DOKTORI ÉRTEKEZÉS. Közvetlen ionizációs tömegspektrometriás módszerek fejlesztése Biomedicinális alkalmazások

DOKTORI ÉRTEKEZÉS

Közvetlen ionizációs tömegspektrometriás módszerek fejlesztése – Biomedicinális alkalmazások

Dénes Júlia Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Kémia Doktori Iskola Vezető: Dr. Inzelt György Analitikai, kolloid- és környezetkémiai, elektrokémiai program Vezető: Dr. Záray Gyula

Témavezető: Dr. Takáts Zoltán Semmelweis Egyetem, CellScreen Alkalmazott Kutatási Központ

Budapest 2010

Tartalomjegyzék 1. Irodalmi áttekintés

3

1.1. Bevezető

3

1.2. Biológiai minták tömegspektrometriás vizsgálata

4

1.2.1. Kapcsolt technikák

4

Gázkromatográfia-tömegspektrometria

5

Ionizációs technikák: EI, CI

6

Alkalmazások

7

Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia-tömegspektrometria

8

Ionizációs technikák: ESI, APCI

10

Alkalmazások

12

1.2.2. Felületvizsgálati módszerek A deszorpciós ionizációs módszerek rövid története

15 15

Secondary Ion Mass Spectrometry

17

Lézer deszorpciós ionizációs technikák

18

Az atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs módszerek

22

Folyadék extrakciós módszerekkel kapcsolt technikák

23

Neutrális deszorpcióval kapcsolt technikák

27

1.2.3. Biológiai szövetek közvetlen vizsgálata

31

2. Az irodalmi bevezető összefoglalása, a témaválasztás indoklása

33

3. Kísérleti rész

36

3.1. Szilárd fázisú extrakció és deszorpciós ionizáció kombinációja

36

3.1.1. Bevezető

36

3.1.2. Az SPE patron fejlesztése

39

3.1.3. A SPEEDI-kártya fejlesztése

44 1

3.1.4. Az elútor egységek kifejlesztése

46

3.1.5. Műszeres eszközfejlesztés

50

3.2. Natív szövetminták vizsgálata DESI és REIMS módszerrel

52

3.2.1. Bevezető

52

3.2.2. Az interfész kifejlesztése, optimalizáció

55

4. Eredmények 4.1. A SPEEDI módszer

61 61

4.1.1. Optimalizálás egycsatornás elúcióra

61

4.1.2. Valós minták mérése, optimalizálás 96 csatornás elúcióra

68

4.1.3. Mérések kártyaformátumban

78

4.2. A REIMS módszer

83

4.2.1. Az ionizáció mechanizmusának tanulmányozása

83

4.2.2. Az ionforrás optimalizációja egészséges állati szövetekre

87

4.2.3. Szövetek azonosítása főkomponens analízissel

91

4.2.4. A táplálkozás hatása a szövetek foszfolipid összetételére

95

4.2.5. Tumoros szövetek vizsgálata

96

5. Következtetések

99

6. Irodalomjegyzék

100

7. Köszönetnyilvánítás

111

8. Összefoglalás

112

9. Abstract

113

2

1. Irodalmi áttekintés 1.1. Bevezető A biológiai eredetű minták analitikai vizsgálata mind a biokémia, mind az orvostudomány szempontjából alapvető jelentőségű. A jelenleg ismert biokémiai folyamatok molekuláris szintű megismerése ugyanis csak ezen a módon valósítható meg, azaz minden egyes biokémiai folyamat leírása mögött hatalmas mennyiségű analitikai információ áll, vagy kell, hogy álljon. A tömegspektrometria (MS: mass spectrometry) ezen vizsgálatok területén mindig is kitüntetett szerepet élvezett, köszönhetően a módszer molekuláris szelektivitásának, a párhuzamos kvalitatív és kvantitatív meghatározás lehetőségének és nem utolsó sorban a tömegspektrometriás adatok egyszerű értelmezhetőségének. Bár a tömegspektrometria hagyományosan csak illékony vegyületek vizsgálatára volt alkalmas, megfelelő származékképzéssel a biológiai szempontból fontos kisméretű molekulák tömegspektrometriás vizsgálata már az 1960-as évektől fogva megoldható volt. A tömegspektrometria bioanalitikai alkalmazásában az igazi forradalmat azonban a deszorpciós és spray ionizációs technikák kifejlesztése hozta. Ezen ionizációs módszerekkel ugyanis lényegében tetszőleges méretű, polaritású, és termikus stabilitású molekula ionizálhatóvá vált. Ilyen módon lehetőség nyílt peptidek, fehérjék, oligoszacharidok, komplex lipidek, nukleinsavak

és

egyéb

fontos

molekulák

származékképzés

nélküli

közvetlen

tömegspektrometriás vizsgálatára, valamint ezen vegyületcsoportok elválasztására szolgáló kromatográfiás technikák esetén a közvetlen tömegspektrometriás detektálásra. A bioanalitikai tömegspektrometriában a következő fordulatot az úgynevezett közvetlen ionizációs technikák megjelenése jelentette. Ezek a technikák fenomenológiailag az atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs technikák közé tartoznak, és közös jellemzőjük, hogy képesek különböző minták előkészítés nélküli vizsgálatára. Bioanalitikai alkalmazások szempontjából a mintaelőkészítés elhagyása egyrészt lehetővé teheti az ultra nagy sebességű (HT: high-throughput) analízist, másrészt pedig az élő rendszerek közvetlen vizsgálatát. Doktori munkám során az elsődleges cél ezen lehetőségek kihasználása volt, azaz a direkt ionizációs tömegspektrometria alkalmazása biológiai minták nagy sebességű vizsgálatára,

valamint

élő

szövetek

vizsgálatára

alkalmas

direkt

ionizációs

tömegspektrometriás módszer kifejlesztése.

3

1.2. Biológiai minták tömegspektrometriás vizsgálata A biológiai minták vizsgálata mind komplexitás, mind pedig a vizsgálandó molekulák érzékenysége szempontjából komoly kihívást jelent a spektroszkópiai alapú analitikai technikák számára. A spektroszkópiai módszerek ideálisan olyan módon alkalmazhatóak minőségi illetve mennyiségi analízisre, hogy a vizsgálandó molekulát egymagában vagy egy zavaró komponenseket nem tartalmazó egyszerű keverék formájában (tiszta oldat) juttatjuk a vizsgálóműszerbe. Gyakorlati alkalmazások esetében ez általában nem megvalósítható, mindazonáltal arra törekszünk, hogy a spektroszkópiás-spektrometriás eszközbe egy adott időpillanatban bejutó minta minél egyszerűbb összetételű legyen, és minél kevesebb zavaró komponenst tartalmazzon a vizsgálandó speciesz mellett. Ennek a leggyakoribb megvalósítási módja a minták pre-frakcionálása (tipikusan extrakcióval vagy kicsapással), a megfelelő frakció komponenseinek kromatográfiás elválasztása, majd a szétválasztott komponensek spektroszkópiás-spektrometriás detektálása. Biológiai minták esetében – tekintettel a több százezer komponensre, amelyek mintegy 15 nagyságrend koncentrációtartományban fordulnak elő – ez a megközelítés a leginkább elfogadott.

1.2.1. Kapcsolt technikák A tömegspektrometriás módszerek bár képesek többféle molekula párhuzamos detektálására, ez szinte minden esetben csökkenti a módszer érzékenységét, illetve gyakran a specificitását is. Az érzékenység csökkenése egyrészt magából az ionizációs folyamatból következik (szupresszió), másrészt pedig a készülék működési ciklusából, mivel lecsökken az egy molekulára jutó mérési idő. A szupressziós folyamatok általában a termodinamikailag kontrollált ionizációs technikák esetében jelentkeznek, ahol a két speciesz közti töltéscserereakció szabadentalpia változása (a koncentráció értékekkel együtt) meghatározza az ionok intenzitás-arányát. További korlátozó tényezőt jelent a tömegspektrometriás módszer felbontása. Az egyszerűbb (és ennek megfelelően olcsóbb) tömegspektrométerek csak egységnyi m/z felbontásra képesek, így azonos nominális tömegű molekulák (pl. lizinglutamin) nem detektálhatóak külön. (Az adott példa esetében még MS/MS módszerrel sem, lévén mind a két molekula elsősorban semleges ammóniavesztés útján fragmentálódik.) Izomer molekulák esetében pedig az egyszerű tömegspektrometriás elkülönítés felbontástól függetlenül nem valósulhat meg, bár a sztereoizomerek kivételével, tipikusan MS/MS

4

módban szelektíven detektálhatóak. Ezen faktorok ismeretében a meglehetősen komplex biológiai rendszerek vizsgálatára szinte minden esetben kromatográfiával kapcsolt tömegspektrometriás meghatározást alkalmaznak. Gázkromatográfia-tömegspektrometria A gázkromatográfiát (GC: gas chromatography) és a tömegspektrometriát külön-külön már az ’50-es években rutinszerűen alkalmazták illékony vegyületek analízisére. A tömegspektrometriában ekkor elterjedten alkalmazott elektronütközéses ionizációs eljárás (lásd ionizációs technikáknál) azonban összetett minták esetén a kiterjedt fragmentáció miatt nem szolgáltatott megfelelő molekulaspecifikus ionformációt. Ezért merült fel az igény az elválasztástechnikai eljárás és a tömegspektrometriás analízis összekapcsolására [1-2]. A két technika ötvözése ideális módszernek bizonyult az összetett minták vizsgálatában. Gázkromatográfiásan illékony és kevésbé illékony vegyületek elválasztása valósítható meg hatékonyan, míg a tömegspektrometriás detektálás lehetőséget biztosít a komponensek azonosítására. A két technika a lényeges szempontokat tekintve kompatibilis, ugyanis kis mennyiségű (tipikusan nanogramm), gázfázisú minták elemzésére alkalmasak; azonban fontos különbség, hogy a GC esetében atmoszférikus körüli nyomáson, vivőgáz segítségével történik a minta komponenseinek elválasztása, míg a tömegspektrometriás elemzés csak vákuumban lehetséges. A kombinált technika legfontosabb része tehát az interfész, ennek technikai megvalósítása volt a legnagyobb kihívás a módszer fejlesztésében. Interfésznek nevezzük ebben az esetben tehát azt az összekötő elemet, mely a kromatográfiás elválasztás és a tömegspektrometriás analízis közötti kapcsolatot biztosítja, vagyis a nyomásbeli különbség és legtöbb esetben az ionizáció problémájára is szolgáltat megoldást. Az első interfész esetében a GC-ből kiáramló gázelegy nagy részét (95-99 %) egyszerűen kiengedték a levegőbe, csak annyit vezettek be a tömegspektrométerbe, amennyit a pumpák teljesítménye megengedett. Így azonban jelentősen lecsökkent a módszer érzékenysége az anyagveszteség miatt, ezért hamarosan megszületett az első olyan interfész technika, amely azután széles körben el is terjedt. A jet szeparátornak nevezett eszköz azon az elven működik, hogy a vivőgáz és az analit molekulák diffúziós együtthatója jelentősen eltér a méretkülönbségből adódóan [3]. A GC oszlopról érkező gázelegyet egy szűk kapillárison vezetik keresztül, mely egy csökkentett nyomású (kb. 10-2 torr) kamrába vezet. A nagy diffúziós együtthatóval rendelkező vivőgáz (általában hélium vagy hidrogén) a kapillárisból széles szögben áramlik ki, míg a kisebb együtthatójú szerves molekulák keskenyebb szögben. A kapilláris végével szemben lévő tömegspektrométer bevezető nyílásába a szerves molekulák bejutnak, a vivőgáz részecskéi 5

elkerülik, míg végül a csökkentett nyomást létrehozó pumpa eltávolítja őket a kamrából. Töltetes oszlopok esetén a gáz áramlási sebessége 10 ml/min nagyságrendű. A régebben alkalmazott diffúziós vákuumpumpák teljesítménye ehhez nem volt megfelelő, ezért alkalmazták a jet szeparátort interfészként. A mai GC-MS rendszerekben kapilláris oszlopot alkalmaznak, kis vivőgáz áramlási sebességgel (1-2 ml/min), ami lehetővé teszi, hogy a GCből egyenesen az ionforrásba juthasson a minta, mivel a mai turbószivattyúk teljesítménye elegendő a vákuum fenntartásához. Ionizációs technikák: EI, CI A tömegspektrometriás analízis első lépése az ionképzés. Ez a folyamat többféle módon valósulhat meg. A GC-MS esetében kétféle ionizációs technikát alkalmaznak leggyakrabban, az elektronütközéses ionizációt (EI: electron impact), illetve a kémiai ionizációt (CI: chemical ionization). Az EI az egyik legrégebbi és leggyakrabban alkalmazott ionizációs technika [4]. Az ionforrásba bejutott molekulákat szabad elektronokkal bombázzuk, ennek hatására a molekulákból M+. gyökionok jönnek létre. Mivel a keletkező molekulaionok belső energiaszintje meglehetősen magas, ezért jól reprodukálható módon, különböző fragmens ionokra esnek szét. A fragmentáció gyakran annyira kiterjedt, hogy a spektrumban maga a molekulaion nem is jelenik meg; ennélfogva az EI ionizációt a kemény ionizációs technikák közé soroljuk. A kémiai ionizáció [5] során a szabad elektronok először egy úgynevezett reagens gáz molekuláival ütköznek, amely az analit molekulákhoz képest nagy (általában 105-szeres) feleslegben van jelen az ionforrásban. Reagens gázként leggyakrabban metánt, ammóniát vagy izobutánt szoktak alkalmazni. A reagens gáz molekuláiból tipikusan EI ionizációs mechanizmus, fragmentáció, illetve intermolekuláris proton transzfer útján protonált (vagy deprotonált) páros elektronszámú (azaz nem gyök jellegű) ionok keletkeznek. A tényleges ionizáció során az analitmolekulák proton-transzfer reakcióba lépnek az ilyen módon létrejött reagens ionokkal és a reakció során ismételten páros elektronszámú, protonált vagy deprotonált molekulaionok jönnek létre. A keletkezett molekulaionok kezdeti belső energiája egyértelműen a proton transzfer reakcióhoz tartozó entalpiaváltozás függvénye. Ez tipikusan lényegesen alacsonyabb, mint az EI ionizáció során keletkezett molekulaionok belső energiája, valamint a protonált molekulaionok lényegesen stabilabbak; ennélfogva a kémiai ionizációt csak kis mértékű fragmentáció kíséri. A kémiai ionizáció előnye, hogy egyféle molekulából egyféle ion keletkezik, és az ion tömege egyértelműen mutatja a molekula tömegét. Ez különösen előnyös összetett keverékek elemzésénél, azonban a kémiai ionizáció

6

során nyert spektrum – az EI spektrumokkal ellentétben – nem alkalmas a molekula egyértelmű, szerkezeti szintű azonosítására. Alkalmazások A GC-MS módszert apoláris, termikusan stabil, illékony vegyületek analízisében alkalmazhatjuk. Mivel a biológiai mintákat alkotó molekulák többsége nem ilyen, ezért az analízist az esetek többségében származékképzési reakció előzi meg, melynek során az analit polaritását csökkentjük; illetve növeljük a termikus stabilitást és az illékonyságot. Annak ellenére, hogy így az analízis ideje jelentősen megnő, még mindig kiterjedt a technika alkalmazási területe, mivel a GC oszlop hosszúsága miatt az elválasztás hatékonyságában nehéz felvenni a versenyt a módszerrel. A biológiai minták analízisében könnyedén találhatunk példát olyan alkalmazásra, melyekhez ma is szinte kizárólag a GC-MS technikát alkalmazzák. Ezek közül a legtipikusabb példa a vizelet szerves savtartalmának meghatározása, mely az anyagcsere betegségek diagnosztikájának egyik alapvető módszere. Ennek GC-MS technikával történő meghatározására 1971 óta [6] lényegében ugyanazt az analitikai módszert alkalmazzák az orvosi laboratóriumi gyakorlatban. A vizelet szerves sav profilját hidroxilaminnal és bisz(trimetilszilil)-trifluoroacetamiddal (BSTFA) való származékképzési reakciót követően határozzák meg. A szteroidok meghatározása mind az anyagcsere rendellenességek vizsgálatában, mind az egyre nagyobb jelentőségű sportolói dopping analízisben fontos szerepet tölt be. Ma az irodalomban már folyadékkromatográfiás-tömegspektrometriás (lásd az alábbiakban) módszereket is találhatunk a detektálásukra, de a laboratóriumi gyakorlatban még mindig a GC-MS technikát alkalmazzák rutinszerű meghatározásukhoz. A származékképzési reakció a szteroidok

esetén

is

általában

szililezés

(MSTFA:

N-metil-N-(trimetilszilil)-

trifluoroacetamid), vagy fluoroacil származékokkal (pl. TFA: trifluoroecetsav anhidrid) történő reakció [7-8]. Az élelmiszeranalitika és a mikrobiológiai kemotaxonómia egyik fontos módszere a zsírsav-összetétel meghatározása. Mivel ezen vegyületeknek számos fajtája (2-től 26-ig terjedő szénatomszám, kettőskötések száma, helyzete, térállása) fordul elő a természetben, a vizsgálandó minták meglehetősen összetettek, így a mai napig GC vagy GC-MS módszert használnak az analízisükre. A zsírsavak a szabad karboxil csoport jelenléte miatt kevéssé illékonyak, ezért az analízist megelőzően metil-észter származékot képeznek belőlük, katalitikus alkilezési reakcióban (leggyakrabban bórtrihalogenid és metanol jelenlétében) [9].

7

A tandem tömegspektrometria (MS/MS) megjelenésével a GC-MS technikának újabb alkalmazásai is születtek [10]. Az MS/MS lényege, hogy a fragmensionok további fragmentációjára van lehetőség a tömegspektrométer analizátorában, amely növeli a módszer érzékenységét, több szerkezeti információt szolgáltat, s így az összetett minták hatékonyabb vizsgálatára ad módot. Ezt technikailag úgy lehet megoldani, hogy vagy térben (mágneses szektor, kvadrupól, repülési idő), vagy időben (lineáris ioncsapda, ioncsapda, ion ciklotron rezonancia, orbitrap) elkülönülve történnek a fragmentációs lépések. Az újabban fejlesztett elválasztási és detektálási technikák, mint a két dimenziós GC (GC×GC), illetve a repülési idő analizátorral kapcsolt GC-k, növelni tudták az analízis hatékonyságát [11], de a biológiai minták vizsgálatában a ’80-as évektől kezdve fokozatosan a folyadékkromatográfiával kombinált módszerek vették át a vezető szerepet. Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia-tömegspektrometria A GC-MS módszer mintaelőkészítése során alkalmazott származékképzési reakciók sok esetben megfelelőek arra, hogy egy nem illékony molekulát illékonnyá tegyenek, azonban számos olyan molekula létezik, melyek ezen az úton sem tehetők mérhetővé. Az ilyen típusú molekulák esetében folyadékkromatográfiát célszerű alkalmazni. A folyadékkromatográfia (LC: liquid chromatography) működési elve, hogy a vegyületeket az állófázishoz való különböző mértékű adszorbciós affinitásuk alapján választjuk szét. A klasszikus folyadékkromatográfiás eljárás elválasztóképessége – az oszlop hosszúsága és így az elméleti tányérszám alapján – a gázkromatográfiás módszerhez képest meglehetősen gyenge. Nagyobb nyomás alkalmazásával azonban a folyadék lineáris sebessége nő, ezért csökken az analit lineáris diffúziója az oszlopon, és nő az elválasztás hatékonysága. A maximálisan 400 bar nyomáson működő technikát nevezzük nagy teljesítményű folyadékkromatográfiának (HPLC: high performance liquid chromatography). A közelmúltban kerültek kereskedelmi forgalomba olyan HPLC rendszerek, melyek már 1000 bar körüli nyomást képesek elérni, ezeket UPLCnek

nevezzük

(ultra

performance

liquid

chromatography,

ultranagy

teljesítményű

folyadékkromatográfia). Az UPLC oszlopok elméleti tányérszáma már nagyságrendileg megközelíti a GC rendszerekét. Az LC, vagy HPLC elválasztást követően a ’70-es évekig kizárólag UV detektálást alkalmaztak. Ez a módszer azonban számos hátránnyal rendelkezik, úgymint UV-kromofór molekulák jelenlétének szükségessége, kis érzékenység, a specifitás és az univerzalitás hiánya. A tömegspektrometria, mint detektálási módszer azonban molekulaspecifikus és univerzális, így a folyadékkromatográfiával összekapcsolva sok problémára megoldást tudott 8

nyújtani. A HPLC-MS széleskörű elterjedése, a GC-MS módszer visszaszorulásával szemben, annak köszönhető, hogy egyrészt lehetővé vált a különböző polaritású vegyületek analízise származékképzési reakció alkalmazása nélkül, másrészt a folyadék fázisú analízishez nem szükséges magas hőmérsékletet és a vegyületek illékonysága sem. Mivel a HPLC módszerben folyadékot alkalmazunk az elúcióhoz, ezért az interfész fejlesztése nagyobb kihívás volt, mint a GC-MS rendszerek esetében. A legjobb megoldást erre a problémára a spray ionizációs módszerek megjelenése jelentette, azonban érdemes megemlíteni a korábban alkalmazott megoldásokat is. Az első kereskedelmi forgalomban is kapható interfész, az úgynevezett moving-belt („futószalag”) volt [12]. Az LC-ből érkező folyadék egy mozgó, saválló acélból készült szalagra kerül, ahonnan a folyadék nagy részét külső melegítéssel elpárologtatják. A további illékony komponensek eltávolítása egymás után elhelyezett, egyre nagyobb vákuumot biztosító pumpák segítségével történik. A szalagon visszamaradó analit bekerül az ionforrásba, ahol termikus deszorpciós folyamat során kerül gáz halmazállapotba, illetve ionizálódik. A módszer egyik hátránya, hogy a nem illékony vegyületek egy része nem képes ionizálódni termikus deszorpcióval sem, később emiatt ötvözték a moving-belt interfészt a FAB ionizációval (lásd 1.2.2.), de az egyszerűbb technikák megjelenésével a módszer nem tudott széles körben elterjedni. A particle beam („részecske nyaláb”) nevű interfész típus kifejlesztése volt a következő lépés a spray módszerek kialakulása felé [13]. A folyamat három jól elkülöníthető lépésből áll, az első a porlasztás, melynek során aeroszol képződik a folyadék halmazállapotú mintából. A cseppek deszolvatációja egy fűtött kamrában történik vivőgáz

segítségével, majd

a

mintát

egy jet szeparátoron vezetik keresztül a

tömegspektrométer ionforrásába, ahol legtöbbször elektronütközéses ionizációval keletkeznek a detektálható ionok, tehát a módszer eredményeként EI típusú spektrumhoz jutunk. A thermospray ionizáció megjelenésével kezdődött el az a folyamat, melynek során az LC-MS módszerek lassan átvették a GC-MS módszerek helyét, ugyanis az előzőekben ismertetett technikák egyike sem bizonyult elég univerzálisan alkalmazható módszernek; valamint ez volt az első olyan interfész, amely egyúttal ionforrásként is szolgált. A thermospray lényege, hogy a folyadék fázisú minta egy kontrolláltan fűtött kapillárison halad át, és a hőmérséklet hatására részben még a kapillárisban elpárolog. A keletkezett gőz a kapillárisból kilépve porlasztógázként viselkedik a hőtágulás hatására, így kis cseppek képződését okozza. A cseppek az interfész fűtött régióján áthaladva deszolvatálódnak. Az ionképződés módja függ az analit és az oldószer minőségétől, illetve hogy alkalmazunk-e a spray után EI ionizációt is. Leggyakrabban az ionok már a folyadékfázisban jelen vannak (hasonlóképpen az elektrospray ionizációhoz, lásd az alábbiakban), és deszolvatáció útján kerülnek gáz halmazállapotba. Ha 9

azonban a sprayben a teljes minta elpárolog, akkor az ilyen módon keletkező gázfázisú minta ionizálható EI/CI körülmények között is. A termospray interfész és ionizációs technika jóval egyszerűbben, és szélesebb körben használható, mint az elődei, így számos publikáció született az alkalmazásáról [14]. Egyik hátránya azonban, hogy nagyobb tömegű molekulák analízisére nem alkalmas, és a jóval érzékenyebb elektrospray módszer megjelenésével mára elveszítette jelentőségét. Ionizációs technikák: ESI, APCI Az

elektrospray

(ES:

electrospray)

tömegspektrometriás

ionforrásként

való

alkalmazása John B. Fenn nevéhez fűződik. A módszernek a biomolekulák analízisében betöltött fontos szerepéért 2002-ben Nobel díjjal tüntették ki a feltalálóját [15]. Az elektrospray lényege, hogy az analitot tartalmazó folyadékból, statikus nagyfeszültség hatására kis cseppekből álló, elektromosan töltött aeroszol keletkezik. A folyadék halmazállapotú

mintát

egy

kapillárisba

vezetjük,

és

a

kapilláris,

valamint

a

tömegspektrométer atmoszférikus interfésze között néhány kV potenciálkülönbséget hozunk létre. A folyadék a kapillárist elhagyva az elektrospray folyamat következtében nagy felületi töltéssel rendelkező cseppekre szakad szét, melyek az interfész atmoszférikus régiójában az ellenelektród felé haladva folyamatosan oldószert veszítenek. Egy bizonyos cseppméret elérésekor, mikor a felületi töltések közötti taszítás nagyobb, mint a cseppet összetartó felületi feszültség (Rayleigh-határ), a csepp szétrobban (Coulomb robbanás) és még kisebb cseppek keletkeznek belőle. Ezt a folyamatot segédgázzal, leggyakrabban nagy sebességű nitrogén árammal, illetve fűtéssel segítik. A gázfázisú ionok képződésére két fő elmélet létezik. Az egyik az ion elpárolgási modell (IEM: ion evaporation model) [16], amely szerint a cseppek mérete addig csökken, míg a felületi töltéstöbblet képes lesz az oldott ionokat a gáztérbe taszítani. A töltött maradék modell (CRM: charged residue model) [17] szerint pedig a Coulomb robbanások addig folytatódnak, míg már csak egy ion marad egy cseppecskében, ebből pedig az oldószer elpárolgása révén jön létre a vizsgálandó ion. A módszerhez vizes alapú oldószerelegyet használnak, több okból is. Egyrészt mivel a biomolekulák jellemzően jól oldódnak vízben, másrészt fontos az ionizáció szempontjából, hogy az alkalmazott oldószer vezetőképes legyen. A spray ezen kívül általában tartalmaz jobban párolgó szerves oldószert is, amely a biomolekulák oldódását még inkább elősegíti, illetve csökkenti a víz felületi feszültségét, így kisebb cseppek keletkeznek, melyek fajlagos felülete nagyobb lesz, ezáltal az oldószer párolgása még könnyebben megvalósulhat. Nem utolsó sorban pedig a fordított fázisú HPLC módszer is ezt a típusú oldószer keveréket igényli. Az elektrospray ionizáció során molekulaionok jelennek meg a tömegspektrumban, melyek protonálódás, 10

