DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS
Immunkompromittált betegek oropharyngealis candidiasisa
Dr. Hermann Péter Semmelweis Egyetem Fogorvostudományi Kar Fogpótlástani Klinika
2004
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Patológia Tudományok Interdiszciplináris Doktori Iskola
8/4. sz. Ph.D. program: Közegészségügyi és Egészségtudományi Kutatások Programvezeto: Dr. Sótonyi Péter egyetemi tanár, akadémikus Témavezeto: Dr. Sótonyi Péter egyetemi tanár, akadémikus
Összefoglaló
A szerzo vizsgálatait 80 vérképzorendszeri malignus elváltozásban szenvedo, a Szent László Kórház Csontvelo-transzplantációs Osztályán (Budapest) ossejt-átültetésben (SCT) részesült beteg részvételével végezte, 24 hónapos vizsgálati idoszak során. A transzplantációs folyamat során mind a 80 betegtol (4X7=28) mikológiai mintát vett transzportközegbe egy beteget kivéve, aki Candida szepszisben hunyt el az utolsó, a transzplantációt követo 7. napi minta levételét megelozoen. Összesen 2233 mintát gyujtött mikrobiológiai vizsgálatra. Az egyik betegtol származó, összesen három mintában C. inconspicua volt kimutatható, amelyet az ID32C-rendszer eloször Candida norvegensisként azonosított. A genetikai RFLP- mintázatok és RAPD-analízis alapján azonban a fenti klinikai izolátumok C. inconspicuanak bizonyultak. Meghatározta a C. inconspicua izolátumok fluconazolérzékenységét és fo extracelluláris enzimatikus virulencia- faktorként funkcionáló enzimeinek - az aszpartát proteáz és foszfolipáz - aktivitását, és azokat ossejttranszplantált betegekbol származó oropharyngeális C. albicans és C. krusei izolátumok esetében kapott értékekkel hasonlította össze. A C. inconspicua klinikai izolátumok 20%-ban tértek el a referenciatörzstol, de egymással teljesen megegyezo mintázatúak voltak. Ez megerosíti, hogy az izolátumok C. inconspicua specieshez, és ugyanahhoz a törzshöz tartoznak. E-teszt alkalmazásával meghatározta a C. inconspicua izolátumok flukonazolérzékenységét. Ezek a MIC flukonazol értékek egybevágnak korábbi vizsgálatok eredményeivel, amelyek szerint a flukonazol- rezisztencia a C. inconspicua törzsek belso tulajdonsága, és magyarázatul szolgálnak a flukonazol elokezelés sikertelenségére az adott esetben. Szerzo vizsgálta a nátrium-, kálium- és litium-klorid alkálifémsók hatását a C. albicans szaporodására és virulencia- faktoraira (szaporodási képesség, csíratömlo-képzo tulajdonság, sejtfelszíni hidrofóbicitás). Következtetései szerint alkálifémsók magas koncentrációja gátló hatású a Candidasejtek szaporodására, és alkálifémsók jelenlétében történt preinkubálás negatív hatású az általa vizsgált minden virulencia- faktorra (szaporodási képesség, csíratömlo-képzo tulajdonság, adherencia képessége és sejtfelszíni hidrofóbicitás).
2
Az antifungális flukonazol-kezelés sikeresnek bizonyult az SCT kezelési periódusban, hiszen a kolonizáció csökkent, de több figyelmet kell fordítani nem csupán az ilyen betegek szájhigiéniájára, hanem a nyálszekréció helyreállítására is, már az SCT-kezelést megelozoen.
3
Tartalomjegyzék
1. 2.
Bevezetés ..............................................................................................................6 Irodalmi áttekintés ................................................................................................8 2.1. Virulencia faktorok ......................................................................................8 2.1.1. Kolonizáció és infekció .....................................................................8 2.1.2. Extracelluláris virulencia faktorok ..................................................11 2.2. A gazdaszervezet védekezo mechanizmusai .............................................11 2.2.1. Humorális védelem..........................................................................12 2.2.2. Celluláris védelem ...........................................................................13 2.3. A Candida hordozást befolyásoló tényezok ..............................................13 2.3.1. Nem..................................................................................................13 2.3.2. A nyál jellemzoi...............................................................................14 2.3.3. Napszaki változás ............................................................................14 2.3.4. Dohányzás........................................................................................14 2.3.5. Topográfiai elhelyezkedés ...............................................................14 2.3.6. Immunállapot...................................................................................15 2.3.7. Alkálifémek .....................................................................................15 2.3.8. Szájüregi mikroflóra ........................................................................16 2.4. Az oralis candidiasisok klinikai típusai.....................................................17 2.4.1. Pseudomembranosus candidiasis .....................................................17 2.4.2. Erythematosus seu atrophias candidiasis .........................................18 2.4.3. Candida leukoplakia ........................................................................18 2.4.4. Candidiasissal társult fogpótlás okozta stomatitis ...........................19 2.4.5. Cheilitis angularis ............................................................................20 2.4.6. Median rhomboid glossitis ..............................................................20 2.4.7. Chronikus multifocalis oralis candidiasis ........................................20 2.4.8. Szisztémás betegséghez társult oralis candidiasis ...........................21 2.5. A candidiasis kezelése ...............................................................................21 3. Az ossejt-átültetés mikológiai vonatkozásai.......................................................23 3.1. Epidemiológia és patogenezis....................................................................24 3.2. Klinikum ....................................................................................................26 3.3. Diagnosztika ..............................................................................................26 3.4. Flukonazol profilaxis .................................................................................27 4. Célkituzések.........................................................................................................29 5. Anyag és módszer ................................................................................................30 5.1. A gombakolonizáció és a nyugalmi nyálszekréció vizsgálatánál alkalmazott anyag és módszer ....................................................................30 5.1.1. A leggyakrabban alkalmazott kondicionáló kezelések ossejt-transzplantált pácienseknél...................................................32 5.1.2. Oralis paraméterek vizsgálata .........................................................34 5.1.3. A statisztikai analízis ......................................................................34 5.2. A gombaizolátumok fenotípusos és genotípusos taxonó miai és virulencia vizsgálata ...............................................................................35 5.2.1. Törzsek ...........................................................................................35 5.2.2. Riboszomális DNS izolálása gombából..........................................37
4
5.2.3. C. inconspicua izolátumok identifikálása PCR-amplifikált rDNS-szekvenciák RFLP-analízisével. ..........................................37 5.2.4. RAPD-PCR analízis........................................................................38 5.2.5. Virulencia faktorok meghatározása ................................................38 5.2.6. A statisztikai analízis ......................................................................41 5.3. Alkáli fémek hatásának vizsgálata a C. albicans szapororodására és virulencia faktoraira ...............................................................41 5.3.1. Organizmusok ..........................................................................41 5.3.2. Vegyszerek ..............................................................................41 5.3.3. Szaporodási vizsgálatok...........................................................42 5.3.4. Csíratömlo-képzodés és tapadás vizsgálata .............................42 5.3.5. Sejtfelszíni hidrofóbicitás vizsgálata .......................................42 5.3.6. A statisztikai analízis ...............................................................43 6. Eredmények .........................................................................................................43 6.1. A gombakolonizáció és a nyugalmi nyálszekréció vizsgálatánál kapott eredmények ........................................................................43 6.1.1. A fogazat állapota ....................................................................43 6.1.2. Gombakolonizáció ...................................................................43 6.1.3. Nyálszekréciós funkció............................................................46 6.2. A gombaizolátumok fenotípusos és genotípusos taxonómiai és virulencia vizsgálata .........................................................................47 6.2.1. A C. inconspicua fenotípusos és genotípusos azonosítása ....................................................................................47 6.2.2 A C. inconspicua, C. albicans és a C. krusei fo virulencia faktorainak összehasonlítása...................................50 6.3. Alkálifémsók hatása a C. albicans szaporodására és virulencia faktoraira ...................................................................................................53 7. Megbeszélés.........................................................................................................57 8. Az értekezés új megállapításai.............................................................................61 Rövidítések jegyzéke ...........................................................................................62 Az értekezés alapját képezo közlemények és eloadások .....................................63 Irodalomjegyzék ..................................................................................................67
5
1. Bevezetés A humán patogén illetve potenciálisan patogén gombák nagy gyakorlati jelentoséggel bírnak (pl. élelmiszeripar, sütoipar stb.), de kiemelkedo az egészségügyi vonatkozásuk is. Megtalálhatók a hüvelyben, a gastrointestinalis tractusban a szájüregtol az anusig a normál flóra tagjaként megbetegedést nem okozva. Olyan fajok is elofordulnak közöttük, amelyek az immunrendszer gyengülésével súlyos infekciók kiváltói
lehetnek,
így
potenciális
kórokozó
(opportunista
patogén)
mikroorganizmusokként jelentkezhetnek (pl. Candida albicans). A C. albicans a populáció jelentos részében kimutatható, mint a normál mikroflóra tagja. Bizonyos helyi és szisztémás tényezok hatására az egyébként opportunista törzs patogénné válhat a gazdaszervezet inváziójával. Az élesztok lokális megbetegedéseket és szisztémás mycosisokat egyaránt okozhatnak (pl. candida sepsis, candida pneumonia, nephritis) [53, 113]. Közülük kiemelkedo jelentoségu faj a C. albicans, mely az élesztok által okozott belso szervi mycosisok mintegy 85%-áért felelos [74]. Az utóbbi évtizedben a mycosisokra hajlamosító tényezok számának növekedésével párhuzamosan jelentosen megnottek a C. albicans által okozott megbetegedések. Különösen nagy az ilyen jellegu fertozések kockázata a súlyos immunhiányos állapottal járó betegségben szenvedoknél (pl. HIV fertozöttek), a tartós széles spektrumú antibiotikum terápiában részesüloknél, transzplantált betegeknél, illetve a rosszindulatú megbetegedés kezelésekor alkalmazott kemoterápiás kezelés során. A HIV fertozöttek esetében a vírus által legyengített immunrendszeru szerveze tben nagy gyakorisággal fordul elo C. albicans okozta fertozés [73, 126]. A szervátültetések sikere érdekében a donor és recipiens hisztokompatibilitásának tipizálása
mellett
mesterségesen
csökkentik
az
átültetett
szerveket
károsító
immunfolyamatok erosségét, így csökken a szervezet ellenállóképessége. Ezzel az átültetett életfontosságú szerv kilökodésének esélye lecsökken, ugyanakkor a gombafertozés veszélye jelentosen megno [48, 174]. A daganatos megbetegedésekkor a tumorsejtek osztódási képessége végtelen, korlátlanná válik. A malignus, rosszindulatú daganatos sejtek kivonják magukat a szervezet ellenorzése alól, áttéteket képeznek. A rákos megbetegedések kezelésére
6
alkalmazott gyógyszerek a sejtproliferációt gátolják, éppen ezért toxikusak mind a tumorsejtekre, mind az osztódó, egészséges sejtekre nézve. Ezen vegyületek tehát tumoros sejtekre kifejtett hatásuk mellett az immunrendszer sejtjeit is károsíthatják, ezáltal a beteg fogékonyabbá válhat a különbözo jellegu mikrobiális fertozésekre. A citotoxikus szerek szelektivitása abban nyilvánul meg, hogy malignus tumorokban a daganatsejtek nagyobb hányada osztódik, mint az egészséges szövetekben. Ismeretes, hogy számos citosztatikum antibakteriális aktivitással bír [12], így a terápia során a normál flóra összetételében szelektív változások történhetnek. A baktériumok számának csökkenésével az élesztok (pl. Candida fajok) aránya megno, ezáltal az egyébként legyengült immunrendszeru szervezetben jelentosen no a gombafertozés esélye. Fontos tehát, hogy a citosztatikumok és a mikróbák lehetséges kölcsönhatásait ismerjük [60, 97]. Az immunszupprimált betegek esetében tapasztalt szeptikémiák az esetek 25-50%-ában orális eredetunek minosülnek. Az orális eredetu infekciók az esetek csaknem felében gombás megbetegedésnek bizonyulnak [139]. Az oropharyngealis candidiasis fungaemiát eredményezhet, amely igen nagy mortalitású. Szeptikémiás candidiasis majdnem minden esetben a szájüreg kolonizációja után jelentkezik, vagy olyan betegeken, akik megelozoen oropharyngealis candidiasisban szenvedtek.
A
nyálmirigyek
csökkent
muködésének
következtében
a
nyál
védofunkcióinak kiesésével no a gombás szájfertozések veszélye. A xerostomián kívül a szájhigiénia alacsony foka, kiveheto fogpótlás viselése, hosszantartó antibiotikus kezelés, inhalációs és szisztémás szteroid kezelés, vérképzoszervi malignus betegségek, valamint a veleszületett és szerzett (pl.: AIDS) immunhiánnyal járó állapotok hajlamosítanak az orális candidiasis kialakulására [138, 140]. Citosztatikum- terápia során a kezeltek közel 40%-ánál jelentkeznek szájüregi mikrobiális komplikációk [147]. Ahhoz, hogy a gomba sikeresen elszaporodhasson a szájüregben, meg kell tapadnia a nyálkahártya felszínén. Bár több sejtfalösszetevorol feltételezik, hogy szerepük lehet a gomba kitapadásában, az ebben a folyamatban elsodleges szerepet játszó molekulákat még nem azonosították pontosan, ugyanígy a tapadást követo események sem ismertek még teljes egészében [27, 72]. Feltehetoen a hypha kialakulása és bizonyos enzimek szekréciója (pl. aszpartát proteázok) elosegítik a szöveti inváziót [167]. A specifikus sejt-sejt kontaktuson kívül nem specifikus kölcsönhatások is szerepet játszhatnak az
7
orális candidiasis kialakulásában. A C. albicans nem specifikusan kötodhet a különbözo akrilát alapanyagú mutárgyak (fogpótlások) illetve egyéb muanyagok felületéhez [104, 167, 170], mely nagy mértékben megnöveli a gombás fertozések kockázatát.
2. Irodalmi áttekintés 2.1. Virulencia faktorok A Candida genus leggyakrabban eloforduló faja a C. albicans több morfológiai formában képes növekedni (sarjadzó, fonalas). Általában elterjedt az a nézet, hogy a csírázó forma invazív és pathogén, míg az éleszto sejtek nem pathogének. Az irodalmi adatok ebben a vonatkozásban azonban ellentmondóak. A candida fertozött elváltozásokból vett szöveti minták ugyan nem minden esetben tartalmaztak valódi hyphákat. A C. albicans törzsek tenyészetei gyakori változást mutatnak a telepmorfológiában, ha a táplálkozási feltételek nem optimálisak. Testhomérsékleten a sarjadzó alakok a gyakoriak. A sejtek alakja is megváltozhat, s néhány esetben megfigyelheto a kromoszómák transzlokációja ?15, 16, 22?. Mindenesetre a szaporodás mértéke igen jelentos szerepet játszik a patogenitásban. 2.1.1. Kolonizáció és infekció. A Candida gazdaszervezet sejtjeihez való adhéziója feltétlenül szükséges a kolonizációhoz és hozzájárul a gazdaszervezeten belüli perzisztáláshoz. Megtapadás nélkül a cand ida növekedési rátája elégtelen ahhoz, hogy a szájüregben és gastrointestinalis traktuson belüli hordozást fenntartsa. Az adhézió folyamatos fenntartása szintén jelentos tényezo a kolonizációból a fertozésbe való átmenet során. A kolonizáció állapotát az infekció felé billentheti egyes betegekben az adhéziós ligandok és receptorok expressziójának megváltozása [16, 117]. A Candida sejtek a gazdaszervezet számos sejtjéhez kötodnek, beleértve az epithel, endothel sejteket és a phagocytákat. Az eddig ismert adhéziós mechanizmusokat az I. táblázatban foglaltuk össze ?26, 65, 68, 84, 104, 137?.
8
I. táblázat A Candida adhéziójának mechanizmusai Adhéziós mechanizmus
A candida adhezinjei
Receptor /közvetlen és mediátor/
Víztaszító képesség
Felületi fehérjék
Hidrofób felületek
Fehérje- fehérje kötés
Integrin-szeru felszíni Ic3b, c3d poliopeptidek fehérjék (pl. fibronektin) Pl.: ? M? 2, ? ?? 2, ? ? 1, Felületi fehérjék
c3d, extracelluláris matrix fehérjék (pl: fibrinogén, kollagén, laminin, fibronektin, entaktin) Fukóz, vagy N-acetil glükóz-amin maradékok a gazda glikoproteineken Streptococcus poliszacharidok Glikoszlingolipid receptorok
Felületi fehérjék Lektin-szeru kapcsolódás
Felületi fehérjék Fimbriák mannoproteinjei
9
Gazdaszervezet /felszín/
Hámsejtek, fogászati anyagok Hámsejtek, endothel sejtek extracelluláris matrix, vér Hámsejtek, endothel sejtek
Hámsejtek,
Kolonizált hámsejtek. Dentális plakk Epitheliális sejtek
Biofizikailag a nyálkahá rtya markerei és a gombák közti nem specifikus kapcsolat hidrofób-hidrofób interakcióként írható le. Biokémiailag a candidák felszínén levo kötofehérjék megkötik a nyálkahártya felszínén lévo glikoproteideket és ily módon is létrejön a tapadás ?26?. Specifikus adhezin-receptor interakcióról beszélünk, amikor a candida felszínén lévo adhéziós protein a nyálkahártyán lévo receptor proteinhez kapcsolódik. Az adhezineket a szerint nevezzük, hogy melyik fehérjéhez kötodnek, pl. fibronektin kötoprotein, fibrinogén kötoprotein, trombin kötoprotein stb. Annál virulensebbnek tekintheto egy adott Candida törzs, minél több ilyen kötofehérjével rendelkezik. A C.albicans expresszál olyan adhezineket, melyek felismerik az extracelluláris mátrixproteineket, beleértve a laminint, fibronektint, entaktint is [120]. A C.albicans is rendelkezik olyan sejtfelszíni fehérjékkel, melyek hasonlóak az emlosök integrinjéhez, pl. ? M? 2 , ? ?? 2 , ? 5? 1 . Ezek kötodnek az endothelialis receptorokhoz, pl. az ic3b-hez és a fibronektinhez. A lektinszeru adhezinek azok a felszíni fehérjék, melyek a fukozil vagy N-acetil- glukózamin determinánsokhoz, vagy galaktozidokhoz kötodnek az epithel sejteken [79, 82]. Különleges jelentoséggel bírhat a candida adhéziója a nyállal borított felszínekhez, ezért van kitüntetett fontossága a lemezes fogpótlásokhoz való tapadásnak ?22, 39?. A C.albicans sejtfelszínének összetétele változó. A felületi makromolekulák expressziója megváltozhat környezeti tényezok hatására. Ezek a változások lehetové teszik a candida sejtek számára az immunrendszer kikerülését, vagy más sejtekhez való tapadását, így a candidiasis létrejöttét. A felületi fehérjék glikozilációjának megváltozása hidrofób fehérjeszerkezetet eredményezhet, így az adhéziós képességek is megváltozhatnak, fokozódhatnak. A gombák és a gazdasejtek kölcsönhatását külso tényezok, pl. a gyógyszeres kezelés is befolyásolhatják. Antibiotikumok a kompetitív baktérium- flóra kipusztításával
újabb
helyeket
szabadíthatnak
fel
a
candida
kolonizációja számára. Ezzel szemben az antifungális szerek csökkenthetik az adhéziót ?38?. Felszínes sérüléskor, ami lehet, pl. fogpótlás okozta decubitus, a nyálkahártya felszínén különbözo receptor proteinek (fibrinogén, fibronektin, trombin) választódnak ki. Ha ez az irritáció mélyebb rétegekre terjed, akkor kollagén, vitronektin, laminin is exponálódik. Ezekhez szintén a megfelelo kötofehérjéken keresztül kapcsolódik az adhesin fehérje és biofilm jön létre a gombák elszaporodásával. A biofilm
10
(makroszkóposan lepedék) az irritáció hatására a szervezet által kiválasztott szérum proteinekbol,
elsosorban
fibrinbol,
desquamálódott
hámsejtekbol,
elpus ztult
leukocytákból, élo és szaporodó baktérium és candida sejtekbol, az általuk kiválasztott extracelluláris mátrix proteinekbol és pseudohyphákból tevodik össze ?26?. Az élo candida sejtek mélyen beágyazódnak a biofilmbe. Ily módon a candida a szervezet saját markereit a felszínére kötve maszkírozza magát és az esetlegesen egyéb okokból csökkent celluláris immunválaszban résztvevo elemek számára hozzáférhetetlenné válik, illetve a szervezet sajátjaként fogja felismerni ?38?.
