ÉVES JELENTÉS 0 2006
DNT DÉL-ALFÖLDI NEUROBIOLÓGIAI TUDÁSKÖZPONT
TERÁPIÁS CÉLÚ IDEGRENDSZERI KUTATÁSOK A MOLEKULÁTÓL AZ INTEGRÁLT IDEGRENDSZERI MÛKÖDÉSIG Pázmány Péter program
DÉL-ALFÖLDI NEUROBIOLOGIAI TUDÁSKÖZPONT
ÖSSZEFOGLALÓ A Dél-Alföldi Neurobiológiai Tudásközpont (DNT) versenyképessé vált a kutatás és fejlesztés területén. Céljaink változatlanok: a neurológia betegségek új, hatékony és jól tolerálható diagnosztikai, illetve kezelési módszereinek, gyógyszereinek felfedezése és fejlesztése. A szegedi régió kiemelkedõ tudományos eredményeit felhasználva komoly és sokat ígérõ kutatási programot valósítunk meg. A DNT részt vesz a leggyakrabban elõforduló neurodegenerációs betegségek gyógyszereinek kifejlesztésében. A gyógyszerkutatás valamennyi fázisában részt veszünk, a felfedezéstõl a preklinikai, klinikai kísérletekig. Az egyes munkacsoportok nagyon szorosan együttmûködnek egymással, valamint más kutatócsoportokkal a világ valamennyi részébõl. A DNT második évének legfontosabb eredménye volt 2006 májusában a „Kutatóközpont és Inkubátorház” (KIH) megnyitása az egyetemi campus centrumában. A Központ összesen 1300 m2 alapterületet ad kutatólaboratóriumok és irodák részére. A legfontosabb kutató-fejlesztõ egységek a következõk: a Számítógép Központ (nagyteljesítményû számítógép klaszterekkel), az NMR Laboratórium (500 és 600 MHz-es készülékekkel), a DNS – Oligonukleotid-RNS – interferencia Laboratórium, a Neuroproteomikai Kutatóhely, a Sejttenyésztõ Laboratórium, a Fluoreszcencia Mikroszkóp Kutatóhely, az Állatház és a Tanulási-Magatartási Laboratórium. Következõ célunk egy fehérjekrisztallográfiai laboratórium berendezése, ezzel válik majd teljessé a „Szerkezeti Biológiai Központ” kialakítása a Kutatóközpont és Inkubátorház keretén belül. Néhány kis- és nagyvállalat is helyet kapott a Központban: a General Electrics, a Kromat Kft., (Agilent), a Rytmion, a Csertex, a JSW Hungary és a két újonnan alapított spin-off vállalatunk, a Vitadel Kft. és Provit Kft. Közeli és szoros együttmûködés indult meg az említett vállalatok munkatársai és a Központban dolgozó 35 kutató között. A DNT végsõ célja a Kutatóközpont erõteljes fejlesztése és a fenntartható fejlõdés. Ebben az évben 3 új hasznosító (spin-off) vállalatot alapítottunk és 2 kisvállalkozás (MusGenex és JSW Hungary) csatlakozott a DNT-hez. Új kapcsolatokat alakítottunk ki hazai (ValDeal Kft.) és multinacionális vállalatokkal (Eli Lilly Bécs, NUMICO Wageningen, JSW Research Graz). Összeállítottunk egy dinamikus termék- és szolgáltatás listát, amelyet a DNT képviselõi Párizsban mutattak be a Második Európai Kutatói és Innovációs Kiállítás- és Vásáron (2006. jún. 8-11). A DNT további feladata, hogy megoldást találjon a neurodegeneratív betegségek korai felismerésére, diagnosztizálására. Nagyon jó együttmûködés alakult ki az EGIS és a DNT között: az EGIS a Központ épületében több kutatólaboratóriumot mûködtet. A DNT kutatási-fejlesztési munkáiban 330 munkatárs vesz részt, többek között 5 akadémikus, 22 MTA doktora, 84 PhD vagy ezzel egyenértékû kutató, 60 doktorandusz és 58 egyetemi hallgató. A DNT 2006-ban összesen 62 dolgozót foglalkoztat, ami 40 új álláshely létesítését jelenti a dél-alföldi régióban. A DNT kutatási-fejlesztési munkái elõsegítik az Hazai szabadalom 4 innovációt, az egyetemi hallgatók és a doktoranduszok képzését. A DNT kutatási-fejlesztési eredményeibõl 4 új Külföldi szabadalom 2 magyar szabadalmi bejelentés készült.
Hazai elõadás Nemzetközi elõadás SCI publikáció Könyvrészlet Könyv PhD MTA doktora Új alapítású spin-off cég
113 119 94 16 1 10 2 4
Összesített impakt faktor
298,81
Prof. Gyula Telegdy, MD. DSc akadémikus, projekt vezetõ
1
TARTALOMJEGYZÉK Összefoglaló Tartalomjegyzék Küldetésnyilatkozat Szervezet és menedzsemnt Átfogó célok Partnerek DNT Kutatóközpont és Inkubátorház Szakmai jelentés 1. Alprogram 2. Alprogram 3. Alprogram 4. Alprogram 5. Alprogram Oktatási kurzus Technológiai transzfer, a kutatási eredmények hasznosítása Együttmûködés az ipari partnerekkel Publikációk Médiamegjelenések Finanszírozás, összesített pénzügyi mutatók Teljesítményindikátorok Monitoring értékelési rendszer
2
1 2 3 4 5 5 7 9 9 16 21 29 33 38 39 40 41 46 47 48 48
KÜLDETÉSNYILATKOZAT: A Délalföldi Neurobiológiai Tudásközpont (DNT) stratégiai célja, hogy magját adja egy, a dél-alföldi régió központtal kiépülõ élettudományi klaszternek. A DNT 9-10 éves távon a területen jelentõs magyarországi kutatóhelyekkel, gyógyszergyártókkal és csatlakozó, valamint spin-off KKV-kkel összefogásban egymást kiegészítõ funkciót vállalva nemzetközi jelentõségre tesz szert a neurobiológia kutatás - fejlesztésben (K+F), és jelentõs mértékû befektetési aktivitást vonz a dél-alföldi régióba. Alapító tagok
A Konzorciumba belépett új tagok
A Konzorcium által alapított társaságok
3
SZERVEZET ÉS MENEDZSMENT 2006. október 31-én a DNT IT szavazati joggal rendelkezõ tagjai: ELNÖK: Prof. Telegdy Gyula akadémikus, egyetemi tanár DNT tudományos vezetõje • DNT 2-es altéma vezetõ SZTE ÁOK Kórélettani Intézete • MTA-Támogatott Kutatóhelyek IT TAGOK: Prof. Penke Botond akadémikus, egyetemi tanár DNT koordinátor, DNT 1-es altéma vezetõ SZTE ÁOK Orvosi Vegytan Intézete Prof. Dékány Imre akadémikus, tanszékvezetõ egyetemi tanár Szegedi Tudományegyetem vezetõsége képviseletében SZTE tudományos rektorhelyettese Prof. Vigh László akadémikus MTA Szegedi Biológiai Központ képviseletében MTA SZBK Biokémiai Intézete Prof. Vécsei László akadémikus, tanszékvezetõ egyetemi tanár DNT 3-as altéma vezetõ SZTE ÁOK Neurológiai Klinika
IRÁNYÍTÓ TANÁCS
OPERATÍV SZINT
I. DÖNTÉSI SZINT II. DÖNTÉSI SZINT
Prof. Janka Zoltán tanszékvezetõ egyetemi tanár DNT 4-es altéma vezetõ SZTE ÁOK Pszichiátriai Klinika Prof. Tóth Gábor tanszékvezetõ egyetemi tanár DNT 5-ös altéma vezetõ SZTE ÁOK Orvosi Vegytan Intézete Dr. Lévay György kutatási osztályvezetõ EGIS NyRt. képviseletében Keresztes Péter ügyvezetõ igazgató Kromat Kft. Papp Csaba DNT menedzserigazgató
DNT KOORDINÁTOR
DNT MENEDZSERIGAZGATÓ
1. ALPROGRAM 2. ALPROGRAM 3. ALPROGRAM 4. ALPROGRAM 5. ALPROGRAM
4
DNT ELNÖK
KÖZPONTI ADMINISZTRÁCIÓ
ÁTFOGÓ CÉLOK: 1.) A DNT multidiszciplináris megközelítésû és nagy szakmai diverzitással jellemzett K+F tevékenységét a terápiás célú neurobiológiai alkalmazott kutatások terén erõsen fókuszált, alkalmazható eredménnyel kecsegtetõ, az ipari partnerek érdekkörébe esõ területen kívánja folytatni. 2.) Cél, hogy a régióban a DNT által koordinált konzorciumi tagok részvételével egy neurobiológiai K+F övezet alakuljon ki, amely közös stratégiai célok mentén végzi hosszú távon jelentõs, részben önfenntartó, piacorientált munkáját. 3.) Kiemelt célunk a szellemi áttörésekre képes kutatók kinevelése, megtartása. Minden szempontból vonzó, itthoni fejlõdésre alkalmas környezetet kívánunk teremteni a jövõ zálogát jelentõ tehetséges tudósnemzedék számára. Karrierlehetõséget kívánunk biztosítani a külföldrõl visszatérni szándékozó tudósaink számára. 4.) Célunk, hogy a projekteket végrehajtó világszínvonalú tudományos potenciálhoz méltó infrastrukturális hátter jöjjön létre a modern funkcionális genomika, proteomika és a terápiás célú orvosi/kémiai fejlesztések területén. 5.) Célunk, hogy a kutatók szemléletét a létrehozott szellemi termékek hasznosítása irányában fejlesszük, megfelelõ közgazdasági alapismeretekkel lássuk el õket ahhoz, hogy azok hasznosulhassanak, jól elõkészített spin-off vállalkozások jöhessenek létre, a konzorcium kutatásaira - fejlesztéseire alapozva. 6.) Célunk, hogy mind a felsõoktatásban, mind a posztgraduális képzésben neurobiológiai tudásbázisunk hasznosuljon, az elért eredményeinket a dél-alföldi régió és az ország a lehetõségekhez mérten minél hamarabb megismerhesse. PARTNEREK: Konzorciumunk központi költségvetésbõl gazdálkodó tagjai: 1. Szegedi Tudományegyetem (SZTE) Az SZTE keretei között 35 munkacsoport vesz részt a kutató-fejlesztõ munkában. Ebbõl 19 az Általános Orvostudományi Karon, 9 a Természettudományi Karon, 6 a Gyógyszerésztudományi Karon, egy munkacsoport pedig a Tanárképzõ Fõiskolai Karon végzi munkáját. 2. Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központ (MTA - SZBK) Az Európai Unió Kiválósági Központja (Center Of Excellence) címet viselõ kutatóközpontban 13 munkacsoport kapcsolódott be a konzorcium kutató-fejlesztõ munkájába. 3. Magyar Tudományos Akadémia Támogatott Kutatóhelyek (MTA-TKI) Szorosan kapcsolódó neurobiológiai kutatások terén Az MTA-TKI négy munkacsoporttal képviselteti magát munkánkban. Ipari partnerek
4. EGIS Gyógyszergyár NyRt. Az EGIS NyRt. a hazai gyógyszergyártás egyik jelentõs képviselõje. A DNT konzorcium keretein belül a gyár az elkészült többfunkciós épületünkhöz kutatólaboratóriumok kialakításával is hozzájárult. 5. SOLVO Biotechnológia ZRt. A Solvo Biotechnológai ZRt. az ABC transzportfehérjékkel kapcsolatos in vitro gyógyszerkutatási módszerek, diagnosztikai eljárások és terápiás hatású vegyületek kutatás-fejlesztésével és forgalmazásával foglalkozó vállalkozás. A céget 2005-ben Magyar Innovációs Nagydíjjal jutalmazták. 6. Diagnosztikum ZRt. A cég profilja megalakulásától kezdve orvosi laboratóriumi diagnosztikumok gyártása, beszerzése, forgalmazása, valamint az ezekhez kapcsolódó eszközök, mûszerek forgalmazása és szervize. A Word Economic Forum (Svájc) 1997-ben beválasztotta a Global Growth Companies (GGC) közé, mint a Közép- és Kelet-Európa kiemelkedõ teljesítményt nyújtó vállalatainak egyikét. 7. Kromat Mûszerforgalmazó Kft. A Hewlett Packard vállalatból leváló Agilent Technologies nevében a teljes kémiai analitikai üzletágat a Kromat Kft vette át Magyarországon. A cég kereskedelmi tevékenységét jól kiegészíti a hatékony proteomikai alap- és alkalmazott kutatások támogatása, élõ kapcsolatépítés a kutatóbázisokkal. 8. Creative Labor Szolgáltató Kft.
5
A vállalat több éves tapasztalattal rendelkezik a molekuláris biológia területén. Klónozási technikák, real-time és hagyományos PCR-es alkalmazások kidolgozása, fehérje expresszió bakteriális és eukarióta rendszerben, fehérje- és DNS analitikai módszerek gyakorlati alkalmazása szerepel eszköztárában. 9. Rytmion Kutató és Fejlesztõ Kft. A cég elsõsorban a szív elektrofiziológia és aritmia gyógyszerkutatás területén tevékenykedik, szoros együttmûködésben a Szegedi Tudományegyetem Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézetével. Tevékenysége a különbözõ gyógyszerjelölt molekulák kardiovaszkuláris hatásainak GLP körülmények közötti vizsgálata. 10. Kation Európa Bt. A vállalkozás az extracelluláris elektrofiziológia és mikroiontoforézis tárgyköréhez kapcsolódó üveg mikroelektródák, elektronikai eszközök és software-ek fejlesztésével, gyártásával és eladásával foglalkozik. Cégünk részt vesz az élvonalbeli neurobiológiai kutatásokban is, kiválóan felszerelt elektrofiziológiai laboratóriumot tart fent az SZTE Általános Orvosi Kar Orvosi Vegytani Intézetében. 11. QualiCont In Vitro Diagnosztikai Kht. A Kht. tevékenysége a hazai in vitro diagnosztikai laboratóriumok szakszerû külsõ minõségellenõrzésének biztosítása, az ehhez kapcsolódó kutatás-fejlesztési, informatikai, képzési-, továbbképzési és nemzetközi együttmûködési feladatok végrehajtása. 2001 év óta ISO 9001 minõségtanúsítással mûködik. 12. Dél-Alföldi Bio-Innovációs Centrum Kht. (DABIC) Genomikai Központja A Kht. tagjai a Szegedi Egyetem, a Bay Zoltán Intézet, a Gabonakutató Intézet, a Csongrád megyei és Szeged városi önkormányzata és számos olyan kis- és középvállalat, amely a genomikai kutatásokban érintett. A központ mûködésének egyik fõ célja olyan projektek irányítása és szervezése, mely több társintézet együttes munkáját igényli. Másik fõ célja egy bioinformatikai rendszer megteremtése. Csatlakozott ipari partnerek 13. JSW Hungary Kft. A JSW Hungary Kft. 2006. augusztusában csatlakozott a DNT programhoz. A cég gyógyszerjelölt molekulák kutatási szerzõdésen alapuló analitikai, biokémiai és molekuláris biológiai tesztelését, valamint azok in vitro szövettenyészeten és in vivo transzgenikus egérmodelleken történõ preklinikai kipróbálását végzi, szorosan kapcsolódva a DNT program 3. és 5. alprogramjához tartozó csoportok kutatásaihoz. Ezen túlmenõen kedvezményesen látje el a konzorcium minden egyes tagját az Alzheimer- és a Parkinson- kór transzgenikus állatmodelljeivel. 14. Musgenex Kft. Dr. Oláh Zoltán, 2006 januárjában MusGenex Kft névvel, az MTA SZBK Biokémiai Intézetének támogatásával és Dr. Sántha Miklós állatorvos bevonásával, egy új spin-off céget hozott létre. A cég tevékenységébe többek között beletartozik transzgenikus riporter állatmodellek tervezése, létrehozása és forgalmazása. Elsõsorban tudományos kutatással foglalkozó intézményeknek szállítunk, beleértve egyetemeket és gyógyszergyárakat, Európában vagy a világ bármely más kontinensén. Konzorciumi alapítású társaságok 15. Provit Kft. A vállalat a Szegedi Tudományegyetem második hasznosító (spin-off) cége. Fõ profiljai: 1, funkcionális élelmiszer komponensek kutatása és alkalmazása, elsõsorban a tokoferolok neuroprotektív hatását kihasználva; 2, fehérjekémiai, proteomikai kuatatások: az egyes betegségek kialakulásánál kulcsszerepet játszó álfehérjék azonosítása és kijelölése a racionális gyógyszertervezés céljára. 16. Vitadel Kft. A vállalat a Szegedi Tudományegyetem elsõ hasznosító (spin-off) cége. Fõ feladata a Dél-Alföldi Neurobiológiai Tudásközpont kutatói által kidolgozott és alkalmazott eljárások, módszerek gyakorlati alkalmazása, illetve forgalmazása. A kft. szerzõdéses munkát kínál üzleti partnereinek a gyógyszerkutatás teljes vertikumában, a számítógépes molekulatervezéstõl és optimalizálástól a klinikai fázisig.
6
DNT KUTATÓKÖZPONT ÉS INKUBÁTORHÁZ 2006. június 15-én volt az Egyetem kampuszának közepén létrehozott új Kutatóközpont és Inkubátorház ünnepélyes megnyitója. Ez a 253 millió Ft-os (mintegy 1 millió eurós) beruházás eddig a legnagyobb a DNT történetében. A Központ 1300 m2 labor-és irodaterületet foglal el. A beruházás legnagyobb részét a DNT projektbõl fedeztük, de más forrásokat is igénybevettünk. (5,08 millió Ft-ot a KF-IIF/2005 pályázatból az épület informatikai és kommunikációs hálózatának kiépítésére; a main-frame komputerek valamint a 600 MHz-es NMR készülék beszerzésére). A Központban a következõ laboratóriumok kaptak helyek: 1) Számítóközpont és Molekulamodellezési Laboratórium Két main-frame számítógép (értékük: 57 millió Ft, ~ 220.000 €); van elhelyezve a laboratóriumban, klaszterben kapcsolva. A központ fõ feladata a molekula-szimuláció és számítógépes molekula (gyógyszer) tervezés, valamint az NMR mérések adatainak feldolgozása. Ebben a laboratóriumban van az épület informatikai és telekommunikációs központja is. 2) NMR Centrum. Az országban egyedülálló teljesítményre képes laboratórium egy 500 és egy 600 MHz-es Bruker gyártmányú NMR-készülékkel van felszerelve. Ezek összértéke kb. 250 millió Ft és más forrásból szereztük be õket, bár a laboratórium berendezését a DNT is támogatta 40 millió Ft-tal. A Centrum fõ feladata a fehérjék szerkezetének és kis molekulákkal (pl. gyógyszermolekulák) lejátszódó kölcsönhatásainak tanulmányozása. Az NMR Laboratórium a közeljövõben megszervezendõ „Strukturális Biológiai Központ” fontos alkotórésze. 3) DNS-Oligonukleotid Laboratórium. A munkahely fõ feladata oligonukleotidok, antiszensz oligonukleotidok és peptid nucleinsavak (PNS) szintézise további biológiai vizsgálatok céljából. 4) RNS-Interferencia Laboratórium. Magyarországion ez az egyetlen laboratórium, ahol molekulatervezés után kis interferáló RNS-et állítanak elõ. Az RNS interferencia a gyógyszertervezés és fejlesztés legmodernebb módszere (Kémiai Nobel-díj, 2006) 5) Peptid és Fehérjelaboratórium. A munkahely feladata peptidek szintézise, a peptidek és fehérjék aggregációjának, a neurotoxicus peptid/fehérje szupramolekuláris szerkezetnek, inklúziós testeknek a tanulmányozása. 6) Neuroproteomikai Kutatóhely. Hazánkban ez is egy egyedülálló munkákra és teljesítményre képes laboratórium, képes kiszolgálni az egész ország neurobiológiai proteomikai igényét. A kutatóhely feladatai: fehérjék izolálása, 2D gélelektroforézissel vagy nano-HPLC-vel történõ elválasztása, a fehérjék azonosítása a tömegspektrometriás peptidszekvenálás és adatbázisok segítségével. A kutatómunkát egy modern tömegspektrométer segíti, amely a legmodernebb szoftverrel van felszerelve. (A DNT 46 millió Ft-tal támogatta a csúcsteljesítményû mûszer beszerzését). A kutatóhely fõ feladata azoknak a célfehérjéknek az azonosítása és validálása, amelyek a neurodegenerációs folyamatokban kulcsszerepet játszanak. 7) Elektrofiziológiai Laboratórium. A munkahely fõ feladata a gyógyszerjelölt vegyületek központi idegrendszerre gyakorolt hatásának tanulmányozása in vivo elektrofiziológiai állatmodelleken. 8) Sejt-és Szövettenyésztõ Laboratórium. A laboratórium fõ feladata olyan in vitro kísérletek véghezvitele sejt- és szövetkultúrákon (pl. organotipikus kultúrák), amelyekkel a neurodegeneratív betegségek sejt- és szövetkultúra modelljein tanulmányozható a gyógyszerjelölt vegyületek hatása.
7
9) Fluoreszcens Mikroszkópiai Kutatóhely. + Sejt- és szövetkultúrákban specifikus fluoreszcens festéssel tanulmányozzuk a Ca2 beáramlást a sejtekbe, a + Zn2 -ionok felszabadulását és a membránpotenciál változásokat a gyógyszerjelölt vegyületek hatására. Egy fluoro-plate-reader hasonló alapelven gyors és kvantitatív méréseket tesz lehetõvé. 10) Állatház. A központban egymás mellett két állatház található: egy a patkányok és egy az egerek részére, minden felszerelés és berendezés eléri a GLP szintet. 11) Tanulási - Magatartási Laboratóriumok. Ezeken a munkahelyeken azt tanulmányozzuk, hogy a gyógyszerjelölt vegyületek milyen hatást gyakorolnak a patkányok és (ritkábban végrehajtott kísérletekben) az egerek tanulására és viselkedésére. A következõ kísérleteket használjuk: nyílt porond (open field) teszt; passzív- és aktív elhárító magatartás; emelet plusz labirintus (maze); Morris vízlabirintus; tárgyfelismerés; forgórudas teszt és keresztlabirintus. A fenti laboratóriumok mellett két másik kutatócsoport is helyet kapott a Centrumban: az Alzheimer-kór Kutatócsoport és az Enteriális Idegrendszeri Csoport. Az EGIS gyógyszergyár több laboratóriumot támogat a Centrumban. A DNT központi irodái szintén a Centrum épületében kaptak helyet. A DNT-t alkotó kisvállalatok (JSW Hungary, Rytmion, Vitadel Kft., Provit Kft.) mellett más cégek (General Electrics, Csertex, ISH Kft.) is laboratóriumot és/vagy irodát kaptak a Központ épületében. Egy 40 m2-es szemináriumkönyvtár helyiséget alakítottunk ki szemináriumok, elõadások, munkamegbeszélések és üzleti tárgyalások céljára. Jelenleg 72 m2 szabad, még nem beépített területünk van kisvállalatok induló vállalkozásához. A DNT-tag kisvállalatok nem fizetnek bérleti díjat, csak rezsiköltséget a laboratóriumok és irodák bérletéért, a többi partner bérleti díjat és rezsiköltséget is fizet. Így a Centrumnak van bevétele a további fejlesztések és az induló spin-off vállalkozások támogatására. (inkubátor funkció). A Centrum épülete a közeljövõben megvalósításra kerülõ „Szegedi Egészségügyi Központ” területének északi részén helyezkedik el, így a tervek megvalósítása során a Centrum kutatói fizikailag is szoros kapcsolatot tudnak fenntartani és kiváló együttmûködést kiépíteni az Egészségügyi Központtal. A Centrum kiváló tudományos és laboratóriumi hátteret ad a gyógyszerkutatás és fejlesztés szinte valamennyi fázisának, a felfedezéstõl a preklinikai és klinikai kísérletekig. A Centrumban jelenleg 35 szenior, posztdoktori és doktori ösztöndíjas kutató dolgozik.