deprotonálódás, illetve gyakran addukt képződés (pl. Na+, K+) útján keletkeznek, tehát a technikát a lágy ionizációs módszerek közé soroljuk. Tipikusan azokat a molekulaionokat látjuk, melyek már a folyadék fázisban ion formájában voltak jelen. Ezért kap fontos szerepet az elektrospray technikában a savak (leggyakrabban ecetsav) jelenléte az oldószerben, mert a megfelelő pH biztosításával erősen befolyásolható a szolvatált ionok képződése. Jellemző a többszörösen töltött ionok megjelenése is, amely a nagy méretű biomolekulák analízisében előnyös, mivel kisebb m/z értékeknél jelennek meg a csúcsok. Biológiai minták vizsgálatában az ESI a leggyakrabban alkalmazott ionizációs eljárás, bár a semleges és kevéssé poláris molekulák, mint például egyes lipidek (karotinoidok, egyes szteroidok) ionizációja ezzel a technikával nem valósítható meg hatékonyan. Az ilyen típusú vegyületek ionizációjára alkalmas módszer az APCI. Az atmoszférikus nyomású kémiai ionizációs (APCI: atmospheric pressure chemical ionization) technika esetében a folyadék fázisú minta szintén egy kapillárison keresztül érkezik az ionforrásba, amely tulajdonképpen egy fűtött pneumatikus porlasztó. A minta nem illékony komponenseiből aeroszol képződik, míg az illékony összetevők a magasabb hőmérséklet és a porlasztógáz segítségével gáz halmazállapotba kerülnek. A gáz halmazállapotú molekulák ionizációja koronakisülés létrehozásával valósul meg. Ez a koronakisülés – ellentétben az elektrospray-vel, amely feszültség-kontrollált – áramkontrollált folyamat, mivel ellenkező esetben elektromos ív jönne létre, amely azon felül, hogy a tömegspektrométer kisfeszültségű tápegységeit tönkreteszi, nem képes molekuláris ionok képzésére sem. Az ionizáció kétféle módon valósulhat meg az APCI eljárás során. Egy részről kémiai ionizációs folyamat zajlik, az oldószerből, illetve a levegőből képződő reagensionok segítségével. Másrészt atmoszférikus nyomáson termikus elektronok is keletkeznek, melyeket elektronbefogással (EC: electron capture) a nagy elektronaffinitású vegyületek megkötnek, egyszeresen negatív ionokat képezve. Mivel gázfázisú ionizációs folyamatról van szó, ezért a konszekutív ionizáció nem valósul meg, így kizárólag egyszeres töltésű molekulaionok keletkeznek. Mivel minden olyan molekula ionizálható azonban ezzel a technikával, amely minimális gőznyomás értékkel rendelkezik, ezért a módszer széles körben elterjedt [18]. Az elektrospray újabban fejlesztett változata a nanospray vagy nanoelektrospray, amely extrém kis mennyiségű minták érzékeny analízisére alkalmas [19]. Az ionizáció mechanizmusa megegyezik az elektrospray módszernél ismertetettel, de amíg ott a folyadék áramlási sebessége 1 μl/perc felett van, a nanospray esetében 1 nl/perc alatti az áramlási sebesség, illetve nem alkalmaznak segédgázt sem. A spray kapilláris vége 1-2 μm átmérőjű, 11

ami lehetővé teszi, hogy a keletkező aeroszolban a cseppméret már elérje a nanométeres nagyságrendet. Az ionizációs hatékonyság, és így az érzékenység nagyságrendekkel nagyobb, mint a hagyományos elektrospray esetében. A spray-technikák sebességét jelentősen lecsökkenti, hogy a minták között könnyen létrejöhet keresztszennyezés, mivel ugyanazon a kapillárison haladnak keresztül. Azonban a high-throughput analitikában a mérés ideje sokkal fontosabb tényező annál, mint hogy az analízis folyamatába a kapilláris mosását bele lehetne venni. Erre a problémára jelentett megoldást az egyszer használatos nanospray kapillárisokat alkalmazó ionforrások megjelenése, melyek esetében minden egyes mintához másik spray-tűt használnak. A technika hátránya azonban, hogy a költségek messze meghaladják más mérési módszerekét. Fontos megemlíteni még két ionizációs technikát, melyek a folyadék minták analízisében ma már szintén jelentős szerepet töltenek be. A szuperszonikus spray ionizációt (SSI: sonic spray ionization) a ’90-es évek első felében írták le [20], kereskedelmi forgalomban pedig egy évtizeddel később vált elérhetővé. Ez a szintén spray-típusú ionforrás a nagy sebességű porlasztógáz energiáját használja fel gázfázisú ionok előállításához, így nem szükséges nagyfeszültség és magas hőmérséklet a működéséhez. A technika elterjedése részben ezek hiányának köszönhető, mivel ilyen úton a termikusan labilis, érzékenyebb vegyületek analízise is megvalósítható, és ma már számos HPLC kromatográfiához kapcsolódó alkalmazásával találkozhatunk az irodalomban [21]. Mivel nincs nagyfeszültség, ezért a spray megközelítőleg semleges, vagyis azonos mennyiségű pozitívan és negatívan töltött cseppet tartalmaz, így a polaritás változtatása nélkül lehet mérni pozitív és negatív módban is. A fotoionizációs folyamatot elsőként a GC technikában (majd később az LC-ben is) alkalmazták detektálási módszerként. Amennyiben egy speciesz, melynek az ionizációs energiája kisebb egy foton energiájánál, abszorbeál egy fotont, akkor ionizáció megy végbe, melyet fotoionizációnak nevezünk. Az atmoszférikus nyomású fotoionizációs módszer (APPI: atmospheric pressure photoionization) a fotoionizációra épül, kripton kisülési lámpából kibocsátott 10 eV energiájú fotonok segítségével történik a LC-ből érkező beporlasztott minta ionizációja. A technika alkalmas kevéssé poláris vegyületek ionizációjára, ezért viszonylag széles körben használják ma is [22]. Alkalmazások A biológiai minták analízisében ma az esetek túlnyomó többségében a HPLC-MS módszert alkalmazzák. A tömegspektrometriás detektálás azonban speciális követelményeket támaszt az elválasztástechnikai módszerrel szemben, ilyenek például a nem illékony 12

komponensek jelenlétének elkerülése, valamint a kisebb áramlási sebesség alkalmazása. Érthető tehát, hogy egy HPLC-MS módszer kidolgozásának kiemelkedően fontos feladata a minta előkészítésének kidolgozása [23], ráadásul a megfelelő választással a teljes analízis ideje is jelentősen lecsökkenhet, ami egyben a mérési költségek csökkenését jelenti. Fokozottan vonatkozik ez a biológiai mintákra, mivel ezek esetében meglehetősen összetett a kiindulási rendszer. Az alábbi ábrán a mintaelőkészítés általános lépéseit tüntettem fel, tipikusan biológiai minták esetére.

minta tartósítása reagens hozzáadása szállítás, tárolás oldószercsere felolvasztás szűrés homogenizáció behelyezés az autosampler-be pre-frakcionálás (kicsapás, méretkiz. krom., elektroforézis)

az analízis elindítása

belső standard hozzáadása

1. ábra: Az LC-MS módszer mintaelőkészítési lépései. A teljes HPLC-MS módszer kidolgozásának első lépése a tömegspektrometriás körülmények optimalizációja standard mintával, mely az ionizáció hatékonyságát, az analízis érzékenységét befolyásolja. Ezután következik a mintaelőkészítés kidolgozása, mely gyakran időigényesebb, mint az analitikai módszer optimalizációja. A minta tartósítása, szállítása és tárolása azért része ennek a folyamatnak, mert biológiai minták esetén általában nem a laboratóriumban állítják elő az analízisre szánt nyersanyagot. Az ábrán a szaggatott vonallal jelölt területen feltüntetett lépések nem mindig szerepelnek a mintaelőkészítés folyamatában. A folyadékkromatográfiás körülmények optimalizációja szintén először standard mintával történik, majd adalékolt (spike-olt) mintákkal (ismert mennyiségű standard hozzáadása a mintához), végül pedig következhet a valódi minták analízise.

13

A biológiai minták elemzésével foglalkozó analitikai irodalom túlnyomó többsége ma már LC-MS módszereket ír le. Az alábbi táblázatban foglaltam össze a legfontosabb alkalmazásokat, irodalmi referenciákkal együtt. Vegyületcsoport Aminosavak

Módszer

Referencia

RPLC-ESI-MS/MS

[24]

LC-MS/MS

[25]

GC-MS

[26]

LC-LC-MS/MS

[27]

ESI-MS/MS

[28]

LC-MS/MS vérmintából

[29]

LC-MS/MS vizelet mintából

[30]

GC-MS

[31]

LC-ESI-MS/MS vérmintából

[32]

Ceramidok

LC-APCI-MS

[33]

Eikozinoidok

LC-APCI-MS/MS

[34]

LC-MS/MS

[35]

GC-MS

[36]

LC-MS

[37]

GC-MS

[38]

LC-MS/MS

[39]

LC-MS/MS

[40]

LC-LC-ESI-MS

[41]

GC-MS

[42]

GC-MS

[11]

TSP-LC-MS

[43]

ESI-MS

[44]

ESI-MS

[45]

LC-MS/MS

[46]

LC-MS/MS

[47]

GC-MS és LC-MS

[48]

LC-MS

[49]

Acil-glicerolok Acil-karnitinek Epesavak

Zsírsavak Neurotranszmitterek Nukleotidok Szerves savak

Foszfolipidek

Szteroidok Cukrok

1. táblázat: Fontos biológiai vegyülettípusok és vizsgálati módszereik.

14

1.2.2. Felületvizsgálati módszerek A deszorpciós ionizációs módszerek rövid története A származékképzés és a spray technikák mellett a biológiai eredetű minták analízisében az úgynevezett deszorpciós ionizációs módszerek is jelentős szerepet játszanak ma már. Ezen technikák közös jellemzője, hogy a fázisátmenet és az ionizáció a minta felületén, egymással kapcsolt módon történik. Az első próbálkozás nem illékony minták közvetlen, származékképzés nélküli tömegspektrometriás vizsgálatára 1969-ben történt és Beckey nevéhez fűződik. Az elektromos mezős deszorpciós ionizáció (FDI: Field Desorption Ionization) volt az első olyan technika, amely kombinálta a deszorpciós és az ionizációs folyamatot, kiküszöbölte a minta elpárologtatásának szükségességét az ionizáció előtt és lehetővé tette a nagy molekulatömegű és/vagy termikusan labilis anyagok vizsgálatát [50]. emitter 2 mm

MS analizátor

ionforrás

fókuszáló plate ellenelektród

2. ábra: Az elektromos mezős deszorpciós ionizáció működése. A minta tömény oldatát felcseppentik egy wolfram vagy rénium szálra, amely szén mikrotűkkel van beborítva, és az oldószert elpárologtatják. Az elektromos potenciál különbség az emitter és egy elektród között jön létre, és elérheti akár a 108 Vcm-1 értéket is. A megfelelő mértékű potenciál különbség és a megfelelő görbültségű felület esetében a térgradiens képes kiszakítani a felületen képződött töltött részecskéket. Bár a technika feltalálása elméletben forradalmasította a biokémiai molekulák tömegspektrometriás kutatását, azonban az ionizációs folyamat nem igazán reprodukálható, így nem is

15

automatizálható, és egyáltalán nem kombinálható semmilyen más módszerrel, ezért egyáltalán nem terjedt el széles körben a használata. McLafferty és Baldwin nevéhez fűződik [51] az úgynevezett deszorpciós kémiai ionizáció (DCI: Desorption Chemical Ionization) módszerének kidolgozása. Ez a technika tulajdonképpen csak fenomenológiai szempontból tartozik a deszorpciós ionizációk közé, mert valójában termikus deszorpció és kémiai ionizációs folyamatok kombinációja. Azt tapasztalták, hogy ha üveg vagy fém mintatartóban lévő mintát közvetlenül egy kémiai ionizációs plazmába helyeznek, akkor csökkenthető a méréshez szükséges hőmérséklet, néha akár 150 °C-kal is, ez pedig visszaszorítja a kevésbé illékony anyagok hőbomlását. A mintát egy rénium vagy wolfram szálra felcseppentik, majd az oldószer elpárologtatása után, behelyezik a tömegspektrométer ionforrásába. A fémszálba kontrollált elektromos áramot vezetnek, és a keletkező hő hatására a minta termikusan deszorbeálódik. A gázfázisú molekulák élettartama ugyan csekély, de a gyors, in-situ ionizáció és azonnali tömeganalízis lehetővé teszi termikusan labilis molekulák vizsgálatát is . A módszer lehetséges alkalmazásai között voltak az oligoszacharidok, kis méretű peptidek, nukleinsavak és egyéb szerves sók mérései, melyeket mind pozitív, mind negatív ionmódban vizsgáltak a DCI technikával, ma azonban már csak elvétve találkozhatunk az alkalmazásaival [52]. A plazma deszorpciós ionizációs módszer (PDI: plasma desorption ionization) során a kalifornium radioaktív bomlásából származó nagy energiájú részecskék által alkotott plazma segítségével valósul meg a deszorpciós és az ionizációs folyamat is [53]. Ez a technika mára szintén feledésbe merült, de a jelentősége abban nyilvánult meg, hogy a második generációs deszorpciós ionizációs módszerek közvetlen előfutára volt. A PDI módszerben már úgynevezett analitikai nyaláb segítségével valósul meg az analit deszorpciós ionizációja, de ez a nyaláb divergens, nincs a vizsgálandó felületre fókuszálva. A deszorpciós ionizációs technikák második generációjára jellemző, hogy egy kollimált (párhuzamos nyalábokból álló) analitikai nyaláb segítségével történik a deszorpció és az ionizáció folyamata. Az analitikai nyalábot nagy energiájú részecskék alkotják (atomok, molekulák, atomi-, vagy molekulaionok, fotonok, stb.), melyeket a minta felületére irányítunk. Az analitikai nyaláb becsapódása a felületen mikroméretű robbanásokat okoz, melynek eredményeképp gázfázisú ionok és molekulák keletkeznek a mintából.

16

Secondary Ion Mass Spectrometry A másodlagos ion tömegspektrometria (SIMS: secondary ion mass spectrometry) technika kidolgozása és fejlődése a ’70-es években kezdődött [54]. Az eljárás lényege, hogy egy elsődleges ionforrásból származó, nagy energiájú (keV nagyságrendű) ionnyalábbal bombázzuk a vizsgálandó felületet. Az ütközések hatására részecskék szakadnak ki a felszínből az ütközési zónában. A felülettől eltávolodó részecskék között vannak semleges atomok, molekulák, elektronok és ionok. Ezeket az úgynevezett másodlagos ionokat mérjük a tömegspektrométer analizátorában. A SIMS módszer kifejezetten szilárd felületek analízisére alkalmas, ma a legfontosabb felhasználási területe a félvezetők felületi analízise az iparban. Az elemanalízis mellett azonban találhatunk számos példát az irodalomban biológiai szövetminták elemzésére[55], illetve az ehhez kapcsolódó képalkotásra (imaging) is. [56].

elsődleges ionsugár ionok semleges részecskék

minta

3. ábra: A SIMS technika működésének sematikus vázlata. Alapvetően kétféle SIMS technikát különböztethetünk meg, a dinamikus és a statikus SIMS-et. A dinamikus SIMS volt az első olyan módszer, amellyel biológiai minta esetén sejtszintű felbontást lehetett elérni, és a mai napig is az egyik legjobbnak számít a felbontás tekintetében. A dinamikus SIMS esetében az elsődleges ionnyaláb alatt a minta felülete folyamatosan megújul, azaz az ionnyaláb folyamatosan erodálja a minta felületét. A módszer molekuláris szinten is invazív és általában monoatomos ionokat eredményez, és ilyen módon csak a minta elemi összetételéről ad információt. Ion-mikroszkóp néven került kereskedelmi forgalomba olyan képalkotó műszer, mely hasonló lencserendszerrel van felszerelve, mint az optikai mikroszkópok. A minta egy nagyobb területére (pár száz mikrométer) irányítják az

17

elsődleges ionnyalábot, a keletkező másodlagos ionok segítségével pedig előállítják a képet. A módszer alkalmazásai között megtalálható az izotópjelzett molekulák kimutatása (farmakológia) [57], sejtek tanulmányozása, képalkotás sejtszinten, mely a technika mechanizmusának köszönhetően akár három dimenzóban is lehetséges. Statikus SIMS esetében a minta felülete nem roncsolódik, és a kisebb energiasűrűségnek köszönhetően a módszer molekuláris szinten is kevésbé invazív, azaz lehetővé teszi kisebb molekulák (MW < 1000 Da) fragmentáció nélküli deszorpcióját is. Biológiai

minták

analízisének

tekintetében

például

a

sejtek

membránlipidjeinek

tanulmányozására található [58] irodalmi hivatkozás a módszerhez kapcsolódóan. A gyors atomos bombázás (FAB: fast atom bombardment) nevű technika hasonló elven működik, mint a SIMS és a ’80-as évektől kezdve már rutinszerűen használják nem illékony, nagyobb tömegű molekulák analízisére [59-60]. A vizsgálandó oldatot feloldják egy mesterséges mátrixban, ami általában glicerin, és ionok helyett semleges atomokkal bombázzák (pl. Ar, Xe). Lágy ionizációs módszer, a spektrumban jellemzően a protonált molekulaion jelenik meg. Szintén hasonló elven működik az úgynevezett folyadék másodlagos ion tömegspektrometria (LSIMS: liquid secondary ion mass spectrometry) [61], [62]. A módszerek közötti eltérés a felületre becsapódó részecskék méretében van, amely a vizsgálható molekulák körét határozza meg [63]. Lézer deszorpciós ionizációs technikák A lézerrel segített deszorpciós ionizációs (LDI: laser desorption ionization) módszerek fejlődése a ’70-es években kezdődött. A deszorpciós folyamat szempontjából a lézer besugárzás valójában hőközlésnek tekinthető, így tulajdonképpen csak olyan típusú molekulák analízisében lehet használni, melyek hajlamosak termikus deszorpcióra. Ebbe a csoportba azonban csak kis méretű, termikusan stabil molekulák tartoznak, így a módszer fejlesztése abba az irányba indult el a ’80-as évek elején, hogy valamilyen módon alkalmassá tegyék nagyobb tömegű molekulák vizsgálatára is. A lézer termikus hatásának másik következménye a biológiai minták tekintetében, hogy a biológiai minták természetes, makromolekuláris mátrixa karbonizálódik a hő hatására, és ez megakadályozza a deszorpciós folyamatot. Ezek az okok vezettek ahhoz az elképzeléshez, hogy a természetes mátrixot mesterségessel lenne célszerű helyettesíteni. A mesterséges mátrixnak egyértelműen meghatározható követelményeknek kell megfelelnie, az ionizációs folyamat és a tömegspektrometriás detektálás természetéből fakadóan. Ezek a következők: abszorbeálja a lézersugárzást, ne lépjen reakcióba az analittal, hanem képes legyen azt beépíteni a

18

kristályrácsába, méghozzá ionos specieszként, illetve a lézer hatására kizárólag gázfázisú bomlástermék képződjön belőle (vs. karbonizáció, lásd feljebb). A leírt szempontok alapján létrehozott mátrix segített-lézerdeszorpciós (MALDI: matrix-assisted laser desorption ionization) technikát Michael Karas és Franz Hillenkamp 1985-ben publikálták elsőként [64]. Úgy tapasztalták, hogy az alanin ionizációs küszöbértékét jelentősen lecsökkenti, ha triptofánnal elegyítve sugározzák be 266 nm hullámhosszúságú lézerrel. A triptofán képes abszorbeálni az ilyen hullámhosszúságú lézer energiát, és megkönnyíti az abszorbcióra nem képes alanin ionizációját. A 2843 Da méretű melittin nevű peptid volt a legnagyobb molekula, amellyel sikerült elérni ilyen típusú mesterséges mátrix segítségével az ionizációs küszöb csökkenését. A módszer fejlődésében az áttörést 1988-ban Tanaka és munkatársai hozták meg [65], az általuk „ultra finom fémpor és folyadék mátrix eljárásnak” nevezett technika alkalmazásával, ugyanis ezzel képesek voltak 30 kDa-nál nagyobb fehérjék detektálására is. Ezért a fejlesztésért 2002-ben Koichi Tanaka kémiai Nobel-díjat kapott. Az elmúlt két évtizedben a MALDI az egyik legelterjedtebb tömegspektrometriás módszer lett, amellyel a nem illékony és termikusan instabil molekulákat (fehérjék, oligonukleotidok, szintetikus polimerek) lehet vizsgálni. A módszer kulcsa a mesterséges mátrix használata, mely mind a deszorpcióban, mind az ionizációban szerepet játszik. A technika fő jellegzetességei: egyszerű mintaelőkészítés és nagyfokú tolerancia a sókkal, pufferekkel és detergensekkel szemben. A MALDI analízis két lépésből áll. Az első lépésben a vizsgálandó mintából és az úgynevezett mátrix vegyületből közös oldat készül olyan módon, hogy az oldat a mátrixmolekulára nézve mintegy 1000-10.000-szer töményebb legyen. Ezután az oldatot beszárítják, hogy minden oldószermaradék, melyet az előkészítés során használtak, elpárologjon. A szárítás eredménye egy „szilárd oldat” lesz, mely a mátrix és az analit „együtt-kristályosodásával” jön létre, és mivel a mátrix koncentrációja nagyságrendekkel nagyobb, ezért az analit molekulák egymástól teljesen izoláltan helyezkednek el, beágyazódva a mátrixba. A klasszikus MALDI analízis második lépése a minta behelyezése a tömegspektrométer ionforrásába, vákuum körülmények közé. Ezután következik a lézerrel történő besugárzás, mely nem folyamatos, hanem impulzus üzemmódú. A deszorpció és ionizáció pontos mechanizmusa még ma is vitatott a szakértők körében, a szakirodalomban két főbb mechanisztikus leírást tartanak elfogadottnak. A fotokémiai ionizációs modell [66] szerint a folyamat két részből áll. Először a mátrix molekulák a lézersugár energiájának hatására gerjesztett állapotba kerülnek – ez a folyamat három különböző úton mehet végbe 19

(4.ábra) – majd fotoelektronokkal való fotoionizációs reakcióban keletkeznek a molekulaion gyökök (pirossal jelölve az ábrán), melyek az analit molekulákkal történő ütközések útján stabilizálódnak, vagyis az analit ionok a gázfázisban képződnek protonálódás vagy deprotonálódás útján.

M M hν

M M

hν

M M

hν

M* M*

M*

2 hν

gerjesztés

M** + M - e–

M+ ˙

+M + H˙

+ e–

(M – H)˙

H˙

(M + H)+

(M – H)+

M–˙ H˙

(M + H)+

M+˙

fotoionizáció

– H2 (M – H)˙+ e–

(M + 2H)+˙ (M – H)–

(M – 2H)–˙ M–˙

fotokémiai reakciók

detektálható ionok

4. ábra: A fotokémiai ionizációs mechanizmus működése (M: mátrix molekula). A klaszter ionizációs modell [67] szerint a savas jellegű mátrix molekulákkal az analit molekulák nagy méretű protonált klaszterekké állnak össze már a kondenzált fázisban. A lézersugárzás hatására ezek deszorbeálódnak a szilárd fázisból a gáz fázisba, ahol a semleges mátrix molekulák deszolvatációja által keletkeznek az analit ionok.

20

lézer sugárzás

deszolvatáció

+

deszorpció

mátrix analit

[

H+

]

proton-transzfer

5. ábra: A klaszter ionizációs mechanizmus működési sémája. A MALDI technika más lézer ionizációs technikához viszonyítva nagyságrendekkel érzékenyebb és sokkal univerzálisabban alkalmazható; mindez tulajdonképpen a mesterséges mátrix jelenlétének köszönhető. Az érzékenység egyik oka a mátrixmolekulák nagy koncentrációja a mintában, ami miatt az analit molekulák gyakorlatilag egyesével elszigetelve fordulnak elő az előkészített mintában. Így az analitmolekulák klaszterképzési reakciója – amely lényegesen lecsökkentené a módszer érzékenységét – gátolt folyamat. Ezen kívül a mátrix abszorbciós képessége minimalizálja a minta roncsolódását, melyet a lézersugár energiája okozna, viszont növeli az energiaátmenet hatékonyságát az analitmolekulák ionizációjának irányába. Mivel a folyamat független a mérendő molekula abszorbciós tulajdonságaitól és a méretétől is, ezért lehetséges kis koncentrációjú (akár 10-15 M), akár 300000 Da-os biomolekulák, tipikusan fehérjék detektálása is a MALDI technikával. Ennek ellenére ma a MALDI módszer legfontosabb felhasználási területe a peptid- és fehérjeanalízishez kapcsolódóan a triptikus emésztmények vizsgálata. Az elektrospray módszerrel összehasonlítva megállapíthatjuk, hogy a két technika a legtöbb szempontból kiegészíti egymást. A szilárd fázisú mintából induló MALDI ionizáció eredményeképp gyakorlatilag kizárólag egyszeresen töltött molekulaionok jelennek meg a spektrumban, így a módszer jól alkalmazható keverékek analízisében (ehhez az alkalmazáshoz tipikusan TOF analizátorral kombinálják), viszont nehezebben oldható meg az elválasztástechnikai módszerekhez való kapcsolása. Valamint nagyon jól automatizálható az analízis folyamata, mivel a minták keveredése akadályozott. Az elektrospray ionizációhoz

21

folyadék fázisú mintára van szükség, így könnyen használható kromatográfiás módszerekkel kombinálva, többszörösen töltött ionokat eredményez. A képalkotás (imaging) az a terület, melyben jelenleg a spray módszerek nehezen veszik fel a versenyt a MALDI, illetve SIMS technikával. A MALDI imaging fejlesztésekről és alkalmazásokról szóló cikkek száma az utóbbi években jelentősen megnőtt [68]. Az atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs módszerek Az atmoszférikus nyomású MALDI (AP-MALDI: atmospheric pressure-MALDI) volt az első olyan ionizációs technika, amely lehetővé tette szilárd fázisú minták atmoszférikus nyomáson történő vizsgálatát [69]. Ennek ellenére a használata nem terjedt el széles körben, mivel az analízis érzékenysége a legtöbb alkalmazáshoz nem megfelelő mértékű. A hagyományos MALDI módszer során is (összehasonlítva például az elektrospray-vel) viszonylag kicsi az ionképződés hatékonysága, és az atmoszférikus nyomáson lejátszódó ionizációs folyamat esetén ez az arány tovább csökken, az érzékenység nagymértékű csökkenését

okozva.

Más

ionizációs

módszerek

atmoszférikus

nyomáson

történő

alkalmazásával részben sikerült erre a problémára is megoldást találni. Az atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs módszerek csoportjába ma már nagyon sok technikát sorolhatunk be, ezek egy része az alábbiakban bemutatásra kerül. Többségük azonban, ahogyan azt már a DCI módszernél is láthattuk, csak fenomenológiai szempontból tartozik ide, mivel nem a hagyományos értelemben vett deszorpciós folyamatra épülnek. Az irodalmi forrás az atmoszférikus nyomású ionizációs technikákat négy nagy csoportra osztja a mintavétel, illetve az ionizáció szempontjából: a termikus deszorpciós, a lézer deszorpciós, a folyadék- és gázsugár deszorpciós és a folyadék extrakciós ionizációs technikákra [70]. Ezzel ellentétben én csak két nagyobb csoportot különböztetnék meg, amelyek az analit fázisváltásának mechanizmusa alapján különíthetők el: a neutrális deszorpcióval kapcsolt ionizációs technikák, illetve a folyadék extrakciós módszerekkel kapcsolt ionizációs technikák. Közös jellemzőjük azonban, hogy már létező és jól bevált technológiákat használnak fel. Az újítás lényege minden esetben az, hogy a „deszorpciós” és az ionizációs folyamatok térben közelebb kerülnek egymáshoz, ami lehetővé teszi a rövid élettartamú specieszek vizsgálatát, így szélesítve a módszerek alkalmazási körét.

