző modellezési megközelítést is vizsgáltunk, nevezetesen az Offord-modellt, egy momentum és adaptív tanulási arány alapú ANN-t (GDX: gradient descent algorithm with variable learning rate) és egy ANN-t Levenberg-Marquardt tanulási algoritmussal (LM). A neurális hálózat modellek felépítésének sémáját a 8. ábra szemlélteti, míg a főbb paramétereiket a 7. táblázat foglalja össze. A rejtett réteg neuronjainál szigmoid transzfer függvényeket, míg az output réteg csomópontjainál lineáris függvényeket
61 Kísérleti rész alkalmaztunk. A mért mobilitás értékeket tanulási (60%), teszt (20%) és validálási (20%) halmazokra osztottuk. A 7. táblázat szerinti felépítésű ANN modelleket, a megfelelő tanulási algoritmusok alkalmazásával az adathalmazokon, Matlab (Natick, MA, USA) környezetben képeztük le. 7. táblázat: A T-CORG kísérleti fázis ANN modelljeinek paraméterei
9. ábra: T-CORG ANN modellek felépítése
Paraméter
ANN GDX
ANN LM
Max_epochs
5000
1000
Idő
Korlátlan
Korlátlan
Max_fail
20
6
Learning rate
1,00e-003
LR_inc
1,05
LR_dec
0,70
Max_perf_inc
1,04
MC
0,90
Min_grad
1,00e-010
1,00e-010
MU
1,00e-003
MU_inc
10
MU_dec
0,1
MU_max
1,00e+010
Az ANN tanulási folyamat akkor került leállításra, amikor az iterációk száma elérte Max_epochs értékét, vagy a gradiens mértéke kisebb lett, mint Min_grad, illetve ha a tanulás időtartama meghaladta volna a megadott értéket (ez mindkét esetben korlátlan volt). A Max_fail a tanulás korai leállítására vonatkozó technika paramétere. A technika alkalmazása érdekében a rendelkezésre álló adatokat három részhalmazra osztottuk a fentebb leírtak szerint. A tanulási halmaz a gradiens számításához, a hálózat súlytényezőinek és eltéréseinek (bias) meghatározásához kerül felhasználásra. A tanulási folyamat során a hiba (error) a validációs halmazon követhető figyelemmel. A validálási hiba a tanulás kezdeti szakaszában általában a tanulási halmaz hibájával együtt csökken. Ugyanakkor, ha a hálózat túlilleszti (overfitting) az adatokat, a validálási halmaz hibája jellemzően növekedni kezd. Ha a validálási hiba egy meghatározott számú iteráción keresztül (Max_fail) növekszik, a tanulási folyamat leáll, és a legkisebb validálási hibához tartozó súlytényezők és eltérések kerülnek kiválasztásra. A teszt halmaz hibája nem került a tanulás során felhasználásra. Ezt a különböző modellek összehasonlításához alkalmaztuk. Ugyanakkor hasznosnak bizonyult a teszt halmaz hibájának ábrázolása a tanulási folyamat során. Ha a teszt halmaz hibája jelentősen eltérő számú iterációs ciklusnál ér el minimumot, mint a validálási halmaz hibája, az a kísérleti adathalmaz nem megfelelő felosztásáról árulkodik155. A korai leállítási technikát a modell általánosíthatóságának biztosítása érdekében alkalmaztuk. Korai leállítással a
62 CZE peptid mobilitások modellezéséhez felhasznált anyagok és módszerek validálási halmaz kiválasztása is fontos, mert ennek jól kell reprezentálnia a tanulási halmaz minden pontját. Ezért a tanulást számos különböző kezdeti feltétellel is elvégeztük, a robosztus hálózati teljesítmény garantálására. A GDX tanulási algoritmus az új súlyokat és eltéréseket minden olyan esetben elveti, amikor az új hiba a korábbit egy előre meghatározott mértékben (Max_perf_inc) meghaladja, és a tanulási arányt LR_dec értékkel megszorozva lecsökkenteti. Egyébként az új súlyok elfogadásra kerülnek. Amennyiben az új hiba kisebb a korábbinál, a tanulási arány LR_inc értékével való szorzás eredményeként kerül növelésre. Az MC momentum állandót (momentum constant) 0 (nincs momentum) és 1 közeli értékek (nagy momentum) közé állítottuk. Az 1 momentum állandóval rendelkező hálózat a lokális gradiensre teljesen érzéketlen, és ezért nem eredményez megfelelő tanulást. MU a Levenberg-Marquardt algoritmus kezdeti értéke. Ez az érték teljesítményfüggvénycsökkenéssel
járó
lépéseknél
MU_dec
értékével
kerül
megszorzásra,
míg
a
teljesítményfüggvény növekedésekor MU_inc értékével szorzódik. Ha MU értéke meghaladta MU_max értéket, az algoritmus leállításra került155. 2.4.5.2 CBGE-CORG modellezési fázis
Erre az adathalmazra kétváltozós Offord-féle és Levenberg-Marquardt tanulási algoritmusú
ANN modelleket alkottunk. A neurális hálózat modellek fő paramétereit a 6. táblázat foglalja össze. A rejtett réteg neuronjainál szigmoid transzferfüggvényeket alkalmaztunk, az output réteg csomópontokhoz lineáris függvényeket. A kísérleti adatbázist tanulási (70%), teszt (15%) és validálási (15%) halmazokra osztottuk. A modell Matlab környezetben került kidolgozásra. A tanulási algoritmus paraméterei megegyeztek a T-CORG adathalmazra alkalmazott LM-ANN modellnél alkalmazottakkal (7. táblázat). 2.4.5.3 A T-CORG és CBGE-CORG kísérleti adatbázisok egyesítése
Mindkét input paraméter halmazt ki kellett bővíteni, hogy kísérleti adathalmazok
egyesítésével mobilitás becslő ANN modellt alkothassunk. A T-CORG inputjait a CBUF
(30mM) és CACN (0 (V/V)%) paraméterek állandó értékeivel, míg a CBUF-CORG inputjait a hőmérséklet 25°C konstans értékével egészítettük ki.
63 Kísérleti rész Az egyesített adatbázisra Levenberg-Marquardt 8. táblázat: Az egyesített adatbázis LM-ANN modelljének paraméterei Paraméter
ANN LM
Max epochs
1000
Idő
Korlátlan
Validation checks
12
Min grad
1,00e-015
MU
1,00e-003
MU increment
10
MU decrement
0,10
MU max
1,00e+010
tanulási algoritmusú ANN modellt dolgoztunk ki. A neurális hálózat modell főbb paramétereit a 6. táblázat foglalja össze. A mobilitás adatbázist három részre – tanulási (60%), teszt (20%) és validálási (20%) halmazokra – osztottuk. A rejtett réteg neuronjaira szigmoid transzfer függvényeket, az output réteg csomópontjaira lineáris függvényeket alkalmaztunk. A LM algoritmus alapú tanulási folyamatot és
neurális hálózat modellt Matlab környezetben alkottuk meg. A 8. táblázat foglalja össze a tanulási algoritmus paramétereit.
Mintaelőkészítés komplex szénhidrátok multi-kapilláris gél elektroforézises elemzéséhez
64
3 Eredmények 3.1 Mintaelőkészítés komplex szénhidrátok multi-kapilláris gél elektroforézises elemzéséhez 3.1.1 A jelölőanyag feleslegének eltávolítása az analízist megelőzően
Az ANTS és APTS jelölés kapcsán felmerülő egyik probléma a derivatizációs
reakcióelegyben jelenlévő jelölőanyag nagy moláris feleslege. Az mintában maradó nagy mennyiségű reagálatlan jelölőanyag a kisebb (néhány cukoregységből álló) oligoszacharidok kimutatását zavarja, mivel ezek a kapillárisban látszólag együtt migrálva átfedésbe kerülnek a túltelített jelölőanyag csúccsal. Sőt a mintaelegyben lévő nagy fajlagos töltésű jelölőanyag az elektrokinetikus injektálású kapilláris elektroforézis rendszerekben további nehézségeket eredményez156, mivel szupresszálja az injektálás során a nagyobb molekulatömegű, kisebb elektroforetikus mobilitású mintakomponenseket. Ezért a megfelelő detektálhatóság érdekében alacsony mintakoncentráció, polimerizáció fok vagy a nyomással történő mintabevitelt nem támogató analízis – a manuális rendszerek túlnyomó többsége és számos kereskedelemben kapható viszkózus géleket tartalmazó készülék – egyaránt megköveteli a minta megtisztítását a szabad jelölőanyagtól az injektálást megelőzően. A probléma megoldása érdekében három jelölőanyag (APTS) eltávolítási módszer hatékonyságának értékelését és kritikai összevetését végeztük el a lehető legjobb minta visszanyerési arány érdekében. A 10. ábra szemlélteti az egyes módszerek hatékonyságának összehasonlítását a megtisztítatlan APTS-jelölt mintával. A minta mind a négy esetben különböző polimerizáció fokú maltooligoszacharidokat (M040 maltodextrin: keményítő szabályozott hidrolízisével előállított, alacsony polimerizáció fokú, α-D-glükóz egységekből felépülő oligoszacharidok keveréke) tartalmazott. Alulról felfelé a minták a következő sorrendben kerültek bemutatásra az ábrán: kezeletlen oligoszacharid létra, Sephadex G10 méretkizárásos állófázist tartalmazó Multiscreen 96-well szűrőplate-tel kezelt minta, Sephadex G10 méretkizárásos állófázist tartalmazó PhyTip kromatográfiás pipettaheggyel kezelt minta és a DPA-6S normál fázisú poliamid
állófázist
tartalmazó
PhyTip
kromatográfiás
pipettaheggyel
kezet
minta
elektroferogramjai. Ahogy az ábrán is jól látható, mindhárom módszer a detektálhatóság növekedését eredményezte a kezeletlen mintához képest, ám a poliamid állófázis
65 Eredmények kiemelkedően teljesített a reagálatlan jelölőanyag eltávolításában (v.ö. a csúcsok relatív magassága az első – APTS – csúcshoz képest, illetve az egyes elektroferogramokon látható csúcsok összes száma).
10. ábra: A reagálatlan jelölőanyag (APTS) eltávolítási módszereinek összehasonlítása a jelölési reakcióelegyből. A legalsó elektroferogram: a tisztítatlan M040 maltodextrin létra elemzése, felette: a Sephadex G10 Multiscreen szűrőplate-en kezelt minta, majd efelett: Sephadex G10 PhyTip eljárással kezelt minta, legfelső elektroferogram: DPA-6S normál fázisú eljárással kezelt maltodextrin létra. Az elválasztás körülményei: 10 cm effektív hosszúságú kapilláris, 3kV feszültség, szobahőmérsékleten (20°C), elektrokinetikus injektálás: 2 kV 20 s. Detektálás: kék LED fényforrás (excitáció: 46-470 nm, 520 nm emissziós szűrő)
Ezért a további kísérletekben a DPA-6S normál fázisú poliamid gyantát tartalmazó hegyeket használtuk PNGase F enzimmel emésztett, APTS molekulákkal jelölt glikoprotein minták vizsgálatánál, a jelölési reakció lejátszódása után a reagálatlan, szabad jelölőanyag eltávolítására a minta elegyekből. A vizsgált glikoproteinek a következők voltak: immunglobulin G (IgG), ribonukleáz B (RNaseB), fetuin magzati szarvasmarhából (fetal bovine fetuin: FET), α-1-savanyú-glikoprotein (AGP). A glikoproteinek fluoreszcensen jelölt glikánjainak multi-kapilláris gél elektroforézises elválasztását 10 és 30 cm effektív hosszúságú kapillárisokkal (12 és 4 csatornás cartridge) egyaránt elvégeztük. A kísérletek eredményeit különböző glikoproteinekből származó mintákon keresztül a 11. ábra mutatja be. Az ábra A részének felső elektroferogramja az α-1-savanyú-glikoproteinből nyert minta elemzését mutatja, ahol az erősen szialilált szerkezetek jellemző csúcsai jól láthatóak körülbelül 8 percnél. A magzati szarvasmarha fetuin (FET) gyorsan migráló (5 perc körül
Mintaelőkészítés komplex szénhidrátok multi-kapilláris gél elektroforézises elemzéséhez
66
detektált), három illetve négy sziálsavat tartalmazó szerkezeteinek (F1-F4) csúcsai jól elkülönülnek. A ribonukleáz B sávján jól látszanak az öt főbb, jól ismert magasabb mannóz szerkezetű izomer csúcsai (M5-M9). Az immunglobulin G sávja az immunglobulinok glikánjaira jellemző tipikus mintázatot mutatja. Az elválasztások felbontó képességének növelése érdekében 10-ről 30 cm-re növeltük a kapillárisok effektív elválasztási hosszát, ez esetben négycsatornás (négy párhuzamos elválasztás szimultán kivitelezését lehetővé tevő) cartridge alkalmazásával. Szemléltetésként a 11. ábra B része két elválasztást mutat be, melyek a felbontás javulását jól példázzák. A felső elektroferogramon a három és négy sziálsavat tartalmazó fetuin glikán szerkezetek két-két izomerét (F1, F2 és F3, F4) is jól láthatóan sikerült elválasztani, szemben a rövidebb kapillárissal, ahol ezek a dupla csúcsok nem azonosíthatóak. Az alsó elválasztás a ribonukleáz B pozíciós izomer glikánjainak – Mannóz-7 (M7abc) és Mannóz-8 (M8abc) – megfelelő felbontású elektroferogramja.
11. ábra: DPA-6S kezelt APTS-jelölt különböző glikoproteinekből nyert glikánok kapilláris gél elektroforetikus profiljai. Minták: α-1-savanyú glikoprotein (AGP), fetuin magzati szarvasmarhából (FET), ribonukleáz B (RNaseB), immunglobulin G (IgG). A panel: 10 cm effektív elválasztási hossz, 3 kV alkalmazott feszültség; B panel: 30 cm effektív elválasztási hossz, 3 kV alkalmazott feszültség; az egyéb elválasztási körülmények megegyeznek a 10. ábra esetén ismertetettekkel.
3.1.2 Humán szérum minták monoszacharid tartalmának eltávolítása
Glikoprotein standardok elemzése során a mátrixhatással összefüggő problémák nem
jelentkeznek, mivel ilyenkor a megfelelő oldószerek és reagensek megválaszthatóak úgy, hogy a derivatizációs és/vagy elválasztási folyamatokat ne zavarják. Ugyanakkor biológiai
67 Eredmények minták vizsgálata során, a mintamátrix jelentős problémákat okozhat. Így humán szérum minták glikozilációs profiljának vizsgálatánál szembesülnünk kellett a viszonylag magas vércukor szint következtében fellépő zavaró hatással. Mivel a jelölési reakcióban a felszabadított glikánokkal együtt a vérkészítményekben relatív nagy mennyiségben található glükóz is megjelölődik, nemcsak kompetíciót alakít ki a nagyobb, komplexebb glikán szerkezetekkel, de elektrokinetikus injektálás során a vizsgálni kívánt molekulák kapillárisba való bejutását is gátolja ion szupresszió által. Különböző módszereket vizsgáltunk a minta vércukor tartalmának a glikoprotein oligoszacharidok enzimatikus felszabadítását megelőző eltávolítására humán szérum mintákból. A glükóz eltávolításra C-18 fordított fázisú kromatográfiás mikropipettákkal történő elválasztást és ultraszűrést egyaránt kipróbáltuk. Eredményeink azt mutatták, hogy a 3 és 10 kDa pórusméretű ultraszűrő eszközök egyaránt jelentősen hatékonyabbnak bizonyultak mint a fordított fázisú állófázist tartalmazó pipetta hegyek. Az egyetlen főbb különbség a 3 és 10 kDa pórusú ultraszűrők között a centrifugálás időigénye volt, ami a 3 kDa-os eszköz esetében a nagyobb hidrodinamikai ellenállás következtében jelentősen megnőtt. A 12. ábra mutatja az APTS jelölt N-glikánok profiljainak összehasonlítását (A) glükóz-eltávolítás nélkül, illetve (B) 3 kDa pórusméretű ultraszűrés alkalmazásával a mintaelőkészítés során. Fontos kiemelni, hogy a jel intenzitása és a jel-zaj arány az elektroferogramokon az ultraszűrés után látványosan javul. Ezt a lépést nélkülözhetetlennek tekinthetjük, ha a humán szérum glikánok finom eloszlásának vizsgálata a cél, melyek profilja értékes diagnosztikai információt szolgáltathat, mint a megváltozott glikozilációs mintázatok.
12. ábra: Humán szérum minta monoszacharid tartalmának ultraszűréses eltávolítása kapilláris gél elektroforézis analízissel. A rész: normál humán szérum PNGaseF enzimmel emésztve, APTS jelölés és azt követő DPA-6S kezelés után; B rész: azonos minta az enzimemésztést megelőző 3 kDa pórusméretű ultraszűréssel. Az elválasztás körülményei megegyeztek az 10. ábra által bemutatottakkal.
Mintaelőkészítés komplex szénhidrátok multi-kapilláris gél elektroforézises elemzéséhez
68
3.1.3 Illékony pufferrendszer exoglikozidáz emésztéshez
A vizsgálni kívánt glikoproteinekből felszabadított szénhidrát szerkezetek összetételének és
kapcsolódási információjának meghatározásához enzimatikus analízist alkalmazhatunk specifikus exoglikozidázokkal. Például, szénhidrát szekvenálást végezhetünk enzim mátrixszal kivitelezett emésztéssel, mely gondosan választott exoglikozidázok keverékét tartalmazza157.
