Autoantitest profil és B-sejt epitópok vizsgálata citrullinált peptidek segítségével rheumatoid arthritisben és a patomechanizmus vizsgálata a betegség egér modelljében
DOKTORI ÉRTEKEZÉS Szarka Eszter
Témavezető: Prof. Sármay Gabriella, egyetemi tanár ELTE TTK Biológia Doktori Iskola, Immunológia Program Programvezető: Prof. Erdei Anna, egyetemi tanár ELTE TTK, Immunológiai Tanszék 2014
Tartalom 1. Rövidítésjegyzék .................................................................................................................. 4 2. Bevezetés .............................................................................................................................. 6 3. Irodalmi áttekintés ............................................................................................................. 8 3.1 A rheumatoid arthritis ________________________________________________________ 8 3.2 A citrullináció fiziológiás funkciója és szerepe rheumatoid arthritisben ________________ 9 3.3 A rheumatoid arthritis patogenezise ____________________________________________ 11 3.4 ACPA-k fajtái és felfedezésük története _________________________________________ 13 3.5 Genetikai háttér és környezeti faktorok szerepe ___________________________________ 15 3.6 A vizsgált, citrullinációs célpontként szereplő fehérjék biológiai funkciója _____________ 17 3.7 Vizsgálatok a rheumatoid arthritis egér modelljében, a kollagén indukált arthritis (CIA) modellen _____________________________________________________________________ 18 3.8 Az Fcγ receptorok szerepe a CIA kialakulásában __________________________________ 18
4. Célkitűzések: ...................................................................................................................... 19 5. Anyagok és módszertan ................................................................................................... 21 5.1 Anyagok és reagensek _______________________________________________________ 21 5.2 A vizsgált peptidek __________________________________________________________ 22 5.3 Betegcsoportok _____________________________________________________________ 23 5.4 Multipin ELISA ____________________________________________________________ 24 5.5 Indirekt ELISA _____________________________________________________________ 25 5.6 Kompetitív ELISA a peptid-specifikus ellenanyagok közötti keresztreakció kimutatására __ 26 5.7 Humán B-sejtek izolálása vérből, tenyésztés ______________________________________ 26 5.8 Peptid specifikus ellenanyagtermelő sejtek kimutatása ELISpot módszerrel ____________ 27 5.9 Peptid-specifikus B-sejtek kimutatása áramlási citometriával (FACS) _________________ 28 5.10 Peptidek hatása RA betegekből szeparált PBMC citokintermelésére __________________ 28 5.11 Kollagén indukált arthritis indukciója, a betegség fokának nyomonkövetése __________ 29 5.12 A 2.4G egyláncú ellenanyag (ScFv) tisztítása ____________________________________ 30 5.13 Áramlási citometriás mérések ________________________________________________ 30 5.14 Extravidin-FITC tartalmú komplexek in vivo immunofluoreszcens lokalizációja _______ 30 5.15 Kollagén- és kollagén peptid specifikus ellenanyagok kimutatása ___________________ 31 5.16 Citokin- és kemokinszint meghatározása _______________________________________ 31 5.17 Citokinszint meghatározása lépsejtkultúra felülúszójából __________________________ 32 5.18 Statisztikai analízis ________________________________________________________ 32
6. Eredmények........................................................................................................................ 34 6.1 A rheumatoid arthritis diagnosztizálása során alkalmazható, új citrullin tartalmú peptidek azonosítása ___________________________________________________________________ 34
2
6.1.1 Citrullin tartalmú peptidek szűrése RA beteg és egészséges szérummintákkal __________ 34 6.1.2 Kompetíció vizsgálata az egyes citrullin tartalmú peptidekre specifikus szérummintákal _ 41 6.1.3 Citrullin tartalmú peptidekre specifikus ellenanyagtermelés vizsgálata ELISpot módszerrel _____________________________________________________________________________ 43 6.1.4 Peptid-specifikus B-sejtek kimutatása áramlási citometriával ______________________ 44 6.1.5 In vitro citokintermelés vizsgálata citrullin tartalmú peptidekkel való aktiváció hatására 47 6.2.1 A 2.4G2 scFv és a kollagén CII-peptid által alkotott komplexek hatása a CIA súlyosságára és lefolyására egerekben ________________________________________________________ 48 6.2.2 Kollagén specifikus ellenanyagtermelés vizsgálata a különböző komplexekkel kezelt CIA egerekben ____________________________________________________________________ 49 6.2.3 A komplexek in vitro kötődése lépsejtekhez és in vivo lokalizációja a lépben___________ 50 6.2.4 Citokin/kemokinszekréció kiváltása az FcRII/III célzásával _______________________ 53
7. Diszkusszió ......................................................................................................................... 57 8. Új tudományos eredmények ............................................................................................ 66 9. Összefoglalás ..................................................................................................................... 67 10. Summary .......................................................................................................................... 68 11. Köszönetnyilvánítás ....................................................................................................... 69 12. Saját közlemények jegyzéke .......................................................................................... 70 12.1 Közlemények az értekezéssel kapcsolódó témában ________________________________ 70 12.2 Egyéb közlemények ________________________________________________________ 71 12.3 Konferenciaközlemények, absztraktok _________________________________________ 71
13. Irodalomjegyzék ............................................................................................................. 73
3
1. Rövidítésjegyzék ACPA: anti-citrullinated protein/peptid antibodies / anti-citrullinált fehérje/peptid antitestek AKA: anti-keratin antibody / anti-keratin antitest APC: allophycocyanin / allofikocianin APF: anti-perinuclear factor / anti-perinukleáris faktor AUC: area under curve / görbe alatti terület BLC: B lymphocyte chemoattractant / B limfocita kemoattraktáns BSA: bovine serum albumin / szarvasmarha szérum albumin CD: cluster of differentiation CIA: collagen-induced arthritis / kollagénindukált arthritis CCP: citrulline containing protein/peptide / citrullin tartalmú fehérje/peptid CR: complement receptor / komplement receptor CRP: C-reactive protein / C-reaktív fehérje CII: type II collagen / II típusú kollagén DAS: disease activity score ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay / enzimkapcsolt immunszorbens esszé FACS: fluorescent activated cell sorter / fluoreszcencia aktivált sejt szorter FcγR: Fc gamma receptor FITC: fluorescein isothiocyanate Fmoc: fluorenylmethoxycarbonyl G-CSF: granulocyte colony stimulating factor / granulocita kolónia stimuláló faktor IFNγ: interferon gamma ITAM: immunoreceptor tyrosine-based activation motif ITIM: immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif LC-biotin: biotinyl-6-aminohexanoic acid (long-chain biotin) / hosszú láncú biotin MARCO: macrophage receptor with collagenous structure MCV: mutated citrullinated vimentin MHC: major histocompatibility complex MIP: macrophage inflammatory protein MMP: matrix metalloprotease MRI: magnetic resonance imaging
4
OD: optical density/ optikai denzitás HLA: human leukocyte antigen HRPO: horse radix peroxidase / tormaperoxidáz PAD: peptidyl arginine deiminase PBMC: peripheral blood mononuclear cells RA: rheumatoid arthritis RF: rheumatoid factor / reumafaktor ROC: receiver operating characteristic ScFv: single chain Fv fragment / egyláncú Fv fragmens SD: standard deviation SLE: systemic lupus erythematosus TLR: toll-like receptor TMB: 3,3’,5,5’ tetramethylbenidine TNFα: tumor necrosis facor alpha t
Bu: terc-butiloxicarbonyl
Ttds: 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamino succinic acid
5
2. Bevezetés Az autoimmun betegségek a világ népességének jelentős hányadát sújtják. Autoimmun betegségnek nevezünk minden olyan folyamatot, amelyben félresiklott immunválasz alakul ki a szervezetben normálisan jelen lévő struktúrákkal, szövetekkel szemben. A betegség lehet szervspecifikus, vagy szisztémás, érinthet egy vagy több szervet, szövetet is. Egy személy több autoimmun betegségben is szenvedhet. A tünetek változatosak a kórkép kialakulásának – az abnormális immunválasznak – a helyétől függően, az általános tünetek a krónikus fáradtság, láz, rossz közérzet. A betegség lefolyása során előfordulhatnak fellángolások (’flare-up’, relapszus), amikor a tünetek súlyosbodnak, illetve a remisszió fázisában a tünetek enyhülése, esetleg átmeneti megszűnése tapasztalható. A félresiklott immunreakció során gyulladás alakul ki az érintett szövetben, idővel az érintett szövet károsodhat, vagy el is pusztulhat. Az autoimmun betegség kritériumait a Witebsky-féle posztulátum [1] írja le: 1, Közvetlen bizonyíték: a betegség átvihető patogén ellenanyagokkal vagy patogén T-sejtekkel 2, Közvetett bizonyíték: a betegség reprodukálható kísérletes állatmodellekben 3, Másodlagos bizonyítékok: limfocita infiltráció a célszervben, társulás más autoimmun betegségekkel, korreláció bizonyos HLA antigének kifejeződésével, az immunreguláció kedvező terápiás hatása. Az autoimmun betegségek besorolhatók a II, a III vagy a IV típusú túlérzékenységi reakciók közé. Jellemző a nemek közti eltérés a betegség előfordulását illetően. Kialakulásának okai összetettek, általában különböző genetikai, infektológiai és környezeti faktorok játszanak szerepet. A perifériás tolerancia (klonális deléció, anergia, szuppresszió) nem megfelelő működése a betegségek gyakori kiváltó okának számít. Manapság nagyon vitatott terület, hogy mikortól tekinthető autoimmun betegségnek a folyamat. Az adott genetikai háttér szükséges, de önmagában nem elégséges feltétele a kórkép kialakulásának, további környezeti hatások (dohányzás, stressz, fertőzések) indítják el az autoreaktív ellenanyagok termelődését. A különféle infekciók szerepe nagyon fontos, változatos mechanizmusok vezethetnek az autoimmun kórkép kiváltásához molekuláris mimikri, epitóp spreading, bystander hatás, a természetes immunrendszer aktiválása, a citokinkörnyezet megváltozása vagy poliklonális sejtaktiváció révén. A folyamat hosszú időn át tünetmentes lehet, a lassú progresszió sokszor megnehezíti a pontos diagnózis felállítását. Általánosságban elmondható, hogy a kórképek
6
rendkívüli összetettsége miatt igen nagy szükség van a témában folytatott alapkutatásokra, amelyek a betegségek hátterét, patomechanizmusát derítik fel. A posztulátum második pontjában említett kísérletes állatmodellek jól alkalmazhatók az autoimmun kórképekben mind alapkutatásra, mind terápiás szerek vizsgálatára, miközben nem szabad figyelmen kívül hagyni az ember és a modellállat között meglévő genetikai-immunológiai sajátosságokat, különbségeket. Szintén a kórképek összetettségéből következően szükséges az újabb és újabb diagnosztikai markerek felkutatása, megkönnyítendő a hasonló kórképek egymástól való elkülönítését, a terápia mielőbbi elkezdését, illetve a megfelelő kezelés kiválasztását. Doktori munkám célja egyrészt a rheumatoid arthritis újabb diagnosztikai lehetőségeinek felkutatása, másrészt a betegség patomechanizmusának vizsgálata kollagén indukált arthritisben, az RA egér modelljében.
7
3. Irodalmi áttekintés 3.1 A rheumatoid arthritis A rheumatoid arthritis (RA) krónikus, autoimmun betegség. Világviszonylatban körülbelül 1% a prevalenciája, háromszor annyi nő érintett, mint férfi. A betegség fő jellemzője elsősorban a kéz és láb kisízületeiben szimmetrikusan jelentkező ízületi gyulladás. A patológiás folyamat előrehaladtával a gyulladás továbbterjedhet a nagy ízületekre, majd a csigolyákra is. A betegség súlyossága, kimenetele az enyhe betegségtől a súlyos ízületi gyulladásig széles skálán mozog. Súlyosabb lefolyású esetekben a beteg teljesen mozgásképtelenné válhat, tolókocsiba kényszerülhet. Az autoimmun folyamat lényege, hogy bizonyos saját ízületi fehérjék ellen immunválasz alakul ki, ennek következménye az ízületi csont és porc degradációja. A betegség kezdetén fellépő fáradékonyság, láz és testsúlycsökkenés után az ízületi gyulladás első tünete, hogy az ízületet borító membrán megvastagszik, vérbővé válik, és nagy mennyiségben termeli az ízületi folyadékot. Ettől jelentős mértékű duzzanat jön létre, ez akadályozza az ízületi mozgást, az izmok görcsbe rándulhatnak és az ízület behajlított állapota állandósulhat. Közben ínhüvelygyulladás, a bőrben reumás csomók és csontelváltozások keletkezhetnek. A betegség előrehaladtával fájdalmas kötőszövetes vagy csontos ízületi merevség alakul ki az adott ízület torzulásával. Az RA átlagosan 3-7 évvel megrövidítheti a várható élettartamot, miután megnő az ilyen betegek hajlama a fertőzésekre és az érelmeszesedésre is. Kialakulásában genetikai tényezőknek, környezeti hatásoknak (dohányzás, stressz), fertőzéseknek is egyaránt szerepük van, vagyis multifaktoriális betegségről beszélünk. A rheumatoid arthritis jelenleg nem gyógyítható véglegesen, de hatékony kezelésére van lehetőség. A gyógyszeres kezelés két nagyobb csoportra bontható. Az egyik a tünetek megszüntetésére, fájdalomcsillapításra irányul. A kezelés nem szteroid gyulladáscsökkentőkkel, illetve szteroidokkal történik. A másik nagy csoportba azok a gyógyszerek tartoznak, melyek a betegség lefolyását tudják módosítani. Ezek az úgynevezett bázisterápiás, azaz DMARD (Disease-Modifying Antirheumatic Drugs) szerek. Amennyiben valamelyik gyógyszer szedése nem eredményez javulást, vagy mellékhatások jelentkeznek, úgy lehetőség van egy másik bázisterápiás szerre való váltásra, de lehetséges több szer kombinált alkalmazása is. Ha így sem érhető el a kívánt hatást, akkor a jelenlegi legfejlettebb, úgynevezett biológiai terápia segíthet. Számos biológiai terápiás szer (Mabthera/Rituxan – anti CD 20, Humira – anti- TNFα, Embrel–TNFαR-IgG1 fúziós fehérje, Cimzia– anti- TNFα, Remicade– anti- TNFα, Tocilizumab – anti-IL-6
8
receptor) alkalmazásával elérhetők tünetmentes időszakok, illetve remisszió. Sajnos azonban ezek a szerek egy idő után hatástalanná válnak – hozzászokás vagy immunreakció kialakulása miatt – így újabb és újabb gyógyszerek alkalmazására van szükség. A gyógyszeres kezelés mellett egyéb lehetőségek is rendelkezésre állnak, mint például gyógytorna, fizikoterápia és UV-fény terápia, illetve súlyosabb esetben akár ortopédsebészeti műtéti beavatkozásra kerülhet sor. A kezelés hatékonyságának növelésében, a szövetkárosodás elkerülése érdekében fontos tehát a betegség mielőbbi diagnosztizálása. Ma olyan érzékeny, a betegség korai felismerésére alkalmas laboratóriumi és képalkotó (röntgen, izotópvizsgálat, MRI) eljárások állnak rendelkezésre, melyekkel a betegséget a tünetek megjelenése után heteken belül diagnosztizálni lehet. Mivel azonban a kóros folyamat, az autoantitestek termelődése már évekkel a tünetek megjelenése előtt elindul, szükséges volna ezen korai stádium diagnosztizálása, amely ma még nem teljesen megoldott feladat. A rheumatoid arthritis a III. típusú, azaz immunkomplex-mediált túlérzékenységi reakciók csoportjába sorolható be. Az RA-ban szenvedő betegek szérumából az autoantitestek két jelentős csoportja mutatható ki [2]. A reumafaktor (RF) a humán IgG Fc régiójával reagáló, IgM, IgG valamint IgA izotípusú ellenanyag, amely a betegek 80 százalékában jelen van. Megemlítendő, hogy az RF más autoimmun betegségben szenvedőkben, sőt egészséges emberek 15 százalékában is kimutatható. Az anti-citrullinált protein autoantitestek (ACPA) egyes citrullinált fehérjéket felismerő IgG, IgM vagy IgA izotípusú ellenanyagok. Az ACPA-ra jellemző, hogy jobban prognosztizálnak, a szintjük stabilabb, mint az RF-é. Az ACPA-k jelenléte RA-ban más autoimmun betegségben szenvedők szérummintáival összehasonlítva a reumafaktornál nagyobb szenzitivitást és specificitást mutat [3], [4] . A betegség kialakulása előtt akár 5 - 10 évvel kimutathatók a szérumból, ezért a betegség előrejelzésére már tünetmentes állapotban is alkalmazhatók.
3.2 A citrullináció fiziológiás funkciója és szerepe rheumatoid arthritisben A citrullináció a szervezetben fiziológiásan is lejátszódó reakció, melyben peptidil arginin deimináz (PAD) enzimek aktiválódása következtében, poszttranszlációs módosulásként egyes fehérjék bizonyos argininjei citrullinná módosulnak. Az arginin erős bázikus tulajdonságával ellentétben a citrullin semleges, így a módosulás befolyásolja a fehérje össztöltését, a
9
töltéseloszlást, megváltozik az izoelektromos pont, illetve változások lépnek fel az ionos és hidrogénkötések erősségében. Ezen változások összességének hatására módosulhat a fehérje elsődleges, másodlagos és harmadlagos szerkezete (1. ábra), de bekövetkezhet denaturáció is. A szerkezetváltozás jelentős befolyást gyakorolhat más fehérjékkel történő interakciókra [3], [5]. A PAD a Ca2+-kötő enzimek csoportjába tartozik, aktivációjához magas Ca2+ koncentráció szükséges. Normális körülmények között az enzim inaktív, aktivitást csak extrém körülmények között (pl. gyulladás, apoptózis) mutat [6]. A PAD szerepet játszik többek között az epitél sejtek terminális differenciációjában, a génexpresszió szabályozásában, valamint az apoptózis folyamatában. A terminális differenciáció során a citokeratin polimerizációjáért illetve a filaggrin profilaggrinból való kialakulásáért felelős. Apoptóziskor a vimentin citrullinációja miatt annak depolimerizációja következik be, a sejt elveszíti az intermedier filamentum hálózatát, ezáltal a sejtalak megváltozik. A génexpresszió szabályozásában a hisztonfehérjék, illetve nukleofozmin citrullinációja játszik szerepet [6]. A nukleofozmin ribonukleoprotein struktúrákhoz kapcsolódó fehérje, a riboszóma létrehozásában és a nukleoluszban zajló transzprotfolymatokban van szerepe. Fehérjék citrullinációja szerepet játszik patológiás körülmények között különböző kórképek kialakulásában is, így a multiplex sclerosisban, Alzheimer-kórban, és a rheumatoid arthritisben. RA betegek 60-70 %-ánál az ízületi saját antigének citrullinációja lehet felelős az immunológiai tolerancia áttöréséért (1. ábra).
10
Citrullin
Arginin
Aktív enzim
PADI
Citrullináció
A harmadlagos szerkezet megváltozása
T-sejt aktiváció 1. ábra: A citrullináció következtében a fehérjék harmadlagos szerkezete megváltozik, a
Negatív töltésű megváltozott aminosav
Arginin
saját felismerése felelős az immunológiai tolerancia áttöréséért [3] (módosítva) Citrullin
3.3 A rheumatoid arthritis patogenezise A betegség kialakulásának hátterében az immunrendszer kóros működése áll, melynek lényege, hogy az a saját fehérjék ellen indít támadást, de mivel azok végleges eliminácója nem következhet be, krónikus gyulladás alakul ki. A „shared epitóp” elmélet szerint a folyamat kialakulásában olyan, az MHC II HLA-DRB1 alléljei által kódolt „shared epitóp” (QKRAA/QRRAA/RRRAA) által felismert peptidszekvenciák játszanak szerepet, amelyek a saját epitópokhoz igen hasonlóak. Ezek a szekvenciák számos krónikus fertőzésért felelős mikroorganizmusban is kifejeződnek. Ezzel magyarázható, hogy bizonyos bakteriális fertőzéseket követően, molekuláris mimikri révén autoimmun betegség alakulhat ki. Az ACPA-k akár évekkel a tünetek megjelenése előtt kimutathatók a később RA-ban szenvedő betegek szérumából. Ha egyszer megjelennek, nagy valószínűséggel kialakul a betegség, ami arra utal, hogy fontos kapcsolat van a citrullinált antigének ellen kialakult immunválasz és az RA között. Valószínű, hogy az antitest termelés és a betegség kialakulása két külön esemény [7]. Ugyanakkor meg kell jegyeznünk, hogy az RA betegek körülbelül egyharmada ACPA negatív. A jelenlegi feltételezés szerint az RA kialakulásához szükséges
11
egy második hatás is. Például egy trauma, vagy átmeneti fertőzés, mely együtt jár az ízületek gyulladásával. Ez kiváltja a PAD enzim aktivációját és ennek következtében az ízületi peptidek/fehérjék citrullinációját [8]. ACPA-pozitív RA kialakulása során, a citrullinált saját molekulákra specifikus ellenanyagok először az ízületen kívül (pl. a tüdőben) alakulnak ki, ahol a dohányzás és szennyező anyagok hatására a PAD enzim aktivitása fokozott mértékű. Az ACPA és az ízületi citrullinált antigének immunkomplexeket képeznek, amelyek gyulladási folyamatokat indítanak el az ízületekben [8], [9](2. ábra). Önmagában sem a dohányzás, sem a PAD aktiváció nem vezet ACPA termelődéshez [10].