22

Folyadék extrakciós módszerekkel kapcsolt technikák A deszorpciós elektrospray ionizáció (DESI: desorption electrospray ionization) 2004es publikációja indította el azt a folyamatot, melynek során az érdeklődés középpontjába kerültek a felületi ionizációs módszerek és ezek tömegspektrometriás felhasználása [71], ezért ennek részletes tárgyalása következik elsőként a témában. nagyfeszültségű tápegység V

oldószer N2

porlasztó kapilláris spray kapilláris

tömegspektrométer bemenet

gázsugár minta

spray felület

d1 α

β

deszorbeált ionok

d2

6. ábra: A deszorpciós elektrospray ionizációs tömegspektrometria működése, és a mérés paraméterei: α: a spray beesési szöge, β: az ionok begyűjtési szöge, d1: a spray csúcs és a felszín távolsága, d2: a tömegspektrométer bemeneti nyílás és a felszín távolsága. A módszer lényege, hogy egy hagyományos elektrospray ionizációs forrást a vizsgálandó felületre irányítunk. A spray-ben keletkezett elektromosan töltött mikrocseppek a felülettel ütköznek, majd az ütközés során keletkezett, felületi molekulákat tartalmazó másodlagos cseppecskék az ESI esetében leírt módon alakulnak gázfázisú ionokká. A DESI ionforrást bármilyen tömegspektrométerhez lehet csatlakoztatni, amely rendelkezik atmoszférikus interface-szel, majd a műszer képességeitől függően különböző módon végezhető a mérés (tandem, selected ion monitoring, pontos tömeg mérése). Gyakorlati tapasztalatokból kiindulva két különböző mechanizmus feltételezhető, hasonlóan a hagyományos LC-MS mérésekhez [72]. Az egyik típusba tartoznak a peptidek, fehérjék, oligoszacharidok, melyeket elektrospray-vel lehet ideálisan analizálni. A másik csoportot olyan vegyületek alkotják, melyeket hagyományosan APCI típusú ionizációval lehet mérni, ilyen például a koleszterin, karotin és a TNT.

23

Az első csoportba tartozó vegyületek analízisének optimálása során a kis d1 távolság (6. ábra) és a közepesen nagy gáz, illetve oldószer áramlási sebesség bizonyultak ideálisnak, ami azt bizonyítja, hogy elengedhetetlen feltétele az ionizációnak az elektromosan töltött cseppecskék ütközése a felszínnel. A cseppek becsapódása után a folyadék szétterül a felszínen, mintegy 3-10-szer nagyobb területen, mint az eredeti csepp átmérője. A becsapódás okozta lökéshullám (shockwave) következtében újabb kis cseppek keletkeznek a szétterülő folyadékfilm szélén („jetting”). Ezt a jelenséget már egy, a SIMS-hez hasonló elven működő ionizációs

technikához

kapcsolódóan

is

leírták

már

(lásd

feljebb).

A

folyamat

hatékonyságához elengedhetetlen a becsapódó cseppek nagy sebessége. A DESI analízis során alkalmazott tipikusan pár száz m/s sebességnél a jetting a folyadék jelentős részét felemészti. A kezdeti összes töltés egy része elvész a felszínen, emiatt az újonnan keletkezett cseppek össztöltése kevesebb, mint a kiindulási cseppeké. A keletkező kisebb töltött cseppek a spray gázáramával, vagy elektrosztatikus kölcsönhatás segítségével, vagy a vákuum szívóhatásával jutnak be a tömegspektrométerbe. A pneumatikus rásegítés fontossága a mechanizmusban ott mutatkozik meg, hogy a peptidek abban az esetben is ionizálódnak, ha a felszínt is azon a potenciálon tartják, amely a spray-re van adva. Ebben az esetben a másodlagos cseppek elektromos feltöltődése a felszín és a tömegspektrométer bemenete közti régióban történik. A második csoport vegyületei az elsőhöz hasonló paraméterek mellett nem ionizálódnak. Ezeknél a méréseknél szükséges, hogy potenciálkülönbség legyen a spray és a felszín között, ellenben nem szükséges a töltött cseppek jelenléte. A spektrum karakterisztikájának és a jelintenzitásnak a függése a d1 távolságtól, illetve a felszín hőmérsékletétől azt jelzi, hogy az ionképződés elsődleges módja az oldószer és az analit közötti töltésátmenet. A heterolitikus töltésátadási reakció proton- illetve elektroncserét jelent egy gázfázisú ion és egy felszínen tartózkodó molekula között. A tisztán gázfázisú ionmolekula reakciók előfordulása sem kizárható ezekben az esetekben, mivel a jelintenzitáshoz való hozzájárulásuk egyre nagyobb, ha növekszik a gőznyomás ugyanolyan kísérleti körülmények között. Heterogén fázisú töltésátadás során általában proton transzfer reakciók mennek végbe (chemical sputtering) [73], melyet a jelenlévő specieszek relatív protonaffinitása határoz meg. Például a koronén ionizálódik metanol (PA = 754 kJ/mol) jelenlétében, ám ha acetont (PA = 816 kJ/mol) alkalmazunk spray oldószerként, akkor nem jelenik meg a koronén ion a pozitív DESI spektrumban. A heterogén töltésátadási reakció jelenléte az úgynevezett deszorpciós APCI (DAPCI) forrás segítségével bizonyítható. Ebben a rendszerben gázfázisú ionok keletkeznek a reagensgázként alkalmazott illékony oldószer gőzéből a koronakisülés hatására (lásd alább). Az ionok a nagy sebességű nitrogén vivőgáz 24

segítségével ütköznek a felszínnel, ahogyan a DESI esetében is. A koleszterin, karotin, koronén és egyéb vegyületek esetén is metanollal, mint protonáló reagenssel DAPCI ionizációs módszerrel is ugyanolyan spektrumot adtak, mint DESI-vel. Negatív ionmódban, amikor toluolt használtak reagensnek, a TNT ionizálódott elektron transzfer reakció útján. A jelintenzitás erősen függ a forrásra adott nagyfeszültség mértékétől, ami azt jelenti, hogy az elektronbefogásos ionizáció elsődleges elektronforrása a koronakisülés. A TNT-t nem sikerült pozitív ion módban detektálni, mivel a protonaffinitása számottevően kisebb, mint a metanolé. Az első csoportba tartozó vegyületek, a peptidek, szénhidrátok, nukleotidok és egyéb tipikus ESI vegyületek esetében pedig nem jelenik meg csúcs a spektrumban, ha DAPCI ionizációs módszerrel vizsgáljuk őket. A két kísérleti tapasztalat (a felszínre adott potenciál és a DAPCI módszer) alapján valószínűsíthető, hogy a fent említett kétféle ionizációs mechanizmus valósulhat meg a DESI analízis során. Ma már az irodalomban számtalan példát találhatunk a DESI módszer felhasználására, melyeket két nagy csoportba oszthatunk. Az egyik a direkt analízis, melynek során a legfontosabb szempont a minta épségének megőrzése. A DESI technika nagy előnye, hogy nincs szükség sem mintaelőkészítésre, sem a minta vákuumba való behelyezésére, ilyen módon pedig könnyen eleget lehet tenni a minimális károkozás igényének. Ebbe a csoportba tartoznak az élelmiszeranalitikai [74], törvényszéki analitikai [75], reptéri biztonsági vizsgálatok [76], biológiai szövetek analízise [77] és képalkotás [78-79]. A másik csoportba a nagy hatékonyságú, vagy high-throughput alkalmazások tartoznak, melyeknél a fő szempont az analízis sebessége. A mintaelőkészítés hiánya, és a méréshez szükséges rövid analízis idő miatt a DESI módszer ennek az igénynek is megfelelhet [80], habár ezek a tulajdonságok gyakran az érzékenység rovására mennek. Ebbe a csoportba tartoznak a gyógyszeranalitikai mérések [81] és biológiai eredetű folyadékminták vizsgálatai [82]. Amennyiben nem adunk nagyfeszültséget a spray-re, de megnöveljük a gáz áramlási sebességét, akkor az úgynevezett deszorpciós szuperszonikus spray ionizációs technikát (DeSSI: desorption sonic spray ionization) kapjuk [83]. A szuperszonikus spray ionizáció egy folyadék bevezetésű ionforrás (lásd fentebb), amely csak a nagy sebességű porlasztógáz erejét használja fel gázfázisú ionok képződéséhez. Ha a nagyfeszültséget és a porlasztó gáz sebességét változtatható paramétereknek tekintjük, akkor a DeSSI a DESI technika egy speciális esete. A vegyületek nagy része, melyek mérhetők a DeSSI módszerrel, DESI-vel is mérhetők, ám az állítás ellentéte nem igaz. A gyakorlati tapasztalatok azt mutatják, hogy az erősen savas vagy bázikus jellegű anyagok esetében jobb mérési eredményt lehet elérni a DeSSI technikával, ellenben a gyengén poláris analitoknál nem ad jobb eredményt. Ennek 25

okait a mechanizmusban kell keresni [84-85], méghozzá a felület és a spray elektrokémiájában. Tulajdonképpen egy másik szélsőséges esete a deszorpciós elektrospray ionizációnak, amikor nem használunk porlasztógázt, viszont extrém nagy folyadék áramlási sebességgel dolgozunk, ezt a technikát jet deszorpciós ionizációnak (JeDI: jet desorption ionization) nevezik [86]. Vékonyra húzott kapillárissal, melynek a belső átmérője 1-20 μm, lehet létrehozni a folyamatos folyadék sugarat, mely a felület egy pontjára irányítható, ahogyan ez a spray technikák esetén is történik, csak ebben az esetben a folyadék áramlási sebessége 0.050.15 ml/min között van. A nagy sebességű jet sugár folyamatosan roncsolja a felületet, melyből gázfázisú ionok szakadnak ki. A technika ígéretes tulajdonságai közé tartoznak a mélységi profil vizsgálatának lehetősége, illetve a kiváló, 1-5 μm-es térbeli felbontás. A spray segítségével működő technikák mellett ebbe a csoportba sorolhatjuk a valódi folyadék extrakciót alkalmazó módszereket, melyek működési elve azon alapul, hogy a felületen lévő vizsgálandó anyagot extrahálják a felülettel érintkező folyamatos folyadék áramlással, tehát valójában nem deszorpciós folyamat során szakadnak ki a felületből a részecskék. A folyadékáram szerepe nem csak az extrakció, hanem az analit eljuttatása az ionforrásba, vagyis szükséges spray-technika alkalmazása is. Mivel a porlasztás előtt történik az analit extrakciója, ezért a deszorpciós módszerekhez képest az érzékenység nagyságrendekkel jobb, viszont a mintavevő rendszer mérete korlátozott, ami a térbeli felbontást határozza meg, amennyiben képalkotásra alkalmazzuk a módszert. Két alapvető típusa van ennek a módszernek, a Sealing Surface Sampling Probe (SSSP) és a Liquid Microjunction Surface-Sampling Probe (LMJ-SSSP). A Luftmann-féle SSSP [87] legfőbb felhasználási területe ma a vékonyréteg kromatográfiás lapok analízise [88]. A technikát alkalmazták többféle felület típusra is (üveg, többféle műanyag felület, porózus felületek, biológiai szövetek), ami lehetőséget ad a felhasználási területek széleskörű kibővítésére. Az alábbi ábrán látható a módszerhez szükséges automata mintavevő felépítése. A bemenő (inlet) kapilláris a HPLC pumpához csatlakozik és a kimenő (outlet) kapillárissal együtt egy saválló acél szelepbe van beépítve, amely mintavételkor rázár a felszínre. A kimenő kapilláris pedig a tömegspektrométer ionforrásába vezet. A vizsgálni kívánt felületet a mintavevő alá kell pozícionálni, majd az extrakciós pozícióba tenni a mintavevőt. A HPLC injektor extrakciós állásában a pumpából jövő oldószer, mely eddig egyenesen az ionforrásba ment, most a felszín felé megy, onnan extrahálja az analitot, majd szállítja az ionforrásba. Két mintavétel között a mintavevő is standby pozícióba áll, mialatt a mintával érintkező része letisztítódik, a keresztszennyezések elkerülése érdekében. A mintavevő tipikus átmérője 2 vagy 4 mm. 26

bemenő kapilláris

kimenő kapilláris

acél szeleptest

tömítőgyűrű szűrő filter

mozgó fej minta

7. ábra: A Luftmann-féle SSSP automata mintavevő rendszerének sémája. Az LMJ-SSP működési elve egyezik az előzőekben ismertetett rendszerével, csak a kivitelezésben különböznek egymástól. A koaxiális mintavevő rendszert két kutatócsoport publikálta egymástól függetlenül 2001-ben [89-90]. A külső kapillárisokban jön az oldószer a HPLC pumpából, míg a belső kapilláris tulajdonképpen felszívja a felületről visszaérkező folyadékot. Ezzel a technikával sikeresen vizsgáltak hidrofób vékonyréteg kromatográfiás lapokat, ám a módszer hátránya, hogy normál fázisú lapok esetén nem volt sikeres a vizsgálat, mivel a vékonyréteg nedvesedése által okozott kapillárishatás miatt az eluáló oldószer és az analit egy része szétterült a felületen. Sikeresen alkalmazták viszont a módszert gyógyszerhatóanyagok és metabolitok kimutatására biológiai szövetekből [91]. Neutrális deszorpcióval kapcsolt technikák Az ebbe a csoportba tartozó technikák alapvetően két részre oszthatók a deszorpció típusa alapján: termikus és lézer által kiváltott folyamatokra épülő módszerekre. A neutrális deszorpciót követően jellemzően az ionizációhoz is kétféle technikát lehet alkalmazni: az elektrospray-t és az APCI-t. A termikus deszorpciós atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció (TD/APCI: thermal desorption

atmospheric

pressure

chemical

ionization)

a

legrégebbi

és

legtöbbet

tanulmányozott AP technika, melyet tömegspektrometriával kapcsolva használnak. A ’70-es évek közepén fejlesztették ki Horning és munkatársai [92], kereskedelmi forgalomban a ’80as években lett elérhető. Az 1990-es években mellőzötté vált, de napjainkban újra előtérbe került. A módszer során a kondenzált és a gőzfázis közötti átmenet hőközlés hatására történik, majd ezt APCI posztionizációs folyamat követi. A hőközlés megvalósítása tipikusan a minta

27

felett vezetett forró gázárammal vagy egy ellenállással fűtött felülettel történhet. A deszorpciós folyamat természete miatt ez az eljárás csak viszonylag kis molekulatömegű (maximum 2000 Da) specieszek vizsgálatára alkalmas, ugyanis termikusan instabil, erősen poláris, illetve nagy molekulatömegű molekulákat nem lehet gáz halmazállapotba jutattni hő hatására. Bebizonyították már régebben [93], hogy keletkeznek ionok hő hatására is, ezt a jelenséget nevezik termikus elpárologtatásnak és kvaterner ammónium és foszfónium sókból keletkezett ionokat tudtak detektálni ilyen módon. Napjainkban újra fejlesztenek alkalmazásokat az atmoszférikus nyomású termikus deszorpciós ionizáció (APTDI: atmospheric-pressure thermal desorption ionization) módszerhez is. Cooks és munkatársai például szerves sók és ezek gázfázisú reakciói esetében használták fel [94]. Az utóbbi időben megjelent publikációk közül kiemelném először azokat, melyeket McEwen és munkatársai közöltek [95-96]. A módszert, melyet kidolgoztak és alkalmaztak, atmoszférikus nyomású szilárd fázisú analízisnek nevezték el (ASAP: atmospheric pressure solids analysis probe). A vizsgálandó anyagot egy olvadáspontmérő kapillárisban helyezik el, ebben történik a termikus deszorpció, majd egy APCI forrásban az ionizáció, és végül az analízis a tömegspektrométerben. Ezzel a technikával olyan specieszeket lehet mérni, amelyeket hagyományos APCI módszerrel nem lehet ionizálni, például lipideket, karotinoidokat friss biológiai mintákból, valamint zsírsavakat. Szintén a TD/APCI módszerek közé tartozik a direkt analízis valós időben (DART: direct analysis in real time) [97]. Nagy előnye, hogy olyan anyagokat is lehet vizsgálni ezzel a módszerrel, amelyeknek nagyon alacsony a gőznyomásuk, mind poláris, mind apoláris típusúakat, és gyakorlatilag bármilyen felületről. Egy kisülési cellán hélium vagy nitrogén gázt vezetnek keresztül, melyből a cellában található tűre adott nagyfeszültség hatására ionok, elektronok és metastabil állapotú specieszek keletkeznek. Ezek több elektródon haladnak át, melyek elválasztják a töltött részeket a semlegesektől, és ez utóbbiak kerülnek be egy fűtött kamrába, melyből egy rácselektródon keresztül jutnak ki mintához, amely atmoszférikus nyomáson található. Tehát a metastabil, gerjesztett állapotú semleges hélium atomok (He* (23S1)) ionizálják a mintát, amely lehet szilárd, folyadék vagy akár gáz halmazállapotú is. A deszorpció és az ionizáció teljes mechanizmusa még nem ismert, de az eddigi adatok azt mutatják, hogy a termikus deszorpció a domináns folyamat. A módszer felhasználási területe nagyon kiterjedt, az irodalomban találhatunk példákat a következőkre: vékonyrétegkromatográfiás

lapok

analízise,

hamisított

gyógyszerek

összetételének

vizsgálata,

reakciókövetés a gyógyszerkutatásban, zsírsav profil meghatározása ép baktériumsejtekből.

28

Egy másik módosított TD/APCI technika a deszorpciós atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció (DAPCI: desorption atmospheric pressure chemical ionization) [98]. Ebben az esetben az elektrospray emitter helyett koaxiálisan beépített hegyes saválló acél elektród található az ionforrásban, melyre ±3 és 6 kV közötti feszültséget kapcsolnak. Az inert vivőgázba különböző oldószergőzöket vezetnek be, amelyeket az elektródon kialakuló koronakisülés ionizál. Néhány esetben a vivőgázt melegítették is. Az ionizációs mechanizmus a DAPCI esetében hasonló, mint az APCI forrásoknál. A deszorpció folyamata azonban nem ennyire tisztán érthető. Fűtött vivőgáz esetében egyértelműen a termikus deszorpció a domináns folyamat. Egyéb esetekben viszont a nagy sebességű gáz kiszakíthat részecskéket a felszínről, amelyek a gáz fázisban ionizálódhatnak. Publikáltak azonban olyan eredményeket, hogy nem alkalmaztak nagy sebességű gázáramot. Ezekben az esetekben azt feltételezik, hogy a sztatikus töltés felhalmozódás lép fel a minta felszínén, ami megkönnyíti az ionizációt (vö. FDI). A DAPCI-MS módszer felhasználási területei között kis molekulatömegű ionok detektálása

szerepel,

gyógyszerhatóanyagoké,

mezőgazdasági

vegyszereké

[99-100],

robbanószereké [101], valamint élemiszerek vizsgálata [102]. A módszer, melyet deszorpciós atmoszférikus nyomású fotoionizációnak (DAPPI: desorption atmospheric pressure photoionization) neveztek el, hasonló elven működik, mint a DAPCI, azzal a különbséggel, hogy a reagens ion populáció fotoionizációs folyamat eredményeképp keletkezik a koronakisülés helyett. Haapala és munkatársai fejlesztették ki a forrást [103]. Egy mikrochip-es porlasztó segítségével forró oldószergőz áramot juttatnak a minta fölé, amelyben UV-lámpa segítségével indítják meg az ionképződési reakciót. A deszorpciós folyamat ebben az esetben is főleg termikus, az ionizáció mechanizmusa azonos az atmoszférikus nyomású fotoionizációs módszerével folyadék bevezetésű ionforrás esetén. A hőmérséklet emelésével a jelintenzitás nő, ami arra enged következtetni, hogy a folyamat termikus, de az oldószer változtatásával is erősen befolyásolható a hatásfok. Azt tapasztalták, hogy toluol, aceton, illetve ezek keverékének a használatával jelentősen megnövelhető az ionizáció hatásfoka, amely ezen molekulák UV abszorpciós sajátosságaival hozható összefüggésbe. Az úgynevezett plazmával segített deszorpciós ionizációs technikákat is itt kell megemlíteni, mert legalábbis részben termikus deszorpciós folyamaton alapulnak. Két hasonló módszer tartozik ide: a plazmával segített deszorpciós ionizáció (PADI: plasmaassisted desorption ionization) [104] és a dielektrikus határkisülés deszorpciós ionizáció (DBDI: dielectric barrier discharge ionization) [105]. Mindkét esetben hélium gáz áramból keletkezik a deszorpciós / ionizációs plazma két elektród között, váltóáram segítségével, és a 29

felülettel való kölcsönhatása révén keletkeznek a mintából az ionok. A legtöbb esetben molekulaionok képződését tapasztalták, ritkábban keletkeznek fragmens ionok is. A deszorpció és ionizáció pontos mechanizmusa még nem tisztázott. A lézer deszorpciós / ionizációs forrás, mely alkalmas a felületi mintavételezésre – függetlenül attól, hogy vákuumban, vagy atmoszférikus nyomáson zajlik ez a folyamat – viszonylag egyszerűen működő szerkezet. A pulzus üzemmódú lézersugarat a felszín egy pontjára fókuszálják, melyet analizálni szeretnének; az anyag deszorbeálódik és ionizálódik a lézersugár hatására; és a keletkező ionokat egy megfelelő tömegspektrométerrel lehet detektálni. A folyamat tényleges mechanizmusa azonban ennél sokkal összetettebb, és nem teljesen tisztázott még, ahogy ezt már a MALDI módszer leírásánál is említettem. Ami azonban biztos, hogy a folyamat során ideális esetben is több semleges részecske keletkezik, mint amennyi ion. Így amennyiben egy jól definiált másodlagos ionizációs módszerrel kombináljuk a lézer deszorpciót, akkor az ionizációs körülményeket független módon optimálhatjuk. Ennek eredményeképp nőhet az ionizáció hatékonysága, befolyásolható a keletkező ionok típusa (atomi- vagy molekulaion), egyszerűsödhet a mintaelőkészítés (akár a mátrix elhagyása) és új variációs lehetőségek adódnak az alkalmazások terén. A legrégebbi típusa a másodlagos ionizációval kombinált atmoszférikus nyomású lézer deszorpciós technikának a lézer ablációs induktív csatolású plazma (LA-ICP: laser ablation inductively coupled plasma) módszer, melyet 1985-ben publikáltak először [106], és azóta széles körben használt módszerré nőtte ki magát [107]. Kereskedelmi forgalomban évek óta elérhető a módszer alkalmazásához szükséges készülék, melyet a legtöbbször úgy állítanak össze, hogy automata analízisre alkalmas; mind felületen lévő egyes pontokéra, mind az egész felület leképezésére. Egy tipikus analízis során a minta egy zárt ablációs kamrában van elhelyezve, melyet átöblítenek argonnal vagy héliummal. A lézersugarat a kamra ablakán keresztül fókuszálják a mintára, majd a besugárzás után deszorbeáló anyagot argon szállítja az ICP égőbe. Az ICP egy szeparált külső forrás, amely a lézer által generált részecskéket deszolvatálja, porlasztja, atomizálja és ionizálja. Az ionok ezután egy atmoszférikus-vákuum interfészen keresztül kerülnek a tömegspektrométerbe. Mivel az ICP atomi ionforrás, ezért a módszer csak elemek analízisére alkalmas, ellenben az érzékenysége kiváló. Az anyagtudományokban, környezeti tudományokban, törvényszéki, archeológiai és biológiai minták analízisében alkalmazzák leggyakrabban. A lézer deszorpciós atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció (LD/APCI: laser desorption atmospheric pressure chemical ionization) módszerben a másodlagos ionizáció

30

eredményeképp molekulaionok keletkeznek [108]. A módszer gél elektroforézissel kombinálva hasznosnak bizonyult a fehérje analízisben. Az első lézer deszorpciós elektrospray ionizációs (ELDI: laser desorption electrospray ionization) módszer publikációja Shiea és munkatársai nevéhez fűződik [109]. A módszer működési elve hasonló az LD/APCI-hoz, kivéve abban, hogy a deszorbeált részecskék ionizációja a töltött cseppekkel, protonált oldószer specieszekkel vagy gázfázisú ionokkal végbemenő reakció útján valósul meg, melyek az elektrospray folyamatban keletkeznek. Az elektrospray másodlagos ionizációként való alkalmazása abból a szempontból bizonyult előnyösnek a többi módszerhez képest, mert így előfordulhat többszörösen töltött ionok képződése is makromolekulákból. A többszörösen töltött fehérje ionok megjelenése a spektrumban arra utal, hogy van olyan fehérje molekula, amelyet a töltött cseppek feloldanak, majd ezután az ionképződés az ESI mechanizmus szerint zajlik. A technikát sikeresen alkalmazták különböző kémiai összetevők direkt analízisére, például egész fehérjemolekulák detektálására biológiai folyadékokból (vér, könny, nyál, szérum), baktérium tenyészetekből és szövetekből anélkül, hogy kémiai mátrixot kellett volna a mintához adni a deszorpciós folyamat hatékonyságának növelése érdekében. Az irodalomban található arra is példa, hogy ugyanezt az eljárást kémiai mátrix segítségével végezték (MALDESI) [110]. Míg az ELDI és a MALDESI technikákban UV lézer forrást alkalmaznak, addig a LAESI (laser ablation with electrospray ionization: lézer abláció elektrospray ionizációval) technikában IR lézert használnak. Ennek legfőbb előnye, hogy akár a minták víztartalma is felhasználható mátrixként az OH-csoport megfelelő rezonancia frekvenciája miatt. Ez indokolja, hogy a módszernek több biológiai minták analízisével kapcsolatos alkalmazása is született az elmúlt években [111].

1.2.3. A biológiai szövetek analízise A tömegspektrometriás alapú szövetvizsgálat mintegy 20 éves múltra tekint vissza. Hagyományosan a vizsgálat meglehetősen bonyolult, magában foglalja a szövetminták homogenizálását, szelektív extrakcióját, és kromatográfiás elválasztását a tényleges tömegspektrometriás analízist megelőzően. Ezen vizsgálatok általában jól definiált molekuláris komponensek mennyiségi meghatározását célozzák, és a rutin diagnosztikai gyakorlat területén nem kerültek alkalmazásra. A deszorpciós ionizációs módszerek fejlődése azonban lehetővé tette a mikroszkópos metszetek közvetlen vizsgálatát, és ilyen módon

31

lehetőség nyílt egyes molekuláris komponensek szövetmintán belüli eloszlásának vizsgálatára is. A biológiai szövetanalízisnek analitikai kémiai szempontból nézve két alapvető fajtája van: a proteomikai, illetve a lipidomikai alkalmazások. Az első típus a szövetek fehérje összetételét vizsgálja, míg a második a különböző lipidek előfordulását. Mindkét területet forradalmasította a MALDI és a SIMS tömegspektrometria megjelenése, mivel ezekkel a módszerekkel a nagyméretű biomolekulák vizsgálata ideálisan megvalósítható [112-113]. A kémiai képalkotás (imaging) során a mintáról olyan kép készül, amelynek minden egyes képpontjához (pixel) egy individuális tömegspketrum tartozik. A legtöbb irodalmi példát fehérjékre találhatunk [114], de folyamatosan nő a száma a lipidomikával foglalkozó publikációknak is [115]. Mind a MALDI, mind a SIMS módszerek ma már klasszikusnak számítanak a képalkotásra alkalmas technikák között. Az előzőekben ismertetett atmoszférikus deszorpciós ionizációs eljárások közül pedig még a DESI [116], a JeDI, a LAESI [117], illetve az SSSP [118] módszerek esetében találhatunk irodalmi példát biológiai szövetek képalkotó analízisére. Az atmoszférikus nyomáson működő módszerek magukban hordozzák azt a lehetőséget, hogy gyors képalkotást biztosítsanak, mely akár egy műtéti beavatkozás számára is információt szolgáltathat. A tömegspektrometriás analízis sok speciesz párhuzamos vizsgálatára ad lehetőséget, amely az ennyire összetett minták esetében különösen előnyös tulajdonság. Azonban a hisztológiához és az autoradiográfiás eljárásokhoz hasonlítva éppen az számít hátránynak, hogy nem specifikus, ezáltal pedig nem elég egyszerű. A műtét közbeni szövetazonosítás egyetlen jól bevált módszere még napjainkban is az intraoperatív hisztopatológiai vizsgálat. Ebben az esetben a műtét során eltávolított szövetrészletekből történik az úgynevezett fagyasztott metszetkészítés. A metszeteket a patológus mikroszkóposan vizsgálja, majd a vizsgálat eredménye alapján születik döntés a műtét folytatásáról. A módszer egyik hátránya, hogy a műtét idejét mintegy fél órával hosszabbítja meg, mivel nagyjából ennyi időt vesz igénybe a vizsgálat. A további hátrányok közé tartozik, hogy a fagyasztásos technikával készült metszetek minősége elmarad a hagyományos beágyazásos technikával készült metszetekétől, valamint az eljárás a műtéti beavatkozás során csak korlátozott számú minta (általában egy minta) esetében vehető igénybe. A közelmúltban számos kísérlet történt a tumoros területek fluoreszcenciás vizualizálására [119]. Bár ezen kutatási projektek során számos olyan, szövetspecifikus fluoreszcens festék került kifejlesztésre amely akár a műtétek során is alkalmazható lenne, a technológia mégsem terjedt el a gyakorlatban. Ennek legfőbb oka, hogy a nagy mennyiségben 32

beadott festék minden esetben okoz bizonyos mellékhatásokat, valamint egy festéktípus csak egy bizonyos, jól definiált tumor típus esetében használható.