Az
exoglikozidáz
alapú
szénhidrát
analízis
bármilyen
kapilláris
elektroforetikus módszerrel alkalmazható, beleértve a multi-kapilláris gél elektroforézist is. Ugyanakkor, amennyiben elektrokinetikus injektálás a kizárólagos lehetőség, szükséges a reakció puffer nagy ionerősségű összetevőinek megfelelő módosítása, vagy eltávolításuk az injektálás előtt. Ez esetben az ultraszűrés nem megfelelő lehetőség, mivel méretüknél fogva a jelölt oligoszacharidok egy jelentős része is elveszne. Azért illékony összetevőket tartalmazó reakció puffer alkalmazása kínálkozott jó lehetőségnek, mivel a CE analízis előtt ezek eltávolítása egyszerűen megoldható. Acetát, formiát és karbonát alapú, 0,1 M koncentrációjú puffereket vizsgáltunk, melyek pHját ammónium-hidroxiddal állítottuk be a reakció szempontjából optimális 5,5-ös értékre. Az eljárás alkalmazhatóságának igazolására neuraminidáz enzimet választottunk a sziálsav csoportok enzimatikus felszabadítására a magzati szarvasmarha fetuin glikánjaiból. Tíz órás 37°C-os inkubálás után a neuraminidáz enzimmel az illékony puffer összetevőket centrifugális vákuum bepárlással távolítottuk el. Az ammónium-acetát reakció puffer bizonyult az emésztési és bepárlási kísérletek alapján a leghatékonyabbnak. A 13. ábra az elektroferogramok releváns részeit kinagyítva mutatja be. Az emésztetlen magzati szarvasmarha fetuin glikánokat a felső elektroferogram szemlélteti, jelölve a két-két négy illetve három sziálsavat tartalmazó glikán dupla csúcsaihoz tartozó molekulák szerkezeteit is (F1, F2 és F3, F4). A középső elválasztáson a 0,1 M koncentrációjú ammónium-acetát pufferben (pH 5,5) végzett neuraminidáz emésztés eredménye látható. Mivel az elválasztás 4,5-ös pH-ján minden sziálsav csoport disszociálva van, eltávolításuk a mintamolekulák tömeg-töltés arányát megnöveli, lassabb migrációt, a migrációs idők növekedését eredményezve. A középső futáson jelölt A3 csúcs a deszialilált F1-F4 glikánokat jelöli, például minden α2-3 és α2-6 kapcsolódású Neu5Ac eltávolítása után a Man(α1-6) és Man(α1-3) oldalláncokról. A2 jelöli a Gal(β1-3) – GlcNAc középső antennájának Man(α1-6) kapcsolódású oldallánc izomerének deszialilált alakját. A korábbi eredmények alapján e csúcs feltételezhetően egy az F3 csúccsal együtt vándorló csúcsból származik14. A1 feltehetőleg az emésztési reakció Gal(β 1-4) kapcsolódású biantennáris mellékterméke158. A 13. ábra alsó
69 Eredmények elektroferogramja egy kontroll kísérlet eredményét mutatja aszialofetuinból felszabadított jelölt glikánok elválasztásával. Fontos észrevenni a csúcseloszlás nagyfokú hasonlóságait a deszialilációs kísérlet és az aszialofetuin elektroferogramja közt.
13. ábra: Neuraminidáz emésztés termékeinek kapilláris gél elektroforetikus elemzése magzati szarvasmarha fetuinból felszabadított glikánokkal, illékony ammónium-acetát reakció pufferrel. Felső elektroferogram: APTS jelölt fetuin glikánok; középső elválasztás: APTS jelölt, neuraminidáz emésztett fetuin glikánok; alsó elválasztás: APTS jelölt aszialofetuin glikánok (kontroll). Szimbólumok: ♦ : sziálsav (Neu5Ac); □ : Galaktóz; ○ : Mannóz; ■ : N-acetil-glükózamin (GlcNAc). Körülmények:30 cm effektív elválasztási hossz, 3 kV alkalmazott feszültség. Egyéb körülmények megegyeznek az 10. ábra által bemutatottakkal.
3.1.4 Következtetések
A komplex szénhidrátok nagyhatékonyságú kapilláris elektroforetikus elválasztása gyorsan
fejlődő terület. A multikapilláris formátumú alkalmazás a glikoziláció változásainak nagy teljesítményű elemzését teszi lehetővé, egyrészt az oligoszacharid eloszlás természetének és/vagy mértékének (profilozás/profiling) vizsgálatával, másrészt exoglikozidáz alapú emésztéses (szekvenálás) analízisével. Mivel a cukrok csak kivételesen tartalmaznak töltést hordozó, kromofór vagy fluorofór csoportokat, elektroforetikus elemzésük megfelelő jelölési módszert követel meg. A 8-aminopirén-1,3,6-triszulfonát (APTS) a célra az egyik
Mintaelőkészítés komplex szénhidrátok multi-kapilláris gél elektroforézises elemzéséhez
70
leggyakrabban alkalmazott reagens, mely lehetővé teszi a fluoreszcens detektálást látható kék fényt emittáló LED hatására. Az APTS jelölés az elektroforetikus elválasztáshoz szükséges töltést is biztosítja a mintamolekuláknak. Ugyanakkor a derivatizációs reakció kiváló kihozatalához szükséges APTS nagy moláris feleslege a reakcióelegyben az injektálás és elválasztás során komoly nehézségeket eredményezhet. Az injektálás során kifejtett zavaró hatása mellett, az oldatban maradó konjugálatlan jelölőanyag a kisméretű oligoszacharidok kimutatását is megnehezíti, mivel gyakran ezek az elválasztás során együtt vándorolnak egy túltelített átlapoló elektroforetikus csúcsot eredményezve. Munkám során a jelölő anyag kapilláris elektroforetikus elemzést megelőző három mintaelőkészítési módszert értékeltem. Sephadex G10 méretkizárásos kromatográfiás módszert alkalmaztunk Multiscreen 96-well szűrőplate-tel és automatizált folyadékkezelő robottal kis térfogatú kromatográfiás pipetta hegy formátumban egyaránt, valamint normál fázisú poliamid DPA-6S állófázist vizsgáltunk kromatográfiás pipetta hegy formátumban. Mindhárom módszer képesnek bizonyult az APTS eltávolítására nagyobb érzékenységet eredményezve a jelölt szénhidrátok analízise során, ugyanakkor a DPA-6S poliamidot tartalmazó pipetta hegyek eredményezték kimagaslóan a legjobb hatásfokot. A humán szérum glikozilációs profiljának vizsgálatához nélkülözhetetlen minta-előkészítési feladatot, a minta glükóz tartalmának eltávolítását, ultraszűréssel sikerült hatékonyan megoldani. Az exoglikozidáz emésztésen alapuló szénhidrát elemzéses metodikát illékony puffer rendszer kidolgozásával sikerült elektrokinetikus injektáláshoz adaptálni, a reakció termékeinek megfelelő analízise érdekében.
71 Eredmények
3.2 A boronsav - lektin affinitás kromatográfia (BLAC) hőmérsékletfüggése 3.2.1 Eredmények és diszkusszió
Első lépésben az elúciós sorrend és tisztaság meghatározása érdekében a modell fehérjéket
RP-HPLC és MALDI-TOF-MS analízisnek vetettük alá, amit mikropreparatív glikoaffinitás kísérletsorozat követett, 5-65°C hőmérsékleti tartományon. A m-aminofenil-boronsav (boronsav) a ribonukleáz B-re specifikus, míg a búzacsíra agglutinin (WGA: wheat germ agglutinin) a tripszin inhibitorra szelektív állófázis. A boronsav és a WGA kombinációja (kevert állófázis), melyre a továbbiakban BLAC/WGA-ként hivatkozok149, mindkét modell fehérjét köti. Mioglobint (semleges jellegű) és lizozimet (bázikus jellegű) használtunk nem glikozilált negatív kontrollként. A különböző hőmérsékleteken kivitelezett glikoaffinitás kromatográfia után a visszanyerési kihozatalt RP-HPLC módszerrel mennyiségileg meghatároztuk, és az eredményeket értékeltük a BLAC/WGA affinitás kromatográfiás glikoprotein izoláció hőmérsékleti optimumának azonosítása céljából. Mennyiségi meghatározás céljára 10 mg/ml koncentrációjú törzsoldatokat készítettünk a ribonukleáz B, mioglobin és tripszin inhibitor modell fehérjékből. Fontos megjegyezni, hogy utóbbi jelentős mennyiségű lizozimet tartalmazott (HPLC-vel és MALDI-TOF-MS-sel vizsgálva, lásd 14. ábra). A mennyiségi analízishez kalibráció készült a törzsoldatok hígítási sorainak (1-64× hígítás) RP-HPLC elemzése alapján, UV214 detektálással. A tripszin inhibitor (lizozim tartalmával együtt), ribonukleáz B és mioglobin hőstabilitása megfelelőnek bizonyult 70°C hőmérsékletig (temperált HPLC kolonnával vizsgálva, adatok bemutatásától eltekintek). A modell fehérjék elúciós sorrendje, a 2.2.3 fejezetben ismertetett elválasztási módszerrel, a következőként adódott: tripszin inhibitor (~11 min), ribonukleáz B (~12 min), lizozim (~15,5 min) és mioglobin (~19 min). A 14. ábra baloldali részén a lizozim tartalmú tripszin inhibitor standard kromatogramja látható, két – A és B jelű – fő csúccsal, melyek retenciós idői 11 és 15 perc. E két frakciót preparatív HPLC oszloppal elválasztottuk. Ahogy a baloldali kis ábrák tömegspektrumai szemléltetik, az összegyűjtött frakciók MALDI-TOF-MS analízise igazolta, hogy az A jelű csúcs tripszin inhibitor (a teljes injektált mennyiség 82,5 (m/m)%-a), míg a B jelű csúcs lizozim (17,5 (m/m)%). A MALDI-TOF-MS analízishez DHB mátrixot alkalmaztunk, mivel a
A boronsav - lektin affinitás kromatográfia (BLAC) hőmérsékletfüggése
72
szinapinsav és az α-ciano-hidroxi-fahéjsav a vizsgált fehérjékkel nem biztosított megfelelő ionizációt.
14. ábra: A kereskedelemben kapható tripszin inhibitor modell fehérje RP-HPLC vizsgálata, mely a lizozim tartalmat is szemlélteti. Víz és acetonitril gradiens elúció alkalmazásával (20-60 (V/V)% 17 perc alatt). Két frakció került összegyűjtésre (A és B). A baloldali rész felső kisméretű diagramjai az egyes csúcsokhoz tartozó MALDI-MS spektrumokat mutatják. Az ábra jobboldali részén az egyes gyűjtött frakciók (A és B) boronsav affinitás kromatográfiás kezelése utáni analízise látható.
A két preparatív RP-HPLC frakciót (A és B a 14. ábra baloldalán) tovább tanulmányoztuk, hogy a tripszin inhibitor relatív magas lizozim tartalmának a glikoaffinitás kromatográfia alapú izolációra gyakorolt hatásait vizsgáljuk. A glikoaffinitás kromatográfia előtt a frakciók pH-ját semleges értékre állítottuk, mivel a HPLC savas mozgófázisa az affinitás kromatográfiás állófázison való megkötődét gátolja. A frakciók (A és B) megkötődési tulajdonságainak vizsgálatára boronsav állófázis tartalmú mikrokolonnát használtunk, amit az elúciók RP-HPLC analízise követett. A tripszin inhibitor irodalomból ismert megkötődési tulajdonságai alapján149,159 (N-acetil-glükózamin és szialo-glikokonjugáltak WGA kötő affinitása), valamint figyelembe véve a lizozim nem glikozilált természetét, azt vártuk, hogy egyik frakció sem lesz kimutatható a glikoaffinitás kromatográfiás lépés után. Azonban, ahogy a 14. ábra jobboldalának felső kromatogramján látható, a lizozim megkötődött az alkalmazott affinitás kromatográfiás állófázison. Első közelítésként ezt a jelenséget a megkötő puffer 8,7-es pH-ján anionos boronsav állófázis (pK: 8,52, a Pallas ver. 3.5.1.1 pKalc programmal számítva – CompuDrug Inc., Sedona, AZ, USA) és a pozitív töltésű lizozim (izoelektromos pont pH: 9,7-11160) között kialakuló erős elektrosztatikus kölcsönhatásnak tulajdonítottuk. A hőmérséklet glikoaffinitás kromatográfiás fehérje izolálásra gyakorolt hatásainak vizsgálatához boronsav és búzacsíra agglutinin (WGA) tartalmú állófázisokat alkalmaztunk
73 Eredmények egyedileg és kevert formában (BLAC/WGA: 50-50 (V/V)% keverék). A tripszin inhibitor, ribonukleáz B és mioglobin modell fehérjéket az alkalmazott állófázisokhoz korábban publikált szelektivitásuk alapján választottuk149, azaz a WGA a tripszin inhibitorra (lásd feljebb), a ribonukleáz B-re pedig a Man(β1-4) és Man(α1-6) gliko-konjugáltakat kötő boronsav specifikus. A semleges glikozilálatlan mioglobint választottuk negatív kontrollnak. A tripszin inhibitor glikozilálatlan bázikus lizozim tartalmával a boronsav és BLAC/WGA állófázist
tartalmazó
mikrokolonnákkal
fellépő
elektrosztatikus
kölcsönhatásokat
tanulmányoztuk.
15. ábra: A modell fehérje keverék RP-HPLC kromatogramjai 5-65°C hőmérsékleten végzett (A) WGA, (B) boronsav és (C) BLAC/WGA affinitás kromatográfiás kezelés után. A fehérjék csúcsai az ábrán jelölve vannak.
A hőmérséklet hatásait a modell fehérjék keverékével vizsgáltuk 5°C és 65°C között, 10°C-os lépésközzel. Az affinitás kromatográfia hőmérsékletét a folyadékkezelő automatába épített 96-os mikrotiter plate hűtő/fűtő egységgel szabályoztuk. Minden mérési pontban három párhuzamos kísérletet végeztünk. A megkötött fehérjéket minden esetben 0,1 M HCl oldattal eluáltuk, amit a fehérjék RP-HPLC analízises mennyiségi meghatározása követett. A kapott csúcsterületek relatív standard deviációja (RSD) minden esetben 10% alatt volt. A 15. ábra hasonlítja össze a különböző állófázisokkal, eltérő hőmérsékleteken végzett kísérletek eredményeit. A modell fehérjék megkötődési tulajdonságainak megfelelően a WGA hatékonyan dúsította a tripszin inhibitort (15. ábra A része), a ribonukleáz B-hez a boronsav mutatott affinitást (15. ábra B része), a kevert BLAC/WGA állófázis mindkét fehérjét kötötte
A boronsav - lektin affinitás kromatográfia (BLAC) hőmérsékletfüggése
74
(15. ábra C része). A várakozásokkal összhangban a ribonukleáz B nem volt kimutatható a WGA elúciókból, és a tripszin inhibitor sem a boronsav mikrokolonnák elúciójából. Ugyanakkor a lizozim jelentős mennyiségben jelen volt mind a boronsav, mind a BLAC/WGA állófázisok elúciójában egészen 55°C-ig (15. ábra B és C része). Ez minden bizonnyal a megkötési pH-n pozitív töltésű fehérje és negatív töltésű boronsav között fellépő erős elektrosztatikus kölcsönhatás eredménye. A WGA tartalmú mikrokolonnák elúcióinak egyikében sem volt kimutatható lizozim. A legmagasabb vizsgált hőmérsékleten (65°C) sem a modell glikoproteinek (ribonukleáz B és tripszin inhibitor), sem a tripszin inhibitor lizozim tartalma nem volt jelen egyik affinitás állófázissal sem, ugyanakkor minden 65°C-os elúcióból mioglobin volt kimutatható (15. ábra felső kromatogramjai). Ezt a fehérje és az agaróz hordozó közt kialakuló nem specifikus kötés eredményének tulajdonítottuk. A 16. ábra szemlélteti a mennyiségi számítások eredményeit a ribonukleáz B, tripszin inhibitor és lizozim fehérjékkel az összes alkalmazott hőmérsékleten. A diagramokon a glikoaffinitás kromatográfia után a modell fehérjék visszanyert koncentrációi a kiindulási koncentrációkhoz viszonyítva százalékosan vannak feltüntetve, mind az egyedi WGA és boronsav (BA: boronic acid; mindkettő szürkével jelölve), mind a kevert BLAC/WGA (feketével jelölve) állófázisokat tartalmazó mikrokolonnákkal. A modell fehérjék kiindulási koncentrációi a ribonukleáz B esetén 10 mg/ml, a tripszin inhibitor esetén 8,75 mg/ml voltak (1,75 mg/ml koncentrációban lizozimet is tartalmazott). A 16. ábra A része mutatja a kísérletek eredményeit tripszin inhibitor glikoproteinnel WGA és BLAC/WGA oszlopokkal. Az ábra B részén hasonló komparatív eredmények láthatók a ribonukleáz B glikoproteinre boronsav és kevert BLAC/WGA állófázisokkal, míg a C részen a tripszin inhibitor lizozim tartalmára végzett mennyiségi számítások eredményei láthatók boronsav és BLAC/WGA állófázisokkal. Az eredmények egyértelműen a szobahőmérsékleten (25°C-ra temperálva) mutatták a legjobb mennyiségi kihozatalt a glikoaffinitás kromatográfia alapú izoláláshoz minden vizsgált esetben. A legnagyobb kihozatal a tripszin inhibitorral (16. ábra A része) 0,79 mg/ml volt a WGA funkcionalizált állófázissal és 0,43 mg/ml a kevert BLAC/WGA oszloppal, ami a kiindulási mennyiség 9,5 és 5,2 százalékának felel meg. Ribonukleáz B-vel (16. ábra B része) is 25°C-on volt a legjobb kihozatal a boronsav állófázissal (0,86 mg/ml, 8,6 (m/m)%) és a BLAC/WGA kevert állófázissal (0,39 mg/ml, 3,9 (m/m)%) egyaránt. Felhívnám a figyelmet, hogy az állófázisok maximális kapacitása hasonló nagyságrendbe esik, azaz 26,3 µg tripszin inhibitor / 5 µl WGA funkcionalizált agaróz és 28,7 µg ribonukleáz B / 5 µl boronsav
75 Eredmények funkcionalizált agaróz, míg a kevert BLAC/WGA állófázissal 14,3 és 13 µg / 5µl állófázis értékek adódtak tripszin inhibitorra és ribonukleáz B-re. Az eredmények a BLAC glikoprotein izolálási metodológia alkalmazhatóságát igazolják.