8
SZAKMAI JELENTÉS 2005. november 1 - 2006. október 31. A DNT a neurodegenerációs betegségek (elsõsorban az Alzheimer- és Parkinson-kór), valamint a szorongásos betegségek és a depresszió kialakulásának mechanizmusát és gyógyszeres kezelési lehetõségeit kutatja. A DNT a projekt lezárása (2008. december) után is folytatni kívánja a kutató-fejlesztõ munkát, kibõvítve a Sclerosis multiplex, illetve a schizofrénia korai felismeréséhez kapcsolódó kutatásokkal. Az utóbbiakhoz a sikeres pályázás céljából már a következõ két évben megtesszük az elõkészületeket. Bár az alprogramok munkája szorosan kapcsolódik egymáshoz és sokszálú kooperációs hálózat alakultki, szervezési okok miatt a munkacsoportok munkáját 13 témacsoportra, klaszterre osztottuk fel. Ez a szervezés teljesen új és eredményei csak a jövõben mutatkoznak meg, de a szakmai beszámolót is a 13 témacsoport szerint tagoltuk. 2004-2008 2004-2008 KÖZÖTTI KÖZÖTTI KUTATÁSOK KUTATÁSOK
KÖ ZP O
K GE
Anxietás
ENDSZERI B EGR ET EG I ID T N
SÉ
Huntingtonkór
Schizofrénia
Alzheimer-kór
K GE
Parkinsonkór
Depresszió
ENDSZERI B EGR ET EG I ID T N
SÉ
KÖ ZP O
Alzheimer-kór
2009 2009 UTÁNI UTÁNI TERVEINK TERVEINK
Parkinsonkór
Depresszió
Huntingtonkór
Anxietás
1. ALPROGRAM: Kóros fehérje-aggregációval járó betegségek (Alzheimer-kór, Parkinson-kór) terápiájának kutatása Projektvezetõ: Dr. Penke Botond 1. Klaszter: Az Alzheimer-kór új gyógyszerei Projektvezetõ: Dr. Penke Botond Munkacsoportvezetõk: Dr. Bogár Ferenc, Dr. Dékány Imre, Dr. Kiss Tamás, Dr. Laczkó Ilona, Dr. Martinek Tamás, Dr. Kálmán János, Dr. Datki Zsolt, Dr. Toldi József, Dr. Budai Dénes, Bodóné Sipos Eszter Célok 1, Peptidek és peptidomimetikumok tervezése és szintézise a ß-amiloidok es az ?-szinuklein neurotoxikus hatasanak kivedesere 2, ß-amiloid es ?-szinuklein (NAC) aggregaciok, valamint az aggregaciora hato potencialis gyogyszerjelolt peptidomimetikumok vizsgalata fizikai-kemiai, spektroszkopiai es elektronmikroszkopos modszerekkel 3, Az Alzheimer- es Parkinson-kor potencialis peptidomimetikum gyogyszereinek tesztelese human trombocita modellen es in vitro sejttenyeszeteken 4, Az Alzheimer- es Parkinson-kor potencialis gyogyszereinek vizsgalata in vitro es in vivo elektrofiziologiai modszerekkel
9
5, Az Alzheimer-kor potencialis gyogyszereinek tesztelese patkany magatartasi es tanulasi kiserletekkel. Potencialis gyogyszermolekulak tesztelese az Alzheimer-kor transzgenikus egermodelljein Motivacio Magyarorszagon kb. 100.000, a vilagon 10 millios nagysagrendû az Alzheimer-kórban szenvedõk száma. A betegségnek jelenleg nincs kielégítõ gyógykezelése. Egy Alzheimer-kór elleni gyógyszernek óriási forgalma lenne, de már egy lezárt preklinikai dosszié is nagyon értékes. Eredmények 1, Peptidek és peptidomimetikumok tervezése és szintézise a ß-amiloidok es az ?-szinuklein neurotoxikus hatasanak kivedesere Az elõzõ munkaszakasz eredményit felhasználva javaslatot tettünk két a biológiai tesztek alapján hatásosnak bizonyult anyag, az LPFFD és LPYFDa módosítására. A tervezés során felhasználtuk, hogy a számítógépes dokkolás szerint az aszpirin molekula kötõdik az Aß molekulahoz es az aromas gyûrût tartalmazó aszpirin és kurkumin biológiai mérésekben bizonyos védõ hatást mutatott. Kiindulópontunk a következõ volt: • Újabb gyûrû beépítésével próbáltuk elérni, hogy a Soto-peptidben (LPFFD) és analógjában (LPYFDa) hasonló gyûrûeloszlás legyen, mint a kurkuminnál • A számítógépes szimuláció alapján a Soto-peptid 3-5-ös régiója amid zárás esetén másodrendû struktúrát mutatott, amit meg kívántunk tartani. A módosítást ezért az N-terminális leucin-prolin szakaszán végezzük el. Ezek alapján a következõ anyagokra tettünk javaslatot: aszpirin-FFDa, aszpirin-YFDa, szalicil-FFDa, szalicil-YFDa. Az eredeti öt aminosavat tartalmazó peptidbõl három aminosavat hagytunk meg, és a C-terminális végen, a prolin helyén szerepel a gyûrûs szalicil molekula, illetve annak acetiles változata. Az új vegyületekre is elvégeztük a szerkezetanalízises számításokat, mely a Soto-peptidhez, illetve az LPYFDa-hoz hasonló eredményre vezetett. Az elmúlt idõszakban a molekulák hatásmechanizmusának tisztázásával kapcsolatban két fontos új eredmény látott napvilágot. Egyrészt 2005 decemberében Rief és munkatársai [1] NMR-es mérésekkel igazolták a korábbi számítási eredményeket, mely szerint a Soto-peptid kötõdik az amiloid-ß(1-42)-hoz (tovabbiakban:Aß(1-42)) ezen belul is a 1622-es regiohoz; masreszt Martinek Tamas es munkatarsai 1H-NMR kotesteszt segitsegevel kimutattak az LPYFDa kotõdését az Aß peptidhez. Figyelembe veve ezeket a tenyeket a konformacioanalizist dokkolasi szamitasokkal egeszitettuk ki. Az itt alkalmazott un. „blind docking” [2] eljaras segitsegevel felterkepeztuk az Aß(1-42) szal lehetseges kotõhelyeit. Egy teljesen új vegyületcsalád vizsgálatát kezdtük el, amelyet eredeti módon terveztünk: membránfehérjékkel és fibrilláris Aß1-42 peptiddel vegzett elõzetes vizsgálatok során kutatócsoportunk azonosított számos, az Aß1-42 peptidhez kotõdõ fehérjét. Ezek szekvenciáját hasonlósági vizsgálatnak vetették alá matematikai algoritmusokat alkalmazva. Eredményként táblázatba foglalva megkaptuk a leggyakrabban elõforduló pentapeptid-szekvenciákat, és külön összegezve minden egyes aminosavnak a pentapeptid adott pozíciójában kiszámolható elõfordulási gyakoriságát. Erre a táblázatra alapozva végeztük el 6 pentapeptid tervezését és szintézisét, valamint in vitro életképességi teszttel (MTT) vizsgáltuk a vegyületek neuroprotektív hatását. A hat vegyület közül kettõ (No.1 és No.6) kiemelkedõ neuroprotektív hatást mutatott. A két vegyületre alapozva megkezdtük különféle módosított származékok, illetve peptidomimetikumok tervezését és szintézisét. A tervezés során a következõ szerkezetmódosításokat alkalmaztuk: 1. Pro/Sar csere 2. retro-peptidek szintézise 3. inverz-peptidek szintézise 4. retro-inverz-peptidek szintézise 5. Glu/piroGlu csere A fent említett eljárással eddig 20 vegyületet szintetizáltunk, melyek biológiai vizsgálata jelenleg folyik. Mivel a vizsgált és kiválasztott vegyületek az összes edddig ismert anyag közül a legjobb védõhatást mutatták Alzheimer-kór modellkísérletekben, elkezdtük az új vegyületcsoport szabadalmaztatását.
10
2, ß-amiloid es ?-szinuklein (NAC) aggregaciok, valamint az aggregaciora hato potencialis gyogyszerjelolt peptidomimetikumok vizsgalata fizikai-kemiai, spektroszkopiai es elektronmikroszkopos modszerekkel Az Aß(1-42) peptid hexafluoro-izopropanolban (HFIP) tortenõ elõkezelésével, a peptid ACSF-ben, illetve PBS-ben történõ oldásával, és az oldat 100 nm-es membránszûrõn való átszûrésével sikerült olyan mintát elõállítanunk, mely jelentõs mennyiségû Aß(1-42) oligomert tartalmaz. Ezen mintaban az oligomerek jelenlete mind a fenyszorasmeres (atlagos hidrodinamikai atmerõ (dH): 10 nm), mind a TEM-mérések alapján kimutatható (d= 6-10 nm). Az elõállított oligomer-minták aggregációját szobahõmérsékleten 20 órás folyamatos méréssel követtük. Megvizsgáltuk, hogy az oligomer-mintához LPFFD-OH pentapeptidet 1:5 molarányban adagolva változik-e az aggregáció kinetikája. A DLS-, illetve TEM-mérések szerint az oligomerek aggregációját nem befolyásolja a hozzáadott pentapeptid; mindkét esetben hasonló méretû és morfológiájú aggregátumok keletkeznek: a szakirodalomban általánosan elfogadott paraméterekkel rendelkezõ, azaz 4-7 nm átmérõjû és 30-100 nm hosszúságú protofibrillumok, illetve protofibrillumgombolyagok. Három különbözõ pH-értéken vizsgáltuk az Aß(1-42) oldodasat, illetve az azt kovetõ oligomerizációt: a. pH= 4.0, b. pH=7.4, c. pH=11.2 értékeken. Eredményeink szerint a fiziológiás pH-hoz képest a savas pH csökkenti az oldhatóságot, és nagymértékben növeli az aggregátumok méretét, míg a lúgos pH kedvez az oldódásnak, még dimerek jelenléte is detektálható az oldatban. Spektrofluorimetriás módszerrel vizsgáltuk az endomorfin-2 hatását az Aß(1-42) aggregációjára. Az endomorfin-2 egy endogén tetrapeptid (YPFF) amely szerkezeti hasonlóságot mutat az aggregációt gátló hatású (BSB=béta sheet breaker) LPFFD peptiddel. A spektrofluorimetriás méréseink során az amiloidhoz kötött tioflavin-T (ThT) festék fluoreszcens intenzitását mértük. A kísérletek azt mutattak, hogy állandó Aß(1-42) peptid (2 napig aggregáltattuk a mérés elõtt) és ThT koncentráció mellett az endomorfin koncentrációját változtatva a fluoreszcens intenzitás nem mutat szignifikáns változást. Eredményeink azt mutatták, hogy az LPFFD-t tartalmazó minták fluoreszcens intenzitása az idõ elõrehaladtával egyre nagyobb eltérést mutatott a csak amiloidot tartalmazó mintákétól, míg az endomorfin nem volt jelentõs hatással az aggregáció kinetikájára. Aß42 idõfüggõ aggregációjának és gátlásának tanulmányozása CD spektroszkópiával CD spektroszkópia: a méréseket vízben (pH ~6), 1 mm-es küvettában 25°C-on végeztük. A minták Aß42 koncentrációja: 44 µM. A gátlókat az idõfüggõ aggregáció 168 órán át tartó megfigyeléséhez a liofilizálás elõtt adtuk az amiloidhoz [gátló/Aß42 moláris arány, rM = 1] és feloldás után 5 percig szonikáltuk. A BSB hatás vizsgálatához az egy hétig öregített Aß42 vizes oldatához adtuk a gátlókat por alakban: gátló/Aß42 rM =2. Aß42 idõfüggõ aggregációjának gátlása (168 órás megfigyelés) t=0 óra: az Aß42 és az Aß42 + LPFFD-OH/ LPYFDa (rM=1) CD spektruma a ß-redõzött réteg és a rendezetlen konformerek elegyére utal t=168 óra: Aß42 168 óra után mind a pozitiv mind a negatív CD sáv csökkenése és a negatív sáv eltolódása a hosszabb hullámhosszak felé (216 nm › 226 nm) csavart ß-szerkezet kialakulására utal. LPYFDa jelenlétében az Aß42 hasonló spektrális viselkedést mutat mint önmagában, tehát az LPYFDa nem befolyásolja lényegesen az Aß42 aggregációját. LPFFD-OH jelenlétében a ß-redõzött réteg (csavart ß) nagyobb mennyisegben van jelen mint az Aß42 illetve az Aß42+LPYFDa eseteben tehat az LPFFD-OH az Aß42 tovabbi aggregaciojat idezi elõ. Célul tûztük ki az Aß1-42 es az amiloid fibrillumok mergezõ hatását kivédõ tetra- illetve pentapeptidek kölcsönhatásának vizsgálatát NMR spektroszkópia segítségével. Az elsõ félévben receptor-ligandum kötõdési vizsgálatokra kidolgozott módszert teszteltük az új Bruker AV600 spektrométeren Aß1-42 fibrillumokkal. A mérést elõször a tiszta ligandumon végezzük el, majd megismételjük a Aß142 fibrillum hozzákeverése után. A különbséget a kiindulási tiszta kispeptid karakterisztikus jeleinek intenzitásához viszonyítjuk (100 %). A 1H NMR méréseket vízelnyomásos technikával pH = 7,4-en foszfát pufferben készítettük, 0,1 mM : 0,5 mM = Aß1-42 : ligandum koncentracio arany mellett 150 µL terfogatban. A munka soran meghataroztuk a kotõdési vizsgálatok reprodukálhatósági körülményeit. Azt tapasztaltuk, hogy az MTT és elektrofiziológiai tesztekben hatástalan Gly5-NH2 és dfypl-OH esetén nincs jelintenzitás csökkenés, míg az RIIGLNH2, LPYFD-NH2, LPFFD-OH és az FRHDS szekvenciáknál a jelintenzitás 16-32% tartományban csökkent, ami szignifikáns mértékû kötõdésre utal. Következtetésként vonhatjuk le, hogy összefüggés áll fenn a biológiai teszektben mutatkozó védõhatás és az Aß1-42 fibrillumokhoz való kötõdés között: a bioaktív peptideknél az integrált jelintenzitás csökken, míg a hatástalan ligandumok esetén nem változott.
11
Az NMR-es kötési teszt további validálására teszteltük a ligandumhoz adott 1-3x-os Aß1-42 fibrillum mennyiség hatását a kötött ligandum arányra. Azt tapasztaltuk, hogy a növekvõ Aß1-42 mennyiséggel növekedett a kötött ligandum mennyisége, ami egyértelmûen igazolja, hogy a jelintenzitás csökkenés az Aß1-42-vel való kölcsönhatásnak tudható be. Az összes alkalmazott fizikai-kémiaimérés és mûszeres vizsgálat végeredménye egyértelmû: az eddig ßszerkezetrombolonak (BSB) tekintett pentapeptidek nem akadalyozzak meg az A?1-42 aggregaciojat (vagyis nem BSB hatasuak), viszont megkotõdnek az A?fibrillumokon és neuroprotektív hatásúak, mert megakadályozzák az Aßfehérje kölcsönhatásokat. 3, Az Alzheimer- és Parkinson-kór potenciális peptidomimetikum gyógyszereinek tesztelése humán trombocita modellen és in vitro sejttenyészeteken Egy új módszert dolgoztunk ki a Zn2+-ionok koncentrációjának in vitro szövetszeleteken történõ vizsgálatára, patkány hippocampusban. Hipotézisünk szerint a jövõben azok a cink-kelátorok lesznek az Alzheimer-kór gyógyszerei, amelyek normalizálják az agyban a Zn2+ koncentrációt. Az Alzheimer-kór egyik diagnosztikai markere a béta-amiloid (Aß) plakk jelenlete az agyszovetben, amelyben az amiloid aggregatumokon kivûl sok más alkotóelem is található. Ezen komponensek között vannak fehérjék, lipidek és 2+ fémion komponensek, pl. Zn . Az agyban lévõ cink ionok három forrásból származhatnak: (a) vezikuláris ürítés, amely az idegsejtek axonterminálisaiban lévõ preszinaptikus vezikulumokban található; (b) a membránhoz kötött metalloproteinekhez 2+ kapcsolódva, vagy (c) a citoplazma gyengén kötött Zn tartalma. A hippokampális CA3 régióban a glutamáterg végû mohaterminálisok vezikulumaikban nagy koncentrációjú szabad cink található. Ezen vezikuláris cink (együtt ürülve a 2+ glutaminsaval) neuromodulátor szerepet tölt be. A cink metabolizmusának zavara, a nem megfelelõ Zn szint az agy 2+ adott területein a neurodegeneratív betegségek iniciálásának egyik rizikó faktora lehet. A Zn egy kétarcú ion: úgy a drasztikus és tartós csökkenés, mint a hasonló, de fordított növekedés toxikus lehet. Szükség volt egy gyors és pontos módszerre, amellyel mérni tudtuk a hippokampális Zn2+ ürítés kinetikáját, valamint bizonyos kelátorok membrán 2+ permeabilitását (pl. TPEN; Kd for Zn = 6.3 x 10-16 M, pH=7.6). Ezt a módszert a korábbi esetekben, az irodalomban fuoreszcens mikroszkópon alkalmazták, de ez a módszer bonyolultsága miatt hosszú elõkészületeket igényelt. Mi a módszert átdolgoztuk fluoro-plate-reader-re ami sokkal gyorsabb és egyszerübb elõkészületet igényel. A cinket specifikusan jelölõ fluoreszcens festékünk egy vízoldékony, nem toxikus kelátor, az N-(6-methoxy-8-quinolyl)-pcarboxybenzoylsulphonamide (TFLZn). A módszer sajátosságai közé tartozik, hogy a 96-well plate-be a szeleteket egy autofluoreszcenciától mentes mûanyag hálóval rögzítjük. A szelet elmozdulása a mérés pontosságát befolyásolhatja, ezért volt szükség a háló alkalmazására. A teljes rendszer összeállítása az agy kiemelése után maximum 10 percig tart. A stresszorok és kelátorok tesztelése maximum 1,5 órát igényel. A szeletek életképességét több viabilitási teszttel is vizsgáltuk, kb. 2 óráig megfelelõnek találtuk. Ezen módszer alkalmazható más élettani folyamatok vizsgálatára is (pl. intracelluláris Ca2+, vagy pH mérésére), csak az adott fluoreszcens festék tulajdonságait kel figyelembe venni. 2+
Az eddigi mérések azt mutatták, hogy az excitátoros aminosavak, pl. glutamát tartósan megnövelték a Zn szintet a neuron citoplazmájában és találtunk olyan Zn2+ kelátorokat, amelyek normalizálták a Zn2+ -szintet mind a citoplazmában, mind az extracelluláris térben. 4, Az Alzheimer- és Parkinson-kór potenciális gyógyszereinek vizsgálata in vitro és in vivo elektrofiziológiai módszerekkel In vitro elektrofiziológia Patkány túlélõ agyszeletekben (motoros agykéreg) vizsgáltuk a neuro toxikus, ill. neuroprotektív peptidek hatását az idegsejtek aktivitására. Korábbi munkánkból ismert az, hogy a motoros kéreg 2/3 rétegbeli horizontális kapcsolatainak ingerlésével kapott kérgi mezõpotenciálokat az Aß(1-42) 10-5 M-os koncentracioban kepes tartosan 40-50%-al csokkenteni (Szegedi V. et al 2005, Neurobiol. Dis.). Elsõ kísérletsorozatunkban egy neurotoxikus peptidszármazék, a NAC („non-amyloid component”) szinaptikus plaszticitásra gyakorolt hatását tanulmányoztuk. Második kísérletsorozatunkban pedig ötszörös feleslegû koktélokban alkalmazva az alábbi vegyületeket teszteltük le: EPPPA-NH2, Gly5-NH2, Phpr-DTyr-DPro-TEDA és EPAPA-NH2. A vizsgált anyagok közül a leghatásosabbnak az EPPPA-NH2 és az EPPPA-NH2 bizonyult, ez a két peptid számítógépes molekulatervezés eredménye. In vitro elektrofiziológia altatott patkányon Az elõzõ elõzõ in vitro kísérletek során legaktívabbnak bizonyult két pentapeptid, az EPAPA és az EPPPA az in vivo
12
elektrofiziológiai mérésekben is a legaktívabb volt. A fenti két peptid Aß1-42-vel egyutt adva megakadalyozza az NMDA receptorokon mert tuzelesi frekvencia novekedest es normalizalja az Aß1-42-nek AMPA receptorokon mutatott neuromodulator hatasat is. A ket pentapeptid szerkezet vezervegyuletkent szolgalt tovabbi peptidek es peptidomimetikumok tervezesehez. Eddig 10 potencialis hatoanyagot teszteltunk glutamat receptorokon, az uj es nagyon aktiv neuroprotektiv anyagok szabadalmi vedelmet elkezdtuk. A projektben igen hatekonyan reszt vallalo Kation Bt. jelenleg a szenszalas elektrodak tovabbfejlesztesen es egy uj tipusu wolfram mikroelektroda kifejlesztesen dolgozik. A sajat fejlesztesû szénszálas üveg mikroelektródákból a a beszámolási idõszakban mintegy 1000 db-ot forgalmazott. 5, Az Alzheimer-kór potenciális gyógyszereinek tesztelése patkány magatartási és tanulási kísérletekkel. Potenciális gyógyszermolekulák tesztelése az Alzheimer-kór transzgenikus egérmodelljein AD modell patkányokon Az AD modellezésének az egyik legrégebbi és máig legelterjettebb módja a szintetikus amyloid ß(1-42) patkany agyba injektalasa. A beadas celpontjaul olyan agyteruleteket erdemes valasztani, mely a kor lefolyasaban kulonosen erintett (pl: entorhinalis kereg (EC), hippocampus (HC)). A modszer legfõbb elõnye a transzgenikus technikával szemben, hogy kivitelezése olcsó és egyszerû. Bár ezzel a modellel az AD-nak csak bizonyos tünetei idézhetõk elõ - amyloidosis, viszont kivállóan alkalmas az amyloidß(1-42) toxikus hatását célzó gyógyszerjelöltek tesztelésére, amennyiben a memóriaromlás mértéke kimutatható memóriatesztekkel. Kísérleteink során amyloidß(1-42) oldatot, valamint kontrollként fiziológiás sóoldatot injektáltunk felnõtt hím patkányok mindkét oldali EC-be. A magatartástesztek két héttel az operáció után kezdõdtek. Az egészen rövid távú, úgynevezett munkamemóriát Y -teszttel, a hosszú távú memóriát tárgyfelismerési teszttel mértük fel. A térbeli memória mérésére Morris-féle vizilabirintus tesztet alkalmaztunk. A magatartásteszteket követõen, abeinjektálás szövettani következményeit immunhisztokémiai módszerekkel vizsgáltuk. A vizilabirintusban és a tárgyfelismerési tesztben az amyloidß(1-42)-vel kezelt és a kontroll csoport teljesítménye között szignifikáns különbséget tapasztaltunk, míg az Y-tesztben a csoportok közel hasonlóan teljesítettek. A magatartástesztek eredménye szerint a beinjektált amyloidß(1-42) károsította a térbeli és a hosszú távú memórát, ugyakkor a munkamemóriában nem okozott kimutatható különbséget a kontroll és az Amyloidß(1-42)-vel kezelt csoportok között. A SZÚfcsatoma mentén nagy számú hip erre aktív asztrocita jelenléte volt kimutatható az amyloidß(1-42)-vel kezeiteknél, míg a kontrollok esetében ilyen erõteljes asztrogliaválaszt nem tapasztaltunk. Az amyloidß(1-42)-ra specifikus immunhisztokémiai festés eredményeképpen plakkszerû struktúrák jelenlétét mutattuk ki a kezelt állatok EC-ben. Transzgenikus modell: Kísérleteinket transzgenikus állatokra is kiterjesztettük, mely napjainkban, megbízhatósága miatt, a leggyakrabban alkalmazott modellek egyike. Az AD modellezésére a leginkább alkalmas amyloid prekurzor protein (APP) és preszenilin-l (PS 1) kettõs mutáns egértörzseket alkalmaztuk. Azt vizsgáltuk, hogy a kór lefolyása során a hippocampusban és neocortexben megjelenõ .és felhalmozódó amyloidß(1-42) miként befolyásolja a térbeli tájékozódást és a munkamemóriát. Amint az közismert, a térbeli tájékozódásért fõleg a hippocampus térsejtei, míg a munkamemóriért elsõsorban a frontális kérgi területek felelnek. Az APP+PS 1 mutáns egereket 11-12 hónapos korukban, a várható memóriadeficit, valamint a plakkok megjelentését követõen kezdtük tesztelni. A térbeli memória felmérésére a Morris-féle vizilabirintustesztet, a munkamemória vizsgálatára a T -tesztet alkalmaztuk. A vizilabirintus tesztben a kontrollként használt "vad" egerek a víz alatti platform helyzetét az 5 napos tesztelés során egyre gyorsabban ismerték fel, míg a transzgenikus egerek teljesítménye a tesztidõ alatt nem javult jelentõsen. A T-tesztben mind a kontroll, mind a transzgenikus egerek hasonlóan teljesítettek. A tesztek eredménye arra mutat rá, hogy az AD során fellépõ memóriadeficit szelektív, az agy specifikus területeinek mûködésére korlátozódik, ugyanakkor a betegség elõrehaladtával egyre nagyobb területet érint. Mérésünkben a térbeli memóriaromlás jelentkezett a hippocampus erõteljes érintettsége folytán, viszont a munkamemóriában még nem történt zavar. Intranazális modell: Az intranazális injektálás egy nem invazív, embereken is jól alkalmazható, effektív módja gyógyszerjelöltek és egyéb molekulák központi idegrendszerbe juttatásának. A módszer fõ elõnye, hogy megkerüli a vér-agy gátat, valamint a gyógyszerek first-pass metabolizmusát a májban és a gasztrointesztinális rendszerben. Korábbi kísérleteink igazolják a intranasalisan beadott amyloidß(1-42) fehérje bejutását az agyba. Ezek a vizsgálatok nagyobb mennyiségû amyloidß(1-42) fehérjét detektáltak a bulbus olfactorius, a frontal cortex, a cerebellum terüle in kizárólag az amyloidß(1-42)-val kezelt állatok esetén. A beavatkozás után négy héttel végzett ELISA méréseink eredményeképpen kizártuk a peptid beadása következtében kialakuló immunizálás lehetõségét is. A magatartásteszteket megelõzõen a
13
patkányok 5 napig kapták a vehiculumban (mukoadhezív és fehérjeoldó komponensekbõl álló oldószer) oldott amyloidB (l-42)-t (kezelt) és a vehiculumot (kontroll) 25µl mennyiségben a jobb orrlyukon keresztül. A munkamemória felmérésére Y -tesztet, a térbeli memóriára a Morris-féle vizilabirintus tesztet alkalmaztuk. A vizilabirintus teszt szerint az amyloidB(l-42)-vel kezelt állatok térbeli memóriája jelentõsen csökkent a kontroll állatokhoz viszonyítva, valamint az elõzõ modellekkel ellentétben, az Y -teszt is szignifikáns különbségeket eredményezett a kezelt és a kontroll csoport között. Ez utóbbi vizsgálat is a frontális kéreg munkamemóriában játszott szerepére mutat rá, továbbá arra, hogy a hippocampus akár kis mértékû károsodása is a térbeli tájékozódás romlását idézheti elõ. Együttmûködés Az 1. klaszter munkatársai elsõsorban a 3. és 5. alprogram munkacsoportjaival alakítottak ki szoros együttmûködést. 2. Klaszter:
Neuroprotektív szabad-gyökfogó vegyületek tervezése, szintézise, biológiai tesztelése. Kísérleti vér-agy gát modell kidolgozása Projektvezetõ: Dr. Zarándi Márta Munkacsoportvezetõk: Dr. Farkas Eszter, Dr. Deli Mária
Célok Neuroprotektív szabad-gyökfogó vegyületek tervezése, szintézise, biológiai tesztelése. Kísérleti vér-agy gát modell kidolgozása Motiváció Farmakológiailag nagyon jelentõs lenne olyan tokoferol származékok elõállítása, amelyek átjutnak a vér-agy gáton és neuroprotektív hatásúak. Erre komoly kereslet van és azonnal eladható funkcionális élelmiszerként lenne forgalmazható. Eredmények 1, Tocopherol származékok és tesztelésük Az á-tocopherol antioxidáns tulajdonságairól a legismertebb. Eddig legszélesebb körben az atherosclerosissal kapcsolatos betegségek (hypertensio, szívinfarktus) megelõzése céljából vizsgálták. Ezen túl, a közelmúltban felmerült az az elképzelés, hogy az á-tocopherol Alzheimer-kórban neuroprotektív lehet az oxidatív neuronkárosodás enyhítése révén. Mivel az á-tocopherol így mind keringési betegségekben, mind Alzheimer-kórban jótékony hatású lehet, azt tûztük ki célul, hogy megvizsgáljuk az ?-tocopherol hatását az agyi vérellátás krónikus csökkenése által kiváltott neurodegeneratív folyamatokra. Kísérleteinkben krónikus agyi hipoperfúziót idéztünk elõ patkányokban. Felnõtt, hím Wistár patkányok (n=135) arteria carotis communisát mindkét oldalon, permanensen lekötöttük (2VO), kontrollként áloperált állatokat használtunk. Az állatok felét á-tocopherollal kezeltük, amelyet ismételt elõ- vagy utókezelés formájában adtunk (5 x 100 mg/kg naponta, i.p.). Az állatok másik csoportja egyezõ protokoll szerint az á-tocopherol oldószerét, szójaolajat kapott. Egy héttel a carotis lekötést követõen az állatok tanulási képességét a Morris maze vízi útvesztõben teszteltük. A tanulási teszt után az állatok egy részébõl szövetmintákat vettünk (vér, máj, zsírszövet, agy) az á-tocopherol HPLCvel történõ szöveti koncentrációjának meghatározására. Az állatok egy másik csoportjánál agyszeleteket festettünk meg krezil-ibolyával a hippocampális piramissejt-réteg sérülésének vizsgálatára, illetve immuncytokémiai módszerrel meghatároztuk a MAP-2-pozitív dendritek denzitását, és az OX-42-vel jelölt mikroglia-aktivitást. Az á-tocopherol koncentrációja 2 héttel a carotis lekötést követõen jelentõsen megemelkedett a perifériás szövetekben és a vérben, míg az agyban kontroll értéken maradt. A tanulási tesztben az á-tocopherol csökkentette a carotis lekötés-okozta tanuláskárosodást. Elsõsorban az utókezelés védte ki a hippocampus CA1 piramissejtek pusztulását, és a MAP-2-pozitív dendritfák degenerációját. A mikrogliasejtek aktivációját az elõ- és utókezelés is kivédte. Eredményeink az irodalmi adatok tükrében arra engednek következtetni, hogy kezeléseink hatására az átocopherol felhalmozódott a perifériás szövetekben, míg az agyszövet nem képes az á-tocopherolt hosszú távon tárolni, így mérésünk idõpontjában a koncentrációnövekedés már nem volt detektálható. Kezelési protokolljaink közül elsõsorban az utókezelés bizonyult hatásosnak, amely valószínûleg azzal magyarázható, hogy az á-tocopherol koncentrációja akkor volt a legmagasabb – így az antioxidáns kapacitása akkor érvényesült leginkább, amikor az idegszöveti sérülés bekövetkezett. Kísérleteink rávilágítottak az á-tocopherol neuroprotektív tulajdonságára krónikus agyi hipoperfúzióban. Az á-tocopherol a patkányokban csak óriási dózisban (100 mg/kg napi dózis ip. beadással) okozott mérhetõ neuroprotektív hatást. A szakirodalom alapján elkezdtük a tocopherol-csoport további tagjainak, a gamma-