2. Az irodalmi bevezető összefoglalása, a témaválasztás indoklása Biológiai

minták

folyadékkromatográfiás

–

tömegspektrometriás

vizsgálatára

jelenleg

elsősorban

tömegspektrometriás,

másodsorban

gázkromatográfiás

–

tömegspektrometriás módszereket használnak. Ezek a módszerek – különös tekintettel a minta előkészítésre – meglehetősen idő- és munkaigényesek, azonban megbízható eredményekkel szolgálnak. Mivel ezen alkalmazások legfőbb felhasználási területe a gyógyszerfejlesztés és a klinikai diagnosztika, a módszerek megbízhatósága tipikusan minden további szempontot felülbírál. Egy módszer megbízhatóságát azonban kizárólag nagy mennyiségű, hosszú idő alatt összegyűlt tapasztalat alapján lehet megítélni, ezért a közlemúltban kidolgozott, alapvetően deszorpciós ionizáción alapuló közvetlen tömegspektrometriás módszerek nem jelentek meg a gyakorlati analitikai munkában. A közvetlen ionizációs tömegspektrometriás módszerek azonban nem csak az analitikai feladat megoldásának az időigényét csökkentik, hanem lehetővé teszik olyan alkalmazások kifejlesztését is, amelyek esetében eddig más módszereket alkalmaztak (pl. centralizált labordiagnosztika) vagy fel sem merült az analitikai kémiai megoldás lehetősége. A doktori munkám alapvető célkitűzése az volt, hogy olyan, közvetlen ionizációs (elsősorban deszorpciós elektrospray ionizáción alapuló) módszereket fejlesszek ki, amelyek segítségével biológiai minták közvetlenül vagy minimális előkészítés után vizsgálhatóak. Mivel analitikai szemszögből a biológiai minták egyértelműen biológiai fluidumokra (vér, vizelet, plazma, szérum, liquor, stb.) és szövetmintákra oszlanak, a doktori munkám kezdetétől fogva párhuzamosan foglalkoztam ezen két mintacsoport közvetlen ionizációs tömegspektrometriai vizsgálatának lehetőségeivel. Mind a fluidumok, mind pedig a szövetminták esetében megpróbáltunk olyan alkalmazást találni, ahol a jelenleg használt módszerek problémákkal küzdenek, és mindenképpen szükséges valamilyen alapvető metodikai változtatás a közeljövőben. A biológiai fluidumok esetében kézenfekvő választásnak látszottak a klinikai kémiailabordiagnosztikai alkalmazások. Jelenleg az ilyen meghatározások esetében alapvetően kémcsőbe levett vérmintákat használnak, amelyek tesztenként néhány ml vért igényelnek, de összességében egy teljes kivizsgálás mintaigénye elérheti a deciliteres mennyiséget. A

33

mintákat egy meglehetősen bonyolult, de analitikai szempontból nézve primitív, úgynevezett labordiagnosztikai automata dolgozza fel. Az automaták jórészt klasszikus színreakciókon alapuló kolorimetriás meghatározásokat alkalmaznak. Emellett – egyszerűbb analitok esetében – elektrokémiai (tipikusan potenciometriás) meghatározás is szerepelhet. Az automaták nagy hátránya, hogy limitált mennyiségű teszt elvégzésére képesek, a diagnosztikai vizsgálatok köre nem vagy csak igen bonyolult módon bővíthető. A direkt ionizációs tömegspektrometriás módszerek ezzel szemben képesek minimális mintamennyiségből kiindulva lényegében tetszőleges számú paraméter meghatározására, amennyiben megfelelő érzékenységet tudunk elérni. Azonban, amint azt az irodalmi áttekintésben leírtam, a módszerek (DESI, DART, DAPCI) érzékenysége szignifikánsan elmarad a hagyományos ionizációs technikák érzékenységétől, ami a biológiai fluidumokból meghatározható komponensek körét nagy mértékben leszűkíti. Ilyen módon a biológiai fluidumok közvetlen ionizációs tömegspektrometriás vizsgálata esetében egy olyan módszer kidolgozása volt a cél, amelynek segítségével viszonylag egyszerűen, de lényegében tetszőleges mértékben megnövelhető az említett módszerek érzékenysége. Szövetminták esetében a szöveti komponensek gyors, kvantitatív meghatározásának lehetőségét kezdettől fogva elvetettük, ugyanis ez nem kivitelezhető a minták homogenizálása és extrakciója nélkül. Bár szövettani metszetek vizsgálhatóak ezekkel a módszerekkel (lásd irodalmi áttekintés), de ezek a vizsgálatok a megfelelő belső standard hiányában nem nevezhetőek kvantitatívnak. A korlátot elsősorban az jelenti, hogy egy szövetminta esetében nem érhető el, hogy a belső standard vegyületet a minta egyenletes eloszlásban tartalmazza. A korábbi, deszorpciós ionizációs módszerekkel elért eredmények és a DESI-alapú kémiai képalkotás eredményei alapján egyértelmű volt, hogy ha egyes komponensek nem is határozhatóak meg a szövetmintákból, a kapott tömegspektrumok alapján a szövetek hisztológiai besorolása viszont egyértelműen megállapítható. Ez a felismerés magában azonban nem ekvivalens a módszerek gyakorlati alkalmazhatóságával, ugyanis a szövettani metszetek hisztológiai besorolására a közönséges optikai mikroszkópiás vizsgálat is alkalmas. A mikroszkópos vizsgálat emellett gyorsabb, olcsóbb, és lényegesen jobb térbeli felbontásra képes. A hisztológiai módszerek azonban – a közvetlen ionizációs tömegspektrometriás módszerekkel ellentétben – kizárólag megfelelően elkészített és festett szövettani metszetek esetében működnek, natív szöveti blokkminták vagy élő szövetrészletek nem vizsgálhatóak ilyen módon. Ez a probléma leginkább a tumor eltávolító műtétek esetében merül fel, ahol

34

szükséges volna az azonnali szövettani diagnózis felállítása, ideálisan még a műtéti beavatkozás közben. Mivel a DESI módszer alkalmas lényegében tetszőleges minta felületének vizsgálatára, és a szöveti DESI spektrumok hisztológiai specificitása ismert (bár csak metszetek esetében), kézenfekvőnek látszott egy, sebészeti környezetben működő DESI alapú technika kifejlesztése. A technika kifejlesztése azzal a reménnyel kecsegtetett, hogy a sebészeti beavatkozás közben feltárt szövetrészletek azonnal azonosíthatóvá válnak, és ilyen módon csökkenthető a tumor eltávolító beavatkozások időigénye, szintén csökkenthető az eltávolított szövet mennyisége, valamint javítható a szöveteltávolítás specificitása. Bár a DESI esetében alkalmazott nagy feszültség, valamint a nagy sebességű gázáram megoldandó problémaként jelentkezett, célként egy olyan módszer kifejlesztését tűztük ki, amely közvetlen ionizációs tömegspektrometrián alapszik, és képes élő szövetek vizsgálatára, illetve a vizsgálati eredmények alapján lényegében valós idejű azonosítására.

35

3. Kísérleti rész 3.1. Szilárd fázisú extrakció és deszorpciós ionizáció kombinációja 3.1.1. Bevezető Doktori munkám során egy újfajta mintaelőkészítési és mérési eljárást dolgoztam ki, amely elsősorban folyadékminták szerves mikrokomponenseinek mennyiségi és minőségi meghatározására szolgál. A kifejlesztett módszer előnye, hogy a tömegspektrometriás mérések időigényét a töredékére csökkenti oly módon, hogy a mérés érzékenysége és szelektivitása

nem

sérül.

A

módszer

kivitelezéséhez

szükséges

eszközöket

is

laboratóriumunkban fejlesztettük. Az irodalmi bevezetőben bemutatott atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs technikák előrevetítették egy, a jelenlegi tömegspektrometriás technikáknál mintegy 2-3 nagyságrenddel gyorsabb alkalmazás kifejlesztésének a lehetőségét. A deszorpciós ionizációs technikák előnye a nagy sebességű analitikai alkalmazásokhoz képest az, hogy az egymás után mért minták nem keveredhetnek egymással (8. ábra b). Ilyen módon a minták közti keresztszennyeződés teljes mértékben kiküszöbölhető. A gázfázisú ionizációs és spray ionizációs technikák esetében az egymás után következő minták ugyanazokon a csővezetékeken áramlanak keresztül (8. ábra a), ami mindenképpen limitálja az egységnyi idő alatt lemérhető minták számát.

b.

a. spray gázfázisú ionok

analitikai nyaláb gázfázisú ionok

minta1

minta2 minta1

minta2

8. ábra: A spray (a) és a deszorpciós ionizációs (b) módszerek működési elve. Az atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs módszerek esetén emellett a minta tömegspektrométerbe történő bejuttatása is kiküszöbölhetővé válik, így nincs szükség a

36

minták módosítására sem, és ilyen módon nagyobb mérési sebesség érhető el. Ellenben ezeknek a technikáknak az érzékenysége messze elmarad a konkurrens spray illetve gázfázisú ionizációs technikák esetében tapasztalt érzékenységtől, ami nagy mértékben korlátozza a módszerek alkalmazhatóságát. Végeztem egy egyszerű szemléltető kísérletet, melynek során a kotininre vonatkozó abszolút érzékenységre jellemző LLOQ (lower limit of quantification) értéket mértem metanolos oldatból a hagyományos elektrospray forrással, illetve a DESI módszerrel. Az elektrospray analízis eredménye 500 pg/ml lett, míg DESI-ve 500 ng/ml-nek adódott az abszolút érzékenység. Ennek a három nagyságrendbeli különbségnek több oka is van, melyek nagy részét a DESI technika alapvető működésében kell keresni (9. ábra). A módszer geometriájából adódik, hogy az ionoknak csak egy töredéke kerül be a tömegspektrométerbe az analízis során. Egyrészt amiatt, hogy kicsi a felületi sűrűség, mivel a felcseppentés során a minta szétterül a felületen. Másrészt pedig a felülettel való ütközés után a töltött részecskék különböző irányokba szóródnak, így kis hányaduk jut be a fűtött kapillárisba.

V

szóródás

szétterülés a felületen

9. ábra: Az ionizációs hatásfok csökkenésének okai a DESI módszer esetében. Az másik nyilvánvaló ok, amely ennél a kísérletnél nem is érvényesülhetett, a mintaelőkészítés hiánya, ami miatt a fellépő mátrixeffektus még jobban lecsökkenti az analit detektálásának hatékonyságát. Doktori kutatómunkám célja egy olyan mintaelőkészítési módszer kifejlesztése volt, melynek alkalmazásával az atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs technikák érzékenysége 2-4 nagyságrenddel megnövelhető, anélkül hogy a módszer időigényét lényegesen megnövelnénk. A mintaelőkészítési módszer esetében az egyik fontos szempont 37

az volt, hogy valamilyen módon helyettesítse az időigényes, és a deszorpciós technikáknál csak körülményesen alkalmazható kromatográfiás eljárásokat. Természetesen szükséges tervezési szempont volt az is, hogy a minta formátuma kompatibilis legyen a deszorpciós elektrospray ionizációs detektálással, ami azt jelenti, hogy az analitnak egy olyan felületen kell elhelyezkednie, amely megfelelő az analízishez. Ezen kívül a mintaelőkészítés legyen gyors, egyszerű és nagy mintaszámmal is kivitelezhető, vagyis legyen alkalmas highthroughput analitikai célok megvalósítására is. Az eljárás kidolgozásához a jól bevált szilárd fázisú extrakciós technikát kombináltam az atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs tömegspektrometriával. A szilárd fázisú extrakció folyamatának csak az utolsó, elúciós lépését kellett módosítani olyan módon, hogy az oldat fázisú minta helyett egy szabad felületen elhelyezkedő szilárd fázisú mintát kapjak. Így jött létre a szilárd fázisú extrakcióval kapcsolt deszorpciós elektrospray ionizációnak (SPEEDI: solid phase extraction enhanced desorption electrospray ionization) elnevezett módszer, melynek vázlatos működési elve az alábbi ábrán látható.

1.

2.

3.

fűtött gázcső ionforrás

oldószer

minta

forró nitrogén felső porózus membrán

deszorbeált ionok spray eluens gőze

+ +

+

adszorbens

alsó porózus membrán

eluens

10. ábra: A SPEEDI eljárás működése. Az eljárás három fő lépésből áll. Először a klasszikus szilárd fázisú extrakciós eljárás szerint az SPE töltet kondícionálása után a vizsgálandó anyagot felvittem az adszorbensre

38

folyadék fázisú minta formájában. A következő lépés a módszer kulcsa, a vizsgált vegyületet koncentráltam a töltet felett található frit felszínére úgy, hogy az egyik irányból oldószert áramoltattam keresztül a tölteten, míg a másik oldalon fűtött nitrogén áramot használtam az oldószer elpárologtatásához. A felületre rászárított mintát DESI technikával analizáltam.

3.1.2. Az SPE patron fejlesztése A mintavevő/mintahordozó SPE patron fejlesztésének első lépése az volt, hogy a kereskedelmi

forgalomban

kapható

szilárd

fázisú

extrakciós

eszközök

kínálatát

megvizsgáltam abból a szempontból, hogy melyik típus lenne alkalmas a tervezett feladatra. A deszorpciós ionizációs vizsgálat biztosításának igénye miatt fontos volt, hogy a töltetet lezáró legalább egyik frit (porózus polimerből készült lemez) hozzáférhető legyen a deszorpciós ionizációs analitikai nyaláb számára. A kereskedelmi forgalomban beszerezhető SPE patronok vázlatos felépítése az alábbi ábrán látható.

mintatartó

adszorbens töltet

polimer fritek

lueres csatlakozó

11. ábra: Kereskedelmi forgalomban kapható SPE patron vázlatos felépítése. Az ábrán látható felépítés a DESI analízis számára sajnos nem jelent megoldást, mivel a töltetet lezáró fritek a polipropilén cső belsejében helyezkednek el. Alternatívaként felmerültek egyéb, kereskedelmi forgalomban szintén beszerezhető SPE eszközök, amelyek nem a hagyományos módon két frit közé töltve tartalmazzák az SPE töltetet, hanem egy egységes üvegszál mátrixba ágyazva (12. ábra). Ezekben a patronokban a töltet, illetve a töltetet hordozó üvegrost hozzáférhető a deszorpciós ionizációs analitikai nyaláb számára. A kezdeti vizsgálatok azonban azt mutatták, hogy bár az analit elúciója sikeresen végbement a felületre, az eluált anyag jelentős része egyedi üvegszálakon illetve a töltetet körülvevő polipropilén cső peremén koncentrálódik, ami meglehetősen nehézzé teszi a deszorpciós

39

ionizációt azokban az esetekben, ahol nem illékony vegyületek kimutatása illetve meghatározása a cél.

üvegszállal elkevert szemcsés adszorbens

polipropilén mintatartó rész

12. ábra: Üvegszálas mátrixba ágyazott töltetet tartalmazó patron. Az SPEEDI patron fejlesztése során az első lépésként a kereskedelmi forgalomban kapható különböző fritanyagokat teszteltem. Különböző pórusméretű saválló acél (SS), polietilén (PE), poli-(vinilidén-difluorid) (PVDF), üveg, cellulóz, kevert cellulóz észter (MCE), Nylon és poli-(tetrafluor-etilén) (PTFE) fritanyagok álltak rendelkezésre. A tesztelés első szakaszában a különböző fritanyagok mintahordozókénti viselkedését vizsgáltam DESI ionizációs módszer esetében, rodamin 123, atrazin, cyclosporin A és angiotenzin II vegyületekkel. A vizsgálatok eredményeit a 2. táblázat tartalmazza. Minden vizsgálat esetében teszteltem a reprodukálhatóságot, a dinamikus tartományt és az abszolút kimutatási határt is. Az SS frit esetében az ionforrás módosításra szorult olyan módon, hogy az SS fritre mintegy 3-4 kV egyenfeszültséget kellett kapcsolni a megfelelő ionizációs hatásfok eléréséhez. Az eredményekből látható, hogy a PVDF, a cellulóz és a Nylon membránok további vizsgálata értelmetlen lett volna. A mérések tapasztalatai szerint ezek a fritanyagok ugyanis egyrészt irreverzibilisen kötnek bizonyos anyagokat (pl. PVDF-angiotenzin), másrészt megduzzadnak az ionizáció során használt oldószertől. Legjobbnak a PTFE és az üveg frit bizonyult, különös tekintettel az abszolút érzékenységre. Bár a reprodukálhatóság tekintetében a PTFE csak a harmadik legelőnyösebbnek bizonyult, mechanikai tulajdonságai és általános kémiai inertsége miatt a továbbiakban ezt használtam. Az SS frit – bár előnyös tulajdonságokat mutatott – kikerült az érdeklődési körből, ugyanis a tömegspektrométer atmoszférikus bemenetéhez közel elrendezett, magas elektromos potenciálon tartott fémeszköz folyamatos ívkisüléseket, valamint esetenként a perem körül kialakuló stabil koronakisülést eredményezett, amelyek egyrészt elektronikus zajt okoztak, másrészt veszélyeztették a tömegspektrométer kisfeszültségű tápegységének működését. Következő lépésként a fritanyagok oldószertűrését teszteltem. Mivel az MCE igen rossz oldószertűrési 40

sajátságokkal rendelkezik, ezért csak speciális esetekben lehetne alkalmazni. A deszorpciós ionizációs és az oldószertűrési kísérletek eredményeképpen három fritanyagot, a PE-t, a PTFE-t és az üveget használtam a további fejlesztési kísérletek során. Atrazin

Cyclosporin A

Angiotensin

Rhodamin

II

123

PE

79

83

66

108

Üveg

93

85

94

76

Cellulóz

65

25

27

46

MCE

40

56

54

21

Nylon

72

61

65

38

PTFE

112

105

128

141

PVDF

28

33

7

82

Saválló acél (SS)

69

85

92

90

2. táblázat: Különböző minőségű fritek tesztelésének eredményei; az értékek a standardnak számító tömör PTFE felülethez mért relatív érzékenységet mutatják. Az SPEEDI patron esetében – a kereskedelmi forgalomban kaphatókhoz hasonlóan – olyan eszközt terveztem, amely két részből, egy mintatartó és egy töltet tartó részből áll. A vákuum manifoldhoz történő egyszerű csatlakoztatás érdekében a töltet tartó rész kúpos geometriája (luer) célszerűnek tűnt, így végül az egyszerű, 1 ml-es polipropilén fecskendőre esett a választás. Annyi módosítást igényelt csak az eredeti állapotához képest, hogy a végét mindig pontosan ugyanannál a méretnél le kellett vágni. Így az eszköz előállítása teljesen reprodukálható lett. A luer részbe két 2 mm átmérőjű frit korong közé töltöttem az adszorbenst. A hengeres rész mérete lehetővé teszi pontosan 25 mg 40-60 μm átlagos szemcseméretű szilikagél betöltését, így a kísérletek jelentős részében 25 mg-os töltetekkel dolgoztam. Az eszköz felépítése a következő ábrán látható.

41

20 μm-es PTFE fritek

25 mg SPE töltet PP mintatartó rész

13. ábra: Az általunk fejlesztett SPE patron felépítése. A patronok összeállítása során az üvegfritek, nem megfelelő mechanikai tulajdonságuk következtében, általában nem tömítettek, és a minta illetve az elúcióhoz használt oldószer a frit mellett folyt ki, ezért végül a további kísérletekhez csak PE illetve PTFE friteket használtam. A fritek optimális pórusméretének meghatározásához többféle valós mintát használtam, különböző pórusméretű PE és PTFE fritekkel. Az alábbi táblázat az 1 ml minta átáramoltatásához szükséges időt mutatja másodpercben, 2 db egymás fölé rétegzett 2 mm átmérőjű friten keresztül, miközben a friteket tartó csővezeték vákuum manifoldhoz van csatlakoztatva, azaz a nyomáskülönbség ~ 1 bar. A teszteléshez tiszta vizet, felszíni vizet (Duna), vizeletet, vérplazmát, és szűrt gyümölcslevet használtam. Fritanyag PE

Pórusméret HPLC

Duna

Vizelet

Plazma

Szűrt

(μm)

víz

víz

gyümölcslé

0.1

15

> 600

130

> 600

> 600

0.22

12

> 600

15

> 600

310

0.45

4

> 600

10

> 600

150

1

4

> 600

3

> 600

20

2

2

95

3

430

12

5

2

40

3

380

15

10

1

25

2

320

8

20

1

10

2

370

3

42

PTFE

0.1

440

> 600

> 600

> 600

180

0.22

370

> 600

> 600

> 600

260

0.45

310

> 600

> 600

> 600

120

1

280

> 600

> 600

> 600

65

2

290

240

520

> 600

70

5

230

320

390

> 600

75

10

125

130

220

> 600

60

20

100

150

105

> 600

10

3. táblázat: A fritek pórusméretének optimalizálása. A mérési eredményekből egyértelműen kiderül, hogy a 0.45 μm alatti pórusméretű PTFE fritek nem használhatók lényegében egyik alkalmazásnál sem, míg a PE általában lényegesen nagyobb áramlási sebességet enged meg. Optimálisnak PE frit esetében az 1 μm – 20 μm tartomány tekinthető, míg PTFE esetében a 10 μm – 20 μm tartomány. Ebből a tapasztalatból kiindulva a további kísérleteknél általában a 20 μm pórusméretű friteket használtam. A 20 μm-nél nagyobb pórusméret esetében már az SPE töltet kis méretű frakciója képes eltömni a frit pórusait. A töltet esetében nem volt szükség az optimális anyagok egyedi megválasztására, ugyanis ebben az esetben is az SPE töltet ugyanazt a szerepet tölti be, mint a hagyományos SPE-töltet. Mivel mind az analitikai kémiában, mind a biokémiában, molekuláris biológiában, sőt még a sejtbiológia területén is a 8 x 12-es formátumú mintatartó plate-eket használják leggyakrabban, ezért a laboratóriumunkban megterveztünk és kiviteleztünk egy olyan plate-et, melyben elhelyezhető 96 általunk készített patron (14. ábra). A minták távolsága ebben a plate-ben egyezik a szabványos távolsággal. A mintatartó plate elkészítése azért volt fontos, hogy high-throughput méréseket is meg lehessen valósítani a kifejlesztett módszerrel.

43

14. ábra: 96 lyukú plate az SPE patronokhoz.

3.1.3. A SPEEDI-kártya fejlesztése A patron mellett felmerült egy kártya formátumú mintahordozó kifejlesztésének igénye, amely méretét tekintve megegyezik egy bankkártyával. A fő alkalmazási területe ennek a típusnak a központosított, minimálisan invazív orvosi diagnosztika területe lehetne. A beküldő intézmények ebben az esetben néhányszor 10 μl biológiai fluidomot, általában teljes vért vennének le a kártyára, hagynák megalvadni/megszáradni, majd postai úton juttatnák el a központi laboratóriumba. Itt történne a minta elúciója, majd a deszorpciós ionizációs tömegspektrometriás vizsgálata. A kártya fejlesztése során praktikus követelmény, hogy tartalmazzon valamilyen mintaazonosítót is. A kártyához felhasználtam a patron kifejlesztése során nyert tapasztalatokat. Egy polipropilén kártyába ágyaztam be az egyes esetekben porózus membránokkal határolt adszorbenst. Az esetenként több rétegű adszorbens beillesztése és rögzítése a maximálisan 2 mm vastag kártyába nem volt egyszerű feladat. Ennél a mintahordozó típusnál, ha lehet, még fontosabb a megfelelő adszorbens kiválasztása. A legegyszerűbbnek ezek közül az újszülöttkori anyagcsereszűrésben is használatos Whatman 903 szűrőpapír (cellulóz) bizonyult. A papírból 4 mm-es korongokat vágtam ki, majd a polipropilén kártyában kialakított 4 mm átmérőjű kerek lyukakba helyeztem, és további, előre lyukasztott PP fólia ráhelyezésével és rápréselésével rögzítettem. Az előre lyukasztott PP fóliák közül az egyiken 3.8 mm átmérőjű, míg a másik oldalra kerülő fólia esetén a lyuk átmérője csak 1 mm volt. A mintafelviteli oldalon értelemszerűen akkora lyukat kellett hagyni, hogy mindenképpen

44

megtartsa a szűrőpapír korongot, amíg azon az oldalon, ahol a vizsgálat történt, célszerű volt az elúciós felületet akkorára csökkenteni, amekkora területet a DESI ionforrás képes egyszerre vizsgálni a minta további mozgatása nélkül. A SPEEDI-kártyát a 15. ábra szemlélteti.

15. ábra: A SPEEDI-kártya. A szűrőpapírkorongokkal ellátott kártyára további, módosított cellulózból készült, peremén ragasztós csíkkal ellátott fedőfólia került. Mivel a sem a cellulóz, sem a véralvadékkal átitatott cellulóz nem ideális felület a DESI ionizáció számára, a szűrőpapírral ellátott kártya továbbfejlesztésének első lépése volt egy porózus, 10 μm vastag PTFE membrán behelyezése a szűrőpapír azon oldalára, ahol a deszorpciós ionizáció történt. Ilyen módon az elúció a PTFE felületre történik, majd az ionizáció is innen megy végbe. A különböző adszorbens kialakításokat az alábbi ábra mutatja. hidrofil PTFE 0,45 μm

cellulóz

hidrofil PTFE 20 μm

C18 SPE disc

hidrofób PTFE

16. ábra: A SPEEDI-kártyáknál használt adszorbens struktúrák. Amennyiben a mintafelviteli oldalra egy 0.45 μm pórusméretű hidrofil membránt helyezünk, a membrán képes visszatartani a vér sejtes elemeit, így a szűrőpapírra lényegében csak plazma kerül. A sejtes elemekben feldúsult vérminta a felületről letörölhető. Teszteltem 45

továbbá a hagyományos SPE töltetek kártyába történő beépíthetőségét is. A patronok esetében használt módszer ebben az esetben is alkalmazható, azonban a patronokban használt 1 mm-es fritvastagság ebben az esetben nem használható. A vékonyabb fritanyagok problémája a lecsökkent mechanikai stabilitás, ami egyrészt a minta szállításakor, másrészt pedig a minta elúciója során jelent problémát, ugyanis az oldószer tölteten való átpréselésekor a membránok átszakadhatnak. A probléma kiküszöbölésének érdekében az ún. SPE diszkek és „monolitikus” SPE töltetek esetében használt, felületmódosított üveg vagy kvarcgyapotba ágyazott SPE töltetet használtam. Ezen töltetek mechanikai stabilitása jó, és ilyen módon nem szükséges a vastag fritanyag használata. Az üvegszálas hordozóba ágyazott különböző töltetekkel sikerült megvalósítani a többrétegű adszorbenst tartalmazó eszközt is.