A gombáknak a
nyálkahártyák felszínén történo telepképzodése során szintén hidrofób-hidrofób interakció érvényesül, mikoris a gombák egymáshoz kapcsolódnak és ily módon virulenciájuk megno, mert mechanikusan fedik és védik egymást ?39?. 2.1.2. Extracelluláris (excretiós) virulencia faktorok A kiválasztott hidrolitikus enzimek gyakran jelentos szerepet játszanak a mikrobiális eredetu betegségek pathogenezisében. A C.albicans számos enzimet szekretálhat, mint lipáz, foszfolipáz, foszfomonoészteráz, hexózaminidáz, proteinázok ?85?. Ez utóbbiakat tanulmányozták a legtöbbet [49], de nincs még végleges következtetés arról, hogy az extracelluláris proteáz aktivitás mindig együtt jár- e fertozéssel.
2.2. A gazdaszervezet védekezo mechanizmusai Mikrobiális interakciók: A normál szájflóra a baktériumokon kívül különbözo gombatörzseket is tartalmaz, amelyeket a sialoprotein köt meg. Fiziológiás körülmények között egyensúly alakul ki és sem a baktériumok, sem pedig a gombák nem kerülhetnek túlsúlyba. A szájüregben található mikrobák versenyben vannak az epithel sejteken található kötohelyekért. Egyensúlyi állapotban ez megakadályozza a candida tömeges kolonizációt ?133?. Amennyiben obligát pathogén mikroba, pl. Staphylococcus aureus van jelen a szájüregben candidával együtt, szinergista módon az epithel sejteken található kötohelyeket elfoglalja, akár mások leszorítása árán is, ez az egyensúly megbomlásához és pl. cheilitis angularis kialakulásához vezethet ?86, 134?.
11
2.2.1. Humorális védelem 2.2.1.1. A nyálban található nem ellenanyag természetu faktorok 2.2.1.1.1. Vas. A fertozések iránti fogékonyság növekszik, ha a szérum és nyál vas szintje
emelkedik,
mivel
a
vas
nyomelemként
alapveto
fontosságú
a
mikroorganizmusok, így a gombák enzimmuködésében is ?113?. 2.2.1.1.2. Laktoferrin. A mucosa ill. a parotis gyulladásakor a laktoferrin koncentrációja a nyálban megno. Hatását úgy fejti ki, ho gy a vasat megköti, így a nyál vas koncentrációja csökken, ami az antifungális aktivitás növekedését eredményezi. A laktoferrin apolaktoferrin formában hatékonyabb, mert az utóbbinak alacsonyabb a vas szaturációja, ezáltal több vasat képes megkötni. Az egyes Candida speciesek érzékenysége különbözo mind a laktoferrin, mind a lizozim iránt ?90, 109, 153?. 2.2.1.1.3. Lizozim (muramidáz). Mind az extracelluláris, mind a phagocytákban lévo lizozim antifungális hatását több úton fejti ki. A lizozim enzim hidrolizálja a sejtfalat a ß-1-4-glycozid kötések bontásával, majd kapcsolódva a membránhoz megváltoztatja abban a proteinek konformációját, laterális és transzverzális mozgását, mellyel permeabilitás fokozódását idézi elo, amely a Candida sejt károsodásához vezet, másrészt IgA ellenanyagokkal kapcsolódva stimulálja a fagocitózist ?18, 63, 157?. 2.2.1.1.4. Hisztidin gazdag polipeptidek (HRPs). A nyálban található ezen hisztidin gazdag fehérjék antifungális aktivitást fejtenek ki valószínüleg a lizozim membránaktív hatásához hasonlóan ?124?. 2.2.1.1.5. Laktoperoxidáz.
A laktoperoxidáz antimikróbás aktivitása is többféle
mechanizmuson keresztül érvényesül ?154?. Egyrészt a mikróbák fehérjéit halogénezi, másrészt aldehidet képez, valamint oxidálja a tio-amino- lipidek szulfhidril csoportjait . A laktoperoxidáz direkt candida ölo hatása xantin oxidázzal és candida elleni specifikus ellenanyagokkal összekapcsolva szignifikánsan no ?115?. 2.2.1.1.6. A nyálban található glikoproteinek a vércsoport antigénekhez hasonlóak, melyek a nyálkahártya felszínén jelennek meg, a nyál pufferkapacitását fokozzák ?124?.
12
2.2.1.2. A nyálban található immun- faktorok A legfontosabb specifikus immunológiai faktor a nyálban a szekrétoros immunglobulin A (sIgA). Az s-IgA képezi az elso humorális specifikus védelmi vonalat az orális candidasissal szemben, oly módon, hogy a gombasejteket aggregálja és így megakadályozza azok adhézióját a nyálkahártya epitheliumon, emellett opszonizálja is azokat a fagocitózis elosegítésére [ 19, 119].
2.2.2. Celluláris védelem Extraoralisan az immunrendszer számos sejtes és nem sejtes eleme vesz részt a gombafertozések legyozésében. Többek között a neutrofil granulocyták, amelyek képesek egyenként akár 10 élesztogomba-sejtet is bekebelezni és a fagocitózist követoen intracellulárisan elpusztítani, mely folyamatban myeloperoxidáz aktivitásuk játssza a foszerepet ?115?. A humán neutrofil granulocyták fungicid aktivitását fokozza az ? interferon, a tumornekrózis faktor, ezek szinergista hatásúak a neutrofilek effektor funkciójára. A cytokinek közül a granulocyta kolonia stimuláló faktor a csontveloben fokozza ezen sejtek képzodését. A candida sejtek eliminációjában a foszerep a fagocitózisé, mint effektor mechanizmusé, ez a hatás azonban csak T sejtek által termelt cytokinek/lymphokinek stimuláló hatására alakul ki ?83, 118?.
2.3. A Candida hordozást befolyásoló tényezok 2.3.1. A nem Általánosságban megállapítható, hogy egészséges populációban is, noknél valamivel gyakoribb a Candida hordozás, mely az antikoncipiensek kiterjedt alkalmazásával magyarázható. Továbbá gyakoribb a Candida hordozás nyáron, aminek oka a reguláció és a keringés megváltozása. A homérséklet Candida virulenciát befolyásoló szerepe és annak klinikai jelentosége kérdéses. Eddig azt sikerült igazolni, hogy a leukociták pusztító hatásával szemben a candidák alacsonyabb homérsékleten ellenállóbbak ?11?.
13
2.3.2. A nyál jellemzoi A nyálmennyiség csökkenése a nyá l puffer kapacitásának csökkenéséhez vezet. A nyálból kimutathatók olyan fehérjék (lizozim, laktoferrin, hisztidin), amelyek antifungális hatással rendelkeznek, s amennyiben a nyálmennyiség csökken, csökken ezen fehérjék gombaellenes hatása is és ez az orális Candida törzsek elszaporodását eredményezi.?81?. Megfigyelések szerint az alacsonyabb pH értékek mellett nagyobb candida számot mutattak ki. A parotisban éppen megtermelodött nyál proteinjei ellenállóbbak a Candida proteinek proteolítikus aktivitásával szemben, mint a kevert nyálé ?133?.
2.3.3. Napszaki változás Alvás közben, amikor a nyálszekréció csökkent, a candida szaporodás mértéke megnövekszik. A páciensek egy része állandóan viseli lemezes fogpótlását, egy részük viszont csak idoszakosan és éjszakára kiveszi. Fogpótlással történo alváskor is növekszik a candida szaporodás, mivel a fogpótlás anyagának nagyobb a víztaszító képessége, mint a mucosának, s így nagyobb lesz a fogpótláson a candidák megtapadása is. Fogpótlással történo alváskor a gombaszám szignifikánsan nagyobb, mint fogpótlás nélküli alváskor ?21, 30? .
2.3.4. Do hányzás A dohányzás 30-70 % - kal emeli a candida elofordulást, ami egyrészt magyarázható a lokális epithelialis elváltozásokkal, másrészt azzal, hogy a dohányfüstben levo anyagok (policiklikus aromás szénhidrogének) táplálékul, elsosorban szénforrásként szolgálnak a C. albicansnak, de egyéb Candida fajok számára is energiaforrást jelenthetnek. Ily módon segíti elo a dohányzás a candidák szaporodását ?2?.
2.3.5. Topográfiai elhelyezkedés A szájüregben vannak olyan predilekciós helyek, amelyek különös jelentoséggel bírnak a gombák megtelepedésének szempontjából. Ilyen a nyelvgyök és a kemény szájpad területe, ahol a candidák proliferációja jól megfigyelheto. Fogpótlást viseloknél leginkább a fogmu illeszkedési vonalában telepszenek meg a gombák. Továbbá a bucca
14
belso felszíne és a szájzug is olyan területek, ahol a gombák kedvezo feltételeket találnak a megtapadáshoz és elszaporodáshoz ?20, 21, 106?.
2.3.6. Immunállapot "0"-ás vércsoportú egyéneknél ill, azoknál, akik vércsoport antigénjeiket nem választják ki a nyálban, magasabb a Candida hordozás aránya. A Candida hordozást befolyásolják a C.albicans elleni specifikus ellenanyagok (IgA, IgG) mennyisége továbbá a Thelper, és Tsuppressor, lymphocytáknak a csökkent aránya ?86?.
2.3.7. Alkálifémek Serum jelenlétében a C. albicans az éleszto sejtbol kinövo jellegzetes fonalat, csíratömlot képez. Ma is vitatott, hogy van-e közvetlen összefüggés a gomba szaporodási formája és invazivitásának mértéke között. A C. albicans okozhat felszíni fertozéseket borön, körmökön és nyálkahártyákon, gasztroenteritiszt, vaginitiszt és uretritiszt, valamint gyakran okozója nozokomiális fertozéseknek immunológiailag nem kompetens gazdaszervezetekben ?34, 71, 113, 158?. A C. albicans általában megtalálható tengervízben és homokban és ilyen körülmények között fertozést okozhat ?14, 17?. C. albicans kvantitatív meghatározását végezték a Földközi tengerben, és 116 tengervíz- mintából 22-ben kimutatták a gombát ?93?. Vizsgálták a Tel Aviv melletti strandok tengervizét és homokját 1989-1991 között, és a leggyakrabban izolált mikroorganizmus Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa és C. albicans volt ?55?. A C. albicans trópusi vizekben, bizonyos körülmények között, olyan denzitást érhet el, amely egészségügyi veszélyt jelenthet ?162?. Felmerült kóroki szerepe a fogorvoslás szempontjából a caries vonatkozásában is, melyet hazai kutatók is vizsgáltak ?52, 53, 112?. A C. albicans számos jellemzojét javasolták virulenciatulajdonságként. A vizsgálódások során azt kell megnézni, hogy mitol patogén valamilyen kórokozó vagy mitol nem. Keresni kell azokat a jeleket, melyek meglétekor tudjuk, hogy adott kórokozó patogénebb a másiknál. Az ilyen tulajdonságok fokozhatják a C. albicans azon képességét, hogy kolonizáljon, túléljen emberi gazdaszervezetben, és hogy betegséget okozzon. Ezek közé tartozik a fenotípusos variabilitás, a csíratömlo-képzo tulajdonsága, az inert és biológiai felszínekhez történo adherencia, a sejtfelszíni hidrofóbicitás és a szekretált hidrolitikus enzimek termelése
15
?27, 113?.
A tengerek ionösszetételére jellemzo, hogy legnagyobb koncentrációban
alkálifém és alkáli földfém kationokat tartalmaznak. Számos közleményben számoltak be C. albicans jelenlétérol tengervízben ?14, 55?. Ez a gomba nemhogy képes hosszú ideig túlélni az alkálifémek ilyen magas koncentrációját tartalmazó közegben, hanem képes fertozést okozni ?14, 17?.
2.3.8. Szájüregi mikroflóra A szájüregben fiziológiásan körülmények között is számos mikroba található, amelyek mennyiségi és minoségi összetétele biztosítja a szájüreg normá l mikroflórájának egyensúlyát. Ezt az egyensúlyt számos tényezo bonthatja meg. Az egyensúly megbomlása nem feltétlenül jelent Candida fertozést, de elosegíti a gombák megtapadását, elszaporodását és esetleg túlsúlyát a szájüregben. Ilyen tényezo lehet, pl. széles spektrumú antibiotikum terápia kortikoszteroid és antikoncipiens szedése, továbbá a szájöblíto szerek túlzott használata ?91?. Az orális szex is olyan tényezo, amely eloidézheti a normál szájflóra jelentos megváltozását ?91?.
A szájüregi
mikrobaflóra összetételét észrevétlenül változtatja meg a táplálékok széles spektrumú antibiotikum tartalma. Háziállatok húshozamának növelése céljából alkalmazott premixben lévo heterociklikus antibiotikumok egyrészt a protein szintézis fokozásával, másrészt az antibiotikum molekulákat körülvevo nagy vízburkuk révén érik el a gyorsabb súlygyarapodást. Ilyen antibiotikumok pl. a tetraciklinek, aminoglikozidok és makrolidek. Egyes országokban fluorokinolonokat használnak a sertésállomány salmonella mentesítésére ?41?. Ezek húsának rendszeres fogyasztása állandó szelekciós hatást jelent a rezisztens baktérium klónok javára. Candida
hordozást
befolyásoló
tényezoként
említheto
még
a
hospitalizáció.
Megfigyelheto, hogy kórházban ápolt betegek Candida hordozási aránya szignifikánsan magasabb, mint a kontrollcsoportban, bár a magas csíraszám önmagában nem jelenti azt, hogy a betegnek candidiasisa lesz ?95?. Az orális candidiasist elosegíto és befolyásoló faktorokat az II. táblázatban foglaltuk össze.
16
II. táblázat
Oralis candidiasist elosegíto és befolyásoló faktorok
Külso tényezok:
? ? ? ? ? ? ? ?
Lokális krónikus irritáció A táplálék éleszto tartalma Táplálkozási tényezok A táplálék antibiotikum és/vagy hormontartalma Fej-nyak terület sugárterápiája Életkor Hospitalizáció Dohányzás
Fogmu: ? ? ?
Rosszul fekvo fogmu A fogmu helytelen használata Szájhigiénia
Endogén tényezok: ? Orális mikroflóra változása ? Immunológiai és endokrin rendellenességek ? Malignus és krónikus kórképek ? Vérképzo rendszer betegségei, vércsoport ? Orális epithelium displasiája
2.4. Az oralis candidiasisok klinikai típusai Az oralis candidiasisokat klinikailag többféle szempont szerint lehet csoportosítani. Az osztályozás alapját a: a gombás fertozés klinikai képe, b: hisztopathológiai elváltozások és c: az elváltozásokhoz társuló alapbetegség esetleges megléte egyaránt képezi. A Candida
fertozés
klinikai
megjelenése
nagyon
sokféle
lehet.
Az
egyes
betegségcsoportok között lehetnek átfedések is, elkülönítésük és az egyes csoportokba sorolás néha nehézségekbe ütközhet ?134?.
2.4.1. Pseudomembranosus candidiasis Az orális candida fertozések egyik leggyakoribb formája. Klinikai megjelenésüket a nyelv felszínérol és a nyálkahártyáról letörölheto fehérfoltok jellemzik. A letörölt felszín alatt erythemás területet találunk, tuszúrásnyi bevérzésekkel. A candidiasis ezen formája elsosorban csecsemoknél és idos betegekben jelentkezik a leggyakrabban.
17
Csecsemoknél az immunrendszer fejletlensége miatt MÉG nem képes a gombákat eliminálni, az idos, legyengült szervezet védekezo rendszere pedig MÁR nem képes a gombákat elpusztítani. Az immunszupresszióval járó kezelések, amelyeket az alapbetegségek eredményesebb gyógyítása érdekében alkalmazunk, a szervezet természetes védekezoképességét legyengítik. Az ilyen pácienseknél fokozottan kell figyelni a Candida fertozés megjelenésére és gondoskodnunk kell antimycotikus profilaxisról. Human Immundeficiencia Vírus (HIV) fertozés kezdeti stádiumára is jellemzo a pseudomembranosus candidiasis megjelenése. Lehet, hogy ez az elso tünet, ami a figyelmet felhívhatja a HIV fertozöttség meglétére. A pseudomembranosus candidiasis esetén található letörölheto fehér foltok nekrotikus szövetrészekbol és desquamativ parakeratotikus epitheliumból állnak. Ez alatt az epithelium külso felszínén polimorfonukleáris leukocitákat tartalmazó mikroabscessusok és ödéma figyelheto meg. A Candida sejtek és hyphák a stratum spinosum rétegéig hatolnak ?134?.
2.4.2. Erythematosus seu atrophias candidiasis E forma klinikai megjelenése elsosorban a nyelvhát, a palatum és a bucca mucosáján figyelheto meg. A beteg égo, csípo érzésre panaszkodik, mert a nyelvháton depapilláltság alakul ki a Candida fertozés következtében. Prediszponáló tényezoként a korábbi/megelozo kortikoszteroid és tetraciklin terápiát írták le. Erythematosus seu atrophias
candidiasis
kialakulhat
perzisztáló
pseudomembranosus
candidiasis
következtében is és `de novo' is. A palatumon vörös terület figyelheto meg, ami az erezettség fokozódásával, ill. az epitheliumréteg vastagságának a csökkenésével magyarázható ?121, 134?.
2.4.3. Candida leukoplakia seu hyperplasticus candidiasis A Candida leukoplakia a szájnyálkahártyán levo, 5 mm- nél nagyobb átméroju, letörölhetetlen fehér folt. Bánóczy és mtsai igazolták, hogy számos esetben megfigyelheto, hogy a szövettanilag leukoplakiaként diagnosztizált elváltozás nem fehér ?7, 8, 9, 10, 151?. Szövettanilag parakeratózis és az epithel hyperplasiája jellemzi ?122?. A malignizáció a diszplázia fokától függ. Ma sem eldöntött, hogy a candida a leukoplakia etiológiájában játszik-e szerepet, vagy másodlagos fertozésrol van-e szó.
18
Budapest III. kerületének tüdoernyoképszuro állomásán végezett saját vizsgálatainkban vizsgáltuk leukoplakia és az oralis candidiasis együttes elofordulását. A megvizsgált 5034 18-90 év közötti (2903 no és 2131 férfi) III. kerületi lakos vizsgálata során 270 esetben (5.36%) észleltünk oralis candidiasist. A szájüregben leggyakrabban eloforduló praecancerosisok közül leukoplakiát 167 (3.32%) esetben, lichen orist 21 (0.42%) esetben észleltünk. A leukoplakia és a candidiasis együttes elofordulását, egymást erosíto hatását több kutató is igazolta (122). Saját vizsgálatunkban a leukoplakia és a candidiasis együttes elofordulását a leukoplakiával kiemelt csoportban 10 esetben észleltük (5.99%). A leukoplakia és az oralis candidiasis együttes elofordulása esetén megno a leukoplakiás terület felülfertozodésének a veszélye is, ami súlyosbítja az elváltozás megítélését, igazolt ugyanis, hogy a leukoplakiáknak ezen csoportja, az ú.n. non-homogén forma, súlyosabb, malignizációra hajlamosabb elváltozás. Míg az összes leukoplakiaknál 2-6 % a malignus átalakulás, addig a non-homogén formánál ez az arány 9-40%. Ezért is nagy jelentoségu, hogy Candida leukoplakia esetén mindig a candidát kezeljük, és törekedni kell a non-homogén forma, homogén formává történo átalakítására ?23, 24, 29, 116? .
2.4.4. Candidiasissal társult fogpótlás okozta stomatitis Ezen elváltozás foleg felso fogpótlás viselésekor jelentkezik. A mucosán erythema és ödémás terület alakul ki, amely pontosan követi a fogpótlás illeszkedési vonalát. A páciensek máskülönben teljesen egészségesek, anamnézisükben egyéb elváltozás, betegség nem szerepel. A nyál pH-ja a fogpótlás és a mucosa között kisebb, mint egészséges pácienseknél, ami szintén kedvez a candidák elszaporodásának. A fogpótlás okozta stomatitises betegeknél 78-100 %-ban mutattak ki élesztogombát, de ez nem feltétlenül jelenti, hogy a betegnek manifeszt candidiasisa is lesz. A fogpótlást viseloknél tízszer nagyobb a gombacsíraszám, mint a fogpótlást nem viseloknél, továbbá a fogpótlás éjszakai viselése szintén emeli a Candida számot. Newton és mtsai a candidiasissal társult fogpótlás okozta stomatitis 3 klinikai típusát különböztetik meg:
19
I. hyperaemiás II. erythemás III. granularis ?99, 106? A fogpótlás okozta stomatitis nem feltétlenül és csak candidiasissal társul, hanem bakteriális fertozés, mechanikai irritáció és allergiás reakció is szerepet játszhat magának a stomatitisnek a kialakulásában ?30, 121, 148?.
2.4.5. Cheilitis angularis A cheilitis angularis a szájzug egy- vagy kétoldali elváltozása, amely klinikailag gyulladt, berepedezett és erythemás lézió. Súlyosabb esetben ki is fekélyesedhet. Oka lehet B12 vitamin vagy vashiány, de HIV pozitív betegeknél is megfigyelték már elofordulását. A cheilitis angularis kialakulásában nemcsak gomba játszhat szerepet, hanem
az
esetek
többségében
a
pathogén
mikróbák
szinergizmusa
folytán
Staphylococcus aureust is izoláltak. Gyakran társul fogpótlás okozta stomatitishez, okozhatja a fizikai harapási magasság süllyedésébol eredo nyálpangás is, de megjelenhet más kórképek tünetegyüttesének részeként, mint pl. a krónikus multifokális oralis candidiasis ?20, 125?.