14
tocopherolnak és tocotrienolnak a biológiai tesztelését is. A szakirodalom adataiból és saját kísérleteinkbõl is világossá vált, hogy a tocopherolok neuroprotelktív hatásában elsõsorban nem a szabad gyökökkel való reakció játszik szerepet, hanem sokkal inkább olyan membránreceptorok aktiválása, amelyek beindítják a sejtek védekezési mechanizmusát. Ezzel magyarázható, hogy az in vitro mérések szerint az á-tocopherol igen kicsiny, míg a gamma- tocopherol és a tocotrienolok nagy neuroprotektív hatással rendelkeznek. A pozitív kísérletek ellenére három problémát kell ahhoz megoldanunk, hogy eladható termékhez jussunk: 1, a tiszta gama- tocopherol és a tocotrienolok magas ára; 2, ezeknek a vegyületeknek alacsony vízoldékonysága és 3, átjutásuk a vér-agy gáton. Elõkísérleteink szerint a 2. és 3. probléma viszonylag egyszerûen megoldható molekuláris „csomagolóanyagok” (pl. ciklodextrinek, vagy lecithin) alkalmazásával. 2, Agyi endotélsejtek interakciójának vizsgálata pathológiás fehérjeaggregátumokkal, peptidekkel: vér-agy gát funkciók vizsgálata A 2005-ös év során megállapítottuk, hogy az amyloid-ß peptid 25-35, 1-40 és 1-42 szakaszai, valamint a prion fehérje (PrP) 106-126 peptidszakasza 10-200 µM koncentrációban, 24-48 órás inkubációt követõen közvetlen toxikus hatást fejtenek ki agyi endotélsejtekre. A 2006-os évben a munkatervnek megfelelõen kísérleteinket a vér-agy gát funkciók vizsgálatára összpontosítottuk, melyek létrehozzák és fenntartják a központi idegrendszer homeosztázisát. Ebben fontos szerepet játszanak a sejtek közötti szoros zárókapcsolatok (tight junction, TJ). A TJ funkciót transzendoteliális elektromos ellenállás (TEER), valamint tesztmolekulák átjutásával mértük. Az asztrocita ko-kultúrában tenyésztett primer agyi endotélsej rétegek ellenállását mind a PrP106-126, mind az amyloid-ß 1-42 peptid kezeles csokkentette, s novelte a paracellularis marker fluoreszcein (ms. 376 Da) es a transzendothelialis tesztmolekula albumin (ms. 67 kDa) atjutasat a sejtretegen A TJ feherje ZO-1, claudin-5, occludin immunfluoreszcens festesevel igazoltuk, hogy a paracellularis permeabilitas emelkedes hattereben az agyi endotelsejtek TJ strukturajanak valtozasa all. Amyloid-ß 1-42 peptid kezeles hatasara a folyamatos, sejtek konturjat kirajzolo ZO-1 festõdés megváltozott, intenzitása csökkent, felszakadozott, a sejtek között rések jöttek létre (ábra). A claudin-5 és occludin integráns TJ fehérjék esetében is hasonló immunjelölést kaptunk. A prion peptid 106-126 kezelés hasonló változást okozott agyi endotélsejt rétegeken. Az amyloid típusú peptidek drasztikusan befolyásolták az agyi endotélsejt rétegek integritását. A TEER csökkenése és a markerek permeabilitási koefficiensének emelkedése arra utalt, hogy a peptidek hatására az endotélsejtek közti szoros zárókapcsolatok mûködése károsodott. Ezt igazolta az endotélsejteket összekapcsoló TJ struktúrák fehérjéinek megváltozott immunfestése, ami a zárókapcsolatok meggyengülését és felszakadozását mutatta. Adataink alapján az amyloid peptidek közvetlenül károsítani tudják a vér-agy gát barrier funkcióját. 3. Klaszter:
Az Alzheimer-kór gyógyszerjelölt vegyületeinek in vivo vizsgálata és toxikológiája Projektvezetõ: Dr. Falkay György Munkacsoportvezetõk: Dr. Nagymajtényi László. Dr. Benedek György, Dr. Erõs István
Célok Gyógyszerjelölt vegyületek (hatóanyagok) bejutása a központi idegrendszerbe, toxikológiai paramétereinek megállapítása, funkcionális neurotoxikológiai vizsgálatok; a hatóanyagok szöveti megoszlásának vizsgálata. Motiváció A fenti vizsgálatokpozitív eredménye esetén ezen a szinten lezárható a preklinikai vizsgálatsorozat és egy eladható termék jön létre, amely Alzheimer-kór ellenes gyögyszer kifejlesztése esetén nagy értéket képvisel. Eredmények 1, Hatóanyagok transzportja a központi idegrendszerbe Kísérleteink során hatóanyagok központi idegrendszerbe történõ transzportját vizsgáltuk intranazális beviteli kapu alkalmazásával, melynek segítségével mód nyílik hatóanyagoknak a vér-agy gát megkerülésével történõ közvetlen agyba juttatására. Vizsgálataink célja megfelelõ Alzheimer-kór modell kialakítása volt ß-amiloid peptid intranazális alkalmazásával. Elõkísérletek során fluoreszcens mikroszkópiás vizsgálatokkal igazoltuk a fluoreszceinizotiocianáttal jelölt dextrán (FITC-dextrán, Mw=4400 Da) és AMCA fluoreszcens festékkel jelölt amiloid peptid (1-40 és 1-42) agyba irányuló transzportját. A következõ lépésben a transzport kinetikájának meghatározását tûztük ki célul. A tesztanyagként alkalmazott FITC-dextránt mukoadhezív és felületaktív anyagokat tartalmazó vizes közegû micelláris oldatba inkorporáltuk 1 mg/ml koncentrációban. Összehasonlításként fiziológiás sóoldatot alkalmaztunk, mely hasonló koncentrációban tartalmazta a FITC-dextránt. A mukoadhezív készítmény és a kontrollként alkalmazott összetétel 40-40 µl-ét juttattuk be éteres narkózissal elaltatott 2 hónapos Wistar patkányok jobb orrlyukába. A
15
patkányagyakból 10-10 régiót (jobb-, bal szaglógumó; jobb-, bal frontális kéreg; jobb-, bal parietális kéreg; hipokampusz; középagy; híd; kisagy) különítettünk el további vizsgálatok céljából. A minták FITC-dextrán tartalmát fluoreszcens spektrofotométer segítségével határoztuk meg. Az eredmények alapján megállapítható, hogy a fiziológiás sóoldathoz képest a mukoadhezív és felületaktív segédanyagokat tartalmazó készítmény esetében lényegesen több FITC-dextránt detektáltunk a kísérleti állatok valamennyi vizsgált agyrégiójában. A tesztmolekula legnagyobb koncentrációját a jobb oldali szaglógumóban, frontális és parietális kéregben mértük, de a mukoadhezív formula, mint vivõanyag a fiziológiás sóoldattal szemben még a középagyban és a hídban is jelentõsen fokozta a FITC-dextrán bejutását. Az agyba jutott ß-amiloid fehérje hatásának kimutatására magatartásvizsgálatokat is végeztünk. Az elsõ vizsgálat során egy hónapon keresztül az állatok naponta 10 µg ß-amiloid fehérjét kaptak intranazálisan . Az állatok egy másik csoportját pedig naponta 2x10µg ß -amiloid fehérjével kezeltük. Elõzetes magatartás kísérleteink alapján az intranazális beviteli rendszer alkalmas lehet egy új Alzheimer-modell kidolgozására. 2, A triciált LPYFD (Tyr-Soto peptid) megoszlása patkányban A hím patkányokat (SPRD, tömeg: 200 g) 100 ?l (P59), illetve 20 µl (Tyr-SOTO) tríciált peptiddel kezeltük intravénásan. A beadást követõen különbözõ idõpontokban (30, 60 perc – P59; 50, 100, 200 perc – Tyr-SOTO) az állatokat elaltattuk, majd a mellkas felnyitása után szív punctioval levettük a vérüket. Ezt követõen a kísérlet szempontjából fontos szerveket (agy, máj, vese, lép, gyomor, herék, tüdõ, szív) kivettük, majd megmértük a szervek tömegét. 50-250 mg szövetet kimetszettünk, a mintákat feloldottuk (2 ml Solvable) és 60°C-on 1 (vér, máj), 2 (vese, agy, tüdõ, here, lép), illetve 3 (szív, gyomor) órán át inkubáltuk. Szobahõmérsékletre történõ hûtés után 200 µl 30 %-os H2O2 oldatot adtunk a rendszerhez (vér esetében 0,1 M EDTA, majd 500 µl H2O2), majd az oxidációs reakciók lejátszódása után újabb 30 percig 60°C-on inkubáltuk az elegyet. Szobahõmérsékletre történõ hûtés után az elegyekhez 10 ml szcintillációs koktélt adtunk (OptiPhase HiSafe 3) és egy éjszakai állás után folyadék szcintillációs számlálóban meghatároztuk a minták radioaktivitását. 3 A [ H]Tyr-SOTO peptid mindhárom vizsgált idõpontban (50, 100, 200 perc) átjut a vér-agy gáton, legnagyobb dózisban a májban van jelen mindhárom idõpontban. A vizsgált peptid mennyisége az agyban folyamatosan emelkedik: 50 perc után 1,32±0,12 pmol/agy, 100 perc után 1,48±0,06 pmol/agy, míg 200 perc után 1,68±0,05 pmol/agy. A kezelést követõ 200. perc után a tríciált peptid mennyisége egyik szervben sem csökken jelentõsen, eliminációja lassú. A kísérletek szerint gyomorszondából is felszívódik a jelzett pentapeptid és bejut az agyba. A radioaktivitás a 200. percig folyamatosan nõ, de még HPLC-vizsgálatokkal bizonyítanunk kell, hogy a változatlan pentapeptid molekula van-e az agyban, vagy valamelyik metabolitja. 3 Az Alzheimer-kór gyógyszerjelölt vegyületeinek in vivo vizsgálata és toxikológiája amiotroph lateral sclerosis (ALS) modellen Ezeket a kísérleteket elsõsorban szabadalmi okokból végeztük el, mert felmerült, hogy a ß-amiloid az ALS keletkezésében is kulcsszerepet játszik, így a ß-amiloid hatását közömbösítõ neuroprotektív gyógyszerjelölt vegyületeink az ALS kezelésében is sikeresek lehetnek. Beállítottuk az ALS patkánymodelljét, (ß-amiloidot jutattunk be intrathecalisan a patkány gerincvelõ egy adott szakaszára) és mozgási teljesítmény alapján megvizsgáltuk, javít-e az állatok állapotán a gyógyszerjelölt anyag. Az elõkísérletek (forgórudas vizsgálatok, mozgási teljesítmény) alapján a gyógyszerjelölt vegyület véd a ß-amiloid gerincvelõi neurotoxikus hatásaival szemben is. 2. ALPROGRAM: Szorongásos betegségek és kóros neuroendokrin folyamatok (tanulás- és memóriazavarok, stressz, szenvedélybetegségek) gyógyszeres kezelése Az alprogram két területen kapcsolódik a gyógyszerkutatáshoz és fejlesztéshez: a szorongásos betegségek és a depresszió (4. klaszter) ill. a szenvedélybetegségek kezelésére alkalmas új vegyületek kutatásával (5. klaszter). Külön kutatási-fejlesztési irányt képvisel az enterális idegrendszer, a „brain-gut axis” vizsgálata (7. klaszter).
16
4. Klaszter:
Anxiolitikumok kutatása; AMPA-receptorok modulációja Projektvezetõ: Dr. Telegdy Gyula Munkacsoportvezetõk: Dr. Telegdy Gyula, Dr. Lévay György
Célok 1, Szorongást és stresszhatást befolyásoló, anxiolitikus hatású peptidek és peptidomimetikumok tervezése, szintézise és biológiai vizsgálata 2, Az AMPA/Kainát receptorokat moduláló potenciális gyógyszerek szintézise, in vitro és in vivo tesztelése és Az AMPA receptor moduláló gyógyszerek hatásmechanizmusának vizsgálata Motiváció Nagy gyakorlati jelentõsége van a szorongást és stresszhatást befolyásoló peptideknek és mimetikumoknak, ezek mint vezérvegyületek (lead) szerepelhetnek a további gyógyszerfejlesztésekben. Az AMPA receptor moduláló vegyületek a pánikbetegségek gyógyszerjelölt molekulái Eredmények Anxiolitikum és antidepresszáns hatású peptidek A CRH peptid család tagjai, mint az urocortin 1, 2 és 3 különbözõ receptorokon hatnak. Az urocortin 3 a CRH 2 receptoron hatva anxiolitikus és stress csökkentõ hatást fejt ki. Antidepresszáns hatásra vonatkozóan nem ismerünk adatokat. Elkezdtük az urocortin 3 (UN3) antidepressziv hatásának tesztelését az irodalomban általában használt módszerrel az ún. erõltetett úszási teszttel. Eddigi vizsgálatok megerõsitik a feltételezést, nevezetesen, hogy az UN3. antidepresszios hatással rendelkezik. A molekula hatáscentrumának vizsgálatai folyamatban vannak. Az urocortin család 1, 2 és 3 származékairól kimutattuk, hogy emeli a colon hömérsékletet . Mindhárom hasonló hatást fejt ki a hatás megjelenésének idejében valamint a dozisokban van külömbség a különbözõ származékok között. A cyclooxigenaz-bénitó noraminophenazon kivédte az urocortinok testhõmérséklet emelõ hatását, bizonyitva a prostaglandinok szerepét az urocortinok által létrehozott hyperthermiában. In vitro vizsgálatokban kimutattuk, hogy striatum szeletek dopamin kibocsájtását a CRF és az urocortin fokozta, amelyet a CRF 1 antagonista antalarmin gátolt, az urocortin 2 és urocortin 3 hatástalan volt. Hasonló rendszerbe teszteltük az endomorfin 1 (EM1) és endomorfin 2 (EM2) dopamin kibocsájtó hatását. Kimutattuk, hogy mind az EM 1 és az EM2 fokozta az elektromos áram okozta dopamin kibocsájtó hatását Az EM1 hatása a muopioid 2, míg az EM2 a mu-opiod 1 receptoron keresztük fejti ki a hatását. Elkezdtük a szorongás proteomikai és genomikai vizsgálatait patkányokban. A szorongó és nem szorongó állatok szétválasztása megtörtént (Telegdy), Az agyból az amygdala, entorchinális kéreg és egyéb kéregrészek szétválasztása megtörtént (Palkovits). További vizsgálatra az anyagok feldolgozása folyamatban van. Befejeztük a ghrelin, mint újonnan felfedezett peptid, hatásának vizsgálatát. A ghrelin agykamrába adva aktiválja a hypophysis-mellékvesekéreg rendszert, emeli a testhõmérsékletet és fokozza az állat mozgásaktivitását. A CRH antagonista és haloperidol kivédte a mozgásaktivitás fokozását. Cyproheptidin gátolta a mellékvesekéreg aktivitást. A testhõmérséklet emelõ hatást a cyproheptidin és a prostaglandin szintézist gátló noraminophenazon csökkentette. AMPA-receptor moduláló vegyületek A projekt keretében az elmúlt félévben 2 vegyületcsaládban összesen 45 db új vegyület szintézise történt meg. A vegyületek biológiai hatékonyságát a projectben elfogadott screen rend szerint vizsgáljuk. Ennek értelmében a fenti vegyületeket elõször in vitro elektrofiziológiai és izolált szervi rendszerekben teszteljük, a hatékony származékokat pedig in vivo kísérleti rendszerekben tovább vizsgáljuk A félév folyamán a fentieknek megfelelõen a következõ vizsgálatokat végeztük el: • Patkány hippokampusz szelet elektrofiziológia, populációs spike mérése: 45 vegyületet vizsgáltunk, közülük 6 jó hatással rendelkezett. • Spreading depression mérése izolált csirke retinán: a kényszerszünet után újrakezdett teszten 18 vegyületet vizsgáltunk meg.
17
• Patch clamp vizsgálatok izolált cerebelláris Purkinje sejteken: 20 vegyület vizsgálatát végeztük el, közülük 3 mutatott gyenge AMPAR pozitív modulátor hatást, a többiek hatástalanok voltak. • In vivo magartásfarmakológiai módszerekkel 10 vegyület anxiolitikus és /vagy antidepresszáns hatását vizsgáltuk meg, ebbõl 1 vegyületet további fejlesztésre javasoltunk. A vegyület antidepresszáns-anxiolitikus terápiás hatással rendelkezik, jelenleg toxikológiai vizsgálatai folynak. Az eredményekbõl 2 szabadalmi bejelentés született. A racionális molekulatervezést nagymértékben meggyorsítja a HPC Szeged Komputer Központ üzembe állása ez év május-júniusában. A szállítók ajánlatainak ismételt áttekintése után az a döntés született, hogy két fõ komponensbõl álló heterogént rendszer kerüljön beszerzésre: egy „Symmetric Multiprocessing” (SMP) gép, valamint egy klaszer-típusú gépegyüttes. Az elõbbit a Silicon Graphics, Inc. (SGI), az utóbbit Fujitsu-Siemens Computers (FSC) le is szállította a második negyedév elején, a következõ konfigurációban (hardver installálásuk megtörtént május 5-én ill. június 7-én): SGI Altix 3700, 48 Intel Itanium processzor, 48Gbyte osztott memória, 2 TByte merevlemez FSC “Primergy Server” 19 AMD Opteron Dual-core Dual-processor számító-egység (összesen 76 processzor -mag), mindegyikhez 3.5Gbyte memória és 160 GByte merevlemez 1 Intel Xeon Dual-core processzor alapú „head node”, 600 GByte merevlemez-köteggel. A felhasználói szoftverkörnyezet megtervezését már a beszerzés elõtt végrehajtották a rendszer-adminisztrátorok. Döntés született a megfelelõ Linux-disztribúció használatáról, és összegyûjtöttük a kezdetben megkívánt alkalmazások listáját. Mivel a tervezett programok többsége nem volt még kellõen tesztelve a beállításra kerül 64-bites operációs rendszer alatt, saját teszjeinket végezük a helyben lefordított verziókkal. Ezen kívül már a korai szakaszban is elõzetes tervek készültek, majd a felhalmozódó tapasztalatok alapján módosultak, a futtatások automatizált kezelésére Distributed Resource Management (DRM) szoftverrel. Választásunk a Sun Grid Engine termékre esett, amely felhasználóink egy részére már megszokott volt. Ennek krábban alkalmazott ehetõségeit kibõvítve, a jelen megvalósítás a felhasználók között az idõátlagban igazságosan elosztott “fair sharing” elvet követi. A kezdeti beállítás és tesztelés sikeres szakaszát követõen, a HPC Szeged Központ immár készen áll a kutatócsoportok kiszolgálására az ország minden részébõl (különös tekintettel a regionális együttmûködésre). Az installált szoftverek molekuláris rendszerek jellemzésének széles körû lehetõségeit nyújtják, beleértve a biokémiai és gyógyszerészeti érdeklõdésre számot tartókat. Különösen elõnyös lehet a nagyteljesítményû párhuzamos alkalmazási környezet a kvantumkémiai és molekuladinamikai programcsomagok számára. Együttmûködés Telegdy Gyula munkacsoportja kollaborációt folytat Tóth Gábor (13. klaszter) munkacsoportjával az urocortin peptidvizsgálatával és szabadalmaztatásával kapcsolatban. 5. Klaszter:
Opioid agonisták és antagonisták Projektvezetõ: Dr. Borsodi Anna Munkacsoportvezetõk: Dr. Benyhe Sándor, Dr. Tóth Géza, Dr. Szûcs Mária, Dr. Szabó Gyula
Célok 1, Új opioid és nociceptiv receptor szelektív agonista és antagonista peptidek szintézise, radiojelölése, biokémiai vizsgálata 2, Opioid peptidek komplex magatartás vizsgálata. Egy nem addiktív új opioid típusú analgetikum vagy gyógyszerkombináció vizsgálata és kifejlesztése Motiváció A szenvedélybetegségek (kábítószer- és alkoholfüggõség) leküzdésének elsõ lépését jelentik azok a vizsgálatok, melyek a különbözõ agonista és antagonista peptidek és mimetikumok pontos hatásmechanizmusának megértését teszik lehetõvé. Errõl a pontról indulhat egy racionális gyógyszertervezés. Eredmények 1, Opioid agonista és antagonista vegyületek szintézise, radiojelölése, biokémiai vizsgálata. Új TIPP (Tyr-Tic-Phe-Phe-OH) és TIPP-NH2 peptideket állítottunk elõ. Az új analógokba ßMePhe és/vagy ßMeCha (ß-
18
metil-ciklohexilalanin) nem természetes aminosavakat építettünk be. Az említett aminosavak szintézisét laboratóriumunkban valósítottuk meg. A ßMeCha új aminosavnak tekinthetõ. A ßMeCha-nak 4 izomerje van, így 8 peptidet állítottunk elõ. A peptideket biológiai tesztekben Borsodi Anna és Szabó Gyula laboratóriumában jellemezték. A legjelentõsebb analógnak a Dmt-Tic-(2S,3S) ßMeCha-Phe-OH bizonyult, mivel nagy affinitással és szelektivitással kötõdött a delta opioid receptorokhoz, funkcionális tesztekben pedig delta antagonista tulajdonsággal bírt. Ezeknek az eredményeknek az eléréséhez a Flamand-magyar TéT pályázatunk is jelentõsen hozzájárult. Eredményeinket a Neurosignals-ban közöltük. Endomorfin (Tyr-Pro-Phe/Trp-Phe-NH2) analógjaink közül a Pro-t helyettesítettük aminociklopentán-karbonsavval (ACPC). Az új analógok biológiai rendszerben (patkány agyi preparátum) enzimekkel szemben ellenállóknak bizonyultak. Ezt a munkát Szûcs Máriával közösen végeztük, a biológiai jellemzést részben az õ laboratóriumában végezték. A Tyr-(1S,2R) ACPC-Phe-Phe-NH2-ot tríciált formában az elõzõ évben állítottuk elõ, a biológiai jellemzését ebben az évben valósítottuk meg. A triciált ligandumot ebben az évben termekké fejlesztetük, amit az Izotóp Intézet Kft forgalmaz. Rónai Andrással (SOTE) és munkatársaival együttmûködve kísérletet tettünk az endomorfinok bioszintézisének feltérképezésére, 3H-Tyr-Phe-OH dipeptid prekurzor felhasználásával. A dipeptidet élõ patkány agyába injektáltuk, majd az agyi extraktumból HPLC vizsgálattal a tríciált endomorfin-2-t azonosítottuk. A Regulatory Peptides-ban ezekbõl a vizsgálatokból jelent meg cikkünk. Együttmûködtünk a Délalföldi Neurobiológiai Tudásközpont más csoportjaival is. Elõállítottunk fenilpropionil-D-Tyr-DPro-TMDA peptidet tríciált formában Prof. Penke Botond csoportjával, amit biodisztribúciós vizsgálatokban használtak. Ezenkívül tríciált endomorfin-2-t is bocsátottunk rendelkezésükre. Eredményeik szerint az Aß1-42 neuronális toxicitását az endomorfin-2 csökkentette, ennek alapján az endomorfin alapvegyület lehet gyógyszerfejlesztésük során. Errõl írt publikációnk a FASEB Journal-ban jelent meg. Külföldi tudományos együttmûködésünk eredményeként svéd kutatókkal sikerült bizonyitanunk, hogy az endomorfin1 és endomorfin-2 különbözõen kötõdik a Substance P aminoterminális végének a SP(1-7)-nek a specifikus kötõhelyéhez. Ezeket az eredményeket a Peptides-ban közöltük. Nagy szelektivitású, a nociceptin receptorokon ható agonista és antagonista ligandanalógok részletes hatástanulmányozását valósítottuk meg in vitro és in vivo modellrendszerekben. Radioreceptor kötési és G-fehérje aktivációs kísérletekben jellemeztünk 13 új NOP receptor ligandot, amelyek kémiai szerkezete az Ac-RYYRIK-ol struktúrán alapult. A származékok az N- és a C-terminálison módosított, valamint szisztematikus Arg ? Cit (Cit = citrullin) szubsztitúciókat tartalmazó hexapeptid analógok voltak. A szerkezet-hatástani adatok arra utaltak, hogy az 4 1 1 Arg citrullinra kicserélhetõ, bár a peptidek biológiai aktivitása némiképpen csökkent, ugyanakkor az Arg ? Cit szubsztitúció gyakorlatilag hatástalan ligandokat eredményezett. A redukált C-terminálisú, alkoholos hidroxid funkciót hordozó peptideket (-Lys-OH, lizinol) hatékonyabbnak találtuk az amidált szerkezetnél (-Lys-NH2). Az Nterminális acetil csoport szintén szükségesnek látszik a nagy affinitás szempontjából és csak korlátozottan helyettesíthetõ pl. klóracetil funkcióval (közlemény: Neurosignals). Folytattuk a ‘lead’ molekulának tekintett acetilált hexapeptid, Ac-RYYRIK-ol biokémiai és farmakológiai jellemzését. A peptid hatásai meglepõen komplexnek bizonyultak, a hatásjelleg függött a tesztrendszertõl és a kísérleti körülményektõl is, a legjelentõsebb faktornak a jelerõsítés hatásfoka (‘stimulus-effect efficiency’) tûnik. Az AcRYYRIK-ol kompetitív antagonistaként viselkedett egér vas deferens preparátumban, és patkány agyi 35 [ S]GTPgammaS kötési kísérletekben. A humán NOP receptorokat expresszáló CHO-sejttenyészetben a peptid 35 tiszta agonista hatásokat mutatott a [ S]GTPgammaS kötési tesztben, aminek okát a natív agyszöveti minták receptor denzitását lényegesen meghaladó receptor-kapacitásban látjuk a sejtkultúra esetében. Egér vastagbél szövetszelet teszten (‘mouse colon bioassay’) a peptid tiszta agonistaként mûködött, és bizonyítottan NOP receptorokon keresztül -/hatott, mert NOP-receptor-hiányos (NOP knock-out) egerekben nem észleltünk izomösszehúzó-hatást. Valamennyi eddig elvégzett in vivo kísérletben az Ac-RYYRIK-ol peptid hatásait hasonlónak találtuk az endogén agonista nociceptin hatásaihoz (spinális és szupraspinális antinocicepció, táplálékfelvételi, lokomóciós, és ‘forced swimming’ tesztek). Az AcRYYRIK-ol minden vizsgált módszerrel nagy hatáserõsséget (affinitás, potency) mutatott, valamint kémiai stabilitása is számottevõ volt (relatív enzimrezisztencia, in vitro). A peptid ligand tehát egy ‘low efficacy’ parciális agonista, ami megfelelõ körülmények között akár tisztán kompetitív agonista hatásokat is mutathat (közlemény: Eur. J. Pharmacol.). Biokémiai kísérletekben jellemeztük a nociceptin peptid néhány karbamoil-származékát. Ezek az analógok csökkent receptor kötõdést mutattak, ugyanakkor a kémiai módosítások növelték a ligandokat inaktiváló endopeptidáz enzimekkel szemben mutatott kémiai stabilitást (közlemény megjelenés alatt: J. Pept. Sci.).