3.1.4. Az elútor egységek kifejlesztése A minta felvitelének és szárításának módja függ a mintaformátumtól. A patron esetében ezek a folyamatok vákuum manifoldban történnek, ahogyan a klasszikus szilárd fázisú extrakció folyamán is, majd ezt követően kerül a minta az elútor egységbe.

17. ábra: Patron formátumban történő mintaelőkészítés. A kártyák elúciója az ionforrásban történik olyan módon, hogy a kártyába épített adszorbenskorongon átáramoltatott folyadékot az ionforrásban használt nagy sebességű gázáram segítségével el lehet párologtatni. Ehhez egy olyan elútor és egyben mintatartó egység tervezésére volt szükség, amely a folyamat során végig rögzített állapotban tartja a kártyát, és biztosítja az oldószer hozzávezetést az elúciós lépéshez. Ezzel az egységgel

46

egyidejűleg egy minta elúciója és közvetlenül utána az analízise valósítható meg, de ezután elegendő a kártyát egyszerűen egy pozícióval odébb helyezni, hogy sorra kerülhessen a következő minta.

18. ábra: A kártyához használt elútor és mintatartó egység. A patron jellegű mintahordozók elúciójához azonban külön elútor egységet kellett tervezni. Az elúciós lépéshez, valamint a szárításhoz történő oldószer, illetve gáz hozzávezetést a következő ábrán látható hengeres, PEEK-ből (poly-ether-ether-ketone) készült betéttel oldottam meg, amely lényegében tökéletesen kitölti a patron mintatartó részét, minimálisra csökkentve a rendszer holttérfogatát. A patront egy luer csatlakozó méretű kúpos furattal ellátott alumínium tömb tartja az elúció során. A patron felfele néző végével szemben helyezkedik el a fűtött gázt kibocsátó, vörösréz csőből készült fúvóka. A fúvóka és a patron végének a távolsága egy csavar segítségével beállítható. A készülék vázlatos felépítését, valamint a fényképét a 19. ábra mutatja.

47

nitrogén

fűtött gázcső pozícionáló csavar

TC

minta

SPE patron

eluens

19. ábra: Az egycsatornás elútor felépítése. Szerves oldószerrel történik az elemzendő anyag elúciója a patront lezáró fritre, majd levegő segítségével ki kell űzni a patronból a benne levő szerves oldószer maradékát. Ez utóbbi lépés elmulasztása általában azt eredményezi, hogy az adszorbensben, illetve fritben maradt oldószer visszaoldja a felületen felhalmozódott elemzendő anyagot, a szembe fújt fűtött gáz pedig visszaszorítja az oldószert az adszorbens belsejébe. Ennek elkerülése érdekében az oldószert egy váltószelepen (Rheodyne, 6-port diverter valve) keresztül vezettem a patronba, amely A állásban az oldószert tartalmazó, fecskendőpumpába helyezett fecskendővel köti össze a patron betétjét, B állásban viszont az ugyanabba a fecskendőpumpába helyezett, levegőt tartalmazó fecskendővel köti össze a betétet. A tapasztalatok azt mutatták, hogy az oldószer kiűzésére nem használható szabályozott nyomású, gázpalackból nyert gáz, ugyanis a patron ellenállása annyira kicsi, hogy csak szabályozott áramlási sebességű, mintegy 50-100 μl/min gázáram az, ami lehetővé teszi az eltávolított oldószer tökéletes elpárologtatását. Ha ugyanis az oldószermaradék túl gyorsan

48

hagyja el a patront, akkor a hirtelen megjelenő oldószercseppet a fűtött gáz egyben lefújja a fritről, ami az elemzendő anyag teljes elvesztését jelentheti. A 96-os mintaformátum esetében az előzőekben ismertetett elútor egység természetesen nem használható. A mintahordozó eszköz ebben az esetben a 8 x 12 luer típusú lyukkal ellátott 1 cm vastag polimer tábla, amibe 96 db patron illeszthető be. Ehhez mintaformátumhoz egy 96 csatornás elútort építettünk.

20. ábra: A 96-os mintaformátumhoz tartozó elúciós berendezés. A 96-os plate-be 8 csatornás sorozatpipettával pipettáztam be az elúcióhoz szükséges oldószert (az előző módszerhez képest itt fordítva helyezkednek el a patronok), majd egy 96 lyukkal ellátott feltét segítségével, fecskendőpumpa által szabályozott áramlási sebességű levegővel nyomtam át a patronokon az oldószert, miközben a plate alatti, 96 lyukkal ellátott, szabályozottan fűtött alumínium tömbön keresztül fűtött gáz áramlott a patronokat lezáró fritekre. A gáz ebben az esetben levegő, amely egy nagy teljesítményű ventilátor segítségével áramlik keresztül a fűtött fémtömbön. A 96 csatornás elútor segítségével 96 db minta mintegy 3-5 perc alatt készíthető elő, ami mintánként 2-3 másodpercet jelent.

49

3.1.5. Műszeres eszközfejlesztés Az analízist két különböző tömegspektrométerrel végeztem. Az egyedi patronok mérése egy TSQ Quantum Discovery (ThermoFinnigan) típusú készülékkel, míg a 96-os plate mérése egy API 4000 Q-TRAP hybrid triple quadrupole/iontrap (Applied Biosystems/MDS Sciex) típussal történt. A TSQ készülék egy kereskedelmi forgalomban kapható DESI forrással volt felszerelve (OmniSpray, Prosolia). Ez a forrás a lehető legnagyobb flexibilitás érdekében kézi manipulátorokkal van ellátva, amelyek gondoskodnak az elektrospray, a minta és a tömegspektrométer megfelelő egymáshoz viszonyított pozíciójáról. A mintatartó, illetve az elektrospray három dimenzióban szabadon mozgatható, és ez utóbbi a tömegspektrométer ionoptikájának síkjában is tetszőleges szögben elforgatható, mivel az analitikai nyaláb becsapódási szöge igen fontos paraméter az atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs technikák esetében. A tömegspektrométer viszont eredeti formájában csak korlátozottan alkalmazható deszorpciós ionizációs kísérletekhez, mivel a fűtött kapilláris külső vége nagyon rövid, ezért szükség volt az atmoszférikus interfész módosítására. A módosított atmoszférikus interfész fejlesztése során első lépésként egy olyan saválló acél csatlakozót kellett kifejleszteni, amelynek segítségével tetszőleges hosszúságú 1/16 hüvelyk külső átmérőjű saválló acél cső csatlakoztatható a készülékhez, és használható atmoszférikus interfészként. Ezután viszont meg kellett oldani a meghosszabított saválló acél cső készüléken kívüli részének a fűtését. Ugyanis a fűtés hiánya két okból is megnehezíti az analízist. Egyrészt a fűtetlen szakasz illékony vegyületek esetében könnyen elszennyeződhet, így a minták közt nagy fokú keresztszennyeződés léphet fel. Másrészt a gázfázisú ionok fémfelületen történő semlegesítődésének folyamatát alapvetően meghatározza a felület hőmérséklete. A fűtést úgy lehetett megvalósítani, hogy a saválló acél csőre üvegszövetből készült harisnya került, majd erre egy fűtőellenállás lett rátekerve, amely mellé 100 Ohmos platina ellenálláshőmérőt rögzítettünk. A fűtőellenállást és a hőmérőt egy hőfokszabályozó egységhez kapcsoltuk, egy, a fűtőkörbe iktatott relé segítségével. A fűtött kapilláris interfész hőmérséklete ilyen módon elektronikusan szabályozhatóvá vált a szobahőmérséklet és 400°C között. A legtöbb ion esetében az optimális interfész hőmérséklet a 250–300°C tartományban volt.

50

eredeti Thermo fűtött kapilláris

új kapilláris

1/16” Swagelok nut

tetszőleges hosszú acélcső csatlakozó a tömegspektrométerhez

21. ábra: Az új és az eredeti atmoszférikus interfész kapilláris. A 96 férőhelyes mintaformátumhoz külön ionforrást is kellett építeni, amely a Sciex API 4000 Q-trap készülékhez lett megtervezve. A 96 férőhelyes mintaformátum mozgatása 2 db, számítógép által vezérelt lineáris mozgatóasztal (Newmark Instruments) segítségével lett megoldva, amely képes a 96 minta programozott egymás utáni vizsgálatának az elvégzésére. Mivel a készülék eredetileg nem fűtött kapilláris típusú atmoszférikus interfésszel működik, ezért itt szükséges volt egy teljesen új atmoszférikus interfész megtervezése és megépítése is.

TC

skimmer

Q0

IONOK fűtött kapilláris

Q1

PEEK ház

22. ábra: Az analízishez tervezett atmoszférikus interface vázlata. Az új ionforrás pedig a következő ábrán látható. Ezzel az összeállítással a 96 férőhelyes mintaformátum mintegy 5 perc alatt végigmérhető, ami mintánként 3-4 másodperces mérési időt jelent, így összességében 96 darab mintát nagyjából 10 perc alatt lehet előkészíteni és analizálni. Ez az időtartam, összehasonlítva egy HPLC módszer időigényével, abszolút versenyképes módszerré teszi a SPEEDI technikát a high-throughput analízisben.

51

23. ábra: Az általunk tervezett ionforrás felépítése.

3.2. Natív szövetminták vizsgálata DESI és REIMS módszerrel 3.2.1. Bevezető Doktori munkám másik részében a biológiai szövetek in situ vizsgálata állt a módszerfejlesztés középpontjában. A DESI módszer által biztosított lehetőséget, miszerint a módszer atmoszférikus nyomáson működik, szerettük volna kihasználni olyan módon, hogy létrehozunk egy rendszert, mely azonnali szövetazonosításra képes. Így akár egy műtét közben folyamatosan információt nyújthat a sebész számára a vágott szövet kémiai jellegzetességeiről, és így a szövet hisztológiai jellegéről. A kutatást elindító egyik elképzelés az volt, hogy ma a SIMS és a MALDI technikák esetében leginkább elterjedt módszert – a fehérjeösszetétel alapján történő azonosítást – elvetettük, és a tömegspektrometriásan egyszerűbben mérhető membránlipid összetétel alapján kívántuk elkülöníteni az egyes szövettípusokat. Az irodalmi adatok alapján a különböző szövetekre nézve a membránlipidek összetétele és aránya eltérő [120].

52

Az első kísérleteket során élelmiszeripari minőségű állati szövetmintákat vizsgáltunk DESI módszerrel. 885.55

100 95 90 85 80 75 70 Relative Abundance

279.23

100 95 90 85 80

55

887.55

50 45 40 30 25

70 Relative Abundance

60

35

255.23

75

65

20

65

723.48

15

810.53

766.54 738.50

60

10

55

5

50

0 700

714.50

747.51 764.52

720

740

760

780.51

857.51

808.54 812.53 794.53

780

800

834.52

820

851.59

840

883.53 861.55 860

904.86 917.54 928.86 940.88

880

900

920

940

979.80 961.95 960

990.60

980

m/z

45 535.47

40 35

885.55

559.47

30 25

303.23

20 15 221.08

10 5 0 100

200

498.29

327.23

157.12

607.47

453.36 300

400

583.47

500

600

723.48

700

857.51 810.53

800 m/z

928.86 979.80 1053.76 900

1000

1100

1210.49 1200

1334.83 1415.71 1300

1400

1500

24. ábra: Sertés máj DESI tömegspektruma (negatív ionmód). A mérések elsődleges célja az volt, hogy a spektrumban a glicerofoszfolipidek csúcsai jelenjenek meg azonosítható módon, ennek érdekében nagyfelbontású méréseket végeztem egy LTQ Orbitrap (ThermoFinnigan) készüléken. A keresett vegyületek a 700-1000 m/z tömegtartományban találhatók, az ábrán kinagyítva látható ez a rész. A glicerofoszfolipidek valóban láthatók és azonosíthatók a spektrumban, közülük a legjellemzőbb a 885.55, amely a foszfoinozitol (18:0/20:4) molekulához tartozik. A kisebb tömegtartományban pedig a zsírsavak csúcsai jelennek meg, például 255.23-nál a palmitinsav (16:0) és 303.23-nál az arachidonsav. A következő módszerfejlesztési lépés az élő szövetek analízise volt, melyet laboratóriumi patkányokon teszteltem. A tapasztalatok azonban azt mutatták, hogy az élő szövetekből DESI módszerrel foszfolipid spektrumot nem lehet előállítani. Ennek oka feltehetően az, hogy az elektrospray nem roncsolja szét kellő mértékben a sejteket ahhoz, hogy a foszfolipidek ionizációját lehetővé tegye. Az üzletben vásárolt szöveteket ezzel ellentétben minden esetben fagyasztva tároltam a mérések előtt, így a sejtek megfelelő 53

mértékű degradációja megvalósulhatott. A DESI technika tehát fagyasztott szöveti analízisre alkalmas, melyet irodalmi példák is igazolnak, azonban sajnálatos módon az in situ vizsgálatokat nem lehet ilyen módon megvalósítani. A probléma megoldása érdekében másik ionizációs technikát kellett találni, amely az ép sejteket szétroncsolja olyan mértékben, hogy az ionizáció végbemehessen. Ezenkívül az eszköznek kompatibilisnek kell lennie a sebészi munka folyamatával. Az in situ, illetve in vivo ionizáció megvalósítására potenciális módszer lehet a gyors termikus elpárologtatás. Szilárd fázisból keletkezett szerves ionok képződését, amely tisztán termikus folyamat eredménye volt, először Holland és munkatársai publikálták [121], majd ezután sikeres alkalmazásai is születtek a módszernek [93, 122-123]. A fűtés gyorsasága azért fontos szempont, mert megfelelő sebességnél a molekuláris elpárolgás összehasonlítható mértékű a bomlással, így számottevő mennyiségű gázfázisú molekula, illetve molekulaion keletkezik, vagyis alkalmas ionforrásnak a rendszer. A hatékony termikus elpárologtatási módszerek kutatása több, termikusan segített ionizációs módszer kidolgozását eredményezte, köztük a termospray ionizációt [124]. Mivel az ionok magasabb nyomáson nagyobb számú ütközésre hajlamosak, és ez a folyamat nem kedvező az analízis szempontjából, ezért úgy tűnik, hogy az atmoszférikus nyomású termikus elpárologtatás a megfelelő módszer, mivel ezen körülmények közt visszaszorul a termikus bomlás. Az atmoszférikus nyomású termikus deszorpciós ionizációnak napjainkban is születnek felhasználásai, például szerves kationok deszorpciója, minimális degradációval [94, 125]. Az úgynevezett elektrosebészetben elterjedt módszer a termikus elpárologtatás. Az elektrosebészet lényege, hogy az élő szövetbe kis felületen nagy frekvenciájú váltakozó áramot vezetnek, így a szövet vágását, illetve elpárologtatását, vagy koagulálását lehet megvalósítani. Az alkalmazott elektromos teljesítményt nem csak nagy frekvencián, de nagy feszültségen is közlik a biológiai szövettel. Ha csak a feszültség lenne nagy, járulékos problémák (pl. izomrángás, kémiai bomlás) lépnének fel. A szövet elektromos ellenállásának hatására az elektromos energia hővé alakul (disszipálódik), amely a szövet víztartalmának felmelegedését, majd végül felforrását okozza. Ha a termikus hatás kisebb mértékű, akkor a szövet fehérjéi denaturálódnak, ezt nevezik termikus koagulációnak. A diatermiás eszköznek általában két funkciója van, a vágás, amikor a termikus hatás nagyon gyors, a szövetet gyakorlatilag elpárologtatják; illetve a koagulálás, amikor a termikus hatás lassabb, és a bekövetkező koagulációt leginkább a vérzés megszűntetésére használják a sebészeti gyakorlatban. A gyakorlatban használt lézersebészeti eszközök alkalmazása úgyszintén a szövetek termikus evaporációján alapul, ugyanis ebben az esetben általánosságban 10.6 μm 54

hullámhosszon dolgozó szén-dioxid lézert használnak. Az infravörös tartományban működő lézer lényegében mellőzi a fotokémiai effektusokat, és a diatermiához hasonlóan tisztán termikus kölcsönhatásba lép a szövetekkel. A további kutatás alapja az a megfigyelés volt, hogy a biológiai szövetek gyors termikus elpárologatása a fő szövetalkotókból, így a foszfolipidekből is gázfázisú molekula ionokat hoz létre. Ez alapján célszerűnek látszott a használatban lévő sebészeti eszközöket felhasználni a módszer fejlesztéséhez. A tömegspektrometriás és a sebészeti eljárások kombinációja lehetőséget nyújt arra, hogy in situ analízis történjen egy sebészeti műtét során. Mivel a módszer kulcsa a gyors elpárologtatás, ezért a technikát „Gyors Elpárologtatású Ionizációs Tömegspektrometriának” neveztük el (REIMS: rapid evaporative ionization mass spectrometry). A kutatás során különböző, a gyakorlatban használt sebészi eszközök és a tömegspektrométer között hoztunk létre kapcsolatot. A különböző eszközökkel történő vágás során a szövet elroncsolódik, és a roncsolódás során képződött ionok tömegspektrometriás elemzésével nyerünk információt a szövet típusát illetően. A tömegspektrometriás vizsgálat optimális kivitelezéséhez új típusú interfész építésére volt szükség, amely alkalmas a vágási folyamat során keletkező minta valós idejű ionizációjára.

3.2.2. Az interfész kifejlesztése, optimalizáció A módszer lényege tehát, hogy ionforrásként a sebészeti eszköz szolgál, amely lehet diatermiás vágóeszköz vagy CO2 lézer. Arra a kérdésre kellett először megoldást találni, hogy a vágás során keletkező ionok milyen módon jussanak be a tömegspektrométerbe. Erre a célra alkalmasnak bizonyult a Bernoulli törvény alapján működő Venturi-cső. A Bernoulli törvény azt mondja ki, hogy egy közeg áramlásakor (a közeg lehet folyadék vagy gáz is) a sebesség növelése a nyomás csökkenésével jár. Ez alapján a Venturi-cső úgy működik, hogy egy szűkülő keresztmetszetű csőben nagy sebességű nitrogén gáz áramlik, és az áramlás felgyorsulása a szűkebb résznél az oldalról csatlakozó csőben nyomásesést, vagyis szívó hatást okoz. A cső szerkezete az alábbi ábrán látható.

55

nitrogén

szívó hatás

25. ábra: A Venturi-cső keresztmetszete. A kifejlesztett technika teljes működése a következő: az elektrosebészeti eszközzel való vágás során keletkező aeroszolt, mely tartalmaz ionokat is, a Venturi-szivattyú segítségével elszívjuk egy tefloncsövön keresztül. Az ionok bekerülnek a tömegspektrométer belsejébe, míg a semleges részecskéket a készülék ionoptikája kiszűri.

56

tube lens

Venturi-cső

skimmer

fűtött kapilláris

nitrogén

teflon cső

elektrokauter

aeroszol

biológiai szövet

26. ábra: A REIMS módszer működésének vázlata. Az első kísérletek célja az volt, hogy a módszerhez egy optimálisan működő rendszert sikerüljön összeállítani. Ehhez először szükség volt egy megfelelő Venturi-szivattyúra, illetve egy csőre, mely összeköti a tömegspektrométerrel, így biztosítva az ionok továbbítását a sikeres analízis érdekében. A kereskedelmi forgalomban beszerezhető Venturi-csövek közül több típust is teszteltem a következő szempontok alapján: méret, a szívóerő függése a nitrogén nyomásától, tisztíthatóság. Ez utóbbi tulajdonság azért került be a választási szempontok közé, mert a vágás során keletkező nagy mennyiségű aeroszol gyorsan elszennyezi a szivattyú, majd ezután a készülék alkotórészeit, így viszonylag gyakran kell tisztítani a rendszert. Az alábbi fényképen látható az összeállított rendszer a Venturi-szivattyúval, illetve az atmoszférikus interfésszel.

57

27. ábra: A Venturi-forrás képe. Az ionok továbbítására szolgáló elszívócsőként flexibilis és szintén könnyen tisztítható csövet célszerű használni, így a polietilén (PE), illetve a teflon (PTFE) jöhetett szóba. Mivel a csőben bekövetkezhet a keletkezett ionok rekombinációja, így a tömegspektrometriás jel intenzitása a cső hosszának növelésével esik. Ezért a következő feladat a cső anyagának és az optimális (a laborkísérletekhez), illetve a maximálisan alkalmazható (műtéti alkalmazáshoz) csőhossz meghatározása volt. Az eredményeket a 4. táblázatban foglaltam össze. Élettartam alatt a tisztítás nélkül a cső eldugulásáig eltelt időt értettem. A mérések eredményéből kiindulva az 1/8 hüvelyk átmérőjű PTFE cső használata mellett döntöttem, a laborban végrehajtott kísérletekhez pedig mindig 50 cm hosszúságú csövet használtam. Anyag

Külső átmérő

Belső átmérő

Hosszúság

Átlagos ion

Élettartam

intenzitás

(perc)

8

PE

1/16 hüvelyk

0.5 mm

50 cm

12x10

10

PE

1/16 hüvelyk

0.75 mm

50 cm

11x108

12-15

PE

1/16 hüvelyk

1 mm

50 cm

11x108

20-25

PTFE

1/16 hüvelyk

1 mm

50 cm

11x108

25-30

PTFE

1/8 hüvelyk

2.4 mm

50 cm

10x108

50-60

PTFE

1/8 hüvelyk

2.4 mm

100 cm

9x107

50-60

PTFE

1/8 hüvelyk

2.4 mm

150 cm

7x107

50-60

PTFE

1/8 hüvelyk

2.4 mm

200 cm

4x107

50-60

PTFE

4 mm

3 mm

50 cm

10x108

20-25

4. táblázat: Az elszívócső paramétereinek tesztelése. 58

Az itt bemutatott eredmények az Erbotom ICC 350 (ERBE Elektromedizin GmbH) típusú diathermiás sebészeti vágóeszköz használatával születtek (a készülék max. 300 MHz frekvencián működik). A fejlesztés során más típusokat is kipróbáltam, mindegyik alkalmas volt spektrumfelvételre, a spektrális sajátságok készülékfüggőnek, illetve paraméterbeállítás függőnek bizonyultak, ám a szövetfelismerés hatékonyságát nem befolyásolták. A kipróbált elektrosebészeti eszközök mindegyikén a 30-90 W vágóteljesítmény tartomány volt a megfelelő a mérésekhez. A megfelelő alkatrészek kiválasztása után a következő feladat az optimális geometriai paraméterek beállítása volt. Ezek a paraméterek a következők: a Venturi-forrás kimenetének távolsága a tömespektrométer atmoszférikus interfészétől, illetve a forrás beesési szöge. Az értékek megfelelő beállításával érhető el a spektrumban a legkedvezőbb jel/zaj arányt, mivel ilyen módon bizonyos mértékben csökkenthető a tömegspektrométer belsejébe bejutó szennyezők mennyisége. Az optimalizációs kísérletek során 2 bar nitrogénnyomás mellett a forrás beesési szögének nagysága 75°-nak adódott, míg a forrás és a készülék távolsága 2-3 cm esetén volt a legjobb, így a további kísérletek során ezekkel a beállításokkal dolgoztam. A szöveti analízist egy LCQ Deca XP (ThermoFinnigan) típusú készüléken végeztem. A tömegspektrométer beállításait olyan módon határoztam meg, hogy standard mintának választottam a sertés májszövetet, amely egyrészt a leginkább homogén szöveti jellegű szerv, másrészt nagyobb mennyiségben rendelkezésemre állt. Májszövet analízis során határoztam meg, hogy a jelintenzitás milyen módon függ a készülék különböző paramétereinek beállításától. Az optimális készülék beállításokat negatív ionmód esetére az alábbi táblázatban tüntettem fel. Készülék paraméter

Optimális érték

Kapilláris hőmérséklet

200 °C

Kapilláris feszültség

- 10 V

Tube Lens Offset

- 30 V

Ion injektálási idő

10-500 ms

5. táblázat: Optimális készülékbeállítások az LCQ Deca XP készülékre. A készülékbe jutó ionok mennyiségét szabályozó úgynevezett ion injektálási idő optimális értéke szövetenként nagyon eltérő, 10-500 ms között változhat. Az ion injektálási idő azt az időintervallumot jelöli, amennyi ideig a tömegspektrométer gyűjti az ionokat 59

analízis előtt. Nagy ion injektálási idő esetén sokáig gyűjti az ionokat, így az ionok összes intenzitása megnő, azonban egy bizonyos határ felett ez a spektrum csúcsainak összeolvadásához vezet, vagyis romlik a jel minősége. A paraméterek optimális beállításai nem jelentenek feltétlenül globális optimumot, különösen nem a vágási teljesítmény és az ion injektálási idő értékeinek az esetében, hanem egyes szövet típusokra érdemes az optimumot meghatározni. Például májszövet vágásához elég 30 W teljesítmény és 10 ms ion injektálási idő, míg ez a beállítás a izomszövet esetében nem bizonyult megfelelőnek. Izomszövet vágása esetén 90 W vágóteljesítmény és a 250 ms ion injektálási időt találtam optimálisnak. Az ion injektálási idő változtatása egy bizonyos határig nem befolyásolja a méréseket, mert az csak az ionok mennyiségét növeli meg és nem torzítja a spektrumot. Az adatok összehasonlítása pedig normalizált spektrumokon történt, pontosan azért, hogy az egyes spektrumok közötti intenzitás különbség ne befolyásolja az eredményeket. A diathermiás vágóeszköz teljesítményének változtatása pedig egy szükséges lépés a megfelelő vágás biztosítása érdekében, ami szintén nem változtatja meg kedvezőtlenül az eredményeket, esetleg részletgazdagabb spektrumokat ad, ami kifejezetten segíti az adatok feldolgozását.

60

4. Eredmények 4.1. A SPEEDI módszer 4.1.1. Optimalizálás egycsatornás elúcióra Az első kísérleteket, valamint a szisztematikus optimalizálást egy festékanyaggal, a Rodamin 116-tal végeztem. Azért esett a választásom erre a vegyületre, mert egyrészt szabad szemmel nagyon jól látható (ami hasznos az elúciós paraméterek optimalizációjánál), piros színű, másrészt tömegspektrometriásan is jól detektálható. A vegyület szerkezete az alábbi ábrán látható.