2.4.6. Median rhomboid glossitis Az elváltozás a nyelv középvonala mellett, szimmetrikusan elhelyezkedo ellipszis vagy rombusz
alakú
lézió,
amely
hátterében
krónikus
candidiasis
szerepel.
Manifesztációjában foleg a dohányzás és a diabetes mellitus játszik szerepet. Az ízlelobimbók atrófiája jellemzi, a hyphák infiltrálódnak a parakeratotikus epithel felso rétegébe és biofilmet képeznek. Rendszerint vegyes, baktérium és gomba tartalmú flóra izolálható ?121?.
2.4.7. Chronicus multifocalis oralis candidiasis Krónikus candidás fertozés meglétekor a szájüreg több helyén, egyidejuleg jelentkezo léziók kombinációja. A tünetegyüttest egy tetrád jellemzi, amely magába foglalja (l) a leukoplákiát, amely szinte mindig megtalálható e tetrádban, (2) a cheilitis angularis egy vagy két oldali változatát, különösen fogpótlást viselo pácienseknél, (3) a median rhomboid glossitist és a palatum lézióját.
20
Holmstrup és Bessermann megállapítása szerint akkor beszélhetünk Chronicus Multifocalis Oralis Candidiasisról, ha a lézió 1 hónapnál tovább fennáll és az általános anamnézisben prediszponáló tényezot nem találunk. Azon páciensek nem sorolhatók ebbe a tünetegyüttesbe, akik a kórelozmény szerint sugárkezelésben részesültek, ill. antibiotikumot vagy citosztatikumot kaptak ?66?. Pindborg vizsgálatai szerint ?121? leggyakrabban az 50-60 éves, dohányzó férfiak betegsége. Az antifungális terápia sikerének érdekében és a recidívát megelozendo a dohányzás mértékének csökkentése ill. e szokás elhagyása a kívánatos.
2.4.8. Szisztémás betegséghez társult oralis candidiasis Az oralis candidiasis gyakran valamilyen szisztémás betegség manifesztációja. Ez lehet valamilyen immunológiai és/vagy haematológiai kórkép, amely a szervezet védekezo rendszerének természetes vagy mesterséges legyengítése folytán vezet a Candida elszaporodásához. Ezek a systemás betegségek nemcsak a szájüregre lokalizálódnak, hanem a szaruképletek (pl. bor, köröm) és a nyálkahártya felszínek (a szájüreg mellett pl. a hüvely, bélcsatorna) lézióját is jelenthetik ?125?.
2.5. A candidiasis kezelése A gombás fertozések leküzdésére alkalmazott antifungális szerek a III. sz. táblázatban láthatók. Alapveto fontosságú azonban, hogy az esetleges alapbetegséget a gombás fertozéssel együtt gyógyítsuk, mert e nélkül a gombás fertozés újbóli megjelenése elkerülhetetlen. Minden esetben az oralis candidiasis diagnózisában és terápiájában résztvevo fogorvosnak a beteg kezeloorvosával konzultálva kell a közös gyógymódot meghatározni. A Candida fajok eltéro antifungális érzékenysége miatt a kezelés megkezdése elott indokolt mikrobiológiai vizsgálati anyagot venni és elküldeni azt a megfelelo laboratóriumba tenyésztés és antimycoticum érzékenység meghatározás céljából. Eredménytelen empirikus kezelés esetén az addig alkalmazott antifungális szer megfelelore történo vá ltása a tenyésztési és antimycoticus érzékenységi vizsgálat alapján a helyesen vezetett terápia elengedhetetlen része. Csecsemok szájpenésze borax-glycerin oldattal, súlyosabb, makacs esetekben nystatin szuszpenzióval (100.000 egység/ml), végso esetben amp hotericin B oldattal (100
21
mg/ml) kezelheto. Nagyobb gyermekek és felnottek orális candidiázisának acut pszeudomembranosus
formájánál
nystatin
vagy
amphotericin
B
szuszpenzió
alkalmazható (1ml 6 óránként 2-3 héten keresztül), de indikálhatunk miconazole gélt is. Szokásos adagja felnotteknél 10 ml gél (250 mg miconazol) 6 óránként ?134?. Fontos megjegyezni, hogy az antimycoticum alkalmazásának legalább 48 órával meg kell haladnia a tünetek megszüntét. Chronicus atrophias candidiázisnál helyileg alkalmazott antifungális szer, a nystatin, amphotericin B, és az imidazole vezet leginkább eredményre. Fogpótlást viseloknél a betegeket instruálni és motiválni kell a fogpótlás éjszakai gombaellenes szerbe történo áztatására, illetve fel kell hívni a beteg figyelmét, hogy a kezelés befejeztével új fogpótlás készítése javallt. Az új fogpótlás készítése vagy az alaplemez alábélelése azért szükséges, mert a már meggyógyult nyálkahártya visszafertozodik a fogmurol, ha azt nem kezeltük és fertozött maradt. Cheilitis angularis kezelésekor, helyi antifungális oldat indikált, mely tartalmaz szteroidot és antibakteriális agenst is, mivel e fertozésekre a pathogének synergismusa jellemzo ?134?. Oralis ketoconazol (200-400 mg/nap) két hétig tartó adagolása, elsosorban AIDS-es páciensek szájüregi gombás fertozésének gyógyítása során ajánlott. Ezen kezelés legnagyobb hátránya az abszorbció zavara, mely függ a gyomorsav szekréciótól. Szájüregi
gombás
infectiók
súlyosabb
formáinál,
AIDS-es
betegeknél,
immunkompromittált pácienseknél a flukonazol (100-200 mg/nap) két héten át történo adagolása a ketaconazolnál hatékonyabbnak bizonyul. Neutropenias és HIV-pozitiv betegeknél eredményesebb itraconazol alkalmazása (200-400 mg/nap) két héten át. Gyakran okoz a betegeknek nehézséget a kapszula lenyelése, ezekben az esetekben az oldat formájában történo adagolás jelenthet megoldást. ?38, 39, 40, 41, 44, 61, 66, 141? (III. táblázat).
22
III. táblázat
A candidiasis kezelésre használható antifungális szerek csoportosítása
A.
Polyének (Irreverzibilisen kötodik a gomba sejtmembránjának ergoszterol molekuláihoz) 1. Nystatin 2. Amphotericin- B
B.
Azol-származékok (Gátolja az ergoszterol szintézist) 1. Chlotrimazol 2. Miconazol 3. Ketoconazol 4. Flukonazol 5. Itraconazol
C.
DNS-analógok (Gátolja a gombák fehérje szintézisét DNS-szinten) 1. 5-Fluorocitozin
3. Az ossejt-átültetés mikológiai vonatkozásai Az invazív gombafertozések az elmúlt évtizedekben egyre növekvo problémát jelentenek az ossejt-átültetés után. Bár a legnagyobb gondot a szisztémás candidiasis jelenti, egyes ossejt-átültetéssel foglalkozó központból származó adatok az Aspergillus által okozott fertozések növekedését jelzik [164]. Az ossejt-átültetést követo gombafertozések három fo csoportba oszthatók. Az elso csoportot a sarjadzógombák jelentik, amelyekre a valódi gombafonal (hypha) képzés hiánya jellemzo, továbbá eloszeretettel telepednek meg a nyálkahártyák felszínén. Az ossejt-átültetett betegekbol izolált Candida speciesek több mint fele C. albicans, amelyet gyakoriságban a C. tropicalis követ [1, 57]. A C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. lusitaniae és a C. guillermondi által okozott fertozések ritkábban fordulnak elo. Kivételesen egyéb Candida speciesek is izolálhatók (C. rugosa, C. norvegensis, C. inconspicua, C. lambica, C. valida).
23
A második csoportba tartozó penészgombák valódi hyphákat képeznek. A fertozés rendszerint a spóra aerosolok belégzésével terjed. Leggyakrabban az Aspergillus által okozott fertozésekkel találkozunk, de ossejt-átültetés után nem ritka a mucorfélék (pl. Rhizopus, Rhizomucor és Absidia) vagy más fonalasgombák (pl. Fusarium, Bipolaris vagy Pseudoallescheria) által kiváltott infekciók sem. A harmadik csoportba a dimorf gombák (pl. Histoplasma, Coccidioidomyces és Blastomyces) tartoznak, amelyek szaporodásuk során sarjadzó és fonalképzéssel járó alakot is öltenek.
3.1. Epidemiológia és pathogenezis A Candida törzsek a nyálkahártyák normális microflórájának részét képezik. Lokális vagy szisztémás fertozés akkor keletkezik, ha a szervezet immunvédekezése legyengül, és a gastrointestinális rendszer nyálkahártyájának épsége sérül. Egy amerikai vizsgálat szerint [12] a Candida speciesek az Egyesült Államokban a vérbol izolált nosocomiális patogének sorában a negyedik helyet foglalják el. Világszerte egyre gyakrabban izolálnak a Candida albicanson kívül egyéb, nem-albicans Candida specieseket is. A Candida fertozések elterjedését segíti elo az intenzív osztályos (így a transzplantációs osztályokon történo) kezelés, a parenterális táplálás, az intravascularis eszközök alkalmazása. Növeli a candidiasis incidenciáját a széles spektrumú, kombinált antibiotikus kezelés (különösen a neutropeniás szakasz ideje alatt), és a T sejtek muködését csökkento immunszuppresszív terápia (citosztatikumok, szteroidok [87, 131]. A kondicionáló kezelés és a graft versus host betegség (GvHD) károsítja a nyálkahártya felszínek integritását, amellyel lehetoséget teremt a kórokozók véráramba kerülésére. A Candida fertozésekkel ellentétben a penészgombák a spórák belégzésével kerülnek a szervezetbe, ezért az infekciók eltéro eloszlást mutatnak. Az Aspergillus fertozések elsosorban a légutakban (sinusok, tüdo) keletkeznek [100, 144]. Az ossejt-átültetést követo
központi
idegrendszeri
gombafertozések
hátterében
is
leggyakrabban
Aspergillus áll, amely hematogén szórással vagy közvetlenül a sinusokból és a periorbitális területrol terjedhet rá az agyhártyákra. A szájüreg, a szájnyálkahártya a Candida kolonizáció jellegzetes helye, és az invazív fertozések kiindulási pontja [42, 62]. A mucositis a ossejt-átültetést követo neutropenia
24
jellegzetes szövodménye, amelynek súlyosságát és kiterjedését számos tényezo befolyásolja: a kondicionáló regimen, a neutropenia tartama és mélysége, valamint a száj baktériumflórája [47, 155]. A nyálszekréció, a nyál összetétele szintén jelentos szereppel bír. A nyál tisztító, fertotleníto hatása egyes összetevoinek (lactoferrin, lizozim) tulajdonítható. Dohányosokban, xerostomiás betegekben az orális gomba kolonizáció kifejezettebb [86]. Összefüggés mutatható ki a Candida hordozás és a szájnyálkahártya pH értéke között is, amennyiben alacsonyabb vegyhatású nyál mellett a gomba kolonizáció eroteljesebb [2, 59]. Az invazív candida fertozések incidenciája a flukonazol profilaxis bevezetése elott 1020% között volt [98]. Ugyanakkor a Candida fungaemiák mortalitása 39%-os, amely akár 90%-ra is emelkedik szöveti fertozés esetén. Az 1990-es évek elején, a flukonazol terápia elterjedésével a C. albicans és C. tropicalis infekciók incidenciája drámaian csökkent, azonban egyes, non-albicans Candida törzsek elofordulása növekedo tendenciát mutat [174]. A Candida kolonizáció változása nemcsak az antifungális profilaxis következménye, hiszen olyan központokban is megfigyelték, amelyekben nem alkalmaztak triazol profilaxist [168, 169]. Továbbá, a non-albicans törzsek elotérbe kerülése már 10 évvel a flukonazol bevezetése elott is megfigyelheto volt [96]. Az invazív aspergillosis incidenciája általában 10-20% közötti, az elofordulás kezelési centrumonként és évenként változik. Ossejt-átültetés elott a Candida kolonizáció igen gyakori jelenség. Egy seattle- i munkacsoport 300 betegben a ossejt-átültetés elott, majd a beavatkozás után a 100. napig hetente surveillance vizsgálatokat végzett. A prospektív, randomizált, kettos-vak vizsgálatban
a
betegek
fele
flukonazo l profilaxisban
részesült.
A
vizsgálat
megállapításai szerint a transzplantáció idopontjában a betegek 80%-a Candida speciesekkel kolonizált volt, és a flukonazol profilaxisban nem részesült betegek 80%-a az átültetést követo idoszakban is kolonizált maradt [25, 146]. Következésképp, a kolonizáció önmagában alacsony prediktív értékkel bír a késobbi invazív Candida fertozés kialakulására vonatkozóan, ezért a surveillance vizsgálatokat az ún. magas kockázatú betegek kiszurésére általában nem is javasolják [37, 77, 165].
25
3.2. Klinikum Transzplantált betegekben a candidiasis leggyakoribb manifesztációi a mucocutan fertozések. Az oropharyngeális megjelenés ritkább, mint az orális forma. Neutropeniás betegekben az akut disszeminált candidiasis elso klinikai jelei gyakran a maculáris vagy erythematosus megjelenést mutató borelváltozások, amelyeket izomfájdalom és érzékenység vagy vese- laesió kísérhet. A leggyakoribb tünet azonban a folyamatos vagy visszatéro, antibiotikus kezelésre nem reagáló láz [35]. A hasi szervek a krónikus disszeminált candidiasis gyakori megjelenési helyei, amely arra utal, hogy a máj és a lép fontos szuro szereppel bír a kórokozó elleni védekezésben. Mindez magyarázatul szolgál arra a megfigyelésre is, hogy miért találkozunk oly gyakran - pozitív hemokultúrák hiányában is - hepatosplenicus candidiasissal. A máj a neutropeniás idoszakban fertozodik, de az infekció csak akkor manifesztálódik, ha a neutrophil sejtek megjelentek, és gyulladás alakult ki [33, 35].
3.3. Diagnosztika Az invazív gombafertozések diagnosztikájában a tenyésztéseknek kiemelt szerepe van. A Candida speciesek izolálása a hemokultúrákból, biopsziás anyagokból vagy fiziológiásan steril helyekrol nyert mintákból alapveto jelentoségu. Sajnos a non- invazív módszerek me gbízhatatlansága, alacsony szenzitivitása és az invazív eljárások nehézkes alkalmazhatósága miatt a szisztémás gombafertozések sok esetben csak késon, nemritkán a boncolás során kerülnek felismerésre. A tenyésztések során izolált Candida speciesek identifikálása és antifungális szerek iránti érzékenységének meghatározása elengedhetetlen, ugyanis egyre gyakrabban találnak egyes antifungális szerekkel szemben rezisztens törzseket [31]. A rezisztencia viszonyok feltérképezésében igen hasznos in vitro érzékenységi vizsgálatokat azonban ma még nem mindegyik mikrobiológiai laboratóriumban képesek elvégezni. Ugyanakkor a törzsek taxonómiai identifikálása az esetek többségében megbízható alapot nyújt a hatékony antifungális kezeléshez. A
rendelkezésre
álló
szerológiai
vizsgálatok
a
Candida
speciesek
anyagcseretermékeinek, antigénjeinek kimutatásán, valamint a Candida ellenes antitestek kimutatásán alapulnak, és érzékenységük korlátozott.
26
A keringo antigén kimutatására szolgáló, legelterjedtebben használt módszer a latex agglutinációs teszt [105], amely 80%-os specificitással, de viszonylag alacsony szenzitivitással rendelkezik. Egy vizsgálat szerint allogén átültetés után az invazív fertozések kevesebb, mint 50%-ában sikerült antigént kimutatni [105]. Az antitest kimutatáson alapuló eljárások a transzplantációt követo súlyos immunhiányos állapot, antitest-termelési zavar miatt nem használhatók, és csak az átültetést megelozo szerostatusz rögzítésére alkalmasak [31].
3.4. Flukonazol profilaxis A Candida expozíció nem elozheto meg, ugyanis a kórokozó rendszerint az endogén flórából származik. Nincs bizonyíték arra nézve sem, hogy a kolonizáció csökkentésével ritkulnának az invazív Candida fertozések. Kivételt talán a Candida parapsilosis fertozések jelenthetnek, amelyek gyakran a parenterális tápoldatokból származnak, azaz a csíramentesen eloállított hiperalimentális oldatokkal csökkentheto a fertozésveszély. Mivel a Candida albicans kézzel is átviheto, az infekció veszély alapos kézmosással is csökkentheto. Az orális Candida albicans kolonizáció csökkentésére számos lehetoség áll
rendelkezésre
(cryoterápia,
chlorhexidin,
glutamin,
pentoxifillin,
sucralfat,
amifostine, lézerkezelés, GM-CSF, IL-11, keratinocyta növekedési faktor, TGF-béta stb.) [47, 142, 156]. Ossejt-átültetett betegek candidiasisának megelozésében a leghatékonyabbnak azonban a flukonazol profilaxis tunik. A flukonazol orálisan jól felszívódó és tolerálható fungisztatikus szer, amely hatékonynak bizonyult candidák által okozott felületes és invazív gombafertozések terápiájában, valamint cryptococcus meningitis fenntartó kezelésében. A flukonazol profilaxis optimális adagja nem ismert. Egyes adatok szerint a napi 100-200 mg-os adag nem elégséges, míg mások szerint hatékonynak bizonyult [132, 36, 172]. Az ossejtátültetéssel foglalkozó központok többsége 400 mg/nap adagot alkalmaz, de a profilaxis ideális idotartama nem ismert. Marr és mtsai randomizált, placebo kontrollált vizsgálatukban a 75 napos profilaxist eredményesnek találták a disszeminált Candida fertozések megelozésében, valamint a bél graft versus host és a candida eredetu halálozás csökkentésben. A flukonazol csoport túlélése is szignifikánsan jobb volt, mint a kontroll csoporté [89]. Az elhúzódó immunszuppresszió (graft versus host betegség és kezelése) tartós profilaxist indokolhat. Autológ átültetésben az invazív fertozés veszélye
27
lényegesen kisebb, ezért a flukonazol profilaxis szükségessége nem egyértelmu. Profilaxis javasolt komoly mucositist okozó kondicionáló kezelések után, és a neutropeniás idoszakban. Számos
kontrollált
vizsgálat
igazolta,
hogy
a
flukonazol
profilaxissal
nagy
hatékonysággal elozhetok meg a Candida albicans és Candida tropicalis fertozések [56, 146]. A seattle- i munkacsoport prospektív, randomizált tanulmánya szerint a flukonazol profilaxis a placebo csoporttal szemben csökkentette a szisztémás gombafertozések elofordulását (7% versus 18%) [146]. A flukonazol csoportban Candida albicans fertozés nem fordult elo, és a nem albicans törzsek által okozott infekciók sem növekedtek jelentosen. Csökkent a gomba kolonizáció és javult a túlélés is. Bár a flukonazol profilaxis mellett a C. albicans és C. tropicalis fertozések ritkultak, azonban egyes központokban a C. glabrata és a C. parapsilosis infekciók emelkedését észlelték [1, 67, 77, 78, 174]. Más adatok szerint a flukonazol profilaxis mellett szignifikánsan megemelkedett az eredendoen flukonazol-rezisztens C. krusei kolonizáció, és a C. krusei által okozott fertozések száma is [145, 173]. Néhány esetben flukonazol rezisztencia kialakulását is megfigyelték, bár a jelenség szerencsére nem gyakori [88, 110].
Az újabb antifungális hatóanyagok alkalmazása elosegítette más, azokra kevésbé érzékeny gomba patogének megjelenését [28, 108]. Az immunológiai kompetencia súlyos hiányát mutató betegekben mind a Candida norvegensis, mind a C. inconspicua tunik ilyen, elotérbe kerülo új patogénnek. Nagyon hasonló élettani jellemzoik miatt, a szokásosan alkalmazott fenotipusos identifikáló rendszerek esetenként nem képesek megkülönböztetni e két faj klinikai izolátumait [13]. A 18S és 26S rDNS-ek restrikciós enzimekkel
történo
összehasonlítása
emésztésével
[amplifikált
kapott
szekvenciarészletek
rDNS-szekvenciák
restrikciós
mintázatának
fragmentumhossz
polimorfizmus (RFLP) analízise] lehetoséget nyújt a megbízható azonosításra és elkülönítésre. A kiválasztott láncindító oligonukleotidokkal („primerekkel”) végzett random amplifikált polimorf DNS („Random Amplified Polymorph DNA”, RAPD) eljárás lehetové teszi izolátumok megkülönböztetését akár klón/törzs szinten is, ahol adott izolátumok közös eredetét az amplifikált DNS-szekvenciák azonos mintázata jelzi [5].