Immunkomplex képződés
2. ábra: A betegség kialakulásának modellje [9] (módosítva) RA-ban az ízület gyulladása során az ízületi hártya sejtjei számos osztódáson mennek keresztül, kialakul a pannus, amely ráterjed a porc felszínére és annak károsodását idézi elő. A folyamat során új erek képződnek, melyekből fehérvérsejtek képesek az ízületi térbe vándorolni [7]. A stimulált rétegbe diffúz módon beszűrődnek a T- és B-sejtek. Follikuláris struktúrában felhalmozódnak a limfociták, majd granulomaszerű reakció alakul ki az ízületi membránban. Az aktivált T-sejtek gyulladási citokineket termelnek [11], és részt vesznek a makrofágok aktivációjában, illetve a T-sejtektől függő B-sejt aktivációban. Egyes citokinek (IL-1, TNF-α) hatására az ízületi fibroblasztokban a mátrix metalloproteinázok
12
termelése jelentősen fokozódik, melyek aktivitása következtében a mátrix degradálódik [12]. A mátrix metalloproteinázok (MMP) szubsztrátjai a fibrilláris kollagén, fibronektin, laminin és a fibrin. Az MMP-k egymás aktivációjáért is felelősek. Szintén az IL-1, TNF-α illetve az IL-17 hatására a RANKL upregulációja következik be, amely kiemelt szerepet játszik az oszteoklasztok differenciálódásában, aktivációjában. A fokozott oszteoklaszt aktivitás a csont eróziójához (3. ábra) vezet [2], [13]. A hyalinporc és csontszövet ezúton történő károsodása felelős a betegek mozgáskorlátozottá válásáért.
3. ábra: Röntgenfelvétel a kéz csontjainak eróziójáról [1]
3.4 ACPA-k fajtái és felfedezésük története Az első ACPA-t „anti-perinuclear factor” (APF) néven 1964-ben detektálták. Az ellenanyag a humán nyelőcső nyálkahártya membrán epitél sejtjeinek keratohialin szemcséivel reagált
13
[4]. RA-s betegek 50-70 %-ban volt kimutatható, szenzitivitása alacsonynak adódott. 1979-ben detektálták az „anti-keratin antibody”-t (AKA), humán és patkány nyelőcső minták vizsgálatakor, az ellenanyag a nyelőcső elszarusodó hámrétegével reagált [4, 7], [14]. Valamivel alacsonyabb szenzitivitása volt (kb. 40-60%), mint az APF-nek (kb. 90 %). A két ellenanyag specificitása viszont hasonló mértékű volt [14]. 1993-ban azonosították mindkét ellenanyag antigénjét, amit nem a keratin, hanem a filaggrin. A filaggrin a keratin-filamentumokhoz kapcsoltan helyezkedik el elszarusodó hámsejtekben [4]. További kutatások során kimutatták, hogy az APF olyan fehérjéket ismer fel, mely az arginin helyett egy szokatlan aminosavat tartalmaztak, a citrullint. Ezt más RA-specifikus ellenanyagok által felismert fehérjékben is azonosították. Bár a specificitása eltérő ezen antitesteknek, és valószínűleg a citrullináltság mértéke is befolyásolja a felismerést, de abban megegyeznek, hogy mindegyikük citrullinált antigéneket ismer fel. Ezért a megnevezésük anti-citrullinated protein/peptide antibody (ACPA) [7]. A továbbiakban két irányba indult el a diagnosztikai kitek létrehozása, a citrullinált protein illetve a citrullinált peptid alapú kitek fejlesztése indult el [4]. A peptid alapú tesztekben a citrullin beépítése peptid szintézis közben zajlik, míg a protein alapú tesztekben a citrullináció szintézis után, izolált PAD enzim általi deiminálással történik. Az első generációs anti-ciklikus citrullinált peptid (anti-CCP) tesztek alapját a humán filaggrinból származó szintetikus, lineáris peptidek alkották, melyek szenzitivitását ciklizálással növelték meg [15]. A második és harmadik generációs tesztekben (CCP2 és CCP3) antigénként a filaggrinnal nem homológ peptidek keveréke szolgált [3]. Az anti-CCP2 tesztek specificitása az RA szérum ellenanyagok kimutatásában kb. 90 - 98 %, szenzitivitása 60-80 % körüli [14, 16]. A protein alapú tesztek közül kiemelendő az MCV (mutated citrullinated vimentin) teszt, melynek antigénje a citrullinált vimentin. 1994-ben egy új RA-specifikus antitestet írtak le, melyet az első beteg neve alapján (Savoie) anti-Sa-nak neveztek el. Ennek az új ellenanyagnak a jelenléte RA-ban igen magas specificitást mutatott (kb. 92-98 %) és már nem csak diagnosztikai, hanem prognosztikai jelentőséggel is rendelkezett. Az anti-Sa szeropozitív egyénekben súlyosabb lefolyású betegség alakult ki. 2004-ben azonosították, hogy az anti-Sa antitest szubsztrátja nem más, mint a citrullinált vimentin. Az RF negatív RA betegek kb. 27%-ában kimutatható volt anti-Sa. RA betegek ízületeiben az eredetitől eltérő, módosított citrullinált vimentint mutattak ki, ezért mutáns citrullinált vimentint használnak antigénként az ELISA tesztben anti-Sa detektálására (MCV teszt) [14], [17] (4. ábra).
14
Anti- Perinukleáris Faktor
Anti- Keratin Antitestek
Anti- Filaggrin Antitestek
Anti- Citrullin Származék Antitestek
Anti- Citrullinált Protein Antitestek
Deiminált Deiminált Rekombináns Vimentin Vossenaar Filaggrin 2004
Anti- Citrullinált Peptid Antitestek
Deiminált Szintetikus Ciklikus Citrullinált Peptidek Fibrin
EBNA-1 Peptid
4. ábra: ACPA autoantitestek és az eddig kifejlesztett diagnosztikai kitek összefoglalása [3]
3.5 Genetikai háttér és környezeti faktorok szerepe A rheumatoid arthritis kialakulási kockázata körülbelül 50 %-ban genetikailag meghatározott. A betegségben háromszor annyi nő érintett, mint férfi. A betegség tényleges kialakulásában a genetikai háttér, és számos környezeti faktor interakciója egyaránt szerepet játszik. Régóta
15
ismert, hogy bizonyos, MHC II osztályba tartozó HLA allélek (HLA-DRB1) összefüggésbe hozhatóak a kórral. Az RA megjelenése korrelációt mutat a HLA-DRB1 β-láncában expresszálódó specifikus, konszenzus aminosav szekvenciával (QKRAA/QRRAA/RRRAA), ez a „shared epitóp” [18]. Ez a struktúra az MHC molekula peptidkötő zsebének kialakításában vesz részt. A kaukázusi népcsoporthoz tartozó RA betegek 80-90 %-ánál kimutatható a „shared epitóp”. Azt is kimutatták, hogy a HLA-DR1 és HLA-DR4 alléljának jelenléte ACPA pozitivitásra hajlamosít az azt hordozó egyedekben, ugyanakkor a HLA-DR3 allél hordozói ACPA negatívak [19]. Bizonyos környezeti faktorok, például a hosszú távú dohányzás jelentős kockázati tényező a betegség kialakulásában. A dohányzás következtében a tüdőbe jutott toxikus anyagok a sejtek apoptózisához vezetnek. Az apoptotizáló sejtekben a PAD aktiválódik, ennek következtében fokozódik a citrullináció, ami a shared epitópot hordozó egyénekben fokozottan növeli az RA kialakulásának rizikóját [20]. A citrullináció több fehérje esetében lehetővé teszi az antigénfelismerést, ugyanis egyes citrullinált peptidek tökéletesen illenek a shared epitóp P4es zsebébe, míg az arginintartalmú peptidek nem [5]. Feltehetően fertőző ágensek, mint Epstein-Barr vírus (EBV), Mycobacterium tuberculosis, Escherichia coli, Proteus mirabilis, retrovírusok és Parvovírus B19 szintén szerepet játszhatnak a kóros folyamat elindításában, egyrészt molekuláris mimikri, másrészt gyulladási citokinek fokozott termeltetése következtében [20]. Ugyancsak szoros kapcsolat mutatkozik az RA és a periodontitisz betegség között, melynek kórokozója, a Porphyromonas gingivalis - a baktériumok közt egyedülálló módon - PAD enzimet expresszál. A két betegség együttes jelenléte esetén a P. gingivalis elleni antitestek erős korrelációt mutatnak az anti-CCP antitestekkel [21]. Az is ismert, hogy sérüléskor, illetve más behatásokra fellépő nekrózis esetén a membránintegritás megszűntével a PAD kiáramlik az intersticiális térbe, majd aktiválódik az ott jelenlévő magas Ca2+-szint következtében. Ez a jelenlevő fehérjék citrullinációját okozhatja. Összefoglalva, a shared epitóp hordozó egyénekben a fertőző ágensekkel való fertőzést követően bekövetkezhet a saját, citrullinált fehérjék felismerése, ami az RA kialakulásához vezet.
16
3.6 A vizsgált, citrullinációs célpontként szereplő fehérjék biológiai funkciója A vimentin főleg mezenchimális sejtekben lévő intermedier filamentum, aminek fontos szerepe van a sejt szerkezetének fenntartásában [17]. Megtalálható az ízületi membránban és extracellulárisan is, ezért RA-ban fontos autoantigénnek tartják. Kutatások szerint az anti-citrullinált vimentin ellenanyagok nem csak érzékeny és specifikus szerológiai markerei az RA-nak, hanem közvetlenül részt is vesznek a betegség patogenezisében [17], [22]. A PAD enzim fontos a vimentin filamentum depolimerzációjában. Az enzim indukálja a filamentum szétszerelődését (pl. apoptóziskor). Ennek eredményeként a finom vimentin filamentum hálózat átalakul, és amorf klaszterek keletkeznek a sejtmag körül. Ez a sejtmag körüli kondenzáció kiváltja a kromatin szerkezet sérülését. Kísérlettel is kimutatták, hogy ha monocitáknál és makrofágoknál apoptózist indukálnak, akkor szelektív vimentin citrullináció figyelhető meg. Gyulladt ízületben a hosszú ideje aktiválódott makrofágok apoptózissal elpusztulnak, melynek következtében az intracelluláris vimentin citrullinálódik bennük. Az extracelluláris proteinek - mint például a fibrin - később módosulnak, miután a PAD enzim kiszivárgott a „haldokló” makrofágokból [8]. A vimentin fehérje fontos molekula a T-sejt válasz kiváltásában: összehasonlították a vimentin és fibrinogén peptid T-sejt aktivációra kiváltott hatását HLA-DR4 transzgénikus egerekben. A két peptid közül a vimentin esetében csak a citrullinált változat váltott ki nagyobb T-sejt aktivációt és IFNγ termelést, míg fibrinogén esetében nem volt szignifikáns különbség a natív és a citrullinált forma között. Tehát elmondható, hogy a citrullinált vimentin fontosabb a T-sejt válasz kiváltásában, mint a fibrinogén [8], [23]. A filaggrin a humán epidermisz keratinfilamentumaihoz kapcsolódó fehérje, a profilaggrinból alakul ki az epitheliális terminális differenciálódás során, és a sejtek keratohyalin granulumaiban raktározódik. A profilaggrin 10-12 tandem filaggrin egységet tartalmaz, az elszarusodás folyamata alatt válik elérhetővé a proteázok számára. A filaggrin egységek felszabadulnak, majd citrullinálódnak [24]. A filaggrin szerepe az RA kialakulásában még nem tisztázott, mivel a filaggrin nem található meg az ízületekben. A citrullinált filaggrint felismerő ACPA esetében valószínűleg keresztreakcióról van szó [25]. A kollagén a kötőszövet egyik fő alkotója, három hélixből (két α1 és egy α2 láncból) felépülő fehérje. A kollagén rost tropokollagén alegységekből áll, azok kovalens kapcsolódásával jön létre. A II típusú kollagén az ízület fő alkotóeleme, a hyalinporc kollagéntartalmának 80-90%a, kollagén elleni autoantitestek a betegek közel 30 százalékából kimutathatóak [26], [27]. A
17
szinoviális membránban kollagén specifikus T-sejtek jelenlétét is sikerült igazolni [28], [29]. Azonban ebben az esetben sem tisztázott, hogy az ellenanyagok jelenléte és a betegség kialakulása között van-e valós összefüggés, ugyanis az anti-kollagén autoantitestek nem csupán a kollagén citrullinált formájával reagálnak [30], [31].
3.7 Vizsgálatok a rheumatoid arthritis egér modelljében, a kollagén indukált arthritis (CIA) modellen A rheumatoid arthritis kísérletes állatmodelljei rendkívül fontos szerepet játszanak a betegség patomechanizmusának jobb megértésében, valamint a hatékony és biztonságos terápia fejlesztésében. A rágcsáló modellek számos fontos információt tártak fel a betegség mechanizmusáról, még az eltérő genetikai háttér ellenére is. A kollagén indukált arthritis a humán rheumatoid arthritis széles körűen alkalmazott állatmodellje, annak rendkívül hasonló immunológiai háttere miatt: jellemző a rendkívül magas autoantitest-termelés és a kollagén-specifikus T-sejtek jelenléte [32]. Mivel a CIA a II típusú kollagén MHC-korlátozott felismerésétől függő modell, az immunválasz mértéke jelentősen eltér az egyes egértörzsek között. A betegség DBA/1 egértörzsben váltható ki II típusú szarvasmarha kollagén oltásával [33]. A II típusú kollagénben a 358-369 aminosavak között leírtak egy immunodomináns, triplahelikális B-sejt epitópot, amely az arthritissel összefüggésbe hozható [34]. Az arthritogén anti-kollagén immunkomplex kristályszerkezetének megoldása arra utal, hogy az autoantitestek a CII egy konzervált régiójához kötődnek [35]. Kimutatták, hogy ezt az epitópot felismerik RA betegekből származó szérumok, de ez nem tapasztalható más donorokból származó szérummal. Továbbá két, erre a triplahelikális epitópra specifikus monoklonális ellenanyaggal sikerült arthritist kiváltani az arra nem hajlamos BALB/c egerekben [36, 37]. Az is ismert, hogy az anti-CII IgG tartalmú immunkomplex képes a betegség lefolyását módosítani az aktiváló Fcγ receptorhoz kötődésen keresztül [38], [39]. Az IgG tartalmú immunkomplexek nagyon fontos tényezők az arthritis pathogenezisében: szabályozó szerepük van mind a CIA centrális, mind pedig az effektor fázisában [40].
3.8 Az Fcγ receptorok szerepe a CIA kialakulásában
18
Az egérben az IgG receptorok négy csoportja került azonosításra: FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII és FcγRIV [41, 42]. Ezek közül az FcγRI, FcγRIII és FcγRIV széles körűen expresszálódnak különféle fehérvérsejteken: neutrofil granulocitákon, makrofágokon, NK sejteken és dendritikus sejteken. Képesek sejtaktivációs szignálok közvetítésére az ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif ) motívumukon keresztül [41, 43-45]. Ezzel ellentétben, az FcγRIIb ITIM motívumot (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) tartalmazó, gátló receptor [46-48]. Az FcγRIIb B-sejteken, makrofágokon, dendritikus sejteken és hízósejteken is expresszálódik. Az FcγRIIb hiánya fogékonnyá teszi a normális körülmények között ellenálló egértörzseket különböző, ellenanyag vagy immunkomplex-függő autoimmun betegségekre [49-51]. Az aktiváló és gátló FcγR szignálok egyensúlya messzemenően befolyásolja a betegség kimenetelét: az FcγRIIb gátol, míg az aktiváló Fcγ receptorok serkentik a CIA kialakulását [42, 52, 53]. Ezt alátámasztja, hogy FcR γ lánc-deficiens egerek teljes mértékben rezisztensek az ellenanyag-mediált arthitisre [38].
4. Célkitűzések: A doktori munkám célja A) a rheumatoid arthritis diagnosztizálása és prognosztizálása során alkalmazható, új citrullin tartalmú peptidek azonosítása, amelyek egyben alkalmasak egy jövőbeni terápia fejlesztésére. B), További célunk volt a rheumatoid arthritis egér modelljén, a kollagén indukált arthritisben (CIA) a kollagén peptidből és az FcγRII-höz irányító egyláncú
19
ellenanyag molekulából álló mesterséges komplexek hatását tanulmányozni a CIA lefolyására és patomechanizmusára. A következő kérdéseket tettük fel: A) 4.1. Az RA betegek szérum mintáiban jelenlevő ACPA által felismert fehérjék (filaggrin, vimentin, kollagén) előzőleg - részben általunk - feltérképezett szekvenciáinak megfelelő citrullinált peptidek, illetve az ezekből álló peptid-panel alkalmas-e az autoantitest profil meghatározására, és ad-e többletinformációt a betegekről a jelenleg elérhető, az ACPA kimutatásra alkalmas kitekkel (anti-CCP2) összehasonlítva? 4.2. Felismerik-e az RA betegek B-sejtjeinek receptorai (BCR) az előző vizsgálatok során azonosított citrullin tartalmú peptideket? Alkalmasak-e a citrullinált epitópok az autoreaktív B-sejtek izolálására? 4.3. Alkalmasak-e a citrullin tartalmú peptidek a B-sejtek autoantitest termelésének vizsgálatára? B) További célunk a betegség patomechanizmusának vizsgálata, különös tekintettel az immunkomlplex-mediált folyamatokra CIA modellben. A kezelés során négy csoportot vizsgáltunk: a kontroll CIA állatokat, a kollagén peptid-extravidin tetramerrel oltott állatokat, a 2.4G2 egyláncú (FcγRII/III specifikus) ellenanyag – extravidin tetramerel oltott állatokat, ill. a mesterséges ’immunkomplexszel’ (kollagén peptid – extravidin- 2.4G2) kezelt állatokat. 4.4. Eltér-e a CIA-ban a betegség kialakulása és lefolyása a fenti állatcsoportokban a különböző komplexekkel való kezelés hatására? 4.5. Milyen az extravidin-FITC tartalmú komplexek lépben való eloszlása, milyen sejtekhez kötődnek a komplexek in vitro és in vivo? 4.6. Hogyan befolyásolják a komplexek a kollagén fehérje elleni és a kollagén peptid elleni ellenanyagtermelést?
20
4.7. Változik-e a citokin- és kemokintermelés a különböző komplexek hatására CIA egerekben?
5. Anyagok és módszertan 5.1 Anyagok és reagensek Ellenanyagok: Rabbit Anti-Human IgG HRPO konjugátum (Dako), Mouse Anti-Human CD 19 APC (BD Pharmingen), Mouse Anti-Human CD 27 PE (BD Pharmingen), Mouse Anti-Human CD 3 FITC (BD Pharmingen),Mouse Anti-Human CD 14 APC (BD Pharmingen), Goat AntiMouse IgG HRPO (Southern Biotech), Goat Anti-Mouse IgG2a (Southern Biotech), Rat Anti-
21
Mouse MARCO ( IBL-12 klón, Pécs), Goat Anti-Rat IgG Cy3 (7G6 klón, Pécs), Rat AntiMouse CR1/2 PE (Soft Flow Inc.), Rat Anti-Mouse CD45R (B220)- PerCP/Cy5.5 (AbD Serotec), Hamster Anti-Mouse CD11c-Alexa 647 (AbD Serotec), Rat Anti-Mouse F4/80Alexa 647 (eBioscence Ltd.)