19
2, Opioid peptidek komplex magatartás vizsgálata. Nem addiktív új opioid típusú analgetikum kifejlesztése. Egyik célunk, azaz kis dependenciakapacitású, kevés mellékhatással rendelkezõ opioid analgetikum kifejlesztése, ún. ‘lead’ molekulák kiválasztása céljából szerkezet-hatás vizsgálatokat végeztünk a mu-receptor endogén ligandjainak tekintett endomorfin-1 és endomorfin-2 konformációsan gátolt 8 új származékával, amelyeket Tóth Géza (SZBK Biokémiai Intézet) csoportja szintetizált. Az új vegyületek a Pro2 helyett aliciklusos aminociklopentán-karbonsavat, ACPC-t és aminociklohexán-karbonsavat, ACHC-t tartalmaznak cisz (S,R és R,S) illetve transz (S,S és R,R) konfigurációban. Radioligand kötési és G-fehérje aktivációs kísérleteink alapján arra a megállapításra jutottunk, hogy a ß-aminosavat 1S,2R konfigurációban tartalmazó endomorfin származékok az alapvegyületekhez hasonló, vagy kismértékben megnövekedett affinitással és szelektivitással kötõdõ mu-opioid receptor agonisták, amelyek emellett extrém proteolitikus stabilitással is rendelkeznek, ezért in vivo vizsgálatokhoz is kiváló eszközök lehetnek Az 1R, 2S konfigurációjú származékok nagyságrendekkel kisebb affinitásúak. (Kézirat írás alatt). Az új ligandok akut és krónikus intracerebroventriculáris expozíciója által kiváltott analgetikus hatásvizsgálatok, tolerancia mérések Szabó Gyulával (SZTE Kórélettani Intézet) együttmûködésben, továbbá a receptoron kiváltott regulációs folyamatok vizsgálatai folyamatban vannak Két „lead” molekulát választottunk ki további részletes biokémiai vizsgálatokra. A vegyületek radioaktív jelölését Tóth Géza (SZBK Biokémiai Intézet) csoportja végezte. A [3H]Tyr-(1S,2R)ACPC-Phe-Phe-NH2 (38,17 Ci/mmol) és a [3H]Tyr(1S,2R)ACHC-Phe-Phe-NH2 (63,4 Ci/mmol) kötõdésének részletes kinetikai, telítési és kompetíciós mérésével megállapítottuk, hogy mindkét új radioligand nagy affintással és szelektivitással jelöli a patkány agyi mu-opioid receptorokat. A két új radioligand kiváló eszköz lehet a mu-receptorok bioaktív konformációjának vizsgálatára. Termékké fejlesztésük folyamatban van. Közlemény Peptides-ban megjelenés alatt. Kifejlesztettünk egy új, konformációsan gátolt, enzimrezisztens delta-opioid peptid antagonistát Tóth Géza (SZBK Biokémiai Intézet) csoportjával együttmûködésben jelöletlen és triciált formában. Radioligand kötési tesztben és 35 ligand-stimulált [ S]GTP?S funkcionalis meresekkel reszeletesen vizsgaltuk kotesi parametereit, un. ‘efficacy’-jet es specifitasat. Eddigi eredmenyeink arra utalnak, hogy az uj ligand delta-1 receptor szelektiv, amely elõtt széleskörû alkalmazási lehetõségek vannak (Kézirat írás alatt). Vizsgálatokat kezdtünk egy másik, mind a klinikumban, mind a kábítószerfüggésben kitüntetett szerepet játszó vegyületcsalád, a kannabiszok receptorainak, illetve azok más receptorokkal való interakciójának vizsgálatára. A gyógyszerkutatást forradalmasíthatja a közelmúlt azon felfedezése, hogy a G-protein kapcsolt receptorok nem monomerek, amint azt eddig gondoltuk, hanem un. homo- és hetero-oligomereket alkotnak, amely komplexek gyökeresen új ligandkötõ, jelátviteli és internalizációs sajátságokkal rendelkeznek. Laboratóriumunkban folyamatban van azon technikák beállítása, amelyek alkalmasak a jelenség vizsgálatára. Együttmûködés Az EGIS gyógyszergyárral alakítottunk ki kooperációt az agyi globális ischemia hatásának mérésére. Az Experimentia Kft. szándéknyilatkozatot tett egy érzékelõ-értékelõ rendszer és szoftver fejlesztésére. A 6. Klaszter:
Az enterális idegrendszer, a „brain-gut axis” vizsgálata Projektvezetõ: Dr. Lonovics János Munkacsoportvezetõ: Dr. Izbéki Ferenc
Célok Új terápiás eljárások kidolgozása a „brain-gut axis” károsodása következtében kialakuló betegségek kezelésére Motiváció A krónikus alkoholizmus, a diabetes és a stressz egyaránt károsítja az enterális idegrendszert, ezért hatásuk jelentõs népegészségügyi problémát jelent. Ennek farmakológiai befolyásolása a betegek százezereinek életét könnyítené meg. Eredmények A diabétesz következtében kialakuló legjelentõsebb gyomor-bélrendszeri szövõdmény a gyomorürülés károsodása,
20
amely akadályozza a cukorbetegség eredményes kezelését is, és amelynek hatékony terápiája nem megoldott (1, 6). A cukorbetegben gyakori magas vérnyomás kezelésére használt imidazolin-receptor agonista moxonidine alkalmazásakor a betegek lassú gyomorürüléssel kapcsolatos panaszainak a csökkenését figyeltük meg. Ebbõl kiindulva, a kérdés tanulmányozására állatmodellt dolgoztunk ki, amelyben vizsgáltuk a moxonidine nem-diabeteszes és diabéteszes patkányok gyomorürülésére gyakorolt hatását. Moxonidine kezelés normalizálta a cukorbeteg állatok lassú gyomorürülését, ugyanakkor a nem-diabéteszes állatokban is gyorsította a gyomorürülést. A moxonidine ezen eddig nem ismert hatásának magyarázata nem tisztázott, további vizsgálataink célja lesz azoknak az enterális és/vagy központi idegrendszeri mechanizmusoknak a feltárása, amelyek gyomorürülést fokozó hatás kialakulásában szerepet játszanak. Eredményeink közvetlen hasznosulását a cukorbetegek gyomorürülési zavarának új terápiás lehetõsége képezi. Lehetõség nyílik a vérnyomáscsökkentõként használt moxonidine új indikációs területen történõ bevezetésére, és újabb gyógyszerfejlesztési irányok kijelölésére is. A krónikus alkohol behatás következtében szintén károsodik az enterális idegrendszer és a bélmotilitás, aminek a táplálékhasznosulásban, ezáltal az alkoholizmus következtében kialakuló testi leromlásban van jelentõsége. Korábban igazoltuk alkoholizmusban a gasztrointesztinális motilitás károsodását, azonban ennek pontos mechanizmusa továbbra sem ismert. Mivel a központi idegrendszerben az alkohol károsítja a nitrerg jelátviteli mechanizmusokat (NOS aktivitást), feltételeztük, hogy hasonló hatás az enterális idegrendszerben is létrejön. Vizsgálataink eredményei igazolják, hogy az idült alkoholfogyasztás okozta bélmûködési zavarokban az enterális idegrendszer nNOS termelõdésének egyes bélszakaszokban eltérõ mértékû károsodása játszik szerepet (2). Eredmények alapján lehetõség nyílik az enterális idegrendszer NOS specifikus farmakológiai befolyásolására és a krónikus alkohol expozíció okozta gyomor-bélrendszeri szövõdmények kezelésére, ami a további kutatásain célja. Irritábilis bélbetegségben (IBS) a stressz okozta vastagbél permeabilitás fokozódásban és viscerális hiperszenzitivitásban az enterális idegeken a proteáz aktivált receptorok (PAR2) aktivációja szerepet játszik. Feltételezve, hogy a proteáz aktivált receptorok fontos szerepet játszanak az IBS tüneteinek kiváltásában, vizsgáltuk a vastagbélben a luminális proteázok esetleges kóroki szerepét. Kimutattuk, hogy a hasmenéssel járó IBS betegekben a széklet szerin-proteaze aktivitás az egészségesekhez ill. a székrekedéssel, vagy alternáló típushoz viszonyítva emelkedett. A székletürítések száma korrelált a proteáz emelkedettség mértékével. Patkányban dexamethasone kezelés javítja a PAR-2 agonista által kiváltott visceralis hiperszenzitivitást, de nem gátolja a vastagbélben a permeabilitás fokozódást. A hatáshoz a vastagbélben a mastocyták számának és funkciójának csökkenése társul. Therápiás jelentõség: Az emelkedett proteáz aktivitás és a beteg tünetei közötti összefüggés igazolása új terápiás lehetõségeket nyithat meg, hiszen pl. jól ismert, hogy a burgonyában lévõ proteáz-inhibitorok gátolják a székletben a proteolitikus aktivitást, de egyéb inhibitorok, pl. a szójában található proteáz inhibitorok potenciális terápiás szerepe is felmerül. Együttmûködés A kutatócsoport a bélmotilitás vizsgálata területén együttmûködik Boros Mihály csoportjával. (3. alprogram) 3. ALPROGRAM: Neurodegeneratív kórképek patomechanizmusa: neuroprotelktív hatású farmakonok fejlesztése Az alprogramban a kutatók a neurodegeneratív és cerebrovasculáris betegségek kialakulásának pontosabb mechanizmusát vizsgálják. A K+F munkák 4 témacsoportban folynak. 3.7. Klaszter:
Kinurénsav származékok mint gyógyszerek. Neuroprotekció a reduktív stressz befolyásolásával Projektvezetõ: Dr. Vécsei László Munkacsoportvezetõk: Dr. Fülöp Ferenc, Dr. Toldi József, Boros Mihály
Célok A projekt fõ tudományos célja a kinurénsav és származékai neuroprotektív hatásának felderítése. Gyakorlati célja egy olyan új vegyület tervezése és szintézise, amelyik átmegy a vér-agy gáton, és védi az idegsejteket, potenciálisan gyógyszerjelölt vegyület.
21
Motiváció A kinurénsav eddig az egyetlen természetes neuroprotektív anyag, amelyik a központi idegrendszerben képzõdik. Nagyon nagy gyakorlati jelentõsége lenne egy olyan új vegyületnek, amelyik szerkezetében közel áll a kinurénsavhoz és a neurodegeneratív betegségek lehetséges gyógyszer, megelõzõ szere. Eredmények Az elõzõ munkaszakaszban szintetizált ciszteamincsoportot tartalmazó három kinurénsavszármazék esetében a vegyületek csak dimetil-szulfoxidban oldódtak. Mivel a dimetil-szulfoxid használata, mint oldószer egyrészt károsítja a vér-agy gátat, másrészt pedig neurotoxikus hatása van, ezért a továbbiakban vízoldékony kinurénsavszármazékok szintézisét terveztük és valósítottuk meg. Ilyen például az N,N-dimetiletiléndiaminnal (1) illetve 3-dimetilamino-1propilaminnal amidált kinurénsav (2), amelyek esetében a tercier nitrogén atomnak köszönhetõen hidrokloridsót választhattunk le, s ezáltal a vegyületek vízoldékonyságát biztosítani tudtuk. Következõ célul az 1 és 2 kinurénsavszármazékok patkány agyfolyadékból történõ minõségi és mennyiségi meghatározását tûztük ki. Jelenleg a kromatográfiás analízis fejlesztése történik. Biológiai eredmények: a 7 új szintetikus vegyület közül 2 (SZR-72 és SZR-73) bizonyult ígéretesnek, ezeknek a részletes vizsgálatát végeztük el. Elekrofiziológia In vitro vizsgálatokban túlélõ hippocampus szeleteken teszteltük (Schaffer kollaterálisok ingerlése – CA1 piramis sejtekrõl történõ field EPSP-k elvezetése) az SZR-72 és SZR-73 hatását. Reményeinket az SZR-72 igazolta: (a perfúziós folyadékban 0.46 mg/100 ml cc.-ban adva), 30-50%-os mértékben gátolta az EPSP-k amplitúdóját. Ez a gátló hatás minden esetben, reprodukálható módon érvényesült. Reményeink abban az értelemben megalapozottak voltak, hogy az SZR-72 mint kinurénsav (KYNA) származék, feltételezetten az NMDA receptorok glicin kötõhelyén hat, így alkalmas lehet agyi traumák, különbözõ kóresetekben fellépõ hiperexcitabilitás fékezésre, blokkolására. Az SZR73 hatása nem volt ilyen egyértelmû: a sokkal kisebb mértékû gátlás gyakran fordult hiperexcitációba, epileptoform jellegû aktivitásba. A hatás értelmezéséhez további kísérletek szükségesek, de magyarázatként felmerülhet, hogy az SZR-73 kevésbé tud kötõdni az NMDA receptorhoz, esetleg metabolizmusa inkább a quinolénsav (QUIN) irányába tolódik. A jövõben enzimgátlók alkalmazásával igyekszünk a kérdést megválaszolni. Ehhez kapcsolódik azon kísérletsorozatunk is, melyben bizonyítottuk, hogy az in vitro alkalmazott kinurenin (KYN) képes in vitro körülmények között is KYNA-vá alakulni, (a szeletben mûködik a KAT!), és kivédeni a - szintén in vitro PTZ applikálással - kiváltott epileptiform aktivitást (Rózsa et al., 2006). Altatott állatokon történt vizsgálatokban ugyancsak a Schaffer kollaterálisok ingerlésével kiváltott CA1 piramis sejtekrõl elvezetett field EPSP-ket vizsgáltuk. Ebben az esetben viszont mód van arra, hogy - az in vitro adatokkal (hatásokkal) összehasonlítva az eredményeket - következtetni tudjunk az anyag vér-agy gáton való átjutására. SZR72-t 4.9; 6.0; 25.0 mg/kg, dózisban alkalmaztuk. A 4.9 mg/kg ekvimoláris azzal a KYNA dózissal, ami perifériásan adva, korábbi vizsgálatokban épp csak valamelyest bizonyult gátló hatásúnak. Kísérleteinkben 4.9 mg/kg dózisban az SZR72 40-50%-os apmlitúdó-csökkenést is kiváltott. Magasabb dózisok hatása kevésbé volt egyértelmû. Hasonlóképpen, az SZR-73 kevésbé mutatott egyértelmû gátló hatást, sõt, bizonyos esetekben, kimondottan facilitálta a kiváltott válaszok amplitúdóját. Ez nagymértékben emlékeztet az in vitro kísérletekben tapasztaltakra. Magatartási vizsgálatok: igazolják, az SZR-72 és az SZR-73 „kinurenin-szerû” hatását, azaz olyan magatartás változások figyelhetõk meg – mindkét anyag alkalmazása esetén -, mint amilyet korábban KYN ill. KYN+PROB esetében megfigyeltünk és közöltünk (sztereotip mosakodások száma, mozgással eltöltött idõ, ágaskodások száma csökken). Az SZR-72 közvetlen hatásának kipróbálása után szeretnénk KYNA ill. SZR-72 szintet mérni a likvorban, perifériás SZR-72 adását követõen, ill. szeretnénk hatását tesztelni agyi traumásmodelleken. Hisztológia: 1.) AZ EGIS céggel együttmûködve egy nagy kísérletsorozaton vagyunk túl, melyben gerbilen - agyi globalis ischemia modellen (4VO)- vizsgáltuk a KYN neuroprotektív hatását. Degenerálódó sejtek száma alapján (+ magatartási kísérletek) bizonyítottuk a KYN neuroprotektív hatását (Gigler et al., 2006). Egyéb vizsgálatok: 1. Migrén modellben a kinurenin és probenecid együttes szisztémás adagolása kivédte a nitroglicerin okozta c-fos emelkedést az agytörzsben. 2. Parkinson kór 6-OHDA-nal elõidézett modelljében a túlélõ substantia nigra sejtekben csökken a kinurenin aminotranszferáz I aktivitás, míg a környezõ astrocytákban feltehetõen kompenzatorikus módon emelkedik az
22
immunreaktivitás. 3. Parkinson kórban szenvedõ betegek vörösvértesteiben a kinurenin aminotransferáz II aktivitás és következményesen a kinureninsav koncentrációja emelkedett. Ezzel ellentétében a plazmában mind az enzimaktivitás, mind a kinurénsav koncentráció csökkent. 4. Fokális dystóniában szenvedõ betegek vörösvértesteiben a kinurenin aminotransferáz I aktivitás emelkedett. Ezzel ellentétében a plazmában az enzimaktivitás csökkent. 5. Huntington kór transzgenetikus állattörzsében a kinurénsav valamint a probenecid tesztelése folyik. A probenecid önmagában közel 25%-kal növelte a transzgenetikus állatok túlélési idejét, míg a kinurenin két különbözõ dózisban szignifikánsan sem befolyásolta a túlélést. A probenecid hatékonyságának további tanulmányozása magatartásvizsgálatokkal, valamint szövettannal folyamatban van. Felmerült a kérdés, hogy a központi idegrendszerben ígéretes neuroprotektív sajátságú szerek, közöttük a KYNA, befolyásolhatják-e az enterális idegrendszer (ENS) mûködését is. 1. Vizsgálatainkban részletesen jellemeztük kutyákon és disznókon a colon motilitási mintázat változását élettani állapotban és KYNA kezelést követõen, ill. 7 órán át fenntartott vastagbél obstrukcióban KYNA kezeléssel (50 mg/kg iv.), vagy anélkül. Szöveti biopsziákból meghatároztunk az oxigén szabadgyök képzõ xanthin oxidoreduktáz (XOR) valamint leukocyta marker MPO enzimaktivitásokat, és kimutattuk, hogy az obstrukciót követõ GI motilitás növekedéssel párhuzamosan a XOR aktivitás emelkedik, szignifikáns leukocita akkumuláció mellett. A KYNA kezelés gátolta a XOR aktivitást, a gyulladásos markerek változását, a szeptikus keringési reakció kialakulását, csökkentette a vastagbél jellegzetes óriás kontrakcióinak motilitási indexét és fokozta a colon simaizom tónusát. Következtetésünk szerint a KYNA citoprotektív hatása az ENS-ben részben az oxigén szabadgyök képzõdés és a következményes leukocita aktiváció gátlásán alapul. A GI motilitási zavarokban glutamát receptor agonista és antagonista kinurenin metabolitok lokális felszabadulása mutatható ki és a glutamát által közvetített facilitáció modulálhatja a kolinerg neurotranszmissziót az ENS-ben. A KYNA nem jut át a véragy gáton, így az ENS glutamát receptorainak és a colon motilitás változásainak célzott befolyásolása lehetséges. A KYNA kezelés kedvezõ GI motilitási és gyulladáscsökkentõ hatásai alapján felmerült (folyamatban van) a szer és az eljárás szabadalmi oltalom alá helyezése (*a tudományos közzététel elõtt, ld. közlemények). A fenti adatok alapján a véragy gáton átjutó, farmakológiailag módosított KYNA analógok (Sr72, Sr73 kódjelû anyagok) perifériás ENS effektusainak (GI motilitási hatások meghatározása) tisztázása is szükségessé vált; a vizsgálatok a szintetizált anyagmennyiségek függvényében történnek. A feltételezhetõen ENSaktív anyagok mikrokeringési és motilitási hatásainak párhuzamos vizsgálatára új kísérletes vizsgálómódszert dolgoztunk ki: egér vékonybélen monitorozzuk a leukocyta-endothelsejt interakciókat és a bél perisztaltika változásait in vivo. A perisztaltika idõbeli alakulását (frekvenciát) és a vízszintes síkban való elmozdulásokat (amplitudót) kalibrációt követõen intravitális videó-mikroszkóp segítségével készített felvételekbõl számíthatjuk számítógépes program segítségével. Módszerünkkel lehetséges a CNS neuroprotektív anyagainak ENS-re gyakorolt hatásainak vizsgálata és az esetleges kedvezõ hatások/nem várt mellékhatások szûrése (a bélmotilitás in vivo monitorozását és analízisét lehetõvé tevõ érzékelõ-értékelõ rendszer és szoftwer fejlesztésére az Experimetria Kft szándék nyilatkozatot tett). A neuroprotekció lehetõségeit más oldalról is megközelítettük. A neuroprotekció lehetõségének egy új megközelítésében az agyi glutamát szintet úgy csökkentjük, hogy felpörgetjük a plazmában a Glu metabolizmusát (oxálecetsav + GOT i.v. adása). Mindennek hatását lokális agyi trauma modellen (fototrombotikus lézió, NeuN és Fluoro-Jade B jelölés- fluorescens mikroszkópia) vizsgáljuk. A még csak pár hónapja kezdõdött kísérletek azt mutatják, hogy már önmagában az oxálecetsav i.v. adása szignifikánsan csökkenti a penumbrában lévõ „sérült” sejtek számát, a primer léziót elszenvedett kéregtérfogatot, és nem mellesleg, a túlélõ egyedek számát (Rákos et al., közlemény elõkészületben). Mindezen vizsgálatok közben derült fény arra, hogy globalis agyi ischemiaval szembeni tolerancia tekintetében nagy különbségek vannak a Wistar patkánytörzsön belül is az egyes vonalak között (Charles-River kontra Harlan; Marosi et al., 2006). A korábban megkezdett kutatási területeken folytattuk az ENS-neuroprotekció vizsgálatát: 1. Meghatároztuk a neurogén eredetû nitrogén monoxid (NO) szintézis jelentõségét a bélmotilitás regulációjában a fenti modellben; 2. A redox-regulátor foszfatidilkolin kezelés hatását; és 3. Az ischaemiás prekondícionálás (IPC) jelentõségét a hypoxia által kiváltott motilitási zavarokra (a vizsgálatok részletes leírását a 2006/1 jelentés 1-4 sz. mellékletei tartalmazzák).