28
4. Célkituzések 1. Célul tuztük ki a szájüregre vonatkozó szubjektív panaszok és a cariológiai állapot felmérését, valamint a nyugalmi nyálszekréció meghatározását vérképzorendszeri malignus elváltozásban szenvedo betegeknél, az ossejt-átültetést megelozoen. További célul tuztük ki a gombakolonizáció arányának meghatározását a transzplantáció során /kondicionálás elott és aplázia alatt/.
Vizsgálataink során arra a kérdésre
összpontosítottunk, hogy van-e összefüggés a szájüreg gombakolonizációja és a nyugalmi nyálszekréció között vérképzorendszeri malignus elváltozásban szenvedo betegeknél az ossejt-átültetést megelozoen, vizsgáltuk továbbá, hogy a fenti paraméterek miként befolyásolják a betegek szájüregének egészségi állapotát.
2.
Az egyik betegtol származó, összesen három mintában C. inconspicua volt
kimutatható, amelyet az ID32C-rendszer eloször Candida norvegensisként azonosított. Az RFLP- mintázatok és RAPD-analízis alapján azonban a fenti klinikai izolátumok C. inconspicuanak bizonyultak. Meg kívántuk határozni a C. inconspicua , C. albicans és C. krusei, izolátumok flukonazol-érzékenységét és fo extracelluláris enzimatikus virulencia- faktorként funkcionáló enzimeinek - az aszpartát proteáz és foszfolipáz aktivitását, és sejtfelszíni hidrofóbicitását.
3.
Az
élesztosejtek
rendelkeznek
olyan
tulajdonságokkal,
amelyek
egy
immunkomprimált gazdaszervezetben le hetové teszik a fertozés létrejöttét – virulencia sajátságokként szerepelnek. Tekintettel arra, hogy a C. albicans a viszonylag magas sókoncentrációjú természetes vizekben bizonyítottan képes humán fertozéseket okozni (Brisou 1975) [17], ezért további célunk volt annak megvizsgálása, vajon milyen hatással vannak az alkálifémsók a gomba ismert virulencia faktoraira. A fentiek alapján vizsgálni kívántuk: három alkálifémsónak (NaCl, KCl és LiCl) a C. albicans, C. parapsilosis, valamint a Rhodotorula rubra opportunista patogén élesztok növekedésére gyakorolt hatását.
4. A fent említett alkálifémsók hatásának tanulmányozását a legjelentosebb humán patogén éleszto, a C. albicans virulencia faktoraira. Vizsgálni kívántuk a csíratömlo-
29
képzo sajátságot, az akrilát lapokhoz való tapadási képességet (és ehhez kapcsolódóan a sejtfelszín hidrofóbicitását), valamint a fenotípusos variabilitás (switching) jelenségét. Összehasonlítottuk fél, negyed, nyolcad minimális gátló koncentrációnyi flukonazol hatását különbözo Candida fajok törzseinek össz sejtfelszíni hidrofóbicitására.
5. Anyag és módszer 5.1. A gombakolonizáció és a nyugalmi nyálszekréció vizsgálatánál alkalmazott anyagok és módszerek Vizsgálatainkat 80 vérképzorendszeri malignus elváltozásban szenvedo, a Fovárosi Szent László Kórház és Rendelointézet Csontvelo-transzplantációs Osztályán ossejtátültetésben (SCT) részesült beteg részvételével végeztük, 24 hónapos vizsgálati idoszak során. A nyolcvan betegbol 37/80 (46%) volt férfi, és 43/80 (54%) no. Az átlagéletkor 29,2 év volt (2-57 év). A betegek megoszlása a transzplantált ossejtek forrása szerint a következo volt: csontvelosejt 33/80 esetben (41%); perifériás vér ossejt 43/80 esetben (54%); mindketto 4/60 esetben (5%). A transzplantátum autológ volt 52/80 betegnél (65%); allogén 28/80 betegnél (35%). A betegek megoszlását a hematológiai státusz és a transzplantáció indoka szerint az IV. táblázatban foglaltuk össze. A 80 beteg közül 18 (22,5%) dohányzott. Ha csak a 18 év fölötti betegeket számoljuk a dohányzás miatt, akkor 69 beteg közül 18-an (26 %) dohányoztak.
30
IV. táblázat
A 80 SCT-betegnél megállapított diagnózis és alkalmazott transzplantációs protokoll
Transzplantátum Diagnózis
Autograft
Összesen
Allograft
Myeloma multiplex
15
3
18
Hodgkin kór
14
14
Non-Hodgkin lymphoma
12
12
Akut myeloid leukemia
3
5
8
Krónikus myeloid leukemia
1
9
10
Akut lymphoid leukemia
4
4
Krónikus lymphoid leukemia
1
1
Súlyos aplasztikus anemia
3
3
Myelodysplasia
2
2
Neuroblastoma
5
5
Medulloblastoma
1
1
Adrenoleukodystrophya Juvenilis rheumatoid arthritis
1 1
1 1
52
31
28
80
5.1.1. A leggyakrabban alkalmazott kondicionáló kezelések ossejt-átültetett pácienseknél [92]
5.1.1.1. Allogén transzplantáció esetén: ?
TBI+Cy (frakcionált teljes testbesugárzás + cyclophosphamide) teljes dózis (12Gy+ cyclophospamide 120 mg/kg) fo indikációs terület: CML, ALL és AML
?
TBI+Melphalan (frakcionált teljes testbesugárzás + melphalan) teljes dózis: (12Gy + melphalan 140mg/m2 ) fo indikációs terület: myeloma multiplex
?
Bu-Cy (busulphan + cyclophosphamide) teljes dózis: (busulphan 16mg/kg + cyclophosphamide 200mg/kg) fo indikációs terület: CML és AML
?
DBM protokoll Kelemen szerint (dibrommannitol + cytarabin + cyclophosphamide) teljes dózis: mitobronitol 120mg/kg + cytarabine 60mg/kg + cyclophosphamide 150mg/kg) fo indikációs terület: CML és AML
?
ATG+Cy (anti- thymocyte globulin + cyclophosphamide) teljes dózis: (anti-thymocyte globulin 80mg/kg + cyclophosphamide 200mg/kg) fo indikációs terület: SAA
5.1.1.2. Autológ traszplantáció esetén: ?
BEAM teljes dózis: (carmustine 300mg/m2 + etoposide 1600mg/m2 + cytarabine 1600mg/m2 + melphalan 140mg/m2 ) fo indikációs terület: M.Hodgkin és NHL
?
Bu-Cy (l. fenn) fo indikációs terület: M.Hodgkin és NHL
?
Melphalan teljes dózis: (200mg/m2 ) fo indikációs terület: myeloma multiplex
32
A kondicionáló kezeléseket napi 2-31 g/m2 hidrálással egészítettük ki, (Isodex infúzió 500 ml-ében 4g NaCl + 2g KCl) összetételu folyadékkal, a betegek folyadék és ionháztartásának gondos követése mellett.
5.1.1.3. Antimikróbás profilaxis, betegek izolálása, táplálása, szupportív ellátása Valamennyi beteg az izolálás kezdetének idopontjától napi 100mg ciprofloxacint, 1125 mg amoxicillin + klavulánsavat, 200 mg flukonazolt és 1000mg acyclovirt kapott szájon át. Az allogén transzplantáltak steril HEPA filteres (általában laminar air flow- val ellátott) kórtermekben lettek izolálva, steril táplálékot kaptak ill. táplálkozási képtelenség esetén tunelizált centrális vénás kanülön keresztül parenterális táplálást. Az autológ transzplantáltak reverz izolációs kórtermekben lettek elhelyezve, s amennyiben szájon át táplálkozni tudtak nem minden esetben részesültek steril étrendben, hanem elégséges volt a fozés nélküli zöldségek és gyümölcsök kiiktatása. Minden beteg fehérvérsejt
mentesített
és
irradiált
vérkészítményeket
kapott,
a
vérlemezke
készítmények apheresissel készültek. Autológ traszplantációt követoen a +1 naptól a megtapadásig napi 300 mikrogramm G-CSF-et adtunk. Az allogén traszplantáltak 2 hetente 0,1g/ttkg intravénás immunoglobulin készítményt kaptak a 100. napig.
5.1.1.4. Graft versus host profilaxis A legtöbb esetben cyclosporin-A (a-1. naptól napi 3mg/kg folyamatos infúzióban, majd a dózis a plasmaszinthez lett igazítva) plusz methotrexat (a +1. napon 15mg/m2 , ill. a +3., +6., +11. napon 10mg/m2 dózisban) kombináció lett alkalmazva. A cyclosporin minden esetben a megtapadástól per os. lett adagolva mégpedig oly módon, hogy addig szükséges i.v. napi dózis meg lett duplázva, s ezután fokozatosan lett csökkentve az adag a plazmaszintek mérési eredményeinek megfeleloen úgy, hogy a legkisebb érték 100ng/ml- nél kisebb ne, a legnagyobb pedig 400ng/ml nagyobb ne legyen.
5.1.1.5. Veno-okluzív májbetegségek (VOD) elleni profilaxis Valamennyi beteg a kondicionáló kezelés elso napjától fogva 1mg/ttkg nátrium- heparint kapott folyamatos infúzióban legalább a megtapadásig. VOD szempontból kiemelten kockázatos kondicionáló kezelések esetén (pl.: Bu-Cy) a +28. napig.
33
5.1.2. Orális paraméterek vizsgálata 5.1.2.1. A fogazat állapotának felmérése: a carieses, hiányzó és tömött fogak számát standard fogtükör és szonda alkalmazásával állapítottuk meg (DMF-T-érték) [51, 171]. 5.1.2.2. Szubjektív xerostomia és nyálszekréció: A betegeket a kondicionáló kezelést megelozoen 7 nappal (a –7. napon), standardizált kérdoív alkalmazásával kikérdeztük szubjektív orális panaszaikról, az esetleges gyengeségérzésrol, fájdalomról, dohányzásról, és szubjektív szájszárazságról. A teljes nyugalmi nyálszekréciót Sreebny és munkatársai eljárásával mértük [149], és a 0,1 ml/perc vagy az alatti szekréciós értékeket tekintettük hiposzalivációnak. A 0,1 ml/perc és 0,2 ml/perc közé eso nyugalmi nyálszekréciós értékeket csökkent nyálszekrécióra utaló jelként értékeltük [150, 160]. 5.1.2.3. Mikrobiológiai vizsgálat: Mikológiai mintákat vettünk az orrból (mindkét oldalról), torokból, buccáról (mindkét oldalról), keményszájpadról és nyelvrol. Ily módon, 7-7 mintát vettünk, 4 alkalommal: a beavatkozást megelozoen 7 nappal (-7. nap), a transzplantáció napján (0. nap), a transzplantációt követo 7. napon (+7. nap) és a 14. napon (+14. nap). Összességében, mind a 80 betegtol 28 mintát vettünk transzportközegbe (Mast Diagnostika), egy beteget kivéve, aki Candida szepszisben hunyt el az utolsó, 7. minta levételét megelozoen. Összesen tehát 2233 mintát gyujtöttünk mikrobiológiai vizsgálatra. A mintákat 24-48 órán belül a Semmelweis Egyetem Orvosi Mikrobiológiai Intézetének Mikrobiológiai Diagnosztikai Laboratóriumába juttattuk, ahol azokat - dúsítást követoen - megfelelo táptalajokra, például szelektív Saboroud agarlemezekre oltották. A gombákat
API
ATB
rendszer
alkalmazásával,
ID32C-panellel
identifikáltuk
(bioMérieux, Marcy L’Etoile, Franciaország).
5.1.3 A statisztikai analízis: „Difference between two portions” összehasonlítással történt. Az értékelés során egyoldalú tesztet („one-sided test”) alkalmaztunk.
34
5.2. A gombaizolátumok fenotipusos és genotipusos taxonómiai és virulencia vizsgálata 5.2.1. Törzsek Referenciatörzsek: C. norvegensis CBS 1922 és C. inconspicua CBS180. Izolátumok: a C. inconspicua 10308, 10310 és 10312, C. albicans 10283, 10268 és 10297, valamint C. krusei 10844 és 11185 izolátumok négy ossejt-átültetett beteg oropharyngeális mintáiból származtak. A fenti izolátumok tulajdonságait és feltételezett klinikai jelentoségét az V. táblázatban foglaltuk össze.
35
V. táblázat
A vizsgált Candida izolátumok néhány tulajdonsága és feltételezett klinikai jelentosége
Beteg
Életkor (év)
Izolátum azonosító száma
Izolálás forrása
Alapbetegség
Klinikai jelentoség
Antifungális elokezelés
patogén
Flukonazol
patogén
Flukonazol
patogén
Flukonazol
patogén
Flukonazol
Candida inconspicua 1
48
10308
torok
10310
buccális
Hodgkin kór
nyálkahártya 10312
szájpad felszíne Candida albicans
2
10
10268
szájpad
súlyos
felszíne
aplasztikus anaémia
3
33
10283
torok
10297
buccális
Hodgkin kór
felszín Candida krusei 4
57
10844
torok
myeloma multiplex
11185
torok
36
A törzseket chloramphenicolt (500 ? g/ml) tartalmazó Saboraud dextróz agarlemezeken tenyésztettük (Oxoid, Basigstoke, Hampshire, Anglia). C.albicans izolátumokat annak alapján azonosítottunk, hogy azok képesek csíratömlot képezni borjúszérumban. Csíratömlo
képletet
nem
képzo Candida törzseket
CHROM-agaron
történo
tenyésztéssel és biokémiai profiljuk meghatározásával identifikáltunk (ID32C-rendszer, bioMérieux, Marcy l’Etoille, Franciaország).
5.2.2. Riboszomális DNS izolálása gombából DNS-t Hoffmann és Winston eljárásának módosított változata szerint izoláltunk [64]. DNS-t
Sabouraud
dextróz
táptalajon,
egy
napig
tenyészetett
gombasejtek
extraktumából. ferdeagarról. Körülbelül 109 sejtet szuszpendáltunk 1,5 ml steril, bidesztillált vízben, a sejteket ugyanebben a vízben, centrifugálással kétszer mostuk, és 200 ? l lizáló pufferben szuszpendáltuk [1 mmol/l EDTA; 100 mmol/l NaCl; 10 mmol/l Tris-HCl (pH=8,0); 2% Triton X-100; 1% SDS]. A szuszpenzióhoz körülbelül 0,3 g üveggyöngyöt adtunk, és a sejteket 3 percen át vortexeléssel roncsoltuk. A szuszpenzióhoz 200 ? l TE-puffert adtunk, az elegyet óvatosan összekevertük, majd 5 percig centrifugáltuk (10 000xg). A felülúszót pipettával eltávolítottuk, és a nukleinsavakat kétszeres térfogatnyi 96%-os etanol hozzáadásával precipitáltuk. A precipitátumot a fent ismertetettek szerint, centrifugálással ülepítettük, 50 ? l térfogatú, 100 ? g/ml ribonukleáz-A (RNase A) enzimet (Sigma) tartalmazó TE-pufferben szuszpendáltuk, majd 1,5 órán át, 37?C-on inkubáltuk. A DNS-t kétszeres térfogatnyi 96%-os etanollal precipitáltuk, centrifugáltuk, és a pelletet vákuum alatt (DNA Mini, HETO Ltd. készülékben) szárítottuk. A DNS-t 50 ? l TE-pufferben szuszpendáltuk és 20?C-on tároltuk.
5.2.3. C. inconspicua izolátumok indentifikálása PCR-amplifikált rDNS-szekvenciák RFLP-analízisével Az rDNS-szekvenciákat az NS3 és ITS4 jelzésu láncindítókkal amplifikáltuk [170]. A PCR-reakciót 30 ? l össztérfogatú, alábbiakat tartalmazó reakcióelegyben végeztük: 3 ? l 10x PCR-puffer; 1,5 ? l, 50 mmol/l MgCl2 ; 0,1 ? l, 25 mmol/l dNTP (mind a négy dNTP-t tartalmazó elegybol); 1,6 egység “DyNazyme II” DNS polimeráz (Finnzymes); 1-1 ? l láncindító (körülbelül 2 pikomól); és 4 ? l izolált gomba-DNS. Az amplifikálást
37
“PCR Sprint Cycler” készülék (Hybaid Ltd., Anglia) alkalmazásával végeztük a következo paraméterek mellett: 5 perc 95?C-on; majd 35 cikluson át: 30 másodperc 95?C-on; 30 másodperc 61,5?C-on; és 3 perc 72?C-on; végül, egy végso láncnövelo lépés 7 percig, 72?C-on. Az amplifikált terméket 4 különbözo restrikciós enzimmel emésztettük [MspI, RsaI, ScrFI, HaeIII; (New England Biolabs)] 1 ? l enzimpuffert, 3 egység restrikciós enzimet és 3 ? l amplifikált DNS-t tartalmazó reakcióelegyekben. Az emésztést 4 órán át hagytuk végbemenni, 37?C-on. A restrikciós enzimekkel kapott DNS-fragmentumokat szokásos módon, agarózgélelektroforézissel
szétválasztottuk
(1,5%
agaróz
0,5 ? g/ml
etidium-bromiddal
kiegészítve, 0,5x TBE-pufferben, 6 V/cm körülbelül 2 órán át). A gélt „Gel Documentation Equipment” készülékkel digitalizáltuk és fényképeztük, és a felvételt „Molecular Analyst Program” (BioRad) programmal analizáltuk.
5.2.4. RAPD-PCR analízis RAPD-PCR-analízist az alábbi három láncindító alkalmazásával végeztünk: P60: 5’CGG TCA CTG T3’; P70: 5’AGC GGG CGT A3’; és P80: 5’CGC GTG CCC A3’. A reakcióelegy a felsoroltakat tartalmazta: 2,5 ? l templát-DNS; 1,4 egység „DyNAzyme II” DNS-polimeráz (Finnzymes); 3 ? l 10x PCR-puffer; 3 ? l 25 mmol/l MgCl2 ; 0,3 ? l, 25 mmol/l dNTP-keverék (Sigma); 1,2 ? l, 50 ? mol/l láncindító; és 19,3 ? l steril, bidesztillált víz. Az amplifikálást az RFLP-analízisnél ismertetettekhez hasonló módon végeztük, azzal az eltéréssel, hogy más anellálási (primer kötodési) homérsékletet alkalmaztunk (38?C a P60 és P70 esetében, 40?C a P80 esetében). Az elektroforézisnél és gélanalízisnél alkalmazott körülmények megegyeztek az RPLP-analízisnél már ismertetettekkel.
5.2.5. Virulenciafaktorok meghatározása 5.2.5.1. Flukonazol-érzékenység meghatározása A patogenitási és virulencia vizsgálatba bevont törzseken flukonazol E-tesztet (AB BIODISC, Solna, Svédország) a gyártó utasításai szerint végeztük, glükózzal (2%) kiegészített, 0,165 mol/l MOPS-val (3-[N-morfolino]propánszulfonsavval) 7,0-es pHértékre beállított RPMI 1640-agarlemezeken (1,5%). A 90 mm átméroju Petri-csészékbe
38
kiöntött agarlemezekre 24 órás gombatenyészet 0,5 McFarland denzitású szuszpenzióját szélesztettük. A lemezeket 15 percig száradni hagytuk, és a flukonazol E-teszt csíkokat az agar felszínére helyeztük. A lemezeket 24 órán át, 35?C-on inkubáltuk. Az eredményeket az NCCLS Candida fajok in vitro érzékenységének tesztelésére vonatkozó szakmai ajánlása szerint interpretáltuk [103]. 5.2.5.2. Extracelluláris proteáz és foszfolipáz aktivitás meghatározása Sejtszuszpenziókat (1x106 sejt/ml) oltottunk 0,2% borjú szérumalbuminnal (BSA) kiegészített 1,2% YCB- (Yeast Carbon Base, Difco) tápközegbe, és a tenyészeteket 72 órán át, rázatás mellett, 27?C-on inkubáltuk. A gombasejteket centrifugálással kiülepítettük, és az enzimaktivitást a felülúszóban meghatároztuk [45, 46]. Az enzimaktivitás- meghatározásokat Remold és munkatársai által leírtak szerint végeztük [127]. Fél milliliter (0,5 ml) mintát inkubáltunk 60 percig, 37?C-on, 2 ml, 1%-os BSAoldattal (pH=3,2). A reakciót 5 ml térfogatú 5%-os triklórecetsav hozzáadásával állítottuk le. A proteolitikus termékek mennyiségét fotometriás úton határoztuk meg, 280 nm-es hullámhosszon. Öt mikroliter (5 ? l) gombasejt-szuszpenziót (107 sejt/ml, 0,9% NaCl-oldatban) oltottunk az alábbi összetevokkel kiegészített SDA-agar felszínére: 5,85% NaCl; 0,05% CaCl2 ; és 10% steril tojássárga. A tenyészeteket 48 órán át, 37?C-on inkubáltuk [69], majd a telepek körül megjeleno precipitációs zóna átmérojét lemértük [127, 135]. Megjegyzendo, hogy bár ezt az eljárást elsosorban extracelluláris foszfolipáz(ok) termelodésének kimutatására alkalmazzák [69, 123], azzal a lipáz és foszfolipáz aktivitások nem különíthetok el [50]. 5.2.5.3. Sejtfelszini hidrofóbicitás meghatározása standardizált hidrofób interakciós kromatográfiás (HIC) módszerrel. A HIC lényege, hogy a szuszpenzióban levo gombák felszini hidrofóbicitásuk mértékében kötodnek a hidrofób Octyl Sepharose CL 4B (Pharmacia) gélhez oszlopkromatográfiás vizsgálatokban. Jól szuszpendált 50 ml Octyl Sepharose CL 4B-t ötször mostunk tízszeres mennyiségu 0,02 M-os Na-foszfát pufferben, pH 6,8, majd ugyancsak ötször mostuk 0,02% Na-azidot tartalmazó desztillált vízben. Felhasználásig 200 ml térfogatnyi Na-azidos-vizes szuszpenzióban tároltuk 4 0 C-on. A HIC-hez 8 mm átméroju és 14 cm magas Pasteur pipettákba 1,5 cm-es cigarettafiltert dugtunk a gél felfogására (1. ábra).