Reagensek: Ficoll-Paque (GE Healthcare), CpG (Sigma), Rh-IL-2 (Immunotools), NeutrAvidin (Thermo Scientific), BSA (Sigma), cryostat-embedding medium (Killik; Bio-Optica), BirA (Avidity LLC ), bovine type II kollagén (Chondrex Inc.), komplett Freund adjuváns (Chondrex Inc.) FluoSpheres NeutrAvidin 1,0 µm, yellow-green fluorescent (Invitrogen), RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail (Stemcell), MACS CD 19 MicroBeads, human (Miltenyi Biotec) Human IgG ELISpot Plus kit (MabTech), Anti-MCV® (Orgentec), CCPlus® IMMUNOSCAN (Euro Diagnostica), Quantikine ELISA kitek TNFα, IL-17, IFNγ, IL-10 (R&D Systems), Mouse Cytokine Array, Panel A (R&D Systems), FlowCytomix (Bender Med Systems)
5.2 A vizsgált peptidek Vizsgálataink során szintetikus peptid párokat teszteltünk, az egyik arginint, a másik citrullint tartalmazott. A peptidszekvenciákat egyrészt az irodalomban megjelent eredmények [54], [55] másrészt saját előzetes eredményeink alapján választottuk ki. Mivel az ELISA módszer során a peptideket a szilárd fázishoz neutravidin-biotin kölcsönhatás segítségével kötjük ki, vizsgáltuk, hogy milyen hatással van a kölcsönhatásra, hogy a peptid a C- vagy az Nterminálison tartalmazza a biotint. Azt tapasztaltuk, hogy a rövid peptidek csak akkor kötődtek ki megfelelően, ha a C-terminálison voltak biotinálva. A másik szempont, a linker és biotin optimalizálása volt. A biotint vagy lizinen (K) keresztül vagy egy plusz linker (Ttds 4,7,10-trioxa-1,13-tridekándiamino borostyánkősav) segítségével kapcsoltatták a peptidekhez, illetve a biotin két változatát használva, az egyik a molekula hosszabb láncú formája (LC biotin, biotinhexánsav). A hosszabb láncú biotin nagyobb teret biztosít a peptidnek, hogy az ellenanyag molekulák jól megközelítsék az oldatban [56]. A csoport által legjobbnak talált optimalizált peptid párokat használtuk vizsgálataink során (1. táblázat). A peptidek szintézisét az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportjában Dr. Magyar Anna vezetésével végezték.
22
1. táblázat: Az optimalizált peptidpárok és szekvenciáik
5.3 Betegcsoportok A vizsgálatokhoz 156 RA betegből származó 209 szérum és vérmintáit használtuk fel, melyet a Budai Irgalmasrendi Kórházból Dr. Nagy György és Dr. Rojkovich Bernadette bocsátott Peptid Filaggrin (19-mer) C-term. LC- biotin
Kontroll szekvencia 306
SHQESTRGRSRGRSGRSGS326
Citrullin tartalmú szekvencia SHQESTXGXSXGRSGRSGS
Filaggrin 311
TRGRS315
TXGRS
SAVRARSSVPGVR77
SAVRAXSSVPGVR
(5-mer) C-term. Ttds-biotin Vimentin C-term. biotin II típusú kollagén C-term. biotin
65
359
ARGLTGRPGDA369
AXGLTGXPGDA
rendelkezésünkre. A betegek közül 140 nő és 26 férfi volt, átlagéletkoruk (±SD) 57 ± 14 év (tartomány: 22-83 év) volt. Összehasonlításul 164 kontroll (H) (ezeket Dr. Prohászka Zoltán, a Semmelweis Egyetem III. sz. Belgyógyászati Klinika munkatársa bocsátotta rendelkezésünkre) személy szérum és vérmintáit vizsgáltuk meg, ezek közül 16 kontroll személy SLE-ben (systemic lupus erythematosus) szenvedett, a fennmaradó 148 személy önkéntes egészséges egyén volt. Az etikai engedély száma: 376/PI/10.,5257-0/20101018EKU. A szérumot natív csőbe levett vérből készítettük. Az alvadási reakció lejátszódása után, az alvadékot centrifugálással választottuk el a szérumtól (2000 g, 4ºC, 10 perc). A szérummintákat felhasználásig -20 és -70º C-on tároltuk. Az általunk vizsgált betegek B-sejt depletáló biológiai terápiában (Rituximab/MabThera) nem részesültek, de gyulladáscsökkentő, immunszuppresszív kezeléseket, és egyes esetekben biológiai terápiát kaptak (Metotrexát, Medrol, Humira, Enbrel, Infliximab). A betegeknek ismert volt az RF titere, az Anti-MCV (Orgentec) és anti-CCP2 tesztet (CCPlus® IMMUNOSCAN, Euro
23
Diagnostica) a laborban végeztük. Az általunk, peptidekkel kapott eredményeket ezekkel a tesztekkel kapott értékekkel hasonlítottuk össze. Eredményeinket szintén összevetettük a betegség aktivitásáról információt adó DAS28 index- szel (DAS = disease activity score). Az index értékelése során megszámolják a duzzadt és nyomásérzékeny ízületek számát, mérik az akut fázisfehérjék termelődését jelző CRP (C-reaktív protein) szintet vagy vörösvérsejt süllyedés mértékét és vizsgálják a fájdalom intenzitását. DAS28 index 3,2 alatt mérsékelt, 3,2 és 5,1 között közepes, míg 5,1 feletti értéke kifejezett gyulladási aktivitásra utal.
5.4 Multipin ELISA Munkánk legelején Multipin ELISA módszerrel kerestük a filaggrin minimál epitópját, illetve a vimentin fehérjét is feltérképeztük átlapoló szekvenciák segítségével. A Multipin™ NCP (non cleveable peptid) szintézis szilárd fázisú peptid szintézis megfelelően derivált tűhegyeken végzett szilárd fázisú peptid szintézist jelent, a szintézis végén a peptidek 96 tűn, a biológiában használatos standard 8 x 12-es szabványos mikrotitráló lemeznek megfeleltethető elhelyezkedésben állnak rendelkezésre. A szilárd fázisú peptidszintézis alapelve, hogy a peptid C-terminálisán lévő aminosav karboxil csoportját a szintézis végéig kovalens kötéssel egy oldhatatlan hordozóhoz, a megfelelően kiválasztott gyantához kapcsolják. A Multipin™ NCP technika alkalmazása esetén, a szintézis végén a peptidek kovalensen kötve maradnak a tűhegyen. A peptidek szintézisét az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportjában Dr. Magyar Anna vezetésével végezték. Az általunk használt tesztben (2. táblázat) az 5 tagú filaggrin peptiden szitematikus arginin-citrullin csere lett végrehajtva, így valamennyi lehetséges variáció felismerése összevethető volt (filaggrinXX, filaggrin RX, filaggrin XR). A tűhegyeket 2% BSA, 0,1% Tween PBS-ben blokkoltuk 1 órán át rázatóasztalon, szobahőmérsékleten. A szérumot ötvenszeresére hígítottuk (2% BSA, 0,1% Tween-PBS) oldatban, 200 μl oldatot mértünk be a mikrotitráló lemez lyukaiba, ebbe mártva inkubáltuk a tűhegyeket rázatóasztalon, 4˚C-on egy éjszakán át. Mosást követően 1:2000 HRPO enzimkapcsolt nyúl anti-humán IgG specifikus másodlagos ellenanyaggal inkubáltunk a tűhegyeket (2% BSA, 0,1% Tween tartalmú PBS oldatban). A színreakciót TMB enzimszubsztrát (0,1 mg/ml) hozzáadása után, 5-10 perc elteltével detektáltuk ELISA Reader segítségével (450 nm). Az enzimreakciót 2 N H2SO4-val állítottuk le (50 μl/lyuk).
24
Regeneráció: a polietilén tűhegyre kötődött ellenanyagok eltávolítása céljából 1 l PBS-hez kimért 100 ml 10% SDS oldatot és 1 ml 2-merkaptoetanolt tartalmazó oldatban, 65˚C-on szonikáltuk 20 percig, majd desztillált vízben inkubáltuk fél órán át rázótermosztátban 60˚Con. Az inkubációs idő lejártával 15 másodpercre 60˚C-os metanolba mártottuk a tűhegyeket, majd 10 percig hagytuk száradni. Minden 5. teszt után TMB szubsztrátba mártással ellenőriztük a regeneráció megfelelő voltát.
Vizsgált peptid Filaggrin19-mer Kollagén (II típus) Fibrin alfa Fibrin béta Vimentin Vimentin65-77 FilaggrinXX FilaggrinRX FilaggrinXR
Normál szekvencia
Citrullinált szekvencia
SHQESTRGRSRGRSGRSGS
SHQESTXGXSXGRSGRSGS
ARGLTGRPGDA
AXGLTGXPGDA
GPRVVERHQSACKDS
GPXVVEXHQSACKDS
RPAPPPISGGGYRAR
XPAPPPISGGGYXAX
STRSVSSSSYRRMFG
STXSVSSSSYXXMFG
SAVRARSSVPGVR
SAVRAXSSVPGVR
TRGRS
TXGXS
TRGRS
TRGXS
TRGRS
TXGRS
2. táblázat: A Multipin ELISA-ban a tűhegyre kötött peptidek szekvenciái
5.5 Indirekt ELISA 96 lyukú ELISA mikrotitráló lemezeket fedtünk 5 μg/ml neutravidinnel, 4 ºC-n inkubáltuk egy éjszakán át. Háromszori mosás (0,05 % Tween 20 / PBS) után a lemezeket fedtük a
25
peptidekkel (1 μg/ml) 37ºC-on, 1 óráig. Háromszori mosás után a lemezeket fél óráig, 37ºC-on blokkoltuk 200 μl/lyuk blokkoló oldattal (2 % BSA / 150 mM NaCl / PBS). A szérumokat 1:100 hígításban vittük fel a lemezre (100 μl/lyuk, 2% BSA / 2 M NaCl / PBS-ben oldva), majd 4 ºC-on, rázatva inkubáltuk egy éjszakán át. Háromszori mosást követően, a lemezt 1 óráig fedtük, 37º C-on nyúl anti-humán IgG-HRPO másodlagos ellenanyaggal 1:2000 hígításban, (2 % BSA /150 mM NaCl / PBS-ben oldva, 100 μl/lyuk). A színreakciót TMB enzim-szubsztrát (0,1 mg/ml) hozzáadása után, 5-10 perc elteltével detektáltuk ELISA Reader segítségével (450 nm). Az enzimreakciót 2 N H2SO4-val állítottuk le (50 μl/lyuk).
5.6 Kompetitív ELISA a peptid-specifikus ellenanyagok közötti keresztreakció kimutatására A módszer során a szilárd fázishoz kötött antigént együtt inkubáltuk a szérumminta – peptid keverékével. A protokoll megegyezik a 3.3 pontban lévő indirekt peptid ELISA protokollal, azzal a kivétellel, hogy a lemezre kötött peptid és a szérumhoz adott peptid koncentrációja ennél a protokollnál 1 μM volt. A vizsgálatokhoz a betegcsoportból 8 RA beteg és a kontroll csoportból 6 szérum mintát használtunk fel.
5.7 Humán B-sejtek izolálása vérből, tenyésztés RA-s és egészséges egyének véréből tisztítottunk B-sejteket két féle módszerrel: -
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail (Stemcell) segítségével (negatív szelekciós ellenanyag-koktél): a vérmintát kétszeresére hígítottuk 2% FCS-PBS-sel, majd a minta minden ml-éhez 25 μl RosettSepet adtunk, és 20 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Inkubálás után 15 ml Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) oldatot rétegeztünk a vér alá, majd 2300 rpm-n centrifugáltuk 30 percig (RT), fék nélkül. A negatív szelekciós ellenanyagkoktél a B-sejteken kívül minden egyéB-sejtet a vörösvértestekhez kapcsol, így azok a sűrűséggradiens centrifugálás után a centrifugacső alján találhatóak. A ficoll és szérum közti felülethatárról leszívtuk a B-sejteket, majd kétszer mostuk steril PBS-2% FCS-sel (1300 rpm, 10 perc, RT).
26
-
Szintén izoláltunk sejteket MACS CD 19 MicroBeads, human (Miltenyi Biotec) mágneses mikrogyönygök segítségével. A vérből ficollon történő centrifugálással elkülönítettük a perifériás mononukleáris sejteket (PBMC). Sejtszámolás után a sejteket megjelöltük negatív B-sejt szelekciós biotin-ellenanyag koktéllal (10µl/107 sejt), majd 10 perc 4ºC-on történő inkubáció után 20µl anti-biotin mikrogyöngyöt adtunk a mintákhoz (/107 sejt). A jelölés Macs pufferben történt. 15 perc után a sejteket mostuk Macs pufferben (300g, 10 perc), majd a felülúszó leöntése után 500 µl pufferben vettük fel. Az oszlopot előzőleg mostuk 3 ml pufferrel, majd a sejtek felvitele után elkezdtük gyűjteni az átfolyó frakciókat. Az oszlopot tovább mostuk 3*3 ml pufferrel. A negatív szeparálás végén a tisztított B-sejteket megszámoltuk, és RPMI I 10% FCS médiumban vettük fel. A sejtfrakció tisztaságát áramlási citometriás módszerrel, anti-CD19 és anti-CD3 ellenanyagok segítségével ellenőriztük.
Sejttenyésztés: a sejteket 3 napig tenyésztettük CO2 termosztátban, 50 ng/ml rh-IL 2 és 1 µg/ml CpG jelenlétében. A beállított koncentráció 2-5 106 sejt/ml volt.
5.8 Peptid specifikus ellenanyagtermelő sejtek kimutatása ELISpot módszerrel Az ellenanyagtermelő B-sejtek kimutatásához a Mabtech human IgG ELISpot kitet használtuk. A lemez lyukait 70% EtOH-val nedvesítettük 2 percig, majd 5x mostuk steril vízzel, és humán IgG specifikus csapdázó ellenanyaggal (15 µg/ml) illetve neutravidinnel (5 µg/ml) fedtük. 2 óra inkubáció után a lemezt mostuk, majd fedtük biotinált petidekkel (10 µg/ml) egy órán át, 37ºC-os termosztátban. Blokkoláshoz RPMI I 10% FCS tartalmú médiumot használtunk. A 4.5 fejezet szerint izolált és 72 órán át 1 µg/ml R848-cal és 10 ng/ml Il-2-vel előzetesen aktivált sejteket 2-5 105 sejt/lyuk koncentrációban tettük ki a lemezre peptid specifikus ellenanyagtermelés vizsgálatához, teljes IgG termelés mérésénél ennek tizedét alkalmaztuk. A sejteket 22 órán át inkubáltuk CO2 termosztátban. A lemez mosása után azt fedtük anti-humán IgG-biotinnal (1 µg/ml), majd Streptavidin HRP-val. A lemezt TMB szubsztráttal hívtuk elő, majd 5 perc után vízzel állítottuk le a reakciót. A lemez szárítása után a kiértékelés ImmunoSpot programmal történt, az értékeket normalizáltuk 105 sejtre. Az eredmények 10 beteg és 10 egészséges egyén vérmintáinak felhasználásával készültek.
27
5.9 Peptid-specifikus B-sejtek kimutatása áramlási citometriával (FACS) Neutravidinnel fedett, fluoreszcens festékkel jelölt yellowgreen gyöngyöket (Invitrogen) (0,5 μl /minta) inkubáltunk a biotinált peptidekkel (15μg/ml) 1 órán keresztül, 37 ºC, rázatva, sötétben. A gyöngy-peptid komplexeket 3-szor mostuk 1 % BSA / PBS-sel (1 ml) 14 000 rpm-n centrifugálva, 4 percig. Mintánként 3,5-4 x 105 előzőleg szeparált B-sejtet inkubáltunk a peptid-gyöngy komplexszel 1/2 órán keresztül, enyhén rázatva, 4 ºC-on, sötétben. A B-sejt tisztaság ellenőrzésre CD3-APC (T-sejt marker), CD14-APC (monocita marker), illetve CD 20 APC (B-sejt marker) jelölés történt (5-5 μl /minta). A memóriasejtek elkülönítésére CD27APC-t használtunk. A fluoreszcensen jelölt ellenanyagokkal 20 percig inkubáltuk a sejteket, jégen, sötétben, majd 2-szer mostuk FACS pufferrel (PBS + 5 % FCS + 0,1 % azid), végül a mintákat 200 μl FACS pufferben vettük fel. Az ellenanyagok kötődésének mértékét FACSCalibur áramlási citométerrel mértük meg (50 000 sejt adatait gyűjtöttük be). A kiértékelés FlowJo programmal (TreeStar Inc.) történt. A gyöngyöket megkötő pozitív sejteket az FSC / SSC alapján felállított limfocita kapuból, a CD20 B-sejt marker segítségével kapuzott B-sejtek közül a gyöngy fluoreszcens csatornájában (FL1) detektáltuk. Az eredményekben a jelölődött (pozitív) sejtek százalékos arányát adtuk meg.
5.10 Peptidek hatása RA betegekből szeparált PBMC citokintermelésére RA betegekből izolált PBMC sejteket tenyésztettünk 4 napig, 30 μg/ml peptid, illetve pozitív kontrollként 1 μg/ml LPS és PHA jelenlétében. A negyedik napon a sejtek felülúszójában vizsgáltuk a peptidek hatását a citokintermelődésre. Áramlási citometriás módszerrel, a FlowCytomixszel (Bender MedSystems) vizsgáltuk a TNFα, IFNγ, IL-10 és IL-17 citokinek mennyiségét. A minták elkészítése a gyártó által ajánlott protokoll alapján történt. A módszer előnye, hogy egyetlen, kis térfogatú mintából (25 μl), több citokin koncentrációja is megállapítható, a biztosított standard sor alkalmazásával.
28
5.11 Kollagén indukált arthritis indukciója, a betegség fokának nyomonkövetése A DBA/1 egerek a Charles River Laboratories-ból származnak (Budapest, Magyarország), a CD16 és a CD64 KO egerek Dr. Mócsai Attilától kaptuk (Semmelweis Egyetem, Budapest, Magyarország) [57],[58]. Az egereket 8–16 hetes koruk közt használtuk a kísérletekre. Az állatkísérleteket az etikai engedélyeknek megfelelően (engedély száma: 21.2/828/003/2007) végeztük. A betegséget az alábbiak szerint indukáltuk: hathetes DBA/1 nőstény egereket immunizáltunk 100 μg CII - komplett Freund adjuváns (CFA) emulziójával. Az oltás szubkután, faroktőbe történt. A CII előzőekben 0.1M ecetsavban került beoldásra, 2 mg/ml koncentrációban. Az oltás utáni 30., 45. és 70. napon különböző komplexek kerültek ráoltásra, amelyeket az állatok intravénásan kaptak. A „kollagén-peptid tetramer” csoport 2.6 μg biotinilált CII-peptid (ARGLTGRPGDA) és 30 μg extravidin (4:1 moláris arányú) keverékével lett beoltva. A „2.4G2 scFv tetramer” csoport 60 μg biotinilált 2.4G2 scFv és 30 μg extravidin keverékét kapta (4:1 moláris arány). Az „immunkomplex” csoport 60 μg biotinilált 2.4G2 scFv, 2.6 μg biotinilált kollagén peptid (CII-peptid) és 60 μg extravidin (2:2:1 moláris arányú) keverékét kapta. A megadott mennyiségek egy-egy állatra vonatkoznak, PBS-ben oldva. A kontollcsoport csak PBS oltást kapott. Vérvételre a CIA indukciója utáni 35., 55. és a 70. napon került sor (5. ábra)
5. ábra: A komplex ráoltások és a vérvételek időrendje Minden állaton egyedileg követtük a betegség előrehaladtát. A CIA kialakulását vizuális skálán értékeltük [59]. A pontok 0-3 értékűek lehetnek végtagonként, az adott végtag megjelenésétől függően. Az értékelésnél figyelembe vettük a duzzanatot, a végtag vörösségét, valamint a szemmel is látható ízületi elváltozásokat. Egy állatra nézve a végtagonkénti pontokat összeadtuk, így a végső érték 0-12 értéket vehetett fel. A betegség előrehaladtát hetente kétszer értékeltük.
29
5.12 A 2.4G egyláncú ellenanyag (ScFv) tisztítása A 2.4G2 scFv plazmidja BL41 E. coli sejtekbe hősokkal lett transzformálva. A fehérjetermelés indukciója 0.5 mM IPTG hozzádásával történt. A sejteket 1 mg/ml lizozimmel és ultrahangos szonikálással tártuk fel. A His-taget tartalmazó egyláncú ellenanyagot 6 M ureában renaturáltuk, majd nikkel-oszlopon, affinitás kromatográfia segítségével tisztítottuk [60, 61]. A fehérjekonstukció tartalmaz egy címkét, amelyet az E.coliból származó BirA biotin ligáz képes felismerni. A biotinilálás a gyártó utasításai szerint történt [62, 63]. Az elkészült fehérje funkcionális integritását minden esetben ellenőriztük egér lépsejtekhez való kötődéssel, áramlási citometriás méréssel.
5.13 Áramlási citometriás mérések A különböző, extravidin-FITC tartalmú komplexek in vitro kötődési tesztje lépsejt szuszpenzión történt, három független kísérletben. 5×105 sejtet jelöltünk az előre elkészített komplexszekkel: biotinilált 2.4G2 scFv-vel és/vagy biotinilált CII-peptiddel, és extravidin-FITC-el 15 percig, jégen. A sejtek egyidejűleg jelöltük az alábbi ellenanyagokkal: anti-egér CD45R (B220)- PerCP/Cy5.5 (B-sejt marker), anti-egér CD11c-Alexa 647 (dendritikus sejt marker), anti-egér F4/80-Alexa 647 (makrofág jelölés). A mintaanalízist FACSCalibur áramlási citométerrel végeztük (Becton-Dickinson), az adatok értékelése FCS Express 3 szoftverrel történt (De Novo Software, Los Angeles, CA).
