AZ ETS-1 TRANSZKRIPCIÓS FAKTOR FEJNYAKI CARCINOMÁKBAN, MELANOMÁBAN ÉS PERITUMORALIS FIBROBLASTOKBAN, VALAMINT A HISZTAMIN HATÁSA AZ ETS-1 EXPRESSZIÓJÁRA Dr. Horváth Barnabás Témavezető: Dr. Ésik Olga
Doktori értekezés tézisei
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Klinikai Orvostudományok Doktori Iskolája Sugárterápia Program
Budapest 2005.
BEVEZETÉS: Mint a malignus fenotípus meghatározó jellegzetességei, az invázió és a metasztázis képzés meghatározó jelentőségű a betegek életkilátásait illetően. Különösen igaz ez a fej-nyaki terület leggyakoribb rosszindulatú daganatára, a planocellularis carcinomára, amelynek esetében a nyaki nyirokcsomó metasztázis megjelenése közel 50%-al rontja a betegek túlélési esélyeit. Bár az utóbbi évtizedekben a fej-nyaki rákok esetében is, mind a diagnosztika, mind a terápiás megoldások terén jelentős fejlődés ment végbe, a túlélési adatok mégsem tükröznek átfogó javulást. Az elmúlt évtizedek molekuláris biológiai vizsgálatai egyértelműen bizonyították, hogy a metasztázis képződés, egy többlépcsős, kaszkádszerű folyamat, amelyben nem csak kizárólag a daganatsejt, ill. a daganatsejthez kapcsolódó faktorok vesznek részt, hanem döntő szerepük van a rosszindulatú elváltozást körülvevő szöveti struktúrák, a gazdaszervezet reakcióinak is. A heterogén primer tumorban jelenlévő, metasztázis képzésre alkalmas tumorsejt szubpopuláció, egy szekvenciálisan egymásra épülő többszörös tumor-gazdaszervezet kölcsönhatásban válik le a primer daganatról, vándorol át az extracelluláris mátrixon, jut át a bazális membránon és kerül a vér vagy a nyirokkeringésbe, majd jut el, erős szelekciós nyomás alatt a célszövetbe és képezhet metasztázist. A jelenleg használt szövettani vizsgálatok korlátai a tumor viselkedésének meghatározására ismertek. Különösen nincsenek eszközeink arra, hogy előrejelezzük, melyik kis primer fej-nyaki tumor fog nyaki metasztázist adni, az azzal együtt járó közel 50%-os 5 éves túlélési esély csökkenéssel. Figyelembe véve az onkológia egyik régi szabályát, miszerint a tumoron végzett első beavatkozás döntő a végeredmény tekintetében, a daganat metasztatizáló képességének előrejelzése rendkívüli fontosságú lenne a fej-nyak sebész számára olyan döntések meghozatalában például, hogy negatív nyaki status mellett végezzen-e elektív nyaki block dissectiót vagy sem. A primer fej-nyaki daganat áttétképző képességének megítélésére az elmúlt évtizedekben, mind klinikai, mind hisztológiai, mind molekuláris szinten több próbálkozás is történt. Ismereteink szerint azonban idáig nem sikerült olyan tényezőt találni,
2
amely rutinszerűen bekerült volna a mindennapi klinikai gyakorlatba, és valós segítséget adna a terápiás döntésekben. Az ets-1 transzkripciós faktor szerepet játszik az invázióban és metasztázis képzésben. Az ets-1 gén által kódolt transzkripciós faktor fehérje képes kötődni az uPA gén enhanceréhez, valamint az MMP-3 és MMP-1 gén promoteréhez, és feltételezhetően ezeknek a géneknek az expressziójának aktiválásán keresztül vesz részt a tumoros invázióban. A gerincesek többségében a sejtek közötti kapcsolat megteremtésében alapvető fontosságú molekulák Ca2+ függő csoportjának egyik legjelentősebb képviselői a cadherinek. Ezeknek a transzmembrán glikoproteineknek szerepe van a morfogenezisben és a differenciált fenotípus megtartásában. Számos carcinomában a csökkent