39
1. ábra
Hidrofób interakciós kromatográfiás módszer
Az állványba tett filterezett pipettákba 1,5 cm3 urtartalmú ballonnal ellátott Pasteur pipettával az alaposan összerázott gélszuszpenzióból kétszer merítve azonos magasságú oszlopokat öntöttünk. Az oszlopokat 3x1,5 ml 0,02 M-os pH 6,8-as Na- foszfát pufferrel mostuk (3 merítés a ballonos pipettával), majd 1-1 gombatörzsnek, vagy mintának 4-4 oszlopot equilibráltunk 4,5-4,5 ml 0,02 M-os Na-foszfát, 0,1 M-, 0,5 M- és 1 M-os ammónium-szulfát, pH 6,8, oldattal. (Közben minden mintának 3 ml 0,02 M-os puffert, 0,1 M-, 0,5 M- és 1 M-os ammónium-szulfátot mértünk ki a késobbi mosáshoz.) Az oszlopok alá kémcsövet helyeztünk, majd mindegyik oszlopra 100 µl A540 = 20 suruségu gombaszuszpenziót mértünk, míg 100 µl-t kontrolként adtunk 3 ml pufferhez. A felvitel befejezése után azonnal elkezdtük a nem kötött gombák lemosását a hidrofób
40
gélrol az elore elkészített 3-3 ml megfelelo, tehát 0,02 M-os Na-foszfát, 0,1M-, 0,5 M-, és
1
M-os
ammónium-szulfát
oldattal.
A
lemosható
gomba
tartalmát
spektrofotométerben 540 nm-en mértük. A kötodés, vagyis a hidrofóbicitás mértékét a következoképpen számoltuk ki:
Kontroll A540 – Eluátum A540 HIC érték (%) = _________________________ X 100
Kontroll A540 Minél nagyobb a HIC érték, annál erosebb a gombák sejtfelszini hidrofóbicitása egy adott oldatban [130].
5.2.6. Statisztikai analízis: Valamennyi kísérleti eredményt 3 független mérés átlagaként adtuk meg. Az analitikai meghatározások reprodukálhatóságát a standard eltéréssel (S.D.) jellemeztük. A statisztikai szignifikanciát Student-féle t-próbával vizsgáltuk.
5. 3. Alkálifémek hatásának vizsgálata a C. albicans szaporodására és virulenciafaktoraira 5.3.1. Organizmusok: Két C. albicans törzset vizsgáltunk, a flukonazol-rezisztens C. albicans és a flukonazol-érzékeny C. albicans ATCC 38247 törzseket. A C. albicans FR törzs egy flukonazol-rezisztens mutáns laboratóriumi törzs [45]. Mindkét törzset SDA ferde táptalajon tartottuk fenn, 4?C-on.
5.3.2. Vegyszerek: Sabouraud dextróz agart (SDA) és mikológiai pepton tápközeg az Oxoid (Basingstoke, Hampshire, Anglia) cégtol származott. Élesztokivonatot a Difco Laboratories (Detroit, Michigan, USA) szereztünk be. Minden általunk használt vegyszer analitikai tisztaságú volt.
41
5.3.3. Szaporodási vizsgálatok: C. albicans sejteket eloinkubáltunk 220 ml térfogatú, 1% élesztokivonatot (Y), 2,5% mikológiai peptont (P) és 2,5% glükózt (G) tartalmazó YPG tápfolyadékban 18 órán át, 30?C-on. A sejteket alkálifémek (0,5-2 mól/l NaCl, 0,5-2 mól/l KCl, 0,0625-0,5 mól/l LiCl) megfelelo koncentrációját tartalmazó, 3 ml térfogatú YPG tápfolyadékban vettük fel olyan denzitásban, hogy 0,1 abszorbciós értéket kapjunk (?=600 nm). A kultúrákat 30?C-on, 12 órán át inkubáltuk, és az optikai denzitást 600 nm hullámhosszon mértük.
5.3.4. Csíratömlo-képzodés és plasztik felszínekhez történo tapadás vizsgálata: A C. albicans törzseket NaCl (1,5 mól/l), KCl (2 mól/l) vagy LiCl (0,25 mól/l) alkálifém-kloridokkal kiegészített YPG tápfolyadékban tenyésztettük 37?C-on, 18 órán át. Az alkálifémsókkal történt eloinkubálást követoen a sejteket háromszor mostuk, majd fogászati akrilát-felszínekhez való tapadási képességüket, valamint csíratömlo-képzodésüket a korábban leírt módszerek szerint vizsgáltuk [45, 54].
5.3.5. Sejtfelszíni hidrofóbicitás vizsgálata: A sejtfelszíni hidrofóbicitásnak alkálifémekkel történo eloinkubálást követo változását módosított eljárásával mértük [129]. A sejteket NaCl (1,5 mól/l), KCl (2 mól/l)
és
LiCl
(0,25 mól/l)
alkálifém-kloridokkal
kiegészített
YPG
tápfolyadékban tenyésztettük 37?C-on, 18 órán át. A sejteket PUM-pufferben (0,097 mól/l K2 HPO4 , 0,053 mól/l KH2 PO4 , 0,03 mól/l urea, 0,4 mmól/l MgSO4 *7H2 O pH=7,1) mostuk, majd a sejtszuszpenziók (5x107 sejt/ml) 1,5 mléhez különbözo térfogatnyi (0-0,5 ml) n- hexadekánt adtunk. Tíz percen át, 30?Con történo inkubálást követoen az elegyeket 120 másodpercig azonos intenzitással rázógépen rázattuk. Tizenöt percen át hagytuk, hogy a szénhidrogén- fázis teljesen felszálljon, majd a vizes fázist Pasteur-pipettával óvatosan leszívtuk, és 1 ml térfogatú küvettába mértük. A vizes fázis fényelnyelésének 600 nm-en történo csökkenését fogadtuk el a sejtfelszíni hidrofóbicitás mértékeként.
42
5.3.6. Statisztikai analízis: Minden kísérleti adat 3-6, egymástól független mérés átlagának az eredménye. Az analitikai eljárások reprodukálhatóságát standard deviáció (S.D.) számításával becsültük. A statisztikai szignifikanciát Student t-vizsgálattal számoltuk ki.
6. EREDMÉNYEK 6.1. A gombakolonizáció és a nyugalmi nyálszekréció vizsgálatánál kapott eredmények 6.1.1. A fogazat állapota: Bár a DMF-T-értéket határoztuk meg (DMF-T = 12,1), csak a carieses fogak jelenléte nyújthatott releváns információt ebben a betegcsoportban, mivel egyrészt, azok bakteriális rezervoárnak tekinthetok, másrészt, növelik a fogászati komplikációk kockázatát az izolációs kamrában töltött ido során. Annak ellenére, hogy a transzplantációs programba bevont betegeket a programba való bekerülésüket megelozoen fogászati vizsgálatnak vetettek alá, 80 beteg közül 20 esetben (25%) carieses fogat találtunk.
6.1.2. Gombakolonizáció: A 80 SCT beteg különbözo mintáinak vizsgálata során, a kondicionálást megelozoen 16 betegbol (20%), az aplázia idején 19 betegbol (23,7%) izoláltunk gombát. A kolonizáció és annak súlyossága igen különbözo volt az egyes betegek esetében, és néhányuk két vagy több gombafajt is hordozott. A gombafajok megoszlását az izolátumokban, és a fertozött betegek számát a VI. táblázatban adtuk meg. A kondicionálást megelozoen, az izolált gombafaj Candida albicans volt, amelyet 16 betegbol (20,0%) izoláltunk. Az apláziás stádiumban izolált törzsek szintén elsosorban C. albicans törzseknek bizonyultak, de az izolátumok között emelkedett a nem albicans fajok száma: Candida glabrata (2) C. inconspicua (5), Candida lambica (1), Candida rugosa (1), Candida valida (1) és Candida krusei (4) specieseket találtunk 9 betegben
43
(11,2%), Aspergillus fumigatus (2,5%) és Saccharomyces cerevisia specieket 1-1 betegben (2,5%). Hét napos kondicionálás flukonazollal 10 beteg esetében eliminálta, 3 betegnél jelentosen csökkentette a Candida kolonizáció gyakoriságát. A hét napos flukonazol kezelés két beteg esetében jelentos változást okozott a kolonizáló Candida speciesekben, egy esetben C. albicans helyett C. inconspicua, a másikban C. glabrata és Saccharomyces cerevisiae jelent meg. A további flukonazol kezelés 16 betegbol 11 esetében szüntette meg a Candida kolonizációt a 14 napos megfigyelési idoszak alatt. A többi betegnél, 2 esetben találtunk kolonizációt ugyanazzal a fajjal a transzplantáció 14. napján, 1 esetben a transzplantáció 7. napján, és 2 esetben más Candida fajok irányába tolódott el a kolonizáció. A kondicionálást megelozoen nem kolonizálódott betegek közül 10 kolonizálódott a transzplantáció napjára. Hat beteg tranziens módon kolonizálódott a transzplantáció idejére, majd Candida- mentessé vált, míg egy beteg tartósan kolonizálttá vált Candida kruseivel, 2 kevert flórával. Az utóbbiak közül, egy beteg kolonizálódott C. krusei és C. albicans speciesekkel, a másik C. rugosa, C. glabrata és C. inconspicua speciesekkel.
44
VI. táblázat
Gomba speciesek megoszlása a kondicionáló kezelést megelozoen és az apláziás stádiumban 80 ossejtátültetett betegnél
Napok
-7
0
+7
+14
Gomba species
I*/ P** I / P
I/P
I/P
Candida albicans
58 / 16 26 / 10 6 / 2
12 / 4
Candida krusei
0/0
7/2
9/2
13 / 3
Candida inconspicua
0/0
4/3
7/2
4/2
Candida valida
0/0
5/1
0/0
0/0
Candida lambica
0/0
5/1
0/0
0/0
Candida glabrata
0/0
1/1
2/1
3/1
Candida rugosa
0/0
4/1
0/0
0/0
Aspergillus fumigatus
0/0
0/0
0/0
1/1
Saccharomyces cerevisiae
0/0
1/1
0/0
0/0
*: gombaizolátumok száma; **: kolonizált betegek száma.
Egy betegnél, aki a kondicionáló kezelést megelozoen nem kolonizálódott, a C. albicans izolátumok száma az apláziás fázis vizsgált idoszakában emelkedett. Egy betegben Aspergillus fumigatus jelent meg 14 nappal a transzplantációt követoen . A folyamatot a VII. táblázat mutatja be és ebbol jól látható, hogy a kondicionálás során alkalmazott antimikotikus prevenció hatására a gombával fertozött betegek száma eroteljesen csökkent. Látható az is, hogy azoknál a pácienseknél, ahol a transzplantáció napjáig (0. nap) nem lehetett gombát izolálni, ott mindössze egy betegnél találtunk a késobbiekben gombás fertozést.
45
VII. táblázat
A gombafajok elofordulása az ossejt-átültetés különbözo idoppontjaiban 80 SCT betegnél
napok/betegszám
-7
0
+7
+14
1. csoport
16
6
2
4
2. csoport
X
10
3
4
3. csoport
X
X
0
0
4. csoport
X
X
X
1
1. csoport : azok a betegek, ahol a gombás fertozés már a –7. napon kimutatható volt; 2. csoport : azok a betegek, ahol a gombás fertozés a 0. napon jelent meg eloször; 3. csoport : azok a betegek, ahol a gombás fertozés a +7. napon jelent meg eloször; 4. csoport : azok a betegek, ahol a gombás fertozés a +14. napon jelent meg eloször. A statisztikai elemzés alapján kijelentheto, hogy a csökkenés mind a gombával fertozö tt összes beteg, mind a csak a Candida albicansszal fertozött betegek vonatkozásában szignifikáns volt a vizsgált periódus alatt (a gombával fertozött összes betegnél: p=0,04; C. albicansszal fertozött betegegeknél: p=0,0476). Dohányzó betegek közül 10/18 esetben (55%) lehetett gombát izolálni, míg a nem dohányzók közül 17/62 esetben (27%) találtunk gombás fertozést. Csak a felnott betegeket vizsgálva a dohányzó 18 beteg közül 10- nél lehetett gombát izolálni (55 %), míg a nem dohányzó csoportban 17 páciensnél találunk gombás fertozést (17/51) (33 %).
6.1.3. Nyálszekréciós funkció: A 80 beteg közül 45 (56%) panaszkodott szájszárazságra, míg 35 betegnél (44%) nem jelentkezett ilyen szubjektív panasz. Hiposzaliváció (teljes nyugalmi nyálszekréció = 0,1 ml/perc) volt mérheto 28 betegnél (35%). Csökkent nyálszekréciót (teljes nyugalmi nyálszekréció: 0,1-0,2 ml/perc) volt megfigyelheto 33 betegnél (41%), és a teljes nyugalmi nyálszekréció normális maradt 15 betegnél (18%). Négy betegnél (5%), fiatal
46
koruk miatt, a vizsgálatot nem tudtuk elvégezni. A kondicionáló kezelés elott 16 betegnél (20%) lehetett gombát izolálni. A 16 betegbol 10- nél (62,5%) volt a teljes nyugalmi nyálszekréció mértéke = 0,1 ml/perc, 2 páciens (12,5%) teljes nyugalmi nyálszekréciós mértéke : 0,1-0,2 ml/perc közé esett és a teljes nyugalmi nyálszekréció mértéke 4 betegnél (25%) volt normális értéku. A 16 beteg közül 10 (62,5%) panaszkodott szájszárazságra, míg 6 betegnél (a 16 betegbol) (37,5%) nem jelentkezett ilyen tünet. Az
apláziás
stádiumban,
a
80
betegbol
19
esetében
(23,7%)
észleltünk
gombakolonizációt, közülük 13 betegnek (68,4%) volt panasza, míg 6 (31,5%) nem panaszkodott szájszárazságra. A transzplantációt megelozoen szájszárazságra panaszkodó ossejt-transzplantált betegeknél
nagyobb
gyakorisággal
volt
kimutatható
C.
albicans
és
más
gombakolonizáció, mint a normális nyálszekréciójú betegeknél.
6.2. A gombaizolátumok fenotipusos és genotipusos taxonómiai és virulencia vizsgálata 6.2.1. A C. inconspicua fenotípusos és genotípusos azonosítása A csíratömloképzés, vagy ennek hiánya a különbözo színu és alakú telepek képzése CHROM-agaron, és a 32 biokémiai tulajdonságot vizsgáló ID 32 identifikáló rendszerben mutatott viselkedés alapján az izolátumok dönto többsége jól besorolható volt a különbözo gomba, elsosorban Candida fajokba, kivéve a C. inconspicua izolátumokat. Az ID32 azonosító csíkok C. inconspicua
izolátumokat C. norvegensisként
azonosították azok eszkulin-pozitivitása alapján, amely az egyetlen teszt C. norveiensis és C. inconspicua elkülönítésére. Ezen izolátumok megbízhatóbb species szintu identifikálásához egy körülbelül 1500 bázispár hosszúságú riboszomális nukleinsav (rDNS)-szekvenciát amplifikáltunk PCR-eljárással, majd a PCR-termékeket 4 különbözo restrikciós enzimmel emésztettük és a fragmentumokat detektáltuk. Az izolátumok és típustörzsek gélelektroforézissel kapott RFLP- mintázatát az 2. ábrán mutatjuk be.
47
2. ábra
C. inconspicua és C. norvegensis referencia-törzsek és klinikai izolátumok amplifikált rDNS-szekvenciáinak RFLP-mintázata
A: MspI-enzim; B: RsaI-enzim; C: ScrFI-enzim; D: HaeIII-enzim. Sávok: 1 sáv: DNS molekulatömeg marker; 2. sáv: 10308 izolátum; 3. sáv: 10310 izolátum; 4. sáv: 10312 izolátum; 5. sáv: C. inconspicua CBS 180; 6. sáv: C. norvegensis CBS 1922.
Látható, hogy csak egy enzim (ScrFI) eredményezett hasonló mintázatokat, míg a többi enzim esetében a fragmentumok száma és mérete (MspI, RsaI és HaeIII) eltért, és azok megjelenése igen jellemzo volt a típustörzsek esetében. Mindhárom klinikai izolátum mintázata teljesen megegyezett a C. inconspicua típustörzsével. A fenti eredmények alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy klinikai izolátumaink a C. inconspicua speciesbe sorolhatók. Ez azt jelenti, hogy az eszkulin teszt az ID32 identifikáló rendszerben nem képes elkülöníteni a C. norvegensis és C. inconspicua törzseket. Ezek az eredmények ellentmondanak azoknak a megfigyeléseknek, amelyekrol Nho és munkatársai számoltak be [107], akik jó egyezést találtak az eszkulin tesztek és az rDNS ITS-régiók
HhaI-emésztéssel
kapott
restrikciós
mintázata
alapján
mért
eredmények között. Három különbözo láncindítóval (P60, P70 és P80) végzett RAPD-PCR-analízis nyilvánvalóan különbözo mintázatokat eredményezett a C. norvegensis és C. inconspicua típustörzsek és C. inconspicua klinikai izolátumok esetében, 20% számított hasonlósági indexszel (3. ábra).
48
3. ábra
C. inconspicua és C. norvegensis referencia-törzsek és három klinikai izolátum (10308, 10310 és 10312) klaszter-analízise a P60, P70 és P80 láncindítók alkalmazásával
primer P60
primer P70
primer P80
27 betegnél (33,7%) igazolt gomba jelenlétét: 4 betegnél (5%) csak a ossejt-átültetést megelozoen; 12 betegnél (15%) csak a ossejt-átültetést követoen; és 11 betegnél (13,8%) mind a ossejt-átültetést megelozoen, mind azt követoen. A leggyakrabban izolált gombafaj Candida albicans volt (ossejt-transzplantációt megelozoen 11, ossejtátültetést követoen 12 betegnél); gyakoriságban ezt a nem-albicans Candida speciesek követték (ossejt-transzplantációt megelozoen 6, ossejt-transzplantációt követoen 9 betegnél). Aspergillus fumigatust találtunk a ossejt-transzplantációt megelozoen 1 betegnél, és ossejt-átültetést követoen 3 betegnél. A nem-albicans Candida speciesek között C. tropicalis és C. krusei fordult elo. Egy betegnél C. inconspicua volt izolálható a torokból, a buccális és a szájpadi felszínekrol.
49
6.2.2. A C. inconspicua, C. albicans és C. krusei fo virulencia-faktorainak összehasonlítása 6.2.2.1. Extracelluláris enzimek
VII. táblázat
A vizsgált Candida izolátumok extracelluláris proteáz és foszfolipáz aktivitása
Izolátum azonosítója
Proteáz aktivitás
Foszfolipáz aktivitás
(A280 nm/sejtkoncentráció)x
(1/Pz)-1a
10
10
Candida albicans 10268
4,8
0,72
10283
6,3
0,86
10297
9,6
0,73
Candida krusei 10844
1,69
0,62
11185
1,92
0,38
Candida inconspicua 10308
3,6
0,92
10310
4,1
0,79
10312
4,0
0,88
a
A foszfolipáz zónát (Pz) úgy számítottuk ki, hogy a telep átmérojét az opaleszkáló
zóna és telepátméro összegével osztottuk. P értékeket Student- féle t-próbával számítottunk (P<5%).