5.14 Extravidin-FITC tartalmú komplexek in vivo immunofluoreszcens lokalizációja A kollagénnel már immunizált állatokból eltávolítottuk a lépet az extravidin-FITC tartalmú komplexszekkel való oltást követő 15. percben, és fagyaszás közbeni beágyazó médiumba tettük őket, folyékony nitrogénben fagyasztottuk, majd -80 oC-on tároltuk felhasználásig. A lefagyasztott lépekből 8µm vastag metszetek készültek, amelyek hideg acetonban lettek fixálva 10 percig. A blokkolás nedves kamrában, 5% BSA-PBS oldattal történt, fél órán át. A
30
metszetek jelölése marginális zóna makrofág specifikus ellenanyaggal (MARCO, patkány IBL-12 klón [64]), történt, amit Cy3-jelölt kecske anti-patkány IgG-vel hívtunk elő. A metszeteket PE konjugált, anti-egér CR1/2 specifikus ellenanyaggal is jelöltük. A felvételek Olympus BX61 fluoreszcens mikroszkóppal készültek. A munkát Dr. Balogh Péter és Neer Zsuzsanna végezte.
5.15 Kollagén- és kollagén peptid specifikus ellenanyagok kimutatása A CII- és CII-peptid-specifikus IgG titert indirekt ELISA módszerrel határoztuk meg az állatok szérumából. Kollagén specifikus ellenanyagok detektálása esetén a lemezeket 5μg/ml szarvasmarha kollagénnel fedtük egy éjszakán át. A blokkolás 1% BSA-PBS-sel történt. A felvitt szérumokat 1:200 kiinduló hígításban, majd négyszeres hígítási sorban alkalmaztuk. A kollagén peptid specifikus ellenanyagszint meghatázozásához 5μg/ml neutravidinnel fedett lemezre vittük fel a biotinilált kollagén peptidet, 1μg/ml koncentrációban. A blokkoló puffer összetétele ez esetben 40 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0,5 % BSA and 0,1% Tween volt A kiinduló szérumhígítás 1:100 volt, majd ötszörös hígítási sort alkalmaztunk. A lemezeket mindkét esetben HRPO konjugált anti-egér IgG-vel, illetve anti-egér IgG2a-val inkubáltuk, az előhívás TMB szubsztráttal történt. A reakciót 2 N H2SO4-val állítottuk le. Az egyes hígítási pontokból végpont-titert számoltunk.
5.16 Citokin- és kemokinszint meghatározása A citokinek és kemokinek kimutatásához egér citokin array-t alkalmaztunk (Mouse Cytokine Array, Panel A, R&D Systems) , a gyártó utasításai szerint. Minden oltási csoportból az összes állat szérumát összekevertük, a vérvétel a 70. napon, az i.v. komplex oltások után 2 órával történt. A kísérlet kivitelezése a gyártó útmutatása szerint történt: a 40 különböző citokin ill. kemokin-specifikus ellenanyagot tartalmazó membránokat inkubáltuk a
31
szérummintákkal, majd mosás után a detektáló, biotinált ellenanyag koktéllal. Az előhívás streptavidin-HRPO-val történt inkubálást követően, kemilumineszcens reagenssel végeztük, a jeleket röntgenfilmen detektáltuk. Az egyes pontokban a pixeldenzitás kiértékelését GenePix Pro 6.0 programmal végeztük, a párhuzamos értékeket átlagoltuk, és összehasonlítottuk a különböző csoportokban kapott értékeket.
5.17 Citokinszint meghatározása lépsejtkultúra felülúszójából Az állatok lépét a második komplex oltást követően egy héttel eltávolítottuk, minden csoportból egy-egy állatot áldoztunk fel. A lépsejtek izolálása után a csoportnak megfelelő komplex oltóanyag 1/10-ét adtuk a sejtkultúrához. 24, 48 és 72 óra elteltével a felülúszóból citokintermelődést néztünk. A 2.4G2 scFv in vitro hatását a citokintermelődésre az alábbiak szerint vizsgáltuk: C57BL/6 vad, CD16 KO, vagy CD64 KO egerekből származó lépsejteket (2,5 x 106 sejt/ml) tenyésztettünk RPMI-1640 médiumban vagy streptavidinnel majd biotinilált 2.4G2 scFv-vel fedett lemezeken (Millipore), 72 órán át, 37 ºC-on. A TNFα, IL-17, IFNγ, és IL-10 citokinek mennyiségének meghatározása Quantikine ELISA kitek (R&D Systems, Minneapolis, USA) segítségével történt, a gyártó útmutatása szerint. Az adott citokinkoncentrációt a standard sor segítségével számítottuk ki.
5.18 Statisztikai analízis A különböző peptidekre kapott OD (optikai denzitás) értékek hányadosát, az ELISA indexet (citrullin/arginin tartalmú peptiddel kapott OD érték) ábrázoltuk. A különböző szérumcsoportok peptid felismerésének eltérését egyváltozós ANOVA analízissel és KruskalWallis teszttel vizsgáltuk. A különböző csoportok közötti antitest szinteket Dunn’s Multiple Comparison Testtel hasonlítottuk össze. A peptidekre kapott OD indexek és a klinikai tesztek kapcsolatának vizsgálatát Spearman-féle korrelációs teszttel végeztük. Az antitest tesztek diagnosztikus hatékonyságát ROC (Receiver
32
Operator Characteristic) görbe analízis segítségével vizsgáltuk. Ezzel a módszerrel számolható a diagnosztikai teszt szenzitivitása és specificitása. A szenzitivitás érték a határérték feletti RA betegek száma százalékosan az összes RA beteghez képest. A specificitás a határérték alatti, illetve az összes kontroll aránya százalékosan kifejezve. A szenzitivitás és specificitás értékét két módon számoltuk. Egyrészről az adott definíció szerint számoltuk a határértéket: az egészséges kontroll csoport átlagához hozzáadva a kétszeres SD-t. Másrészről a ROC analízis eredményeinek alapján az egyes tesztek specificitás értékeit egységesítettük, ezáltal szenzitivitási értékük egyértelműben összemérhetővé vált. Autoellenanyagok esetében a 95%-os specificitás általánosan elfogadott diagnosztikailag optimalizált érték. Meghatároztuk a definíció szerinti pozitív és negatív prediktív értékeket (PPV és NPV). PPV megadja a betegség jelenlétének a valószínűségét, ha a teszt pozitív, vagyis a valódi betegek számát a pozitívak között. Megadható a határérték feletti betegek és a határérték feletti betegek és egészségesek arányával százalékosan kifejezve. A NPV a betegség hiányának a valószínűsége, ha a teszt negatív. Tehát, ha a teszt negatív, akkor mennyi az esélye annak, hogy a vizsgált egyén nem beteg. Megadható a határérték alatti egészségesek és a határérték alatti egészségesek és betegek arányával, százalékosan kifejezve. A CIA kísérletek során a különböző állatcsoportok arthritis pontjait permutációs teszttel értékeltük ki, az alacsony mintaszám miatt. Az ELISA mérésekhez Kruskal-Wallis tesztet alkalmaztunk. Minden statisztikai analízis elvégzéséhez a GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, Inc.) programot használtuk.
33
6. Eredmények 6.1 A rheumatoid arthritis diagnosztizálása során alkalmazható, új citrullin tartalmú peptidek azonosítása Célunk volt az általunk beállított peptid-panellel az autoantitest profil meghatározása RA betegek szérumából, a kötődés vizsgálata RA betegek B-sejtjeihez, illetve a B-sejtek autoantitest termelésének vizsgálata.
6.1.1 Citrullin tartalmú peptidek szűrése RA beteg és egészséges szérummintákkal A Multipin ELISA kísérletek során megállapítottuk, hogy a filaggrin peptidből a 15-mer nem bizonyult elég hatékonynak az RA betegek és egészségesek elkülönítésében. Ezzel ellentétben az 5-mer filaggrin peptideket rövidségük ellenére is felismerték az RA betegek autoantitestjei. Az arginin-citrullin szisztematikus cseréje ezekben a peptidekben arra az eredményre vezetett, hogy a TXGRS (filaggrin XR) peptid esetén adódott a legmarkánsabb különbség az RA és egészséges csoport között, így a további kísérleteinkhez ezt a peptidet választottuk ki. A vimentin fehérje feltérképezése nem hozott új áttörést az irodalomból már ismert adatokhoz képest. Előkísérleteink során filaggrin peptid esetében vizsgáltuk a biotinálás pozícióját, illetve a biotin és peptidek közé beépített linkerek szerepét (3. táblázat). A rövidebb, 5-mer filaggrin epitópokat vizsgálva azt tapasztaltuk, hogy csak a C-terminálisukon biotinált peptidek esetében tapasztalható reakció az RA betegek szérumaival (6.ábra), míg a hosszabb, 19-mer peptidek esetében a biotinálás pozíciója nem befolyásolta a peptid felismerését [65].
34
Filaggrin 5-mer
LC-biotin-TXGRS (kód: p3,p4) Biotin-TXGRS (kód: p5, p6) TXGRS-K-LC biotin (kód: p7, p8) TXGRS-K-Ttds biotin (kód: p9, p10) TXGRS-Ttds-K-LC biotin (kód: p11, p12)
Filaggrin 19-mer
LC-biotin-SHQESTXGXSXGRSGRSGS SHQESTXGXSXGRSGRSGS-K-LC biotin SHQESTXGXSXGRSGRSGS-K-Ttds-LC biotin SHQESTXGXSXGRSGRSGS-Ttds-K-LC biotin
3. táblázat: Az előkísérlet során vizsgált filaggrin peptidek, kiemelve a legjobbnak talált peptidek
35
ELISA index
RA szérumok SLE szérumok Egészséges szérumok
6. ábra: Az 5-mer filaggrin peptidek felismerése a biotin elhelyezkedésének függvényében p3-p6: N-terminálison biotinált TRGRS/TXGRS peptidek (ld. 2. táblázat) p7-p12: C-terminálison biotinált TRGRS/TXGRS peptidek (ld. 2. táblázat) Előzetes eredményeink alapján a továbbiakban két filaggrin, egy vimentin és egy kollagén epitópot vizsgáltunk, mindegyikük C-terminálison biotinált. Az 5-mer filaggrin peptid esetében hatékonyabb linkernek bizonyult a Ttds, a többi peptid esetében a hosszú láncú biotin (LC biotin) volt a legalkalmasabb. Mind a négy, optimalizált peptid esetében azt tapasztaltuk, hogy az RA szérumminták specifikusan felismerik a citrullintartalmú peptidet, amíg az egészséges és SLE kontrollok nem. Az ELISA indexek eltérése a különböző betegilletve kontrollcsoportok között szignifikánsnak adódott (7. ábra). A négy legjobbnak ítélt peptidet a szenzitivitás és specificitás értékeik alapján választottuk ki. Vizsgáltuk mind a definíció szerinti értékeket (ekkor a diagnosztikai határértéket az egészséges mintákból állapítottuk meg: ELISA index átlag + 2 SD). Másrészt a könnyebb összehasonlíthatóság végett a specificitást rögzítettük 95%-on, és az ehhez tartozó szenzitivitás értékeket vizsgáltuk (4. táblázat). A peptid-panel össz-szenzitivitása 80 %-nak adódott. ROC-görbe analíziskor (a program az összes lehetséges határértékhez tartozó szenzitivitást és specificitást számolja) a görbe alatti terület információt ad a leendő diagnosztikai teszt minőségéről. 0,5, illetve az alatti érték esetén a teszt nem használható a diagnosztikában, mivel nem elég hatékony az
36
egészségesek és a betegek elkülönítése. Általánosságban elmondható, hogy minél közelebb van a görbe alatti terület értéke 1-hez, annál megbízhatóbb tesztről van szó. Eredményeink alapján a 19-mer filaggrin görbe alatti területe a legnagyobb: 0.7991. Hasonló értékeket kaptunk a vimentin (0.787) és 5-mer filaggrin (0.7593) esetében is, míg a kollagén értéke gyengébbnek adódott (0.6258).
37
Filaggrin 19-mer 125
*** ***
Szenzitivitás %
ELISA index
1000 100 50
25
100 75 50 25 0
0 RA
SLE
0
H
25
Filaggrin 5-mer ***
7
75
100
125
125
*** Szenzitivitás %
6 5
ELISA index
50
100% - Specificitás%
4 3 2
100 75 50 25
1 0
0 RA
SLE
0
H
25
Kollagén
75
100
125
***
7
***
6
125
5
Szenzitivitás %
ELISA index
50
100% - Specificitás%
4 3 2
100
1
75 50 25 0
0 RA
SLE
0
H
25
50
75
100
125
100% - Specificitás%
Vimentin ***
125
Szenzitivitás%
ELISA index
20 15 10 5
100 75 50 25 0
0 RA
SLE
H
0
25
50
75
100
125
100% - Specificiás%
7. ábra: Az optimalizált peptidek ELISA index értékei és ROC görbéi (H: egészséges minták)
38
Definíció szerint peptid
Filaggrin 19-mer Filaggrin 5-mer
Diagnosztikailag optimalizálva
specificitás szenzitivitás specificitás szenzitivitás PPV NPV (%) (%) (%) (%) (%) (%)
99
51
95
57
98
65
98
51
95
55
96
63
Vimentin
97
37
95
42
91
55
Kollagén
98,5
30
95
34
96
55
4. táblázat: A peptidek specificitás, szenzitivitás, pozitív és negatív prediktív értékei
A tesztben pozitívnak bizonyult szérumokat csoportokba rendeztük az alapján, hogy az adott szérum hány peptidet ismert fel. A csoportokon belül vizsgáltuk a peptid-epitópok felismerésének eloszlását, illetve a csoportok közötti különbséget a CCP, MCV titerben, a DAS 28 indexben, vagy a betegség időtartamában (8. ábra)
39
8. ábra: A: Összefüggések a CCP, MCV titer értékek és a betegség fennállásának ideje, valamint a felismert peptidek száma között B: A csoportokon belüli peptidfelismerés eloszlása (balról jobbra: 1, 2 és 3 peptidet felismerő szérumok) A CCP, illetve MCV titerrel egyértelmű összefüggést tapasztaltunk: minél több peptidet ismert fel egy adott szérum, átlagosan annál magasabbnak adódott a CCP vagy MCV titere (8. A ábra). Ugyanakkor nem találtunk összefüggést sem a betegség hosszával (bár a legrégebben betegek ismerték fel a legtöbb peptidet), sem pedig a betegség aktivitását jelző DAS 28 indexszel. Az egy peptidet felismerő szérumok fele a vimentin peptiddel reagált, körülbelül 30%-uk bizonyult filaggrin pozitívnak, míg csak körülbelül 20%-uk ismerte fel a kollagén citrullinált epitópját. A két peptidet felismerők esetében inkább a filaggrin epitópok dominálnak, a három peptiddel reagáló szérumok közel fele filaggrin és/vagy vimentin pozitív, a kollagénnel a szérumminták kevesebb, mint 20 %-a reagált (8. B ábra). A továbbiakban vizsgáltuk azon szérumminták peptid felismerését, amelyek CCP2 és/vagy MCV és/vagy RF negatívnak bizonyultak. Bár ezeknek a szérumoknak a száma nem volt magas, az általunk használt peptid-panellel még a tripla negatív szérumok is közel 20%-ban pozitivitást mutattak (9. ábra).
40
9. ábra: A konvencionális tesztekkel negatívnak bizonyult szérumok kimutathatósága a peptid-panel segítségével
6.1.2 Kompetíció vizsgálata az egyes citrullin tartalmú peptidekre specifikus szérummintákal A Prof. Georg Schetttel (Erlangen, Németország) végzett kollaborációs munka során CCP pozitív szérummintát, illetve az abból citrullinált vimentin fehérjével affinitás-tisztított ellenanyagot hasonlítottunk össze az általunk beállított peptid-panelen [66]. Azt tapasztaltuk, hogy nem csak a CCP pozitív szérum, de a belőle tisztított, vimentin fehérjére specifikus ellenanyag is felismerte a filaggrin peptidet (10. ábra). Ezért kompetitív ELISA méréseket végeztünk, hogy a peptideket felismerő ellenanyagok közti esetleges keresztreakciót ellenőrizzük.
41
anti-vimentin
Filaggrin 19-mer
Kollagén
Vimentin
Filaggrin 19-mer
Kollagén
Vimentin
ELISAindex ratio ELISA
CCP+ szérum
10. ábra: A CCP pozitív szérum és az ebből affinitás-tisztított vimentin-specifikus IgG peptidfelismerése [66] (módosítva)
Vimentin ELISA
Filaggrin ELISA 25 20
3
ELISA index
ELISA index
4
2 1
15 10 5
0 RA
H
szérum+ filaggrin
RA
H
szérum+ vimentin
RA
H
0
szérum
RA
H
szérum+ filaggrin
RA
H
RA
H
szérum+ szérum vimentin
11. ábra: Kompetitív ELISA vizsgálat vimentin és filaggrin peptidek között (H: egészséges minták)
42
Ehhez a teszthez csak olyan szérumokat használtunk, amelyek mindkét vizsgált peptidre (19-mer filaggrin, vimentin) pozitívak voltak. A szérumokat előinkubáltuk a szilárd fázishoz kikötöttnek megfelelő mennyiségű, oldott peptiddel. Mindkét esetben azt tapasztaltuk, hogy a vizsgálni kívánt peptiddel azonos oldott peptiddel való előinkubáció csökkentette az RA szérumok által adott jel erősségét, míg a más peptiddel történő előkezelés nem okozott jelentős változást. Egészséges szérumok esetében nem tapasztaltunk változást egyik peptid esetében sem (11. ábra)
6.1.3 Citrullin tartalmú peptidekre specifikus ellenanyagtermelés vizsgálata ELISpot módszerrel Annak eldöntésére, hogy a citrullin tartalmú peptidek, amelyeket az RA szérummintákban levő autoantitestek felismernek, alkalmasak-e az ellenanyagtermelő B-sejtek kimutatására, in vitro aktivált memória B-sejtek peptid-specifikus válaszát vizsgáltuk. 2-5x106/ml egészségesekből illetve RA betegekből tisztított B-sejt ellenanyagtermelő sejtté való diferenciálódását követtük nyomon az aktivációt követően. Mind az egészséges, mind az RA betegekből származó sejtek esetében vizsgáltuk az össz-IgG termelést és a peptid-specifikus ellenanyagtermelő sejteket is. A nem aktivált mintákban egyáltalán nem termelődött kimutatható mennyiségű ellenanyag. Nem tapasztaltunk eltérést az egészséges és beteg Bsejtek össz IgG termelésében. A peptid-specifikus ellenanyagtermelő sejtek száma egészségesekben minden esetben 10/105 B sejt alatti volt, függetlenül a peptid citrullintartalmától. A vimentin és a 19-mer filaggrin peptiddel vizsgálva szignifikáns különbséget tapasztaltunk az ellenanyagtermelő sejtek számában a citrullintartalmú peptid javára (12. A ábra). 5-mer filaggrin peptid esetében is láttunk különbséget, noha ez nem szignifikáns, míg a kollagén peptidek esetében nem mutatkozott eltérés az arginin és citrullin tartalmú peptidek között (12. B ábra)
43
2500
1500
* 20 10
R
gG A RA v R im A R R vim A fi X R l-19 A f -R To il-1 ta 9-X lI gG H H vi m H R v H im fil X H 19fil R -1 9X
0
2500
1500 50
5
(10 sejtre normalizálva)
R
gG A RA fi R l-5A R fi R l-5A X c R ol l A R To co l ta l X lI gG H fil H H 5-R fil H 5-X co H ll R co ll X
0
To ta lI
ellenanyagtermelő sejtek száma
B
**
30
To ta lI
ellenanyagtermelő sejtek száma (105 sejtre normalizálva)
A
12. ábra: Egészséges és RA betegekből tisztított, aktivált B-sejtek ellenanyagtermelő képességének összehasonlítása ELISpot módszerrel (H: egészséges minták)
6.1.4 Peptid-specifikus B-sejtek kimutatása áramlási citometriával Az egészséges és RA beteg vérmintákból szeparált B-sejtekhez való peptidkötődést neutravidinnel burkolt Yellowgreen mikrogyöngyök segítségével vizsgáltuk, amelyekre biotinilált peptideket kötöttünk. Előzetes kísérletek során PBMC-hez való kötődést is vizsgáltunk CD3 és CD14 marker mellett, de nem tudtunk kimutatni kötődést sem a monocitákhoz, sem a T-sejtekhez, sem a peptiddel fedett, sem pedig a peptid nélküli kontroll gyöngyökkel sem. Az izolált B-sejteket vizsgáltuk aktiválás nélkül, illetve 3 napos aktiváció után, a 4.5 fejezetben leírtaknak megfelelően. A kiértékelés az alábbiak szerint zajlott: pozitív kapuzással elkülönítettük az élő sejteket, majd a CD20 pozitív sejteket autofluoreszcencia és izotípus-kontroll alapján. A Yellowgreen gyöngyöt kötött sejteket az FL-1 csatornában különítettük el (13. ábra).