intercellularis adhézió és a differenciált epithelium karakterisztika elvesztése arra utal, hogy a cadherineknek fontos szerepe van malignus progresszióban. Ezt támasztja alá, hogy bizonyították, a cadherineknek szerepe van a daganatos invázió és metasztázis képződés gátlásában. A kis molekula tömegű biogén amin, a hisztamin, a biológiában széles körben előforduló kémiai mediátor. Egyrészt neurotranszmitter, a gastrointestinális és simaizom funkció mediátora, másrészt fő szerepet játszik az allergiás reakcióban, a gyulladásban és a sejt proliferációjában is. Már a 60-as években feltételezték, hogy a hisztamin részt vesz a carcinogenezisben, bár mind a mai napig számtalan nyitott kérdés maradt hátra. A hisztamin egyik fő forrását jelentő hízósejtekkel kapcsolatos első megfigyelés Ehrlich (1879) nevéhez fűződik, miszerint a hízósejtek nagy számban vannak jelen a tumorhoz közeli területeken. Pár évvel később Westphal (1890) a doktori téziseiben rögzítette a hízósejt akcelerációt a tumor közvetlen környezetében. Az utóbbi időben több munkacsoport is igazolta azt az eredeti megfigyelést, hogy a hisztamin egyik fő forrásának számító hízósejtek felszaporodnak számos solid tumor környezetében, sőt colorectalis daganatok esetében prognosztikai jelentőséggel is bírnak. A hisztidin decarboxileződését katalizáló hisztidin dekarboxiláz (HDC), mint a hisztamin bioszintézisért felelős enzim, specifikus markere a hisztamin szintézisnek. Irodalmi adatok igazolják, hogy emlő és colon carcinomában, melanomában, lymphomában valamint leukémiában, mind a HDC-t kódoló mRNS, mind a HDC protein
szintje és következményesen a hisztamin szintézis, szignifikánsan magasabb, mint a környező ép szövetekben. A daganaton belüli hisztamin koncentráció mérésére is történtek vizsgálatok, bár meggyőző eredmények elsősorban emlő, bőr és colon carcinomák esetében állnak rendelkezésünkre. Chanda és Ganguly, Reynolds és mtsai. valamint Garcia-Caballero, egyaránt magasabbnak találták a hisztamin koncentrációt az emlő tumorban, mint a környező ép szövetekben. A hisztamin szerepe a tumor genezisben és a metasztázis képződésben még nem tisztázott. Falus és mtsai. igazolták, hogy a hisztamin hatása melanoma sejtek proliferációjára az aktuális hisztamin receptor típus megoszlás függvénye, ugyanakkor a hisztamin indirekt úton irányítja a helyi T sejt polarizációt a Th2 predominancia irányába. Experimentális carcinomákban a hisztaminnak, mint egy autocrin növekedési faktornak, a legfontosabb hatása, hogy a H2 receptorokon keresztül stimulálja a proliferációt. A hisztaminnak az immunrendszerre gyakorolt kettős hatásához hasonlóan, ahol a H2 receptoron keresztül immunszupresszor és a H1 receptorokon keresztül immunstimuláló, a daganatok proliferációjára is ambivalens hatása van. Amíg a hisztamin a H2 receptoron keresztül serkenti a sejt proliferációt, addig a H1 receptorokon keresztül a tumor növekedését gátolja. Az invázió és metasztázis képzés folyamata nagymértékben függ a daganat angiogen potenciáljától. Vizsgálatok igazolták a hisztamint mint angiogen faktort, de az angiogenezis folyamatában betöltött specifikus működése még ismeretlen. Zaubermann több mint harminc éve publikálta megfigyelését, miszerint a hisztamin nyúl corneában angiogenezist indukál. Újabb vizsgálatok alapján a hisztamin érképződést kiváltó hatását valószínűleg a nitrogén oxid generálásával fejt ki.