Amint az a VII. táblázatból látható, a három C. albicans izolátum esetében viszonylag magas extracelluláris enzimszinteket mértünk. A C. krusei izolátumok esetében a proteáz aktivitás szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a két másik species esetében (P<5%), és némileg alacsonyabb foszfolipáz (lipáz) aktivitásokat eredményezett, az utóbbi eltérés azonban nem volt szignifikáns. A C. inconspicua izolátumok esetében közepes proteáz aktivitási értékek voltak kimutathatóak. Ezek az aktivitási értékek kismértékben (de nem szignifikáns mértékben) alatta maradtak a C. albicans aktivitási
50
értékeinek, de szignifikánsan magasabbak voltak a C. krusei izolátumok aktivitásánál (P<5%). A C. inconspicua izolátumok extracelluláris foszfolipáz aktivitása hasonló volt C. albicans izolátumokéhoz (mindkét törzs esetében magas szinteket mértünk). A patogenitás és extracelluláris enzimtermelés közti kapcsolat C. albicans vonatkozásában már bizonyított tény [69, 80, 94, 135, 136].
6.2.2.2. Sejtfelszíni hidrofóbicitás A VIII. táblázatból látható, hogy az össz sejtfelszini hidrofóbicitás alapján a C. inconspicua a legerosebben hidrofób, ezt követi a C. krusei, majd pedig a C. albicans. Ez azt jelenti, hogy a C. inconspicua a legérintettebb tapadási szempontból.
51
VIII. táblázat
Különbözo Candida faj sejtfelszíni hidrofóbicitásának összehasonlítása hidrofób interakciós kromatográfiával Kötési % eluálás után Na-foszfát
Ammónium-szulfát
Törzsek
0,02 M-os
0,1 M-os
0,5 M-os
1 M-os
C. albicans 10268
28
33
40
54
C. albicans 10268
41
69
64
70
C. albicans 10268
51
61
63
79
C. albicans 10268
51
76
73
77
C. albicans 14738
16
28
29
36
C. albicans 14738
31
42
51
56
C. albicans 14738
37
42
47
61
C. krusei 10844
60
85
87
94
C. krusei 10844
69
86
90
94
C. krusei 10844
49
80
87
94
C. krusei 13356
68
82
88
90
C. krusei 13356
54
79
81
88
C. krusei 13356
56
83
77
88
C. inconspicua 10308
91
97
96
97
C. inconspicua 10308
97
99
98
99
C. inconspicua 10308
90
96
96
99
C. inconspicua 11825
76
85
92
92
C. inconspicua 11825
60
85
87
88
C. inconspicua 11825
46
85
89
90
52
6.3. Alkálifémeksók hatása a C. albicans szaporodására és virulencia-faktoraira Vizsgáltuk
a
nátrium-klorid,
kálium-klorid,
és
lítium-klorid
különbözo
koncentrációinak hatását egy flukonazol-érzékeny vad törzs, és egy flukonazolrezisztens laboratóriumi mutáns szaporodási hozamára, csíratömloképzésére és hidrokarbon adherenciájára. A két törzs növekedésének magas nátrium, kálium és litium koncentrációk jelenlétében mutatott gátlását szemlélteti a IX. táblázat.
IX. táblázat
NaCl, KCl és LiCl alkálifémsók hatása C. albicans FR és ATCC 38247 törzsek szaporodási hozamára
Gátló koncentráció (%) KCl FR ATCC LiCl 38247 0.5M 13.7 9.5 0.0625M
13.1
ATCC 38247 28.5
NaCl
FR
0.5M
16.5
ATCC 38247 8.9
FR
1.0M
29.6
19.4
1.0M
22.6
22.7
0.125M
27.9
31.8
1.5M
37.8
34.9
1.5M
29.8
27.3
0.25M
44.3
45.6
2.0M
49.3
44.8
2.0M
34.3
36.9
0.5M
72.9
71.3
P értékeket Student- féle t-próbával számítottunk (P<5%). Mindkét törzs növekedését koncentrációtól függo módon gátolta mindhárom alkálifém. Adott nátrium-, kálium- vagy litium-klorid-koncentráció gátló hatása a két törzs esetében hasonló volt. Amint az várható volt, a három alkálifém közül a litium mutatta a legerosebb gátló hatást a C. albicans növekedésére. A litium sejt-toxicitása szakirodalomból ismert tény, és az az RNS-anyagcsere enzimeinek a gátlásának és/vagy energetikai megszorításoknak a következménye [32, 111]. A X. táblázat mutatja, hogy az alkálifémsókkal történt eloinkubálás szignifikáns mértékben csökkenti a sejtek csíratömlo-képzo tulajdonságát.
53
X. táblázat
Alkálifémsókkal történt preinkubálás hatása C. albicans FR és ATCC 38247 törzsek csíratömlo-képzo tulajdonságára
Kontroll NaCl (1.5M) KCl (2M) LiCl (0.25M)
C. albicans FR % csíratömlo % csíratömlo (1.5 h) (3 h) 53.3 83.1 ** 8.1 9.4** ** 16.9 18.5** ** 16.4 13.6**
C. albicans ATCC 38247 % csíratömlo % csíratömlo (1.5 h) (3 h) 97.8 98.2 * 95.1 97.0 91.0** 97.5 ** 88.9 98.5
A P értékeket a Student t-teszt alapján számoltuk ki (*P<1%; **P<0,1%).
Ez a gátló hatás a két vizsgált Candida-törzs esetében eltéronek bizonyult. Az flukonazol-rezisztens törzs esetében a csíratömlok számának szignifikáns (P<0,1%) csökkenését észleltük, még 3 órával a csíraképzodést követoen is. Az ATCC 38247 törzs esetében azonban a gátlás csak 1,5 óra után volt szignifikáns. A csíratömloképzodés 3. órájában nem volt különbség a kontroll és a kezelt sejtek között. A
sejtek
eloinkubálásához
alkalmazott
valamennyi
alkálifémsó
koncentrációkban gátolta mindkét törzs adhézióját (XI. táblázat).
54
a
vizsgált
XI. táblázat
Alkálifémsókkal történt preinkubálás hatása C. albicans FR és ATCC törzsek adhéziójára
C. albicans
C. albicans
FR
ATCC 38247
(A640 nm /g)
(A640 nm /g)
Kontroll
30.9
39.9
NaCl (1.5M)
28.5
33.3*
KCl (2M)
23.3**
27.7***
LiCl (0.25M)
13.9***
25.3***
A P értékeket a Student t-teszt alapján számoltuk ki (*P<5%; ** P<1%; ***P<0,1%).
Litium fejtette ki a legerosebb, míg a nátrium a leggyengébb gátló hatást mindkét C. albicans törzs adhéziója esetében. A 4. ábra mutatja, hogy alkálifémeket tartalmazó YPG tápközegben történo preinkubálást követoen mindkét törzs sejtjeinek sejtfelszíni hidrofóbicitása csökken.
55
4. ábra
Élesztosejtek affinitása hexadekán irányába a szénhidrogén térfogatának a függvényében FR (A) és ATCC 38247 (B) törzsek esetében
110
% abszorbció
100 90 80 70 60 0
0,2
0,4
0,6
ml hexadekán
A Az eredményeket a vizes szuszpenzió kezdeti abszorbciójának (?=600 nm) százalékában fejeztük ki a szénhidrogén térfogatának a függvényében.
110
% abszorbció
100 90 80 70 60 0
0,2
0,4
0,6
ml hexadekán
B Kontroll: - ? -
NaCl: - ¦ -
56
KCl: - ? -
LiCl: - ? -
7. MEGBESZÉLÉS A malignus hematológiai elváltozásokban szenvedo betegekben jelentkezo súlyos, opportunista gombafertozések elofordulási aránya drámai módon emelkedett az elmúlt 20 évben. Neutropéniás betegekben, ezek a fertozések a morbiditás és mortalitás fo okai. A malignus hematológiai betegségekben szenvedo betegeknél eloforduló mycosisok 20-40%-a disszeminált, és több mint 70%-uk fatális következményekkel jár [70, 128]. Az immunszupresszív terápiában részesülo és szervtranszplantáción átesett betegeknél a candidiasis és aspergillosis a leggyakoribb gombás fertozések [159, 161]. Ezek a fertozések különösen súlyos problémát okoznak ossejt-transzplantált recipienseknél. A malignitás miatt csak szokásos dózisú kemoterápiás kezelésben részesülo betegeknél az immunfunkciók sokkal gyorsabb helyreállása figyelheto meg, ezért
az
ilyen
betegeknél
kisebb
valószínuséggel
lépnek
fel
opportunista
gombafertozések. Ezzel szemben, a csontvelo-transzplantált betegek csaknem teljesen immunszupresszáltak lehetnek a transzplantációt követoen több, mint egy évig, részben a limfocitafunkciók késleltetett helyreállása, részben a graft versus host betegség megelozését célzó tartós gyógyszeres kezelés miatt. Ennél a betegcsoportnál még mindig a fertozés a vezeto halálok. A nyál minosége, mennyisége és annak összetevoi kulcsfontosságú szerepet játszanak a szájüregben
található
élesztosejt-populáció
szabályozásában.
A
nyál
átmosó
funkciójának kiesése és a nyál antifungális komponenseinek, például a laktoferrin és lizozim hiánya szolgálhat magyarázatul arra, hogy a xerostomiás betegeknél emelkedik az orális gombahordozás és a gombás fertozések aránya [86]. Az általunk kapott eredmények összhangban vannak Arendorf és mtsai. [2] felvetésével, miszerint a dohányzás lokalizált epitheliális elváltozásokat okoz, amelyek lehetové teszik a candida kolonizációt. Leírták, hogy a dohányzás jelentos mértékben, 30-70%kal növelte a candida hordozóállapotot. A dohányzás és a Candida kolonizáció közti összefüggés különös jelentosséggel bír, mivel a kérdéses enzimrendszer fokozhatja a szénhidrogének karcinogén aktivitását.
57
Valószinu, hogy a füst, a nikotin és a kátrány az állandó irritációval és mikrosérülésekkel exponálja a candida-köto szöveti receptorokat, s ez hozzájárul a nagyobb arányú kolonizációhoz és hordozáshoz. Az SCT betegekben, a Candida fajoktól eltéro gombák (Aspergillus) által okozott gombakolonizáció is emelkedett [156]. A candida hordozóállapot és a nyelv felszínén mérheto pH közti összefüggést igazolja az a megfigyelés, miszerint a gombahordozás savas nyál esetében magasabb [3, 59]. Bár a transzplantációt követoen, a fokozott kontaminációs veszély miatt a nyálszekréció mérésére nem volt mód, a tény, hogy közvetlenül a ossejt-átültetést megelozoen a betegek
56%-a
xerostomiára
panaszkodott,
és
a
betegek
35%-a
esetében
hiposzalivációt, 41%-a esetében csökkent nyálszekréciót mértünk, a malignus betegségekkel járó fontos faktorra utal, azaz arra, hogy maga a betegség vezethet hiposzalivációhoz és a szájszárazság szubjektív érzéséhez. Ismert, hogy a xerostomia és a nyálmirigyek csökkent muködése csaknem elkerülhetetlenül elofordul olyan betegeknél, akik nyálmirigyei, fej- vagy nyaktumor miatt kaptak sugárkezelést , vagy akik teljes test besugárzásnak lettek kitéve [150]. A nyálszekréció csökkenése gyors szuvasodáshoz, mucositishez, nyelési nehézséghez és fokozott fertozésveszélyhez vezet magával a betegséggel összefüggésben, még az SCT kezelést megelozoen, és a terápia megkezdésével a tünetek súlyos formában nyilvánulhatnak meg. A flukonazol antifungális profilaxis sikeresnek bizonyult az SCT kezelési periódusban, hiszen a kolonizáció csökkent, de több figyelmet kell fordítanunk nem csupán az ilyen betegek szájhygiénéjére, hanem a nyálszekréció helyreállítására is, már az SCT-kezelést megelozoen. A C. inconspicua klinikai izolátumok 20%-ban tértek el a referenciatörzstol, de egymással teljesen megegyezo mintázatúak voltak. Ez megerosíti, hogy az izolátumok C. inconspicua specieshez, és ugyanahhoz a törzshöz tartoznak. E-teszt alkalmazásával meghatároztuk a C. inconspicua izolátumok flukonazolérzékenységét. A 10308, 10310 és 10312 jelzésu izolátumok MIC flukonazol értékei =256 ? g/ml, =256 ? g/ml, illetve = 256 ? g/ml voltak. Ezek a MIC flukonazol értékek egybevágnak korábbi vizsgálatok eredményeivel, amelyek szerint a flukonazolrezisztencia a C. inconspicua törzsek belso tulajdonsága [4, 169], és magyarázatul szolgálnak a flukonazol elokezelés sikertelenségére az adott esetben.
58
Bár a fenti gomba izolátumok kóroki szerepét nehéz megítélni ezekben a betegekben, hiszen valamennyien súlyos alapbetegségben szenvednek, közülük nyolc, három speciesbe (C. albicans, C. krusei és C. inconspicua) sorolható Candida izolátumot tekintettünk potenciális kórokozónak (V. sz. táblázat). Ismeretes, hogy patogén gombák, közülük Candida speciesek, különbözo hidrolitikus enzimeket, például proteázokat, foszfolipázokat és lipázokat termelnek [114]. Ezek az enzimek szerepet játszhatnak a fertozés eloidézésében azáltal, hogy roncsolják sejtmembránokat és extracelluláris mátrixot a gazdaszervezetben, ezáltal elosegítik a fertozés szóródását és a szövetek invázióját. A C. albicans által termelt, a patogenitásban lényeges szerepet játszó enzimeket két fo csoportba, proteázok és foszfolipázok közé soroljuk [50]. A szakirodalomban nem találtunk adatot arra vonatkozólag, hogy az újonnan felismert gomba patogén, a C. inconspicua esetében is jelen vannak-e ilyen enzimek, és azok szerepet játszhatnak-e a fertozés létrehozásában. Meghatároztuk tehát az oropharyngeális C. inconspicua izolátumok extracelluláris proteáz és foszfolipáz (lipáz) aktivitását, és azt csontvelo transzplantált betegekbol izolált oropharyngeális C. albicans és C. krusei izolátumok hasonló enzimaktivitási értékeivel hasonlítottuk össze. Ezek az enzimek szerepet játszhatnak figyelem központjába újabban került Candida speciesek patogenitásában is. Bor és nyálkahártya fertozések, valamint intravénás fertozést okozó disszeminált candidiasis modelljeiben kimutatták, hogy a csíratömlok hozzájárulnak a virulenciához [76,152]. A sejtfelszíni hidrofóbicitásnak központi szerepe van a C. albicans opportunista
fungális
patogén
patomechanizmusában.
Hidrofil
sejtekkel
összehasonlítva, a hidrofób sejtek ellenállóbbnak tunnek a fagociták által történo öléssel szemben, és egérben virulensebbek [129, 143].
Ez a megfigyelés jól egyezik Gorga és munkatársai eredményeivel [58]. Kísérleteikben a tengervízben az élesztosejtek felszíni hidrofóbicitása a 16. naptól fokozatosan csökkent, a csökkenés folytatódott 32 napon keresztül. Következtetéseik szerint a sejtfelszíni hidrofóbicitás változása éhezésnek vagy magas nátrium-koncentrációnak tudható be. Kísérleteinkben komplex tápközeget alkalmaztunk a sejtek preinkubálásához, így a sejtfelszíni hidrofóbicitás változása csak az alkálifémek magas koncentrációjával volt okozati összefüggésben.
59
Következtetéseink szerint alkálifémek magas koncentrációja gátló hatással volt Candida-sejtek szaporodására, és alkálifémek jelenlétében történt preinkubálás negatív hatással volt az általunk vizsgált minden virulencia-faktorra (csírázóképesség, adherencia képessége és sejtfelszíni hidrofóbicitás). Kiemeljük, hogy az eloinkubálás alatt indukált változások fennmaradtak akkor is, amikor a magas koncentrációjú alkálifémsókat eltávolítottuk a sejtszuszpenzióból. Érdemes továbbá megjegyezni, hogy még a nátriumklorid és kálium-klorid nagyon magas koncentrációja mellett is észleltük a Candidasejtek számottevo szaporodását. Eredményeink azt is mutatták, hogy bár az alkálifémsók szignifikáns mértékben csökkentették a gomba bizonyos virulencia-tulajdonságait, nem tudták teljes mértékben gátolni sem a sejtek adhéziós képességét, sem csíratömloképzodési potenciálját. A C. albicans élesztogomba gazdaszövetekhez és akrilát felszínekhez történo adhéziója fontos lépés a sikeres kolonizálás irányába [27, 75, 102], ennek gátlására számos antifungális hatású szert kipróbáltak, melyek hatásosak lehetnek a gombák akrilát felszínhez történo adhéziójának megelozosében, valamint az eltávolításukban [101, 163, 166]. Ennek megfeleloen, a magas sókoncentrációk ellenére, ilyen környezetben a Candida-sejtek egészségügyi kockázatot jelenthetnek. A fogpótlások magas koncentrációjú sóoldatban tartása csökkentheti a gombák letapadását és elszaporodását. A vizsgálatunkból az derült ki, hogy a gombák szaporodását legjobban a LiCl gátolta. Mivel a LiCl sejttoxikus, ezért ezt a gyakorlatban nem tudjuk használni, de a NaCl-t, ami kisebb mértékben, de gátolja úgyszintén a gombák szaporodását jól lehetne alkalmazni teljes lemezes fogpótlást viseloknél.
60
8. Az értekezés új megállapításai ?
Az ossejt-átültetés folyamán alkalmazott flukonazol-profilaxis szignifikánsan csökkentette a C. albicans kolonizációs gyakoriságát. Ugyanakkor lehetové tette más, flukonazol-rezisztens candida faj megtelepedését a szájüregben.
?
Dohányzó betegekben több, mint kétszer gyakoribb az oropharyngealis candida kolonizáció és hordozás, mint a nem dohányzóknál. Csak a felnott betegeket vizsgálva a candida koloizáció gyakorisága 40 %-kal nagyobb a dohányzó csoportban.
?
Az API candida identifikáló rendszerében az ID 32 panelben az eszkulin-teszt nem érzékeny annyira, hogy határozottan elkülönítse a C. norvegensis faj törzseit a C. inconspicua faj törzseitol. Megbízható elkülönítés a riboszomális DNS-szekvenciák PCR-amplifikált géntermékeinek RFLP mintázata alapján, vagyis molekuláris genetikai taxonómiai vizsgálattal lehetséges.
?
A flukonazol-rezisztencia a C. inconspicua belso tulajdonsága és ez magyarázatul szolgál a flukonazol elokezelés sikertelenségére.
?
A Magyarországon általunk elsokként izolált és molekuláris genetikai módszerekkel
azonosított
C.
inconspicua
törzsek
hidrofóbicitásuk,
extracelluláris proteáz- és lipáztermelésük mértéke alapján virulenciájukat tekintve a C. albicans és a C. krusei között helyezkednek el. ?
A flukonazol fél, negyed és nyolcad minimális gátló koncentrációban megváltoztatja a C. albicans, C. krusei és C. inconspicua sejtfelszini hidrofóbicitását.