O OH

H3C

N H

O

CH3 NH+

28. ábra: A Rodamin 116 szerkezete. Az elúciós folyamat optimalizálandó paraméterei a következők: a fűtött gáz (nitrogén) hőmérséklete és áramlási sebessége, az eluáló szerves oldószer típusa és áramlási sebessége, a fúvóka és a patron távolsága, valamint a maradék oldószert kiűző levegő áramlási sebessége. Az optimalizációs kísérleteket 100 ng festékanyag 10 ml vízben való feloldásával végeztem. A legjobb elúciós oldószernek a Rodamin 116-hoz a metanol bizonyult, szilika alapú, C18 oldalláncokat tartalmazó adszorbens esetén. A megfelelő oldószer kiválasztását minden esetben a megfelelő adszorbens réteggel rendelkező vékonyréteg kromatográfiás lapon történő futtatással oldottam meg. Először meghatároztam azt az oldószer mennyiséget, ami az összes oldatban lévő, meghatározni kívánt anyagmennyiség felületre való feljuttatásához szükséges. Ez a mennyiség leginkább az eluáló oldószer és az analit polaritásától és H-kötésre való hajlamától függ, de kisebb eltéréseket okozhat a longitudinális diffúzió jelensége is. A

61

szükséges elúciós térfogatot a konkrét oldószer-analit-adszorbens rendszerhez hozzá lehet rendelni, és ezután annak az oldószer mennyiségnek a meghatározása következett, amely elpárologtatható időegység alatt a frit felszínéről. Az alábbi grafikonok esetében a mért eredmények a Rodamin 116 metanollal történt elúciójából származnak. Ha az optimalizációs folyamat során, egy jól kiválasztott gáz hőmérsékletnél elkezdtem növelni az eluens áramlási sebességét, akkor egy bizonyos sebességig a párolgás sebessége a felületen szintén nőtt. De egy jól definiált áramlási sebességnél a frit felületén kialakult egy összefüggő folyadék film, és egy katasztrófajelenség következett be, a felületen lévő anyagot újra feloldotta az oldószer, a gázáram pedig szétfújta a folyadékot. Ezt a folyamatot szemlélteti a 29. ábra. A képen látható, hogy így az összes anyag a frit szélére kerül, így a DESI vizsgálatra alkalmatlan lesz a minta (29. ábra c). A 30. ábrán látható az elúcióhoz szükséges idő a folyadék áramlási sebesség függvényében. A kisebb áramlási sebességeknél az ideális görbétől való eltérést a longitudinális diffúzió okozza. A nagyobb áramlási sebességeknél pedig egyszer el kell érni ahhoz a határhoz, amikor már nem képes több oldószer elpárologni a felszínről, ezt neveztem a maximális párolgási kapacitásnak, és ez meghatározza az elúcióhoz szükséges minimális időtartamot, mivel a szükséges térfogat már előzőleg meghatározott mennyiség. A maximum párolgási kapacitás (MER: maximum evaporation rate) tehát az időegység alatt, egységnyi felszínről elpárologtatható térfogat az adott folyadékra nézve. Ebből következik, hogy ez az érték függ a folyadék fajtájától, a párologtatást segítő gáz hőmérsékletétől és áramlási sebességétől. A 31. ábra grafikonján az elpárologtatható mennyiségeket láthatjuk a gáz áramlási sebességének függvényében, különböző hőmérsékleteken. Piros vonal jelzi a MER értéket. Egyértelmű, hogy minél nagyobb a gáz sebessége, annál több oldószert képes elpárologtatni, és minél nagyobb a hőmérséklete, annál gyorsabb a párolgás. De bizonyos áramlási sebesség felett már nem nő tovább a párolgási kapacitás, és ez az érték jelenti a módszer maximális analitikai áteresztőképességét.

62

gas

a.

2.5E+06

relatív intenzitás

2.0E+06

1.5E+06

1.0E+06

5.0E+05

0.0E+00

b.

0.2

0.4

0.6

gas

0

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

frit átmérője (mm)

1.2E+06

relatív intenzitás

c.

gas

1.4E+06

1.0E+06 8.0E+05 6.0E+05 4.0E+05 2.0E+05 0.0E+00 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

frit átmérője (mm)

29. ábra: Az elúció lehetséges eredményeinek összehasonlítása a maximum párolgási sebesség alatti (a), illetve feletti (b és c) értékeknél. Látható tehát, hogy a módszer korlátja az eluens áramlási sebessége, pontosabban maximum párolgási kapacitás. Tehát az optimálás fő feladata mindig az volt, hogy a lehető legnagyobb áramlási sebességet megtaláljam az egyes oldószerekre, a megfelelő gáz hőmérséklettel és gáz áramlási sebességgel együtt.

63

30. ábra: A maximum párolgási kapacitás függése a folyadék áramlási sebbességétől és az elúciós időtartamtól.

31. ábra: A folyadék áramlási sebessége a gáz áramlási sebességének függvényében, különböző hőmérsékleteken (metanol oldószerrel). Az optimális értékeket, melyek a Rodamin 116 metanolos elúciójára vonatkoznak, a 6. táblázatban foglaltam össze. Ezekkel a beállításokkal egy patron elúciója 1.5 perc alatt megvalósulhat.

64

180 μl

Eluens térfogata

200 μl/min

Eluens áramlási sebessége

200 °C

Gáz hőmérséklete

3000 ml/min

Gáz áramlási sebessége Oldószer maradékát kiűző levegő áramlási

100 μl/min

sebessége

6. táblázat: A Rodamin 116 elúciójára vonatkozó optimális paraméterek. Ahhoz, hogy a módszert rutinanalitikai, illetve high-throughput alkalmazásokban lehessen alkalmazni, szükséges volt kvantitatív mérési lehetőségek kidolgozása is. Már a DESI módszerrel történt vizsgálatok eredménye is azt mutatta, hogy korrekt kvantifikálás csak olyan módon valósítható meg, hogy az analithoz kémiailag nagy mértékben hasonló belső standardet a még folyadékfázisú mintához adjuk. Ilyen módon a belső standard elkeveredik a mintával, és az analit molekuláéhoz hasonló körülmények között ionizálódik. Ezt az elvet alkalmaztam a SPEEDI módszerrel végzett kvantitatív vizsgálatok során is, és a Rodamin 116-hoz a Rodamin 123-t választottam belső standardként.

O OMe

H2N

O

NH2+

32. ábra: A Rodamin 123 szerkezete. A megfelelő belső standard kiválasztásához szintén a vékonyréteg kromatográfiás futtatást alkalmaztam a további kísérletek esetében is. Ennél a vizsgálatnál is 10 ml térfogatú vizes mintákkal dolgoztam. Az optimális elúciós körülmények között végeztem a minta előkészítését. A Rodamin 116-ra nézve a 0.3; 1.0; 3.0; 10.0; 20.0; 30.0 ng/ml-es koncentrációknál vettem fel a mérési pontokat. A Rodamin 123 belső standard koncentrációja

65

15.0 ng/ml volt. Az alábbiakban látható a két vegyület tömegspektruma, valamint a felvett kalibrációs görbe.

358.89

100 95 90 85 80 75 70

Relative Abundance

65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 336.76 337.32

15

359.38 344.75

10 346.78 5

300.77

310.78

331.86 335.15

317.23 321.08

338.02

352.73

359.73 367.02 369.19

0 305

310

315

320

325

330

335 m/z

340

345

350

355

360

365

370

33. ábra: A Rodamin 116 tömegspektruma.

66

p

[

]

345.31

100 95 90 85 80 75 70

Relative Abundance

65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 344.82

15 10 5

337.18 300.70

315.27 319.19

331.86

337.39

345.80 346.01

353.36

367.30

0 310

320

330

340

350 m/z

360

370

379.27 385.01 392.86 395.31 380

390

400

34. ábra: A Rodamin 123 tömegspektruma. A kalibrációs egyenes pontjainak mérése során nem Full Scan üzemmódban mértem, hanem SRM-ben (Single Reaction Monitoring), melynek során csak kiválasztott ionok, és a legjellemzőbb fragmenseik közti átmenetek intenzitását mérjük. A Rodamin 116 esetében ez az átmenet a 359→272, míg a Rodamin 123 esetében a 345→285.

67

terület R116 / terület R123

7 y = 0.1978x - 0.0248 2 R = 0.9999

6 5 4 3 2 1 0 0

5

10

15

20

25

30

35

c R116 / c R123 (ng/ml)

35. ábra: SPEEDI módszerrel felvett kalibrációs egyenes vizes oldatból Rodamin 116-ra.

4.1.2. Valós minták mérése, optimalizálás 96 csatornás elúcióra A Ciklosporin A nevű gyógyszer hatóanyag egy 11 aminosavból álló ciklopeptid, immunoszupresszáns hatású, szervátültetés után adják a pácienseknek a kilökődés megakadályozására. Tömegspektrometriásan jól detektálható. A kimutatási határa a DESI módszerrel végzett analízis során 1000 ng/ml körüli értéknek adódott, ami azért problematikus, mivel a terápiás koncentrációja plazmában 50-500 ng/ml-ig terjed. Így adott volt a lehetőség egy gyakorlati probléma megoldására az általam fejlesztett módszer segítségével. Az első feladat a megfelelő belső standard kiválasztása volt. A kezdeti kísérleteket a Valinomicin nevű, hasonló szerkezetű ciklopeptiddel végeztem.

68

1133.60

100

1149.99

95 90 85 80 75

Relative Abundance

70 65 60 55 50 45 40 1224.69

35 30 25 20

1129.26

1212.37

1142.92

15 10 5

1165.39

1119.74

1240.37 1244.64 1254.23

1184.57 1195.07

1273.13

1288.82

0 1120

1140

1160

1180

1200 m/z

1220

1240

1260

1280

1300

36. ábra: Ciklosporin A mérése Valinomicin belső standard alkalmazásával. Ahogy a spektrumon is látható, ezek a vegyületek szívesen képeznek adduktot alkáli fémekkel. Az 1134-nél, illetve az 1150-nél látható csúcsokat a Valinomicin, az 1224-nél és 1240-nél láthatókat a Ciklosporin A nátrium ionnal, illetve kálium ionnal képzett adduktjai adják. Az ionizáció szempontjából láthatóan megfelelő belső standard lett volna a Valinomicin, ám az elúciós kísérletek azt mutatták, hogy a vegyületek szerkezete mégsem mutat elég hasonlóságot. A legjobban alkalmazható belső standard végül a Ciklosporin D nevű vegyület lett, amelyet a gyógyszerszint meghatározásának HPLC-s módszereiben is használnak [126]. Vizelet vagy plazma mintákhoz hozzáadtam a Ciklosporin A (CsA), illetve a Ciklosporin D (CsD) megfelelő mennyiségű vizes oldatát úgy, hogy a minta végső térfogata 1 ml legyen. A szilika alapú C18-as adszorbenst tartalamzó SPE-patront először 0.5 ml metanollal, majd 0.5 ml metanol – víz 5:95 eleggyel kondícionáltam, majd a minta felkerülése után 0.5 ml metanol – víz 5:95 eleggyel mostam, és hagytam kiszáradni teljesen. Az elúció optimális paramétereit és a készülékbeállításokat a következő táblázatban foglaltam össze.

69

Elúciós paraméterek: Eluens: hexán – izopropanol 1:1 Eluens térfogata: 180 μl Gáz hőmérséklete: 150 °C Készülék paraméterek: Spray beesési szöge Felület-spray távolság Felület-tömegspektrométer bemenetének távolsága Spray feszültség Nitrogén nyomása Spray oldószer Spray oldószer áramlási sebessége Ion mód Kapilláris feszültség

TSQ Quantum

API 4000 QTRAP

60°

60°

~2 mm

~2 mm

~2 mm

~2 mm

4000 V

3000 V

7 bar

8 bar

metanol – víz 1:1

metanol – víz 1:1

2 μl/min

10 μl/min

pozitív

pozitív

30 V

300 V (declustering potential)

Kapilláris hőmérséklet

300 °C

180 °C

Tube lens offset

100 V

-

7. táblázat: A Ciklosporin A elúciós paraméterei és a készülékbeállítások. Ahogy a táblázatban is látható, a méréseket két készüléken végeztem. Az egycsatornás elúcióval előkészített minták mérése a TSQ Quantum készüléken történt. Ugyanolyan paraméterek mellett sikerült a 96 csatornás formátumban is a minták előkészítése, és mivel az ehhez tartozó ionforrás a másik készülékhez lett tervezve, ezért ezeket a mintákat az API 4000 QTRAP tömegspektrométerrel analizáltam. A felvett kalibrációs görbék a következő ábrákon láthatók. Spike-olt humán plazma, illetve vizelet mintából is sikerült kalibrációs egyenest felvenni úgy, hogy SIM (Selected Ion Monitoring) üzemmódban mértem, melynek során csak kiválasztott ionok intenzitását méri a készülék. Az általam megadott tömegtartományok a következők voltak: 1202.5-1203.9 (CsA+H+); 1224.5-1225.9 (CsA+Na+); 1240.5-1241.9 (CsA+K+); 1216.5-1217.9 (CsD+H+); 1238.5-1239.9 (CsD+Na+); 1254.5-1255.9 (CsD+K+). Ezek közül minden esetben csak a Na-adduktokra vonatkozó arányt használtam fel a

70

kalibrációs egyeneshez, mert ezek voltak a legintenzívebb csúcsok, és így volt a legkisebb az adatok szórása.

6

terület CsA/terület CsD

5

4

3

2

y = 0.0024x + 0.1905 R2 = 0.9999

1

0 0

500

1000

1500

2000

2500

cCsA (ng/ml)

37. ábra: Kalibrációs egyenes vizelet minták Ciklosporin A tartalmának méréséhez, a TSQ készülékkel mérve (BST: Ciklosporin D, 250 ng/ml).

71

1224.9

2.6e5 2.5e5 2.4e5 2.3e5 2.2e5 2.1e5

1225.9

2.0e5 1.9e5 1.8e5 1.7e5 1.6e5 In te n sity, cp s

1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1240.8

1.0e5 9.0e4

1226.8

8.0e4 7.0e4

1241.8

6.0e4 1238.9

5.0e4

1239.8

4.0e4 3.0e4 2.0e4

1216.8 1209.81212.9

1217.8

1215.5 1215.0

1.0e4 1210

1215

1242.8

1227.9

1220

1228.7 1222.9 1225

1254.8 1229.7

1230

1236.9 1235

1238.0 1240

1244.21245.0

1255.2

1245 1250 m/z, amu

1255

1257.9 1260

1263.2 1264.3 1270.6 1272.6 1265

1270

1275

1279.81282.8 1284.5 1280

1285

38. ábra: Ciklosporin A tömegspektruma az API 4000 QTRAP készüléken mérve Full Scan üzemmódban.

72

8 7

terület 1225 / terület 1239

6 5 4 3 y = 0.0741x - 0.2075 R2 = 0.999

2 1 0 0

20

40

60

80

100

120

cCsA (ng/ml)

39. ábra: Kalibrációs egyenes vizelet minták Ciklosporin A tartalmának méréséhez, az API 4000 QTRAP készülékkel mérve (BST: Ciklosporin D, 25 ng/ml).

73

3

terület CsA/terület CsD

2.5 2 1.5 1

y = 0.0209x + 0.3042 R2 = 0.998

0.5 0 0

20

40

60

80

100

120

cCsA (ng/ml)

40. ábra: Kalibrációs egyenes plazma minták Ciklosporin A tartalmának méréséhez, az API 4000 QTRAP készülékkel mérve (BST: Ciklosporin D, 25 ng/ml). A TSQ Quantum tömegspektrométerrel készült mérések esetén a vizeletmintákból a következő koncentrációknál vettem föl a pontokat a kalibrációs egyeneshez: 20, 40, 200, 400 és 2000 ng/ml. Mivel az API 4000 QTRAP készülék jobb érzékenységi paraméterekkel rendelkezik, illetve a terápiás koncentráció értékek miatt is a kisebb koncentráció tartományra szerettem volna nagyobb figyelmet fordítani, ezért ezeknél a méréseknél kisebb koncentráció értékeket választottam. A vizelet mintáknál: 5, 10, 20, 50 és 100 ng/ml, a plazma mintáknál pedig: 2, 10, 20, 40 és 100 ng/ml. Az adatok azt is mutatták, hogy a módszer alkalmazható a terápiás koncentráció tartományában, mivel a kimutatási határ a SPEEDI módszerrel 100 pg/ml-nek adódott, ami egy

nagyságrenddel

alacsonyabb,

mint

a

legkisebb

terápiás

dózis.

A

mérés

reprodukálhatósága is megfelelő, 50 ng/ml-nél átlagosan 10.3 %-nak adódott a standard deviáció, ez összehasonlítható a jelenleg Ciklosporin A detektálásra használatos ELISAmódszerével. Az optimalizáció után összehasonlító méréseket végeztem az általam fejlesztett SPEEDI módszer és a DESI technika között, melynek során a Ciklosporin A szintjét spike-olt humán plazma mintákból mértem. A DESI analízis esetében 1 μl mintát cseppentettem fel és szárítottam rá a porózus PTFE fritre, míg a SPEEDI módszer mintaelőkészítéséhez 100 μl plazma mintát használtam fel. Az alábbi ábrán látható a mért eredmények összefoglalása. A 74

grafikonon logaritmikus skálát használtam, mert így szemléletesebb a módszerek közti különbség.

1E7

SPEEDI/DESI Direct DESI

Integrált csúcsterület

1000000

100000

10000

1000

100 10

100

1000

10000

Koncentráció (ng/ml)

41. ábra: A DESI és SPEEDI módszerekkel mért CsA analízis eredménye. Az ábrán feltüntetett mérési eredményekből az derül ki, hogy a direkt analízis érzékenysége nagyjából két nagyságrenddel kisebb abban a tartományban (3-30 μl/ml), ahol mindkét módszer lineáris; amely különbség abból adódik, hogy a SPEEDI módszerben a felületre ennyivel több analit kerül a mintaelőkészítés során. A következő ábrán pedig a módszerek kimutatási határát ábrázoltam a minták térfogatának függvényében. Érthető módon a DESI analízis esetében a minta térfogata nem lehet nagyobb 1-2 μl-nél, mivel a felcseppentés és megszárítás folyamata egyébként nem lenne megfelelő az analízishez. Ezért az egyenes, amely a grafikonon látható, egy elméleti munkavonal, melyet a valódi mérési eredményekből extrapoláltam. A DESI módszer dinamikus tartományát tehát korlátozza a felcseppentéses mintafelvitel, míg a SPEEDI módszerrel felvett pontok egyenest alkotnak a 10 ng/ml – 30 μg/ml koncentrációs tartományban. Látható, hogy kis mintatérfogatnál az analízis érzékenysége jobb a SPEEDI esetében. Ennek egyik oka az SPE-effektus, vagyis a minta elválasztása a mátrixtól a tölteten, a másik ok pedig, hogy koncentráljuk a mintát a felületre. Nagyobb mintatérfogatoknál a DESI jobb lenne mint a SPEEDI, de ezt a kísérletet 75

nem érdemes elvégezni a már említett ok miatt. A DESI hatékonysága abból adódna ebben az esetben, hogy az SPE töltet már telítődik ekkora térfogatnál a mátrix és a minta

Kimutatási határ (ng/ml)

komponenseivel és nem képes több anyagot adszorbeálni.

Minta térfogata (μl)

42. ábra: A kimutatási határ mintatérfogattól való függése a DESI és a SPEEDI módszerek esetében. A következő vegyület, melynek mérése környezetvédelmi okokból fontos, az atrazin volt. Ezt a triazin vázas molekulát növényvédőszerként alkalmazták sokáig, de az Európai Unióban az 1990-es években betiltották a használatát.

Cl

H N

N N

N HN

43. ábra: Az atrazin szerkezete.

76

Felszíni vizekből azonban még ma is sok helyen kimutatható, ezért szükséges módszer fejlesztése a kimutatására. Belső standardnak a simazin nevű, hasonló szerkezetű vegyületre esett a választásom, amely megfelelőnek bizonyult mind az elúció, mind az ionizáció szempontjából. 10 ml vizes oldatból indult a mintaelőkészítés, az elúció 200 °C-os gázhőmérséklet mellett 200 μl metanollal történt. Az analízis paraméterei ugyanazok voltak, mint a Ciklosporin A esetében. Az alábbi ábrákon látható az atrazin és a simazin tömegspektruma, valamint a felvett kalibrációs egyenes, amelynek felvételekor MRM üzemmódban dolgoztam, és az atrazinra a 216→174, simazinra pedig a 202→132 átmenet intezitását mértem.

216.1

9.0e5 8.5e5 8.0e5 7.5e5 7.0e5 6.5e5 6.0e5

In te nsity, cp s

5.5e5 5.0e5 4.5e5

202.1

4.0e5 3.5e5 218.1 3.0e5 2.5e5

247.2

204.1

2.0e5

217.1

1.0e5

219.1 221.1

203.1

5.0e4 191.2 195.0 190

202.4 197.1 198.1 199.1

195

200

205.2

209.1 210.1

214.2 215.2

210.5 209.7 213.7 205

210

215

245.3 249.2

228.2 225.1

1.5e5

218.8

223.1

220.2 222.1 224.2 220 m/z, amu

225

231.1 226.2 227.7

229.3 233.2 235.2 237.2 232.2 234.6 230

236.1 235

240.2 241.2 240.6 240

243.2

248.2

244.2 242.6 245

247.6 250

44. ábra: Atrazin és simazin tömegspektruma az API 4000 QTRAP készüléken.

77

4 3.5

terület atrazin /terület simazin

3 2.5 2 1.5

y = 0.115x + 0.1295 R2 = 0.9982

1 0.5 0 0

5

10

15

20

25

30

35

catrazin /csimazin (ng/ml)

45. ábra: Kalibrációs egyenes vízminták atrazin tartalmának méréséhez, az API 4000 QTRAP készülékkel mérve (BST: simazin, 25 ng/ml).

4.1.3. Mérések kártyaformátumban A kártya formátumban történő mintaelőkészítés optimalizációja szintén a Ciklosporin A analízisével történt. 10-1000 ng/ml koncentrációjú spike-olt humán plazma mintákat használtam három különböző módon előkészítve. Kontrollként egyszerű, szűrőpapírra felcseppentett minták szolgáltak. A kártyában pedig kétféle megoldást alkalmaztam, egyszer csak magából a szűrőpapírból eluáltam az analitot, másodszor pedig a szűrőpapír fölötti PTFE membránra történt az elúció. A kártya formátumú mintahordozóra minden esetben 20 μl mintát cseppentettem fel, a felesleget letöröltem, majd egy órát hagytam száradni. Az elúció 50 μl aceton – izopropanol eleggyel történt. A mérési eredményekből levont tapasztalatokat a 8. táblázatban foglaltam össze. A szűrőpapír esetében a direkt felületi analízis azért nem ad megfelelő értékeket, mert az analit felületi eloszlása nagyon egyenetlen, ami több tényezőnek is köszönhető, például a szűrőpapír inhomogenitásának. Az elúció ezen tényezők nagy részét 78

kiküszöböli, de a szűrőpapír inhomogenitása ellen a legjobb megoldás a SPEEDI-kártya, melyben az elúció során az analit a PTFE membránra kerül át. A relatív standard deviációs értékek a kártya esetében is bizonyítják, hogy a kvantitatív analízishez szükséges a belső standard alkalmazása. A kártya esetében azonban nem szükséges a belső standardot még a folyadék

mintához

hozzáadni.

Ugyanis

a

kártyára

felvitt

vérminta

mennyiségét

tömegméréssel meghatároztam, és a mért értékek eltérése 5%-on belül volt. Ami azt jelenti, hogy ez a mennyiség reprodukálható, és így a belső standard hozzáadható a már megszárított mintához is. A táblázat utolsó sorában látható értékeket ezzel a módszerrel kaptam, és látható, hogy a relatív standard deviáció ilyen módon a legkedvezőbb. Szűrőpapír Kimutatási határ (ng/ml) Relatív standard deviáció

Szűrőpapír

SPEEDI-kártya

elúcióval

elúcióval

800

120

50

45%

18%

12%

26%

12%

4.2%

Belső standard nélkül CsD belső standarddal

8. táblázat: A SPEEDI-kártya összehasonlítása a hagyományos szűrőpapíron történt direkt analízissel, illetve elúciós analízissel Ciklosporin A mérésekre. A kártya formátumú mintahordozó eszköz elsődleges alkalmazási területe az orvosi diagnosztika lehet, ezért egy ilyen alkalmazást teszteltem az új módszerrel. A szűrőpapíron beszárított vérmintákat legelterjedtebben az újszülöttkori anyagcsere-betegség szűrésnél használják, de már egyre több alkalmazási területe van ennek a mintatípusnak. Az újszülöttkori anyagcsere-betegségek szűréséhez a laboratóriumba érkezett mintákból egy 4-6 mm átmérőjű korongot vágnak ki, melyet metanollal extrahálnak, majd a beszárított extraktumot sósavas butanollal butil-észterezik, ismét szárazra párolják, majd az acetonitrilvíz elegyben felvett mintát elektrospray ionizációs tandem tömegspektrometriával analizálják. A módszer meglehetősen körülményes és időigényes, így ennek a kiváltására szerettem volna kidolgozni a SPEEDI-kártyás technikát. A mérésekhez egyik oldalon PTFE membránnal

79

borított Whatman 903 szűrőpapírt tartalmazó kártyát használtam. A kártyára 20 μl friss, alvadásgátló mentes teljes vért vittem fel, majd azt a mennyiséget, amit a korong nem szívott be, letöröltem a felületről. A vért alvadni hagytam 1 órára, majd 10 μl sósavas butanolt cseppentettem rá, és mikrohullámú sütőben megszárítottam. A száraz kártyát a mintatartóba helyeztem, és 50 μl metanollal eluáltam, miközben 100 ml/min szobahőmérsékletű nitrogént fújattam rá. A mérés során aminosavakat és acil-karnitineket kell detektálni, mert ezek vérből mért koncentrációjának normálistól való eltérése utal az anyagcsere rendellenességekre. A mérés MRM (Multiple Reaction Monitoring) módban történt, melynek során összesen 73 darab átmenet intenzitását mértem. Az alábbi ábrákon láthatók egy egészséges vérmintából felvett aminosav, illetve acil-karnitin spektrumok.

592 550

500

450

400

350

300

250

200

150

100

50

0

132.1/76.0

174.2/72.1 146.1/44.0

191.2/89.1 186.1/84.0

206.1/104.1 191.2/72.1

231.2/70.1 238.1/136.1 260.2/158.1 146.0/90.0 222.2/120.1 232.2/113.1 246.2/144.1 459.3/70.1 192.0/90.0 Q1/Q3 Masses, amu

46. ábra: Aminosavak mérése szárított vérmintából SPEEDI-kártyás módszerrel.

80

392 380 360 340 320 300 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

218.2/85.1 274.2/85.1 300.2/85.1 316.3/85.1 360.2/85.1 374.3/85.1 424.3/85.1 444.4/85.1 472.4/85.1 496.4/85.1 508.4/85.1 260.2/85.1 288.2/85.1 304.2/85.1 344.3/85.1 370.3/85.1 400.3/85.1 428.4/85.1 456.4/85.1 482.4/85.1 500.4/85.1 Q1/Q3 Masses, amu

47. ábra: Acil-karnitinek mérése szárított vérmintából SPEEDI-kártyás módszerrel. A fenilketonuria (PKU) a leggyakrabban előforduló anyagcsere rendellenesség, melynek során a fenilalanin felhalmozódik a vérben, és az agyra kifejtett mérgező hatása miatt értelmi visszamaradottságot okoz. Az alábbi ábrán látható egy fenilketonuriás vérminta mérési eredménye. A 222→120 átmenet tartozik a fenilalaninhoz.

81

2400 2300 2200 2100 2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

132.1/76.0

174.2/72.1 146.1/44.0

191.2/89.1 186.1/84.0

206.1/104.1 191.2/72.1

231.2/70.1 238.1/136.1 260.2/158.1 146.0/90.0 222.2/120.1 232.2/113.1 246.2/144.1 459.3/70.1 192.0/90.0 Q1/Q3 Masses, amu

48. ábra: Fenilketonuriás minta tömegspektruma.