16. ábra: A modell fehérjék glikoaffinitás kromatográfiás kihozatali arányainak diagramjai a hőmérséklet függvényében százalékosan, RP-HPLC-vel meghatározva. A: tripszin inhibitor WGA és BLAC/WGA állófázisokkal, B: ribonukleáz B boronsav (BA) és BLAC/WGA állófázisokkal, és C: a tripszin inhbitor lizozim tartalma boronsav és BLAC/WGA állófázisokkal. A fehérjék kiindulási koncentrációi: 10mg/ml ribonukleáz B és mioglobin, 8,25 mg/ml tripszin inhibitor és 1,75 mg/ml lizozim.
Ahogy a 16. ábra C részén is látható, a boronsav lizozim megkötésére kiemelkedő hatékonyságot eredményezett, több mint 90%-os kihozatallal (a kiindulási 1,75 mg/ml koncentrációhoz viszonyítva) az optimum hőmérsékleten (25°C). A kevert állófázissal töltött oszlop alkalmazásával a kihozatali arány még mindig kimagasló, a kiindulási mennyiség 53 százalékának megfelelő, 0,92 mg/ml értéket eredményezett, aminek oka a fellépő erős elektrosztatikus kölcsönhatásban keresendő. Mivel az m-aminofenil-boronsav hidroxil csoportjainak számított pK értékei 8,52 és 9,12, a megkötő puffer 8,7-es pH-ján negatív töltéssel rendelkezik, míg a lizozim egy erősen pozitív fehérje (pI: 11). Így a boronsav tartalmú állófázison erős elektrosztatikus kölcsönhatás eredményeként retenciót szenved. Mivel a boronsav tartalmú állófázis ioncsere-kapacitása jóval nagyobbnak adódik a
A boronsav - lektin affinitás kromatográfia (BLAC) hőmérsékletfüggése
76
glikoaffinitás kölcsönhatás kapacitásánál, a megkötött lizozim mennyisége jóval meghaladta a cél glikoproteinét. A jövőben ionpár képző reagensek alkalmazását tervezzük vizsgálni e hatás kiküszöbölésére. A legalacsonyabb, 5°C, vizsgált hőmérsékleten (15. ábra alsó kromatogramjai) mindhárom modell fehérje kihozatalában jelentős hatékonyság csökkenést tapasztaltunk, feltételezhetően a megnövekedett a közeg viszkozitása (1,525 mPa×s 5°C-on és 0,8938 mPa×s 25°C-on) és a molekulák lassabb diffúziója révén a kötőhelyekhez161. A hőmérsékletet tovább növelve 35°C fölé az eluált glikoproteinek mennyisége 9. táblázat: A migolobin kihozatala 65°C-on végzett affinitás kromatográfiával Normalizált Koncentráció Kihozatal csúcsterület [mg/ml]
fokozatosan csökkent, és 55°C fölött már nem volt kimutatható. Ugyanakkor a mioglobinnal
fellépő
nem-specifikus
BA
9,81
0,28
2,8%
kölcsönhatások kerültek túlsúlyba (felső
WGA
3,5
0,10
1,0%
kromatogramok). Az eluált mioglobin
BLAC
5,95
0,17
1,7%
koncentrációit és kihozatalát az affinitás állófázisokkal 65°C-on a 9. táblázat szemlélteti.
3.2.2 Következtetések
A bemutatott eredmények alapján 25°C hőmérsékleten érhető el a BLAC/WGA
glikoaffinitás kromatográfia alapú mikropreparatív glikoprotein izoláció legjobb mennyiségi kihozatala tripszin inhibitor és ribonukleáz B modell glikoproteinekkel. A BLAC/WGA mikrokolonnák maximális kapacitása hasonló mindkét cél glikoprotein esetén. Magas hőmérsékleten az agaróz hordozóval fellépő nem-specifikus kölcsönhatások kerülnek túlsúlyba, amit 65°C-on a glikozilálatlan mioglobin megjelenése valamennyi elúcióban igazolt. Ugyanakkor, annak ellenére, hogy a lizozim (kereskedelmi tripszin inhibitor nagymennyiségű szennyezője) nem glikoprotein, kimutatható volt a boronsav és BLAC/WGA tartalmú állófázisok elúcióiban. Ennek okát a megkötő puffer 8,7-es pH-ján negatív töltésű boronsav és a pozitív töltésű fehérje között fellépő erős elektrosztatikus kölcsönhatásnak tulajdonítottuk. A jövőben tervezzük a hőmérséklet hatásait külön is vizsgálni a megkötési és elúciós lépésekben, hogy a glikoaffinitás kromatográfia alapját képző jelenségeket, a retenció mechanizmusát még részletesebben megismerhessük és a módszer hatékonyságát a szelektív glikoprotein izolációra tovább optimalizálhassuk. További állófázisok és a modell
77 Eredmények glikoproteinek szélesebb skálájának értékelését is tervezzük, hogy nagy áteresztőképességű módszert dolgozzunk ki komplex biológiai mintákból, mint a humán szérum vagy plazma, glikoproteinek szelektív izolálására és dúsítására, biológiai markerek kutatásainak támogatására.
78 Mikropreparatív affinitás kromatográfiás glikoziláció profilozás
3.3 Mikropreparatív affinitás kromatográfiás glikoziláció profilozás A munka folytatásaként a BLAC módszer miniatürizálását és automatizálását végeztük el, és a gyakorlatban is hasznosítottuk a humán szérum glikoziláció vizsgálatára kidolgozott metodika (lásd 3.1 fejezet) hatékonyságának további növelésére. A kidolgozott metodika a következő lépések sorozatából áll: ultraszűrés, mikropreparatív glikoaffinitás alapú glikoprotein dúsítás, enzimatikus glikán felszabadítás, fluorofór cukor jelölés, posztderivatizációs tisztítás és kapilláris gél elektroforetikus analízis. A 17. ábra szemlélteti vázlatosan a mintaelőkészítés és analízis lépéseit, melyet a komparatív glikán profil vizsgálatokhoz dolgoztunk ki.
17. ábra: A humán szérum mintaelőkészítési és elemzési folyamatának sematikus összefoglalása BLAC/ConA mikropreparatív glikoprotein izolálással és kapilláris gél elektroforézissel
Első lépésben a kevert (pooled: nagyszámú minta keveréke) normál vagy prosztata karcinómás szérumból a kismolekulák ultraszűréses eltávolítása történik. Könnyen belátható, hogy a vicinális hidroxil csoportokat tartalmazó glükóz is kiválóan kötődik az affinitás állófázishoz, ezért eltávolítása a glikoproteinek izolálása előtt indokolt. Ezt követi szérum makromolekula
tartalmának
BLAC/ConA
mikropreparatív
affinitás
kromatográfiás
frakcionálása, mellyel a vizsgálni kívánt glikoproteinek szelektíven izolálhatók. A feldúsított szérum
glikoproteinekből
felszabadítottuk,
majd
az
N-glikánokat
PNGaseF
8-aminopirén-1,3,6-triszulfonáttal
emésztéssel jelöltük
enzimatikusan
reduktív
aminálási
reakcióval. Normál fázisú kromatográfiás módszert alkalmaztunk a reagálatlan szabad
79 Eredmények jelölőanyag (APTS) poszt-derivatizációs eltávolítására. Végül a mintákat komparatív LEDindukált fluoreszcenciás detektálású multikapilláris gél elektroforézisnek alávetve a glikozilációs profilokat értékeltük. 3.3.1.1 BLAC/ConA mikropreparatív glikoprotein dúsítás
18. ábra: A mikropreparatív affinitás kromatográfiás szérum glikoprotein dúsítás összehasonlítása boronsav (A), konkanavalin A (B) és kombinált BLAC/ConA (C) állófázisok alkalmazásával. A számozott csúcsok a jelölt glikánokat reprezentálják. Kapilláris gél elektroforetikus körülmények: 30 cm effektív hosszúságú, 20 µm belső átmérőjű kvarc kapilláris; háttér elektrolit: 25 mM acetát (pH 4,75); 8 kV alkalmazott feszültség 20°C-on; injektálás: 2 kV 20 s
A glikoproteinek izolálására és dúsítására a humán szérum mintákból kombinált boronsav konkanavalin
A
(BLAC/ConA)
mikropreparatív
affinitás
kromatográfiás
technikát
alkalmaztuk. A 18. ábra hasonlítja össze a APTS jelölt szérum N-glikánok kapilláris gél elektroforetikus profiljait boronsav- (A elektroferogram), konkanavalin A affinitás kromatográfiás (B elektroferogram) és kombinált BLAC/ConA kromatográfiás (C elektroferogram) glikoprotein dúsítás után kevert normál humán szérumokból. A csúcsok mintázatainak eltérése szembetűnő az 1, 3, 4, 5, 10, 11 és 15 csúcsok összehasonlításával. Például a 4-es csúcs csak a boronát állófázishoz kötődik (A), és így jelen van a BLAC/ConA állófázissal kezelt mintában is (C), azonban a konkanavalin A állófázissal kezelt szérum
80 Mikropreparatív affinitás kromatográfiás glikoziláció profilozás profiljából hiányzik (B). Hasonlóan a 15-ös csúcs a konkanavalin A-ra specifikus glikán, mely megjelenik a konkanavalin A (B) és BLAC/ConA (C) állófázissal kezelt mintákban, azonban a boronsav kromatográfiás elektroferogramról (A) hiányzik. A kombinált BLAC/ConA állófázissal kezelt mintában néhány csúcs relatív intenzitása eltérést mutat az egyes állófázisokkal külön kezelt mintáktól, néhány extrém esetben nehezen látható az alkalmazott detektálási érzékenységgel az A és B elektroferogramokon (ilyenek az 1, 3, 5, 10 és 11 csúcsok). Első közelítésben a konkanavalin A és a boronsav feltételezett kombinált hatásával magyarázható ez a jelenség, mely a kötési erősség és/vagy kapacitás eltérését okozhatja a kombinált formánál162. A munka folytatásaként konkanavalin A és boronsav eltérő arányú keverékeivel, illetve boronsav más lektinekkel való kombinációjával e jelenség és a mögötte húzódó mechanizmus megértésére lehetőség nyílhat. A 19. ábra normál humán szérum APTS jelölt N-glikánjainak elektroforetikus profiljait mutatja be BLAC/ConA mikropreparatív glikoprotein dúsítás alkalmazásával (A) és affinitás kromatográfiás kezelés nélkül (B). Az elektroferogramok releváns részei mindkét panelen nagyítva is bemutatásra kerültek. A csúcsok magasságait a kinagyított részleteken normalizáltuk a legnagyobb intenzitású csúcsra (mindkét esetben a 7-es csúcs), melynek magasságát 10,0 RFU értéknek vettük. A glikáncsúcsok egyértelmű azonosítása érdekében csak a 0,2 relatív fluoreszcencia egységet (RFU) meghaladó intenzitású csúcsok jel-zaj viszonyát tekintettük elfogadhatónak, ezek az ábrán számozással vannak feltüntetve. Jól látható az ábrán, hogy a BLAC/ConA glikoprotein dúsítással preparált minta esetén jelentősen nagyobb mennyiségű glikán csúcs felelt meg a kritériumnak (17 számozott csúcs a 12-vel szemben). Ugyanakkor a csúcsok magasságainak eloszlása is eltérést mutatott BLAC/ConA kezelés után (1, 2, 4, 6, 12, 15, és 17-es csúcsok). Ennek magyarázata valószínűleg
az,
hogy
ezek
a
humán
szérumban
nagyságrendileg
alacsonyabb
koncentrációban jelenlévő glikoproteinek nagyobb affinitással rendelkeznek a kombinált BLAC/ConA állófázishoz, és ezért feldúsulnak az affinitás kromatográfiás kezeléssel (v.ö. 19. ábra kinagyított részei).
81 Eredmények
19. ábra: APTS jelölt normál szérum glikánok kapilláris gél elektroferogramjai BLAC/ConA affinitás kromatográfiás glikoprotein dúsítással (A) és nélküle (B). A 0,2 relatív fluoreszcencia egységet meghaladó csúcsokat tekintettük relevánsnak, és ezek az elektroferogramokon számozással kerültek megjelölésre. Az elválasztás során alkalmazott 4 kV feszültség kivételével az egyéb körülmények a 18. ábra által bemutatottakkal megegyeznek.
3.3.1.2 Komparatív glikozilációs profil vizsgálat
Egészséges egyénektől származó (kereskedelemben elérhető) és öt negyedik stádiumú
prosztata karcinómás beteg kevert szérum mintáinak glikoproteinjeit izoláltuk a BLAC/ConA mikropreparatív affinitás kromatográfiás technikával, és az 17. ábra által bemutatott
82 Mikropreparatív affinitás kromatográfiás glikoziláció profilozás downstream mintaelőkészítési és elemzési módszert kiviteleztük velük. A minták glikozilációs profiljainak összehasonlítását a 20. ábra mutatja be.
20. ábra: Normál pooled humán szérum (alsó elektroferogram) és prosztata karcinómás szérum (felső elektroferogram) N-glikozilációs profiljainak összehasonlító kapilláris gél elektroferogramjai BLAC/ConA mikropreparatív affinitás kromatográfiás glikoprotein dúsítással. A számok (1-16) a 18. ábra és 19. ábra számozott csúcsait jelölik. A prosztata rák specifikus glikozilációs mintázatokat betűk (A-D) jelölik. Az elválasztás körülményei megegyeznek a 18. ábra által bemutatottakkal.
Az alsó elektroferogramon látható számozott csúcsok a BLAC/ConA technikával kezelt normál
humán
szérum
N-glikozilációs
profiljára
jellemző
mintázatot
mutatnak.
Hasonlóképpen a megfelelő csúcsokat a felső, BLAC/ConA affinitás kromatográfiásan dúsított prosztata rákos humán szérum minta elektroferogramján is megszámoztuk. Amíg a csúcsok
túlnyomó
többsége
megfeleltethető
egymásnak
a
két
elektroferogramon,
megfigyelhető négy további csúcs (A, B, C és D), melyek egyértelműen csak a prosztata karcinómás szérum glikán profiljában vannak jelen. Ezek (vagy ezek egy része) nagy valószínűséggel a glikozilációs mintázat prosztata rák specifikus megváltozásának eredményei. Ezeket a szénhidrátokat további munka keretében érdemes biológiai marker potenciáljuk feltérképezése érdekében további szerkezeti és biológiai vizsgálatoknak alávetni. A két profil közös csúcsainak némelyike (2, 4, 5 és 9) láthatólag a csúcsarány szempontjából eltérést mutat, ezek is hordozhatnak diagnosztikai információt, ezért további vizsgálatuk indokolt lehet.
83 Eredmények
3.3.2 Következtetések
A munka első részében kidolgoztuk az N-glikozilációs profil kapilláris elektroforézis alapú
vizsgálatának
metodikáját.
Párhuzamosan
kidolgozásra
került
a
vizsgálni
kívánt
glikoproteinek megkötésére és szelektív elúciójára a boronsav - lektin affinitás kromatográfia, mely boronsav és különböző lektinek keverékét tartalmazó állófázisokat alkalmaz egy elválasztó oszlopban (BLAC)149. A munka folytatásaként a BLAC/ConA állófázis miniatürizált és automatizált specifikus glikoprotein dúsítási alkalmazását dolgoztuk ki. A technikát humán szérum mintaelőkészítésre alkalmaztuk egészséges és prosztata karcinómás minták glikozilációs profil összehasonlító vizsgálatához. A glikán profilok eltéréseit LEDindukált fluoreszcenciás detektálású multikapilláris gél elektroforézissel vizsgáltuk. A glikoprotein
dúsítást
egylépéses
elúcióval
mindössze
5
µL
állófázist
tartalmazó
mikrokolonnákkal végeztük. A 17. ábra által bemutatott munkamenet alkalmazásával a kevert prosztata karcinómás szérum minta komparatív glikozilációs profil vizsgálata lehetővé tette az egészséges egyénekből származó mintákhoz képest eltérések azonosítását.
84 Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus elválasztásoknál
3.4 Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus elválasztásoknál 3.4.1 Kísérleti eredmények
Mindösszesen 1650 körüli kísérleti CZE futás került kivitelezésre a T-CORG és CBGE-CORG
fázisokban. A 21. ábra jellemző CZE mintákat mutat be a tripeptid minták keverékének (a minta az öt tripeptid keverékét és az EOF markert tartalmazta) elválasztásán a T-CORG kísérleti fázisból. Az ábrán bemutatott elválasztásokat különböző hőmérsékleten futtattuk, 15% metanolt tartalmazó háttér elektrolittal, 12 kV feszültség hatására. Jól látható, hogy a hőmérséklet növelésével a migrációs idők és a csúcsfelbontás csökkenést mutatnak. A tripeptid minták migrációs sorrendje a következőként adódott: lizin (KKK), alanin (AAA), tirozin (YYY), szerin (SSS) majd aszparginsav (DDD) aminosavakból felépülő tripeptid csúcsok (a zárójelben látható mintajelöléseket az aminosavak egybetűs rövidítéseiből az ábrán is feltüntetettük). A lizin tripeptid csúcsa az EOF markert is megelőzte, következésképpen itt a mobilitás értéke negatívnak adódik. Az elektroforetikus mobilitás és az elektroozmózis sebessége egyaránt növekedést mutat a hőmérséklet emelésével a közeg viszkozitásának változása következtében. Így hőmérséklet fő hatása elektroozmotikus áramlás mellett
az
lecsökkenése.
analízis A
idő
hőmérséklet
10°C-kal való növelése az EOF-t közel 20%-kal növeli163. Mivel az EOF
irányával
vándorló
ellentétesen
mintakomponensek
mobilitásait szintén csökkenti a hőmérséklet emelése, az analízis 21. ábra: T-CORG kísérleti fázis elektroferogramjai
idejének jelentősebb.
csökkenése Ugyanakkor
még nem
szabad elfelejteni, hogy az analízisidő magasabb hőmérséklet hatására történő csökkenésében rejlő lehetőségek kiaknázása, a rendszer hatékony termosztálását igényli a nagyobb mennyiségben képződő Joule-hő elvezetésére. Másrészt az analízisidő csökkenése a felbontás
85 Eredmények romlásával jár együtt163-164. A hőmérséklet hatását a tripeptid minták elválasztására a 21. ábra szemlélteti. A CBGE-CORG kísérleti fázisra vonatkozóan a 22. ábra mutat néhány szemléletes példát a tripeptid mintakeverék elválasztására 10 mM koncentrációjú foszfát pufferrel. A puffer metanol tartalmának emelése a csúcsfelbontás romlását eredményezte az elválasztás idejének csökkenése mellett. A 20 (V/V)% metanolt tartalmazó pufferrel kapott elektroferogramon a mintacsúcsok erősen átlapolnak, ami az azonosításukat jelentősen megnehezíti. Mindazonáltal a migrációs sorrend a korábban leírthoz képest nem változott. Kapilláris
elektroforézisnél
számos adalékot alkalmaznak az elválasztó kémiai
rendszer
fizikai-
tulajdonságainak
megváltoztatására165. A szerves oldószereket a puffer elektrolit polaritásának és viszkozitásának módosítására mind
az
áramlásra,
használják.