61
Rövidítések jegyzéke: AML ALL ATCC ATG BEAM BSA Bu+Cy CML Cy DBM dNTP FR G-CSF GM-CSF GvHD HEPA HhaI HIC HIV HRPs ID 32C IL-11 ITS MOPS NCCLS NHL PCR RAPD RFLP SCT SDA TBE-puffer TBI TGF-béta VOD YPG
acut myeloid leukemia acut lymphoid leukemia American Tissue Cell Collection anti-tymocyta globulin carmustine, etoposide, cytarabine, melphalan borjú szérum albumin busulphan+cyclophosphamide chronicus myeloid leukemia cyclophosphamide dibromannitol nukleotid-tri- foszfát flukonazol rezisztens granulocyta kolónia stimuláló faktor granulocyta-makrofág stimuláló faktor graft versus host disease high efficiency particulate air restrikciós endonukleáz hidrofób interakciós kromatográfia human immundeficiencia vírus histidine rich polypeptides identifikáló rendszer 32 kémiai elemmel interleukin-11 internal transscribed spacer 3(N-morfolino)propan-szulfonsav Natio nal Committee for Clinical Laboratory Standards non-Hodgkin lymphoma polimerase chain reaction random amplifikált polimorf DNS restrikciós fragmentumhossz polimorfizmus stem cell transplant Sabouraud dextróz agar tris-bórsav+EDTA puffer teljes test besugárzás T-cell growth factor veno-occlusive májbetegség gombát, peptont és glükózt tartalmazó tápfolyadék
62
Az értekezés alapját képezo közlemények és eloadások I. Cs. Dombi, T. Vörös-Balog, P. Hermann, Á. Czeglédy, N. Vincze, J. Bánóczy.: Risk group of oral precancer attached to X-ray lung-screening examination Community Dent. Oral Epidemiol.; (2001) 29: 9-13. IF: 1,35 II. P. Hermann, Zs. Berek, G. Nagy, K. Kamotsay, F. Rozgonyi: Pathogenesis, microbiological and clinical aspects of oral candidiasis (candidosis) (A Review) Acta Microbiol. et Immunol. Hun. (2001) 48 (3-4), pp 479-495. III. Hermann P., Berek Zs., Nagy G., Kamotsay K., Rozgonyi F.: Az oralis candidiasis(candidosis) molekuláris patogenezise Orv. Hetil. (2001) 142. 2621-2625. IV. Hermann P., Berek Zs., Kamotsay K., Nagy G., Rozgonyi F.: Az orális candidiasis (candidosis) klinikai mikrobiológiai és terápiás vonatkozásai Orv. Hetil. (2001) 142. 2667-2671. V. Márton K., Boros I., Lesti A., Hermann P., Faluhelyi P., Fejérdy P.: A kevert- és a palatinális nyálszekréció vizsgálata teljes fogpótlást viselo egészséges és Sjögren-szindrómában szenvedo személyeken Fogorvosi Szemle (2002) 95. 67-71. VI/a Hermann P., Márton K., Forgács K., Gál E., Lenkey B., Rozgonyi F.: Alkálifémek hatásának vizsgálata Candida albicans né hány, virulenciával összefüggo tulajdonságára Fogorvosi Szemle (2003) 96. 61-64. VI/b P. Hermann, K. Forgács, E. Gál, B. Lenkey, G. Nagy, F. Rozgonyi.: Effects of Alkali Metal Ions on Some Virulence Traits of Candida albicans Folia Microbiol. (2003) 48 (2), 173-176 IF: 0,976 VII. P. Hermann, K. Forgács, L. Majoros, Á. Gyetvai, A. Maráz, F. Rozgonyi Identification of oropharyngeal Candida inconspicua isolates from bone marrow transplanted (BMT) patients and investigation of their extracellular virulence factors Mycoses (lektori vélemény alapján átdolgozás alatt) VIII. P. Hermann, Zs. Berek, G. Kriván, K. Márton and A. Lengyel Incidence of oropharyngeal candidosis in stem cell transplant (SCT) patients Acta Microbiol. et Immunol. Hun. (elfogadva)
63
Idézheto absztraktok IX. P. Hermann, G. Kriván, T. Masszi, Zs. Berek, T. Vörös-Balog, G. Nagy, F. Rozgonyi: Evaluation of fungal colonization of the oral cavity before and after stem cell transplantation (SCT) in the context of basal saliva secretion 27 th Annual Meeting European Group for Blood and Marrow Transplantation Maastricht, The Netherlands, March 25-28, 2001. Blood Marrow Transplantation (2001) 27, p337 (Abstract) IF: 2,55 X. P. Hermann, K. Márton, G. Kriván, T. Masszi, Zs. Berek, G. Nagy, F. Rozgonyi: Investigation of fungal colonization related to saliva secretion in stem cell transplant patients 80-th general Session and Exhibition of the International Association for Dental Research. 2002. március 5-9. San Diego J Dent Res 81 (Spec Iss A) 2002. A-284 P. Nr. 2221 IF: 3,35 XI. G. Nagy, P. Hermann, M. Madléna, P. Fejérdy, B. Lenkey: Effects of Alkali Metals on Candida albicans 80-th general Session and Exhibition of the International Association for Dental Research. 2002. március 5-9. San Diego J Dent Res 81 (Spec Iss A) 2002. A-284 P. Nr. 2226 IF: 3,35 XXV. K. Márton, P. Hermann, K. Dankó, P. Fejérdy, M. Madléna and G. Nagy: Evaluation of oral Manifestations in Patienst with Polymyositis and Dermatomyositis 81-th general Session and Exhibition of the International Association for Dental Research. 2003. június 25-28. Göteborg, Svédország J Dent Res 82 (Spec Iss B) 2003. B-299 P. Nr. 2304 IF: 3,35 XII. Hermann P., Forgács K., Majoros L., Gyetvai Á., Rozgonyi F.: Investigation of antifungal resistance and extracellular virulence factors of oropharyngeal Candida norvegensis isolates from bone marrow transplanted (BMT) patients 4-th European Congress of Chemotherapy and Infection Párizs 2002. május 4-7. International Journal of Antimicrobial Agents Volume 19, Supplement 1 (2002) S76 IF: 1,141 XIII. P. Hermann, K. Márton, G. Kriván, K. Forgács, L. Majoros, F. Rozgonyi: Correlation between antifungal resistance and extracellular virulence factors of oropharyngeal Candida norvegensis isolates from bone marrow transplant (BMT) patients 81-th general Session and Exhibition of the International Association for Dental Research. 2003. június 25-28. Göteborg, Svédország J Dent Res 82 (Spec Iss B) 2003. B-299 P. Nr. 2306 IF: 3,35
64
XIV. P. Hermann, G. Kriván, K. Forgács, L. Majoros, Á. Gyetvai, F. Rozgonyi, T. Masszi: Correlation between antifungal resistance and extracellular virulence factors of oropharyngeal Candida norvegensis isolates from stem cell transplant patients 29 th Annual Meeting European Group for Blood and Marrow Transplantation Istanbul, Turkey, July 20-23, 2003. Bone Marrow Transplantation Volume 31, Supplement 1. #673, S186 IF: 2.554
Eloadások
XV. Hermann P., Rozgonyi F. és Berek Zs.: Az oralis candidiasis klinikai vonatkozásai Jubileumi Árkövy kongresszus Budapest. (1998) XVI. Vörös-Balog T., Hermann P., Dombi Cs., Bánóczy J.: A nyál sreptococcus mutans és lactobacillus számának meghatározására alkalmas új módszer Magyar Fogorvosok Egyesülete Fogpótlástani Társaságának XIII. és a Magyar Parodontológiai Társaság XI. Kongresszusa Pécs (1999) XVII. Rozgonyi F., Csukás Zs., Berkes Zs., Kamotsay K., Hermann P.: Szisztémás gombafertozések gyakorisága, patogenezise, laboratóriumi diagnosztikája és terápiás lehetoségei immunszuppresszált betegekben. Magyar Infectológiai Társaság Vándorgyulése, Debrecen (1999) XVIII. Hermann P., Berek Zs., Vörös-Balog T., Nagy G., Rozgonyi F.: Csontvelo-transzplantált betegek szájüregi vizsgálatának klinikai és mikrobiológiai értékelése. Szegedi tudományos továbbképzo konferencia és fogorvos találkozó. Szeged (2000) XIX. Márton K., Hermann P., Nagy G., Nemes K.: Oralis candidiasis kialakulása és terápiája szisztémás immunrendszeri betegségekben. Szegedi tudományos továbbképzo konferencia és fogorvos találkozó. Szeged (2000) XX. Márton K., Lesti A., Fejérdy P., Hermann P., Faluhelyi P., Boros I.: Teljes nyugalmi nyálszekréció és palatinális nyálszekréció vizsgálata teljes fogpótlást viselo egészséges és Sjögren-szindrómában szenvedo betegeken. Szegedi tudományos továbbképzo konferencia és fogorvos találkozó. Szeged (2001)
65
XXI. Hermann P., Kriván G., Masszi T., Berek Zs., Márton K., Nagy G., Rozgonyi F.: Csontvelotranszplantált betegek szájüregi gombás fertozésének és nyugalmi nyálszekréciójának összehasonlító értékelése Szegedi tudományos továbbképzo konferencia és fogorvos találkozó. Szeged (2001) XXII. Hermann P., Kriván G., Masszi T., Berek Zs., Márton K., Nagy G., Rozgonyi F.: Az orális mikroflóra és a dentális státusz értékelése csontvelo-transzplantált betegeknél. Az MFE Fogpótlástani Társaságának XIV. a Magyar Fogorvosok Implantológiai Társaságának IV., és a Magyar Parodontológiai Társaság XII. Kongresszusa. Debrecen (2001) XXIII. Márton K., Hermann P., Dankó K., Somogyi E., Fejérdy P., Nagy G.: Izomero mérése polymyositisben és dermatomyositisben szenvedo betegeken Az MFE Fogpótlástani Társaságának XIV. a Magyar Fogorvosok Implantológiai Társaságának IV., és a Magyar Parodontológiai Társaság XII. Kongresszusa. Debrecen (2001) XXIV. K. Marton, P. Hermann, J. Kovacs, K. Danko, P. Fejerdy, G. Nagy: Clinical oral investigation in patients with polymyositis and dermatomyositis FDI World Dental Congress (2002) XXV. Hermann P. Márton K.,Kriván G. Berek Zs., Forgács K.,Nagy G., Rozgonyi F.: Csontvelotranszplantált betegek fogászati státusának és orális mikroflórájának értékelése MFE FDI-Árkövy Vándorgyulés (2002) XXVI. Márton K., Hermann P., Kovács J., Dankó K., Fejérdy P., Nagy G.: Polyomyositises és dermatomyositises betegek orális klinikai vizsgálata MFE FDI-Árkövy Vándorgyulés (2002)
66
Irodalomjegyzék 1.
Abi-Said D, Anaissie E, Uzun, O et al.: The epidemiology of hematogenous candidiasis caused by different Candida species. Clin Infect Dis 1997; 24: 1122-1128
2.
Arendorf, T.M. and Walker, D.M.: Oral Candidal Population in Health and Disease. Br Dent J 1979;147, 267-272
3.
Arendorf, T.M., Walker, D.M.: The Prevalence and Intra Oral Distribution of Candida albicans in Man. Arch Oral Biol 1980; 25, 1-10
4.
Baily, G.G., Moore, C.B., Essayag, ,S.M., deWit, S., Burnie, J.P. ? Denning, D.W. Candida inconspicua, a fluconazole-resistant pathogen in patients with human immunodeficiency virus. Clin Infect Dis 1997; 25, 161-163
5.
Baleiras Couto, M.M., Eijsma, B., Hofstra, H., Huis In’t Veld, J.H.J. & van der Vossen, J.M.B.M. Evaluation of molecular typing techniques to assign genetic diversity among Saccharomyces cerevisieae strain. Appl Environ Microbiol 1996; 62, 41-46
6.
Banerjee, SN, Emori, TG, Culver, DH et al.: Secular trends in nosocomial primary bloodstream infections in the United States, 1980-1989. Am J Med 1991; 91 (Suppl 3B):3SB86-89.
7.
Bánóczy, J., Csiba, Á.: Szájüregi leukoplakiák klinikai képének és kórszövettani szerkezetének összehasonlító vizsgálata. Fogorv. Szle. 1970; 63, 63-65
8.
Bánóczy, J.: A szájüregi praecancerosisok új osztályozása. Fogorv. Szle. 1985; 78, 22-25
9.
Bánóczy, J.: Follow-up Studies in Oral Leukoplakia. J Maxillofac Surg 1977; 5, 69-74
10.
Bánóczy, J.; A leukoplakia. Fogorv. Szle. 1980; 73, 1-6
11.
Barlow, A.J.E., Chattaway, F.W.: Observations on the Carriers of Candida albicans in Man. Br J Dermatol 1969; 81, 103-110
67
12.
Bodet, C.A., Jorgensen, J.H., Drutz, D.J.: Antibacterial activities of antineoplastic agents. Antimicrob. Agents Chemother. 1985; 28, 437-439
13.
Bodey, G.P.: Candidiasis – pathogenesis, diagnosis and treatment. 2. kiadás. Raven Press, New York 1994
14.
Bonde G.J.: Bacterial indicators of water pollution. Adv Aquat Microbiol 1977; 1: 273-364
15.
Bouchara, J. , Tronchin, G., Annaix, V., et al: Laminin receptors on Candida albicans germ tubes. Infect Immun 1990; 58, 48-52
16.
Brassart, D., Woltz, A., Golliard, M., et al: In vitro inhibition of adhesion of Candida albicans clinical isolates to human buccal epithelial cells by Fuc? ? 2Gal? -bearing complex carbohydrates. Infect Immun 1991; 59, 1605-1628
17.
Brisou, J.: Yeasts and fungi in marine environments. Bull Soc Fr Mycol Med 1975; 4: 159-162
18.
Brown, L.R.; Dreizen, S.; Handlers, S.et al: The effect of radiation-induced xerostomia on saliva and serum lysozym and immunglobulin levels. J Dent Res 1975; 54, 740-750
19.
Brown, L.R.S., Dreizen, T.E., Daly, J.B., Drane, S., Handler, L.J., Riggan, R. M. and Johnston D.A.: Interrelations of oral microorganisms immunoglobulins and dental caries following radiotherapy. J Dent Res 1978; 57, 882-893
20.
Budtz-Jorgensen, E.: Candida-Associated Denture Stomatitis and Angular Cheilitis. In: Oral Candidosis 1990; Butterworth
21.
Budtz-Jorgensen, E.: The Significance of Candida albicans in Denture Stomatitis Scand. J Dent Res 1974; 82, 151-161
22.
Calderone, R..: Molecular interactions at the interface of Candida albicans and host cells. Arch Med Res 1993; 24, 275-279
23.
Cawson, R.A., Binnie, W.H.: Candida Leukoplakia and Carcinoma. A Possible Relationship. University of Iowa Press 1980; 59-63
68
24.
Cawson, R.A.: Chronic Oral Candidosis. Denture Stomatitis and Chronic Hyperplastic Candidosis. E&S Livingstone 1966; p.139-152
25.
Chen, K.Y., and G.H. Fletcher.: Malignant tumours of nasopharynx. Radiology 1971;99, 165-171
26.
Critchley, I.A., Douglas, L.: Role of glycosides as epithelial cell receptors for Candida albicans. J Gen Microbiol 1987; 133, 637-641
27.
Cutler, J.E.: Putative virulence factors of Candida albicans. Annu Rev Microbiol 1991; 45: 187-218
28.
D’Antonio, D., Violante, B., Mazzoni, A. et al. A nosocomial cluster of C. inconspicua infections in patients with hematological malignancies. J Clin Microbiol 1998; 36, 792-795
29.
Daniels, T.E., Schwartz 0., Larsen, V., D és mtsai.: Langerhans Cells in Candidal Leukoplakia. J Oral Pathol 1985; 14, 733-738
30.
Davenport, J.C.: The Oral Distribution of Candida in Denture Stomatitis. Br Dent J 1970; 129, 151-160
31.
Denning DW, Baily GG, Hood SV: Azole resistance in Candid. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1997; 16, 261-280
32.
Dichtl B., Stevens A., Tollervey D.: Lithium toxicity in yeast is due to the inhibition of RNA processing enzymes. EMBO J 1997; 16, 7184-7195
33.
Dictar, M.O., Maiolo, E., Alexander, B., Jacob, N. & Veron, M.T. (2000) Mycoses in the transplanted patient. Med Mycol 2000; 38 Suppl 1, 251-258
34.
Dorko, E., Pilipcinec, E., Tkacikova, L.: Candida species isolated from cerebrospinal fluid. Folia Microbiol 2002; 47, 179-181
35.
Dupont, B.: Clinical manifestations and management of candidosis in the compromised patient. In Fungal Infection in the Compromised Patient. 2nd ed. (Warnock DW&Richardson MD, Eds, John Wiley, Chichester) 1992; 5583
36.
Ehninger, G., Schuler, H.K., Sarnow, E.: Fluconazole in the prophylaxis of fungal infection after bone marrow transplantation. Mycoses 1996; 39, 259-263
69
37.
Eisen, D., Essel, J. & Broun, E.R.: Oral cavity complications of bone marrow transplantation. Semin Cutan Med Surg 1997; 16, 265-272
38.
Ellepola, A.N., Samaranayake, L. : Adhesion of oral Candida albicans isolates to denture acrylic following limited exposure to antifungal agents. Arch Med Res 1998; 43, 999-1003
39.
Ellepola, A.N., Samaranayake, L. : The effect of limited exposure to antimycotics on the relative cell-surface hydrophobicity and the adhesion of oral Candida albicans to buccal epithelial cells. Arch Oral Biol 1998; 43, 879-884
40.
Ellepola, A.N., Samaranayake, L.P.: The in vitro postantifungal effect of nystatin on Candida species of oral origin. J Oral Pathol & Med 1999; 28, 112-116
41.
Epstein, J.: Antifungal Therapy in Oropharyngeal Mycotic Infections. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1990; 69, 32-38
42.
Epstein, J.B., Ransier, A., Lunn, R. et al: Prophylaxis of candidiasis in patients with leukemia and bone marrow transplants. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1996; 87, 291-295
43.
Epstein, JB., Hancock, PJ., Nantel, S.: Oral candidiasis in hematopoietic cell transplantation patients: an outcome-based analysis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2003; 96 (2), 154-63
44.
Evans, T.G., Mayer, J., Cohen, S., és mtsai: Fluconazol Failure in the Treatment of Invasive Mycoses. J. Infect. Dis. 1991; 164, 1232-1239
45.
Fekete-Forgács, K., Gyüre, L., Lenkey, B.: Changes of virulence factors accompanying the phenomenon of induced fluconazole resistance in Candida albicans. Mycoses 2000; 43, 273-279
46.
Fekete-Forgács, K., Jeney, A., Varga, G. & Lenkey, B. Investigation of ? glucosidase as a potential virulence factor of Candida albicans. J Basic Microbiol 2000; 40, 87-92
47.
Filicko, J., Lazarus, H.M., Flomenberg, N.: Mucosal injury in patients undergoing hematopoietic progenitor cell transplantation: new approaches to prophylaxis and treatment. Bone Marrow Transplant 2003; 31,1-10
70
48.
Flynn, P.M., Cunningham, C.K., Kerkering, T., et al.: Oropharyngeal candidiasis in immunocompromised children: a randomized, multicenter study of orally administered fluconazole suspension versus nystatin. J Pediatr 1995; 127, 322-328
49.
Forgács, K. A flukonazol-rezisztencia kialakulását követo morfológiai, fiziológiai változások vizsgálata Candida albicansban. Doktori értekezés tézisei, Debrecen 2000.
50.
Fu, Y., Ibrahim, A.S., Fonzi, W., Zhou, X., Ramos, C.F. & Ghannoum, M.A: Cloning and characterization of a gene (LIP1) which encodes a lipase from the pathogenic yeast Candida albicans. Microbiology 1997; 143, 331-340
51.
Gábris K., Nagy G., Madléna M., Dénes Zs., Márton S., Keszthelyi G., Bánóczy J.: Association between Microbiological and salivary caries activity tests and caries experience in Hungarian adolescents. Caries Res 1999; 33: 191-195
52.
Gábris, K., Nagy, G., Madléna, M., Dénes, Zs., Márton, S., Keszthelyi, G., Bánóczy, J.: Serdülokorúak fogazati állapotának és a nyál mikrobiológiai vizsgálati eredményeinek összefüggései Fogorv Szle 1998; 91: 374-382
53.
Gergely L.: Orvosi mikrobiológia Semmelweis Kiadó, Budapest, 2003, 492-510
54.
Ghannoum, M.A. & Abu-Elteen, K.H. Correlative relationship between proteinase production, adherence and pathogenecity of various strains of Candida albicans. J Med Vet Mycol 1986; 24, 407-413
55.
Ghinsberg R.C., Bar Dov L., Rogol M., Sheinberg Y., Nitzan Y.: Monitoring of selected bacteria and fungi in sand and sea water along Tel Aviv coast. Microbios 1994; 77, 29-40
56.
Goodman, JL., Winston, D.J., Greenfield, R.A. et al.: A controlled trial of fluconazole to prevent fungal infections in patients undergoing bone marrow transplantation. N Engl J Med 1992; 326, 845-851
57.
Goodrich, JM., Reed, E.C., Mori, M. et al.: Clinical features and analysis of risk factors for invasive candidal infection after marrow transplantation. J Infect Dis 1991; 164, 731-740
71
58.
Gorga, F., Galdiero, E., Donnarumma, G.. Salerno, G., De Martino, L.: Ultrastructural and biochemical studies on Candida albicans after prolonged incubation in sea water. FEMS Microbiol Lett 1996; 145, 167-172
59.
Guggenhe imer, J., Moore, PA.: Xerostomia: etiology, recognition and treatment. J Am Dent Assoc 2003; 134 (1), 61-9 ; quiz 118-9
60.
Hamilton-Miller, J.M.T.: Antimicrobial activity of 21 antineoplastic agents. Br J Cancer 1984; 49, 269-367
61.
Hay, R.Y.: Overview of Studies of Fluconayole in Oropharyngeal Candidiasis. Revs Infect Dis 1990; 12, 334-341
62.
Heimdahl, A., Mattsson, T., Dahllöf, G. et al.: The oral cavity as a port of entry for early infections in patients treated with bone marrow transplantation. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1989; 68, 711-716
63.
Hill, I.R., P., Porter : Studies of bactericidal activity to Escherichia coli of procine serum and colostral immunglobuline and the role of lysozyme with secretory IgA. Immunology 1974; 26, 1239-1250
64.
Hoffman, C. & Winston, F.: A ten- minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene, 1987; 57, 267-272
65.
Holmes, A.R., Gopal, K. Jenkinson, H.F.: Adherence of Candida albicans to a cell-surface polysaccharide receptor on Streptococcus gordonii. Infect Immun 1995; 63, 1827-1834
66.