44
13. ábra: A citometriás mérések kiértékelése-egy reprezentatív kísérlet alapján FSC: előre irányuló fényszórás, SSC: oldalra irányuló fényszórás, FL-4: a CD20-APC mérési csatornája, FL-1: a Yellowgreen gyöngy mérési csatornája. A középső ábrán feketével az autofluoreszcencia, pirossal patkány IgG1-APC izotípus kontroll, a kék görbe a CD 20- APC ellenanyag kötődését jelzi.
Előzetes aktiválással és a nélkül is 8-8 RA beteg B-sejtjeit vizsgáltuk. Általánosságban elmondható, hogy a peptiddel nem fedett gyöngy a blokkolás ellenére igen magas hátteret adott (a sejtek körülbelül 10 százalékánál volt megfigyelhető kötődés), illetve minden esetben tapasztaltunk kötődést az arginintartalmú peptiddel fedett gyöngy esetében is. Ez a két tényező megnehezítette a kiértékelést, hiszen a detektálni kívánt autoreaktív sejtek csak néhány százalékát jelentik a keringő limfocitáknak. A sejtek előzetes aktiválása nélkül a betegek fele reagált egy-egy peptiddel, a különbség viszont jelentős az arginin- és citrullintartalmú peptidek között. Míg az aktivált sejtekhez több féle peptid is kötődött, kisebb volt a citrullinált peptid javára adódó különbség.
45
nem aktivált minták
aktivált minták 40
Kötődés mértéke, %
Kötődés mértéke, %
40 30 20 10
20 10 0
la gg Fi rin la g 5 Fi g r R i la gg n 5 Fi rin X la gg 19 ri R Vi n 1 9 m en X Vi tin m e R K ntin ol la X gé K ol n R la gé n X há tté r
há tté r
en ti n
X
R m
Fi
Vi
en ti n
Vi
m
rin Fi la gg
la gg
rin
5R
5X
0
Fi
30
egészséges Kötődés mértéke, %
40 30 20 10
Fi
la gg rin Fi 19 la R gg rin 19 Vi X m en tin Vi R m en tin K X ol la gé n K R ol la gé n X há tté r
0
14. ábra: A Yellowgreen gyöngyökre kötött peptidek kötődése B-sejtekhez. Az aktivált mintákat CpG és rh-IL-2 jelenlétében tenyésztettük a kötődési vizsgálatok előtt. A háttér a peptiddel nem fedett gyöngyök aspecifikus kötődését mutatja. További különbség, hogy az aktiválatlan mintákban a filaggrin 19-mer peptid kötődését nem vizsgáltuk, a kollagén peptid esetében pedig nem tapasztaltunk a háttértől való eltérést. A legjelentősebb különbségeket mindkét esetben az 5-mer filaggrin peptiddel tapasztaltuk, míg az egészséges egyénekből származó B-sejtek esetében nem volt jelentős eltérés a háttérhez képest egyik vizsgált peptid esetében sem (14. ábra).
46
6.1.5 In vitro citokintermelés vizsgálata citrullin tartalmú peptidekkel való aktiváció hatására Funkcionális kísérleteink során vizsgáltuk a peptidek hatását RA betegekből izolált PBMC citokintermelésére is. A sejteket 4 napig tenyésztettük a peptidek jelenlétében, majd Flow Cytomix Multiplex gyöngy-alapú array segítségével, áramlási citometriás módszerrel meghatároztuk a vizsgált citokinek koncentrációját a felülúszóból. A kísérletek során az IFNγ, a TNFα, az IL-10 és IL-17 mennyiségét vizsgáltuk. Az arginin- és citrullintartalmú peptidekre adott válasz különbségét akkor tekintettük pozitívnak, ha legalább kétszeres eltérés mutatkozott a citrullintartalmú peptid javára. A TNFα szintjében nem tapasztaltunk jelentős választ egyik vizsgált betegnél sem. A többi citokin esetében a vizsgált betegek körülbelül fele termelt jelentős mennyiségű IFNγ és IL-17 citokint a citrullin tartalmú peptidek hatására, míg a betegek másik fele IL-10 termeléssel válaszolt. A gyulladásos citokinek termelődését a 19-mer filaggrin és/vagy a vimentin peptidek esetében tapasztaltuk, míg az immunszuppresszáns IL-10 termelődését a 19-mer filaggrin és/vagy kollagén peptid hatására figyeltük meg (15. ábra).
2500
IL-17 termelés (pg/ml)
IFN termelés (pg/ml)
1000 750 500 250
2000 1500 1000 500
0 fil 19 R
fil 19 X
vim R
0
vim X
fil 19 R
fil 19 X
vim R
vim X
IL-10 termelés (pg/ml)
300
200
100
0 fil 19 R
fil 19 X
koll R
koll X
15. ábra: A peptidek hatására termelődött citokinek RA PBMC kultúra felülúszójában (R: arginin tartalmú peptid, X: citrullin tartalmú peptid)
47
6.2 Kollagén indukált arthritises vizsgálatok A továbbiakban az RA egérmodelljén, kollagén indukált arthritises egereken végeztünk vizsgálatokat annak kiderítésére, hogy a betegség kiváltásában szerepet játszó kollagén peptid epitóp egymagában vagy FcγR-hez irányítva, mintegy az immunkomplexek hatását mímelve, befolyásolja-e a betegség lefolyását, valamint az ellenanyag- és citokintermelést.
6.2.1 A 2.4G2 scFv és a kollagén CII-peptid által alkotott komplexek hatása a CIA súlyosságára és lefolyására egerekben A 2.4G2 és CII peptid-komplexek CIA módosító hatását a II típusú szarvasmarha kollagénnel előzetesen beoltott egereken vizsgáltuk. A DBA/1 egerek először csak egy szarvasmarha kollagén és CFA oltást kaptak (0.nap), majd az előzőekben leírt komplexekkel oltottuk őket intravénásan a 28. napon. Az állatok arthritis pontjait (arthritis score) hetente kétszer monitoroztuk. Négy héttel a kezdeti oltás után az arthritis tünetei még nem kezdtek mutatkozni. Az extravidin-CII peptid komplex („kollagén peptid tetramer”) és az extravidin2.4G2 ScFv komlpex („ScFv tetramer”) kezelés hatására már az oltás után 5 nappal megemelkedtek a csoportban lévő állatok arthritis score értékei. A csak puffert kapott kontroll csoportnál ekkor az ízületi gyulladás tünetei még csak elvétve mutatkoztak (0-2,5). A komplex ráoltás utáni 10. napon (vagyis a kezdő oltástól számított 40. napon) már szignifikáns eltérés mutatkozott a kontroll csoporthoz képest mind a kollagén peptid tetramerrel, mind az ScFv tetramerrel, mind pedig az „immunkomplexszel” oltott csoportban. Nem tapasztaltunk eltérést a kontroll csoporttól abban az esetben, ha a megfelelő mennyiségű CII peptid, vagy az egyláncú ellenanyag extravidin nélkül, monomer formában lett oltva. Az 55. napon, a második komplex ráoltás után 10 nappal az arthritis pontokban talált szignifikáns különbség megmaradt a kontroll csoport és az „immunkomplex” valamint a „peptid tetramer” csoportok között, jelezve ezzel a betegség súlyosbodását (16. ábra).
48
35. nap
55. nap
40. nap **
10.0
10.0
7.5
7.5
7.5
m er m on o
er
er
Sc Fv
pl
te tr am
Sc Fv
er +
K
te tr am
on om
er + m
on om
C Pe pt id
m
Sc Fv
te tr am
om K II P
ep tid
K
om
0.0
K
0.0
on tr ol l
0.0
K on tr ol l K om C II pl Pe ex pt id Pe te pt tr id am m Sc er on Fv om te er t ra + m Sc er Fv m on om er
2.5
er te tr am Sc er Fv m on om er
2.5
pl ex
2.5
ex
5.0
Pe pt id
5.0
**
II
5.0
Score
Score
10.0
12.5
Pe pt id
***
12.5
C
**
12.5
on tr ol l
score
**
16. ábra: A komplex kezelések hatása az arthritis score-ra. Az eredmények két kísérlet összegzéséből származnak, csoportonként 8-12 állat pontszámait hasonlítottuk össze.
6.2.2 Kollagén specifikus ellenanyagtermelés vizsgálata a különböző komplexekkel kezelt CIA egerekben A CIA-ban szenvedő állatok szérummintáiban összehasonlítottuk mind a kollagén, mind pedig a kollagén peptid-specifikus ellenanyagok szintjét, 5 nappal az első (a kísérlet 35. napja), majd 10 nappal a második komplex oltást követően (a kísérlet 55. napja). A teljes kollagén ellenes ellenanyagszintek az alábbiak szerint alakultak: az első komplex oltást követő 5. napon a kollagén peptid tetramer csoportban kissé megemelkedett a specifikus ellenanyagtiter a kontroll csoporttal összevetve. A többi kezelésnél nem tapasztaltunk eltérést az anti-kollagén IgG szintek között. A második komplex oltást követő 10. napi vérvételből származó minták között nem volt különbség a kollagén specifikus IgG titerek között. (17. ábra bal oldala). Ezzel ellentétes módon, a kollagén peptid-specifikus IgG titerben szignifikáns különbség mutatkozott az FcRII/III-hoz irányított CII peptiddel („immunkomplex” kezelés) oltott állatok javára a többi csoporthoz képest. Ez a magasabb peptid specifikus ellenanyagválasz mindkét időpontban megfigyelhető. A kollagén peptid tetramer és az ScFv tetramer csoportban is van peptid-specifikus ellenanyagtermelés, ezek szintje azonban csak kis mértékben haladja meg a kontrollcsoport által termelt peptid specifikus IgG szintjét. A CII peptid specifikus IgG2a titer ehhez hasonló megoszlást mutat. (17. ábra jobb oldala). 49
17. ábra: Kollagén és kollagén-peptid specifikus IgG titerek a kísérlet 35. napján (fent) és 55. napján (lent)
6.2.3 A komplexek in vitro kötődése lépsejtekhez és in vivo lokalizációja a lépben Áramlási citometriás és immunohisztokémiás kísérleteket is végeztünk annak kiderítése érdekében, hogy az adott komplex kostrukciók mely sejtekhez kötődnek. A peptid tetramer, ScFv tetramer, ill. immunkomplex in vitro kötődési tesztjében CIA egerek lépsejtjeit vizsgáltuk. A citometriás mérések során a 2.4G2 ScFv-t és CII peptidet is tartalmazó „immunkomplex” a B220 pozitív sejtek (B-sejtek) 47 %-hoz, a CD11c pozitív sejtek (dendritikus sejtek) 41 %-hoz, és az F4/80 pozitív sejtek 60 %-hoz kötődött. Az F4/80 sejtfelszíni marker a mieloid sejtek egyes alpopulációin expresszálódik, beleértve a makrofágokat és dendritikus sejteket [67]. A 2.4G2 tetramer kötődése hasonló, a B-sejtek 40 %-a, a dendritikus sejtek 36 %-a, és az F4/80 pozitív sejtek 55 %-a kötötte a komplexet. Teljesen eltérő kötődési profilt tapasztaltunk a CII peptid tetramer esetén: a komplex a Bsejtek 10%-hoz, a DC-k 30%-hoz, illetve az F4/80 pozitív sejtek 40%-hoz kötődött. (18. ábra)
50
Ez azt jelentheti, hogy a CII peptid képes a makrofágok és dendritikus sejtek Fcγ receptoraihoz kötődni az egerekben termelődött, peptid specifikus IgG segítségével. A nem immunizált állatokból származó lépsejtek esetében nem tapasztaltunk kötődést az immunkomplex esetében. Kontroll B220
Immunkomplex
2.4G2 tetramer
CII peptid tetramer 24.52 88..5522
1.78
28.88
24.52
1.72
3.50
3.37
3.53
1.79
7.95
6.56
5.17
0.95
1.27
1.16
1.13
CD11C
F4/80
Izotípus kontroll
Extravidin -FITC
18. ábra: A 2.4G2 ScFv-CII peptid komplex, a CII peptid tetramer és a 2.4G2 ScFv tetramer kötődése in vitro, lépsejtekhez. A komplexek extravidin-FITC jelölést tartalmaztak, az egyes lépsejtpopulációk CD45R (B220)–PerCP/Cy5.5 (B-sejt), CD11c–Alexa 647 (dendritikus sejt), F4/80–Alexa 647 (makrofág) jelöléssel lettek elkülönítve. A kontroll mintában extravidinFITC háttér, illetve Alexa 647 konjugált patkány IgG2b-t izotípus kontroll kötődése látható. Az ábrán három, független kísérletből származó reprezentatív mérések vannak feltüntetve.
Az in vivo lokalizációs kísérletekhez az állatokat extravidin-FITC tartalmú komplexekkel oltottuk. 15 perccel az intravénás oltás után a 2.4G2 ScFv- CII peptid komplexek leginkább a lép marginális zónájában voltak megfigyelhetőek, ko-lokalizációt mutatva a marginális zóna makrofág markerrel (MARCO). Néhány esetben CR1/2 pozitív, follikuláris sejtekkel is ko-
51
lokalizáció tapasztalható, valószínűleg dendritikus sejtekről van szó. Az IgM, vagy IgD pozitív B-sejtekkel nem tapasztaltunk ko-lokalizációt. A 2.4G2 tetramerrel oltott állatokban az előzőekhez hasonló kötődést tapasztaltunk, azzal a különbséggel, hogy a 2.4G2 tetramer kevesebb B-sejtet jelölt meg, mint az „immunkomplex”. A CII-peptid tetramer ezektől eltérő módon, leginkább a lép T-sejtes zónájában mutatott kötődést. (19. ábra) Immunkomplex
100 μm
100 μm
CII peptid tetramer
100 μm
100 μm
2.4G2 ScFv tetramer
100 μm
100 μm
19. ábra: A komplexek in vivo lokalizációja 15 perccel az oltás után. A metszetek komplement receptor (CR1/CR2) specifikus antitesttel, vagy MZ makrofág marker (MARCO) specifikus antitesttel lettek festve. A komplexek a zöld csatornában, a CR1/2 illetve MARCO a piros csatornában látható. Az átfedés sárga színnel jelenik meg.
Összefoglalva az in vivo és in vitro kötődési kísérleteket, elmondható, hogy a 2.4G2 egyláncú ellenanyagot tartalmazó konstrukciók kötődnek a B-sejtek egy részéhez, röviddel az oltás után a komplexek zöme a marginális zóna makrofágokhoz kötődik, illetve kisebb mértékben a fehér pulpában található dendritikus sejtekhez asszociálódik. A CII-peptid tetramerek elsősorban az utóbbi sejtpopulációhoz mutatnak kötődést.
52
6.2.4 Citokin/kemokinszekréció kiváltása az FcRII/III célzásával Két különböző kísérletet végeztünk abból a célból, hogy megvizsgálhassuk, hogy a komplex konstrukciók oltása vált-e ki valamilyen eltérést a citokinek és kemokinek termelődése szempontjából a CIA állatok mintáiban. Először a komplexekkel oltott állatokból származó lépsejtkultúrákat kezeltünk in vitro a különböző konstrukciókkal, majd a sejtek felülúszóját teszteltük 24, 48 és 72 óra eltelte után. Csak az immunkomplexszel kezelt lépsejtek felülúszójában találtunk különbséget a TNFα, IL-17, IFNγ, és IL-10 citokinek termelődésében, időfüggés is megfigyelhető volt. A 2.4G2 tetramerrel kezelt sejtek jóval alacsonyabb mértékben termeltek csak citokineket, míg a CII-peptid tetramer kezelés egyáltalán nem váltott ki citokintermelést. (20. ábra) A TH2 immunválaszra jellemző citokin, az IL-4 egyik kultúrában sem termelődött kimutatható mennyiségben. Ez egybecseng azzal, hogy a 2.4G2-CII peptid komplex képes stimulálni pro-inflammatórikus citokinek termelődését in vitro. Az ezek közé tartozó IL-17 szerepe kritikus az arthritis kialakulásában.
53
IL-10 termelés (pg/ml) 150
100
50
IL-17 termelés (pg/ml)
IFN termelés (pg/ml) 400
300
200
100
TNF termelés (pg/ml)
500
24h
24h
48h
0
48h 72h
I C mm K II pe un on pt ko tro i m l Sc d te pl l Fv tr ex a te m tr er Im C m K am II pe un on er pt ko tro i m l Sc d te pl l Fv tr ex a te m tr er Im C m K am II pe un on er pt ko tro i m l Sc d te pl l Fv tr ex a te m tr er am er
I C mm K II pe un on pt ko tro i m l Sc d te pl l Fv tr ex a te m tr er Im C m K am II pe un on er pt ko tro i m l Sc d te pl l Fv tr ex a te m tr er Im C m K am II pe un on er pt ko tro i m l Sc d te pl l Fv tr ex a te m tr er am er
600
I C mm K II pe un on pt ko tro i m l Sc d te pl l Fv tr ex a te m tr er Im C m K am II pe un on er pt ko tro i m l Sc d te pl l Fv tr ex a te m tr er Im C m K am II pe un on er pt ko tro i m l Sc d te pl l Fv tr ex a te m tr er am er
I C mm K II pe un on pt ko tro i m l Sc d te pl l Fv tr ex a te m tr er Im C m K am II pe un on er pt ko tro i m l Sc d te pl l Fv tr ex a te m tr er Im C m K am II pe un on er pt ko tro i m l Sc d te pl l Fv tr ex a te m tr er am er
700 200
0
200
150
100 50 0
72h 24h
24h
48h 72h
500
400
300
200
100
0
48h 72h
20. ábra: In vitro citokintermelés. A citokinek mennyiségét a lépsejt kultúra felülúszójából
határoztuk meg, a komplexszekkel való kezelés után 24, 48 és 72 órával.
A 2.4G2 scFv mind az FcγRII mind az FcγRIII pozitív sejtekhez képes kötődni. Annak
tisztázására, hogy valóban az FcγRIII felelős-e a fokozott citokintermelődésért,
összehasonlítottuk a 2.4G2 indukálta TNFα és IL-17 produkcióját vad típusú, CD16 KO és
CD64 KO C57BL/6 egerek lépéből származó kultúrákban. Az eredményeink szerint a CD64
KO egér lépsejtjei képesek voltak ezen citokinek szekréciójára a 2.4G2 stimuláció után, ezzel
ellentétben a CD16 KO egér lépsejtjei nem. Ezzel bizonyítottuk az FcγRIII szerepét,
amelynek hiányát nem kompenzálja sem az FcγRI sem az FcγRII. (21. ábra)
54
kontroll 2.4G2
vad típus
CD 16 KO
CD 64 KO
IL-17 koncentráció (pg/ml)
TNF koncentráció (pg/ml)
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
kontroll 2.4G2
vad típus
CD 16 KO
CD 64 KO
21. ábra: TNFα és IL-17 produkció a 2.4G2 ScFv tetramerrel kezelt állatokban, 72 órával a kezelés után.
Annak eldöntésére, hogy a komplexek képesek-e in vivo kemokin- illetve citokintermelést kiváltani, az alábbi kísérletet végeztük: a kollagén indukált arthritises állatok a harmadik komplex ráoltást a kísérlet 70. napján kapták. Az oltás után 2 órával az állatokból vért vettünk, majd a szérumokat csoportonként összegyűjtöttük. Minden csoport szérumaiból citokin/kemokin fehérje mikro-array alkalmazásával mutattuk ki a citokineket, kemokineket. A kapott értékeket normalizáltuk a kontroll csoporthoz viszonyítva. (22. ábra) A kontrollal összevetve, az „immunkomplex” oltás számos citokin és kemokin fokozott termelődését indukálta. A 2.4G2 ScFv-CII peptid komplex kiváltotta a BLC (CXCL13, B limfocita kemoattraktáns), a G-CSF (granulocita kolónia stimuláló faktor), az IL-1, IL-3, IL6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-16, IL-17, IL-23, a MIP-1 és MIP-2 (makrofág gyulladási protein) és a TNFα fokozott szekrécióját. Az IL-10 és a MIP-2 szintje az immunkomplexszel kezelt állatokban körülbelül a kontroll csoport által termelt mennyiség 2500-szorosa. A CII-peptid-tetramert kapott állatok szérumából az alábbi faktorok szintjének emelkedése volt kimutatható: IL-10, IL-17, IL-23 és MIP-2, míg a 2.4G2 tetramerrel kezelt csoportban az FcRII/III keresztkötése a G-CSF, IL-6, IL-10 és MIP-2 termelődését fokozta in vivo.
55
2.4G2 ScFv tetramer CII peptid komplex Immunkomplex
22. ábra: A szérumok kemokin és citokinprofilja 2 órával a booster oltás után. A mikro-array-vel kapott eredményeket (pixel denzitás), normalizáltuk a kontroll csoportra. A vonal a tízszeres különbséget jelöli, e fölött tekintetük lényeges különbségnek a kezelés hatására bekövetkezett változást.