82

4.2. A REIMS módszer 4.2.1. Az ionizáció mechanizmusának tanulmányozása Az elektrosebészeti szöveti elpárologtatás mechanizmusának alapja a Joule-hő általi felmelegedés, melyet az elektromos áram bevezetése indukál a szövetben. Ez okozza a víztartalom elpárolgását és termikus ionizációját, végül pedig bekövetkezik a szövet degradációja, melyet az intenzív üregesedés és a buborékok kiszakadása okoz. Az ionképződés két különböző módon valósulhat meg. Az egyik elmélet szerint semleges molekulák lépnek ki a gázfázisba, ahol az ionizált vízmolekulákkal protontranszfer reakcióba lépnek. A folyamat fenntartásához nagy mennyiségű ionizált víz jelenléte szükséges, ezért a fenti mechanizmus szerinti ionképződés valószínűleg megjelenik az elektrosebészeti folyamatban. Ez az út az atmoszférikus nyomású kémiai ionzációhoz (APCI) hasonlít. A pozitív ionmódban 369.3522 m/z-nél megjelenő molekulaion, amely a [koleszterin+H]+-H2O addukt, alátámasztja ennek a mechanizmusnak a végbemenetelét. Az alternatív mechanizmus a szövet gyors termikus elpárologtatásán alapul, amely rendszer ebben az esetben semleges és ionos molekulák vizes oldatának tekinthető. Mivel a párolgás és a hőbomlás sebessége összemérhető, ezért mind az analit molekulaionok, mind az elsőrendű hőbomlásból származó molekulák jelen lesznek a gázfázisban. Ez az út a termospray ionizációhoz hasonlít, melynek során az oldatfázisban képződött ionok lépnek közvetlenül a gőztérbe. Számos [M-H]- foszfoetanolamin (PE) ion és PE-NH3 típusú molekula megjelenése a spektrumban kapcsolatba hozható ezzel a mechanizmussal. A PE és PE-NH3 ionok intenzitása összemérhető, mely nagyfokú hődegradációra utal a gázfázisú ionképződés mellett. A PE [M-H]- ionok ammónia vesztése nem figyelhető meg MS/MS mérések során, tehát ez a folyamat valószínűleg még a gázfázisú ionképződés előtt végbemegy.

Hasonló,

hőbomlásból

származó

molekulák

jelenléte

figyelhető

meg

foszfoinozitolok esetén is, melyekből víz lép ki hő hatására. Lizofoszfolipidek szintén származhatnak termikus degradációs folyamatból. Ezek esetében a viszonylag kisfokú hőbomlás (a detektált ionok legnagyobb mennyisége kapcsolatba hozható az intakt foszfolipid molekulaionokkal) összefüggésben van a kísérlet során alkalmazott atmoszférikus nyomással. Az analit molekula ionok ezen körülmények között ütközések során (collisional cooling) kinetikus energiát vesztenek, ilyen módon az esély a gázfázisú degradációra csökken. További vizsgálatokat végzetem a feltételezés bizonyítására, valamint a kétfajta vázolt mechanizmus

83

ionképződési folyamathoz való hozzájárulásának tisztázására. Alternatív eljárásokat próbáltam ki a termikus elpárologtatásra. Az egyik eljárás az egyenáramból származó Joulehővel történő melegítés volt, a másik pedig a tisztán termikus hőközlési folyamat. Mindkét eljárást teszteltem korona kisüléses posztionizációval, illetve anélkül is. Különböző vizes oldatokkal teszteltem az összeállításokat: anilin, bradikinin, fenilalanin, foszfoetanolamin, bradikinin+PE, illetve homogenizált májszövet oldatával. Az anilin hexánnal készült oldatát is megvizsgáltam a közvetlen fűtéses módszerrel. Az egyenárammal történő termikus elpárologtatás esetén jelentősen kevesebb ionizált vízmolekula képződése várható, mint amikor rádiófrekvenciás váltóáramot használunk (ami az intenzív elektromos kisülések hiányából adódik), de még mindig több, mint a tiszta hőközlés esetén (T ≤ 400°C). Ahogyan az alábbi táblázatban is látható, posztionizáció hiányában a bradikininből és a fenilalaninból molekulaionok keletkeznek. A PE mix is molekulaionokat ad (protonált, illetve deprotonált), és negatív módban ammóniavesztés is tapasztalható. Minta típusa

Joule-hő

Közvetlen fűtés

Korona

kisüléses

posztionizáció Anilin hexánban

-

-

[M+H]+ / -

Anilin vízben

[M+H]+ / -

[M+H]+ / -

[M+H]+ / -

Fenilalanin

[M+H]+ / [M-H]-

[M+H]+ / [M-H]-

[M+H]+ / [M-H]-

vízben Bradikinin (BK)

[M+H]+, [M+2H]2+ / [M+H]+, [M+2H]2+ / [M-H]-

[M-H]-

Glicero-

[M+H]+ / [M-H]-,

[M+H]+

foszfoetanolamin

[(M-NH3)-H]-

[(M-NH3)-H]-

/

[M-H]-, [M+H-141]+ /

ok keveréke (PE

FA [M-H](16:0, 18:0, 18:1, 20:4)

mix) BK+PE

PE: [M+H]+ / [M-H]-, PE: [M+H]+ / [M-H]-, [M+H-141]+ / [(M-NH3)-H]-

[(M-NH3)-H]-

FA [M-H]-

BK:-

BK:-

(16:0, 18:0, 18:1, 20:4)

9. táblázat: A különböző termikus elpárologtatási módszerek során keletkezett ionok típusai.

84

Az intakt és a hődegradációt szenvedett foszfoetanolaminok aránya erősen függ az

Intenzitás

elpárologtatás hőmérsékletétől, ahogyan a következő ábrán látható.

Hőmérséklet (°C) 49. ábra: Az intakt és hődegradációt szenvedett foszfoetanolaminok keletkezésének hőmérsékletfüggése. Azok a minták, melyek PE, illetve PE+BK keveréket tartalmaztak, ugyanolyan spektrumot szolgáltattak, vagyis a bradikinin még ekvimoláris mennyiségben sem volt detektálható. A jelek intenzitása erősen függött a minták pH-jától is. A fenilalanin molekulaionjainak intenzitása a pH függvényében az alábbi ábrán látható.

85

Intenzitás

pH 50. ábra: A fenilalanin molekulaionjainak pH-függése. Az ionok intenzitása erősen lecsökkent az izoelektromos pontnak megfelelő pH tartományban, amely a fenilalanin esetében pH = 5.5 . Ez a megfigyelés igazolta, hogy az oldatfázisban történő disszociáció kapcsolatba hozható a spektrumban megjelenő csúcsokkal. Az összes minta esetében megfigyelhető volt valamilyen összetett pH függés. Annak érdekében, hogy ez az összefüggés világosabb legyen, megvizsgáltam az anilin 10 mM-os hexános oldatát a közvetlen fűtéses módszerrel (mivel ez a minta nem vezeti az elektromos áramot, ezért Joule-hő nem keletkezhet benne). Az eredmények azt mutatták, hogy a hexános oldat gyors termikus elpárologtatásakor nem képződnek ionok, ez a tapasztalat is alátámasztja azt a feltételezést, hogy az ionok már a kondenzált fázisban jelen vannak, és az elpárologtatás során jutnak a gázfázisba. A korona kisüléses posztionizáció a fenilalanin és az anilin oldatok esetében molekulaionokat eredményezett, mivel a folyamat mechanizmusa feltehetően kémiai ionizáció, mely az ionizált oldószermolekulák segítségével megy végbe, ez jelen esetben a víz. A PE és a PE+BK minták mérésekor karboxilát és lizofoszfolipid fragmensek képződését tapasztaltam. A homogenizált májszövet analízisekor számos kisebb molekulatömegű ion (nagyrészt [M-H]- típusú zsírsav ion) képződött, és a 600-as m/z felett nem is jelentek meg

86

csúcsok a spektrumban. A legintenzívebb jel a 369.3522 m/z-nél látható koleszterin csúcs volt. Ezek a megfigyelések arra engednek következtetni, hogy az ionizált víz molekulák jelenléte nem szükséges a foszfolipidek elektrosebészeti ablációjához, habár a potenciális szerepük az ionizációban nem zárható ki teljes mértékben. Ha a kondenzált fázisú mintát, mely szolvatált ionokat tartalmaz, gyors termikus elpárologtatásnak vetjük alá, akkor párhuzamosan történik a gázfázisú ionok képződése és a hődegradáció. Az alkalmazott hőmérséklet mértéke befolyásolja a kétféle termék keletkezésének arányát. Fontos befolyásoló tényező lehet még a gázfázisú részecskék ütközések általi energiavesztése (collisional cooling) atmoszférikus nyomáson. Ugyan nem történt még próbálkozás arra, hogy REIMS méréseket alacsonyabb nyomáson hajtsanak végre, de feltételezhető, hogy a gyors ütközéses energiavesztés atmoszférikus nyomáson előnyös folyamat, ami hozzájárul a termikusan képződött molekulaionok nagyszámú túléléséhez.

4.2.2. Az ionforrás optimalizációja egészséges állati szövetekre A kísérleti részben bemutatott optimalizált paraméterek mellett értékelhető, reprodukálható eredmények születtek. Az alábbi ábrán látható egy tipikus sertés májszöveti spektrum.

723.53

100 95

699.53

90 85

725.60

749.60

80 75 885.60

Relative Abundance

70 65 60 55 50 727.60

45 35

721.53

30

737.60

25

673.53

20

770.53

713.67

15

687.53

10 5

766.60

697.60

40

617.07 629.67

642.33

773.53

810.47 794.60 820.53 834.47

657.67

861.53 849.40

868.67

890.53

0 620

640

660

680

700

720

740

760

780

800

820

840

860

880

900

m/z

51. ábra: Egy tipikus májszöveti spektrum elektrokauterrel vágva, negatív ionmódban.

87

A membránlipidek elsősorban 600-900 m/z között találhatók, ezért a spektrumok felvételét nagyrészt erre a tartományra szűkítettem le a vizsgálatok során. Először különböző sertés szervek szöveteit vizsgáltam, ugyanolyan kísérleti körülmények között. A vizsgálatok során beigazolódott hogy a különféle szövetek membránlipid összetétele nagymértékben specifikus. Az eredményeket mutatja a következő ábra.

Intenzitás

Intenzitás

Intenzitás

Inetnzitás

Intenzitás

600 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 600

650

700

750

800

850

750

800

850

hasnyálmirigy

vese

máj

tüdõ

lép

650

700

m/z

52. ábra: A különböző sertés szervekből felvett spektrumok összehasonlítása. Az ábrán látható tömegspektrumokon szabad szemmel is látható különbség van a különböző csúcsok egymáshoz viszonyított arányában, azonban az adatok összehasonlítására matematikai alapú módszert is alkalmaztam, melyet a következő részben mutatok be. A

88

következő lépés a módszer fejlesztésében azonban a csúcsok azonosítása volt. Ehhez nagy felbontású tömegspektrométerre volt szükség, mivel a pontos tömeg ismerete nagyban megkönnyíti a molekulatípus tömeghez való egyértelmű hozzárendelését. A nagy felbontású mérések egy LTQ Orbitrap Discovery (ThermoFinnigan) típusú tömegspektrométerrel készültek. Az alábbi ábrákon láthatók a negatív, illetve pozitív ionmódban rögzített, standardnak választott sertés máj szövetről készült felvételek.

699.4919

100

725.5073 749.5067

95 90 85 766.5331

80

885.5433

75

Relative Abundance

70 65 60 55 50

713.5074

45

742.5332

40 794.5641

35 30 687.4916

25

775.5211

673.4764

20

880.5925

15 642.4824

10 5

834.5968 810.5233

607.4645

894.5920 911.5627

863.5579

659.4689

939.4755

0 600

620

640

660

680

700

720

740

760

780 m/z

800

820

840

860

880

900

920

940

53. ábra: Nagy felbontású tömegspektrum negatív ionmódban sertés máj szövetről.

89

806.5036

100 95 90 85 80 628.6086

75

Relative Abundance

70

782.5641 772.5781

65

815.6229 839.6202

60 55 50

746.5638

45

737.4448

40 653.3544

35

855.6253

30 25 20

533.5079

15 10

879.6254 895.6548

688.6649 602.5947

504.0207

541.5466

667.3897

590.4533

919.6629

716.5198

947.6840

5 0 500

550

600

650

700

750

800

850

900

950

m/z

54. ábra: Nagy felbontású tömegspektrum pozitív ionmódban sertés máj szövetről. A csúcsok egyértelmű azonosításához fragmentációs (MS/MS) méréseket is végeztem. Negatív módban a zsírsavból származó RCOO- ionok alapján, pozitív módban pedig a [M+HRCOOH]+ ion tömege alapján történt az azonosítás az esetek többségében. A pontos tömegmérések esetén a pontosság minden esetben 1 ppm alatt volt. Az eredményeket az alábbi táblázatban foglaltam össze.

Pozitív ionmód Foszfatidil-kolinok (PC)

16:0, 16:1, 18:1, 18:2, 20:4, 20:2, 20:3, 22:6

Foszfatidil-etanolaminok (PE)

14:0, 16:0, 16:1, 18:1, 18:2, 20:4, 20:2, 20:3 22:6

Szfingomielinek (SM)

18:0, 18:1, 20:4, 22:6

Trigliceridek (NH4+ adduktok)

16:0, 16:1, 18:1, 18:2, 20:4, 20:2, 20:3 22:6

Negatív ionmód Zsírsavak

2:0, 3:0, 4:0, 8:0, 8:1, 10:0, 10:1, 12:0, 12:1, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 20:2, 20:3, 20:4, 22:6

90

Foszfatidil-etanolaminok (PE)

14:0, 16:0, 16:1, 18:1, 18:2, 20:4, 20:2, 20:3 22:6

Foszfatidil-etanolaminok –NH3 (PE-NH3)

ugyanazok, mint a PE-k esetében

Foszfatidil-szerinek (PS)

16:0, 18:1, 18:0

Foszfatidil-inozitolok (PI)

16:0, 18:0, 20:4

Plazmalogének

16:0, 18:1

Foszfatidsavak

16:0, 18:1, 18:0

10. táblázat: A spektrumok alapján eddig azonosított vegyületek listája.

4.2.3. Szövetek azonosítása főkomponens analízissel A főkomponens analízis (PCA: principal components analysis) a többváltozós statisztikában gyakran alkalmazott matematikai eljárás. A lényege, hogy úgy redukálja az adatok mennyiségét, hogy közben minél kisebb legyen az információ veszteség, ami úgy valósulhat meg, hogy a nagyszámú korreláló változók számát le kell csökkenti kisebb számú korrelálatlan változóra. Ez úgy történik, hogy meg kell keresni a minta kovariancia mátrixának (ha standardizált adatok vannak, akkor a korrelációs mátrixának) a sajátértékeit, majd azokat a főkomponenseket el lehet hanyagolni, amelyek az adatoknak csak csekély arányú varianciáját magyarázzák. A 600-900 tömegtartományban felvett tömegspektrum 300 dimenziós

adatnak

minősül

matematikai

szempontból,

amennyiben

egységnyi

tömegfelbontással dolgozunk. A PCA analízis végeredményeképpen a dimenziók számát lecsökkentjük kettőre, illetve háromra, ezeket szemléltetjük az alábbiakban bemutatott ábrákon. Az adatok feldolgozásához egy erre a célra megírt szoftvert használtam. Az alábbi ábrán látható az előzőekben bemutatott öt különböző, sertésből származó szövet PCA-val végzett kiértékelésének eredménye.

91

hasnyálmirigy

máj tüdő

lép

vese

55. ábra: Különböző sertés szövetek spektrális különbségének szemléltetése PCA módszer segítségével. A REIMS módszer és a PCA analízis segítségével a szerven belüli különbségek is jól szemléltethetők, ahogyan az alábbi ábrán látható a vese különböző részei esetében.

92

vesemedence

vesevelő

vesekéreg

56. ábra: A vesében található különböző szövettípusok PCA kiértékelése. A legtöbb kísérletet a diathermiás sebészeti eszközzel végeztük, volt lehetőségünk azonban egy sebészeti széndioxid lézer (Dream Pulse 3 system) tesztelésére is. A készüléket 10 ms-os impulzus szélesség és 100 ms-os impulzus intervallum mellett maximum 30 W teljesítménnyel használtuk. A mérési tapasztalatok, összhangban az előzetes feltételezésekkel, azt mutatták, hogy a két technika által szolgáltatott adatok eltérnek egymástól, ugyanis a spektrumokat a PCA kiértékelési módszerrel el tudjuk egymástól különíteni. A lézer technika alkalmazásával, a lézersugárzás természetéből adódóan, rövidebb működési idő alatt hatékonyabb a szövet vágása, illetve elpárologtatása, ami ráadásul több ion képződésével jár együtt. Így a lézer vágás során felvett spektrumok ugyanazokat a csúcsokat tartalmazzák eltérő intenzitással, emellett, emellett a jel/zaj arány csökken. A kifejlesztett módszer szempontjából azonban a spektrumok reprodukálhatóak, tehát szintén alkalmasak szövetazonosításra. Az alábbi ábránkon sertés máj szövet lézeres vágással készült spektruma, illetve PCA kiértékeléssel különféle sertés szövetek, különböző technikákkal előállított spektrumainak összehasonlítása látható.

93

767.47

737.60

100 95 90 85

723.47

80

713.53

75

Relative Abundance

885.47

743.60

70

770.47

699.40

65 60

794.67

55

687.53

50 45

763.47

685.60

40

751.47

35 30

775.53

806.40

849.80

876.67 874.20 865.27

891.93

633.33

20 15 10

834.33

671.40

25

816.47 773.60

611.47

647.47

661.33

5 0 620

640

660

680

700

720

740

760

780

800

820

840

860

880

900

m/z

57. ábra: Sebészeti lézerrel készült sertés máj szöveti spektrum, negatív ionmódban.

ELEKTROKAUTER tüdő

vesevelő vesemedence vesekéreg

máj LÉZER

58. ábra: Elektrokauterrel és sebészeti széndioxid lézerrel vágott szövetek spektrumbeli eltérései PCA módszer segítségével szemléltetve.

94

4.2.4. A táplálkozás hatása a szövetek foszfolipid összetételére A szöveti foszfolipid összetétel nagymértékben specifikus az adott szövet sejttípusaira, ez elengedhetetlen a megfelelő membránműködés szempontjából. Emellett a bizonyos zsírsavakban gazdag táplálkozás kismértékben képes befolyásolni az összfoszfolipid-tartalom zsírsavösszetételén keresztül a membránlipid kompozíciót. A szakirodalomban erre a jelenségre számos példa található [127], így számunkra a kérdés az volt, hogy a különböző diéták a szöveti spektrumokat milyen mértékben befolyásolják. Ennek érdekében egy 10 hetes, zsírsavfelvételt monitorozó kísérletsorozatot végeztünk patkányokon. A kísérletben 60 darab Wistar patkány vett részt, ezeket húszas csoportokra elkülönítve, különböző takarmányokkal etettük a kísérlet ideje alatt. Az első csoport kontrollként teljes értékű alaptakarmányt, a második csoport telített zsírokban gazdag (sertészsírral átitatott) alaptakarmányt, harmadik csoport pedig telítetlen zsírsavakban gazdag (étolajjal átitatott) alaptakarmányt a kapott. A különböző takarmányok zsírsav profilját GCMS méréssel állapítottuk meg, az eredmények a következő táblázatban láthatók. Telítetlen

Kontroll

Zsíros

Olajos

0 (telített)

19

31

11

1

27

32

28

2

24

20

25

3

12

6

10

4

18

11

26

kötések száma

11. táblázat: A patkánytakarmányok százalékos zsírsav összetétele. Az első hét után minden héten csoportonként két egyedből történt in vivo mintavétel, különböző szervekből: máj, szív, vesék, lép, tüdő, herék. A műtét egy része mély narkózisban történt, az előzetesen lemért tömegű állatokat intraperitoneálisan adott, testsúlyuknak megfelelő mennyiségű fenobarbitál injekció segítségével altattuk el. A szív kauterezése előtt az állatot intrakardiális KCl injekcióval extermináltuk. A mintavételt az optimalizációnál leírt körülmények között végeztük, ERBE ICC 300 diathermiás készülékkel és LCQ Deca XP

95

tömegspektrométerrel. Minden szervből a méretétől függően 20-30 másodpercnyi spektrum került felvételre. Ezeket, normalizálás után, főkomponens analízis segítségével értékeltük ki.

59. ábra: Szívből és májból készült felvételek PCA elemzésének eredménye. Méréseink alapján kiderült, hogy REIMS módszerrel is kimérhetőek a szélsőséges táplálkozás hatásai a szövetek foszfolipid összetételére. Ezek az eltérések azonban nem befolyásolják a szövetazonosítást. Az egyes szerveken belül a táplálkozási csoportok statisztikailag elkülöníthetőek voltak. Legszélsőségesebb eredmények a szív esetében mutatkoztak, ez összefüggésben van a szív fokozott zsírsav metabolizmusával [128]. A máj esetében, a várttal ellentétben, nem volt nagy különbség az eltérő zsírsav összetételű táplálékot fogyasztó csoportok között. A táplálkozási csoportok közötti különbségek ellenére nem látszik indokoltnak bármilyen korrekciót alkalmazni a szövetfelismerés során, mivel a leírt eltérések nem befolyásolják a szövetek foszfolipid spektrum alapján történő elkülönítését.

4.2.5. Tumoros szövetek vizsgálata A kifejlesztett módszert, elképzeléseink szerint, a rákos daganatok műtéti eltávolításában lehetne elsősorban felhasználni. Egyrészt a kimetszés közbeni folyamatos szövetazonosítás jöhet szóba, illetve a tumor eltávolítása után a tumorágy szondázása. Az előzőekben leírtak alapján a tumoros szövetek is specifikus foszfolipid profillal rendelkeznek,

96

ugyanis ezek a sejtek a kiindulási szövethez képest más differenciáltsági szinten állnak, emellett számos egyébb funkcionális változáson mentek keresztül, ami miatt külön szövettípusként kezelhetőek. A REIMS módszer előnye az alternatív, szövetanalízisre használt tömegspektrometriás technikákkal (pl. DESI, MALDI) szemben, hogy nincs szükség nagyfeszültség alkalmazására, nagysebességű gázáramra, illetve nem igényel mintaelőkészítést. A sebész munkafolyamatát a tömegspektrometriás adatgyűjtés közvetlenül nem befolyásolja, a kissé módosított vágóeszközön kívül nem kell egyéb eszközöket használnia. Az első tumor minták vizsgálatát ex vivo végeztük, a minták állatorvosi műtétek során eltávolított daganatokból származtak. A tumoros minták mindegyike kutyákon végzett műtétek során keletkezett. Ahogy az alábbi ábrán is látható, a főkomponens analízis segítségével az egészséges és a rákos szövet jól elkülöníthető egymástól.

60. ábra: Kutyából származó egészséges és tumoros szövetek 3 dimenziós főkomponens analízise. A következőkben sor került in vivo mérésre is, melynek során a tumor eltávolítását diathermiás vágóeszközzel végezte a sebész, miközben a tömegspektrometriás adatrögzítés folyamatosan zajlott. A műtét során az izmokat infiltráló mastocytomát a szövetazotosítás

97

segítségével sikerült épszélben kimetszeni. A kutya egy 4 év körüli kaukázusi juhász, 6 héttel a műtét után teljesen tünetmentes.

61. ábra: Tumor és a körülötte lévő szövet spektrális különbségének szemléltetése PCA módszerrel és fényképen (1: izom, 2: bőr, 3: bőr alatti kötőszövet, 4: tumor).

98

5. Következtetések Doktori munkám során olyan módszerek fejlesztésén dolgoztam, melyek a biológiai minták analízisének gyakorlatát egyszerűbbé, gyorsabbá és költséghatékonyabbá tehetik. A szilárd fázisú extrakcióval kapcsolt deszorpciós elektrospray ionizációs módszerrel a biológiai fluidumok vizsgálata hatékonyan megvalósítható. A kifejlesztett kártyaformátum vagy

akár

a

–

diagnosztikai

laboratóriumokban

gyakorlatban

használt

–

96-os

mintaformátumú típus a laboratóriumi diagnosztikában alkalmazható, a tömegspektrometriás detektálás érzékenysége összehasonlítható a jelenlegi LC-MS/MS módszerekével, miközben az egy mintára jutó analízis idő a töredékére csökken (2-8 másodperc/minta). A kifejlesztett mintaelőkészítési módszer kombinálható egyéb, az irodalmi bevezetőben bemutatott atmoszférikus nyomású ionizációs technikákkal is, ami szélesíti a módszer alkalmazási területét. A gyors elpárologatáson alapuló direkt tömegspektrometriás szövetvizsgálat alapvetően új módszer az in vivo vizsgálatok területén. A bemutatott kísérleti adatok alapján egyértelműen

megállapítható,

hogy

a

technika

teljes

mértékben

kompatibilis

az

elektrosebészetben, illetve a lézersebészetben alkalmazott orvosi eszközök használatával, valamint a mért adatok és azok kiértékelési algoritmusa alkalmas az egészséges és tumoros szövetek azonnali differenciálására. Az eredmények fényében azt reméljük, hogy a módszer alkalmazása valódi alternatívát jelenthet az intraoperatív szövetazonosítás területén.

99

6. Irodalomjegyzék 1.

Gohlke, R.S., Time-of-Flight Mass Spectrometry and Gas-Liquid Partition Chromatography. Analytical Chemistry, 1959. 31(4): p. 535-541.

2.

Gohlke, R.S. and F.W. McLafferty, Early Gas-Chromatography Mass-Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 1993. 4(5): p. 367-371.

3.

Ryhage, R., Use of a Mass Spectrometer as a Detector and Analyzer for Effluent Emerging from High Temperature Gas Liquid Chromatography Columns. Analytical Chemistry, 1964. 36(4): p. 759-764.

4.

Dempster, A.J., A new Method of Positive Ray Analysis. Physical Review, 1918. 11(4): p. 316.

5.

Munson, M.S.B. and F.H. Field, Chemical Ionization Mass Spectrometry. I. General Introduction. Journal of the American Chemical Society, 1966. 88(12): p. 2621-2630.

6.

Horning, E.C. and M.G. Horning, Metabolic Profiles: Gas-Phase Methods for Analysis of Metabolites. Clin Chem, 1971. 17(8): p. 802-809.

7.

Wolthers, B.G. and G.P.B. Kraan, Clinical applications of gas chromatography and gas chromatography-mass spectrometry of steroids. Journal of Chromatography A, 1999. 843(1-2): p. 247-274.

8.

Noppe, H., et al., Novel analytical methods for the determination of steroid hormones in edible matrices. Analytica Chimica Acta, 2008. 611(1): p. 1-16.

9.

Thurnhofer, S. and W. Vetter, A Gas Chromatography/Electron Ionization-Mass Spectrometry-Selected Ion Monitoring Method for Determining the Fatty Acid Pattern in Food after Formation of Fatty Acid Methyl Esters. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005. 53(23): p. 8896-8903.

10.

Larsson, L. and A. Saraf, Use of gas chromatography ion trap tandem mass spectrometry for the detection and characterization of microorganisms in complex samples. Molecular Biotechnology, 1997. 7(3): p. 279-287.

11.

Pasikanti, K.K., P.C. Ho, and E.C.Y. Chan, Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2008. 871(2): p. 202-211.

12.