3
4
CÉLKITŰZÉSEK: 1. Az ets-1 transzkirpciós faktornak és az E-cadherinnek az áttét képzésben betöltött szerepe alapján feltételeztük, hogy alkalmasak a fej-nyaki carcinomák metasztázis képességének előrejelzésére. Ezért műtéten átesett betegek (fagyasztott ill. paraffinba ágyazott)
anyagának vizsgálatával összefüggést kerestünk az ets-1 és Ecadherin valamint a primer tumor metasztatizáló kézsége között. A hisztamin, általunk feltételezett metasztázis kézséget fokozó hatását vizsgáltuk melanoma sejtvonalakon és peritumoralis fibroblast setjtenyészetben. 2. Metasztatikus tulajdonsággal rendelkező melanoma sejtvonalakon bizonyítékot kívántunk szolgáltatni a hisztaminnak az ets-1-re gyakorolt hatásáról. 3. Választ kerestünk arra a kérdésre, hogy a hisztamin a peritumoralis fibroblastokban valóban fokozza-e az ets-1 és következményesen az MMP-3 expresszióját, ezzel növelve a tumor invazív és metasztatikus tulajdonságát. MÓDSZER: Ets-1 és MMP-3 RT-PCR vizsgálata betegekből származó tumormintában Műtét során eltávolított fagyasztott tumormintákból, RT-PCR vizsgálattal igazoltuk az ets-1 mRNS jelenlétét, majd összevetettük 4 metasztatizáló (M1-4) és 4 nem metasztatizáló (N1-4) esetben a detektált ets-1 és MMP-3 RT-PCR eredményeket. A ets-1 és MMP-3 primereket az irodalomból vettük és szintetizáltattuk. Ets-1, E-cadehrin, és Ki-67 immunhisztokémiai vizsgálat betegekből származó tummormintákban Az E-cadherin által közvetített intratumorális sejt-sejt közötti adhéziót, a Ki-67 által detektált tumor proliferativ aktivitását, valamint az ets-1 transzkripciós faktor által közvetített mátrix remodelláló képességet vizsgáltuk (ets-1 esetében 40 beteg [32 férfi, 8 nő], E-cadherin esetében 98 beteg [87 férfi, 11 nő]) immunhisztokémiai módszerrel, mint a fej-nyaki planocellularis carcinomák agresszivitásának lehetséges markereit. A primer tumor mintákat két csoportra osztottuk: N(0) csoport (n=48), ahol klinikailag vagy a block dissecatum feldolgozása után nem volt szinkron nyaki metasztázis és 2 éves követési idő alatt sem jelentkezett, N(+) csoport (n=50), ahol a diagnózis felállításakor ill. a nyaki dissecatum feldolgozásánál, vagy a következő 2 év alatt
5
jelentkezett nyaki metasztázis. Az immunhisztokémiai vizsgálatot paraffinos metszeteken végeztük, E-cadherin (H-108), Ki-67 (BioGenex), és nyúlban termelt poliklonális Ets-1 antitesttel (c-20, Santa Cruz Biotech. Inc.). Human melanoma sejtvonalakon végzett RT-PCR vizsgálat és flowcitometria A műtéti anyagon végzett vizsgálatok tapasztalatainak valamint irodalmi adatok felhasználásával metasztatikus fenotípussal rendelkező humán melanoma sejtvonalakon (HT-168, HT-168/M1, A2058, WM35) vizsgáltuk az ets-1 gén expresszióját, ill. hisztaminnal való kapcsolatát RT-PCR-el és flow citometriával. Ezt követően, a H2 receptornak a folyamatban történő részvételét igazoltuk flow citometriával. Annak megítélésére, hogy a H2 receptor részt vesz-e az ets-1 modulációban, a sejteket, (1 µM) hisztaminnal, (100 nM) dBcAMP-t és (1 µM) H2 agonistával (dimaprit) kezeltünk, 24 órás inkubációval. Human fibroblast sejttenyészetben végzett RT-PCR, flow-citometria és immuncitokémiai vizsgálat Rekombináns bázikus fibroblast növekedési faktor (bFGF) és hisztamin jelenlétében ill. ezek hiányában vizsgáltuk fibroblast tenyészetben az ets-1 és MMP-3 mRNS szintjét RT-PCR technikával, valamint az ets-1 és MMP-3 protein mennyiségét flowcytometriával. A modell belső kontrolljaként Wernert és mtsai. által bFGF-ral végzett kísérlet szolgált. A hisztamin feltételezett hatásának in situ, sejten belüli vizualizálására fluorescens immuncitokémiai vizsgálatot végeztünk a fibroblast tenyészetben. EREDMÉNYEK: Az ets-1 jelen van a fej-nyaki planocellularis carcinoma sejtekben, de elsősorban a peritumorális stroma fibroblastjainak fontos molekulája Míg a tumorok 50%-ában észleltünk pozitív ets-1 immunreakciót a daganat sejteken belül, addig a peritumoralis régió fibroblastjai minden esetben pozitívak voltak.