Eredményeink azt jelzik, hogy mind a FcRII/III célzott CII peptid, mind pedig a CII-peptid tetramer stimulálja a CIA kialakulásában és fenntartásában kritikus szerepet játszó gyulladási citokinek szekrécióját.[68-71]
56
7. Diszkusszió Az ACPA detektálása a jelenleg ismert legérzékenyebb és legnagyobb specificitású laboratóriumi diagnosztikai módszer, amely alkalmas az RA betegek korai diagnosztizálására. A betegek körülbelül 30%-a azonban a jelenlegi tesztekkel ACPA negatív, ezért fontos új epitópok keresése, azonosítása, hogy az esetlegesen ál-negatív RA betegek kiszűrhetőek legyenek. Az első ciklikus citrullinált peptid, amiből az anti CCP-1 ELISA alapú diagnosztikai kitet fejlesztették, a filaggrin volt [15]. Az epitóp peptid az alábbi szekvenciával rendelkezett: 306SHQESTXGRSRGRSGRSGS324 (X-citrullin). Ezt a peptid módosítottuk, az arginineket citrullinre cseréltük a 314, 316, 318 pozícióban. Azonosítottuk továbbá a citrullinált filaggrin minimál epitópját , a TXGRS szekvenciát, amit az RA szérumok még specifikusan felismernek [65]. Ezen két peptidből, valamint a kollagén és vimentin peptidekből hoztuk létre az általunk beállított és tesztelt citrullin-peptid-panelt. A teszteket ELISA alapú rendszerben végeztük. Előzetes kísérleteink során ellenőriztük a különböző hosszúságú biotinilált peptidek neutravidinnel fedett lemezre való kötődését. Megállapítottuk, hogy a rövidebb peptidek esetében jelentősen befolyásolja az epitóp hozzáférhetőségét [65]. Az eredmények ismeretében ezért a hosszú láncú biotin C-terminálison való alkalmazása mellett döntöttünk. Az epitóp hozzáférhetőségének javítása érdekében további spacer szakasz is beépítésre került, növelve a távolságot az epitóp és a biotin között. Régebbi eredmények alapján [72], biotin-6-aminohexánsav (hosszúláncú biotin) és a hosszabb Ttds spacer hatékonyságát is vizsgáltuk a rövid, 5-mer filaggrin peptid esetében. Összehasonlítva a két verziót, a Ttds spacert tartalmazó TXGRS peptidet jóval hatékonyabban ismerték fel az RA szérumok (60% szenzitivitás), mint a hosszú láncú biotint tartalmazó peptidet (40% szenzitivitás). A 19-mer filaggrin, a vimentin és a kollagén peptid szenzitivitása 95%-os specificitásnál 62 %, 44 %, és 41 %. Bár a filaggrin nem expresszálódik az ízületben, az a feltételezés, hogy keresztreagáló autoantitestek képesek a felismerésére [25]. Saját munkánkban mi is megfigyeltünk keresztreakciót RA szérumból affinitás tisztított antivimentin ellenanyag és a 19-mer filaggrin peptid között [66]. Annak eldöntésére, hogy fennáll-e a keresztreakció lehetősége az 5-mer filaggrin és a vimentin peptid között, kompetitív ELISA méréseket végeztünk. A várható eredménynek megfelelően kompetíciót figyeltünk meg a szilárd fázishoz kötött és a szolubilis fázisban levő peptidek között azonos peptid esetében, viszont kereszt-kompetíció más peptiddel nem volt kimutatható. Sem a szolubilisan hozzáadott 19-mer filaggrin nem volt képes leszorítani az ellenanyagokat a lekötött vimentin peptidről, sem a vimentin peptid nem fejtett ki gátló hatást az ellenanyagok
57
filaggrin peptidhez való kötődésében. Ezek az adatok az ACPA válasz poliklonalitására utalnak, továbbá arra, hogy a filaggrin peptiddel keresztreagáló ellenanyagok nem a vimentin immundomináns epitópját ismerik fel eredendően. Az ACPA válasz jelentős diverzitását már többen is leírták [30, 73-76], utalva arra, hogy a különféle citrullinált fehérjéket különféle ACPA klónok ismerik fel, mivel csak igen kis mértékű keresztreakció volt megfigyelhető. Lundberg és munkatársai 17 különböző betegcsoportot azonosítottak az ACPA specificitás profilja alapján, valamint megállapították, hogy a HLA-DRB1 shared epitóp allél, a PTPN22 gén és a dohányzás szoros összefüggést mutat a citrullinált α-enolázt és a citrullinált vimentint felismerő ellenanyagok meglétével. Ezek az adatok alátámasztják azt a lehetőséget, hogy a specifikus ACPA reaktivitás eltérő patomechanizmusú, és/vagy eltérő lefolyású betegcsoportot azonosíthat a rheumatoid arthritises betegeken belül [77]. Egy másik munkacsoport eredményei szerint a felismert epitópok száma korrelál az anti-CCP titerel, de nem mutat összefüggést a betegek klinikai paramérereivel [74]. Az epitóp spreading, vagyis a kezdetben egy vagy néhány autoantigén epitóp felimerésének kibővülése több epitópra, még a betegség tüneteinek kialakulása előtt bekövetkezik [73, 78]. Kérdéses, hogy a különböző epitópfelismerési mintázatok valóban összefüggésbe hozhatóak-e egyes klinikai fenotípusokkal a diagnosztizált betegek esetében. A fentiekhez hasonlóan, mi is elvégeztük a korrelációvizsgálatot a rendelkezésünkre álló klinikai markerek és a 4 epitópot tartalmazó (5-mer filaggrin, 19-mer filaggrin, vimentin, kollagén) citrullin-peptid-panel felismerésének adatai között. Mivel a különböző egyedekben jelenlevő ellenanyagok eltérő epitóp kombinációkat ismerhetnek fel, ezért az egyes peptidekkel kapott adatok összegzése után megállapítottuk a teljes peptid-panel diagnosztikai értékeit. A 4 citrullin pepdidből álló ELISA panel szenzitivitása 81%, 95%-os specificitás mellett, ezek az értékek összevethetőek a kereskedelmi forgalomban kapható kitek diagnosztikai paramétereivel. A klinikai paraméterek vizsgálatakor pozitív összefüggést találtunk a felismert peptidek száma, illetve az adott szérum CCP2 és MCV titere között. A peptidpozitivitás eloszlásának vizsgálatakor kimutattuk, hogy az egy peptidet felismerő szérumok fele a vimentin peptiddel reagál, míg a két peptidet felismerő szérumok fele a filaggrin peptidekhez kötődik. A kollagén peptid felismerése csak a három peptiddel reagáló csoportban válik hangsúlyossá. Ezek az adatok egyrészt arra utalnak, hogy az általunk vizsgált peptidek domináns és nem keresztreagáló autoantigén epitópok, másrészt szemléltetik az epitóp spreading lehetséges folyamatát. Legfontosabb eredményünk a peptid-panel vizsgálata során, hogy a tizenkét CCP2 negatív szérumból hetet, a hat MCV negatívból ötöt, a tripla negatív szérumokból (CCP2/MCV/RF
58
negatív) pedig hét esetből kettő szérumot sikerült pozitívként azonosítanunk a peptid-panellel. Ebből az a következtetés vonható le, hogy az általunk beállított 4 peptides panel segítségével kiszűrhetőek lennének azok az ACPA pozitív betegek, akik fals negatív eredményt adtak a CCP2 teszt során. Ismert, hogy az ACPA pozitív és negatív betegek patomechanizmusában vannak eltérések [66, 79], - a CCP pozitív esetekben a betegség lefolyása általában súlyosabb – ezért az ACPA jelenlétének minél korábbi kimutatása jelentős előnyökkel jár mind a diagnosztika, mind pedig a terápia szempontjából. Habár más közleményekkel egybevágóan nem találtunk összefüggést az ACPA felismerési profil és olyan klinikai értékek között, mint a DAS28 vagy CRP [74, 77], nem zárható ki annak a lehetősége, hogy a peptidfelismerési profil meghatározása hasznos lehet a személyre szabott terápia jövőbeli fejlesztésében. Ugyanígy nem találtunk korrelációt a felismert peptidek száma és a betegség időtartama között, habár szignifikáns különbség volt a betegség hosszában a négy peptidet felismerő csoportba tartozó betegek és a csak egy epitóppal reagáló betegek között, amely ismét az epitóp spreadingra utalhat. In vitro aktivált, RA betegekből származó B-sejtek citrullinált fehérje specifikus ellenanyagtermelését már előttünk is leírták [80, 81]. Ellentétben ezekkel a közleményekkel, mi nem figyeltünk meg jelentős citrullin-peptid specifikus ellenanyagtermelést egészséges donorokból származó B-sejteknél. Ennek az eltérésnek lehetséges magyarázata, hogy mások voltak a B-sejt kultúra körülményei, illetve eltérő peptideket vizsgáltunk. Az általunk alkalmazott kisérleti rendszerben elsősorban a memória B-sejteket stimuláltuk a TLR7 és TLR8 agonista R848, valamint IL-2 jelenlétében [82]. A peptid specifikus ELISpot vizsgálatok során szignifikáns különbséget találtunk az RA betegekből származó aktiválódott, peptid specifikus ellenanyagtermelő sejtek számában a citrullin és arginin tartalmú kontroll peptidek között a 19-mer filaggrin és a vimentin peptid esetében. Eredményeink az RA betegekben jelenlevő autoreaktív memóriára utalnak, mivel a betegek memória B-sejtjei a citrullin tartalmú peptidekre specifikus IgG termelő sejtekké diferenciálódtak in vitro körülmények között. A korábbi irodalmi adatok szerint peptidkötődési vizsgálatok rheumatoid artitisben elsősorban T-sejteken folytak, peptid-MHCII komplexek alkalmazásával. Snir és munkatársai leírták, hogy a vimentin citrullinált formája képes kötődni HLA-DRB1*0401 pozitív T-sejtekhez, míg a peptid natív formája nem. Ugyanakkor a citrullinált peptid hasonló mértékű kötődését mutatták ki mind RA betegek, mind egészségek T-sejtjeihez [83]. Az általunk vizsgált peptidek esetében nem találtunk T-sejtekhez való kötődést, mivel azt az általunk beállított kísérleti rendszerben nem peptid-MHCII komplex segítségével néztük. A B-sejtekhez való
59
kötődés 2-15% eltérést mutatott a citrullinált peptidek javára RA betegekben. Ez az érték jóval magasabb, mint az SLE betegekben leírt epitóp-peptid kötődés (0.10%– 0.17%) [84]. Az eltérés következhet a két eltérő betegségből, valamint a módszerek különbözőségéből is. Nem tapasztaltunk hasonló, háttértől való eltérő kötődést az egészségesekből származó B-sejtek esetében. Több közlemény is leírta, hogy RA betegekből származó PBMC citrullinált peptidek hatására gyulladási citokinek termelésére képes [83], [85]. A proinflammatórikus citokinek fontos regulátorai az ízületi gyulladásnak [86]. A Th 1 és Th 17 sejtek által termelt IFNγ és IL-17 a betegség súlyosbodását okozza [77]. Az IL-17 már a tünetek kialakulása előtt is fokozottan termelődik, szintje ekkor a legmagasabb [87]. Hueber és munkatársai azt is leírták, hogy az ACPA titere összefüggésbe hozható a szérumból kimutatható proinflammatórikus citokinek szintjével [88]. Újabb adat, hogy a betegek egy része IL-10 termeléssel válaszolt a peptidkezelésre, amelyet a regulátor T-sejtek termelnek. Egy izraeli kutatócsoport eredményei szerint alacsony dózisú multiepitóp peptidkezeléssel csökkenthetők a betegség tünetei adjuváns indukálta arthritis állatmodellben, egyidejűleg megfigyelték a regulátor T-sejtek számának növekedését is (közlés alatt). Az IL-10 szupresszálja az IL-1 és TNF citokineket, gátolja a mátrix metalloproteinázok termelődését, valamint gátolja az oszteoklasztok fejlődését, megelőzve ezzel az ízület károsodását [89]. Mivel az IL-10 polimorfizmusa öszefüggést mutat az autoantitest termeléssel és az ízületi károsodással [90], az adott peptidre adott citokinválasz hasznos információ lehet a terápia szempontjából. Mindezeket az adatokat összegezve, a filaggrinból, vimentinből és kollagénből felépülő citrullin peptid-panel több ACPA pozitív RA beteget képes detektálni a kereskedelmi forgalomban kapható kitekhez képest, valamint a peptidek, különösen a filaggrin és a vimentin peptidek, alkalmasak az autoreaktív RA B-sejtek detektálására, memória B-sejtek működésének vizsgálatára és további tanulmányozására. A kit továbbfejlesztés után szintén hasznos segítség lehet a személyre szabott terápia kialakításában. A kollagén indukált arthritis az RA nagyon fontos modellje, jól használható a gyulladás, az autoimmun folyamatok, és az arthritis tanulmányozására. A kollagén specifikus ellenanyagok elsődleges szerepet játszanak a betegség indukciójában, az autoantitestekből keletkező immunkomplexek gyulladás kialakulásához és szövetkárosodáshoz vezetnek [32, 53, 59, 91]. Mindezek ellenére a CIA immunkomplexek általi modulációjának mechanizmusa még nem teljesen tisztázott. Célunk volt az FcγRII/III receptorokhoz irányított, a kollagén
60
immunodomináns epitópját tartalmazó mesterséges immunkomplexek hatásának vizsgálata a CIA indukciójára és lefolyására. A CII peptidet a kollagén triplahelkális konformációjú, 359-369 régiójában elhelyezkedő epitópjaként írták le, amely elsődleges célpontjául szolgál a kollagén specifikus ellenanyagoknak, mind egérben, mind RA betegekben [36, 37]. Feltételeztük, hogy a kollagén-indukált arthritises egerek memóriasejtjei felismerik az FcRII-hoz irányított CII peptidet, ami az ellenanyagtermelés gátlásához vezet, végső soron pedig enyhítene a betegség tünetein. Ezzel szemben az arthritis pontok értékelésénél azt láttuk, hogy az összes konstrukció (2.4G2 tetramer, CII-peptid tetramer, immunkomplex) súlyosbító hatással volt a tünetekre a csak kollagénnel oltott kontrollcsoporthoz képest. Amikor viszont az állatok monomer formában kapták a peptidet, vagy az egyláncú ellenanyagot, nem tapasztaltunk eltérést a kontrollcsoporttól. Kontrollként beoltottuk a különböző komplexeket kollagénnel előzetesen nem-immunizált állatokba is, ekkor az arthritis semmilyen megjelenési formáját nem tapasztaltuk. Ezért arra következtettünk, hogy az arthritis pontok szignifikáns emelkedése a 2.4G2 tetramerrel és az immunkomplexszel oltott csoportban valószínűleg az FcγRII/III pozitív sejtek, mint a makrofágok és a dendritikus sejtek célzásának az eredménye [60, 92]. Megvizsgáltuk a különböző komplexek in vitro és in vivo kötődését kollagénnel immunizált állatok lépsejtjeihez, hogy azonosíthassuk a célzott sejteket. Az in vitro kötődés során a lép Bsejtek közel fele kötötte 2.4G2 tetramert, illetve az immunkomplexeket. Ez a megfigyelés párhuzamban áll egy korábbi tanulmánnyal, amely szerint az FcγRIIb expressziója leszabályozódik a germinális centrum B-sejteken [93]. Az in vivo kötődés kiértékelése során azt tapasztaltuk, hogy az immunkomplexek legfőképpen a MARCO pozitív, marginális zóna makrofágokhoz kötődtek. Az immunkomplexek és a CII peptid tetramer esetében egy gyengébb kötődés is megfigyelhető volt CR1/CR2high sejtekhez. Ezen sejtek T-sejtes zónában való elhelyezkedése kizárja azt, hogy follikuláris dendritikus sejtek legyenek, mégis dendritikus sejt szerű a morfológiájuk. Az áramlási citometriás mérések azt mutatták, hogy a dendritikus sejtek körülbelül 40%-a, illetve az F4/80 pozitív makrofágok több mint fele kötötte a 2.4G2 tartalmú konstrukciókat in vitro. Mivel a CII-peptid tetramer – a B-sejtek kis hányada mellett – szintén kötődött makrofágokhoz és dendritikus sejtekhez is, azt feltételezzük, hogy a kollagénnel immunizált állatok szérumában jelen lévő kollagén specifikus ellenanyagok ismerték fel a peptidet és mediálták a kötődést (23. ábra). Korábban leírták, hogy a DC-k képesek FcγRIIb közvetített úton felvenni az immunkomplexeket azok degradációja nélkül, majd azokat újraexpresszálni a felszínükön, ami a B-sejtek proliferációját
61
és IgG2a ellenanyagtermelést indukálja [94]. Ezzel egybevágóan nekünk is sikerült igazolni, hogy a 2.4G2 ScFv-CII-peptid komplexek FcγRIIb receptoron keresztüli kötődése a dendritikus sejtekhez valóban kiváltja a peptid specifikus IgG2a termelődését az immunkomplexszel kezelt állatokban. Annak eldöntésére, hogy a CII-peptidet tartalmazó komplexek, illetve tetramerek képesek-e ellenanyagtermelés indukciójára, összehasonlítottuk a kollagén-specifikus, illetve a CII-peptid specifikus IgG titereket a négy különböző CIA csoportban.
Th1 válasz indukciója
antigén prezentáció
citokin szekréció fokozott ellenanyag termelés
scFv tetramer CII peptid
immunkomplex FcγR
ellenanyag termelés gátlása
Peptid
specifikus IgG 23. ábra: tetramer Az FcγR célzott komplexek lehetséges CIA moduláló hatásai
a) Dendritikus sejteken: az immunkomplex vagy a CII-peptid tetramer peptidspecifikus IgG molekulán kereszüli FcγRII/III kötődése fokozza az antigén prezentációt. b) Makrofágokon: A 2.4G 2scFv tetramer, immunkomplex vagy a CII-peptid tetramer képes keresztkötni a FcγII/III vagy FcγRIV receptorokat, ezáltal citokinszekréciót indukálni. c) A DC-k és makrofágok által termelt citokinek, mint az IL-12 vagy IL-23, indukálhatják a gyulladásos TH1 választ. d) B-sejteken: az immunkomplexek képesek a BCR-hez és a gátló FcγRIIb-hez egyidejűleg kötődni és az ellenanyagtermelést gátolni; vagy a CII-peptide tetramer képes a BCR-ek keresztkötésére és a CII-peptid specifikus immunválasz stimulálására.