Ez
elektroozmotikus mind
elektroforetikus
a
minták
mobilitására
22. ábra: CBGE-CORG kísérleti fázis elektroferogramjai
hatással van. A puffer elektrolit viszkozitásának növekedése az elektroozmotikus áramlás sebességének csökkenésével jár163. A puffer szerves oldószer tartalma a pH-t is befolyásolja. A szerves oldószerek elektroforetikus mobilitásra gyakorolt összetett hatásainak modellezése kihívást jelentő feladat. Kísérleti eredményeink alapján elmondható, hogy mind a metanol, mind pedig az acetonitril csökkenti az alkalmazott mintapeptidek elektroforetikus mobilitását, és a mobilitások különbségeit. Ennek következtében a felbontás is romlik. A metanol koncentrációjának hatását a tripeptid minták elválasztására a 22. ábra mutatja be.
3.4.2 Statisztikai értékelés
A kondicionálás során fellépő nyomás problémák, a kapilláris belső falának hibája, a
kapilláris végeinek sérülése okozta hibás futásokat eltávolítottuk a kísérleti adathalmazból, és elvégeztük a megmaradt futások deviációinak statisztikus elemzését. A T-CORG kísérleti fázis adatainak relatív standard deviációjának (%RSD) elemzését a kiugró értékek eltávolítása és az erősen szóró eredmények megismétlése után a 10. táblázat foglalja össze.
86 Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus elválasztásoknál
10. táblázat: A T-CORG kísérleti fázis RSD analízise %RSD Migráció
Mobilitás
EOF
AAA
DDD
KKK
SSS
YYY
AAA
DDD
KKK
SSS
YYY
Átlag
0,504
0,426
1,684
0,634
0,447
0,398
1,579
0,537
1,492
1,178
1,463
Min
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,265
0,000
0,000
0,131
0,000
Max
2,343
3,415
4,997
1,753
1,971
2,107
4,051
2,074
4,108
4,620
6,157
P85
0,820
0,733
3,052
0,996
0,724
0,624
2,508
0,849
2,592
2,237
2,450
P95
1,236
0.958
4,063
1,542
1,028
0,843
3,143
1,185
3,022
2,926
3,480
A CBGE-CORG kísérleti fázis migrációs időinek átlag %RSD értékei 0,844, 1,194, 4,444, 0,819, 0,926 és 0,955 voltak az EOF, AAA, DDD, KKK, SSS és YYY esetében. A mobilitások átlagos %RSD értékei 3,052, 0,830, 2,671, 1,208 és 1,695 az AAA, DDD, KKK, SSS és YYY mintákkal. A migrációs idők és mobilitás értékek pontosságának összehasonlítása meglepő módon alacsonyabb relatív standard deviációkat mutatott a migrációs időkre. A mobilitás értékek deviációit vártuk alacsonyabbnak, mivel az EOF marker hatását – az EOF reprodukálhatóságának tökéletlenségét – tételeztük fel a csúcsok egymáshoz képest való eltolódásának okaként, ami mind az EOF, mind pedig a minták csúcsainak eltolódását eredményezi. Másrészről, a mobilitás meghatározásához két szórással rendelkező értéket szükséges számításba venni, míg a migrációs időknél értelemszerűen csak egyet. Nyilvánvalóan kiváló reprodukálhatóságot sikerült a teljes kísérleti fázis során elérni, így a mobilitás-számítás nem eredményezhette a pontosság javulását, hanem némileg nagyobb %RSD értékeket eredményezett. A %RSD értékek mélyreható elemzése a paraméterfüggő szabályszerűségek feltárása érdekében azt mutatta, hogy a CACN növelése a %RSD növekedésével jár együtt (23. ábra). Erre a hatásra már a kísérleti fázis kivitelezése alatt fény derült, hisz a nagyobb acetonitril tartalmú pufferekkel szembetűnő volt a futások közti eltérés. A további vizsgálatok azt mutatták, hogy a magas acetonitril koncentráció a kapillárisok külső polimer borítását is károsítja (24. ábra), és így a kapillárisba levegőbuborék bejutásának esélyét nagyban növeli. Így a magas acetonitril tartamú pufferekkel végzett futtatásokat különös odafigyeléssel volt szükséges kivitelezni a kapilláris végeinek rendszeres mikroszkópos ellenőrzésével. A %RSD értékelése más paraméterfüggő szabályszerűséget nem mutatott. A hibás futások kiszűrése és a szükséges ismételt kísérletek elvégzése után a T-CORG, CBGE-CORG és az egyesített prediktív modellezéshez 710, 1783 és 2493 adatpont állt rendelkezésre.
87 Eredmények
23. ábra: CACN (V/V%) vs %RSD 16kV alkalmazott feszültség
24. ábra: Acetonitril adalék hatására károsodott kapillárisborítás mikroszkópos felvétele
mellett
3.4.3 Mintapeptidek töltésszámítása
Általában a peptidek töltéseit a disszociációra képes csoportokat egyenként tekintve
számítják. Így az általános i-edik savas csoportra az egyensúly a következőképp írható fel166: k AH ← → A− + H + K
ki =
1 [ A− ] ⋅ [ H + ] = Ki [ AH ]
(24)
A negatív töltés moláris frakciója az i-edik savas csoportra alapján az alábbi kifejezéssel írható fel167-168: Ni =
ki [ H + ] [ A− ] 10( pH − pki ) = = [ AH ] + [ A− ] 1 + ki [ H + ] 1 + 10( pH − pki )
(25)
Következésképpen a csoportok disszociációját egymástól függetlenül kezelve a negatív töltések teljes mennyisége (Nt) a fenti kifejezés minden savas csoportra való összegzésével adódik:
Nt = ∑ i
10( pH − pki ) 1 + 10( pH − pki )
(26)
Ugyanakkor a j-edik bázisos funkciós csoportra az egyensúly az alábbiak szerint módosul: k BH + ← →B+ H+ K
kj =
1 [ B] ⋅ [ H + ] = Kj [ BH + ]
Így a csoportra a pozitív töltés moláris frakciója az alábbi kifejezéssel írható fel:
(27)
88 Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus elválasztásoknál Pj =
[ BH + ] 1 1 = = ( pH − pk j ) + + [ B] + [ BH ] 1 + k j [ H ] 1 + 10
(28)
Így a pozitív töltések összes mennyisége a moláris frakciók szerinti összegzéssel kapható meg: Pt = ∑ j
1 1 + 10
(29)
( pH − pk j )
A peptid Q töltése adott pH-n a pozitív és negatív töltések összegzésével kapható meg: Q= Pt − N t
(30)
A fenti kifejezés a peptid töltésére i+j független protonálható funkciós csoportra vonatkozik, a Stokes-féle rádiuszt állandónak feltételezve a különböző töltésű formák esetén166. Ugyanakkor a disszociációra képes csoportok, különösen kis peptidek esetén, nem tekinthetők függetlennek egymástól. A pK értékek nem csak a protonálható funkciós csoporttal rendelkező aminosav minőségétől függenek, hanem a szomszédos aminosav oldalláncok protonálódásra képes csoportjaitól, illetve a peptidlánc sztérikus tulajdonságaitól is105. Ezeket a megfontolásokat figyelembe véve a tanszékünkön multiprotikus ionok ionkromatográfiás vizsgálata során alkalmazott egyenletrendszer alkalmazása kínálkozott alternatívának150. Az egyszeresen (i=1), kétszeresen (i=2), …, m-szeresen (i=m) protonált formák φ moláris frakciói a következőképp írhatók fel:
φi (i =1,2,3,...,m ) =
H + m
i
∏K
i
n =1
1 + ∑ H +
k =1
k
n
(31)
k
∏K n =1
n
ahol Kn az n-edik protonálódásra képes csoport protonálódási állandója. A teljesen disszociált formára a fenti egyenlet az alábbiak szerint módosul:
φ0 =
1 m
1 + ∑ H +
k =1
k
(32)
k
∏K n =1
n
A tripeptid teljes töltése adott pH-n így az alábbi kifejezéssel számítható: = Q
m
∑φ ⋅ Q i =0
i
i
ahol Qi az i-szeresen protonált formához tartozó töltés értéke.
(33)
89 Eredmények A tripeptidek töltéseit a (30) és a (33) egyenlet alapján egyaránt kiszámítottuk a Pallas pKalc szoftverrel kapott pK értékek alapján. A tripeptidek mólarányeloszlás (φ vs pH) függvényeit, számított töltéseit a pH függvényében mindkét fent ismertetett számítási módszerrel és az egyes protonálódási állapotokhoz tartozó szerkezeteit a 25-29. ábra mutatja. Jól látható a diagramokon, hogy a két módszerrel kapott töltés értékek a pH függvényében nagyfokú egyezést mutatnak. Eltérés a görbék lefutásában csak a több egymáshoz közel eső pK értékkel rendelkező funkciós csoportot tartalmazó – aszparginsav (26. ábra), lizin (27. ábra) és tirozin (29. ábra) aminosavakból felépülő tripeptid – minták esetén tapasztalható.
25. ábra: Az alanin aminosavakból felépülő tripeptid mólarányeloszlás (fent baloldalon), és töltés (fent jobboldalon) függvénye, az egyes protonálódási állapotokhoz tartozó szerkezetek bemutatásával (lent); a töltés számítását a pH függvényében (jobb felső diagram) mind a Henderson-Hasselbach egyenlettel ((30) egyenlet, szaggatott vonal), mind a (33) egyenlettel (piros folytonos vonal) elvégezve.
26. ábra: Az aszparginsav aminosavakból felépülő tripeptid mólarányeloszlás (fent baloldalon), és töltés (fent jobboldalon) függvénye, az egyes protonálódási állapotokhoz tartozó szerkezetek bemutatásával (lent); a töltés számítását a pH függvényében (jobb felső diagram) mind a Henderson-Hasselbach egyenlettel ((30) egyenlet, szaggatott vonal), mind a (33) egyenlettel (piros folytonos vonal) elvégezve.
90 Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus elválasztásoknál
27. ábra: A lizin aminosavakból felépülő tripeptid mólarányeloszlás (fent baloldalon), és töltés (fent jobboldalon) függvénye, az egyes protonálódási állapotokhoz tartozó szerkezetek bemutatásával (lent); a töltés számítását a pH függvényében (jobb felső diagram) mind a Henderson-Hasselbach egyenlettel ((30) egyenlet, szaggatott vonal), mind a (33) egyenlettel (piros folytonos vonal) elvégezve.
28. ábra: A szerin aminosavakból felépülő tripeptid mólarányeloszlás (fent baloldalon), és töltés (fent jobboldalon) függvénye, az egyes protonálódási állapotokhoz tartozó szerkezetek bemutatásával (lent); a töltés számítását a pH függvényében (jobb felső diagram) mind a Henderson-Hasselbach egyenlettel ((30) egyenlet, szaggatott vonal), mind a (33) egyenlettel (piros folytonos vonal) elvégezve.
91 Eredmények
29. ábra: A tirozin aminosavakból felépülő tripeptid mólarányeloszlás (fent baloldalon), és töltés (fent jobboldalon) függvénye, az egyes protonálódási állapotokhoz tartozó szerkezetek bemutatásával (lent); a töltés számítását a pH függvényében (jobb felső diagram) mind a Henderson-Hasselbach egyenlettel ((30) egyenlet, szaggatott vonal), mind a (33) egyenlettel (piros folytonos vonal) elvégezve.
A fenti diagramok (25-29. ábra) vizsgálatából jól 11. táblázat: A tripeptidek Q és M értékei a kísérleti körülmények mellett Minta Q M AAA
-0,22
231,05
DDD
-3,18
360,08
KKK
2,77
405,38
SSS
-0,6
278,65
YYY
-0,52
507,00
látható, hogy az elválasztásokhoz alkalmazott 7,5-ös pH-n a kétféle számítási módszer mind az öt mintamolekula eredményez.
esetén Így
a
azonos módszer
töltés
értékeket
megválasztása
a
megalkotott modellek pontosságát nem befolyásolja. Az alkalmazott pH-n a mintamolekulák töltéseit és töltéssel korrigált molekulatömegeit a 11. táblázat foglalja össze.
3.4.4 Modellezési eredmények
A következőkben a modellezési eredményeket a megfelelő kísérleti fázisok szerint külön
kerülnek ismertetésre. Végül a T-CORG és CBGE-CORG kísérleti fázisok egyesítése kerül bemutatásra. 3.4.4.1 T-CORG kísérleti adatbázis modellezési eredményei
Az 1.3.1 fejezetben bemutatott szemi-empirikus modellek nem képesek az elválasztási
körülmények változásainak többségét számításba venni. Ez a magyarázata, hogy az Offordmodell a pufferösszetétel változását, a különböző futási hőmérsékleteket, illetve az összefüggés esetleges nem-lineáris természetét figyelmen kívül hagyva, nem képes megfelelő
92 Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus elválasztásoknál pontosságú modellezési teljesítményt nyújtani. A 12. táblázat mutatja be a modellekkel kapott és a kísérleti mobilitás értékek korrelációs együtthatóit, a teljes és egyszerűsített (szerves adalékanyagok változásait nem tartalmazó) adathalmazokra egyaránt. Az Offord-modell rugalmatlan viselkedését a 30. ábra által bemutatott korrelációs diagram jól szemlélteti, vízszintes vonalakat mutatva az egyes tripeptid mintákhoz (csak négy különíthető jól el, mivel a SSS és YYY minták átfednek az ábrán). Ennek oka, hogy mindössze Q és M input paramétereket figyelembe véve az olyan hatások kezelésére, mint a hőmérséklet vagy szerves adalék mennyisége, a modell nem képes. Ezzel szemben, az ANN modellek képesek voltak a változó futási hőmérséklet és szerves adalék anyagok (feltételezhetően nem-lineáris) hatásainak kezelésére, igen jó prediktív teljesítményt eredményezve. Az LM-ANN modellel kapott és a kísérleti mobilitások korrelációját a 31. ábra mutatja be. Az ANN megközelítés kiváló alkalmazhatóságát a 12. táblázat is szemléletesen demonstrálja. 12. táblázat: Korrelációs együtthatók Modell TVSE Offord szerves adalék nélkül TVSE Offord ANN GDX (tanulási, teszt, validálási) ANN LM (tanulási, teszt, validálási)
30. ábra: Az Offord-modell korrelációs diagramja (T-CORG)
T-CORG 0,9415 0,9209 0,9976 0,9990
CBGE-CORG 0,9417 0,9082 0,9961
31. ábra: Az LM-ANN modell korrelációs diagramja (TCORG)
Bár a GDX és LM algoritmusok egyaránt nagyon jól adaptálhatónak bizonyultak az adott adathalmazhoz, a tanulási teljesítményük eltéréseket mutatott. A GDX algoritmus a tanulási paraméterek fárasztó beállítását igényelte a LM algoritmussal kapottnak megfelelő korreláció elérése érdekében. Sőt a GDX tanulása 1443 iterációt igényelt, szemben a 14 iteráció után leállított LM tanulási folyamattal, mely némileg még jobb korrelációs értékeket is adott. Így a
93 Eredmények LM tanulási módszert fogadtuk el a bemutatott adatokhoz alkalmasabbnak, és így a következő modellezési feladatokhoz is ezt használtuk. A 12. táblázat mutatja a GDX és LM tanulási algoritmusú ANN-ekkel kapott korrelációs értékek összehasonlítását. A LM algoritmus tanulási teljesítményét a 32. ábra szemlélteti. Az iteráció 14 tanulási ciklus után leállításra került, mivel a validálási halmaz hibája elérte a minimumát, és a további ciklusok a modell túltanulását okozták volna.
32. ábra: Az LM-ANN tanulási-teljesítmény grafikonja (T-CORG)
33. ábra: YYY minta predikciós diagramja 12 kV elválaszásokra (T-CORG)
34. ábra: 15 (V/V)% MetOH tartalmú elektrolittal 12 kV elválasztások predikciós diagramja az öt mintapeptidre (T-CORG)
Az LM tanulású ANN modell prediktív képességét a 33. ábra és 34. ábra szemlélteti, ahol a kísérleti mobilitások körökkel, a számított értékek folytonos vonalakkal vannak jelölve. A tirozin aminosavból álló tripeptid példáján keresztül mutatja be a 33. ábra 12 kV feszültség
94 Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus elválasztásoknál különböző
alkalmazásával,
összetételű
pufferekkel,
változó
hőmérsékleten
végzett
elválasztások esetén, míg a 34. ábra a hőmérséklet hatásaira helyezi a hangsúlyt 15 (V/V)% metanolt tartalmazó pufferrel 12 kV feszültség hatására kivitelezett elválasztások esetén minden mintapeptidre. 3.4.4.2 CBGE-CORG kísérleti adatbázis modellezési eredményei
A várakozásoknak megfelelően az Offord-modell nem nyújtott erre az adathalmazra sem
pontos modellezési teljesítményt, mivel sem
a
futtató
puffer
összetétel-
változásainak hatásait, sem pedig a tanulmányozott összefüggés esetleges nem-lineáris karakterisztikáit nem képes kezelni.