6
Az ets-1 a daganatsejteken belül nem mutatott statisztikailag értékelhető összefüggést sem a klinikopatológiai faktorokkal sem a metasztázisok jelenlétével sem a Ki-67 proliferációs index-szel sem a túléléssel. A vizsgált klinikopatológiai faktorok (nem, grade, tumor stádium, lokalizáció) és a daganatsejteken belül észlelt ets-1 immunpozitivitás között nincs szignifikáns kapcsolat. Az N(0) és N(+) csoport közötti ets-1 pozitivitás nem szignifikáns (p=0,273). Az ets-1 pozitív csoportban talált Ki-67 index átlaga (43% ± 17,6% SD), míg az ets-1 negatív csoportban (40% ± 15,8% SD), amely értékek között nincs statisztikailag értékelhető eltérés (p=0,794).
követően, szignifikáns emelkedés volt megfigyelhető a kezeletlen sejtekkel szemben. A bFGF növeli a fibroblastok hisztamin termelését Flow-citometriával jelentősen emelkedett hisztamin mennyiség volt mérhető a fibroblastokban, 20 órás bFGF-al történő inkubációt követően. ÖSSZEFOGLALÁS:
A hisztamin növelte a peritumoralis fibroblastok ets-1 és következményesen az MMP-3 expresszióját Az RT-PCR vizsgálat során mind a hisztamin mind a bFGF szignifikánsan növelte mind az ets-1, mind a MMP-3 mRNS szintjét 6 órás hisztamin ill. bFGF inkubációt követően, összehasonlítva a kezeletlen, kontroll sejtekkel. Flow-citometriás vizsgálat során összehasonlítva az ets-1 és MMP-3 fehérje mennyiségét a bFGF és hisztamin kezelt fibroblast tenyészetekben, 20 órás inkubációt
Összességében a vizsgálati sorozat eredményeiből levonható következtetés az, hogy a fej-nyaki planocellularis carcinomákban az ets-1 transzkripciós faktor jelenlétének nincs közvetlen, a túlélésben vagy a klinikopatológiai faktorokban kifejezhető statisztikai jelentősége, azonban az ets-1 gén expressziója bizonyos tumorsejt frakciókban, összefüggésben más tumor biológiai jelenségekkel, indikátora lehet a metasztatikus kaszkádban résztvevő tumorsejt klónnak. Konzekvens jelenléte a peritumorális fibroblastokban arra utal, hogy patofiziológiai jelentősége inkább a tumor és környezete kölcsönhatásában van. A vizsgálatok azt igazolják, hogy a Ki-67 proliferációs index és az E-cadherin expresszió mérése hasznos technika lehet a magas rizikójú betegcsoport kiválasztásában, akiknél agresszívabb onkológiai kezelés szükséges. Mindezekből arra következtettünk, hogy az E-cadherin és a Ki-67 értékes résztvevője lehet, egy a fejnyaki daganatok prognózisát vizsgáló panelnek. A metasztatikus melanoma sejtvonalakon végzett vizsgálataink egyértelmű összefüggést mutattak a hisztamin kezelés és az ets-1 expresszió növekedése között, valamint igazolták, hogy ezt a hatást a hisztamin a H2 receptoron keresztül fejti ki. Ismerve az ets-1 malignus sejtekben igazolt szerepét, eredményeink felvetik a lehetőségét, hogy a hisztamin sejt proliferációt növelő és migrációt fokozó hatását ets-1 mediált úton fejtené ki. A G fehérjéhez kapcsolt H2 receptor, protein-kináz A-n keresztül, a c-jun és c-fos-on át aktiválja az ets-1 indukciójában szerepet játszó AP-1 transzkripciós faktort. Feltételezzük, hogy a hisztamin ezen a szignál transzdukciós úton keresztül fokozza az ets-1 expresszióját.