62
Bár a kollagén-specifikus IgG titerben nem figyeltünk meg jelentős változást egyik kezelés hatására sem, a FcRII/III célzott CII immunkomplex jelentősen megemelte a CII-peptid specifikus IgG titert mind a kontroll csoporthoz, mind pedig a tetramerekkel oltott csoportokhoz viszonyítva. Eredményeink azt jelzik, hogy bár a CII-peptid specifikus IgG minden kollagénnel immunizált csoportban jelen van, az FcRII/III célzott CII-peptid jóval hatékonyabb a peptid-specifikus ellenanyagválasz kiváltásában, mint a CII-peptid tetramer önmagában. A szerológiai adatokból szintén kiderül, hogy a FcRII/III célzott ‘immunkomplex’ növeli az IgG2a izotípusú, inflammatórikus ellenanyag szintézisét, ami a Th1 válasszal hozható összefüggésbe [95]. A CII-specifikus IgG2a jelenléte a szérumban lehetővé teszi az IgG2a tartalmú immunkomplexek kialakulását. Az IgG2a a makrofágokon és neutrofileken jelen lévő aktiváló FcγRIV receptorokhoz körülbelül tízszer-százszor nagyobb affinitással kötődik, mint a gátló típusú FcγRIIb receptorhoz. Vagyis az IgG2a alosztályú ellenanyagok gyulladási folyamatokat aktiválnak és nem érvényesül az immunkomplexek gátló hatása az ellenanyagtermelésre [96]. Eredményeink alapján azt feltételezzük, hogy a CII-peptid-IgG2a komplexek erősítik a gyulladásos reakciót a kollagén indukált arthritises DBA/1 egerekben FcγRIV receptorhoz való kötődésen keresztül. Ezt alátámasztja egy közelmúltban megjelent közlemény, amely leírja, hogy az egér magas affinitású FcγRIV receptora elengedhetetlen az ellenanyag- indukálta arthritis kiváltásához [97]. Az immunkomplexek FcγR pozitív sejtekhez való kötődésének kimenetelét az aktiváló és gátló típusú Fcγ receptorok egyensúlya szabja meg. CIA egerekből származó makrofágokban leírták a FcγR expresszió szabályozásának zavarát, ami az aktiváló FcγRI és FcγRIII fokozott expressziójához, illetve a gátló FcγRIIb leszabályozásához vezetett [98]. Ezért a FcγRII/III célzott CII peptid komplexekről és a 2.4G2 tetramerekről azt gondoljuk, hogy képesek ezeken a makrofágokon jelen lévő FcγRIII receptorokhoz fokozottan kötődni, kiváltva ezzel olyan proinflammatórikus citokinek szekrécióját, mint az IL-1 és TNFα [99]. A proinflammatórikus citokinek fontos regulátorai az RA ízületi gyulladásában [86]. A Th 1 és Th 17 sejtek által termelt IFNγ, IL-17 és IL-23 a betegség súlyosbodását okozza [77], sőt, az IL-17 és TNFα együttes jelenléte súlyos lefolyású betegséget jelez előre [100]. CIA-ban leírták, hogy az autoimmun arthritis kialakulásához nélkülözhetetlen az IL-23/IL-17 tengely [68]. Azt is kimutatták, hogy az IL-17 deficiens egerek CIA rezisztensnek bizonyultak [101], valamint az IFNγ és az IL-17 fokozta az FcγR mediálta ízületkárosodást immunkomplex mediált arthritises egerekben [102]. Ezért megvizsgáltuk, hogy a 2.4G2scFv-CII peptid komplexek milyen citokinek szekrécióját váltják ki. A kollagénnel immunizált CIA egerek in vitro lépsejtkultúráiban IFNγ, TNFα, IL-17 és IL-10 szekréciót tudtunk kimutatni az FcRII/III
63
célzott CII peptid immunkomplex hatására. A további, protein mikro-array-en végzett kísérletek alapvető különbséget mutattak számos citokin és kemokin termelésében, két órával az egerek különböző komplexekkel való oltása után. Az immunkomplex kezelés hatására jelentős emelkedést tapasztaltunk az IL-1, IL-3, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-17, IL-23 és TNFα szekréciójában, valamint a CXCL13, MIP-1 és MIP-2 kemokinek szekréciója is emelkedett. A CII peptid tetramer stimulálta az IL-10, IL-17, IL-23 és MIP-2 termelődését, amíg a 2.4G2 tetramerek fokozták a G-CSF, IL-6, IL-10 és MIP-2 szekrécióját. A makrofágok aktivációját – többek közt – az immunkomplexek aktiváló Fcγ receptokokhoz kötődése váltja ki, ami számos gyulladási mediátor termelődéséhez vezet [103, 104]. A makrofág inflammatórikus protein 1α (MIP-1α/CCL3) az RA szinoviumot bélelő sejtek és intersticiális makrofágok által termelt fehérje [105, 106], amely TNFα hatására termelődik [103]. A MIP-1α jelentős mennyiségben jelen van a szinoviális folyadékban, és kemoattraktáns hatással bír a monocitákra, T-sejtekre, B-sejtekre, NK-sejtekre, valamint bazofil és eozinofil granulocitákra is [107]. A MIP-1α és a MIP-2 expressziója és hatása az IL-10 citokinnel együtt ismert folyamat a CIA kialakulása során. Az IL-10 fontos immunmodulátor a CIA patogenezisében a MIP-1α és MIP-2 expressziójának szabályozása révén [69]. Az antigén-stimulált dendritikus sejtek és makrofágok által termelt IL-23 az egyik nélkülözhetetlen faktora a Th 17 sejtek túlélésének és expanziójának, amely sejtek IL-17, IL-6 és TNFα citokineket termelnek. Az IL-23/IL-17 tengelynek kulcsfontosságú szerepe van az autoimmun arthritis kialakulásában [108]. Az IL-23 autokrin/parakrin módon hat a dendritikus sejtekre és makrofágokra, stimulálva azok proinflammatórkus citokintermelését (IL-1, IL-6, TNF-α) [68]. Eredményeink azt mutatják, hogy a 2.4G2-CII komplexek, illetve az in vivo kialakult IgG2aCII peptid immunkomplexek az aktiváló FcγRIII-hoz, és/vagy az FcγRIV-hez kötődnek, indukálják a makrofágok és dendritikus sejtek IL-23 szekrécióját, ami kiváltja a Th 17 sejtek IL-17, IL-6 és TNFα szekrécióját. Ezeken kívül további gyulladási citokinek és kemokinek emelkedett szekréciója is megfigyelhető volt a komplex ráoltás hatásának köszönhetően. A kollagén indukált arthritises DBA/1 egerek kezelése a 2.4G2-CII peptid immunkomplexszel szintén emelte az IL-3 és GCSF szekrécióját. Újabb adatok szerint a CD11b+ makrofágok jelenlétében, CD4+ T-sejtek által termelt IL-3 citokinnek nagyon fontos szerepe van a CIA korai szakaszában. Az IL-3 képes a bazofil granulociták aktiválására, tovább növelve a folyamatban részt vevő effektor sejtek sorát [109]. További kutatások arról is beszámolnak, hogy szuboptimális dózisban, II típusú kollagénnel immunizált DBA/1 egerekben M-CSF vagy G-CSF előzetes, napi szintű
64
oltása jelentősen fokozta a betegség tüneteit, vagyis az M-CSF és a G-CSF proinflammatórikus szerepet tölthet be a CIA kialakulása során [110]. Az FcγRII/III targetált CII peptid komplexek által indukált kemokinek közül a BLC (CXCL13), a MIP1 és a MIP-2 a legfontosabb. A B limfocita kemoattraktáns CXCL13 kemokin szabályozza a follikulusok kialakulását, valamint segíti az ektopikus nyirokszövet kialakulását a szinoviumban, és stimulálja az autoreaktív ellenanyagok lokális termelődését [111]. A CXCL13 expresszióját kimutatták RA szinoviális sejtekből, valamint a kemokin gátlása csökkentette a betegség súlyosságát CIA modellben, arra utalva, hogy a CXCL13 is fontos faktor a betegség kialakulásában és patomechanizmusában [93]. Mindezeket az eredményeket összefoglalva, azt mondhatjuk, hogy az FcγRII/III célzott CIIpeptid mesterséges immunkomplexek fokozzák a gyulladásos Th1 mediált, autoreaktív IgG2a választ, továbbá serkentik különféle gyulladásos citokinek és kemokinek szekrécióját a kollagén indukált arthritises DBA/1 egerekben. A II típusú kollagén peptid tetramerekkel kezelt, kollagénnel pre-immunizált állatokban valószínűleg kialakulhatnak CII-peptid-IgG2a természetes immunkomplexek is, amelyek képesek az aktiváló FcγRIV receptorhoz kötődni. A 2.4G2 ScFv-t tartalmazó komplexek a FcγRIII receptorhoz kötődnek, mindkét aktiváló FcγR fokozza az IL-23 és MIP-2 proinflammatórikus citokinek termelődését, amelyeknek kulcsfontosságú szerepük van az autoimmun arthritisben. Eredményeink hozzájárulnak az immunkomplexek által kiváltott patológiás folyamatok mechanizmusának tisztázásához CIAban.
65
8. Új tudományos eredmények
- Az általunk beállított citrullin-peptid-panel segítségével lehetővé válik a CCP negatívként diagnosztizált rheumatoid arthritises betegek detektálása - Kimutattuk, hogy bár a citrullinált vimentin fehérjét felismerő autoantitestek keresztreagálnak a filaggrin peptiddel, a filaggrin peptidet felismerő ellenanyagok nem a vimentin immunodomináns epitópjával keresztreagálnak. - A citrullin tartalmú filaggrin és vimentin peptidek segítségével lehetővé vált az autoreaktív RA B-sejtek áramlási citometriás detektálása, valamint az in vitro autoantitest termelés mérése RA-ban. - A citrullin peptid stimulációra adott citokinválasz vizsgálata hasznos információval szolgálhat az RA betegek kezelésének megválasztásában. - A betegség patomechanizmusát vizsgálva CIA modellben megállapítottuk, hogy a CII peptidet tartalmazó immunkomplexek hatására fokozódik a kollagén peptid specifikus IgG2a ellenanyag termelése. - Kimutattuk, hogy az IgG2a tartalmú immunkomplexek felelősek a gyulladásos környezet fenntartásáért, és az autoreaktivitás pozitív visszacsatolásáért.
66
9. Összefoglalás Az autoimmun betegségek a világ népességének 5-10 %-át sújtják. A sajátot támadó immunreakció során gyulladás alakul ki az érintett szövetben. A rheumatoid arthritis az ízületeket érintő progresszív, szisztémás autoimmun betegség, melynek etiológiája nem pontosan ismert. Széleskörű kutatások folynak a betegség hátterének, patomechanizmusának felderítésére. A kísérletes állatmodellek, mint például a kollagén indukált arthritis, jól alkalmazhatók mind az alapkutatás során, mind a terápiás szerek vizsgálatára. Nagy igény mutatkozik újabb diagnosztikai markerek felkutatására, ami megkönnyíti a hasonló kórképek egymástól való elkülönítését, és a megfelelő terápia mielőbbi elkezdését. Az általunk beállított és jellemzett, filaggrin, vimentin és kollagén peptidekből álló citrullin-peptid-panel specificitása és szenzitivitása összevethető a kereskedelmi forgalomban kapható diagnosztikai kitekével, azonban a peptid-panel jelentős mértékben felismer olyan betegekből való szérummintákat is, amelyek a korábbi tesztekben CCP negatívnak bizonyultak. A peptid pozitivitás mértéke szoros összefüggést mutatott a CCP2 és MCV titerekkel. Kimutattuk, hogy a filaggrin peptidet felismerő ellenanyagok nem keresztreagálnak a vimentin immundomináns epitópjával, bár az MCV fehérje-specifikus antitestek felimerik a filaggrin peptidet. .A peptid-panel alkalmasnak bizonyult az autoreaktív B-sejtek detektálására is. Az RA betegek in vitro PBMC kultúráiban, a peptid stimuláció hatására a betegek többségében IFNγ és IL-17 gyulladásos citokinek termelődését figyeltük meg, ugyanakkor a betegek más csoportjának sejtjei anti-infammatórikus IL-10 termeléssel reagáltak. Mindezek alapján, a peptid-panel alkalmasnak tartjuk diagnosztikai célú vizsgálatokra, a továbbiakban segítség lehet a személyre szabott terápia fejlesztésében. A kollagén indukált arthritises egerekben a betegség patomechanizmusát vizsgáltuk. FcγRII/III-hoz irányító 2.4G2-CII peptid komplex, kisebb mértékben a 2.4G2 tetramer és a CII peptid tetramer a betegség tüneteinek súlyosbodását idézte elő, továbbá kimutattuk, hogy jelentősen fokozódott a CII peptid specifikus IgG2a izotípusú inflammatórikus ellenanyag termelődése az 2.4G2-CII peptid komplexszel oltott állatokban. Megfigyeléseink szerint a 2.4G2-CII komplexek, illetve az in vivo kialakult IgG2a-CII peptid immunkomplexek az aktiváló FcγRIII-hoz, és/vagy az FcγRIV-hez kötődve citokin/kemokin szekréciót indukálnak a makrofágokból és dendritikus sejtekből. A termelődött gyulladásos citokinek közül több is kulcsfontosságú az autoreaktív arthritis kialakulásában. Összefoglalva, a mesterséges immunkomplexek - a természetes körülmények között kialakuló immunkomplexek modelljeiként- fokozzák a gyulladásos Th1 mediált, patológiás IgG2a választ.
67
10. Summary Autoimmune diseases affect 5-10 % of world population. Self-specific pathological immune response causes inflammation and tissue damage. Rheumatoid arthritis is a progressive, systemic autoimmune disease which is distinguished by chronic inflammation of synovial joints. Because of complexity of the disease, additional research is needed to understand better the background and pathogenecity of this disorder. There is a need for novel diagnostic possibilities and disease markers that should potentiate early diagnosis and help to find relevant treatment. We have characterized a citrulline-peptide-panel containing filaggrin, vimentin and collagen peptides that has similar sensitivity and specificity values then commercially available tests. Furthermore, the panel is able to detect almost 60% of patients from the CCP negative group. Numbers of recognized peptides has shown strong association with CCP2 and MCV titers. We showed that antibodies reacting with the filaggrin peptide do not cross-react with the immunodominant epitope of vimentin; however MCV protein-specific antibodies recognize the filaggrin peptide. With this citrulline peptide panel we are able to detect autoreactive B cells by flow cytometry and also peptide specific antibody producing cells via ELISpot. PBMC from RA patients treated with citrullinated peptides in vitro secreted pro-inflammatory cytokines such as IFNγ and IL-17 in about 50 % of cases, while cells from an other group of patients produced anti-inflammatory IL-10. Taking all together these data, we conclude that the citrulline peptide panel is applicable for diagnostic purpose, and may be applied to develop personalized therapy in the future. The collagen induced arthritis (CIA) in mice is one of the best models for the human disease. We have studied the effect of complexes composed of collagen peptide and FcγRII/III specific single chain antibody 2.4G2. In the four experimental groups (2.4G2 scFv-CIIpeptide complexes, CII-peptide ‘tetramer’s or 2.4G2 scFv ‘tetramer’s) of mice, surprisingly we found that all molecular constructs aggravated disease activity. FcRII/III targeted CIIpeptide complexes enhanced the synthesis of the inflammatory IgG2a isotype, which is associated with a Th1 response. We suggest that 2.4G2 scFv-CII-peptide complexes and the in vivo formed IgG2a -CII-peptide immune complexes may bind to FcγRIII and/or to FcγRIV, inducing the secretion of IL-23, which in turn trigger Th17 cells. Taking all together these data indicate that the administration of FcγRII/III targeted CII-peptide complexes into collagen primed DBA/1 mice enhances the inflammatory Th1 driven IgG2a response. Thus we conclude that inflammatory IgG2a containing immune complexes have major role in maintenance of inflammation and trigger positive feedback of autoreactivity. 68
11. Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom témavezetőmnek Prof. Dr. Sármay Gabriellának, hogy biztosította számomra a doktori munka elvégzésének lehetőségét, hasznos tanácsait, útmutatását, szakmai fejlődésem előremozdítását, türelmét. Köszönettel tartozom Prof. Dr. Erdei Annának, hogy doktori munkámat az ELTE Immunológiai Tanszékén végezhettem. Köszönöm Neer Zsuzsának és Dr. Ádori Mónikának, hogy bevezettek a kutatómunkába, és a későbbiekben mindig feltétel nélkül segítettek. Köszönöm Dr. Kövesdi Dorottyának az építő jellegű kritikát, hasznos tanácsait. Köszönöm Huber Krisztinának a munkában nyújtott hatalmas segítséget, lelkiismeterességét, precizitását. Köszönöm Dr. Nagy Györgynek, Dr. Rojkovich Bernadettnek, Dr. Baka Zsuzsának és Dr. Gáti Tamásnak a Budai Irgarmasrendi Kórház munkatársainak az RA minták folyamatos biztosítását, illetve betegadatok rendelkezésemre bocsátását. Köszönettel tartozom Babos Fruzsinának és Dr. Magyar Annának az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport munkatársainak a peptidek szintéziséért. Köszönöm Pásztor Mártának, Gősi Sándornének és Mikesy Árpádnak a technikai segítségüket. Köszönöm a Jelátvitel labor munkatársainak és az Immunológiai tanszék összes dolgozójának a munkámhoz kapott segítséget és a jó hangulatot. Köszönöm családomnak és barátaimnak, hogy biztosították a kiegyensúlyozott hátteret, és mindenben támogattak.
69
12. Saját közlemények jegyzéke 12.1 Közlemények az értekezéssel kapcsolódó témában E. Szarka, F. Babos, A. Magyar, K. Huber, Z. Szittner, K. Papp, J. Prechl, J. Pozsgay, G.Nagy, B. Rojkovich, T. Gáti, J Kelemen, Z. Baka, M. Brózik, B. Pazár, G. Poór, F. Hudecz and G. Sármay Recognition of new citrulline containing peptide epitopes by autoantibodies produced in vivo and in vitro by B cells of Rheumatoid arthritis patients IMMUNOLOGY (2013) 141(2):18191. IF: 3.705 F. Babos, E. Szarka, G. Nagy, Z. Majer, G. Sármay, A. Magyar, F. Hudecz The role of N- or C-terminal biotinylation in antibody recognition of citrullin containing filaggrin epitope peptides in Rheumatoid arthritis BIOCONJUGATE CHEMISTRY 24: (5), pp 817–827 (2013) IF: 4.58 Szarka E*, Neer Z*, Balogh P, Adori M, Angyal A, Prechl J, Kiss E, Kovesdi D, Sarmay G, Exacerbation of collagen induced arthritis by Fcgamma receptor targeted collagen peptide due to enhanced inflammatory chemokine and cytokine production. BIOLOGICS: TARGETS & THERAPY 6: pp. 101-115. (2012) (*: megosztott első szerzők)
Baka Z, Barta P, Losonczy G, Krenacs T, Papay J, Szarka E, Sarmay G, Babos F, Magyar A, Geher P, Buzas EI, Nagy G, Specific expression of PAD4 and citrullinated proteins in lung cancer is not associated with anti-CCP antibody production INTERNATIONAL IMMUNOLOGY 23:(6) pp. 405-414. (2011) IF: 3.301
70
Harre U, Georgess D, Bang H, Bozec A, Axmann R, Ossipova E, Jakobsson PJ, Baum W, Nimmerjahn F, Szarka E, Sarmay G, Krumbholz G, Neumann E, Toes R, Scherer HU, Catrina AI, Klareskog L, Jurdic P, Schett G, Induction of osteoclastogenesis and bone loss by human autoantibodies against citrullinated vimentin. JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION 122:(5) pp. 1791-1802. (2012) IF: 14.152
12.2 Egyéb közlemények Angyal Adrienn, Szekeres Zsuzsanna, Balogh Péter, Neer Zsuzsanna, Szarka Eszter, Virág Viktor, Medgyesi Dávid, Prechl József, Sármay Gabriella, CD16/32-specific biotinylated 2.4G2 single-chain Fv complexed with avidin-FITC enhances FITC-specific humoral immune response in vivo in a CD16-dependent manner. INTERNATIONAL IMMUNOLOGY 22:(2) pp. 71-80. (2009) IF: 3.403
12.3 Konferenciaközlemények, absztraktok Babos F, Szarka E, Adori M, Baka Z, Nagy Gy, Sármay G, Hudecz F, Magyar A, Synthesis and comparison of new citrullinated epitopes the early diagnosis of rheumatoid arthritis JOURNAL OF PEPTIDE SCIENCE 16: p. 166. (2010) Szarka E, Babos F, Magyar A, Hudecz F, Nagy Gy, Sármay G, Identification of a new citrullinated epitope on filaggrin for the early diagnosis of rheumatoid arthritis ANNALS OF THE RHEUMATIC DISEASES 69:(S2) p. A1. (2010) Sármay G, Szarka E, Pozsgay J, Szili D, Babos F, Nagy GY, Rojkovich B, Magyar A, Hudecz F, Citrullin-containing peptides as B-cell epitopes In: Kiss T, Perczel A Proceedings of 4th European Conference on Chemistry for Life Sciences, Bologna: Medimond Publisher, 2011. pp. 95-103. Babos F, Szarka E, Nagy GY, Majer ZS, Sármay G, Magyar A, Hudecz F, The role of N- or C-terminal biotinylation in antibody recognition of citrullin containing filaggrin epitope peptides. EUROPEAN JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION 42:(1) p. 61. (2012)
71
Baka Zs, Barta P, Losonczy G, Krenacs T, Papay J, Szarka E, Sarmay G, Babos F, Magyar A, Geher P, Buzas EI, Falus A, Nagy Gy, Increased citrullination in lung cancer does not lead to the production of anti-citrullinated protein antibodies EUROPEAN JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION 42:(2) p. 61. (2012)
Szarka E, Pozsgay J, Huber K, Kemenes K, Babos F, Baka Z, Magyar A, Hudecz F, Nagy Gy, Sarmay G, New possibility of characterization of rheumatoid arthritis B-cells: citrulline containing peptides EUROPEAN JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION 42:(1) pp. 62-63. (2012)
Szittner Z, Szarka E, Papp K, Prechl J, Babos F, Magyar A, Hudecz F, Sarmay G, Nagy Gy Application of a microarray platform in rheumatoid arthritis for the detection of anticitrullinated peptide antibodies and rheumatoid factors. EUROPEAN JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION 42:(1) p. 62. (2012)
72
13. Irodalomjegyzék
1. 2. 3.
4. 5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13. 14.
15.
16.