23
Ad 1. Igazoltuk, hogy a neuronalis NO a colon perisztaltikát stimuláló transzmitter. Nem szelektív NOS gátlás hatására a motilitás átmeneti gátlása figyelhetõ meg, míg szelektív nNOS gátlószer hatására tartós motilitás gátlás alakul ki. Az NO képzõdés nem-specifikus gátlása a késõbbiekben a motilitás jelentõs fokozódását eredményezi, amely jelentheti az inhibitor motorikus neuronok neurotranszmissziójának felfüggesztését, vagy a nagyobb arányban termelõdõ induktív NO motilitást mérséklõ hatásának felfüggesztését. A jelentõs mennyiségû induktív eredetû NO mérsékli az obstrukció által kiváltott motilitás fokozódást. E témakörhöz csatlakozó vizsgálataink szerint krónikus alkohol fogyasztás esetén jelentõsen csökken a colon konstitutív NOS aktivitása, a nitrerg neuronok száma és az nNOS proteinek mennyisége, amely jelentõs neuronális funkció zavarokat okoz az ENS-ben (és hipermotilitáshoz, az alkoholbetegség tipikus szövõdményéhez vezet). Ad 2. A hipoxiás GI károsodás in vivo modelljeiben a foszfatidilkolin elõkezelés és a foszfatidilkolinban gazdag étrend szignifikánsan kivédi a szöveti károsodást és mérsékli a helyi következményes gyulladásos reakciót is. Igazoltuk, hogy a folyamat a megváltozott neuronális nitrogén monoxid (NO) szintézissel áll összefüggésben. Ad 3. GI hipoxiát követõen az izomtónus fokozódik, és a kontrakciók frekvenciájának és amplitúdójának emelkedésében, illetve irreguláris jellegében megnyilvánuló motilitás diszfunkció következik be. Az IPC csökkenti a reperfúzió során kialakuló motilitás diszfunkciót, és a neuronális NO szintézis gátlása egyértelmûen rontja az IPC kedvezõ hatásait. Együttmûködés Az EGIS gyógyszergyárral alakítottunk ki kooperációt az agyi globális ischemia hatásának mérésére. Az Experimetria Kft. szándéknyilatkozatot tett egy érzékelõ-értékelõ rendszer és szoftver fejlesztésére. A RET-en belül szoros kooperációban dolgozunk az 1. Alprogram 1. klaszter kutatóival új neurodegeneráció-ellenes szerek kifejlesztésének területén. 8. Klaszter: Szelektív stresszfehérje-indukáló gyógyszerhatású vegyületek Projektvezetõ: Dr. Vígh László Munkacsoportvezetõ: Dr. Sántha Miklós Célok 1, Szelektív stresszfehérje indukción alapuló neuroprotektív gyógyszercsalád kifejlesztése 2, Neurodegeneráció és neuroprotekció: védõanyagok és mechanizmusok kutatása, új típusú neuroprotektív szerek elõállítása és vizsgálata 3, Neurodegeneráció és neuroprotekció modellezése in vivo transzgenikus egerekben Motiváció Óriási tudományos és gyakorlati jelentõségû lenne a nagy áteresztõképességû lipidomika hazai alkalmazása és fejlesztése, valamint egy új típusú szelektív stresszfehérje-indukáló neuroprotektív hatású gyógyszerjelölt vegyület fejlesztése. Eredmények 1, A screening technika kifejlesztése: HSP70, HSP27 promóter-riporter konstrukciók készítése és optimalizálása (partner: Sántha Miklós). Az elsõ évben sikeresen B16 egér melanóma sejtvonalon beállított hsp70 promoter-YFP, valamint a hsp25 promoter-EGFP riporter konstrukciókkal SH-SY5Y humán neuroblasztóma sejtvonalat transzformáltunk és stabil klónokat izoláltunk. Várakozásainknak megfelelõen e vonalak messzemenõkig alkalmasnak bizonyultak az elsõ évben beállított hõsokk indukciós kezelések tesztelésére. A második félévben e sejtvonalon beállított citoprotekciós teszt segítségével elindítottuk ipari (Lipopharma, NGENE) valamint konzorciumi partnerek által rendelkezésünkre bocsátott neuroprotekciós potenciállal bíró gyógyszerjelöltek részletes analízisét és tárgyalásokat kezdeményeztünk új molekulacsaládok beszerzésének lehetõségérõl is. Az elsõ évben laboratóriumunkban beállított molekuláris mikroszkópiai módszert továbbfejlesztettük, felszereltük egy, a zavaró hátteret jelentõsen csökkentõ teljes visszaverõdésen alapuló TIRF mikroszkópiai üzemmóddal. Az 1. részfeladatban elõállított riporter klónok valamint a nagy érzékenységû gyorsan pásztázó fluoreszcencia mikroszkóp segítségével kifejlesztettünk egy sejtszintû stressz profilt követni képes sejt analizátort, ami egyidejûleg számos sejt részletes jellemzésére alkalmas. Ugyanezen technikát adaptáltuk egyedi riporter molekulákat alkalmazva (HSP, receptor, lipid) a sejtmembránok stressz hatására történõ szerkezet változásainak követésére (raft térképezés). Ezzel kifejlesztettünk egy nagy áteresztõ képességû “high content” screening technikát, mellyel nagy számú sejt több paraméterének egyidejû követése ill. statisztikus analízise válik lehetõvé. Elkezdtük egy cél-szoftware fejlesztését is,
24
mely képanalízis segítségével automatikusan kiértékeli a vizsgálati eredményeket. A technika validálása folyamatban van. 2, A legkorszerûbb tömespektrometriára épülõ lipidomika (GC-MS, ESI-MS) és membránbiokémia alkalmazása és fejlesztése: A Regensburgi Egyetemmel közösen folytattuk a nagy áteresztõ képességû lipidomikai módszer közös fejlesztését. A többi részfeladatunkhoz kapcsolódóan karakterizáltuk a sejtkultúrák tenyésztési körülmény változásai által okozott mélyreható lipid molekula speciesz átrendezõdéseket, valamint az 1.2. pont metodikájával meghatároztuk a HS válasz alterációját. Ezen vizsgálatunk teszi lehetõvé a stresszválasz screening technika standardizálását, valamint utat nyit a gyógyszerjelöltek lipidomra gyakorolt hatásának sejtmodellen történõ vizsgálatára. A lipidomika projekt hazai megvalósítására Penke Botonddal ill. Janáky Tamással kooperációban az ezévben beállított új tömegspektrométer felhasználásával kerül sor a második félévben. Ezenkívül több új módszert fejlesztettünk ki GC-MS-re, így pl. nagypontosságú szterol analízist állítottunk be, valamint az ún. "fast-GC" technikát a nagyáteresztõképességû, de nagyfelbontású zsírsav analízis érdekében. 3, Az Alzheimer-kór klasszikus egérmodelljének beszerzése és tenyésztése: Az Alzheimer-kór klasszikus egérmodelljét, a B6C3-Tg(APPswe x PSE1dE9)85Dbo/J kettõs transzgenikus egértörzset az amerikai Jackson Laboratories-tól az év elsõ felében beszereztük. A hemizygota egereket C57B/6 egértörzzsel kereszteztük vissza, az utódokat az APPswe és PSE1dE9 transzgénekre PCR technikával genotipizáltuk. Jelenleg a kettõs transzgenikus egereket folyamatosan fenntartjuk és a DNT konzorcium tagjai részére a modellállatok alapkutatási célra bármikor elérhetõek. Az Alzheimer-kór és Parkinson-kór további állatmodelljeivel a konzorcium csoportjait a JSW-Hungary Kft. fogja ellátni. 4, Humán hsp27 transzgenikus egerek létrehozása: Petesejt pronucleus mikroinjekcióval létrehoztunk olyan transzgenikus egereket, amelyek a human hsp27 fehérjét túltermelik. 38 utód PCR technikával végzett genotipizálásakor 8 transzgenikus újszülöttet azositottunk, amelyekbõl az FVB/N egértörzzsel történt visszakeresztezés révén transzgenikus vonalakat hoztunk létre. A transzgén kifejezõdését két transzgenikus vonalban elõzetesen májszövetben, western blot analizissel vizsgáltuk. Azt találtuk, hogy az egyik transzgenikus egérvonal (line 65) kismértékben a másik vonal (line 46) nagymértékben túltermeli a human hsp27 fehérjét. A transzgén agyi kifejezõdésének vizsgálata immunhisztokémiai módszerekkel jelenleg folyamatban van. 5, Humán HSPB2 és HSPB3 transzgenikus egerek elõállitása: Az elsõ félévben 66 olyan embrionális õssejt (ES) vonalat hoztunk létre, amely genomjában a humán HSPB2-HSPB3 transzgéneket tartalmazta. 5 különbözõ kópiaszámú transzgenikus ES sejt vonallal egér blasztocyszta embriókat injektáltunk. Összesen 12 kiméra egeret állitottunk elõ. Ebbõl 6 olyan kiméra volt, amelynek szomatikus sejtjeinek nagy része (70-90%-a) a HSPB2 és HSPB3 transzgénnel transzformált embrionális õssejtekbõl (ES) származott. A kiméra him foundereket C57B/6 anyákkal visszakeresztezve és utódjaikat PCR módszerrel genotipizálva azt találtuk, hogy 2 him sikeresen örökitette utódjainak a transzgéneket (girm- line transmission). Ugyanakkor 2 másik him nem örökitette egyik transzgént sem, két további him pedig sterilnek bizonyult és egyáltalán nem adott utódokat. A két transzgenikus vonal (line 49 és line 52) western blot vizsgálatakor azt találtuk, hogy mindkét vonalban kifejezõdött a HSPB2 ill. HSPB3 transzgén a májban, a szivben és az agyban. Az agyban túltermelt fehérje lehetõséget teremt a HSPB2 és HSPB3 fehérjék neuroprotektiv hatásának igazolására. Együttmûködés A 2005 végén elõkészített, az intézményi technológia transzfer szabályzat valamint a magán ill. intézményi befektetõk kapcsolatából eredõ bizonytalanságok miatt 2006 végére tolódott a neurodegeneratív betegségek elleni, a sejtek stresszválaszán alapuló gyógyszer fejlesztõ cég megalapítása. A cégalapítás elõkészítéseként megkezdõdtek a tárgyalások több hazai (NGENE, Oncotherm, SOLVO) valamint külföldi (Lipopharma) potenciális ipari partnerekkel különféle gyógyszerjelölt molekulacsaládok tesztelésére a megalapítás alatt álló spin off cég keretében. A RET-en belül szoros kooperációt alakítottunk ki az 1. altéma 1. klaszterével (Penke Botond) és a 4. altéma 12. klaszterével ( Janáky Tamás)
25
3.9. Klaszter:
A neurodegeneráció és neuroprotekció alapjai Projektvezetõ: Dr. Párducz Árpád Munkacsoportvezetõk: Dr. Jancsó Gábor, Dr. Bari Ferenc, Dr. Tamás Gábor
Célok 1, Neurodegeneráció és neuroprotekció: védõanyagok és mechanizmusok kutatása, új típusú neuroprotektív szerek elõállítása és vizsgálata 2, Potenciálisan neuroprotektív hatású vegyületek agyi vérkeringésre gyakorolt hatása és gyógyszerbiztonsági vizsgálata 3, Marker gének és fehérjék azonosítása a humán és a patkány agykéreg lassú gátló sejtjeiben Motiváció A neurodegeneráció ellenes potenciális gyógyszerek racionális tervezésében feltétlenül szükséges a neuroprotekció alapjainak megismerése, erre az alapkutatásra kiemelkedõen sikeres gyógyszerkutatás és fejlesztés épülhet. Eredmények 1, A neuroszteroidok neuroprotektív hatásának igazolására végzett vizsgálataink során az Összehasonlító Élettani Intézettel együtt sikerült beállítanunk egy olyan kísérletes modellt, amelynek reprodukálhatósága megfelelõ. Ezt alkalmazva igazoltuk, hogy a dehydroepiandrosteron (DHEA) képes kivédeni a hideg lézió hatását. Kimutattuk, hogy az elsõdleges motoros kérgen standardizált körülmények között létrehozott hideg lézió mérete szignifikánsabban kisebb azoknál az állatoknál, melyeket a beavatkozás elõtt, vagy közvetlen azután dehydroepiandrosteron szulfáttal (DHEAS) kezeltünk. Lényeges volt tisztázni, hogy maga a neuroszteroid vagy annak ösztrogénné metabolizálódó formája hatásos. Ezt vizsgálandó, az állatok a konvertáló enzim (aromatáz) gátlószerét, letrazolt kaptak a DHEAS-al együtt. Ezek a kísérletek azt igazolták, hogy a letrazol blokkolja a DHEAS protektív hatását, ami arra utal, hogy a lokálisan szintetizálódó 17ß-osztradiol jatszik szerepet a folyamatban. Azt a megfigyelesunket, hogy a trauma utan alkalmazott neuroszteroid hatekonyabbnak bizonyult, mint az elõkezelés, nagyon lényegesnek tartjuk, ennek további vizsgálata feltétlenül indokolt. 2006-ban folytattuk kísérleteinket az idegsejtek akut sérüléseinek jellemzésére szolgáló, általunk korábban beállított target deprimációs modellel. Elõzetes eredményeink arra utaltak, hogy a kalcium-kötõ fehérjék neuroprotektív hatásúak és ezt a kísérleti rendszert használtuk munkahipotézisünk igazolására. Olyan területeken idéztünk elõ sérülést, melyek kalcium-kötõ fehérje szintje különbözõ és kvantitatíve jellemeztük az intracelluláris kálcium szint változását és a sérült sejtek morfológiai megõrzöttségét. Megállapítottuk, hogy ilyen „fiziológiás” körülmények között a magasabb parvalbumin szint, illetve a parvalbumin upreguláció a neuronok degenerációjának mértékét csökkenti. Ez az észlelés bõvitheti a terápiás beavatkozás lehetõségeit, de további vizsgálatok szükségesek a kalcium-kötõ fehérje szint és a sérüléssel szembeni rezisztencia foka közötti ok-okozati összefüggés bizonyítására. Ezeket - a mesterségesen parvalbumin szint modulált sejteken (transzgenikus egereken) történõ vizsgálatokat – most kezdtük el. Technológiai fejlesztés: A makromolekulák fénymikroszkópos szintû lokalizációja megfelelõ immuncitokémiai festésen alapul és a kísérleti körülményektõl függõ változások követése a reakció minõségének (jellegének) és erõsségének reprodukálható elemzését igényli. Erre a feladatra számítógépes eljárás fejlesztettünk ki, mely – belsõ standard felhasználásával – a metszeteken az immunreakció erõsségét és kiterjedését számszerûsíti és grafikusan jellemzi. A fénymikroszkópos képet 1600x1200 pixel felbontásban színes képként digitálisan rögzítjük majd a képfeldolgozást az általunk kifejlesztett programmodullal az Image-Pro-Plus képfeldolgozó rendszer környezetében (Media Cybernetics) végezzük. A program – jelenlegi fejlesztési szintjén – néhány antitesttel történõ festésnek (CD11b, MCP1) az avidinbiotin technikával elõhívott reakciója kiértékelésére alkalmas, és egy a felhasználó által körülhatárolt agyrégióban az immunreakció relatív kiterjedését, valamint a kontroll területre vonatkoztatott erõsségét határozza meg. Vizsgálataink a vincristin perineurális alkalmazását követõ, a primer szenzoros neuronok egész területére kiterjedõ morfológiai elváltozások elemzésére irányultak. Megállapítottuk, hogy lokális perineurális vincristin kezelést követõen az érzõ neuronokban a perifériás neuropathiakra jellemzõ morfológiai és neurokémiai változások alakulnak ki. Vincristin alkalmazása a nociceptív afferens neuronok fenotípusának megváltozását eredményezi: jelentõsen emelkedett a choleratoxin B alegységét (CTB) kötõ és transzportáló kisméretû ganglionsejtek száma és a CTB transzganglionáris transzportja. Ennek következtében a gerincvelõ hátsó szarvának felületes rétegeiben – amely a nociceptív/fájdalomérzõ afferensek fõ végzõdési területe – CTB-pozitív idegrostok jelentek meg, amit a neuropathiat kísérõ jellemzõ morfológiai eltérésnek tartanak. Ugyanakor depletálódott a kisméretû, nociceptív ganglionsejtekre
26
specifikus marker-enzym, a thiamin monofoszfatáz (TMP) a substantia gelatinosaba projiciáló primér afferens idegvégzõdésekbõl. Ezek a megfigyelések arra utaltak, hogy az axonális transzport gátlása – ami a vincristinnek a mikrotubulusok depolimerizációja következtében kialakuló jellemzõ hatása – fontos szerepet játszhat a neuropathias elváltozások kialakulásában. Ez a megállapítás alátámasztja az axonális transzport zavarainak a neurodegeneratív megbetegedések pathomechanizmusában betöltött szerepére vonatkozó elképzeléseket. Korábbi eredményeink alapján feltételezzük, hogy az intraneuronális GM1 gangliozid szint emelkedése (amit a CTB fokozott megkötése és intracelluláris transzportja jelez) az (érzõ) neuronok sajátos protektív mechanizmusának tekinthetõ, amelyet a neuronok károsodása aktivál. Eredményeink szerint az intraneuronális transzportfolyamatok farmakológiai befolyásolása lehetõséget teremthet ezen specifikus intrinsic neuronális protektív mechanizmusok aktiválására. 2, Újszülött malacokon vizsgáltuk az SZTE ÁOK Orvosvegytani Intézetében Tótlh Gábor és munkatársai által szintetizált pituiter adenilcikláz aktiváló peptid (PACAP és analógjainak agyi vérkeringésre gyakorolt hatását. A PACAP egy, a humán szervezetben is megtalálható polipeptid. Két biológiailag aktív formája létezik; egy 27 illetve egy 38 aminosavból álló forma. A PACAP a központi idegrendszerben neurotranszmitterként, neuromodulátorként illetve neurotrofikus faktorként ismert. Neuroprotektív tulajdonsága vizsgálata folyamatban van. Az eddigi eredmények szerint több állat kísérletben, hatására csökkent a hipoxiás / iszkémiás stresszel létrehozott agyi infarktus nagysága. Ebben valószínûleg ismert antiapoptotikus, antiinflammatorikus hatása mellett vazodilatátor hatása is szerepet játszhat. Kísérleteinkben a zárt koponya ablak / intravitális mikroszkópia módszerével egyrészt jellemeztük a PACAP-pal kiyáltott pia arteriola reakciókat, másrészt megvizsgáltuk, hogy az érreakciókban szerepet játszik-e a ciklooxigenáz (COX) vagy a nitrogén-oxid szintáz (NOS) rendszer aktivitása. Emellett megvizsgáltuk 4 különbözõ peptid fragmens feltételezett PACAP antagonista hatását, valamint hogya peptid fragmensek potencíroznak egyéb agyi vazomotor válaszokat. Altatott, lélegeztetett, instrumentált újszülött malacokban (n=54) a lokálisan alkalmazott PACAP (1-38 illetve 1-27) -8 -6 dózisfüggõ (10 -10 M) vazodilatációt (4±2-36±5%) hoz létre, míg az általunk használt rövidebb PACAP (6-27, 6-38, 6-15, 20-31) fragmentumok hatástalanok voltak. A COX-gátló indometacin (5 mg/kg, iv.) kivédte PACAP által elõidézett vazodilatációt, míg a NOS inhibitor L-NAME (15 mg/kg, iv.) nem befolyásolta azt. A szelektív COX-2 gátló, NS 398 nem befolyásolta sem a PACAP 1-38, sem az 1-27 által kiváltott agyi értágulatot, míg azt a szelektív COX-1 inhibítor SC 560 teljesen meggátolta. Ezzel az elsõ olyan endogén anyagot ismertük meg amely nem COX-2 hanem a COX-1 által termelt dilatátor prosztanoidok útján fejt ki hatást az újszülött agyban. Jelenleg Rolf Uddman professzor (Lund, Svédország) segítségével feltérképezzük az agyi erek PACAP-erg beidegzését újszülött malacban. Kísérleteink alapján arra következtetünk, hogy a PACAP által kiváltott vazodilatációban döntõen a COX enzim által termelt prosztanoidok vehetnek részt, míg az NO szerepe alárendeltnek tûnik. Eredményeink hozzájárulhatnak az agyi vérkeringés újszülöttkori szabályozásának és a PACAP neuroprotektív hatásának pontosabb megértéséhez. 3, Csoportunk publikálta az elsõ, humán agyszelet preparátum technológia kifejlesztésével készült cikket Dr. Barzó Pál (SZTE Idegsebészeti Klinika) közremûködésével. Kimutattunk, hogy az agykérgi axo-axonikus sejtek serkentõ hatásúak lehetnek, ami a posztszinaptikus sejtek sejtterületre jellemzõ klorideloszlásának a következménye. Patkány szomatoszenzoros kéregbõl elvezetett neurogliaform sejtek immunhisztokémiai jellemzésében történt ezenkívül elõrelépés. A projekt során mintegy 60 db 1-2. rétegbeli neurogiaform sejt in vitro pach-clamp elvezetésével, ill. biocytinnel való feltöltésének segítségével vizsgáltuk a sejtekben elõfordulható neurokémiai markereket. Erre azért van nagy szükség, mert a többi interneurontól eltérõen, eddig nem volt ismert olyan marker, ill. markerkombináció, amellyel nagy megbizhatósággal kimutatható lenne a neurogliaform sejtek elõfordulási mintázata, sûrûsége. Vizsgálataink zöme a technikai megoldások finomításával telt, mivel az elvezetett sejtek immunhisztokémiai tipizálása korántsem kiforrott technika. Optimalizálás után 3 olyan markert sikerült közvetlenül, ezenkívül egyet közvetve kimutatnunk, amellyek nagy megbízhatósággal elõfordulnak a neurogliaform sejtekben (COUPTF2, NOS, alphaactinin). Ezen markerek közül egyrõl bebizonyítottuk, hogy más interneuronokban is elõfordul. Feltételezzük viszont róla, hogy ezen marker jelenléte utal az adott interneurontípusok közös eredetére ill. születésük pontos helyére. Két marker eddigi vizsgálataink alapján kizárólagosan a neurogliaform sejtekre jellemzõ. Humán agyszeletbõl a projekt során eddig mindössze 5 neurogliaform sejtet sikerült elvezetni. Bebizonyítottuk, hogy akárcsak a patkányban, a humánban is a neurogliaform sejtek felelõsek a GABAB receptoron keresztül történõ lassú gátlás létrejöttében.
27
Együttmûködés Szoros tudományos együttmûködés alakult kiPenke Botond (1. Alprogram 1. klaszter), Tóth Gábor (5. Alprogram 13. klaszter) és Bacsó Pál (SZTE Idegsebészeti Klinika) munkacsoportjával. Tamás Gábor tudományos eredményeinek gyakorlati alakalmazásával a SOLVO cég foglalkozik. 3.10. Klaszter:
Oxidatív stressz ellenes anyagok Projektvezetõ: Dr. Ferdinándy Péter
Célok Az oxidatív stressz kutatása: peroxinitrit ellenes vegyületek tesztelése és génterápiás módszerek alkalmazása a neuroprotekcióban Motiváció Az oxidatív stressz számos más hatása mellett a neurodegeneráció kialakulásában is részt vesz, ezt az Alzheimer kórban központi szerepet játszó ß-amiloid aggregatumok is kivaltjak. Nagy gyakorlati jelentõsége lenne egy olyan gyógyszerjelölt vegyületnek, amely megakadályozza az oxidatív stressz kialakulását és neuroprotektív hatású. Eredmények A kutatócsoport az oxidatív stressz és stressz adaptáció biokémiai hátterének vizsgálatában a matrix metalloproteinázok oxidatív aktiválódását vizsgálta, illetve az NO és szuperoxid reakciójából keletkezõ peroxinitrit markereinek, és a peroxinitrit scavengerek screen módszereinek kidolgozását végezte. A peroxinitritrõl egy review közleményünk jelent meg, továbbá a következõ konkrét eredmények születtek: • A szívizomban az érzõ neuronok gén expresszióra kifejtett hatását Puskás László (SZBK) munkacsoportjával közösen vizsgálta DNS chip és RT-PCR technikával, melybõl egy közlemény jelent meg a FASEB Journal 2006ban. Ezen project során elsõként megfigyeltük, hogy az érzõ neuronok hiánya számos idegi mûködéssel és egyéb anyagcserefolyamattal összefüggõ gének expressziós változását okozzák, és hogy a kémiai denerváció capsaicinnel érdekes módon a capsaicin receptorának a TRPV1-nek és egy hasonló transiens receptor potenciál csatorna fehérjének az overexpresszióját okozza a szívben. Ezek az eredmények a TRPV1 receptor modulátor molekulák terápiás jelentõségét vetítik elõre a kardiovaszkuláris rendszer idegi elemeiben. • Jelenleg folyó kísérleteinkben a szenzoros neuronok oxidatív és nitrozatív stresszben kifejett hatását vizsgáljuk a szívben, aminek eredményeibõl egy közlemény elõkészítés alatt áll. • A koleszterin metabolizmus és az amyloid precursor protein (APP) metabolizmus agyi beta-amyloid depozíciójának vizsgálatában vettünk részt Alzheimer betegség modellben Sántha Miklós és Kálmán János munkacsoportjaival együtt, amibõl egy nemzetközi közlemény jelent meg. A neurológiai állatmodellekben használatos anyagcsereméreg, a 3-nitropropionsav kardiovaszkuláris hatásait vizsgálva megállapítottuk, hogy ez a méreg kis dózisban a peroxinitrit szinteket befolyásolva stressz adaptációs választ vált ki. Együttmûködés Szoros tudományos kooperáció alakult ki az 1. alprogram 1. klaszterével (Kálmán János), a 3. alprogram 8. klaszterével (Sántha Miklós), és a 4. alprogram 12. klaszterével ( Puskás László) A kutatócsoport eredményeit a gyakorlatban a Pharma Hungary 2000 Kft., spin-off alkalmazza (www.pharmahungary.com) A Kft. a fenti témához részben kapcsolódó témában saját finanszírozásban adott be egy szabadalmat (PCT). 3.11. Klaszter:
Õssejtkutatás Projektvezetõ: Dr. Gulya Károly
Célok Szöveti regeneráció: csontvelõ eredetû õssejtek autológ reintegrációja patkány retinába Motiváció Nagy gyakorlati jelentõségû egy olyan állatmodell kifejlesztése és tesztelése, amelyben felnött patkányok in vitro kezelt össejtjeit autológ transzplantáció révén terápiás célból juttatunk vissza a központi idegrendszer ép vagy kísérletes módon károsított részeibe (retina, hippocampus, agykéreg stb.).
28
Eredmények In vitro kísérleteinkben olyan neurotrófok tesztelését végezzük, amelyek reményeink szerint a differenciálatlan csontvelöi eredetü össejteket a neuroektodermális sejtsors-választás felé irányítják. Kísérleteinkben EGF-, NGF- és FGF-kezelt sejtek fenotípusos jellemzõit vizsgáltuk meg immunhisztológiai és Western blot technikákkal, s néhány korai megjelenésü markert is azonosítottunk. Az ex vivo kezelt sejtek fenotípusának Western-blot analízise során megállapítotuk, hogy a differenciálatlan sejtekre jellemzõ Ki67 antigén mellett jelen vannak a differenciáltabb, a neuronális fejlõdési vonalon elindult sejtekre jellemzõ antigének is (pl. PGP 9.5, Tuc4, ß-tubulin III, PSA-NCAM). Ezirányú kísérleteink során ebben az évben további markereket vizsgálunk meg, így a mikrotubulus-asszociált protein 2A-t is. A különbözö mitogénekkel történõ kezelések hatásosságát (mitogenicitását) a Ki67 index meghatározásával végeztük el. Az ex vivo kezelt õssejtszármazékokat egyrészt a retinába vagy az agyba injektálva, másrészt intracardialisan adva az agyban, a gerincvelõben és a retinában vizsgáltuk a sejtek reintegációját. Megállapítottuk, hogy mind az EGF, mind az NGF kezelés nagyszámú õssejtszármazék célszövetbe való települését eredményezte. E sejtek Tuc4 fenotípust mutatnak, ami azt jelzi, hogy e sejtek a neuronális fejlõdési útra léptek. További vizsgálatainkban e neuronok kifejlett fenotípusát vizsgáljuk meg, különös tekintettel a specifikus kolinotoxinnal (saporin) roncsolt nucleus basalis magnocellularisba reintegrálódó õssejtszármazékok esetleges kolinerg fenotípusára. Más kísérleteinkben a különbözõ neurotrófokkal ex vivo kezelt õssejtszármazékokat mechanikailag károsított patkány retinákba injektáltuk vissza. Megállapítottuk, hogy a neuroektodermális fejlõdés útján elindított sejtek a retina minden rétegébe reintegrálódtak és 7 nappal a visszainjektálás után életképesek voltak. Folyamatban vannak olyan kísérletek is, amelyekben a calmodulin gének expresszióját vizsgáljuk a különbözõ neurotrófok hatására neuroszférákká alakult õssejtszármazékokban. További kísérleteinkben olyan központi idegrendszeri explant-, illetve szeletkultúrákat hoztunk létre (retina, hippocampus), amelyekben az in vivo rendszereknél sokkal gyorsabban vizsgálhatók az egyes neurotrófokkal kezelt õssejtszármazékok reintegrációjának hatásossága. A screenelésnek ez az in vitro módszere alapja lehet egy knowhow értékesítésnek is. Tovább vizsgáljuk annak a lehetöségét is, hogy a neurotrófokkal kezelt csontvelõi eredetü sejtpopulációk megfelelö lefagyasztási technikával hosszú idön át eltarthatók és igény szerint feléleszthetõk legyenek. Kidolgoztunk két olyan protokollt, amelyekkel az össejtszármazékok 10-15%-a 1 hónappal a lefagyasztás után feléleszthetõ. Ez az arány más típusú lefagyasztott sejtek felélesztésénél mérhetõ arányokhoz viszonyítva jónak mondható. Az ilyen módon lefagyasztott és felélesztett sejtek kereskedelmi forgalmazására egy oszták cég (JSW Research, Graz, Austria) mutat kezdeti érdeklõdést. Együttmûködés A DNT-RET projekt egyéb céljaihoz kapcsolódó fejlemény, hogy a Schering Europe (Berlin) és a Karolinska Institute (Stockholm), az Alzheimer kór PET ligandjai kifejleszésére alakított kooperációja megkereste Laboratóriumunkat, s auroradiográfiai és immunhisztokémiai vizsgálatok elvégzésére tett ajánlatot. A kooperáció 2006 szeptemberében kezdõdött. Jelenleg Alzheimer kór-specifikus mikroglia markerek detektálását végezzük immunhisztokémiai és histoblot technikák felhasználásával. A sikeres pilot-study után, feltehetöen 2007 elejétõl, hivatalosan is részt vehetünk a Schering-Karolinska kooperációban. 4. ALPROGRAM, 12. Klaszter:
Neuroproteomikai centrum létrehozása, Pszichiátriai betegségek funcionális genomikája, proteomikája, célfehérjék kijelölése Projektvezetõk: Dr. Janka Zoltán, Dr. Janáky Tamás Munkacsoportvezetõk: Dr. Medzihradszky Katalin, Dr. Puskás László Dr. Juhász Gábor, Dr. Palkovits Miklós, Dr. Telegdy Gyula, Dr. Kovács Kornél
Az alprogram egységes egészként mûködik, így egyetlen klaszterbe soroltuk be. A neuroprotemikai centrum virtuális laboratóriumként mûködik Szegeden (2 munkahely) ill. Budapesten (1 kutatócsoport). Célok 1, Egy modern neuroproteomikai centrum kialakítása, muszerek beszerzése, laboratóriumok felszerelése. 2, Sejtmembrán mikrodomén- és szignál-rendszer vizsgálatok. 3, Funkcionális genomikai és proteomikai vizsgálatok.