7
8
Az E-cadherin szignifikáns összefüggést mutat a metasztázisok jelenlétével, a Ki-67 proliferációs index-szel és a túléléssel A metasztázist adó N(+) és a nem metasztatizáló csoport N(0) Ecadherin expressziójában szignifikáns eltérést találtunk (p=0,042). A Ki-67 index eltérése az E-cadherin megtartott és E-cadherin csökkent csoportban szignifikáns (p=0,006). Az E-cadherin megtartott csoport életkilátásai szignifikánsan jobbak, mint az E-cadherin csökkent csoporté. A hisztamin növeli a melanoma sejtek ets-1 expresszióját, a H2 receptoron keresztül Minden vizsgált melanoma sejtvonalban jelen volt az ets-1 mRNS, továbbá mind a négy sejtvonalban emelkedett az ets-1 expresszió mértéke az alkalmazott hisztamin hatására. A melanoma sejtek, amelyeket hisztaminnal vagy H2 agonistával (dimaprit) vagy dBcAMP-vel kezeltünk jól megfigyelhető ets-1 expresszió szint növekedést mutattak.
Annak megítélésére, hogy a tumorsejtek által termelt növekedési faktor és a hisztamin valóban fokozza-e az ets-1 transzkripciós faktor expresszióját a peritumorális fibroblastokban és ezzel párhuzamosan emelkedik-e az ets-1 által regulált MMP-3 expresszió mértéke is, in vitro kísérletink szolgálnak. Mind az bFGF mind a hisztamin jelenlétében nőtt az ets-1 és az MMP-3 mRNS valamint fehérje szintje. A protein szintű vizsgálatot megerősíti az immunfluorescens festés eredménye, amely in situ a vizsgált sejtekben jól vizualizálhatóan igazolta a fehérje szintek növekedését. Bár az in vitro kísérletek klinikai értékelése nagy körültekintést igényel, az eredmények azt látszanak igazolni, hogy a különböző forrásokból származó hisztamin szintje a tumoron belül, elősegítheti az ets-1 és következményesen az MMP-3 termelődését a peritumorális fibroblastokban, ill. növelheti a daganat invazívitását. Az ábrában megpróbáltuk összefoglalni, saját eredményeink ill. a rendelkezésünkre álló irodalmi adatok alapján, a tumor és közvetlen környezete hisztamin mediált kölcsönhatását, összefüggésben a peritumoralis fibroblastok MMP termelésével.
HíZÓSEJT
HA bFGF
FIBROBLAST
HA
Ets-1
TUMOR
HA
bFGF MMP-3
Invázió Metasztázis
E-cadherin
MMP-3 hasítja az E-cadherin extracellularis doménjét, Agresszívabb fenotipus
9
KÖSZÖNETNYILVÁNíTÁS: Értekezésem végén szeretném kifejezni köszönetemet és hálámat mindazoknak, akik az eddig elvezető többéves munkában önzetlen és pótolhatatlan segítséget nyújtottak: -témavezetőmnek, Dr. Ésik Olgának; -Dr. Schaff Zsuzsa Profeszor Asszonynak, akiknek a segítsége, útmutatásai nélkül nem készülhetett volna el ez az értekezés; -volt és jelenlegi főnökeimnek, Z. Szabó László Professzor Úrnak és Csokonai Vitéz Lajos Tanár Úrnak, akik kutatási tevékenységemet támogatták; -Dr. Falus András Professzor Úrnak, aki munkámat lehetővé tette laboratóriumában; -Dr. Hegyesi Hargitának, aki a laboratóriumi munkába bevezetett, és mindvégig aktív együttműködésével segített, valamint az értekezés elkészítésénél időt nem kímélve segítségemre volt; -minden kollégámnak, akik az Országos Gyógyintézeti Központ Fülorr-gégészeti Osztályán Ph.D. napomon helyettem is dolgoztak a betegellátásban; - Dr. Nagy Pálnak a szövettani metszetek kiértékelésénél nyújtott segítségért; - Truszka Ferencnének, aki a szövettani vizsgálatok elvégzésében rendkívüli segítséget nyújtott; - a Schering-Plough Central East AG cégnek, amely a Ph.D. tandíjamat vállalta a képzés teljes ideje alatt, és személy szerint Dr. Lipcsei Andrásnak; - betegeimnek, akiknek a hozzájárulása a kutatáshoz szavakkal nem kifejezhető. Végül, de nem utolsó sorban köszönettel tartozom családomnak kutatómunkám és az értekezés megírása alatti támogatásukért, és különösen feleségemnek és kisfiamnak a megszámlálhatatlan tőlük távol töltött óra miatti megértésükért.