A
mobilitások
becsült közti
és
kísérleti korrelációs
együtthatókat a 12. táblázat foglalja össze, a teljes és egyszerűsített (szerves adalékok
nélküli)
adathalmazokra
egyaránt. A szerves adalék nélküli adathalmaz jelentősen jobb korrelációs
35. ábra: LM-ANN modell korrelációs diagramja (CBGECORG)
együtthatója, jól szemlélteti az Offord-modell tökéletlenségeit a vizsgált kísérleti körülmények közt. Következésképpen a CACN és CMeOH – két leginkább befolyásoló paraméter – változásának kiszűrése a megfelelő korrelációs együtthatók látványos javulását eredményezte. Az alkalmazott LM-ANN modell ezzel szemben alkalmas volt a puffer koncentrációváltozásainak és szerves oldószertartalmának (feltételezhetően nem-lineáris) hatásainak kezelésére, igen jó prediktív teljesítményt eredményezve. A becsült és kísérleti mobilitások korrelációs eredményeit 35 tanulási ciklus után a 35. ábra mutatja be az összes különböző tripeptid mintára. Az ANN megközelítés kiváló alkalmazhatóságát, a 12. táblázat korrelációs értékeit összevetve, szemléletesen sikerült demonstrálni. A 36. ábra és 37. ábra mutatja az ANN prediktív képességét, a kísérleti mobilitásokat körökkel, a számított értékeket folytonos vonalakkal jelölve. A 36. ábra lizin aminosavakból felépülő tripeptid mintára szemlélteti a prediktív teljesítményt különböző összetételű pufferekkel, míg a 37. ábra a különböző pufferkoncentrációk hatásait mutatja be az összes mintakomponens elektroforetikus mobilitására.
95 Eredmények
36. ábra: A KKK minta predikciós diagramja 12 kV-tal történő elválasztásoknál (CBGE-CORG)
37. ábra: Predikciós diagram 12 kV-tal történő elválasztásokra 10 (V/V)% metanolt tartalmazó pufferekkel (CBGE-CORG)
3.4.4.3 A CBGE-CORG és T-CORG adatbázisok egyesítése
A majd 2500 kísérleti mobilitás értéket tartalmazó nagymennyiségű adat modellezése
különös gondosságot igényelt. A tanulási paraméterek módszeres beállítása képessé tette az alkalmazott LM-ANN modellt az összes vizsgált kísérleti jellemző – azaz T, CBUF, CACN, CMeOH, U, Q, és M – figyelembe vételére, kiváló prediktív képességről téve tanúbizonyságot.
38. ábra: A LM-ANN tanulási teljesítménye az egyesített adatokkal
A legjobb korrelációs együttható értéket (r2=0,9972) a tanulási folyamat 152 iterációs ciklusa után kaptuk. A LM algoritmus tanulási teljesítményét a 38. ábra mutatja be, míg a korrelációt a 152 tanulási ciklus után számított és a kísérletileg meghatározott mobilitás értékek között a 39. ábra szemlélteti. További iterációs ciklusokkal a validálási halmaz hibája
96 Peptidek mobilitásának modellezése kapilláris zóna elektroforetikus elválasztásoknál nőni kezdett, a modell túltanulását okozva, ami igazolta, hogy jól sikerült megválasztani a leállítás idejét. A 40. ábra tovább szemlélteti az egyesített adathalmazra alkalmazott ANN modell prediktív teljesítményét, ahol a körök jelölik a kísérleti, a folytonos vonalak a modellel kapott mobilitásokat. Az ábra a metanol koncentráció változásának hatásait mutatja a mintapeptidek mobilitásaira. Mivel a CMeOH paraméter mindkét adathalmazban (T-CORG és CBGE-CORG) szerepet játszott, így a 40. ábra a két kísérleti adathalmaz unióját tartalmazza.
39. ábra: A LM-ANN modell korrelációs diagramja az egyesített adathalmazra
40. ábra: A predikciós diagram az egyesített adathalmazra 12 kv feszültséggel 30 mM koncentrációjú pufferrel
3.4.5 Következtetések
A peptidek elektroforetikus mobilitása és töltöttségi állapotuk, méretük (hidrodinamikai
sugárral, molekulatömeggel vagy aminosav alkotók számával kifejezve) és alakjuk (az oligoés polipeptid láncok konformációja) között a megfelelő korreláció elérése továbbra is kihívást jelentő feladat. A hagyományos szemi-empirikus QSPR modellek hiányosságainak leküzdésére kétféle stratégia áll rendelkezésre. Egyrészt a kétváltozós modellek további peptid paraméterekkel való kiegészítése, hogy a modell leíró képességét, működési tartományát a szélesebb skálájára kiterjeszthessék. Másrészt nem-lineáris modellezési módszerekkel, mint a mesterséges neurális hálózatok, pontosabb és robosztusabb modellek megalkotása. A peptidek elektroforetikus mobilitásának előrejelzésére az elválasztási körülmények függvényében újszerű, alapvetően paraméter vezérelt megközelítést alkalmaztunk kisszámú, egyszerű, reprezentatív mintával létrehozott kiterjedt kísérleti adatbázis alapján. Külön figyelmet fordítottunk az olyan, korábbi modellezési munkák során még nem vizsgált, elválasztási körülmények hatásaira, mint a háttérelektrolit szerves adalékanyag tartalma és az elválasztás hőmérséklete. A gépi intelligencia módszerek lineáris modellezési technikákkal szemben
97 Eredmények mutatott kiváló alkalmazhatósága és prediktív teljesítménye a peptidek szerkezeti jellemzői és elektroforetikus mobilitásuk között fennálló nem-lineáris összefüggést igazolja.
98 Összefoglalás
4 Összefoglalás A komplex szénhidrátok nagyhatékonyságú kapilláris elektroforetikus elválasztása gyorsan fejlődő terület. Doktori dolgozatom első felében e területen elért eredményeket foglaltam össze. A multikapilláris formátumú alkalmazás a glikoziláció változásainak nagy áteresztőképességű természetének
elemzését
és/vagy
teszi
lehetővé,
mértékének
egyrészt
az
(profilozás/profiling)
oligoszacharid vizsgálatával,
eloszlás másrészt
exoglikozidáz alapú emésztéses (szekvenálás) analízisével. Mivel a cukrok csak kivételesen tartalmaznak töltést hordozó, kromofór vagy fluorofór csoportokat, elektroforetikus elemzésük megfelelő jelölési módszert követel meg. A 8-aminopirén-1,3,6-triszulfonát (APTS) a célra az egyik leggyakrabban alkalmazott reagens, mely lehetővé teszi a fluoreszcens detektálást látható kék fényt emittáló LED hatására. Az APTS jelölés az elektroforetikus elválasztáshoz szükséges töltést is biztosítja a mintamolekuláknak. Ugyanakkor a derivatizációs reakció kiváló kihozatalához szükséges APTS nagy moláris feleslege a reakcióelegyben az injektálás és elválasztás során komoly nehézségeket eredményez. Az injektálás során kifejtett zavaró hatása mellett, az oldatban maradó konjugálatlan jelölőanyag a kisméretű oligoszacharidok kimutatását is megnehezíti, mivel gyakran ezek az elválasztás során együtt vándorolnak egy túltelített átlapoló elektroforetikus csúcsot eredményezve. Munkám során a jelölő anyag kapilláris elektroforetikus elemzést megelőző három mintaelőkészítési módszert értékeltem. Mindhárom módszer képesnek bizonyult az APTS eltávolítására, nagyobb érzékenységet eredményezve a vizsgálni kívánt jelölt szénhidrátok analízise során, azonban a DPA-6S normál fázisú poliamid kromatográfiás állófázist tartalmazó pipetta hegyek kimagaslóan a legjobb hatásfokot eredményezték. A humán szérum glikozilációs profiljának vizsgálatához nélkülözhetetlen mintaelőkészítési feladatot, a minta glükóz tartalmának eltávolítását, ultraszűréssel sikerült hatékonyan megoldani. Az exoglikozidáz emésztésen alapuló szénhidrát elemzéses metodikát illékony puffer rendszer kidolgozásával sikerült elektrokinetikus injektáláshoz adaptálni, a reakció termékeinek megfelelő analízise érdekében. A munka folytatásaként a hőmérséklet hatásait vizsgáltam meg a glikoproteinek boronsav lektin affinitás kromatográfiás (BLAC: boronic acid - lectin affinity chromatography) izolálásának és dúsításának hatékonyságára. Búzacsíra agglutinin (WGA: wheat germ agglutinin) és m-aminofenil-boronsav (boronsav) tartalmú állófázisokat vizsgálva egyedileg és kevert formában, integrált 96-os mikrotiter plate hűtő/fűtő egységgel szerelt automatával. Ribonukleáz B és tripszin inhibitor modell proteinek glikoaffinitás kromatográfiás dúsítását
99 Összefoglalás vizsgáltam nem glikozilált mioglobin (semleges) és lizozim (bázikus) fehérjék jelenlétében széles (5-65°C) hőmérséklettartományon. Az eredmények alapján meghatároztam a mikropreparatív affinitás kromatográfiás glikoprotein izoláció kihozatalának hőmérsékleti optimumát. Ugyanakkor nagy mennyiségű lizozim jelenlétét tapasztaltam az m-aminnofenil-boronsav tartalmú állófázisok elúcióiban, rávilágítva a negatív töltésű állófázis és a pozitív töltésű fehérje közt az alkalmazott pH-n fellépő ioncserés mechanizmusra. Másrészt, magas hőmérsékleten (65°C) nem specifikus kölcsönhatások érvényesültek az agaróz hordozóval, amit a mioglobin jelenléte igazolt az elúciókban. Továbbfejlesztettem a humán szérum glikoproteinek vizsgálatát az innsbrucki Horváth Laboratóriumban kidolgozott boronát - lektin affinitás kromatográfia (BLAC) adaptálásával az N-glikozilációs profil monitorozásához. Az optimalizált és automatizált glikoaffinitás kromatográfiás mikropreparatív módszert a humán szérum glikoproteinek izolálására és dúsítására alkalmaztam. A N-glikánokat az izolált glikoproteinekből enzimatikusan szabadítottam fel, majd 8-aminopirén-1,3,6-triszulfonsavval jelöltem. LED indukált fluoreszenciás detektálású kapilláris gél elektroforetikus analízissel végeztem multiplex formában a komparatív szénhidrát profilozást. A párhuzamosan preparált minták, és az oszlopok
reprodukálhatóságát
(„sample-to-sample”
és
„column-to-column”
reprodukálhatóság) egyaránt értékeltem. Demonstráltam a módszer alkalmazhatóságát egy gyakorlati példán keresztül, a glikozilációs különbségek vizsgálatát egészséges és prosztata karcinómában szenvedő egyének BLAC mikropreparatív affinitás kromatográfiásan izolált szérum glikoproteinjeiből felszabadított glikánok összehasonlító multikapilláris gél elektroforetikus analízisével. Végül a peptidek kapilláris zóna elektroforézises elválasztásának modellezése területén elért eredményeket mutattam be. Ismertettem a különböző modellezési megközelítéseket, újszerű paraméter vezérelt módszerrel, kiterjedt kísérleti adatbázisra épülve vizsgáltam a különböző modellek predikciós teljesítményét. Részletesen bemutattam a szemi-empirikus és gépi intelligenciára épülő (mesterséges neurális hálózat) modellekkel elért eredményeket az elektroforetikus mobilitás szimulációjára, ahol utóbbiak kiváló predikciós hatékonyságát igazolta, rávilágítva az elektroforetikus mobilitás és a pepipdek jellemzőinek és az elválasztás paramétereinek nem-lineáris összefüggéseire. Az elért eredmények megalapozhatják számítógépes szimulációs alkalmazás kifejlesztését, a peptidelválasztások optimalizálására, a futtatópuffer összetételének és az elválasztási körülmények meghatározásával a munka- és időigényes kísérleti optimalizálás leegyszerűsítésére.
100 Összefoglalás
101 Irodalomjegyzék
Irodalomjegyzék 1
2 3
4
5
6 7 8
9 10
11
12
13
14
15
16
Endo, T. Fractionation of glycoprotein-derived oligosaccharides by affinity chromatography using immobilized lectin columns. Journal of Chromatography A 720, 251-261 (1996). Townsend, R. R. & Hotchkiss Jr., A. T. Techniques in Glycobiology. (Marcel Dekker, New York, 1997). Warner, T. G. Metabolic engineering glycosylation: biotechnology's challenge to the glycobiologist in the next millenium. Carbohydrates in Chemistry and Biology 4, 1043-1064 (2000). Kita, Y. et al. Quantitative glycomics of human whole serum glycoproteins based on standardized protocol for liberating N-glycans. Molecular and Cellular Proteomics 6, 1437-1445 (2007). Madera, M., Mechref, Y., Klouckova, I. & Novotny, M. V. Semiautomated highsensitivity profiling of human blood serum glycoproteins through lectin preconcentration and multidimensional chromatograpy/tandem mass spectrometry. Journal of Proteome Research 5, 2348-2363 (2006). Fukuda, M. N. HEMPAS disease: genetic defect of glycosylation. Glycobiology 1, 915 (1990). Hounsell, E. F., Davies, M. J. & Smith, K. D. in Protein Protocols Handbook 651652 (1996). Kalász, H. & Báthori, M. Chromatographic techniques in studies of the calcium channels and of calcium antagonists in physiological cells. Trends in Analytical Chemistry 14, 442-449 (1995). Harvey, D. J. Identification of protein-bound carbohydrates by mass spectrometry. Proteomics 1, 311-328 (2001). Ortner, K., Sivanandam, V. N., Buchberger, W. & Müller, N. Analysis of glycans in glycoproteins by diffusion ordered nuclear magnetic resonance spectroscopy. Analytical and Bioanalytical Chemistry 388, 173-177 (2007). Wilson, N. L., Schulz, B. L., Karlsson, N. G. & Packer, N. H. Sequential analysis of N- and O-linked glycosilation of 2D-PAGE separated glycoproteins. Journal of Proteome Research 1, 521-529 (2002). Kislinger, T., Humeny, A. & Pischetsrieder, M. Analysis of protein glycation products by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Current Medicinal Chemistry 11, 2185-2193 (2004). Sagi, D., Kienz, P., Denecke, J., Marquardt, T. & Peter-Katalinic, J. Glycoproteomics of N-glycosylation by in-gel deglycosylation and matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry mapping: Application to cogenital disorders of glycosylation. Journal of Proteomics 5, 2689-2701 (2005). Guttman, A., Chen, F.-T. A. & Evangelista, R. A. Separation of 1-aminopyrene-3,6,8trisulfonate-labeled aspargine-linked fetuin glycans by capillary gel electrophoresis. Electrophoresis 17, 412-417 (1996). Guttman, A., Chen, F.-T. A., Evangelista, R. E. & Cooke, N. High-resolution capillary gel electrophoresis of reducing oligosaccharides labeled with 1-aminopyrene-3,6,8trisulfonate. Analytical Biochemistry 233, 234-242 (1996). Guttman, A., Cooke, N. & Starr, C. M. Capillary electrophoresis separation of oligosaccharides: I. Effect of operational variables. Electrophoresis 15, 1518-1522 (1994).
102 Irodalomjegyzék 17
18
19
20 21
22
23
24 25 26 27 28
29
30
31 32
33 34 35 36 37
Olajos, M., Hajós, P., Bonn, G. K. & Guttman, A. Sample Preparation for the Analysis of Complex Carbohydrates by Multicapillary Gel Electrophoresis with Light-Emitting Diode Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry 80, 4241-4246 (2008). Lacunza, I., Kremmer, T., Díez-Masa, J. C., Sanz, J. & Frutos, M. d. Comparison of α1-acid glycoprotein isoforms from healthy and cancer patients by capillary IEF. Electrophoresis 28, 4447-4451 (2007). Campa, C., Coslovi, A., Flamigni, A. & Rossi, M. Overview on advances in capillary electrophoresis-mass spectrometry of carbohydrates: a tabulated review. Electrophoresis 27, 2027-2050 (2006). (ed International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use (ICH)) (1999). Royle, L. et al. Secretory IgA N- and O-Glycans Provide a Link between the Innate and Adaptive Immune System. Journal of Biologycal Chemistry 278, 20140-20153 (2003). Harvey, D. J. Proteomic analysis of glycosilation: structural determination of N- and O-linked glycans by mass spectrometry. Expert Review of Proteomics 2, 87-101 (2005). Taverna, M., Baillet, A. E. & Baylocq-Ferrier, D. Identification of monosaccharides by high-performance liquid chromatography using methanolysis and light scattering detector. Journal of Chromatography 514, 70-79 (1990). Harvey, D. J. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates. Mass Spectrometry Reviews 18, 349-450 (1999). Dell, A. & Morris, H. R. Glycoprotein Structure Determination by Mass Spectrometry. Science 291, 2351-2356 (2001). Mechref, Y. & Novotny, M. V. Structural Investigation of Glycoconjugates at High Selectivity. Chemical Reviews 102, 321-370 (2002). Zaia, J. Mass Spectrometry of Oligosaccharides. Mass Spectrometry Reviews 23, 161227 (2004). Evangelista, R. A., Liu, M.-S. & Chen, F.-T. A. Characterization of 9-aminopyrene1,4,6-trisulfonate-derivatized sugars by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Analytical Chemistry 67, 2239-2245 (1995). O'Shea, M. G., Samuel, M. S., Konik, C. M. & Morell, M. K. Fluorophore-assisted carbhydrate electrophoresis (FACE) of oligosaccharides: efficiency of labelling and high-resolution separation. Carbohydrate Research 307, 1-12 (1998). Ruiz-Calero, V., Puignou, L. & Galceran, M. T. Determination of glycosaminoglycan monosaccharides by capillary electrophoresis using laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B 791, 193-202 (2003). Guttman, A. High-resolution carbohydrate profiling by capillary gel electrophoresis. Nature (London) 380, 461-462 (1996). Khandurina, J., Anderson, A. A., Olson, N. A., Stege, J. T. & Guttman, A. Large-scale carbohydrate analysis by capillary array electrophoresis: Part 2. Data normalization and quantification. Electrophoresis 25, 3122-3127 (2004). Callewaert, N. et al. Total serume protein N-glycome profiling on a capillary electrophoresis-microfluidics platform. Electrophoresis 25, 3128-3131 (2004). Royle, L., Radcliffe, C. M., Dwek, R. A. & Rudd, P. M. in Methods in Molecular Biology Vol. 347 (ed Inka Brockhausen-Schutzbach) 125-144 (Humana Press, 2006). http://www.eurocarbdb.org,
. Takahashi, N. & Tomiya, N. Elution Coordinate Database for 2-D/3-D Sugar Map, http://www.gak.co.jp/ECD/Hpg_eng/hpg_eng.htm). Rudd, P. GlycoBase, http://glycobase.ucd.ie/cgi-bin/public/glycobase.cgi).