Holmstrup, P., Bessermann, M.: Clinical, Therapeutic and Pathogenic Aspects of Chronic Oral Multifocal Candidiasis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1983; 56, 388-394
67.
Hoppe, J.E., Klingebiel, T., Niethammer, D.: Selection of Candida glabrata in pediatric bone marrow transplant recipients receiving fluconazole. Pediatr Hematol Oncol 1994; 11, 207-210
68.
Hostetter, M.K.: Adhesin and ligands involved in the interaction of Candida spp, with epithelial and endothelial surfaces. Clin Microbiol Rev 1994; 7, 29-34
72
69.
Ibrahim, A.S., Mirbod, F., Filler, S.G. et al. Evidence implicating phospholipase as a virulence factor of Candida albicans. Infect Immun 1995; 63, 1993-1998
70.
Jantunen, E., Ruutu, P., Niskanen, L., Volin, L., Parkkali, T., KoukilaKkahkola, P., Ruutu, T.: Incidence and risk factors for invasive fungal infections in allogenic bone marrow transplant recipients. Bone Marrow Transplantation 1997; 19, 801-808
71.
Jautova, J., Viragova, S., Ondrasovic, M., Holoda, E.: Incidence of Candida species isolated from human skins and nails: a survey. Folia Microbiol. 2001; 46, 333-337
72.
Kennedy, M.J.: Adhesion and association mechanisms of Candida albicans. Curr Top Med Mycol 1988; 2, 73-169
73.
Klein, R.S., Harris, C.A., Small, C.B., Moll, B., Lesser, M., Friedland, G.H.: Oral candidiasis in high-risk patients as the initial manifestation of the aquied immunodeficiency syndrome. N Engl J Med 1984; 311, 354-358
74.
Klepser, E.M., Lewis, R.E., Pfaller, A.M.: Therapy of Candida infections: susceptibility testing, resistance and therapeutic options. Ann Pharmacother 1998; 32, 1353-1361
75.
Klotz, S.A., Drutz, D.J., Harrison, J.L., Huppert, M.: Adherence and penetration of vascular endothelium by Candida yeasts. Infect Immun 1983; 42, 374-384
76.
Kretschmar, M., Hube, B., Bertsch, T., Sanglard, D., Merker, R., Schröder, M., Hof, H., Nichterlein, T.: Germ tubes and proteinase activity contribute to virulence of Candida albicans in murine peritonitis. Infect Immun 1999; 67, 6637-6642
77.
Kriván, G., Nikolova, R., Masszi, T. és mtsai: A surveillance vizsgálatok értéke a neutropéniás idoszakban, csontvelo transzplantált betegekben. Magyar Belorv Arch 1995; 48(S1), 25
78.
Kunova, A., Trupl, J., Dluholucky, S. et al.: Use of fluconazole is not associated with a higher incidence of Candida krusei and other non-albicans Candida species. Clin Infect Dis 1995; 21(1), 226-227
79.
Kurtzmann, C., Phaff, H.J.: Molecular taxonomy. in: The Yeasts. Academic Press London, 1987; 63-94
73
80.
Kwon-Chung, K.J., Lehman, D., Good, C. & Magee, P.T.:Genetic evidence for role of extracellular proteinase in virulence of Candida albicans. Sabouraudia 1985; 23, 81-83
81.
Lewis, M., Samaranayake, L.P., Lamey P.: Diagnosis and Treatment of Oral Candidosis. J. Oral Maxillofac Surg 1991; 49, 996-1000
82.
Lodder, J.: The Yeasts. A Taxonomic Study. North Holland 1970; 5-48
83.
Lombardi, G., Di Massimo, A.M., Del Gallo, F., et al: Mechanisms of action of an antigen nonspecific inhibitort factor produced bt human T cells stimulated by MPPs and PPD. Cell Immunol 1986; 98, 434-443
84.
Lopez-Ribot, J.L., Chaffin, W.L.: Binding of the extracellular matrix comnponent entactin to Candida albicans. Infect Immun 1994; 62, 4564-4569
85.
MacDonald, F., Odds, F.C.: Virulence for mice of a proteinase-secreting strain of Candida albicans and a proteinase-deficient mutant. J Gen Microbiol. 1983; 129, 431-436
86.
MacFarlane, T.W.: Ecology and Epidemiology of Candida. In: Oral Candidosis, (L.P. Samaranayake and T.W. MacFalane, Eds.) Wright, London 1990; 33-75
87.
Maródi, L.: Local and systemic host defense mechanisms against Candida: immunopathology of candidal infections. Pediatr Infect Dis J 1997; 16, 795-801
88.
Marr, KA., Seidel, K., Slavin, M.A. et al.: Prolonged fluconazole prophylaxis is associated with persistent protection against candidiasis-related death in allogeneic marrow transplant recipients: long-term follow-up of a randomized, placebo-contolled trial. Blood 2000; 96, 2055-2061
89.
Marr, KA., White, TC., van Burik, J.-A.H. et al.: Development of fluconazole resistance in Candida albicans causing disseminated infection in a patient undergoing marrow transplantation. Clin Infect Dis 1997; 25 , 908-910
90.
Marson, L., Heremans, J. F.: Lactoferrin in milk from different species. Com Biochem Physiol 1971; 39, 119-125
91.
Mason, A.P.P., Weber, J.C.P., Willoughby, J.M.T.: Oral Carríage of Candída albícans, ABO Blood Groups and Secretor Status in Healthy Subjects. J Med Vet Mycol 1988; 26, 49-53
74
92.
Masszi T.: Transzplantáció hemopoetikus ossejtekkel: Egy új program elindításának tapasztalatai a szent László Kórházban (1993-2000) Doktori Értekezés. Budapest, 2000
93.
Mates, A.: Quantitative determination of Candida albicans in sea water. Microbios 1994; 78, 27-30
94.
McDonald, F. & Odds, F.C.: Virulence for mice of a proteinase-secreting strain of Candida albicans and a proteinase-deficient mutant. J Gen Microbiol. 1983; 129, 431-438
95.
McGoven, J.J., Parrott, R.H., Emmous, C.W., és mtsai: The Effect of Aureomycin and Chloramphenicol on the Fungal and Bacterial Flora of Chil dr.en. N Engl J Med 1953; 10, 297-301
96.
Meunier-Carpentier, F., Kiehn, T.E., Armstrong, D.: Fungemia in the immuno-compromised host: changing patterns, antigenemia, high mortality. Am J Med 1981; 71, 3, 363-370
97.
Meurman, J.H., Torkko, H., Pyrhö nen, S.: Antineoplastic agents inhibit the growth of Streptococcus mutans and Streptococcus sanguis in vitro. Oral Microbiol Immunol 1991; 6, 177-181
98.
Meyers, J.D.: Fungal infections in bone marrow transplant patients. Semin Oncol 1990; 17, 3, 10-13
99.
Mitchell, K.G., Bradley, J.A., Ledingham, I.M.C.A., és mtsa: Coloniyation of the Oral Cavity. Surg Gynecol Obstet 1982; 154, 870-874
Candida
100. Morrison, V.A., Haake, R.J., Weisdorf, D.J.: Non-candidal fungal infections after bone marrow transplantation: risk factors and outcome. Am J Med 1994; 96(6), 497-503 101. Nagy, G., Fekete Forgács, K., Madléna, M., Lenkey, B.: Virulence Factors in case of Fluconazole Resistance in Candida albicans. J Dent Res 2000; 79, Abstr. No 2678 102. Nair, R.G., Samaranayake, L.P.: The effect of oral commensal bacteria on Candida adhesion to denture acrylic surfaces. APMIS 1996; 104, 339-349 103. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1997. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. NCCLS document M27A. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa.
75
104. Negre, E., Vogel, T., Levanon, A. et al.: The collagen binding domain of fibronectin contains a high affinity binding site for Candida albicans. J Biol Chem 1994; 269, 22039-22044 105. Ness, M.J., Vaughan, W.P., Woods, G.L.: Candida antigen latex test for detection of invasive candidiasis in immunocompromised patients. J Infect Dis 1989; 159495-502 106. Newton, A.V.: Denture Sore Mouth. A Possible Aetiology. Br Dent J 1962; 112, 357-365 107. Nho, S., Anderson, M.J., Moore, C.B. & Debnning, D.W.: Species differentiation by internally transcribed spacer PCR and HhaI digestion of fluconazole-resistant Candida krusei, Candida inconspicua, and Candida norvegensis strains. J Clin Microbiol 1997; 35, 1036-1039 108. Nielsen, H. & Stenderup, J.: Invasive Candida norvegensis infection in immunocompromised patients. Scand J Infect Dis 1996; 28, 311-312 109. Nikawa, H., Samaranayake, L., Tenuovo, J.: The Fungicidal Effect of Human Lactoferrin on Candida albicans and Candida krusei. Arch Oral Biol 1993; 38, 1057-1063 110. Nolte, F.S., Parkinson. T., Falconer. D.J. et al.: Isolation and characterization of fluconazole- and amphothericin B-resistant Candida albicans from blood of two patients with leukemia. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41, 196-199 111. Northrop, F., Ljubojevic, S., Davies, J.M.: Influence of Na and anions on the dimorphic trans ition of Candida albicans. Microbiology 1997; 143, 3757-3765 112. Nyárasdy, I., Madléna, M.: Caries rizikófaktorok meghatározása és jelentoségük a caries prevencióban: In Preventív fogászat (szerk: Bánóczy J., és Nyárasdy I.) Medicina, Budapest, 1999; 108-118 113. Odds, F.C.: Candida and candidosis: A Review and bibliography. Balhere Tindall, London 1988. 114. Ogawa, H., Nozawa, Y., Rojanavanich, V. et al.: Fungal enzymes in the pathogenesis of fungal infections. J Med Vet Mycol 1992; 30, 189-196
76
115. Okuda, T., Yasuoka, T., Okra, N.: Myeloperoxidase, deficiency as a predisposing factor for deep mucocutaneous candidiasis. J Oral Maxillofac Surg 1991; 49, 183-186 116. Oliver, D.E., Shillitoe, W.J.: Effects of Smoking on the Prevalence and Intraoral Distribution of Candida albicans. J Oral Pathol 1984; 13, 265-270 117. Olsen, I.: Chemotaxonomy of yeasts. Acta Odontol Scand 1990; 48, 19-25 118. Papadimitriou, J.M., Ashman, R.B.: Macrophages: Current views on their differentiation, structure and function. J Ultrastruct Pathol 1989; 13, 343-372 119. Pereira, H.A., Hosking,C.S.: The role of complement and antibody in opsonization and intracellular killing of Candida albicans. Clin Exp Immunol 1984; 57, 307-314 120. Phaff, H.J.: DNA, enzymes and cell wall. in: The yeasts: A Taxonomic study. Elsevier Science Publishers B.V. 1984; pp17-21 121. Pindborg, J.J., Nielsen, H.: Significance of oral lesions: Oral Candidiasís. J Dent Res 1989; 68, 859-864 122. Pindborg, J.J.: Oral Leukoplakia. Austral Dent J 1971; 16, 83-89 123. Price, M.R., Wilkinson, I.D. & Gentry, L.O.: Plate method for the detection of phospholipase activity of Candida species in vitro. Sabouraudia 1982; 20, 7-9 124. Rayhan, R., Xu,L., Santarpia, R., et al: Antifungal activities of salivary histidine-rich polypeptides agarost candida albicans and other oral yeasts flora. Oral Microbiol Immunol 1992; 7, 51-52 125. Razek, M.K., Shaaban, N.: Histochemical and Histopathological Studies of Alveolar Mucosa Under Complete Dentures. J Prosthet Dent 1978; 39, 29-34 126. Reef, S.E., Mayer, K.H.: Opportunistic candidal infections in patients infected with human immunodeficiency virus: prevention issues and priorities. Clin Infect Dis 1995; 21, 99-102 127. Remold, H., Fasold, H. & Staib, F. :Purification and characterization of a proteolytic enzyme from Candida albicans. Biochim Biophys Acta 1968; 67, 399-406
77
128. Ribaud, P.: Fungal infections and the cancer patients. Europ J of Cancer 1996; 33, (Suppl.4.) 50-54 129. Rosenberg, M., Gutnick D., Rosenberg, E.: Adherence of bacteria to hydrocarbons: a simple method for measuring cell-surface hydrophobicity. FEMS Microbiol Lett 1980; 9, 29-33 130. Rozgonyi F.: Methicillin rezisztens Staphylococcus aureus törzsek kóroki szerepe, virulenciája, a rezisztencia fenotipusa és mechenizmusa Doktori Értekezés. Debrecen, 1987 131. Sable, C.A. & Donowitz, G.R. (1994) Infections in bone marrow transplant recipients. Clin Infect Dis 1994; 18, 273-284 132. Safdar, A., van Rhee, F., Henslee-Downey, J,P, et al.: Candida glabrata and Candida krusei fungemia after high-risk allogeneic marrow transplantation: no adverse effect of low-dose fluconazole prophylaxis on incidence and outcome. Bone Marrow Transplant 2001; 28, 873-878 133. Samaranayake, L., MacFarlane, T.W.: Factors affecting the in vitro adherence of the fungal oral pathogen Candida albicans to epithelial cells of human origin. Arch Oral Biol 1982; 27, 869-873 134. Samaranayake, L.P., MacFarlane,T.W.: Oral Candidosis. Butterworth 1990; pp4-103 135. Samaranayake, L.P., Raeside, J.M. & MacFarlane, T.W.: Factors affecting the phospholipase activity of Candida species in vitro. Sabouraudia 1984; 2, 201-207 136. Samaranaye,L.P., Wu, T.: The expression of secreted aspartyl proteinases of candida species in human whole saliva. J Med Microbiol 1999; 48, 711-719 137. Santoni, G., Gismondi, A., Liu, J.H. et al.: Candida albicans expresses a fibronectin receptor ant igenically related to ? 5? 1 integrin. Microbiol 1993; 140, 2971-2974 138. Schroeder, S.A., Krupp, M.A., Tierney, Z.M. Jr., Mc Phel, S.J.: Korszeru orvosi diagnosztika és terápia. Officina Kiadó, Budapest, 1990; 585-661 139. Scully, C., El Cabir, M., Samaranayake, Z.P.: Candida and oral candidosis (A review), Critical reviews in Oral Biology and Medicine1986, 5, 2-18
78
140. Scully, C., Flint, S., Porter, S.: Oral diseases. Martin Dunitz Kent, 1996; 203-260 141. Scully, C.: Chronic Atrophic Candidosis. Leading Article, 1986; 437-446 142. Siegman-Igra, Y., Raban, M.Y.: Failure of Fluconazole in Systemic Candidiasis. Eur J Clin Microbiol. Infect Dis 1992; 11, 201-207 143. Singleton, D.R., Masuoka, J., Hazen, K.C.: Cloning and analysis of a Candida albicans gene that affects cell surface hydrophobicity. J Bacteriol 2001; 183, 3582-3588 144. Sinkó, J., Csomor, J., Nikolova, R.: Invazív gombainfekciók elofordulása onkohema-tológiai betegekben. Orv Hetil 1998; 139, 8, 409-412 145. Sinkó, J., Nikolova, R., Reményi, P. et al.: Candida colonization of patients undergoing hematopoetic stem cell transplantation and receiving fluconazole prophylaxis. Bone Marrow Transplant (in press) 146. Slavin, M.A., Osborne, B., Adams, R. et al.: Efficacy and safety of fluconazole for fungal infections after marrow transplant – a prospektive, randomized, double-blind study. J Infect Dis 1995; 171, 1545-1552 147. Sonis, S.T., Sonis, A.L., Lieberman, A.: Oral complications in patients receiving treatment for malignancies other than of the head and neck. J Am Dent Assoc 1978; 97, 468-472 148. Spiechowicz, E., Rusiniak-Kubik, K., Skopinska-Rozewska, E., Sokolionicka, K., Zabuska-Jablonska, W., Brajczewska-Fischer, D., Rolski, B., Ciechowicz, M., Gil, I., and R. P. Renner:. Immunological status of patients with denture stomatitis and yeast infection after treatment of maxillofacial tumors. Arch Immunol Ther Exp 1994; 42, 263-267 149. Sreebny, L.M., Bánóczy, J., Baum, B.J., Edgar, W.M., Epstein, J.B., Fox, P.C., Larmas, M. : Saliva. Its role in health and disease. Int Dent J 1992; 42, 292-93 150. Sreebny, L.M.: Saliva in health and disease: An appraisal and update. Int Dent J 2000; 50, 141-61 151. Sugár, L., Bánóczy, J.: A leukoplakia és carcinoma összefüggése. Fogorv. Szle. 1970; 63, 225-230
79
152. Suzuki, S., Yasue, T., Ohashi, M.: The roles of proteinase production and germ tube formation in the invasion of Candida albicans into newborn mouse skin. Nippon Hifuka Gakkai Zasshi 1989; 99, 1227-1234 153. Tabak, L., Mandel, I.D., Karland, D.D et al: Alterations in lactoferrin in salivary gland disease. J Dent Res 1978; 57, 43-47 154. Tenovuo, J., Valtakoski, J., Knuuttila, M.L.: Antibacterial activity of lactoperoxidase adsorbed by human salivary sediment and hydroxyapatite. Caries Res 1977; 11, 257-262 155. Tenovuo, J.O. Human saliva: clinical chemistry and Microbiology. CRC Press, Boca Raton Fla. 1989; 23-29 156. Thurmond, J. M., Brown, A.T., Sims, R. E. et al: Oral Candida albicans in bone marrow transplant patients given chlorhexidine rinses: occurence and susceptibilities to the agent. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1991; 82, 291-295 157. Tobgi, R.S., Samaranayake, L., MacFarlane, T.W.: In vitro susceptibility of candida species to lysozyme. Oral Microbiol Immunol 1988. 3, 35-39 158. Tomsikova A.: Causative agents of nosocomial mycoses. Folia Microbiol 2002; 47, 105-112 159. Toren, A., Or, R., Ackerstein, A., Nagler, A. : Invasive fungal infections in lymphoma patients receiving immunotherapy following autologous bone marrow transplantation (ABMT). Bone Marrow Transplant 1997; 20, 67-69 160. Torres, S. R., Peixoto, C. B., Caldas, D. M., Silva, E. B., Akiti, T., Nucci, M., Uzeda, M. de.: Relationship between salivary flow rates and Candida counts in subjects with xerostomia. Oral Surg Oral Med Oral Path Oral Rad and Endont 2002; 93 , 114-19 161. Tumbarello, M., Tacconelli, E., Pagano, L., Ortu, L., Barbera, E., Morace, G., Cauda, R.,Leone, G., Ortona, L.: Comparative analysis of prognostic indicators of aspergillosis in haematological malignancies and HIV infection. J of Infection 1997; 34, 55-60 162. Valdes-Collazo ,L., Schultz, A.J., Hazen ,T.C.: Survival of Candida albicans in tropical marine and fresh waters. App. Environ Microbiol. 1987; 53, 1762-1767
80
163. Verran, J., Maryan, C.J.: Retention of Candida albicans on acrylic resin and silicone of different surface topography. Prosthet Dent 1997; 77, 535-539 164. Wald, A., Leisenring, W., van Burik, J-A. et al.: Epidemiology of Aspergillus infections in a large cohort of patients undergoing bone marrow transplantation. J Infect Dis 1997; 175, 1459-1466 165. Walsh, T.J.: Role of surveillance cultures in prevention and treatment of fungal infections. NCI Monogr 1990; 9, 43-45 166. Waters, M.G.J., Williams, D.W., Jagger, B.D.S., Lewis, M.A.O.: Adherence of Candida alb icans to experimental denture soft lining materials. Prosthet Dent 1997; 77, 306-312 167. Watts, H.J., Cheah, F.S.H., Hube, B., Sanglard, D., Gow, N.A.R. (1998) Altered adherence in strains of Candida albicans harbouring null mutations in secreted aspartic proteinase genes. FEMS Microbiol Lett 1998; 159, 129-135 168. White MH.: Editorial response: the contribution of fluconazole to the changing epidemiology of invasive candidal infections. Clin Infect Dis 1997; 24, 1129-1130 169. White, T.C., Marr, K.A. & Bowden, R.A.: Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev 1998; 11, 382-402 170. White, T.J., Bruns, T., Lee, S. & Taylor, J.: Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand, DH, Sninsky, JJ& White, TJ.(eds) PCR Protocols. Academic Press, Inc. San Diego, 1990; 315-322 171. WHO - 1977 Oral Health Surveys, Basic Methods, 2nd Ed. Genova, 68. 172. Wingard, J.R., Merz, W.G., Rinaldi, M.G, et al.: Increase in Candida krusei infection among patients with bone marrow transplantation and neutropenia treated prophylactically with fluconazole. N Engl J Med 1991; 325, 1274-1277 173. Wingard, J.R.: Fungal infections after bone marrow transplant. Biol Blood Marrow Transplant. 1999; 5, 55-68 174. Wingard, J.R.: Importance of Candida species other than C albicans as pathogens in oncology patients. Clin Infect Dis 1995; 20, 115-125
81