ECM alkotórászek proteolízise
10
AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK: Közlemények: 1. Barnabás Horváth, Hargita Hegyesi, Pál Nagy, András Falus, Zsuzsa Schaff. Expression of ets-1 transcription factor in human head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and the effect of histamine on metastatic potential of invasive tumor through the regulation of expression of ets-1 and matrix metalloproteinase MMP3. Head Neck 27:585-596, 2005. 2. Hargita Hegyesi, Barnabás Horváth, Éva Pállinger, Zoltán Pós, Viktor Molnár and András Falus. Histamine elevates the expression of Ets-1, a protooncogen in human melanoma cell lines through H2 receptor. FEBS letters 579:2475-2479, 2005. 3. Horváth Barnabás, Csákó László, Nagy Pál, Csokonai Vitéz Lajos, Schaff Zsuzsa. Az ets-1 transzkripciós faktor expressziójának vizsgálata immunhisztokémiai és RT-PCR módszerrel fej-nyaki planocellularis carcinomákban. Fül-, Orr-, Gégegyógyászat 51:126132, 2005.
5. Horváth B., Nagy P., Schaff Zs. E-cadherin: a fej nyaki planocellularis carcinomák lehetséges prognosztikai markere. Magyar Fül-Orr-Gégeorvosok Egyesületének 38. Kongresszusa, 2004. Sopron 6. Horváth B., Hegyesi H, Falus A., Schaff Zs. Peritumorális fibroblast tenyészet matrix metalloproteináz termelése. Magyar FülOrr-Gégeorvosok Egyesületének 38. Kongresszusa, 2004. Sopron 7. Barnabás Horváth, István Udvaros, Hargita Hegyesi, Pál Nagy, András Falus, Zsuzsa Schaff. The effect of histamine on metastatic potential of invasive tumor through the regulation of expression of ets-1 and matrix metalloproteinase MMP-3. XVIII World Congress of International Federation of Oto- Rhino- Laryngological Societies, Rome, 2005. 8. István Udvaros, Barnabás Horváth, Pál Nagy, Zsuzsa Schaff. Histochemical Study of E-cadherin and Ki-67 in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. XVIII World Congress of International Federation of Oto- Rhino- Laryngological Societies, Rome, 2005.
Előadások, poszterek: 1. H. Hegyesi, É. Pállinger, U. Schaefer, B. Horváth, E. Buzás and A. Falus. Presence of H3-receptor on the surface of human melanoma cell lines. XXXIst meeting of the European Histamine Research Society, Eger, Hungary, 22-26 May, 2002 2. Horváth B., Hegyesi H., Csokonai V.L., Falus A., Schaff Zs. A hisztamin hatása a fej nyaki planocellularis daganatok metastatizáló képességére az Ets-1 és az MMP3 expresszió szabályozásán keresztül. Magyar Fül-Orr-Gégeorvosok Egyesületének 37. Kongresszusa, 2002. Siófok 3. Horváth B, Hegyesi H, Falus A, Schaff Zs. A hisztamin hatása a fej nyaki planocellularis daganatok metastatizáló képességére az Ets1 és az MMP3 expresszió szabályozásán keresztül. Országos Gyógyintézeti Központ II. Tudományos Nap, 2003. november 14. 4. Salamon F, Nagy P, Tóta J, Csákó L, Horváth B. Laphámrák típusok a gégében Országos Gyógyintézeti Központ II. Tudományos Nap, 2003. november 14.
11
12