103 Irodalomjegyzék 38 39 40
41
42
43 44 45 46 47 48
49 50 51
52 53
54 55 56
57
58
Rudd, P. M., Merry, A. H., Wormald, M. R. & Dwek, R. A. Glycosylation and prion protein. Current Opinion in Structural Biology 12, 578-586 (2002). Tekoah, Y. et al. Controlled glycosylation of therapeutic antibodies in plants. Archives of Biochemistry and Biophysics 426, 266-278 (2004). Ma, S. & Nashabeh, W. Carbohydrate Analysis of a Chimeric Recombinant Monoclonal Antibody by Capillary Gel Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry 71, 5185-5192 (1999). Callewaert, N., Geysens, S., Molemans, F. & Contreras, R. Ultrasensitive profiling and sequencing of N-linked oligosaccharides using standard DNA-sequencing equipment. Glycobilogy 11, 275-281 (2001). Dang, F., Zhang, L., Hagivara, H., Mishina, Y. & Baba, Y. Ultrafast analysis of oligosaccharides on microchip with light-emitting diode confocal fluorescence detection. Electrophoresis 24, 714-721 (2003). Domann, P. J. et al. Separation-based Glycoprofiling Approaches using Fluorescent Labels. Practical Proteomics 7, 70-76 (2007). Hirabayashi, J., Arata, Y. & Kasai, K.-i. Glycome project: Concept, strategy and preliminary application to Caenorhabditis elegans. Proteomics 1, 295-303 (2001). Scherz, H. & Bonn, G. K. Analytical Chemistry of Carbohydrates. (Thieme Verlag, 1998). Villalobo, A., Horcajadas, J. A., Andre, S. & Gabius, H. J. in Glycosciences eds H. J. Gabius & S. Gabius) 485 (Chapman & Hall, 1997). Hauri, H. P., Appenzeller, C., Kuhn, F. & Nufer, O. Lectins and traffic in the secretory pathways. Vol. 476 32-37 (FEBS Lett, 2000). Danguy, A., Decaestecker, C., Genten, F., Salmon, I. & Kiss, R. Applications of Lectins and Neoglycoconjugates in Histology and Pathology. Acta Anatomica 161, 206-218 (1998). Karlsson, K. A. Bacterium-host protein-carbohydrate interactions and pathogenicity. Biochemical Society Transactions 27, 471-474 (1999). Essentials of Glycobiology. (Cold Spring Harbor Press, 1999). Zheng, Y.-J., Ornstein, R. L. & Leary, J. A. A density functional theory investigation of metal ion binding sites in monosaccharides. Journal of Molecular Structure: THEOCHEM 389, 233-240 (1997). Weis, W. I., Drickamer, K. & Hendrickson, W. A. Structure of C-type mannosebinding protein complexed with an oligosaccharide. Nature 360, 127-134 (1992). Monzo, A., Bonn, G. K. & Guttman, A. Lectin-immobilization strategies for affinity purification and separation of glycoconjugates. TrAC, Trends in Analytical Chemistry 26, 423-432 (2007). Kilpatrick, D. C. Handbook of Animal Lectins: Properties and biomedical applications. (Wiley & Sons, 2000). Kasai, K.-i. & Hirabayshi, J. Galeczins: A Family of Animal Lectins That Decipher Glycocodes. Journal of Biochemistry 119, 1-8 (1996). Neurohr, K. J., Young, N. M. & Mantsch, H. H. Determination of the carbohydratebinding properties of peanut agglutinin by ultraviolet difference spectroscopy. Journal of Biological Chemistry 255, 9205-9209 (1980). Ohyama, Y., Kasai, K., Nomoto, H. & Inoue, Y. Frontal affinity chromatography of ovalbumin glycoasparagines on a concanavalin A-sepharose column: A quantitative study of the binding specificity of the lectin. Journal of Biological Chemistry 260, 6882-6887 (1985). Kochibe, N. & Furukawa, K. Purification and properties of a novel fucose-specific hemagglutinin of Aleuria aurantia. Biochemistry 19, 2841-2846 (1980).
104 Irodalomjegyzék 59 60
61
62
63 64
65
66
67 68
69
70 71
72 73
74 75
76
Endo, T. Lectin-affinity chromatography of carbohydrates. Journal of Chromatography library 66, 251-265 (2002). Debray, H. & Montreuil, J. Alueria aurantia agglutinin: A new isolation procedure and further study of its specificity towards various glycopeptides and oligosaccharides. Carbohydrate Research 185, 15-26 (1989). Yang, Y. & Hancock, W. S. Approach to the comprehensive analysis of glycoproteins isolated from human serum using a multi-lectin affinity column. Journal of Chromatography A 1053, 79-88 (2004). Tozzi, C., Anfossi, L. & Giraudi, G. Affinity chromatography techniques based on the immobilization of peptides exhibiting specific binding activity. Journal of Chromatography B 797, 289-304 (2003). Narayanan, S. R. & Crane, L. J. Affinity chromatography supports: a look at performance requirements. Trends in Biotechnology 8, 12-16 (1990). Masárová, J., Dey, E. S., Carlsson, J. & Danielsson, B. Novel peptide surface for reversible immobilization of concanavalin A. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 60, 163-170 (2004). Wang, W. C., Clark, G. F., Smith, D. F. & Cummings, R. Separation of oligosaccharides containing terminal alpha-linked galactose residues by affinity chromatography on Giffonia simplicifolia I bound to concanavalin A-sepharose. Analytical Biochemistry 175, 390-396 (1988). Rassi, Z. E., Truel, Y., Maa, Y.-F. & Horváth, C. High-performance liquid chromatography with concanavalin A immobilized by metal interactions on the stationary phase. Analytical Biochemistry 169, 172-180 (1988). Ambudkar, S. V., Lelong, I. H., Zhang, J. & Cardarelli, C. Purification and reconstution of human P-glycoprotein. Methods in Enzymology 292, 492-504 (1998). Tulsiani, D. R. P. Structural Analysis of the Asparagine-Linked Glycan Units of the ZP2 and ZP3 Glycoproteins from Mouse Zona Pellucida. Archives of Biochemistry and Biophysics 382, 275-283 (2000). Schuette, C. G., Weisgerber, J. & Sandhoff, K. Complete analysis of the glycosylation and disulfide bond pattern of human β-hexosaminidase B by MALDI-MS. Glycobilogy 11, 549-556 (2001). Sharma, S. K. & Mahendroo, P. P. Affinity chromatography of cells and cell membranes. Journal of Chromatography 184, 471-499 (1980). Helmholz, H., Cartellieri, S., He, L., Thiesen, P. & Niemeyer, B. Process development in affinity separation of glycoconjugates with lectins as ligands. Journal of Chromatography A 1006, 127-135 (2003). Hancock, W. S., Yang, Z. & Hincapie, M. Multi-lectin affinity chromatography and uses thereof. Wo patent 2005107491 (2005). Spivak, J. L. & Hollenberg, M. D. Affinity chromatography with agarose-lectin derivatives: separation of human glycoproteins and application to erythroprotein purification. Progress in Clinical and Biological Research 29, 641-653 (1979). Yamamoto, K., Tsuji, T. & Osawa, T. in Protein Protocols Handbook (ed John M. Walker) 917-931 (Humana Press, 2002). Yang, Y. & Hancock, W. S. Monitoring glycosylation pattern changes of glycoproteins using multi-lectin affinity chromatography. Journal of Chromatography A 1070, 57-64 (2005). Wilchek, M. & Miron, T. Limitations of N-hydrixysucinimide esters in affinity chromatography and protein immobilization. Biochemistry 26, 2155-2161 (1987).
105 Irodalomjegyzék 77
78
79 80
81
82
83
84
85
86
87
88 89 90 91
92 93 94
Ito, Y., Seno, N. & Matsumoto, I. Immobilization of Protein Ligands on New FormylSpacer-Carriers for Preparation of Stable and High Capacity Affinity Adsorbents. Journal of Biochemistry 97, 1689-1694 (1985). Nilsson, K. & Mosbach, K. Immobilization of enzymes and affinity ligands to various hydroxyl group carrying supports using highly reactive sulfonyl chlorides. Biochemical and Biophysical Research Communications 102, 449-457 (1981). Ernst-Cabrera, K. & Wilchek, M. Silica containing primary hydroxyl groups for highperformance affinity chromatography. Analytical Biochemistry 159, 267-272 (1986). Cartellieri, S., Hamer, O., Helmholz, H. & Niemeyer, B. One-step purification of fetuin from fetal bovine serum. Biotechnology and Applied Biochemistry 35, 83-89 (2002). Nakamura, K., Hashimoto, T., Kato, Y., Shimura, K. & Kasai, K. Tresyl-activated support for high-performance affinity chromatography. Journal of Chromatography (1990). Cartellieri, S., Helmholz, H. & Niemeyer, B. Preparation and Evaluation of Ricinus communis Agglutinin Affinity Adsorbents Using Polymeric Supports. Analytical Biochemistry 295, 66-75 (2001). Bedair, M. & Rassi, Z. E. Affinity chromatography with monolithic capillary columns: II. Polymethacrylate monoliths with immobilized lectins for the separation of glycoconjugates by nano-liquid affinity chromatography. Journal of Chromatography A 1079, 236-245 (2005). Rosenfeld, H. et al. Comparison of modified supports on the base of glycoprotein interaction studies and of adsorption investigations. Journal of Chromatography A 1092, 76-88 (2005). Kobata, A. & Endo, T. Immobilized lectin columns: useful tools for the fractionation and structural analysis of oligosaccharides. Journal of Chromatography 597, 111-122 (1992). Konami, Y., Yamamoto, K., Osawa, T. & Irimura, T. Strong affinity of Maackia amurensis hemagglutinin (MAH) for sialic acid-containing Ser/Thr-linked carbohydrate chains of N-terminal octapeptides from human glycophorin A. FEBS letters 342, 334-338 (1994). Qiu, R. & Regnier, F. E. Comparative Glycoproteomics of N-Linked Complex-Type Glycoforms Containing Sialic Acid in Human Serum. Analytical Chemistry 77, 72257231 (2005). Hirabayashi, J. & Kasai, K.-i. Glycomics, Coming of Age. Trends in Glycoscience and Glycotechnology 12, 1-5 (2000). Hirabayashi, J. Lectin-based structural glycomics: Glycoproteomics and glycan profiling. Glycoconjugate Journal 21, 35-40 (2004). Kasai, K.-i. & Ishii, S.-i. Quantitative Analysis of Affinity Ckromatography of Trypsin. Journal of Biochemistry 77, 261-264 (1975). Nakamura-Tsuruta, S., Uchiyama, N. & Hirabayashi, J. High-throughput analysis of lectin-oligosaccharide interactions by automated frontal affinity chromatography. Methods in Enzymology 415, 311-325 (2006). Taketa, K. Characterization of sugar chain structures of human a-fetoprotein by lectin affinity electrophoresis. Electrophoresis 19, 2595-2602 (2005). Taketa, K., Kamakura, K., Fukazawa, M., Ikeda, S. & Taga, H. Lectin-gradient gel affinity electrophoresis of glycoproteins. Electrophoresis 19, 1275-1278 (1998). Ogata, M., Taga, H. & Taketa, K. Lectin affinity electrophoresis of alpha-fetoprotein detected by immunoenzymatic and chemiluminescent amplification followed by direct scanning. Acta Medica Okayama 50, 119-124 (1996).
106 Irodalomjegyzék 95
96
97
98
99
100
101
102 103
104 105 106
107
108
109
110
111
Morinaga, T., Sakai, M., Wegmann, T. G. & Tamaoki, T. Primary structures if human alpha-fetoprotein and its mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80, 4604-4608 (1983). Hageman, J. H. & Kuehn, G. D. Boronic Acid Matrices for the Affinity Purification of Glycoproteins and Enzymes. Methods in Molecular Biology (Totowa, NJ, United States) 11, 45-71 (1992). Liang, J. N. & Chylack, L. T. J. Change in the protein tertiary structure with nonenzymatic glycosylation of calf alpha-crystallin. Biochemical and Biophysical Research Communications 123, 899-906 (1984). Li, Y., Larsson, E. L., Jungvid, H., Galaev, I. Y. & Mattiasson, B. Shielding of protein-boronate interactions during boronate chromatography of neoglycoproteins. Journal of Chromatography, A 909, 137-145 (2001). Koyama, T. & Terauchi, K.-i. Synthesis and application of boronic acid-immobilized porous polymer particles: a novel packing for high-performance liquid affinity chromatography. Journal of Chromatography B 679, 31-40 (1996). Palanisamy, U. D., Winzor, D. J. & Lowe, C. R. Synthesis and evalutation of affinity adsorbents for glycoproteins: an artificial lectin. Journal of Chromatography B 746, 265-281 (2000). Hyun, S., Kim, J., Kwon, M. & Yu, J. Selection and syntheses of tentacle type peptides as 'artificial' lectins against various cell-surfacecarbohydrates. Bioorganic & Medicinal Chemistry 15, 511-517 (2007). Cifuentes, A. & Poppe, H. Simulation and optimization of peptide separation by capillary electrophoresis. Journal of Chromatography, A 680, 321-340 (1994). Ma, W. et al. Accurate quantitative structure-property relationship model of mobilities of peptides in capillary zone electrophoresis. Analyst (Cambridge, United Kingdom) 131, 1254-1260 (2006). Dolnik, V. Capillary electrophoresis of proteins 2003-2005. Electrophoresis 27, 126141 (2006). Kasicka, V. Capillary electrophoresis of peptides. Electrophoresis 20, 3084-3105 (1999). Offord, R. E. Electrophoretic mobilities of peptides on paper and their use in the determination of amide groups. Nature (London, United Kingdom) 211, 591-593 (1966). Grossman, P. D., Colburn, J. C. & Lauer, H. H. A semiempirical model for the electrophoretic mobilities of peptides in free-solution capillary electrophoresis. Analytical Biochemistry 179, 28-33 (1989). Compton, B. J. Electrophoretic mobility modeling of proteins in free zone capillary electrophoresis and its application to monoclonal antibody microheterogeneity analysis. Journal of Chromatography 559, 357-366 (1991). Cross, R. F. & Wong, M. G. Objective testing for the dependence of electrophoretic mobilities upon size in capillary zone electrophoresis. Chromatographia 53, 431-436 (2001). Adamson, N. J. & Reynolds, E. C. Rules relating electrophoretic mobility, charge and molecular size of peptides and proteins. Journal of Chromatography, B: Biomedical Sciences and Applications 699, 133-147 (1997). Tessier, B., Blanchard, F., Vanderesse, R., Harscoat, C. & Marc, I. Applicability of predictive models to the peptide mobility analysis by capillary electrophoresiselectrospray mass spectrometry. Journal of Chromatography, A 1024, 255-266 (2004).
107 Irodalomjegyzék 112
113 114
115
116
117
118
119
120 121 122
123
124 125
126
127
128
129
Xin, Y., Mitchell, H., Cameron, H. & Allison, S. A. Modeling the Electrophoretic Mobility and Diffusion of Weakly Charged Peptides. Journal of Physical Chemistry B 110, 1038-1045 (2006). Cifuentes, A. & Poppe, H. Behavior of peptides in capillary electrophoresis. Effect of peptide charge, mass, and structure. Electrophoresis 18, 2362-2376 (1997). Jalali-Heravi, M., Shen, Y., Hassanisadi, M. & Khaledi, M. G. Prediction of electrophoretic mobilities of peptides in capillary zone electrophoresis by quantitative structure-mobility relationships using the Offord model and artificial neural networks. Electrophoresis 26, 1874-1885 (2005). Janini, G. M., Metral, C. J. & Issaq, H. J. Peptide mapping by capillary zone electrophoresis: How close is theoretical simulation to experimental determination. Journal of Chromatography, A 924, 291-306 (2001). Janini, G. M., Metral, C. J., Issaq, H. J. & Muschik, G. M. Peptide mobility and peptide mapping in capillary zone electrophoresis. Experimental determination and theoretical simulation. Journal of Chromatography, A 848, 417-433 (1999). Rickard, E. C., Strohl, M. M. & Nielsen, R. G. Correlation of electrophoretic mobilities from capillary electrophoresis with physicochemical properties of proteins and peptides. Analytical Biochemistry 197, 197-207 (1991). Jalali-Heravi, M., Shen, Y., Hassanisadi, M. & Khaledi, M. G. Artificial neural network modeling of peptide mobility and peptide mapping in capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography, A 1096, 58-68 (2005). Li, Q. et al. Development of a quantitative structure-property relationship model for predicting the electrophoretic mobilities. Computers & Chemistry (Oxford, United Kingdom) 26, 245-251 (2002). Yu, K. & Cheng, Y. Machine learning techniques for the prediction of the peptide mobility in capillary zone electrophoresis. Talanta 71, 676-682 (2007). Tanford, C. Physical Chemistry of Macromolecules. (1961). Kim, J., Zand, R. & Lubman, D. M. Electrophoretic mobility for peptides with posttranslational modifications in capillary electrophoresis. Electrophoresis 24, 782-793 (2003). Solinova, V., Kasicka, V., Koval, D. & Hlavacek, J. Separation and investigation of structure-mobility relationships of insect oostatic peptides by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis 25, 2299-2308 (2004). Nyberg, F., Zhu, M. D., Liao, J. L. & Hjerten, S. in Proceedings of Electrophoresis 88 (ed Claus Schafer-Nielsen) 141–150 (VCH Publishers, 1988). Issaq, H. J., Janini, G. M., Atamna, I. Z., Muschik, G. M. & Lukszo, J. Capillary electrophoresis separation of small peptides: effect of pH buffer additives, and temperature. Journal of Liquid Chromatography 15, 1129-1142 (1992). Hilser, V. J., Jr., Worosila, G. D. & Rudnick, S. E. Protein and peptide mobility in capillary zone electrophoresis. A comparison of existing models and further analysis. Journal of Chromatography 630, 329-336 (1992). Sanz-Nebot, V., Toro, I., Benavente, F. & Barbosa, J. pKa values of peptides in aqueous and aqueous-organic media. Prediction of chromatographic and electrophoretic behaviour. Journal of Chromatography, A 942, 145-156 (2002). Chen, N., Wang, L. & Zhang, Y. K. Correlation free-solution capillary electrophoresis migration times of small peptides with physicochemical properties. Chromatographia 37, 429-432 (1993). Gaus, H. J., Beck-Sickinger, A. G. & Bayer, E. Optimization of capillary electrophoresis of mixtures of basic peptides and comparison with HPLC. Analytical Chemistry 65, 1399-1405 (1993).