McFadden, W.H., H.L. Schwartz, and S. Evans, Direct analysis of liquid chromatographic effluents. Journal of Chromatography A, 1976. 122: p. 389-396.

100

13.

Creaser, C.S. and J.W. Stygall, Particle-beam Liquid-Chromatography MassSpectrometry - Instrumentation and Applications - A Review. Analyst, 1993. 118(12): p. 1467-1480.

14.

Arpino, P., Combined Liquid-Chromatography Mass-Spectrometry. 2. Techniques and Mechanism of Thermospray. Mass Spectrometry Reviews, 1990. 9(6): p. 631-669.

15.

Fenn, J., et al., Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science, 1989. 246(4926): p. 64-71.

16.

Iribarne, J.V. and B.A. Thomson, On the evaporation of small ions from charged droplets. The Journal of Chemical Physics, 1976. 64(6): p. 2287-2294.

17.

Dole, M., et al., Molecular Beams of Macroions. The Journal of Chemical Physics, 1968. 49(5): p. 2240-2249.

18.

Byrdwell, W.C., Atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry for analysis of lipids. Lipids, 2001. 36(4): p. 327-346.

19.

Gibson, G.T.T., S.M. Mugo, and R.D. Oleschuk, Nanoelectrospray emitters: Trends and perspective. Mass Spectrometry Reviews, 2009. 28(6): p. 918-936.

20.

Hirabayashi, A., M. Sakairi, and H. Koizumi, Sonic spray mass spectrometry. Analytical Chemistry, 1995. 67(17): p. 2878-2882.

21.

Dams, R., et al., Sonic Spray Ionization Technology: Performance Study and Application to a LC/MS Analysis on a Monolithic Silica Column for Heroin Impurity Profiling. Analytical Chemistry, 2002. 74(13): p. 3206-3212.

22.

Marchi, I., S. Rudaz, and J.L. Veuthey, Atmospheric pressure photoionization for coupling liquid-chromatography to mass spectrometry: A review. Talanta, 2009. 78(1): p. 1-18.

23.

Chang, M.S., et al., Historical review of sample preparation for chromatographic bioanalysis: Pros and cons. Drug Development Research, 2007. 68(3): p. 107-133.

24.

Piraud, M., et al., Ion-pairing reversed-phase liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometric analysis of 76 underivatized amino acids of biological interest: a new tool for the diagnosis of inherited disorders of amino acid metabolism. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2005. 19(12): p. 1587-1602.

25.

Gaut, J.P., et al., Artifact-free quantification of free 3-chlorotyrosine, 3-bromotyrosine, and 3-nitrotyrosine in human plasma by electron capture-negative chemical ionization gas chromatography mass spectrometry and liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (vol 300, pg 252, 2002). Analytical Biochemistry, 2002. 304(2): p. 275-275. 101

26.

Valerio, A., G. Baldo, and P. Tessari, A rapid method to determine plasma homocysteine

concentration

and

enrichment

by

gas

chromatography/mass

spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2005. 19(4): p. 561-567. 27.

Byrdwell, W.C., Dual parallel liquid chromatography with dual mass spectrometry (LC2/MS2) for a total lipid analysis. Frontiers in Bioscience, 2008. 13: p. 100-120.

28.

Duffin, K.L., J.D. Henion, and J.J. Shieh, Electrospray and tandem mass spectrometric characterization of acylglycerol mixtures that are dissolved in nonpolar solvents. Analytical Chemistry, 1991. 63(17): p. 1781-1788.

29.

Van Hove, J.L.K., et al., Acylcarnitines in plasma and blood spots of patients with long-chain 3-hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase defiency. Journal of Inherited Metabolic Disease, 2000. 23(6): p. 571-582.

30.

Vernez, L., et al., Determination of carnitine and acylcarnitines in urine by highperformance liquid chromatography-electrospray ionization ion trap tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2003. 984(2): p. 203-213.

31.

Bove, K.E., et al., Bile acid synthetic defects and liver disease: A comprehensive review. Pediatric and Developmental Pathology, 2004. 7(4): p. 315-334.

32.

Tagliacozzi, D., et al., Quantitative analysis of bile acids in human plasma by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry: A simple and rapid one-step method. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 2003. 41(12): p. 1633-1641.

33.

Pettus, B.J., et al., Mass spectrometric analysis of ceramide perturbations in brain and fibroblasts of mice and human patients with peroxisomal disorders. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2004. 18(14): p. 1569-1574.

34.

Lee, S.H., et al., Targeted lipidomics using electron capture atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2003. 17(19): p. 2168-2176.

35.

Mesaros, C., S.H. Lee, and I.A. Blair, Targeted quantitative analysis of eicosanoid lipids in biological samples using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2009. 877(26): p. 2736-2745.

36.

Vallance, H. and A. Derek, An improved method for quantification of very long chain fatty acids in plasma. Clinical Biochemistry, 1994. 27(3): p. 183-186.

37.

Johnson, D.W., Contemporary clinical usage of LC/MS: Analysis of biologically important carboxylic acids. Clinical Biochemistry, 2005. 38(4): p. 351-361.

102

38.

Watson, D.G., et al., Analysis of biogenic amines and their metabolites in biological tissues and fluids by gas chromatography--negative ion chemical ionization mass spectrometry (GC-NICIMS). Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 1990. 8(8-12): p. 899-904.

39.

Hows, M.E.P., et al., High-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometric assay for the simultaneous measurement of dopamine, norepinephrine, 5-hydroxytryptamine and cocaine in biological samples. Journal of Neuroscience Methods, 2004. 138(1-2): p. 123-132.

40.

Nordstrom, A., et al., Derivatization for LC electrospray ionization-MS: A tool for improving reversed-phase separation and ESI responses of bases, ribosides, and intact nucleotides. Analytical Chemistry, 2004. 76(10): p. 2869-2877.

41.

Klawitter, J., et al., Development and validation of an assay for the quantification of 11 nucleotides using LC/LC-electro spray ionization-MS. Analytical Biochemistry, 2007. 365(2): p. 230-239.

42.

Kuhara, T., Diagnosis and monitoring of inborn errors of metabolism using ureasepretreatment of urine, isotope dilution, and gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2002. 781(1-2): p. 497-517.

43.

Buchanan, D.N., J. Muenzer, and J.G. Thoene, Positive-ion thermospray liquid chromatography--mass spectrometry: detection of organic acidurias. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 1990. 534: p. 1-11.

44.

Pulfer, M. and R.C. Murphy, Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrometry Reviews, 2003. 22(5): p. 332-364.

45.

Han, X.L. and R.W. Gross, Global analyses of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples by ESI mass spectrometry: a bridge to lipidomics. Journal of Lipid Research, 2003. 44(6): p. 1071-1079.

46.

Houjou, T., et al., A shotgun tandem mass spectrometric analysis of phospholipids with

normal-phase

and/or

reverse-phase

liquid

chromatography/electrospray

ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2005. 19(5): p. 654-666. 47.

Thevis, M. and W. Schanzer, Current role of LC-MS(/MS) in doping control. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007. 388(7): p. 1351-1358.

48.

Sjovall, J., Fifty years with bile acids and steroids in health and disease. Lipids, 2004. 39(8): p. 703-722. 103

49.

Hammad, L.A., et al., Multiple-Reaction Monitoring Liquid Chromatography Mass Spectrometry for Monosaccharide Compositional Analysis of Glycoproteins. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2009. 20(6): p. 1224-1234.

50.

Beckey, H.D., Field desorption mass spectrometry: A technique for the study of thermally unstable substances of low volatility. International Journal or Mass Spectrometry and Ion Physics, 1969. 2(6): p. 500-502.

51.

Baldwin, M.A. and F.W. McLafferty, Direct chemical ionization of relatively involatile samples. Application to underivatized oligopeptides. Organic Mass Spectrometry, 1973. 7(12): p. 1353-1356.

52.

Vincenti, M., The renaissance of desorption chemical ionization mass spectrometry: characterization of large involatile molecules and nonpolar polymers. International Journal of Mass Spectrometry, 2001. 212(1-3): p. 505-518.

53.

Macfarlane, R. and D. Torgerson, Californium-252 plasma desorption mass spectroscopy. Science, 1976. 191(4230): p. 920-925.

54.

Benninghoven, A., Beobachtung von oberflächenreaktionen mit der statischen methode der sekundärionen-massenspektroskopie. I die methode. Surface Science, 1971. 28(2): p. 541-562.

55.

Belu, A.M., D.J. Graham, and D.G. Castner, Time-of-flight secondary ion mass spectrometry: techniques and applications for the characterization of biomaterial surfaces. Biomaterials, 2003. 24(21): p. 3635-3653.

56.

Fletcher, J.S., Cellular imaging with secondary ion mass spectrometry. The Analyst, 2009. 134(11): p. 2204-2215.

57.

Lorey, D.R., G.H. Morrison, and S. Chandra, Dynamic Secondary Ion Mass Spectrometry Analysis of Boron from Boron Neutron Capture Therapy Drugs in CoCultures: Single-Cell Imaging of Two Different Cell Types within the Same Ion Microscopy Field of Imaging. Analytical Chemistry, 2001. 73(16): p. 3947-3953.

58.

Sostarecz, A.G., et al., Phosphatidylethanolamine-Induced Cholesterol Domains Chemically Identified with Mass Spectrometric Imaging. Journal of the American Chemical Society, 2004. 126(43): p. 13882-13883.

59.

Barber, M., et al., Fast Atom Bombardment Mass-Spectrometry. Analytical Chemistry, 1982. 54(4): p. 645A-657A.

60.

Murphy, R.C. and K.A. Harrison, Fast-Atom-Bombardment Mass-Spectrometry of Phospholipids. Mass Spectrometry Reviews, 1994. 13(1): p. 57-75.

104

61.

Gibson, B.W. and P. Cohen, Liquid Secondary-Ion Mass-Spectrometry of Phosphorylated and Sulfated Peptides and Proteins. Methods in Enzymology, 1990. 193: p. 480-501.

62.

Cornett, D.S., et al., Matrix-free desorption of biomolecules using massive cluster impact. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 1994. 8(12): p. 996-1000.

63.

Garrison, B.J. and Z. Postawa, Computational view of surface based organic mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews, 2008. 27(4): p. 289-315.

64.

Karas, M., D. Bachmann, and F. Hillenkamp, Influence of the wavelength in highirradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules. Analytical Chemistry, 1985. 57(14): p. 2935-2939.

65.

Tanaka, K., et al., Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 1988. 2(8): p. 151-153.

66.

Ehring, H., M. Karas, and F. Hillenkamp, Role of photoionization and photochemistry in ionization processes of organic molecules and relevance for matrix-assisted laser desorption lonization mass spectrometry. Organic Mass Spectrometry, 1992. 27(4): p. 472-480.

67.

Karas, M. and R. Kruger, Ion Formation in MALDI: The Cluster Ionization Mechanism. Chemical Reviews, 2003. 103(2): p. 427-440.

68.

McDonnell, L.A. and R.M.A. Heeren, Imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews, 2007. 26(4): p. 606-643.

69.

Laiko, V.V., M.A. Baldwin, and A.L. Burlingame, Atmospheric Pressure MatrixAssisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry, 2000. 72(4): p. 652-657.

70.

Van Berkel, G.J., S.P. Pasilis, and O. Ovchinnikova, Established and emerging atmospheric pressure surface sampling/ionization techniques for mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry, 2008. 43(9): p. 1161-1180.

71.

Takats, Z., et al., Mass Spectrometry Sampling Under Ambient Conditions with Desorption Electrospray Ionization. Science, 2004. 306(5695): p. 471-473.

72.

Takáts, Z., J.M. Wiseman, and R.G. Cooks, Ambient mass spectrometry using desorption electrospray ionization (DESI): instrumentation, mechanisms and applications in forensics, chemistry, and biology. Journal of Mass Spectrometry, 2005. 40(10): p. 1261-1275.

105

73.

Cooks, R.G., S.-C. Jo, and J. Green, Collisions of organic ions at surfaces. Applied Surface Science, 2004. 231-232: p. 13-21.

74.

García-Reyes, J.F., et al., Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry for Trace Analysis of Agrochemicals in Food. Analytical Chemistry, 2008. 81(2): p. 820829.

75.

Ifa, D., et al., Forensic applications of ambient ionization mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2009. 394(8): p. 1995-2008.

76.

Takats, Z., et al., Direct, trace level detection of explosives on ambient surfaces by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Chemical Communications, 2005(15): p. 1950-1952.

77.

Wiseman, J.M., et al., Mass Spectrometric Profiling of Intact Biological Tissue by Using Desorption Electrospray Ionization. Angewandte Chemie International Edition, 2005. 44(43): p. 7094-7097.

78.

Kertesz, V. and G.J.V. Berkel, Improved imaging resolution in desorption electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2008. 22(17): p. 2639-2644.

79.

Wu, C., et al., Molecular imaging of adrenal gland by desorption electrospray ionization mass spectrometry. The Analyst, 2010. 135(1): p. 28-32.

80.

Barbula, G.K., et al., Desorption Electrospray Ionization: Achieving Rapid Sampling Rates. Analytical Chemistry, 2009. 81(21): p. 9035-9040.

81.

Soparawalla, S., et al., Pharmaceutical cleaning validation using non-proximate largearea desorption electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2009. 23(1): p. 131-137.

82.

Ma, X., et al., Versatile Platform Employing Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry for High-Throughput Analysis. Analytical Chemistry, 2008. 80(15): p. 6131-6136.

83.

Haddad, R., R. Sparrapan, and M.N. Eberlin, Desorption sonic spray ionization for (high) voltage-free ambient mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2006. 20(19): p. 2901-2905.

84.

Pasilis, S.P., V. Kertesz, and G.J. Van Berkel, Unexpected Analyte Oxidation during Desorption Electrospray Ionization-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry, 2008. 80(4): p. 1208-1214.

85.

Volny, M., et al., Surface effects and electrochemical cell capacitance in desorption electrospray ionization. The Analyst, 2008. 133(4): p. 525-531. 106

86.

Takats, Z., et al., Jet desorption ionization. Proceedings of the 54th ASMS Conference on Mass Spectrometry, 2006(Seattle, May 28-June 1).

87.

Luftmann, H., A simple device for the extraction of TLC spots: direct coupling with an electrospray mass spectrometer. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2004. 378(4): p. 964-968.

88.

Van Berkel, G.J., A.D. Sanchez, and J.M.E. Quirke, Thin-Layer Chromatography and Electrospray Mass Spectrometry Coupled Using a Surface Sampling Probe. Analytical Chemistry, 2002. 74(24): p. 6216-6223.

89.

Wachs, T. and J. Henion, Electrospray Device for Coupling Microscale Separations and Other Miniaturized Devices with Electrospray Mass Spectrometry. Analytical Chemistry, 2001. 73(3): p. 632-638.

90.

Modestov, A.D., et al., Scanning Capillary Microscopy/Mass Spectrometry for Mapping Spatial Electrochemical Activity of Electrodes. Analytical Chemistry, 2001. 73(17): p. 4229-4240.

91.

Van Berkel, G.J., et al., Liquid microjunction surface sampling probe electrospray mass spectrometry for detection of drugs and metabolites in thin tissue sections. Journal of Mass Spectrometry, 2008. 43(4): p. 500-508.

92.

Dzidic, I., et al., Atmospheric pressure ionization (API) mass spectrometry. Formation of phenoxide ions from chlorinated aromatic compounds. Analytical Chemistry, 1975. 47(8): p. 1308-1312.

93.

Stoll, R. and F.W. Röllgen, Thermal evaporation of intact positive ions of quaternary ammonium and phosphonium salts. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications, 1980. 16: p. 789.

94.

Chen, H., Z. Ouyang, and R.G. Cooks, Thermal Production and Reactions of Organic Ions at Atmospheric Pressure. Angewandte Chemie International Edition, 2006. 45(22): p. 3656-3660.

95.

McEwen, C.N., R.G. McKay, and B.S. Larsen, Analysis of Solids, Liquids, and Biological Tissues Using Solids Probe Introduction at Atmospheric Pressure on Commercial LC/MS Instruments. Analytical Chemistry, 2005. 77(23): p. 7826-7831.

96.

McEwen, C. and S. Gutteridge, Analysis of the Inhibition of the Ergosterol Pathway in Fungi Using the Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP) Method. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2007. 18(7): p. 1274-1278.

107

97.

Cody, R.B., J.A. Laramee, and H.D. Durst, Versatile New Ion Source for the Analysis of Materials in Open Air under Ambient Conditions. Analytical Chemistry, 2005. 77(8): p. 2297-2302.

98.

Williams, J.P. and J.H. Scrivens, Rapid accurate mass desorption electrospray ionisation

tandem

mass

spectrometry

of

pharmaceutical

samples.

Rapid

Communications in Mass Spectrometry, 2005. 19(24): p. 3643-3650. 99.

Williams, J.P., et al., The use of recently described ionisation techniques for the rapid analysis of some common drugs and samples of biological origin. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2006. 20(9): p. 1447-1456.

100.

Chen, H., et al., Surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry for direct ambient sample analysis without toxic chemical contamination. Journal of Mass Spectrometry, 2007. 42(8): p. 1045-1056.

101.

Song, Y. and R.G. Cooks, Atmospheric pressure ion/molecule reactions for the selective detection of nitroaromatic explosives using acetonitrile and air as reagents. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2006. 20(20): p. 3130-3138.

102.

Chen, H., et al., Rapid Differentiation of Tea Products by Surface Desorption Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007. 55(25): p. 10093-10100.

103.

Haapala, M., et al., Desorption Atmospheric Pressure Photoionization. Analytical Chemistry, 2007. 79(20): p. 7867-7872.

104.

Ratcliffe, L.V., et al., Surface Analysis under Ambient Conditions Using PlasmaAssisted Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry, 2007. 79(16): p. 6094-6101.

105.

Na, N., et al., Direct detection of explosives on solid surfaces by mass spectrometry with an ambient ion source based on dielectric barrier discharge. Journal of Mass Spectrometry, 2007. 42(8): p. 1079-1085.

106.

Gray, A.L., Solid Sample Introduction by Laser Ablation for Inductively Coupled Plasma Source-Mass Spectrometry. Analyst, 1985. 110(5): p. 551-556.

107.

Mokgalaka, N.S. and J.L. Gardea-Torresdey, Laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry: Principles and applications. Applied Spectroscopy Reviews, 2006. 41(2): p. 131-150.

108.

Coon, J.J., K.J. McHale, and W.W. Harrison, Atmospheric pressure laser desorption/chemical ionization mass spectrometry: a new ionization method based on

108

existing themes. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2002. 16(7): p. 681685. 109.

Shiea, J., et al., Electrospray-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry for direct ambient analysis of solids. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2005. 19(24): p. 3701-3704.

110.

Sampson, J.S., A.M. Hawkridge, and D.C. Muddiman, Generation and Detection of Multiply-Charged Peptides and Proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (MALDESI) Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2006. 17(12): p. 1712-1716.

111.

Nemes, P. and A. Vertes, Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure, in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry. Analytical Chemistry, 2007. 79(21): p. 8098-8106.

112.

Eijkel, G.B., et al., Correlating MALDI and SIMS imaging mass spectrometric datasets of biological tissue surfaces. Surface and Interface Analysis, 2009. 41(8): p. 675-685.

113.

Altelaar, A.F.M., et al., Imaging mass spectrometry at cellular length scales. Nat. Protocols, 2007. 2(5): p. 1185-1196.

114.

Stoeckli, M., et al., Imaging mass spectrometry: A new technology for the analysis of protein expression in mammalian tissues. Nat Med, 2001. 7(4): p. 493-496.

115.

Schiller, J., et al., MALDI-TOF MS in lipidomics. Frontiers in Bioscience, 2007. 12: p. 2568-2579.

116.

Dill, A.L., et al., Mass spectrometric imaging of lipids using desorption electrospray ionization. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2009. 877(26): p. 2883-2889.

117.

Nemes, P., A.S. Woods, and A. Vertes, Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry, 2010. 82(3): p. 982-988.

118.

Van Berkel, G.J. and V. Kertesz, Application of a Liquid Extraction Based Sealing Surface Sampling Probe for Mass Spectrometric Analysis of Dried Blood Spots and Mouse Whole-Body Thin Tissue Sections. Analytical Chemistry, 2009. 81(21): p. 9146-9152.

109

119.

Kosaka, N., et al., Clinical implications of near-infrared fluorescence imaging in cancer. Future Oncology, 2009. 5(9): p. 1501-1511.

120.

Belsare, D. and D. Roy Chowdhuri, Phospholipid distribution in blood and tissues of some submammalian species. Lipids, 1968. 3(1): p. 21-23.

121.

Holland, J.F., B. Soltmann, and C.C. Sweeley, Model for Ionization Mechanisms in Field Desorption Mass-Spectrometry. Biomedical Mass Spectrometry, 1976. 3(6): p. 340-345.

122.

Gaffney, J.S., R.C. Pierce, and L. Friedman, Mass spectrometer study of evaporation of .alpha.-amino acids. Journal of the American Chemical Society, 1977. 99(13): p. 4293-4298.

123.

Cotter, R.J. and A.L. Yergey, Thermal desorption of quaternary ammonium cations. Journal of the American Chemical Society, 1981. 103(6): p. 1596-1598.

124.

Blakley, C.R., J.J. Carmody, and M.L. Vestal, A new soft ionization technique for mass spectrometry of complex molecules. Journal of the American Chemical Society, 1980. 102(18): p. 5931-5933.

125.

Takats, Z. and R.G. Cooks, Thermal formation of serine octamer ions. Chemical Communications, 2004(4): p. 444-445.

126.

Taylor, P.J., et al., Evaluation of 3 Internal Standards for the Measurement of Cyclosporin by HPLC-Mass Spectrometry. Clin Chem, 2005. 51(10): p. 1890-1893.

127.

Turner, N., et al., Greater effect of diet than exercise training on the fatty acid profile of rat skeletal muscle. Journal of Applied Physiology, 2004. 96(3): p. 974-980.

128.

Stein, O. and Y. Stein, Metabolism of fatty acids in the isolated perfused rat heart. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Specialized Section on Lipids and Related Subjects, 1963. 70: p. 517-530.

110

7. Köszönetnyilvánítás Szeretnék

köszönetet

mondani

témavezetőmnek,

Takáts

Zoltánnak,

valamint

munkatársaimnak, Szaniszló Tamásnak, Balog Júliának, Czuczy Noéminek, Szabó Eszternek, Szekeres Ákosnak, Hosszú Ádámnak, Katona Máriának, Albrecht Katalinnak és Dobos Juditnak a szakmai és baráti támogatásért. Köszönöm Kertész Vilmosnak, Szalay Dánielnek, Gödörházy Lajosnak, Szendrei Eszternek, Patikásné Krisztinának és Balogh Lajosnak a munkám

technikai

hátterének

megteremtését.

Valamint

szeretném

megköszönni

Édesanyámnak, hogy mindenben számíthatok rá.

111

8. Összefoglalás Doktori munkám során olyan közvetlen ionizációs módszereket fejlesztésén dolgoztam, melyek segítségével biológiai minták közvetlenül vagy minimális előkészítés után vizsgálhatóak. Mivel analitikai szemszögből a biológiai minták egyértelműen biológiai fluidumokra és szövetmintákra oszlanak, párhuzamosan foglalkoztam a két mintacsoport közvetlen ionizációs tömegspektrometriai vizsgálatának lehetőségeivel. Mind a fluidumok, mind pedig a szövetminták esetében megpróbáltunk olyan alkalmazást találni, ahol a jelenleg használt módszerek problémákkal küzdenek, és mindenképpen szükséges valamilyen alapvető metodikai változtatás a közeljövőben. A biológiai fluidumokkal kapcsolatban a klinikai kémiai-labordiagnosztikai alkalmazásokra esett a választás, mivel a nagy mintaszámú vizsgálatok alapvetően megkövetelik a minél gyorsabb, egyszerűbb és olcsóbb analitikai megoldásokat. A módszer fejlesztése során az egyik fontos szempont az volt, hogy valamilyen módon helyettesítse az időigényes, és a deszorpciós technikáknál csak körülményesen alkalmazható kromatográfiás eljárásokat. Az eljárás kidolgozásához a szilárd fázisú extrakciós technikát kombináltam az atmoszférikus nyomású deszorpciós ionizációs tömegspektrometriával. A szilárd fázisú extrakció folyamatának csak az utolsó, elúciós lépését kellett módosítani olyan módon, hogy az oldat fázisú minta helyett egy szabad felületen elhelyezkedő szilárd fázisú mintát kapjak. Így jött létre a szilárd fázisú extrakcióval kapcsolt deszorpciós elektrospray ionizációnak (SPEEDI: solid phase extraction enhanced desorption electrospray ionization) elnevezett módszer. Az eljáráshoz szükséges laboratóriumi eszközök tervezése és kivitelezése is doktori munkám részét képezte. Szövetminták vizsgálatával kapcsolatban célként egy olyan módszer kifejlesztését tűztük ki, amely közvetlen ionizációs tömegspektrometrián alapszik, és képes élő szövetek vizsgálatára, illetve a vizsgálati eredmények alapján lényegében valós idejű azonosítására. Az elektrosebészetben használt módszerek biológiai szövetek gyors termikus elpárologatásán alapulnak, amely a fő szövetalkotókból, így a membránalkotó lipidekből is gázfázisú molekula

ionokat

hoz

létre,

melyeket

egy

új

típusú

interfész

beiktatásával

tömegspektrometriásan analizálhatunk. Matematikai módszer segítségével a különböző egészséges és tumoros szöveteket el tudtuk különíteni egymástól. Mivel a módszer kulcsa a gyors

elpárologtatás,

ezért

a

technikát

„Gyors

Elpárologtatású

Ionizációs

Tömegspektrometriának” neveztük el (REIMS: rapid evaporative ionization mass spectrometry).

112

9. Abstract My PhD work was focused on the development of direct ionization methods, which are capable of the analysis of biological samples with minimal or no sample preparation. As biological specimens represent two, fundamentally different sample types (biological fluids and tissue samples) my research was divided into two parallel sub-projects. In case of biological fluids the objective was to enhance the sensitivity and reproducibility of Desorption Electrospray Ionization (DESI)-based methods to the level of practical applicability, while we intended to keep all the advantages of DESI regarding simplicity and speed of analysis. The novel method is based on the on-line coupling of solid phase extraction (SPE) technique with the atmospheric pressure desorption ionization mass spectrometry. The last step of the solid phase extraction was modified in order to present a perfectly accessible solid phase sample for DESI-MS analysis. Using this approach (termed Solid Phase Extraction Enhanced Desorption Ionization: SPEEDI) sensitivities similar to those of LC-MS/MS methods have been achieves, while the analysis still remained in the 2-8 s/sample range. My PhD work also included the design and construction of the sample preparation equipment and consumables needed for the technique. Analysis of intact tissue samples has been attempted by using various direct ionization methods (or combination of them), however it was concluded soon, that introduction of a novel approach is necessary to fully achieve our objectives. Already, at relatively early stage of my PhD work, thermal tissue evaporation has emerged as a promising solution. Since surgery widely employs these techniques in the form of electrosurgery and laser surgery, ion formation during thermal evaporation was studied in details and it was concluded that the method indeed yields considerable ion current consisting predominantly intact molecular ions of complex lipids. The corresponding data was found to show high tissue-specificity, hence, a rapid statistical analysis method was developed to fully utilize this feature. It was demonstrated that (1) the overall method is fully compatible with approved surgical equipment and (2) the data evaluation algorithm is capable of differentiating malignant tumors from healthy tissue parts in real time, thus the method has real potential on the field of intraoperative tissue identification.

113