29
Motiváció A pánikbetegségek és a depresszió hatékony gyógyszereinek racionális tervezéséhez szükségünk van a betegségek kialakulásában kulcsszerepet játszó fehérjék mint farmakológiai célpontok azonosítására és validálására. Eredmények Az SzTE Orvosi Vegytani Intézetében, a tavaly kialakított NeuroProteomikai Centrumban üzembehelyezték a WATERS Co. Protein Expression System rendszerét, melynek beszerzése részben DNT finanszírozásában történt. Az elmúlt hónapokban elsajátítottuk a mûszer-rendszer elemeinek használatát, azonban bioinformatikai szoftvere annyira összetett, hogy annak megértéséhez és megtanulásához még sok idõre van szükség. LC/MS módszereket fejlesztettünk ki fehérjék azonosítására 2D gélelektroforézisbõl származó mintákból, ill. összetettebb, sok fehérjét tartalmazó minták vizsgálatára. Nagyszámú fehérjeminta gyors analízisére kidolgoztunk egy olyan rendszert, melyben manuálisan egyszerre 96 mintát tudunk emészteni, majd egy nanoHPLC rendszer segítségével automatikusan MALDI lemezre felvinni. A Waters Q-TOF készülékére kidolgozás allatt áll egy olyan LC-MS módszer is, mely jelentõsen (45 percrõl 8 percre) le tudja rövidíteni egy LC-MS vizsgálat idejét, megnövelve ezáltal a tömegspektrométer teljesítõképességét. Beállítottuk a GE Life Sciences automata emésztõrendszerét is, melynek segítségével a 96 lyukú ELISA lemezen történõ tripszines emésztéseket végeztünk, melynek termékeit tömegspektrometriával vizsgáltuk. Saját szerveren üzembe állítottunk és igényeinknek megfelelõen konfiguráltunk két adatbáziskezelõ szoftvert (MASCOT és ProteinLynx Global Server), melyek a fehérjeazonosítások bioinformatikai részét végzik. A házon belüli szerverek használata rendkívül megkönnyíti az adatbáziskeresést, s olyan feladatok is elvégezhetõk használatával, melyek az interneten keresztül elérhetõ programokkal nem. Az MTA SzBK Proteomikai laboratóriumában a Kromat Kft. által rendelkezésünkre bocsátott tömegspektrométert (Agilent XCT Plus Iontrap) MALDI-módban már korábban sikerült beállítani, rutinszerûen mûködtetni. Ezután a nanoHPLC rendszer beállítását, az ioncsapdához kapcsolását, on-line LC-MS/MS kísérletek beállítását céloztuk meg. Módszereket dolgoztunk ki egyrészt oldatban készült fehérjeemésztések termékeinek, másrészt 1D és 2D gélelektroforézisbõl származó fehérjeemésztmények analízisére. Többféle gradienst, valamint izokratikus elúciót próbáltunk ki a különbözõ komplexitású minták analízisére.A komplex elegyek vizsgálatára 90 perces grádiens módszert állítottunk be, míg a csak 1-3 fehérjét tartalmazó gélelektroforetikus mintákat 45 perces módszerrel analizáltuk. Mivel ez utóbbi módszer is elég idõigényes, a nagyobb mintaszámú vizsgálatsorozat gyorsabb kivitelezésére új izokratikus HPLC elválasztást állítottunk be az ioncsapdás tömegspektrométer elé. Ennek segítségével egy minta analízise 6-8 percre csökkenthetõ, megnövelve a készülék áteresztõképességét. A fentiekkel párhuzamosan végeztük az MS adatgyûjtési paraméterek optimalizálását, a HPLC elúciós profilokat is figyelembe véve. Az LC-MS/MS adatok lekereséséhez beállítottuk a házi Agilent SpektrumMill bioinformatikai szervert. Az ezzel végzett lekeresések eredményeit más, on-line elérhetõ lekeresõ programok (Mascot, ProteinProspector) eredményeivel hasonlítottuk össze a megfelelõ lekeresési paraméterek beállítása végett. A szoftver rendkivül sokoldalú képességei segítenek a fehérjeazonosítások megbízhatóságának növelésében, a hibás találatok kiszûrésében. A standardokkal beállított módszereket éles mintákon sikeresen alkalmaztuk, számos fehérjét azonosítottunk, illetve poszt-transzlációs módosításokat kerestünk. Sikerrel próbáltuk ki rendszerünk frakciószedõ/felcseppentõ egységét. Segítségével a kapilláris-kromatográfia frakciói egybõl a MALDI-lemezre gyûjthetõk, s így off-line MALDI-MS analízist végezhetünk a tömegspektrométer APMALDI opciója segítségével. Januárban résztvettünk a XXXVII. Kromatográfiás Továbbképzõ Tanfolyam megszervezésében, melynek 108 résztvevõje volt. A tanfolyam keretében létrehoztuk a Magyar Proteomikai Társaságot, s elõadásokkal megtartottuk elsõ összejövetelét is. A tavalyi évben sikeresen megszervezett proteomikai tanfolyamot újra meghirdettük (április 24-26). A tanfolyamot ismételten olyanok számára szerveztük, akik most ismerkednek a proteomikában alkalmazható elválasztástechnikai és tömegspektrometriás eljárásokkal. A tavalyi tanfolyam során nyert tapasztalatok alapján idén a tömegspektrometria alapjait, a fehérje mintaelõkészítést, elválasztási technikákat, a tömegspektrumok kiértékelését és az adatbázislekeresést ismertetõ elõadások mellett helyet kaptak esettanulmányok is, ahol konkrét példákon keresztül mutattuk be, milyen nehézségeket kell legyõzni, hogyan kell bizonyos problémákat megközelíteni a siker érdekében. A tanfolyamon 41 fõ vett részt. 4.2., 4.3. és 4.4. programpontokban leírt vizsgálatok kivitelezéséhez (membrán mikrodomén és szignálrendszer fehérjék vizsgálata, genomikai és proteomikai vizsgálatok) megkezdtük a mintagyüjtést szorongásos állatmodellben. A vizsgálatokhoz azonos korú, kb. 200-250 g súlyú hím Wistar patkányokat használtunk. Az állatokat szétválasztottuk
30
„elevated plus maze” tesztben szétválasztottuk nem szorongó, közepesen szorongó és szorongó csoportokra. A szétválasztás alapja, hogy az adott széria állatcsoport átlagától hány százalékban tér el az egyes állatok teljesítménye. Proteomikai vizsgálatokhoz felhasználtuk az EGIS Gyógyszergyár NyRt. 50 generáción keresztül beltenyésztett szorongó egértörzsét is. A kísérletekhez makro- és mikrodisszekciós mintavétel történt humán, patkány és egér agyakból, az alábbi részfeladatok alapján: •Patkányok agyából raft-protein vizsgálatokhoz. Mincropunch minták 60 különbözõ agy területébõl. Agymetszetek száma: 312, micropunch száma: 1566, mintaszám: 360. • Plus maze-ban tesztelt patkányok agyának mikrodisszekciós feldolgozása agyi proteinek vizsgálatához. 22 patkányagy került feldolgozásra (fagyasztott agyi sorozatmetszetek, micropunch minták 4 agyterületbõl). Agymetszetek száma: 836, micropunch száma: 264, mintaszám: 88. • Patkány- és egéragyak makrodisszekciós mintavétele: elõkísérletek szignál-proteinek meghatározásához. Agyak az EGIS által kifejlesztett anxietas egértörzsekbõl (n=10). Agymetszetek száma: 260, macropunch száma: 240, mintaszám: 60. 2) Patkányagyak (n=4, 2 kontrol és 2 LPS-kezelt), agymetszetek száma: 132, macropunch szám: 48, mintaszám: 8. • Elevated plus maze-ben tesztelt patkányok agyának mikrodisszekciós feldolgozása genomikai vizsgálatokhoz. 21 patkányagy került feldolgozásra (fagyasztott agyi sorozatmetszetek, micropunch minták 4 agyterületbõl). Agymetszetek száma: 798, micropunch száma: 252, mintaszám: 84. • Humán agyminták kontrol és depressziós öngyilkos egyének agyából genomikai és proteomikai vizsgálatokhoz. Az agyak a budapesti Humán Agyminta Bank-tól származnak, adataikat (klinikai, patológiai és neuropatológiai) a Bank Database-ben tároljuk. Kivett agyterületek száma: 4, micropunch száma: 624, mintaszám: 78. • Egéragyak mikrodisszekciós mintavétele „Ösztrogének hatása az agyi proteomra” vizsgálatokhoz. Ovariectomizált és ösztrogén-kezelt állatok (n=16). Fagyasztott agyi sorozatmetszetek, micropunch 5 agyterületbõl. Agymetszetek száma: 752. micropunch száma: 612, mintaszám: 80. • Humán agyminták mintavétele agyi proteomikára, acetylcholin és ösztrogén receptorok meghatározására. Minták 4 középkorú és 4 idõs nõ agyából. Vizsgált agyterületek száma: 7, micropunch szám: 282, minták száma: 47. Megkezdtük a pályázathoz kapcsolódó patkány makrodisszekciós agyminták analízisét. Elsõször a két 2D-gélen elválasztott mintákat vizsgáltunk, hogy teszteljük a gélszeparáció, illetve a tömegspektrometriás analízis érzékenységét, reprodukálhatóságát. Vizsgálatokat végeztünk annak kiderítésére, hogy milyen mennyiségû agyminta elegendõ a 2D elektroforézist követõ megbízható fehérjeazonosítás kivitelezéséhez. Megállapítottuk, hogy szerint 200 ?g fehérjét tartalmazó agyminta 2D elektroferogramjából kivágott foltokból már elegendõen nagy találati pontszámú, megbízható fehérjeazonosításokat végezhetõk. További proteomikai fehérjeazonosításokat végeztünk a 1D-elektroforézissel szeparált patkány szinaptoszóma, ill. szinaptoszóma membrán mintákból. Az 1 cm-es darabokra felszeletelt gélekbõl mintegy 400 fehérjét azonosítottunk. A fehérjék többsége szinaptikus, ill. mitokondriális eredetû. Egy-egy gélcsíkban sokszor 10-15 fehérjét is azonosítottunk. Ezután megkezdtük 1D gélen elválasztott, kontroll ill. szorongó egerekbõl izolált fehérjék összehasonlító analízisét (96 minta). Az esetek többségében elmondható, hogy az 1D elválasztásból 10-20 fehérjét sikerült kimutatnunk sávonként. Az fehérjék közül a fõkomponensek jó találattal, jó lefedettséggel jelentek meg, míg a többi alacsony pontszámmal, kevés peptiddel szerepelt. Teszteltük az analízisek reprodukálhatóságát, az eredeti és hígított mintákon, és azt tapasztaltuk, hogy két, egymás utáni azonos minta analízise, ugyanazon metódussal, ugyanolyan körülmények mellett sem hoz egyforma eredményt. A fõkomponensek esetében hasonló lefedettségi értéket kaptunk, ám az azonosított peptidek csak 60-70%-ban egyeztek egymással. Két párhuzamos futásban tehát az alacsony peptidtalálatú fehérjék csak 30%-ban fednek át! A csoportok közt különbséget adó fehérjék valószínûleg nem a fõ komponensek közt keresendõk, tehát, kicsi az esély a különbségek szignifikáns bizonyítására. Célszerûbbnek látjuk tehát a fehérjék multidimenziós frakcionálását az LC-MS/MS analízis elõtt. Egy ilyen multidimenziós elválasztási eljárást vizsgáltunk a stressz által kiváltott molekuláris mechanizmusok tanulmányozása érdekében kontrol és szorongó patkányok két agyrészletén (prefrontális cortex, amygdal). Az agyi minták fehérjéit a 2D elektroforézis elõtt folyadék fázisú izoelektromos fókuszáló készülékkel (Microrotofor, BioRad) elõfrakcionáltuk, majd azonosítottuk a stressz hatására eltérõen expresszálódó fehérjéket. Az azonosított fehérjék között találunk sejtszaporodást indukáló fehérjéket (MAPK1 és GDI2), melyek expressziója csökkent stressz hatására, míg a többi fehérjéé nõtt, így a signalling-ban szerepet játszó (FABP, GFAP), a fehérje lebontásban szerepet kapó (V-type H+ ATPase, SKP1) és a védõ funkciót ellátó (Hsp60, Hsp70) fehérjéké. A munkánk azt is megmutatta, hogy a folyadék fázisú izoelektromos fokuszálás nagyon hasznos elõfrakcionálási technika lehet, ha a sejtekben kis mennyiségben jelenlévõ fehérjék expressziós változásait is nyomon szeretnénk követni.
31
Az egér, ill. humán agyminták vizgálatához beállítottuk a 2D-DIGE „full stain” elektroforetikus elválasztási módszert és megállapítottuk, hogy a megbízható kvantitatív eredmények eléréséhez legalább 20-25 µg össz-protein tartalmú minta kell. Ezzel megnyílt a lehetõség az egyes agyterületek proteomikai összehasonlítására is. Elkezdtük a proteomikai interpretációs modellek ápítését a Cytoscape 2.3.2. illetve az Agilent Literature Search Engine segítségével. A modellezéshez megírtuk a Cytoscape gráfok MATLAB file-okká konvertálását, ami segítette az eredmények interpretációját és matemetikai analízisét. Egy ilyen elemzést bemutatunk az EGIS szorongó egértörzsének agyából származó a szinaptikus scaffold és raftképzõ proteinekre. (1. ábra)
1. ábra
A fenti hálózat a dynamin, szinapszin, preszinaptikus protein95, és az ezrin protein interakciós hálózatából egyesítéssel készült. Azt jeleníti meg, hogy a kísérletileg igazoltan megváltozó koncentrációjú négy szinaptikus fehérjével az Agilent Literature Search Engine-nel végzett keresés alapján milyen és mekkora interaktív protein hálózat hangolódott át a szorongó egértörzsben a normálhoz képest. Itt jegyezzük meg, hogy a proteomikai munka során számos elõre nem látható jelentõs problémába ütköztünk, amelyeket annak ellenére meg kell oldani, hogy a feladat magában a pályázatban nem szerepel. Ilyenek voltak az interpretációs problémák ami a modellezéshez vezetett, illetve a nõstény állatok használatának kidolgozása mivel a nõstényekben az anxietás és a depresszió gyakoribb mint hímekben. A gyulladási reakciók proteomikai vizsgálatát is elkezdtük, hogy a mûtéti beavatkozások utáni gyulladások miatt ne mérjünk mûtermékeket. Ez magyarázza, hogy a megjelölt feladatokon felül néhány új munka is szerepel a beszámolóban. Az alprogramban résztvevõ több csoport együttmûködésével végzett proteomikai fehérjeazonosításokkal a következõ eredmények születtek: 1. Az EGIS Gyógyszergyár 50 generáció keresztül beltenyésztett anxietásban szenvedõ egértörzs agyának fehérjeösszetételét hasonlítottuk össze a normál egerek agyának fehérjeösszetételével. 123 különbözõképpen expresszált fehérjét azonosítottunk. A fehérjelistát átadtuk az EGIS Gyógyszergyárnak kiértékelés céljából. 2. A szorongás és depresszió nõkben sokkal gyakoribb, mint férfiakban, ezért a összehasonlítottuk az ovarektomizált és álmûtött nõstény egerek agyának fehérjekészletét. A két csoport között 53 fehérje kifejezõdésében találtunk különbséget. 3. Ovariektomizált egerekben vizsgáltuk, hogy a mesterséges ösztrogénpótlás hogyan változtatja meg agyuk fehérjeösszetételét. A két csoport között 57 fehérje expressziójában találtunk különbséget. A proteomikai vizsgálatok során kapott fehérjék génjeinek kifejezõdését megvizsgáltuk egér hippokampuszban. 5 gén próbája mûködött jól, ezeknek a géneknek a génexpressziós változásait fogjuk a következõkben meghatározni az
32
EGIS szorongó egérmodelljében. Tesztkísérletként azokban a transzgenikus egerek hippokampuszában hasonlítottuk össze ezeknek a géneknek a kifejezõdését, amelyek a fat-1 gént hordozzák. Ez a gén képes n-6 zsírsavakat n-3-má alakítani, így eltolva az agyban is az n-3 többszörösen telítetlen zsírsavak arányát. Feltételezésünk szerint ez a génmódosítás számos neurodegeneratív betegségben (pld. Alzheimer-kór) és más pszichiátriai kórképben is védõ hatású lehet. Ugyanennek a fat-1 transzgenikus állatnak a hippokampuszát elsõsorban szignáltranszdukciós útvonalban érintett fehérjékre érzékeny fehérje-chippel vizsgáltuk meg. Több olyan fehérjének a kifejezõdése változott meg, amely az apoptózissal, és a posztszinaptikus fehérjékkel volt kapcsolatban. Mivel tudjuk, hogy az n-3 zsírsavak az Alzheimer-kór kialakulását gátolják, ezért arra voltunk kiváncsiak, hogy melyek azok a gének, amelyek az n-3 transzgenikus állatban eltérõ kifejezõdést mutatnak a kontroll egerekhez képest. Ehhez DNS-chip kísérleteket terveztünk és hajtottunk végre. Több, mint 200.000 nyers adatból meghatároztuk azokat a géneket, amelyek fokozott, vagy csökkent szintézist mutattak. Az eredmények alapján 20 gént kvantitatív valós-idejû PCR segítségével igazoltuk. Több olyan gént sikerült azonosítanunk, amelyek membránfehérjékkel, lipidanyagcserével, transzport-folyamatokkal kapcsolatosak. A modellezésel egybekapcsolt proteomikai eredmény értékelés, bár még kezdeti stádiumban van, de máris visszaigazolta a pályázat azon alapgondolatát, hogy a pszichiátriai betegségekben tapasztalt receptor heterogenitás nem a genetikai heterogenitásra, hanem a receptorok molekuláris környezetében bekövetkezõ változásokra vezethetõ vissza. Ez a kezdeti eredmény a vártnál sokkal átütõbben igazolta vissza a kutatási irány jogosságát. A bemutatott modellek alapján várható a szinaptoszóma preparátumokban további protein interakciós eredmények megjelenése. Az eredményekre támaszkodó modellünk további hatóanyag célpontok, illetve diagnosztikus értékû biomarkerek kijelölését teszi lehetõvé az ipari partnerek számára. Együttmûködés A lehetõ legszorosabb együttmûködés alakult ki a 12. Klaszter munkacsoportjai és a Dr. Lévay György által vezetett EGIS kutatócsoport között, az 50 generációs beltenyésztett „szorongó” egértörzs funkcionális genomikai-proteomikai vizsgálatában. 5. ALPROGRAM 13. Klaszter:
Neurobiológiai betegségek diagnosztikája Projektvezetõ: Dr. Tóth Gábor Munkacsoportvezetõk: Dr. Pávics László, Dr. Fülöp Ferenc, Dr. Welker Ervin, Dr. Dux László, Dr. Puskás László, Dr. Dombi György
Célok 1, *Tc-jelzett peptidek tervezése és szintézise az Aß-plakkok kozponti idegrendszerbeli kimutatasara. Trodat alapu *Tc jelzett diagnosztikumok fejlesztese 2, A prion feherje atalakulas mechnizmusanak megismerese es a prion betegseg diagnozisa 3, Neuromuszkularis betegsegek diagnosztikaja 4, Pszichiatriai betegsegek genexpresszion alapulo diagnosztikaja 5, Sclerosis Multiplex (SM) negy pathologiailag jol definialt altipusanak liquormintak alapjan tortenõ tanulmányozása Motiváció Óriási gyakorlati jelentõsége lenne az Alzheimer-kór olcsó, megbízható és korai diagnózisának, hogy a betegség gyógyszeres kezelése idõben elkezdõdjön. Maga a diagnosztikum is jó piacot ígér, uyganez érvényes a prion betegség és a neuromuszkuláris betegségek megbízható diagnosztikumaira. A betegségek gyakorisága folytán nagyon fontos a pszichiátriai betegségek génexpresszión alapuló diagnosztikája. A sclerosis multiplex négy altípusának elkülönítése a likvorminták alapján olyan egyedi gyógyszerelést tenne lehetõvé, amelyre eddig még nem volt példa. Eredmények 1, Peptid molekulák jelölése 99mTC izotóppal Laboratóriumi körülmények között a Cys-Cys-Leu-Pro-Tyr-Phe-Asp (1) (Kémiai formula:C39H54N8O10S2, M. W.: 859,02) aminosav szekvenciájú peptid izotópos nyomjelzését a molekula szerkezetének ismeretében 99mTc izotóppal végeztük technécium-trikarbonillel való komplex kialakításával. Az egy pozitív töltéssel bíró technécium(I)-trikarbonil komplex
33
99m
+
[ Tc(CO)3(OH2)3] (2) irodalmi adatok alapján igen elõnyös prekurzor számos jelzett radiofarmakon – különösen érzékeny biomolekulák preparálásában [1,2]. Képes enyhe reakciókörülmények között egy-, két-, és három-fogú ligandként in vivo körülmények között is stabil komplexet létrehozni. A legstabilabb szerkezet olyan esetben jöhet létre, amikor a biomolekulában egy leszorítható proton (pl. karbonsav-csoport) geometriailag elõnyös közelében még két elektron-donor atom helyezkedik el, azaz lehetõség van egy neutrális három-fogú technécium-karbonil komplex kialakulására. Mivel az 1 peptid (4-amino-3-(2-(2-(1-(2-(2-(2-amino-3-mercaptopropanamido)-3mercaptopropanamido)-4-methylpentanoyl)pyrrolidine-2-carboxamido)-3-(4-ydroxyphenyl)propanamido)-3phenylpropanamido)-4-oxobutanoic acid) szerkezetében ez az elõnyös szerkezet az aszparagin-láncvégen elvileg kialakulhat, technécium jelzési kísérleteinket ebbe az irányba fókuszáltuk. A 2 komplex irodalmi módszert [3] követve létrehozható Mo/ Tc izotópgenerátor vizes eluátumában jelenlévõ 99m pertechnetát-anion ([ TcO4] ) boro-hidrides redukciójával amennyiben a redukciót szénmonoxid jelenlétében végezzük. A gáz formájú CO helyett a reakció kényelmesen végezhetõ ún. boranokarbonátokkal (pl: K2[H3BCO2] (3)), amelyek bomlásuk során kontrolláltan biztosítanak elegendõ szénmonoxidot a 2 komplex kialakításához [4]. A keletkezett 2 komplex néhány óráig vizes oldatban igen jó stabilitással bír, ahogyan ezt radiokromatográfiás méréseink is bizonyították, a komplex 6 óra múlva is 95%-ban jelen van. (Analízis módszere a következõ volt: izokratikus HPLC kation cserélõ oszlop 10 mm 150x4,1 mm; 35 mM HNO3/MeOH 85:15, 2 ml/min; Rt(TcO4 ) = 3 perc, Tc-karbonil = 5 perc). 99
99m
Az (1) peptid (0,5 mg) jelzését az így kapott (2) radioaktív prekurzorral (50-300 MBq) különbözõ hõmérsékleten, inkubációs idõben és pH mellett vizsgáltuk az optimális reakció körülmények megállapítása érdekében. A reakcióelegy összetételét, azaz a jelzés hatásfokát vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal követtük nyomon. (Analízis módszere a következõ volt: (Silica gel 60 F254 TLC aluminium sheets 20 x 20 cm; Futtatószer: acetonitril : víz (95:5) tf%; mini-GITA gamma TLC-szkenner; Tájékoztató Rf értékek: (TcO4 ) < 0,1; jelzett peptid = 0,2 – 0,8; Tc-karbonil > 0,9). A mérések eredményeibõl megállapítható, hogy a jelzés jó hatásfokkal (> 95%) végbemegy 30 – 40 oC-on, 15 perc alatt, enyhén savanyú pH tartományban (pH < 7). A radio-kromatogramokon ugyanakkor jól látható, hogy a jelzett peptid csúcsa nem homogén (két-három a radio-TLC-n nem elkülöníthetõ csúcs is látszik), azaz vélhetõen a (2) radioaktív prekurzor nem csak az (1) peptid kiválasztott láncvégéhez kötõdik, hanem a cisztein-cisztein-részen lévõ aktív csoportokhoz is koordinálódik. Ezek kevésbé stabil komplexet képeznek (2) vegyülettel, valamint az eredeti peptid szerkezetét ellenõrizhetetlen módon befolyásolhatják, ezért jelenlétük nem kívánatos a jelzett peptidben. Az egyes csúcsok aránya (vagy helyesebben a jelzett peptid csúcsának alakja) a kísérletek szerint nagymértékben függ az alkalmazott pH-tól, ezért a jelzési körülmények további, pontosabb vizsgálata szükséges. Vélhetõen szükséges lesz nagyobb felbontású HPLC-s vizsgálati módszert is beállítani a kapott eredmények világosabb értékelése érdekében. 2, Diagnosztikumok fejlesztése idegrendszeri betegségek korai felismerésére A pályázati munka második év elsõ félévében kokain hidrokloridból hat lépésben jutottunk a 2 kulcsintermedier származékhoz. (2. ábra).
2.ábra E munka folytatásaként a pályázati munka második év második félévében a korábban elõállított ditiol-amin-amid típusú izotópfogó ligandum felhasználásával közvetlen elõanyagát (3) kaptuk a korábban elõállított és diagnosztikumként használt tropánvázas TRODAT-1 jelzésû vegyületnek (3. ábra). Több irodalmi módszert próbáltunk ki a tiol csoportok benzil védõcsoportjának eltávolítására, ezek közül a trifluoro-ecetsav jelenlétében higany-acetáttal történõ reakció tûnt a legígéretesebbnek, azonban a keletkezõ termék nehéz tisztíthatósága miatt a szerkezet egyértelmû bizonyítása ez idáig nem sikerült, ez jelenleg is folyamatban van. A várt szerkezet igazolását követheti a preparatív léptékû szintézis, ehhez az utolsó elõtti lépés intermediere rendelkezésünkre áll, majd ezt követheti a radioaktív izotóp behelyezése.