108 Irodalomjegyzék 130
131
132
133
134
135 136
137
138
139 140
141
142 143 144 145 146
147
Survay, M. A., Goodall, D. M., Wren, S. A. C. & Rowe, R. C. Oligoglycines and oligoalanines as tests for modeling mobility of peptides in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography 636, 81-86 (1993). Basak, S. K. & Ladisch, M. R. Correlation of electrophoretic mobilities of proteins and peptides with their physicochemical properties. Analytical Biochemistry 226, 5158 (1995). Cross, R. F. & Cao, J. Salt effects in capillary zone electrophoresis. I. Dependence of electrophoretic mobilities upon the hydrodynamic radius. Journal of Chromatography, A 786, 171-180 (1997). Adamson, N. J. & Reynolds, E. C. High performance capillary electrophoresis of casein phosphopeptides containing 2-5 phosphoseryl residues: relationship between absolute electrophoretic mobility and peptide charge and size. Electrophoresis 16, 525-528 (1995). Castagnola, M. et al. Capillary zone electrophoresis of peptides: prediction of the electrophoretic mobility and resolution. Journal of chromatography, B: Biomedical applications 656, 87-97 (1994). Castagnola, M. et al. Predictive model for capillary electrophoretic peptide mobility in 2,2,2-trifluoroethanol-water solution. Electrophoresis 19, 1728-1732 (1998). Metral, C. J., Janini, G. M., Muschik, G. M. & Issaq, H. J. A computer method for predicting the electrophoretic mobility of peptides. Journal of High Resolution Chromatography 22, 373-378 (1999). Sanz-Nebot, V., Benavente, F. & Barbosa, J. Liquid chromatography-mass spectrometry and capillary electrophoresis combined approach for separation and characterization of multicomponent peptide mixtures. Application to crude products of leuprolide synthesis. Journal of Chromatography, A 950, 99-111 (2002). Cross, R. F. & Garnham, N. F. The problem with the offord equation: hydration - a statistical investigation of the effect of charge size and confirmation of the effect of charge distribution upon electrophoretic mobilities. Chromatographia 54, 639-646 (2001). Skoog, B. & Wichman, A. Calculation of the isoelectric points of polypeptides from the amino acid composition. Trends in Analytical Chemistry 5, 82-83 (1986). Piaggio, M. V., Peirotti, M. B. & Deiber, J. A. Exploring the evaluation of net charge, hydrodynamic size and shape of peptides through experimental electrophoretic mobilities obtained from CZE. Electrophoresis 27, 4631-4647 (2006). Mittermayr, S., Olajos, M., Chován, T., Bonn, G. K. & Guttman, A. Mobility modeling of peptides in capillary electrophoresis. Trends in Analytical Chemistry 27, 407-417 (2008). Comprehensive Descriptors for Structural and Statistical Analysis v.2.0 (Gainesville, 1994). Fausett, L. V. Fundamentals of neural networks: architectures, algorithms, and applications. (Prentice-Hall, Inc., 1994). Mitchell, T. M. Machine Learning. (McGraw-Hill, 1997). Kasicka, V. Recent developments in capillary electrophoresis and capillary electrochromatography of peptides. Electrophoresis 27, 142-175 (2006). Cifuentes, A. & Poppe, H. Effect of pH and ionic strength of running buffer on peptide behavior in capillary electrophoresis: theoretical calculation and experimental evaluation. Electrophoresis 16, 516-524 (1995). Jaros, M., Hruska, V., Stedry, M., Zuskova, I. & Gas, B. Eigenmobilities in background electrolytes for capillary zone electrophoresis: IV. Computer program PeakMaster. (2004).
109 Irodalomjegyzék 148 149
150
151 152 153
154
155 156 157 158
159
160 161 162
163 164 165
166 167 168
Hruska, V., Jaros, M. & Gas, B. Simul 5 - free dynamic simulator of electrophoresis. Electrophoresis 27, 984-991 (2006). Monzo, A., Bonn, G. K. & Guttman, A. Boronic acid-lectin affinity chromatography. 1. Simultaneous glycoprotein binding with selective or combined elution. Analytical and Bioanalytical Chemistry 389, 2097-2102 (2007). Horváth, K., Olajos, M., Felinger, A. & Hajós, P. Retention controlling and peak shape simulation in anion chro matography using multiple equilibrium model and stochastic theory. Journal of Chromatography A 1189, 42-51 (2008). Felinger, A. Data Analysis and Signal Processing. Vol. 21 (Elsevier, 1998). Po, H. N. & Senozan, N. M. The Henderson-Hasselbalch Equation: Its History and Limitations. Journal of Chemical Education 78, 1499 (2001). Hajós, P., Horváth, O. & Denke, V. Prediction of Retention for Halide Anions and Oxoanions in Suppressed Ion Chromatography Using Multiple Species Eluent. Analytical Chemistry 67, 434-441 (1995). Mittermayr, S. Peptide Mobility Modelling in Capillary Zone Electrophoresis MSc Biomedical Informatics thesis, University for Health Sciences, Medical Informatics and Technology, (2008). Demuth, H., Beale, M. & Hagan, M. MATLAB Neural Network Toolbox™ 6 User’s Guide. (2008). Landers, J. P. & Editor. Handbook of Capillary and Microchip Electrophoresis and Associated Microtechniques. (CRC, 2008). Guttman, A. Multisructure sequencing of N-linked fetuin glycans by capillary gel electrophoresis and enzyme matrix digestion. Electrophoresis 18, 1136-1141 (1997). Zhuang, Z., Starkey, J. A., Mechref, Y., Novotny, M. V. & Jacobson, S. C. Electrophoretic Analysis of N-Glycans on Microfluidic Devices. Analytical Chemistry 79, 7170-7175 (2007). Yamashita, K., Kamerling, J. P. & Kobata, A. Structural study of the carbohydrate moiety of hen ovomucoid. Occurrence of a series of pentaantennary complex-type asparagine-linked sugar chains. Journal of Biological Chemistry 257, 12809-12814 (1982). Wright, A. T. et al. Differential Receptors Create Patterns That Distinguish Various Proteins. Angewandte Chemie Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005). Li, X., Hupp, A. M. & McGuffin, V. L. in Advances in Chromatography Vol. 45 eds Eli Grushka & Nelu Grinberg) 1-88 (Taylor & Francis Group, 2006). Olajos, M. et al. Boronic acid lectin affinity chromatography (BLAC). 2. Affinity micropartitioning-mediated comparative glycosylation profiling. Analytical and Bioanalytical Chemistry 392, 195-201 (2008). Kuhn, R. & Hoffstetter-Kuhn, S. Capillary Electrophoresis: Principles and Practice. (Springer-Verlag, 1993). Lottenspeich, F. & Engels, J. W. Bioanalytik. 2 edn, (Elsevier, 2006). Idei, M. et al. Comparison of high-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis in the analysis of somatostatin analogue peptides. Journal of Chromatography A 648, 251-256 (1993). Messana, I. et al. Peptide analysis by capillary (zone) electrophoresis. Journal of Chromatography, B: Biomedical Sciences and Applications 699, 149-171 (1997). Hasselbalch, K. A. The hydrogen number and oxygen-combining power of the blood. Biochemische Zeitschrift 82, 282-288 (1917). Henderson, L. J. Concerning the Relationship between the Strength of Acids and their Capacity to Preserve Neutrality. American Journal of Physiology 21, 173-179 (1908).
Tézispontok Az elmúlt évek során a kapilláris elektroforézis területén elért eredményeim az alábbiak szerint foglalhatók össze. 1. Komplex szénhidrátok nagyhatékonyságú analitikai vizsgálata. a. Analitikai minta-előkészítési módszert dolgoztam ki glikoproteinekből enzimatikusan (peptid-N-glikozidáz F enzimmel) felszabadított komplex szénhidrátok nagy áteresztőképességű multi-kapilláris gél elektroforézises vizsgálatára érzékeny LED-indukált fluoreszcenciás detektálással. b. A módszer érzékenységének növelésére kidolgoztam a reagálatlan jelölőanyag nagy
feleslegének
eltávolítására
egy
automatizálható
normál
fázisú
kromatográfiás mikropreparatív eljárást, melyet különböző méretkizárásos kromatográfiás módszerekkel összehasonlítva értékeltem. c. A módszert ismert glikozilációjú fehérjék (ribonukleáz B, alfa-1-savanyúglikoprotein, fetuin, immunglobulin G) vizsgálatával értékeltem. A nagy áteresztőképességű multi-kapilláris gél elektroforézis 12 minta gyors (5-10 perc analízisidő) párhuzamos analízisére (10 cm hosszúságú kapillárisokkal) nyújtott lehetőséget, vagy 4 párhuzamos elválasztásra 30 cm hosszú kapillárisokkal (15 perc analízisidővel) a felbontás további növelése mellett, kiváló érzékenységű detektálást (alacsony kimutatási határ) biztosítva. 2. Exoglikozidáz enzimemésztésen alapuló szénhidrát szerkezetvizsgálat illékony pufferrendszerrel. a. A komplex szénhidrátok szerkezetvizsgálatához az exoglikozidáz enzimekkel végzett emésztés módszerét dolgoztam ki a reakcióelegyben illékony pufferösszetevők
alkalmazásával,
mely
a
termékek
érzékeny
analízisét
elektrokinetikus injektálással is biztosítja. b. A módszert az erősen szialilált glikán szerkezeteket (3 és 4 sziálsavval – Nacetil-neuramin sav – rendelkező triantennáris komplex oligoszacharidokat) tartalmazó fetuin modell glikoprotein sziálsavas csoportjainak neuraminidáz emésztéses felszabadításával sikeresen validáltam. A reakció-puffer ionos összetevőinek zavaró hatását (ionszupresszió az elektrokinetikus injektálás során) a minták analízisét megelőző centrifugális vákuumbepárlással szüntettem meg.
i
3. Komplex biológiai minták szabad szénhidrát tartalmának eltávolítása a mátrixhatások kiküszöbölésére. a. A komplex biológiai minták (pl. vérkészítmények) glikoprotein tartamának glikozilációinak analitikai vizsgálatát zavaró szabad redukáló szénhidrát tartalom (pl. vércukor) hatását sikerült megfelelő minta-előkészítéssel kiküszöbölnöm. b. Igazoltam, hogy 3 és 10 kDa pórusméretű ultraszűrő eszközökkel a (glikoprotein)
makromolekulák
kiváló
hatásfokkal
visszanyerhetőek
a
vércukor hatékony eltávolítása mellett, különbséget a kisebb pórusméretű szűrőkkel fellépő nagyobb nyomásesés miatt a szűrési idő (centrifugális szűrés időtartama) növekedésében tapasztaltam. 4. Boronsav - lektin affinitás kromatográfiás glikoprotein izolálás és dúsítás a. Megoldottam a glikoproteinek szelektív izolálására és dúsítására az maminofenil-boronsav és különböző lektinek keverékével végzett boronsav lektin affinitás kromatográfia (BLAC) miniatürizálását és automatizálását. b. Elvégeztem a BLAC mikropreparatív glikoaffinitás kromatográfia (búzacsíra agglutinin tartalmú BLAC/WGA állófázissal) hőmérsékleti optimalizálását automatizált programozható hőmérsékletű kialakítással. c. Vizsgálataim rávilágítottak a boronsav tartalmú állófázisok és a (magas izoelektromos ponttal rendelkező) bázisos fehérjék (a tripszin inhibitor szennyezéseként jelen lévő lizozim) között, a glikoaffinitás kromatográfia során alkalmazott 8,7-es pH-n fellépő ioncserés retenciós mechanizmusra. 5. Komparatív humán szérum glikozilációs profil vizsgálat BLAC glikoaffinitás kromatográfiás glikoprotein dúsítással. a. A komplex biológiai minták glikozilációjának vizsgálatára kidolgozott módszert sikerrel kombináltam az optimalizált BLAC glikoprotein dúsítással és alkalmaztam humán szérum glikozilációs profiljának vizsgálatára. b. A BLAC/ConA (m-aminofenil-boronsav és konkanavalin A tartalmú állófázissal) technikával a humán szérum mintából kimutatható glikán csúcsok számát és intenzitását egyaránt hatékonyan sikerült növelnem. c. Igazoltam a módszer alkalmasságát glikozilációs különbségek kimutatására kevert normál és prosztata karcinómás humán szérum mintákból. 6. Kapilláris zóna elektroforézises peptid elválasztások modellezése.
ii
a. Peptidek
kapilláris
elektroforetikus
mobilitásának
modellezésére
nagyhatékonyságú analitikai elválasztások tervezéséhez újszerű, paraméter vezérelt megközelítés alapján átfogó kísérleti adatbázist hoztam létre, nagyszámú elválasztási paraméter (az elválasztás hőmérséklete, a háttér elektrolit koncentrációja, szerves adalék – metanol és acetonitril – tartalma, alkalmazott feszültség, reprezentatív tripeptid minták tömege és töltése) kombináció mellett, a kísérleti elválasztások számának optimálásával. A kísérleti eredményeket statisztikailag értékeltem. b. A kétváltozós szemi-empirikus Offord-modellt és mesterséges neurális hálózati modelleket (egy momentum és adaptív tanulási arányú és egy LevenbergMarquardt
tanulási
algoritmust
használó)
alkalmaztam
a
kísérleti
adathalmazra. A modellek prediktív teljesítményét értékeltem a modellel számított és kísérletileg meghatározott peptid elektroforetikus mobilitás értékek korrelációja alapján. c. Az eredmények alapján megállapítottam, hogy mindössze két változóval (a minta molekulatömege és töltése) az elektroforetikus mobilitás nem határozható meg kellő pontossággal (az olyan elválasztás befolyásoló tényezőket, mint a hőmérséklet, a háttér elektrolit koncentrációja vagy szerves oldószer tartalma, a modell nem képes kezelni). Ugyanakkor a mesterséges neurális hálózati modellek minden fontos paramétert képesek inputként kezelni kiváló predikciós hatékonysággal (r2=0,9972). A mesterséges neurális hálózati modell
lineáris
modellezési
technikákkal
szemben
mutatott
kiváló
teljesítménye alapján az elválasztás paraméterei és a peptidek elektroforetikus mobilitása között fennálló összefüggés nem-lineáris természetét (különösen az olyan komplex hatások, mint a hőmérséklet és szerves oldószertartalom együttes hatásai) is igazoltam.
iii
Theses The main results of dissertation are summarized in the following thesis points. 1. High performance analysis of complex carbohydrates. a. Sample preparation methodology was developed for high throughput multicapillary gel electrophoretic analysis of complex carbohydrates enzimatically released (by peptide-N-glycosidase F digestion) from glycoprotein with sensitive LED-induced fluorescence detection. b. The sensitivity of the method was further increased by efficient removal of the unreacted high molar excess of the labelling agent after the derivatization reaction by automated micropreparative normal phased chromatography. The post-derivatization clean up technique was validated with different size exclusion chromatographic methods. c. The analytical method was evaluated with glycoprotein standards of known glycosylation
(ribonuclease
B,
α-1-acidic
glycoprotein,
fetuin
and
immunoglobulin G). Sensitive (low limit of detection) , rapid (5-10 min), high throughput analysis of 12 samples was carried out with multi-capillary gel electrophoresis in 10 cm capillaries, or alternatively parallel analysis of four samples in 30 cm capillaries with higher resolution in 15 min. 2. Exoglcosidase digestion based structural analysis of carbohydrates with volatile buffer system. a. Structural analysis of complex carbohydrates by enzymatic digestion with exoglycosidases in reaction buffer consists of volatile buffer components is presented, supporting the sensitive analysis of the resulting carbohydrates with electrokinetic injection. b. The method was successfully validated enzymatic (neuraminidase) release of the sialic acid (N-acetyl-neuraminic acid) content from the highly sialylated glycane
structures
(tri-
and
terasialylated
triantennary
complex
oligosaccharides) of fetuin. The biasing effects of the ionic buffer components (ion suppression during electrokinetic injection) were eliminated by centrifugal vacuum evaporation of the solvent and the volatile buffer components prior to analysis.