E. Witebsky, N.R.R., K. Terplan et al., Chronic thyroiditis in autoimmunization. JAMA, 1957. 164: p. 1439-1447. Nora Ng MB MRCP, A.K.M.F., Rheumatoid Arthritis – Getting the Best Outcome. EliA Journal, 2007. 1. Akari Suzuki, R.Y., Kazuhiko Yamamoto, Citrullination by peptidylarginine deiminase in rheumatoid arthritis. New York Academy of Sciences, 2007. 1108: p. 323-339. F. Benkharda, R.-L.H., Anti-Citrullinated Protein / Peptide Antibodies in Rheumatoid Arthitis. Elia Journal, 2007. 1. Lars Klareskog, J.R., Karin Lundberg, Leonid Padyukov, Lars Alfredsson, Immunity to citrullinated proteins in rheumatoid arthritis. The Annual Reviews Immonology, 2008. 26: p. 651-675. Bence György, E.T., Edit Tarcsa, András Falus, Edit I. Buzás Citrullination: A posttranslational modification in health and disease. International Journal of Biochemistry & Cell Biology 2006. 38: p. 1662-1677. Floris van Gaalen, A.I.-F., Tom W. J. Huizinga, René E. M. Toes, The devil in the details: The emerging role of anticitrrulline autoimmunity in rheumatoid arthritis;. The Journal of Immunology, 2005. 175: p. 5575-5580. Katleen Van Steendam, K.T., Dieter Deforce, The relevance of citrullinated vimentin int he production of antibodies against citrullinated proteins and the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Rheumatology Oxford Journal, 2011. Lars Klareskog, V.M., Karin Lundberg, Leonid Padyukov, Lars Alfredsson, Smoking, citrullination and genetic variability in the immunopathogenesis of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunology, 2011. 23: p. 92-98. Baka, Z., et al., Specific expression of PAD4 and citrullinated proteins in lung cancer is not associated with anti-CCP antibody production. Int Immunol, 2011. 23(6): p. 405-14. Cope, A.P., Exploring the reciprocal relationship between immunity and inflammation in chronic inflammatory arthritis. . Rheumatology Oxford Journal, 2003. 42: p. 716– 731. Aryeh M. Abeles, M.D., and Michael H. Pillinger, M.D., The Role of the Synovial Fibroblast in Rheumatoid Arthritis Cartilage Destruction and the Regulation of Matrix Metalloproteinases. Bulletin of the NYU Hospital for Joint Diseases, 2006. 64(1-2). Panayi, G.S., B cells: a fundamental role in the pathogenesis of rheumatoid arthritis? Rheumatology Oxford Journal, 2005. 44(suppl.2): p. ii3–ii7. Zoltán Szekanecz, L.S., Zoltán Szabó, Andrea Feket, Anikó Kapitány, Anikó and S.S. Végvári, Gabriella Szücs, Sándor Szántó, Gabriella Lakos, Anti-Citrullinated protein antibodies in rheumatoid arthritis: As good as it gets? Clinic Rev Allerg Immunol, 2008. 34: p. 26-31. Schellekens, G.A., et al., Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest, 1998. 101(1): p. 273-81. Dejan Spasovski, T.G., Nada Marina, Jordan Calovski, Snezana Percinkova, and B.O. Ljubinka Rajcevska, Koco Cakalorski, The diagnostic value of the second generation anti-CCP test in rheumatoid arthritis. JMB, 2008. 27(1): p. 52-58.
73
17.
18. 19. 20. 21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32. 33.
Hani S El-Gabalawy, J.A.W., Anti-Sa antibodies: prognostic and pathogenetic significance to rheumatoid arthritis. Arthritis Research and Therapy, 2004. 6(2): p. 86-89. Deighton C, C.L., Recent advances in the genetics of rheumatoid arthritis. Curr Rheumatol Rep, 2006. 8(5): p. 394-400. de Vries RR, H.T., Toes RE, Redefining the HLA and RA association: to be or not to be anti-CCP positive. J. Autoimmun, 2005. 25: p. 21-5. Edwards CJ, C.C., Early environmental factors and rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol., 2006. 143(1): p. 1-5. Liao F, L.Z., Wang Y, Shi B, Gong Z, Cheng X, Porphyromonas gingivalis may play an important role in the pathogenesis of periodontitis-associated rheumatoid arthritis. Med Hypotheses, 2009. 72(6): p. 732-735. Lilla Soós, Z.S., Zoltán Szabó, Andrea Fekete, Margit Zeher, Ildikó F., K.D. Horváth, Anikó Kapitány, Anikó Végvári, Sándor Sipka, Gyula, and G.L. Szegedi, Clinical Evaluation of anti-mutated citrullinated vimentin by ELISA in rheumatoid arthritis. The Journal of Immunology, 2007. 34(8): p. 1658-63. Anouk L. Feitsma, E.I.H.v.d.V., Kees L. M. C. Franken, Hanane el Bannoudi, Berendina G. Elferink, Jan W. Drijfhout, Tom W. J. Huizinga, René R. P. de Vries, René E. M. Toes, A. Ioan-Facsinay, Identification of citrullinated vimentin peptides as T cell epitopes in HLA-DR4-Positive patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism, 2010. 62(1): p. 117-125. Girbal-Neuhauser E DJ, A.M., Dalbon P, Sebbag M, Vincent C, Simon M, Senshu T, Masson-Bessière C, Jolivet-Reynaud C, Jolivet M, Serre G., The epitopes targeted by the rheumatoid arthritis-associated antifilaggrin autoantibodies are posttranslationally generated on various sites of (pro)filaggrin by deimination of arginine residues. J Immunol, 1999. 162: p. 585-94. Masson-Bessiere, C., et al., The major synovial targets of the rheumatoid arthritisspecific antifilaggrin autoantibodies are deiminated forms of the alpha- and betachains of fibrin. J Immunol, 2001. 166(6): p. 4177-84. Andriopulos NA, M.J., Miller EJ, Bradley EL, Antibodies to native and denatured collagens in sera of patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rhematism, 1976. 19: p. 613-7. Tarkowski A, K.L., Carlsten H, Herberts P, Koopman WJ, Secretion of antibodies to types I and II collagen by synovial tissue cells in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rhematism, 1989. 32: p. 1087-92. He X, K.A., Stuart JM, Accumulation of T cells reactive to type II collagen in synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis. The Journal of rheumatology, 2000. 27: p. 589-93. Londei M, S.C., Verhoef A, Brennan F, Leech ZA, Duance V, Persistence of collagen type II-specific T-cell clones in the synovial membrane of a patient with rheumatoid arthritis. Proc Natl Acad Sci USA. , 1989. 86: p. 636-40. Snir, O., et al., Multiple antibody reactivities to citrullinated antigens in sera from patients with rheumatoid arthritis: association with HLA-DRB1 alleles. Ann Rheum Dis, 2009. 68(5): p. 736-43. Wegner N, L.K., Kinloch A, Fisher B, Malmstrom V, Feldmann M,Venables PJ, Autoimmunity to specific citrullinated proteins gives the first clues to the etiology of rheumatoid arthritis. Immunol Rev, 2010. 233: p. 34-54. Courtenay, J.S., et al., Immunisation against heterologous type II collagen induces arthritis in mice. Nature, 1980. 283(5748): p. 666-8. Stuart JM, D.F., Serum transfer of collagen-induced arthritis in mice. J Exp Med, 1983. 158(2): p. 378-392.
74
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40. 41. 42. 43. 44. 45. 46.
47. 48. 49.
50.
51. 52.
53.
Bajtner E, N.K., Engstrom A, Holmdahl R, Chronic development of collagen-induced arthritis is associated with arthritogenic antibodies against specific epitopes on type II collagen. Arthritis Research and Therapy, 2005. 7: p. 1148-57. Dobritzsch D, L.I., Uysal H, Nandakumar KS, Burkhardt H, Schneider G, Crystal structure of an arthitogenic annicollagen immune complex. Arthritis & Rhematism, 2011. 63: p. 3740-8. Burkhardt, H., et al., Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse. Arthritis Rheum, 2002. 46(9): p. 2339-48. Schulte, S., et al., Arthritis-related B cell epitopes in collagen II are conformationdependent and sterically privileged in accessible sites of cartilage collagen fibrils. J Biol Chem, 1998. 273(3): p. 1551-61. Nandakumar, K.S., et al., Induction of arthritis by single monoclonal IgG anticollagen type II antibodies and enhancement of arthritis in mice lacking inhibitory FcgammaRIIB. Eur J Immunol, 2003. 33(8): p. 2269-77. Nandakumar KS, S.L., Holmdahl R., Collagen type II-specific monoclonal antibodyinduced arthritis in mice: description of the disease and the influence of age, sex, and genes. Am J Pathol., 2003. 163(5): p. 1827-1837. Rowley, M.J., K.S. Nandakumar, and R. Holmdahl, The role of collagen antibodies in mediating arthritis. Mod Rheumatol, 2008. 18(5): p. 429-41. Nimmerjahn, F., et al., FcgammaRIV: a novel FcR with distinct IgG subclass specificity. Immunity, 2005. 23(1): p. 41-51. Ravetch, J.V. and S. Bolland, IgG Fc receptors. Annu Rev Immunol, 2001. 19: p. 275-90. Buhl, A.M. and J.C. Cambier, Co-receptor and accessory regulation of B-cell antigen receptor signal transduction. Immunol Rev, 1997. 160: p. 127-38. Daeron, M., Structural bases of Fc gamma R functions. Int Rev Immunol, 1997. 16(12): p. 1-27. Takai, T., Roles of Fc receptors in autoimmunity. Nat Rev Immunol, 2002. 2(8): p. 580-92. Daeron, M., et al., The same tyrosine-based inhibition motif, in the intracytoplasmic domain of Fc gamma RIIB, regulates negatively BCR-, TCR-, and FcR-dependent cell activation. Immunity, 1995. 3(5): p. 635-46. Isakov, N., ITIMs and ITAMs. The Yin and Yang of antigen and Fc receptor-linked signaling machinery. Immunol Res, 1997. 16(1): p. 85-100. Takai, T., Multiple loss of effector cell functions in FcR gamma-deficient mice. Int Rev Immunol, 1996. 13(4): p. 369-81. Clynes, R., et al., Modulation of immune complex-induced inflammation in vivo by the coordinate expression of activation and inhibitory Fc receptors. J Exp Med, 1999. 189(1): p. 179-85. Nakamura, A., et al., Fcgamma receptor IIB-deficient mice develop Goodpasture's syndrome upon immunization with type IV collagen: a novel murine model for autoimmune glomerular basement membrane disease. J Exp Med, 2000. 191(5): p. 899-906. Nimmerjahn, F. and J.V. Ravetch, Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nat Rev Immunol, 2008. 8(1): p. 34-47. Kleinau, S., P. Martinsson, and B. Heyman, Induction and suppression of collageninduced arthritis is dependent on distinct fcgamma receptors. J Exp Med, 2000. 191(9): p. 1611-6. Magnusson, S.E., et al., Amelioration of collagen-induced arthritis by human recombinant soluble FcgammaRIIb. Clin Immunol, 2008. 127(2): p. 225-33.
75
54.
55.
56. 57. 58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67. 68. 69.
70. 71. 72.
H. Bang, K.E., A. Gauliard, K. Lütheke, P. E. Rudolph, G. Fredenhagen, W. Berg, E. Feist, G.-R. Burmester Mutation and citrullination modifies vimentin to a novel atoantigen for rhematoid arthritis. Arthritis & Rhematism 2007. 56(8): p. 2503-2511. H. Burkhardt, B.S., R. Bockermann, Ǻ. Engström, J. K. Kalden, R. Holmdahl Humoral immune response to citrullinated collagen type II determinants in early rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology, 2005. 35(5): p. 1643-52. Ádám Bartos, K.U., Ferenc Hudecz, New biotin derivatives for labeling and solubilizing IgG peptides. Peptide Science, 2009. 92(2): p. 110-5. Hazenbos, W.L., et al., Impaired IgG-dependent anaphylaxis and Arthus reaction in Fc gamma RIII (CD16) deficient mice. Immunity, 1996. 5(2): p. 181-8. Ioan-Facsinay, A., et al., FcgammaRI (CD64) contributes substantially to severity of arthritis, hypersensitivity responses, and protection from bacterial infection. Immunity, 2002. 16(3): p. 391-402. Wooley, P.H., et al., Type II collagen-induced arthritis in mice. I. Major histocompatibility complex (I region) linkage and antibody correlates. J Exp Med, 1981. 154(3): p. 688-700. Angyal, A., et al., CD16/32-specific biotinylated 2.4G2 single-chain Fv complexed with avidin-FITC enhances FITC-specific humoral immune response in vivo in a CD16-dependent manner. Int Immunol, 2010. 22(2): p. 71-80. Kurucz, I., et al., Correct disulfide pairing and efficient refolding of detergentsolubilized single-chain Fv proteins from bacterial inclusion bodies. Mol Immunol, 1995. 32(17-18): p. 1443-52. Chapman-Smith, A. and J.E. Cronan, Jr., The enzymatic biotinylation of proteins: a post-translational modification of exceptional specificity. Trends Biochem Sci, 1999. 24(9): p. 359-63. O'Callaghan C, A., et al., BirA enzyme: production and application in the study of membrane receptor-ligand interactions by site-specific biotinylation. Anal Biochem, 1999. 266(1): p. 9-15. Kvell, K., et al., Species-specific restriction of cell surface expression of mouse MARCO glycoprotein in murine cell lines. Biochem Biophys Res Commun, 2006. 341(4): p. 1193-202. Babos, F., et al., Role of N- or C-terminal biotinylation in autoantibody recognition of citrullin containing filaggrin epitope peptides in rheumatoid arthritis. Bioconjug Chem, 2013. 24(5): p. 817-27. Harre, U., et al., Induction of osteoclastogenesis and bone loss by human autoantibodies against citrullinated vimentin. J Clin Invest, 2012. 122(5): p. 1791802. van den Berg, T.K. and G. Kraal, A function for the macrophage F4/80 molecule in tolerance induction. Trends Immunol, 2005. 26(10): p. 506-9. Iwakura, Y. and H. Ishigame, The IL-23/IL-17 axis in inflammation. J Clin Invest, 2006. 116(5): p. 1218-22. Kasama, T., et al., Interleukin-10 expression and chemokine regulation during the evolution of murine type II collagen-induced arthritis. J Clin Invest, 1995. 95(6): p. 2868-76. Lubberts, E., Th17 cytokines and arthritis. Semin Immunopathol, 2010. 32(1): p. 4353. Alam, M.K., et al., Ectopic expression of Bcl-2, but not Bcl-xL rescues Ramos B cells from Fas-mediated apoptosis. Eur J Immunol, 1997. 27(12): p. 3485-91. Bartos, A., K. Uray, and F. Hudecz, New biotin derivatives for labeling and solubilizing IgG peptides. Biopolymers, 2009. 92(2): p. 110-5.
76
73.
74. 75.
76.
77.
78.
79.
80. 81. 82.
83.
84. 85.
86.
87. 88.
89. 90.
91.
van der Woude, D., et al., Epitope spreading of the anti-citrullinated protein antibody response occurs before disease onset and is associated with the disease course of early arthritis. Ann Rheum Dis, 2010. 69(8): p. 1554-61. Willemze, A., et al., The ACPA recognition profile and subgrouping of ACPA-positive RA patients. Ann Rheum Dis, 2012. 71(2): p. 268-74. Trouw, L.A. and M. Mahler, Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis. Autoimmun Rev, 2012. 12(2): p. 31822. Ioan-Facsinay, A., et al., Anti-cyclic citrullinated peptide antibodies are a collection of anti-citrullinated protein antibodies and contain overlapping and non-overlapping reactivities. Ann Rheum Dis, 2011. 70(1): p. 188-93. Lundberg, K., et al., Genetic and environmental determinants for disease risk in subsets of rheumatoid arthritis defined by the anticitrullinated protein/peptide antibody fine specificity profile. Ann Rheum Dis, 2013. 72(5): p. 652-8. Ioan-Facsinay, A., et al., Marked differences in fine specificity and isotype usage of the anti-citrullinated protein antibody in health and disease. Arthritis Rheum, 2008. 58(10): p. 3000-8. Fisher, B.A., et al., Heterogeneity of anticitrullinated peptide antibodies and response to anti-tumor necrosis factor agents in rheumatoid arthritis. J Rheumatol, 2012. 39(5): p. 929-32. Reparon-Schuijt, C.C., et al., Secretion of anti-citrulline-containing peptide antibody by B lymphocytes in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 2001. 44(1): p. 41-7. Bellatin, M.F., et al., Production of autoantibodies against citrullinated antigens/peptides by human B cells. J Immunol, 2012. 188(7): p. 3542-50. Jurk M, H.F., Vollmer J, Schetter C, Krieg AM, Wagner H, et al., Human TLR7 or TLR8 independently confer responsiveness to the antiviral compound R-848. Nat Immunol 2002. 3: p. 499. Snir, O., et al., Identification and functional characterization of T cells reactive to citrullinated vimentin in HLA-DRB1*0401-positive humanized mice and rheumatoid arthritis patients. Arthritis Rheum, 2011. 63(10): p. 2873-83. Zhang, J., et al., Identification of DNA-reactive B cells in patients with systemic lupus erythematosus. J Immunol Methods, 2008. 338(1-2): p. 79-84. von Delwig, A., et al., Response of Th17 cells to a citrullinated arthritogenic aggrecan peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 2010. 62(1): p. 143-9. Arend, W.P. and J.M. Dayer, Inhibition of the production and effects of interleukin-1 and tumor necrosis factor alpha in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 1995. 38(2): p. 151-60. Kokkonen, H., et al., Up-regulation of cytokines and chemokines predates the onset of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 2010. 62(2): p. 383-91. Hueber, W., et al., Proteomic analysis of secreted proteins in early rheumatoid arthritis: anti-citrulline autoreactivity is associated with up regulation of proinflammatory cytokines. Ann Rheum Dis, 2007. 66(6): p. 712-9. Szekanecz, Z., et al., Cytokines in rheumatoid arthritis. Potential targets for pharmacological intervention. Drugs Aging, 1998. 12(5): p. 377-90. Lard, L.R., et al., Association of the -2849 interleukin-10 promoter polymorphism with autoantibody production and joint destruction in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 2003. 48(7): p. 1841-8. Stuart, J.M. and F.J. Dixon, Serum transfer of collagen-induced arthritis in mice. J Exp Med, 1983. 158(2): p. 378-92.
77
92.
93. 94.
95.
96. 97. 98.
99.
100.
101. 102.
103. 104. 105. 106. 107. 108. 109. 110. 111.
Szekeres, Z., et al., Modulation of immune response by combined targeting of complement receptors and low-affinity Fcgamma receptors. Immunol Lett, 2010. 130(1-2): p. 66-73. Lenardo, M.J., et al., ALPS-ten lessons from an international workshop on a genetic disease of apoptosis. Immunity. 32(3): p. 291-5. Hauser, A.E., S.M. Kerfoot, and A.M. Haberman, Cellular choreography in the germinal center: new visions from in vivo imaging. Semin Immunopathol. 32(3): p. 239-55. Mukherjee, P., et al., TNF receptor gene therapy results in suppression of IgG2a anticollagen antibody in collagen induced arthritis. Ann Rheum Dis, 2003. 62(8): p. 707-14. Nimmerjahn, F. and J.V. Ravetch, Fcgamma receptors: old friends and new family members. Immunity, 2006. 24(1): p. 19-28. Mancardi, D.A., et al., The murine high-affinity IgG receptor FcgammaRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. J Immunol. 186(4): p. 1899-903. Blom, A.B., et al., Skewed balance in basal expression and regulation of activating v inhibitory Fcgamma receptors in macrophages of collagen induced arthritis sensitive mice. Ann Rheum Dis, 2003. 62(5): p. 465-71. Abrahams, V.M., et al., Induction of tumor necrosis factor alpha production by adhered human monocytes: a key role for Fcgamma receptor type IIIa in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 2000. 43(3): p. 608-16. Kirkham, B.W., et al., Synovial membrane cytokine expression is predictive of joint damage progression in rheumatoid arthritis: a two-year prospective study (the DAMAGE study cohort). Arthritis Rheum, 2006. 54(4): p. 1122-31. Nakae, S., et al., Suppression of immune induction of collagen-induced arthritis in IL17-deficient mice. J Immunol, 2003. 171(11): p. 6173-7. Grevers, L.C., et al., Different amplifying mechanisms of interleukin-17 and interferon-gamma in Fcgamma receptor-mediated cartilage destruction in murine immune complex-mediated arthritis. Arthritis Rheum, 2009. 60(2): p. 396-407. McInnes, I.B. and G. Schett, Cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Nat Rev Immunol, 2007. 7(6): p. 429-42. Szekanecz, Z., J. Kim, and A.E. Koch, Chemokines and chemokine receptors in rheumatoid arthritis. Semin Immunol, 2003. 15(1): p. 15-21. Koch, A.E., Chemokines and their receptors in rheumatoid arthritis: future targets? Arthritis Rheum, 2005. 52(3): p. 710-21. Szekanecz, Z. and A.E. Koch, Chemokines and angiogenesis. Curr Opin Rheumatol, 2001. 13(3): p. 202-8. Koch, A.E., et al., Macrophage inflammatory protein-1 alpha. A novel chemotactic cytokine for macrophages in rheumatoid arthritis. J Clin Invest, 1994. 93(3): p. 921-8. Paradowska-Gorycka, A., et al., IL-23 in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Scand J Immunol. 71(3): p. 134-45. Bruhl, H., et al., Important role of interleukin-3 in the early phase of collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum, 2009. 60(5): p. 1352-61. Foote, L.C., et al., Intracellular signaling for inducible antigen receptor-mediated Fas resistance in B cells. J Immunol, 1996. 157(5): p. 1878-85. Legler, D.F., et al., B cell-attracting chemokine 1, a human CXC chemokine expressed in lymphoid tissues, selectively attracts B lymphocytes via BLR1/CXCR5. J Exp Med, 1998. 187(4): p. 655-60.
78