34
3.ábra 3, A prion fehérje átalakulás mechanizmusának megismerése és a prion betegség diagnózisa. Elõzmények: Poliklonális antitesteket állítunk elõ a PrP fehérje rövid, 7-8 aminosavból álló peptidjeivel immunizálva csirkéket. Az antitesteket microtiterpléten, két különbözõ módon teszteltük. Ezeket az antitesteket jellemeztük a következõ lépésben idén. Elöször is az IgY antitestekebõl állítottunk elõ megint elegendõ mennyiségben a további kísérletekhez. Az immunizált csirkék tojásaiból vontuk ki õket az Eggcelent kit (Pierce Inc.) segítségével majd a megfelelõ peptideken alapuló affinitás kromatográfiával tovább tisztítottuk. A tisztított antitesteket TSE-ében szenvedõ hörcsögökbõl nyert agy-homogenát segítségével a prion fehérje abnormális formáján is teszteltük. Adszorbeáltuk az IgY antitesteket a mikrotiterplaten és rekombináns proteint illetve egészséges és beteg állatokból nyert agy-homogenátumot inkubáltunk rajta, majd megfelelõ mosás után acetylcholinesterase-Fab conjugátot használtunk másodlagos antitestként. Kontrolként Spi-Bio kit antitestjeit alkalmaztuk, ami felismeri mind két formáját a fehérjének. Az IgY antitestek felismerték a prion fehérjét mind a normal mind a fertõzött, agy homogenátumokban. Mind emellett a detektált szignál nagyságából a fertõzött agyminták esetében arra a következtetésre jutottunk, hogy az anti testek az abnormális formát csökkent mértékben, vagy egyáltalán nem ismerik fel. Ennek az egyértelmû eldöntését megnehezití hogy a fertõzött agy-homogenát tartalmaz valamennyi normál formájú PrP-t is. Ez egy nagyon érdekes eredménynek látszik, amit úgy kívánunk megerõsíteni, hogy a normális PrP-t proteázos emésztéssel eltávolítjuk detektálás elõtt a mintákból. Ez az eredmény fontos mind a fehérje abnormális formájú szerkezetének megismerése (mind a négy antitest a fehérje C-terminális része ellen irányul), mind hatékony diagnosztikai módszer kifejlesztése szempontjából. 4, Diagnosztikumok fejlesztése idegrendszeri betegségek korai felismerésére - Neuromuszkuláris betegségek diagnosztikája a, Korábban leírtuk a denervált, majd reinnervált patkányizom regenerációjának morfológiai jellemzõit, és a motoros véglemezek kifejezõdését (Pintér et al. 2003), amelyek a regeneráció károsodott voltára utaltak. Mivel az innerváció és annak minõsége alapvetõen meghatározza az izomrostok funkcionális/biokémiai típusát, jelenlegi kísérleteinkben megvizsgáltuk a reinnervált, majd regenerált izmok rosttípus-összetételét a miozin nehézláncok kifejezõdése alapján. Az immunhisztokémiai összehasonlító analízis bizonyította, hogy az eredetileg lassú típusú, fõleg miozin nehéz lánc I.et (MHCI) kifejezõ soleus izom reinnervációt követõen gyors izommá alakult át. A reinnervált izom roncsolását követõ regeneráció után, a regenerált izom tovább gyorsult, és az izomrostok egy része még a leggyorsabb típusú miozin nehézláncot (MHCIIB) is kifejezte. Eredményeink valóban azt jelzik, hogy a reinnervált izmok károsodást követõen a fiziológiástól eltérõ módon alkalmazkodnak, és nem tudják fenntartani az eredeti rosttípus-mintázatot. Jelenleg folyó kísérleteinkben az MHC expresszió transzkripciós regulációját vizsgáljuk RT PCR segítségével. Az extracelluláris matrix izomregenerációt befolyásoló esetleges szerepét egy tipikus extracelluláris fehérje, a matrilin2 kifejezõdése alapján vizsgáltuk. Northern és Western blot alapján a matrilin génje már a regeneráció kezdeti stádiumában aktiválódott, immunhisztokémiai vizsgálat alapján pedig mind az aktivált mioblasztok, mind a differenciálódó miotubulusok körül erõsebben fejezõdött ki. A matrilin-2 valószínûleg a motoros véglemezek újraszervezõdésében is részt vehet, mivel a véglemezek környékén, valamit az idegekben is erõsebb volt a kifejezõdése. További vizsgálataink a matrilin-2 regulációjának molekuláris mechanizmusaira irányulnak.
35
b, A miosztatin mutáns compact egér egyes végtagi izmainak morfológiai/immunhisztokémiai elemzése azt mutatta, hogy a leggyorsabb típusú, miozin nehéz lánc IIB-t kifejezõ rostok száma megnõtt a normál egerekhez képest, és ezen rostok átmérõje még kifejezettebben nõtt a hím egyedekben. A miosztatin fiziológiás szerepéhez tehát valószínûleg hozzátartozik a rosttípus- és méret fenntartása, és hatása nemi különbségeket mutat. Az androgén hormonok esetleges szerepét a miosztatin expressziójában az androgén dependens levator ani izom hormonális befolyásolásával vizsgáltuk. Hím Wistar patkányok egy csoportját kasztráltuk, egy másik csoportot kasztrálást követõen naponta tesztoszteronnal kezeltünk, kontrollként pedig kezeletlen, nem kasztrált állatok szolgáltak. A kasztrálást, illetve hormonkezelést követõen különbözõ idõpontokban az állatokból eltávolítottuk az androgénérzékeny levator ani izmukat, súlymérés és morfológiai vizsgálat mellett az izmokból a miosztatint specifikus primerekkel RT PCR reakcióban amplifikáltuk. Vizsgálataink szerint a kasztrált állatokban a miosztatin transzkript szintje emelkedõ tendenciát mutatott, míg a tesztoszteron kezelés hatására az izomsúly újra normalizálódott, a miosztatin szintje pedig szignifikánsan lecsökkent a kasztrálthoz és a kontrollhoz képest is. Jelenleg vizsgáljuk ezen, ill. más állatcsoportokban a miosztatin protein expresszióját. Eredményeink arra utalnak, hogy az androgének izomtömeg-növelõ hatása a miosztatin mRNS-szintû regulációján keresztül is megvalósulhat, ennek részletes molekuláris mechanizmusa azonban jelenleg még nem ismert. 5, Pszichiátriai betegségek génexpresszión alapuló diagnosztikája-DABIC Kht. A pályázat ezen szakaszában olyan módszert validáltuk, amely alkalmas teljes vérbõl fehérvérsejteket izolálni, majd abból akár hónapokkal késõbb is RNS-t kivonni úgy, hogy közben az RNS degradációja nem következik be. Ennek a módszernek a jelentõssége, hogy esetleges limfociták génexpressziós mintázatán alapuló diagnosztikai kit kifejlesztésénél nagy elõny, hogy a vér mintavétele és annak analízise különbözõ helyen történhet. A vér mintavétel klinikákon történik, majd onnan egy központi laboratóriumba szállítják, ahol a géenxpressziós vizsgálatot végzik. 10 normál emberbõl izoláltunk leukocita-extraktumot, és olyan körülmények között dolgoztunk fel, amely egy klinikailaboratóriumi mintavétel-feldolgozás körülményeit imitálta. A protokoll alapján megfelelõ mennyiségû RNS-t sikerült izolálnunk, amelyeket cDNS-sé átírva olyan templáthoz jutottunk, amelyen kvantitatív valós-idejû PCR-ben (QRT-PCR) teszteltünk. Több olyan génnek a kifejezõdését tudtuk igazolni, amelyek elõzetes eredményeink alapján szkizofréniára jellemzõ markerek lehetnek (dopamin receptor, káliumcsatorna gének). Emellett különbözõ normalizációs gének kifejezõdését is megvizsgáltuk. A protokollokat TaqMan univerzális próbákkal hajtottuk végre. Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy az általunk optimalizált módszer alkalmas vérbõl centrifugálás nélkül leukocitákat izolálni, makd abból jó minõségû RNS-t preparálni génexpressziós analízisekhez. A Transmentix KFT-vel sikerült megállapodnunk, hogy az általuk tervezett szkizofrénia betegek génexpressziós mintázat meghatározásában részt vállalunk közös szabadalom vagy alkalmazás fejében. Jelenleg 50 beteg mintájának az elõzetes feldolgozásán dolgozunk. A KFT-nek Európában egyedülálló készülékhez van hozzáférése: egy nanokapilláris elven mûködõ QRT-PCR microarray technológiához. A készülék alkalmas nagyszámú genomi DNS mintán több alcsoportra bontva SNP-ék analízisére TaqMan protokollal. A módszer lényege, hogy olcsón nagy számú mintán, nagyszámú SNP vizsgálható. OIyan SNP TaqMan próbák lettek tervezve és megvásárolva, amelyekbõl elkészült egy teszt SNP-QRT-PCR csip. Az SNP-k közül (összesen 32 féle) a legtöbbet már leírtak szkizofréniában szenvedõ betegekben eltérõ populációkban. Az elsõ kísérletekben 24 normál ember genetikai variációit határoztuk meg. 6, Sclerosis Multiplex (SM) négy pathológiailag jól definiált altípusának liquorminták alapján történõ tanulmányozása A multiple sclerosis diagnosztizálásához, a betegség során keletkezõ biomarkerek meghatározásához, a metabolitok azonosításához és ebbõl a lehetséges terápiás lehetõségekre történõ javaslattételhez metabolomikus analízist végeztünk az SZTE Neurológiai Klinika liquor mintabázisát felhasználva. A vizsgálat egyik legfontosabb eleme a mintából NMR segítségével készített spektrum készítése. Elõzetes vizsgálatainkat az Élettan Intézetbõl kapott patkány testfolyadékokon végeztük. A spektrumok nagyságrendileg 1000 csúcsot tartalmaznak. A folyadék fázisú nmr vizsgálatokat H2O/D2O 9:1 arányú keverékében szobahõmérsékleten hajtottuk végre BRUKER AVANCE DRX-500 NMR spektrométer felhasználásával. A készülék 5mm átmérõjû mintacsövek befogadására 1 alkalmas mérõfejjel van ellátva, amely két független frekvencia csatornával ( H: 500.12 MHz és 50-202 MHz tartományon belül széles sávon hangolható) rendelkezik. Terveink szerint a liquor felvételeket nagyobb érzékenységû 600 MHz 1H frekvenciájú készüléken vesszük fel, ami a
36
következõ elõnyökkel jár: i) a jel/zaj viszony javul, ami a komponensanalízisben jelentõs elõnnyel jár; ii) a spektrum kémiai eltolódás irányában nagyobb feloldást mutat, ami a jelek szeparálódásában és integrálásában nagyobb pontosságot jelent. A BRUKER DRX 600 MHz-es készülék 2006 júliusában került beállításra (a mágnes felgerjesztésére ekkor került sor). A készüléken 2006 szeptemberétõl mérjük a likvor mintákat, de az adatok még nem elegendõek statisztikai kiértékeléshez. A vizsgálatokra 24 liofilizált biológiai minta érkezett négy csoportban (I/24/1, I/24/2, I/24/3, II/1, II/2, II/3, III/1, III/2, III/3, III/4, III/5, III/6, IV/1, IV/2, IV/3, IV/4, IV/5 , IV/6, IV/7, IV/8, IV/9, IV/10, IV/11, IV/12 jelzésekkel). A folyadék fázisú vizsgálatokat H2O/D2O 9:1 arányú keverékében szobahõmérsékleten hajtottuk végre BRUKER AVANCE DRX-500 NMR spektro¬méter felhasználásával. A készülék 5mm átmérõjû mintacsövek befogadására alkalmas mérõfej¬jel van 1 ellátva, amely két független frekvencia csatornával ( H: 500.12 MHz és 50-202 MHz tartományon belül széles sávon 1 hangolható) rendelkezik. A vizsgálatok során H-NMR spektrumok felvételét és értékelését hajtottuk végre. A felvételek készítése során a H2O jelek telítésével megszabadultunk a nagy intenzitású és az értékelést zavaró vízjeltõl. A spektrumok alapján a minták három csoportba oszthatók, az elsõ csoport mintáinak (I/24/1, I/24/2, I/24/3) spektrumában intenzív laktát jeleket detektáltunk, a kismolekulás metabolitok jelei kis intenzitással jelentkeznek a spektrumban (1. ábra). Lényeges lépés a mérési technikánál, hogy az alapvonalba olvadó széles jeleket sikerült méréstechnikailag kiszûrni, ezáltal az integrálás pontos eredményeket ad. A II csoport mintáiban (II/1, II/2, II/3, IV/1, IV/2, IV/4, IV/6) a laktát mellett acetil-acetát, glükóz (á és ß), valamint aminosavak jelenlétét mutattuk ki (3. ábra). 1 A harmadik csoport mintái (III/2, III/3, III/4, III/5, III/6, IV/9, IV/10, IV/11, IV/12) esetén az H-NMR spektrumokban csak az acetil-acetát, acetát és laktil jeleket detektáltuk , a kismolekulás metabolitok mennyisége csekély. A projekt megvalósítása során a következõ feladatokat kell még megoldanunk 1. Az összes liquor-minta 600 MHz-es nmr spektrumának felvétele (FID adatbázis) 2. A spektrumokból adatbázis-kompatibilis mátrix készítésének optimalizálása: alapvonalkorrekció matematikai optimalizálása, csúcslista (peak-picking), integrál (fix szakaszos, csúcs szerinti), oszlopdiagram Bucket hisztogram) szerinti kovariancia minõség meghatározása. 3. Orvosdiagnosztikai adatbázisból mátrix készítése (stratégia kidolgozás nehezen számszerûsíthetõ információkra (progresszivitás, típus, stb.), releváns és nem releváns adatok kiszûrése (nem, életkor, képalkotó diagnosztika, stb.), Együttmûködés A klaszteren belül intenzív együttmûködés alakult ki az egyes kutatócsoportok valamint a Diagnosticum, a DABIC és a Qualicont vállalatok között. Az Alzheimer-kór diagnosztikum kidolgozása szorosan kapcsolódik az 1. alprogram 1. klaszteréhez.
37
OKTATÁSI KURZUS 2005.12.01.-2006.11.30.
Proteomikai tanfolyam A tanfolyam Janáky Tamás és Medzihradszky Katalin vezetésével zajlott 2006. április 24-27. között. Összesen 50 fõ vett részt az elméleti oktatáson, amelyet 3x3 nap gyakorlati képzés is követett. Humán Neuroanatómiai tanfolyam Palkovits Miklós vezetésével a mikrodisszekciós technikát 2006 szeptember 21 és november 11 között tartják Budapesten, egyetemi hallgatók és doktoranduszok, valamint fiatal kutatók részére. A humán agy mikrodisszekciós mintavételérõl film készült Az Alzheimer-kór és sejtélettani alapjai speciálkollégium Penke Botond, Toldi József, Kálmán János, Datki Zsolt vezetésével 2006-2007 tanév során heti 2 órában megvalósuló speciálkollégium (AOK-K99022, 2 kreditpont). Az egyetemi hallgatókat és doktoranduszokat megcélzó oktatás 250300 hallgató rendszeres részvételével zajlik. Speciálkollégiumok egyetemi doktoroknak és hallgatók részére 1. Neurodegeneratív betegségek, neuroplaszticitás és neurodegeneráció - Dr. Toldi József 2006. 2. NMR Spektroszkópia - Dr. Dombi György 2006. 3. Idegsejtek és gliasejtek plaszticitása - Dr. Párdutz Árpád 2006. 4. A hormonok szerepe az idegsejtek mûködésében - Dr. Párdutz Árpád 2006. 5. Nyomjelzõ anyagok és technikák - Dr. Tóth Géza 2006. 6. A neurokémia alapjai - Dr. Benyhe Gábor 2006. 7. A szignáltranszdukciók mechanizmusa - Dr. Borsodi Anna 2006. 8. Sejtbiológia - Dr. Gulya Károly 2006. 9. Molekuláris medicína: õssejtek és terápiás alkalmazásuk - Dr. Gulya Károly 2006. 10. Molekulária neurobiológia - Dr. Gulya Károly 2006. 11. L. Pasterur és Szent-Györgyi Albert élete és munkássága - Dr. Penke Botond és Dr. Datki Zsolt 2006. XXXVIII. Kromatográfiás Továbbképzõ Tanfolyam A tanfolyamot az évtizedes hagyományoknak megfelelõen Szegeden szerveztük. A 95 résztvevõ az ország valamennyi fontos egyetemi vagy ipari kutatóhelyét képviselte. A tanfolyamot Janáky Tamás (4. alprogram) és a Kromat Kft. szervezte 2006. január 25-27. között. A Magyar Tudomány Napja Az MTA Szegedi Bizottságának és az SZTE-nek közös rendezvénye, melyen a regionális egyetemi tudásközpontok mutatkoznak be az egyetem és a nyilvánosság számára. A 2006. november 17-i elõadássorozat keretében a DNT altémavezetõk és a menedzserigazgató 8-8 percben mutaják be a Dél-Alföldi Neurobiológiai Tudásközpont eddig elért eredményeit. A tervek szerint rendezvény évenként ismétlõdik, és a most mûködõ és jövõben csatlakozó centrumok beszámoltatásának egyik hivatalos fóruma lesz. Ész beszél elõadássorozat • 2005. december 8.: Üzleti tervezés II: A tõke tulajdonságai. Tánczos Péter, partner, Euroventures • 2006. január 19.: A szellemi tulajdon és védelme (Dr. Molnár István ügyvezetõ igazgató, Biopolisz Kft) • 2006. február 23.: A technológiai transzfer mint a szellemi tulajdon megtérülésének egyik lehetõsége (Dr. Mogyorósi • Péter ügyvezetõ igazgató, Laser Consult Kft.) • 2006. március 23. : Gyógyszeripar: a molekula fejlesztéstõl a marketingig (Dr. Pávó Imre regionális kutatási igazgató, Eli Lilly and Company) • 2006. április 27: Dél-alföldi tudásközpontok: Dr. Buzás Norbert innovációs igazgató, SZTE, Dr. Alföldi Péter, menedzserigazgató, SZTE DNT, Kovács Tibor, igazgató, SZTE DEAK
38
TECHNOLÓGIA TRANSZFER, A KUTATÁSI EREDMÉNYEK HASZNOSÍTÁSA Új spin-off cégek alapítása • A Szegedei Egyetem részvételével 2 spin-off cég alakult: a Vitadel Kft. és a Provit Kft. • Az MTA Szegedi Biológiai Központ (MTA SZBK) részvételével alakult meg a Musgenex Kft. • A prion diagnosztika kifejlesztésére megalakult a Biospiral 2006 Bt. az MTA-SZBK területén Szabadalmak: Négy hazai szabadalmi bejelentés készült: 1, Az Alzheimer-kór és az amiotróf lateral sclerosis kezelésére alkalmas vegyületek (1. Alprogram) 2, és 3, A pánikbetegségek kezelésére alkalmas AMPA-receptor modulátorok (PO 600650 és PO 600651; EGIS Gyógyszergyár) 4, Iratin származékok mint új típusú láz-és fájdalomcsillapítók (2. Alprogram) Két külföldi szabadalmi bejelentés is történt: 1, Peroxinitrit markerek humán alkalmazhatósága. PharmaHungary 200 Kft. 2, Kísérleti vér-agygát modell. Japán szabadalmi bejelentés Termékek: • Egérkísérletekhez a fej befogására alkalmas mûanyag öntvény, a stereotaxiás kélszülék segítségével az agyba történõ hatóanyagbevitel céljára (3. Alprogram, Dr. Juhász Gábor) • Egy új, triciált opiát peptid (2. alprogram, Dr. Tóth Géza) • Javított multikapillárisos szénelektród in vivo elektrofiziológiai vizsgálatokra (Kation Bt.) • Glikogén szintetár kináz 3 beta (GSK-3ß) (Creative Bt.) Uj Forrasok bevonasa: • A SZOTE Kht palyazatabol vasarolt nagyteljesitmenyû számítógéprendszer (57 millió Ft érték) a DNT „Kutatóközpont és Inkubátorház”-ban áll a DNT kutatói hálózat rendelkezésére. • Az SZTE Gyógyszerészkar új, 600 MHz-es NMR készüléke (150 millió Ft érték) a DNT Kutatóközpontban lett elhelyezve és akutatók rendelkezésére áll. • A párizsi 2. Nemzetközi Innovációs Kiállítás és Vásár-on a szabadalmaink értékesítésére több befektetõ céggel is tárgyal t a DNT-t képviselõ menedzserigazgató (Papp Csaba) és a koordinátor (Dr. Penke Botond)
39
EGYÜTTMÛKÖDÉS AZ IPARI PARTNEREKKEL EGIS Gyógyszergyár NyRt. A vállalat kulcsszerepet játszik a második alprogram kutatási-fejlesztési munkáiban. A DNT Kutatóközpont és Inkubátorházban a következõ laboratóriumok mûködnek az EGIS támogatásával: DNS- és Oligonukleotid Laboratórium, RNS-Interferencia Laboratórium, Számítóközpont és a Peptid-Protein Laboratórium Kromat Kft. A vállalat a 4. alprogram munkáiban kulcsszerepet tölt be. A Kromat Kft. segítségével indult be a Neuroproteomikai Laboratórium mûködése és a vállalat részt vesz a Provit Kft. spin-off cég alapításában is. JSW Hungary Kft. A JSW Hungary Kft. 2006. augusztusában csatlakozott a DNT programhoz. A cég gyógyszerjelölt molekulák kutatási szerzõdésen alapuló analitikai, biokémiai és molekuláris biológiai tesztelését, valamint azok in vitro szövettenyészeten és in vivo transzgenikus egérmodelleken történõ preklinikai tesztelését végzi, szorosan kapcsolódva a DNT program 3. és 5. alprogramjához tartozó csoportok kutatásaihoz. Ezen túlmenõen kedvezményesen látja el a konzorcium minden egyes tagját az Alzheimer- és a Parkinson- kór transzgenikus állatmodelljeivel. Musgenex Kft. A társaság több új, a konzorcium profiljában is szereplõ, különbözõ neurodegenerációs betegségek megelõzésére és gyógyítására alkalmas gyógyszerhatóanyag felfedezésével, a vezérmolekulák gyógyszerré, gyógyhatású készítménnyé fejlesztésével járulhat hozzá a projekt megvalósításához; eddig már két amerikai/világszabadalom felfedezésében és sikeres megvalósításában vett részt. A Musgenex rendelkezik az állatkísérletekhez és kísérleti állatok tartásához szükséges engedélyekkel, továbbá új neurodegenerációs betegségeket modellezõ transzgenikus egerek kifejlesztésével járulhat hozzá a konzorcium feladatainak sikeres teljesítéséhez Vitadel Kft. A DNT saját alapítású cége, melynek elsõdleges feladata a konzorciumi partnerek által nyújtott szolgáltatások kiközvetítése, kapcsolatépítés. A projekt befejeztével az elõbbieken túlmenõen az egyetemi konzorciumi partner részére kíván projektmenedzsmenti szolgáltatásokat végezni. Fenntartható fejlõdés A DNT egyik pályázatban is megfogalmazott célja, hogy a pályázati idõszak leteltével olyan szervezet alakuljon ki, amely képes saját bevételeibõl és egyéb forrásokból költségeinek jelentõs részét fedezni. A kapcsolatok komplex rendszerét kidolgozva feladati szintek szerint a következõ bevételi forrásokra számítunk. Nemzetközi kapcsolatrendszer A Szegedi Tudományegyetem részt vesz a magyar, cseh, szlovák, horvát, román, ukrán egyetemek és a Cedars Sinai Medical Health Care részvételével alakított konzorciumban. A DNT által alapított Vitadel spin-off cég mint ernyõcég a konzorciumi szerzõdés keretein belül olyan nemzetközi kapcsolatokkal rendelkezõ társasághoz tud kapcsolódni, mely a szabadalmi jogok értékesítésében jelentõs potenciállal és nagy tapasztalatokkal rendelkezik. A DNT felvette a kapcsolatot a NUMICO multinacionális vállalattal egy funkcionális élelmiszer eladása és az Eli Lilly bécsi irodájával egy potenciális gyógyszer továbbfejlesztése céljából. Hazai kapcsolatrendszer A DNT tervezi, hogy a Nemzeti Fejlesztési Terv 2007-tõl induló szakaszában pályázatot állít össze. A pályázatok célja, hogy forrást találjunk azon K+F munkákhoz, melyek csak részben kapcsolódnak a jelenlegi RET pályázathoz, vagy az eredeti munkatervben nem szerepelnek a kutatási eredmények fejlõdése miatt. Egy nyertes pályázattal szélesítjük a DNT kutatási spektrumát, s növelve a kutatók számának kritikus tömegét. Regionális kapcsolatrendszer A DNT felvette a kapcsolatot a ValDeal cég magyarországi igazgatójával, a Szegedi Tudományegyetem volt innovációs igazgatójával. Együttmûködési megállapodást szeretnénk kötni a céggel projektjeink esetleges továbbfinanszírozását, illetve újabb projektek létrehozását célozva. A DNT integrálódni kíván a szegedi és a dél-alföldi technológiai egészségügyi koncepcióba is a Szeged Pólus Khtn, illetve a Szegedi Egészségügyi Központon keresztül. Helyi kapcsolatrendszer A DNT pályázati súlyánál fogva, s mert karok közötti helyet foglal el, integráló szerepet kíván betölteni; a pályázati központ projektmenedzselési szolgáltatások nyújtásával tudja majd fenntartani, létszámát.