iv
3. Removal of the free carbohydrate content of complex biological samples to cope with matrix effects. a. Sample preparation method was developed for the elimination of the biasing effects of the carbohydrate content of biological samples. b. The results showed that ultrafiltration with either 3 kDa or 10 kDa cut-off values provided significantly higher performance that of reversed phase bead filled pipette tips. The only major difference between the two ultrafiltration methods was the required centrifugation time, which was significantly longer for the 3 kDa membranes. 4. Glycoprotein isolation and enrichment by
boronic acid - lectin affinity
chromatography a. For the selective isolation and enrichment of glycoprotein the miniaturization and automation of the affinity chromatographic technique, using a novel combination of m-aminophenyl boronic acid and different lectins in the stationary phase referred as boronic acid - lectin affinity chromatography (BLAC), was carried out in an automated high-throuhput manner. b. Optimization of the glycoaffinity chromatographic method involved the study of the effects of the temperature using wheat germ agglutinin containing stationary phases (BLAC/WGA) and automated liquid handling robot with integrated 96-well plate temperature controller. c. I have also found during the temperature study that large amount of lysozyme (contamination of the commercial trypsin inhibitor) was present in the elution fractions of the m-aminophenyl boronic acid containing micropartitioning columns due to ion-exchange mechanism occurring between the positively charged protein (pI: 11) and the negatively charged stationary phase (calculated pK values 8.52 and 9.12) at the operation pH (8.7). As the ionexchange capacity of the boronic acid containing stationary phases was apparently much higher than its glycoaffinity capacity, the amount of bound lysozyme was significantly higher. Application of ion-pair-forming reagents is suggested to eliminate this effect. 5. Comparative human serum glycosylation profiling with BLAC glycoprotein enrichment.
v
a. The sample preparation method for glyosylation analysis of complex biological samples was successfully combined with the optimized BLAC glycoprotein enrichment and applied for human serum glycosylation profiling. b. Both the number and intensity of the detectable glycane peaks were significantly improved with BLAC/ConA (m-aminophenyl boronic acid and concanavalin A containing stationary phase) glycoaffinity enrichment. c. The applicability of the developed analytical method for comparative glycosylation studies was proved by differentiation of glycosylation profiles of pooled sera from prostate cancer patients and healthy individuals. 6. Modelling of peptide separations by capillary zone electrophoresis. a. Novel parameter driven approach was developed for modelling of capillary zone electrophoretic mobility of peptides to optimize high performance analytical separations. Extensive experimental database was obtained with the systematic adjustment of a wide range of separation parameters (temperature, background electrolyte concentration and organic solvent – methanol and acetonitrile – content, applied voltage, mass and charge of the representative tripeptide samples) with optimized number of experimental runs. The experimental results were statistically evaluated. b. Two variable semi-empirical (TVSE) and artificial neural network (ANN) approaches were utilised to predict the electrophoretic mobilities of model peptides. Two different ANN training algorithms were applied, namely a gradient descent ANN using momentum as well as adaptive learning rate and an ANN with Levenberg-Marquardt training algorithm. The performance of the models was compared based on the experimental data. c. The equation of the linear TVSE model only considered sample charge and size. Thus the TVSE model could not incorporate buffer composition changes, different running temperatures or possible nonlinear characteristics of the studied relationship and thus did not give accurate modelling performance In contrast, the ANN models were capable of incorporating varying running temperatures and (possible nonlinear) influences of the organic solvent additives and hence provided reasonably good predictive power (r2=0.9972). The presented results demonstrated the superiority to the TVSE models and thereby strongly advocate the usage of ANN approaches for comparable modelling tasks. vi
vii
A szerző tudományos munkássága Publikációk 1. Krisztián Horváth, Marcell Olajos, Attila Felinger, Péter Hajós: Retention controlling and peak shape simulation in anion chromatography using multiple equilibrium model and stochastic theory, Journal of Chromatography A, 2008, 1189, 42-51 IF: 3,756 2. Marcell Olajos, Péter Hajós, Günther K. Bonn, András Guttman: Sample preparation for the analysis of complex carbohydrates by multicapillary gel electrophoresis with light-emitting diode induced fluorescence detection, Analytical Chemistry, 2008, 80, 4241-4246
IF: 5,287
3. Stefan Mittermayr, Marcell Olajos, Tibor Chován, Günther K. Bonn, András Guttman: Mobility modeling of peptides in capillary electrophoresis (Review), Trends in Analytical Chemistry, 2008, 27 (5), 407-417
IF: 5,485
4. Marcell Olajos, Alex Monzo, Lorenzo de Benedictis, Zuly Rivera, Günther K. Bonn, András Guttman: Boronic acid lectin affinity chromatography (BLAC) 2. Affinity micropartitioning-mediated comparative glycosylation profiling, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2008, 392, 195-201
IF: 3,328
5. Marcell Olajos, Tibor Chován, Stefan Mittermayr, Tamás Kenesei, Péter Hajós, Imre Molnár, Ferenc Darvas, András Guttman: Artificial neural network modeling of pH dependent structural descriptor-mobility relationship for capillary zone electrophoresis of tripeptides, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 2008, 31 (15), 2348-2362
IF: 1,272
6. Marcell Olajos, Ákos Szekrényes, Péter Hajós, Doug T. Gjerde, András Guttman: Boronic acid lectin affinity chromatography (BLAC) 3: Temperature dependence of glycoprotein isolation and enrichment, Analytical and Bioanalytical Chemistry, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010, 397(6), 2401-2407
viii
IF: 3,480
Konferencia előadások Szóbeli előadások
1. M. Olajos, S. Mittermayr, A. Guttman: Model based approaches for the prediction of peptide mobilities in capillary zone electrophoresis; 5th International Symposium on Computer Applications and Chemometrics in Analytical Chemistry (SCAC2010), 2125 June 2010, Budapest, Hungary 2. M. Olajos, S. Mittermayr, A. Guttman: Modell alapú megközelítések a peptidek kapilláris zóna elektroforézises elválasztásainak előrejelzésére; Műszaki Kémiai Napok 2010, 27-29 April 2010, Veszprém, Hungary 3. A. Guttman, M. Olajos, Á. Szekrényes, D. Gjerde: Glycosylation pattern analysis by glycoaffinity partitioning and multicapillary gel electrophoresis; MSB2009 24th International Symposium on MicroScale Bioseparations, 18-22 October 2009, Dalian, China
4. M. Olajos, S. Mittermayr, P. Hajós, A. Guttman: New Endeavors in Glycoproteome Analysis: High Throughput N-glycan Profiling by Capillary Gel Electrophoresis; 8th Balaton Symposium, 2009 September 2-4, Siófok, Hungary 5. S. Mittermayr, M. Olajos, T. Chován, A. Guttman: Application of Model-based Approaches to Predict Peptide Mobilities in CZE; 8th Balaton Symposium, 2-4 September 2009, Siófok, Hungary 6. M. Olajos, P. Hajós, G. K. Bonn, A. Guttman: Glikoprotein szacharidok molekuláris szerkezetének meghatározása multikapilláris elektroforézissel, LED indukált fluoreszcens detektálással; Műszaki Kémiai Napok 2009, 21-24 April 2009, Veszprém, Hungary 7. M. Olajos, A. Monzo, P. Hajós, A. Guttman: Temperature effects in boronic acid lectin affinity chromatography (BLAC); MSB2009 23rd International Symposium on MicroScale Bioseparations, 1-5 February 2009, Boston, USA 8. A. Guttman and M. Olajos: Sample preparation issues in complex carbohydrate analysis by capillary gel electrophoresis; CECE 2008 5th International Meeting on Bioanalysis, 24-25 November 2008, Brno, Czech Republic (Book of Abstracts page 19, ISBN 978-80-254-3194-8) 9. M. Olajos, P. Hajós, G. K. Bonn, A. Guttman: Glikoprotein szaccharidok analízise complex biológiai mintákból multikapilláris gél elektroforézissel; METT Vándorgyűlés 2008., 5-7 November 2008, Sárvár, Hungary 10. M. Olajos, S. Mittermayr, T. Chován, P. Hajós, A. Guttman: New advances in mobility modelling for capillary zone electrophoresis of peptides; 4th International Symposium on Compter Applications and Chemometrics in Analytical Chemistry (SCAC2008), 1-5 September 2008, Balatonalmádi, Hungary 11. A. Guttman, M. Olajos: Semi-automated sample preparation for capillary gel electrophoresis analysis of complex carbohydrates; 8th Horváth Award Symposium, Innsbruck, Austria, 14-15 April 2008 12. A. Guttman and M. Olajos: Sample preparation for capillary gel electrophoresis profiling of glycoprotein born N-linked oligosaccharides; MSB2008 22nd International Symposium on MicroScale Bioseparations, 9-13 March 2008, Berlin, Germany ix
13. A. Guttman, M. Olajos, H. Glasner, D. T. Gjerde, V. Amirkhanian, M. Liu: High sensitivity profiling and sequencing of complex carbohydrates by multicapillary electrophoresis (oral presentation), CECE2007 4th International Meeting on Bioanalysis, 12-13 November 2007, Brno, Czech Republic 14. A. Guttman, Z. Rivera, M. Olajos, T. Ringer, R. Mayer, G. K. Bonn: Fluorescent Isotope Coded Affinity Tag (FCAT) for Quantitative Proteomics; Dalian2007, 25-28 October 2007, Dalian, China 15. T. Chovan, S. Mittermayr, T. Kenesei, M. Olajos, I. Molnár, F. Darvas and A. Guttman: Artificial Neural Network Modeling of Structure-Mobility Relationships in CZE; 7th Balaton Symposium, 5-7 September 2007, Siófok, Hungary
Poszterek
1. M. Olajos, P. Hajós, A. Guttman: New advances in glycoprotein analysis addressing structural investigation of complex glycans by capillary gel electrophoresis; Euroanalysis2009, 6-10 September 2009, Innsbruck, Austria 2. M. Olajos, K. Horváth, P. Hajós: Prediction of retention and elution profiles for analysis in high performance ion chromatography; Euroanalysis2009, 6-10 September 2009, Innsbruck, Austria
3. M. Olajos, S. Mittermayr, T. Chován, P. Hajós, A. Guttman: Capillary electrophoresis mobility modeling of peptides with particular emphasis on proteomics application; MSB2009 23rd International Symposium on MicroScale Bioseparations, 1-5 February 2009, Boston, USA 4. M. Olajos, A. Monzo, P. Hajós, A. Guttman: Temperature effects in boronic acid lectin affinity chromatography (BLAC); MSB2009 23rd International Symposium on MicroScale Bioseparations, 1-5 February 2009, Boston, USA 5. M. Olajos, Á. Szekrényes, P. Hajós, A. Guttman: Temperature effects in boronic acid – lectin affinity chromatography (BLAC) of proteins; CECE 2008 5th International Meeting on Bioanalysis, 24-25 November 2008, Brno, Czech Republic (Book of Abstracts page 31, 42, ISBN 978-80-254-3194-8) 6. K. Hotrváth, M. Olajos, P. Hajós: Többszörösen protonálható anionok ionkromatográfiás elválasztása; METT Vándorgyűlés 2008, 5-7 November 2008, Sárvár, Hungary 7. A. Monzo, M. Olajos, L. de Benedictis, G. Bonn, A. Guttman, Boronic Acid Lectin Affinity Chromatography (BLAC) In Glycoproteomics; HUPO 2008, #P-TUE-210, 18-20 August 2008, Amsterdam, Netherlands 8. A. Monzo, M. Olajos, L. de Benedictis, P. Hajós, G. K. Bonn, A. Guttman: Determination of disease specific glycosylation patterns in the human serum glycoproteome using boronic acid lectin affinity chromatography (BLAC) and multicapillary gel electrophoresis in different cancer types (poster), HPLC2008, Baltimore, USA, 10-16 May 2008 9. S. Mittermayr, M. Olajos, T. Chován, A. Guttman: Modeling of peptides structural descriptor – mobility relationship dependence on temperature and buffer organic solvent concentration in capillary zone electrophoresis using semi-empirical and artificial neural network approaches; HPLC2008, 10-16 May 2008, Baltimore, USA x
10. M. Olajos, L. de Benedictis, P. Hajós, G. K. Bonn, A. Guttman: Analysis of complex carbohydrates by capillary gel electrophoresis with fluorescence detection; 8th Horváth Award Symposium, 14-15 April 2008, Innsbruck, Austria 11. L. de Benedictis, A. Monzo, M. Olajos, G. K. Bonn, A. Guttman: Comparative glycosylation profiling using boronic acid lectin affinity chromatography (BLAC) and capillary gel electrophoresis; 8th Horváth Award Symposium, 14-15 April 2008, Innsbruck, Austria 12. M. Olajos, A. Monzo, L. de Benedictis, P. Hajós, G. K. Bonn, A. Guttman: Analysis of human serum glycoproteins by boronic acid lectin affinity chromatography (BLAC) and multicapillary electrophoresis; APP 2008 5th International Meeting of the Austrian Proteomics Platform, 20-23 January 2008, Seefeld in Tirol, Austria 13. M Olajos., H. Glasner, L. de-Benedictis., D. Gjerde, V. Amirkhanian, M. Liu, G. Bonn, A. Guttman: Increased sensitivity analysis of complex carbohydrates by multicapillary electrophoresis; HPLC2007 conference, 17-21 June 2007, Ghent, Belgium 14. S. Mittermayr, M. Olajos, T. Kenesei, F. Darvas, I. Molnar, A. Guttman, T. Chovan: Modeling of buffer pH dependent structure-mobility relationship in capillary zone electrophoresis using artificial neural networks (poster), HPLC2007 conference, 17-21 June 2007, Ghent, Belgium 15. K. Horváth, M. Olajos, A. Felinger, P. Hajós, Integrated Description of Chromatographic Process of Anions Using Stochastic Theory and Multiple Species Analyte/Eluent Retention Model; 19th Annual International Ion Chromatography Symposium, 24-27 September 2006, Pittsburgh, USA
Elismerések 1. Meghívott előadó: 5th International Symposium on Computer Applications and Chemometrics in Analytical Chemistry (SCAC2010); 21-25th June 2010 2. Fiatal kutatói díj: 8th Balaton Symposium on High-Performance Separation Methods and 15th International Symposium on Separation Sciences; 2009. szeptember 2-4., Siófok 3. Fiatal kutatói díj: Magyar Elválasztástudományi Társaság Vándorgyűlése 2008, 2008. november 5-7., Sárvár 4. Első helyezés: Veszprémi Egyetem Tudományos Diákköri Konferencia (ITDK) Kémiai Szekció, 2005. November 26. 5. Köztársasági ösztöndíj: Veszprémi Egyetem 2004/2005 tanév
xi
Köszönetnyilvánítás Szeretném köszönetem kifejezni Dr. Hajós Péter egyetemi docensnek, hogy lehetőséget biztosított a Pannon Egyetem Analitikai Kémiai Intézeti Tanszékén PhD tanulmányaim lefolytatására, munkámat mindenben támogatta, és hogy a tanszék munkájába már 2004-ben TDK dolgozatom keretében bekapcsolódhattam. Köszönettel tartozom még Dr. Horváth „Ráksi” Krisztiánnak, Tófalvi Renátának és Varga Erzsébetnek, akik a tanszéken hosszú éveken át segítették munkámat. Külön szeretném kiemelni mentorom Prof. Guttman Andrást, a Horváth Laboratory of Bioseparation Sciences vezetőjét, aki lehetőséget biztosított, hogy kutatómunkát folytathassak az Innsbrucki Egyetem Analitikai- és Radiokémiai Tanszékén, és nem csak szakmailag, de emberileg is maximálisan mellettem állt a legnehezebb időszakban is. Köszönettel tartozom Prof. Günther K. Bonn-nak az Insbrucki Egyetem Analitikai- és Radiokémiai Tanszékének tanszékvezetőjének. Továbbá kötelességem megemlíteni a Horváth Laboratórium fiatal kutatói kollektíváját, akiknek szintén sokat köszönhetek, névszerint Zuly „la Mamasita” Rivera-Monroy, Vukics Viktória, Szilágyi Ági, Szántai Eszter, Heidi Glasner, Stefan „Putenmann” Mittermayr, Szekrényes „Bunyi” Ákos, Alex „Pancho” Monzo, Lorenzo de Benedictis. Meg kell továbbá említenem a madridi Consenjo Superior de Investigaciones Científicas Instituto de Química Orgánica General intézetből Prof. Mercedes de Frutos-t, Prof. José Carlos Díez-Masa-t és Javier „el Guapo” Otero-t. Köszönettel tartozom a Semmelweis Egyetemről Dr. Rónai Zsoltnak és a biológiai minták (vérkészítmények) biztosításával nyújtott segítségért Olajos Ferencnek. Köszönöm Doug T. Gjerde-nek, a PhyNexus Inc. alapítójának, hogy az igényeimnek megfelelően legyártották a kromatográfiás mikrokolonnákat (PhyTip) és rendelkezésemre bocsátották. Továbbá Varoujan Amirkhanian-nak (eGene Inc./Qiagen Inc.), hogy szénhidrát analízisre egyedi multi-kapilláris gél elektroforézis készüléket gyártottak és bocsátottak rendelkezésemre. Köszönöm Dr. Chován Tibornak a Pannon Egyetem Folyamatmérnöki Intézeti Tanszékének tanszékvezetőjének a modellezési munka és a disszertáció lektorálása során nyújtott segítséget. Továbbá köszönöm a támogatást Prof. Felinger Attilának. Szeretném megköszönni Dr. Darvas Ferencnek a ThalesNano ZRt. alapítójának és igazgatótanácsi elnökének az irántam táplált törtetlen bizalmat, támogatást és türelmet. Kötelességem kifejezni hálámat az Innsbrucki Orvosi Egyetemről Prof. Christian Knopnak, Dr. Katja Teklenbergnek és Dr. Hatos „tündérlány” Lillának, akik nélkül nem juthattam volna el idáig. Továbbá köszönöm a nevek fesorolása nélkül a támogatást minden budapesti, veszprémi, innsbrucki, illetve a világ bármely pontján élő barátomnak, akiktől az élet minden területén nagyon sokat kaptam. Végül, de nem utolsó sorban szeretném hálámat kifejezni családomnak, kiemelve szüleimet, akik mind anyagilag mind emberileg egész életem során, néha már erőn felül támogattak, jó példát mutatva ezzel. Az ő támogatásukat egy élet is kevés lenne meghálálni. PhD doktori disszertációmat Prof. Horváth Csaba emlékének ajánlom.
xii