40
PUBLIKÁCIÓK 1. Alprogram
1. Klaszter
1) Kellermeyer MSZ, Grama L, Karsai A, Nagy A, Kahn A, Datki Z, Penke B: Reversible mechanical unzipping of amyloid beta-fibrils Biophys J 88, 198A-199A, 2005 IF = 4.507 2) Szegedi V., Juhász G., Budai D., Penke B.: Divergent effects of Aß 1-42 on ionotropic glutamate receptor-mediated responses in CA1 neurons in vivo. Brain Research, 1062, 120126., 2005. IF = 2.521 3) Oksman M., Iivonen H., Hõgyes E., Amtul Z., Penke B.: Leenders I., Broersen L., Lütjohann D., Hartmann T., Tanila H.: Impact of different saturated, poly unsaturated and cholesterol containing diets on beta-amyloid accdumulation in APP/PS1 transgenic. Neurobiology of Disease, 236, 563-572., 2006 4) Zana M., Juhász A., Rimanóczy A., Bjelik A., Baltás E., Ocsovszki I., Boda K., Penke B., Dobozy A., Kemény L., Janka Z., Kálmán J.: Alzheimer's lymphocytes are resistant to ultraviolet B-induced apoptosis. Neurobiol Aging. 27, 831-834, 2006 5) Law JM, Szori M, Izsak R, Penke B, Csizmadia IG, Viskolcz B.:Folded and unfolded conformations of the omega-3 polyunsaturated fatty acid family: ch(3)ch(2)[ch=chch(2)](b)[ch(2)](m)cooh: first principles study. J Phys Chem A Mol Spectrosc Kinet Environ Gen Theory 110(18), 6100-11. 2006 6) Szegedi V, Juhasz G, Rozsa E, Juhasz-Vedres G, Datki Z, Fulop L, Bozso Z, Lakatos A, Laczko I, Farkas T, Kis Z, Toth G, Soos K, Zarandi M, Budai D, Toldi J, Penke B.: Endomorphin-2, an endogenous tetrapeptide, protects against Abeta1-42 in vitro and in vivo. FASEB J. 20 (8), 1191-3., 2006 7) Shemer I, Holmgren C, Min R, Fulop L, Zilberter M, Sousa KM, Farkas T, Hartig W, Penke B, Burnashev N, Tanila H, Zilberter Y, Harkany T.: Non-fibrillar beta-amyloid abates spike-timing-dependent synaptic potentiation at excitatory synapses in layer 2/3 of the neocortex by targeting postsynaptic AMPA receptors. Eur J Neurosci., 23 (8), 2035-47., 2006 8) Hetényi C, Paragi G, Maran U, Timar Z, Karelson M, Penke B.: Combination of a modified scoring function with two-dimensional descriptors for calculation of binding affinities of bulky, flexible ligands to proteins. J Am Chem Soc. 128 (4):1233-9., 2006 9) Karsai Á., Mártonfalvi Zs., Nagy A., Grama L., Penke B., Kellermayer M.S.Z.: Mechanical manipulation of Alzheimer’s amyloid ß1-42 fibrils. Journal of Structural Biology 155, 316-326, 2006 10) Zarandi M., Soos K., Fülöp L., Bozsó Zs, Datki Zs, Tóth G.K., Penke B.: Synthesis of Aß(1-42) and its derivatives with improved efficiency Peptide Sci., in press 2006. December 11) Hollender D, A. Karoly-Lakatos, P. Forgo, T. Kortvelyesi, Gy. Dombi, Zs. Majer, M. Hollosi, T. Kiss, A Odani: Al(III) binding ability o fan octapeptide and its phosphorylated derivative, J. Inorg. Biochem., 100, (2006) 351-361. 12) Tamas A. Martinek, Istvan M. Mandity, Livia Fülöp, Gábor K. Tóth, Elemér Vass, Miklós Hollósi, Enikõ Forró, Ferenc Fülöp Effects of the Alternating Backbone Configuration on the Secondary Structure and Self-Assembly of ?-Peptides J. Am. Chem. Soc. 128, 13539-13544, (2006) 13) Kálmán J Juhász A, Bogáts G, Babik B, Rimanóczy A, Janka Z, Penke B, Palotás A. Elevated levels of inflammatory biomarkers in the cerebrospinal fluid after coronary artery bypass surgery are predictors of cognitive decline. Neurochem. Int. 2006; 48:177-180.IF: 2.994, Cit.: 0 14) Szegedi V., Gábor Juhász, Dénes Budai, Botond Penke. Divergent effects of A?1-42 on ionotropic glutamate receptor-mediated responses in CA1 neurons in vivo. Brain Res. 2005 Nov 16;1062(1-2):120-6. Epub 2005 Oct 24. IF: 2,54 1. Alprogram
2. Klaszter
15) Farkas E., de Vos, R.A.I., Donka, G., Jansen Steur, E.N., Mihály, A., Luiten, P.G.N. (2006) Age-Related Microvascular Degeneration in the Human Cerebral Periventricular White Matter. Acta Neuropath. (Berl.), 111(2), 150-157. IF: 2.527 (JCR 2005) 16) Farkas E., Domoki, F., Institóris, Á., Annaházi, A., Busija, D.W., Bari, F. (2006) Neuroprotection by diazoxide in animal models for cerebrovascular disorders. Vasc. Dis. Prev., 3(3), 253-264. IF: not defined, yet.
41
17) Farkas E.,Institóris, Domoki, F., Mihály, A., Bari, F. (2006) The effect of pre- and post-treatment with diazoxide on the early phase of chronic cerebral hypoperfusion in the rat. Brain Res., 1087(1), 168-174. IF: 2.296 (JCR 2005) 18) Farkas E. Süle, Z., Tóth-Szûki V., Mátyás, M., Antal, P., Farkas, I.G., Mihály, A., Bari, F. (2006) Tumor necrosis factor-alpha increases cerebral blood flow and ultrastructural capillary damage through the release of nitric oxide in the rat brain. Microvasc. Res., in press. IF: 2.362 (JCR 2005) 19) Veszelka Sz, Pásztói M, Farkas AE, Krizbai I, Dung NTK, Niwa, M, Ábrahám CS, Deli MA. Pentosan polysulfate protects brain endothelial cells against bacterial lipopoly-saccharide-induced damages. Neurochemistry International, 2006, doi:10.1016/j.neuint.2006.08.006 IF2004: 3.211 1. Alprogram 20) 6.402
3. Klaszter
Horváth G., Kekesi G. Interaction of endogenous ligands mediating antinociception. Brain Res. Rev. 2006 52:69-92, 2006IF:
21) Kolarovszky-Sipiczki, Z., Gáspár, R., Ducza, E., Páldy, E., Benyhe, S., Borsodi, A., Falkay, G. Effect of subtype-selective alfa1adrenoceptor inverse agonists on non-pregnant and late pregnant cervical resistance in vitro in the rat. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology (elfogadva) 22) Jójárt B. Possible dynamic anchor points in a benzoxazinone derivative - human oxytocin receptor system - a molecular docking and dynamics calculation. Journal of Molecular Modelling DOI 10.1007/s00894-006-0112-4 23) Jójárt B.Receptor based QSAR studies of non peptide human oxytocin receptor antagonists Journal of Molecular Graphics Modelling DOI: 10.1016/j.jmgm.2006.05.010 Könyvfejezetek 1. Kálmán J, Janka Z, Pákáski M Dementia in Hungary, a state report, 2006. European Dementia Consensus Network .(EDCON). Ed. Stoppe G., Springer Vienna, 2007. (in press) Deli MA. The role of blood-brain barrier in neurodegenerative diseases In: Molecular bases of Neurodegeneration, Research Signpost, Ed.: Diliegro I pp. 137-161, 2005 2. Deli MA, Blood-brain barrier models. In: Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology, Vol. 11, Chapter 5b, Lajtha A (Ed.), Springer, in press 2. Alprogram
4. Klaszter
24) Bagosi Z. Jászberényi M., Bujdosó E., Telegdy, G.: The effects of corticotropin-releasing factor and the urocortin on striatal dopamine release induced by electrical stimulation - an in vitro superfusion study. Neurochemical Research. 31,209-213,2006.IF: 2.187 25) Bagosi Z. Jászberényi M., Bujdosó E., Telegdy, G. The effects of endomorphins and diprotin a on striatal dopamine release induced by electrical stimulation - an in vitro superfusion study. Neurochemistry International. Accepted for publication 2006 IF: 2.994. 26) Jászberényi M., Bujdosó E.,Bagosi Z., Telegdy, G.: Mediation of the Behavioral, endocrine and thermoregulatory actions of ghrelin. Hormones and Behavior. 50,266-273, 2006. IF: 3.737 27)
Telegdy G., Adamik, A., Tóth, G. The action of urocortins on body temperature in rats. Peptides. 27, 2268-2294, 2006.IF: 2.231
28) 1. Gressens, P., Spedding, M., Gigler, G., Kertész, Sz., Villa, P., Medja, F., Williamson, T., Kapus, G., Lévay, G., Szénási, G., Barkóczy, J., Neau, I. And Hársing, L.G.Jr. (2005) The effect of AMPA antagonist in models of stroke and neurodegeneration Eur.J.Pharmacol, 51): 58-67 29) Benedek Gy., A., Móricz, K., Jurányi, Zs., Gigler, G., Lévay, G., Hársing, L.G., Mátyus, P., Szénási, G. and Albert, M. (2006) Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res., elfogadva 2. Alprogram
5. Klaszter
30) Ioja E., Géza Tóth, Sándor Benyhe, Dirk Tourwe, Antal Peter, Csaba Tömböly, Anna Borsodi. Opioid Receptor Binding Characteristics and Structure-Activity Studies of Novel Tetrapeptides in the TIPP (Tyr-Tic-Phe-Phe) Series. NEUROSIGNALS, 2005; 14:317-328 IF: 3,585 31) Gündüz Ö.,Sipos, F., Spagnolo, B., Kocsis, L., Magyar, A., Borsodi, A., Caló, G., Benyhe, S. (2006) Structure-activity studies on Ac-RYYRIK-NH2 hexapeptide analogues targeting NOP receptor. NEUROSIGNALS, 2006/2007; 15:74-90 IF: 3,585
42
32) Gündüz Ö., Rizzi, A., Baldisserotto, A., Guerrini, R., Spagnolo, B., Gavioli, E.C., Kocsis, L., Magyar, A., Benyhe, S., Borsodi A. and Calo’, G. (2006) In vitro and in vivo pharmacological characterization of the nociceptin/orphanin FQ receptor ligand Ac-RYYRIK-ol. EUR. J. PHARMACOL. 2006 Jun 6; 539(1-2):39-48 IF: 2,5 33) Ligeti M.., Bõsze S., Csámpai, A., Gündüz, Ö., Rónai, A.Z., Medzihradszky-Schweiger, H., Benyhe, S., Borsodi, A., Hudecz, F. and Magyar, A. (2006) Synthesis of enzymatically resistant nociceptin-related peptides containing a carbamic acid residue. J. PEPTIDE SCI. 2006 Jul; 12(7):481-90 IF: 1,652 34) András Z. Rónai, Erzsébet Szemenyei, Erzsébet Kató, László Kocsis, György Orosz, Mahmoud Al-Khrasani, Géza Tóth: Endomorphin synthesis in rat brain from intracerebroventicularly injected ?3H?-Tyr-Pro: A possible biosynthetic route for endomorphins. Regulatory Peptides 134, 54-60 (2006) IF: 2.272 35) Botros M., Matthias Hallberg, Tobias Johansson, Qin Zhou, Gunnar Lindeberg, Per-Anders Frändberg, Csaba Tömböly, Géza Tóth, Pierre Le Greves, Fred Nyberg: Endomorphin-1 and endomorphin-2 differentially interact with specific binding sites for substance P (SP) aminoterminal SP1-7 in the rat spinal cord. Peptides 27, 753-759 (2006) IF: 2.311 36) Mukherjee A., Kanchan Kothari, G. Tóth, E. Szemenyei, H.D. Sarma, J. Környei, Meera Venkatesh: 99mTc labeled annexin V fargments: a potential SPECT radiopharmaceutical for imaging cell death. Nuclear. Med. Biol. 33, 635-643 (2006) IF: 2.129 37) Keresztes A., Géza Tóth, Ferenc Fülöp And Mária Szûcs: Synthesis, radiolabeling and receptorial characterization of ?3H??(1S,2R) ACPC2?endomorphin-2. Peptides in press IF: 1.738 38) Birkás E., Tóth G., Kertész I., Bakota L., Gulya K., Szûcs M. Receptorial characterization of a new delta opioid peptide antagonist, Tyr-Tic–(2S,3R)?MePhe-Phe-OH. FEBS J. 272 (Suppl.1.): C3-017P, p. 218, 2005. IF: 3,164 39) Cinar R., Ken Mackie, Tamás F. Freund, Maria Szûcs. Searching for possible interactions between CB1 and GABAB receptors in rat brain hippocampal membranes. FEBS J. 273 (Suppl 1.): PP-54, p.91, 2006. IF: 3,164 40) Tóth G., A. Keresztes, E. Szemenyei, A.Z. Rónai, E. Kóta, M. Szûcs and F. Fülöp. Design, synthesis and radiolabeling of novel endomorphin analogues containing unnatural ?- and ß-amino acids. FEBS J. 273 (Suppl 1.): OP-97, p. 69, 2006. IF: 3,164 41) Kopniczky Z., Dochnal R, Macsai M, Pal A, Kiss G, Mihaly A, Szabo G.: Alterations of behavior and spatial learning after unilateral entorhinal ablation of rats. Life Sci. 2006; 78(23):2683-8. IF: 2,158 Szabo G., Dochnal R., Toth G., Macsai M.: Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide affects nicotine – induced analgesia in mice. Chinese Journal of Pathophysiology 22 (13) 141. 2006. 2. Alprogram
6. Klaszter
42) Takacs R., Varkonyi Tamas, Roka Richard, Lazar Mate, Legrady Peter, Lengyel Csaba, Papos Miklos, Pavics Laszlo, Kempler Peter, Dr. Lonovics Janos. A gyomorürülési zavar, az emésztõszervi tünetek és a diabéteszes neuropathia jellemzõinek tanulmányozása hosszú ideje fennálló 1-es és 2-es típusú diabetesben. Magyar Belorvosi Archivum 2006;59:27-34 43) Krecsmarik M., Izbéki F, Bagyánszki M, Linke N, Bódi N, Kaszaki J, Katarova Z, Szabó Á, Fekete É, Wittmann T. Chronic ethanol exposure impairs neuronal nitric oxide synthase in the rat intestine. Alcohol Clin Exp Res 2006;30:1-7. 44) Róka R., András Rosztóczy, Mathilde Leveque, Ferenc Izbéki, Ferenc Nagy, János Lonovics, Jean Fioramonti, Tibor Wittmann, Lionel Bueno. Elevated fecal protease activity: a new patophysiological factor and possible therapeutical target in diarrhea predominant irritable bowel syndrome. Clinical Gastroenterology and Hepatology 2006 accepted 45) Róka R., Rosztóczy András, Mathilde Leveque, Izbéki Ferenc, Nagy Ferenc, Molnár Tamás, Lonovics János, Raffael GarciaVillar, Jean Fioramonti, Lionel Bueno, Wittmann Tibor. Széklet szerin-proteáz aktivitás: új pathofiziológiai factor a diarrhea-predominans irritábilis bél szindrómában. Magyar Belorvosi Archivum 2006 (in press.) Könyvfejezetek 1.) Çinar R, Mackie K, Freund T.F., Szûcs M. Interplay between CB1 and GABAB receptors in rat brain hippocampal membrane. Biokémia, XXX (3.) E7-08, p. 62. 2.) Birkás E., Tóth G., T. Wen, J. Pintar, Szûcs M. (2006): A Tyr-Tic-(2S,3R)?MePhe-Phe-OH új delta opioid peptidantagonista in vivo és in vitro jellemzése egéragyi membránokban. Biokémia, XXX (3.), P-08, p. 66. 3. Alprogram 7. Klaszter 46) Németh H.., Toldi, J., Vécsei, L.: Role of kynurenines in the central and peripheral nervous system. (invited paper) Current Neurovascular Research 2:249-260, 2005. IF:1,425 47)
Németh H., Toldi, J., Vécsei, L.: Kynurenines, Parkinson's disease and other neurodegenerative disorders: preclinical and clinical
43
studies. (invited paper) J. Neural. Transm. S 70:285-304, 2006. IF: 2,628 48) Sas K., Robotka, H., Toldi, J., Vécsei, L.: Mitochondria, metabolic disturbances, oxidative stress and the kynurenine system, with focus on neurodegenerative disorders. J. Neurol. Sci. in press 2006. 49) Hartai Zs., Klivényi, P. Janáky, T., Penke, B., Dux, L., Vécsei, L.: Kynurenine metabolism in plasma and in red blood cells in Parkinson's disease. J. Neurol. Sci. 239:31-35, 2005. IF: 2,366 50) Klivényi P., Kékesi, K.A., Hartai, Zs., Juhász, G., Vécsei, L.: Effects of mitochondrial toxins on the brain amino acid concentrations. Neurochem. Res. 30:1421-1427, 2005. IF: 2,218 51) Hartai Zs., Klivényi, P., Janáky, T., Penke, B., Dux, L., Vécsei, L.: Peripheral kynurenine metabolism in focal dystonia. Medicinal Chemistry in press, 2006. 52) Klivényi P., Bende, Zs., Hartai, Zs., Penke, Zs., Németh, H., Toldi, J., Vécsei, L.: Behaviour changes in a transgenic model of Huntington's disease. Behav. Brain Res. 169:137-141, 2006. IF: 2,992 53) Knyihár-Csillik, E., Chadaide, Z., Mihály, A., Krisztin-Péva, B., Fenyõ, R., Vécsei, L.: Effect of 6-hydroxydopamine treatment on KAT-I (KAT-I) immunoreactivity of neurons and glial cells in the rat substantia nigra. Acta Neuropathologica 112:127-137, 2006. IF: 2,503 54) Knyihár-Csillik, E., Toldi, J., Krisztin-Péva, B., Chadaide, Z., Németh, H., Fenyõ, R., Vécsei, L: Kynurenine supported with probenecid prevents stimulation induced increased c-fos immunoreaction in the caudal trigeminal nucleus. J. Neural Transm. In press 2006. IF: 2,628 55) Knyihár-Csillik E., Toldi J., Mihaly A., Krisztin-Peva B., Chadaide Z., Nemeth H., Fenyo R., Vecsei L.: Kynurenine in combination with probenecid mitigates the stimulation-induced increase of c-fos immunoreactivity of the rat caudal trigeminal nucleus in an experimental migraine model. J Neural Trasm. In press 2006. 56) Lur G., Rakos G., Juhasz-Vedres G., Farkas T., Kis Z. and Toldi J (2006) Effects of dehydroepiandrosterone sulfate on the evoked cortical activity of controls and of brain-injured rats. Cell Mol Neurobiol. 2006. Jun 7 (Epub ahead of print). 57) Marosi M., Rakos G., Robtoka H., Nemeth H., Sas K., Kis Z., Farkas T., Lur G., Vecsei L. and Toldi J. (2006) Hippocampal (CA1) activities in Wistar rats from different vendors. Fundamental differences in acute ischemia. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2):231-235. 58) Juhász-Vedres G., Rózsa É., Rakos G., Dobszay M., Kis Z., Wolfling J., Toldi J., Párducz Á., Farkas T. (2006) Dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS) is neuroprotective when administered either pre-or post-injury in a focal cortical cold lesion model. Endocrinology. 147(2): 683-6. 59) Kaszaki J., Wolfárd A., Szalay L., Boros M.: Pathophysiology of ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc 38:826-828, 2006. IF 0,511 60) Erõs G., Kaszaki J., Czóbel M., Boros M.: Systemic phosphatidylcholine pretreatment protects the canine esophageal mucosa during acute experimental biliary reflux. World J. Gastroenterol 12: 271-279, 2006. IF 3,318 61) Erõs G., Kaszaki J., Czóbel M., Boros M.: Foszfatidilkolin elõkezelés hatása kísérletes epés reflux akut szakaszában. Magyar Sebészet 58: 406-414, 2006. 62) Palásthy Z., Kaszaki J., Lázár J., Nagy S., Boros M.: Intestinal nitric oxide synthase activity changes during experimental colon obstruction. Scand J Gastroenterol 41: 910-918, 2006. IF 1,824 63) Szabó A., D Menger M, Boros M.: Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals. Microsurgery. 26: 50-53, 2006. IF 0,812 Könyv Vécsei, L. (editor): Kynurenines in the brain: from experiments to clinics. Nova Science, pp. 1-205, New York, 2005. 3. Alprogram 8. Klaszter 64) De Marco A., Vigh, L., Diamant, S., and Goloubinoff. P. Native folding of aggregation-prone recombinant proteins in Escherichia coli by osmolytes, plasmid- or benzyl alcohol-overexpressed molecular chaperones. Cell Stress and Chaperones 10:329-339 (2005). IF 2.718 65) Horváth I., Török, Z., Balogh, G., Maslyanko, A., Nagy, E., Balogi, Z., Gombos, I., Vígh, L. Stress protein responses in mammalian cells under the control of lipid composition and microdomain organization of membranes. Chem. Phys. Lipids 143, 46 (2006)IF 1.971 66)
44
Bjelik A., Bereczki E., Gonda S., Juhász A., Rimanóczy A., Zana M., Csont T., Pákáski M., Boda K., Ferdinándy P., Dux, L.,
Janka Z., Sántha M. and Kálmán J. 2006. Human apoB overexpression and high-cholesterol diet differently modify the brain APP metabolism in the transgenic mouse model of atherosclerosis. Neurochemistry Int. 49(4):393-400. IF: 3.2 67) Bjelik A., Pákáski, M., Bereczki E., Gonda,S., Juhász ,A., Rimanóczy A., Zana,M., Janka,Z., Sántha, M., and Kálmán, J. 2006. APP mRNA splicing is upregulated in the brain of biglycan transgenic mice. Neurochemistry Int. (in press) IF: 3.2 3. Alprogram 9. Klaszter 68) Párducz A., T. Hajszan, N.J. MacLusky, Zs. Hoyk, E. Csakvari, A. Kurunczi, J. Prange-Kiel and Cs. Leranth Synaptic remodeling induced by gonadal hormones and neurosteroids Neuroscience, 138(3): 977-85 (2006) IF: 3,601 69) Turchányi, B., Hamar, J., Tömböl, T., Siklós, L.: Capsaicin delays regeneration of the neuromuscular junction of rat extensor digitorum longus muscle after ischemia. Muscle Nerve, 33:556-567 (2006) IF: 2.43 70) George O., A. Parducz, D. Dupret, M. Kharouby, M. Le Moal, P.V. Piazza and W. Mayo Smad-dependent alterations of PPT cholinergic neurons as a pathophysiological mechanism of age-related sleep-dependent memory impairments. Neurobiology of Ageing, 2005 Nov 26; [Epub ahead of print] IF: 5,516 71) Hoyk Zs., Cs. Varga and A. Parducz Estrogen induced region specific decrease in density of 5-bromo-2-deoxyuridine labeled cells in the olfactory bulb of adult female rats Neuroscience, 141(4): 1919-24 (2006) IF: 3,601 72) Obál I.G. Juhász-Vedres, E. Rózsa, G. Rakos, M. Dobszay, Zs. Kis, J. Wölfling, J. Toldi, A. Párducz and T. Farkas Dehydroepiandrosteron sulfate (DHEAS) is neuroprotective both in pre- and in post-injury administration in a focal cortical cold lesion model. Endocrinology, 147(2): 683-6 (2006) IF: 5,151 Obál I, Engelhardt JI, Siklós L. Axotomy induces contrasting changes in calcium and calcium-binding proteins in oculomotor and hypoglossal nuclei of Balb/c mice. J Comp Neurol, 499: 17-32 (2006) IF: 3,500 73)
Annaházi A.
74) Szabadics J., Varga, C., Molnár, G., Oláh, S., Barzó, P. and Tamás, G. (2006) Excitatory effect of GABAergic axo-axonic cells in microcircuits of the cerebral cortex. Science 311, 233-235. 3. Alprogram 10. Klaszter 75) Zvara A., Bencsik P, Fodor G, Csont T, Hackler Jr L, Dux M, Fürst S, Jancsó G, Puskás LG, Ferdinandy P. Capsaicin-sensitive sensory neurons regulate myocardial function and gene expression pattern of rat hearts: a DNA microarray study. FASEB J, 20:160-162 (2006). IF: 7.064 76) Turan N., Csonka C, Csont T, Giricz Z, Fodor G, Bencsik P, Gyöngyösi M, Cakici I, Ferdinandy P. The role of peroxynitrite in chemical preconditioning with 3-nitropropionic acid in rat hearts. Cardiovasc Res 70:384-390 (2006) IF: 5.283 77) (2006)
Ferdinándy P. Peroxynitrite: just an oxidative/nitrosative stressor or a physiological regulator as well? Br J Pharmacol 148:1-3 IF: 3.41
3. Alprogram 11. Klaszter 78) Bakota L., Orojan I, Gulya K (2005) Intranuclear differences in calmodulin gene expression in the trigeminal nuclei of the rat. Acta Biol Szeged 49, 9-14. 79) Orojan I., Szigeti C, Varszegi S, Gulya K (2006) Dithranol abolishes UCH-L1 immunoreactivity in the nerve fibers of the rat orofacial skin. Brain Research (in press). IF: 2.296 80) Orojan I, Bakota L, Gulya K (2006) Differential calmodulin gene expression in the nuclei of the rat midbrain-brain stem region. Acta Histochemica (in press). IF.: 0.92 Könyv, könyvfejezet: Vigh,L., Torok,Zs., Balogh,G., Glatz, A., Piotto,S. And Horvath,I. Membrane-regulated stress response: a theoretical and practical approach. In „Molecular Aspects of the Stress Response: Chaperones, Membranes and Networks” Ed by: Peter Csermely and Laszlo Vigh, Landes Bioscience and Springer, 2006. 4. Alprogram 12. Klaszter 81) Must A., Zoltán Szabó, Nikoletta Bódi, Anna Szász, Zoltán Janka, Szabolcs Kéri Sensitivity to reward punishment and the prefrontal cortex in major depression Journal of Affective Disorders 90: 209-215 (2006) 82)
Janáky T.
45
83) Likó I: Evidence for an extended interacting surface between ??-amyloid and serum amyloid P component. István Likó, Marianna Mák, Éva Klement, Éva Hunyadi-Gulyás, Tamás Pázmány, Katalin F. Medzihradszky, Zoltán Urbányi. Accepted in Neurosci. Lett. IF 2,019 84)
Shahar T.
85) Puskás L. Laszlo G. Puskás & Klára Kitajka. (2006) Nutrigenomic approaches to study the effects of n-3 PUFA diet in the central nervous system. Nutrition and Health, Vol. 18, pp. 213–218. 86) P. Medveczky, J. Antal, A. Patthy, K. Kékesi, G. Juhász, L. Szilágyi, L. Gráf: Human trypsin 4 selectively cleaves myelin basic protein: does this brain protease play a role in the patomechanism of multiple sclerosis? FEBS Letters 580(2):545-52, 2006 imp. p. 3.843 87) Zs. Kovács, K.A. Kékesi, I. Ábrahám, D. Székács, N. Király, E. Papp, I. Császár, É. Szegõ, K. Barabás, M. Andrásfalvy, A. Erdei, T. Bártfai, G. Juhász: Facilitation of spike-wave discharge activity by LPS in WAG/Rij rats Neuroscience 140(2):732-42, 2006 imp. p. 3.456 88) G. Nyitrai, K.A. Kékesi, G. Juhász: Extracellular level of GABA and Glu: in vivo microdialysis-HPLC measurements Curr Top Med Chem 6(10):935-40, 2006 imp. p. 4.4 89) K.A. Kékesi, Zs. Kovács, N. Szilágyi, M. Bobest, T. Szikra, Á. Dobolyi, G. Juhász, M. Palkovits: Concentration of nucleosides and related compounds in cerebral and cerebellar cortical areas and white matters of the human brain, Cellular and Molecular Neurobiology (Epub ehead of print 2006 Aug 1.) imp. p. 1.97 90) Barabás K, Szegõ M.É, Kaszás A. Nagy M G, Juhász G, Ábrahám. IM. Sex differences in estrogen-induced p44/42 MAPK phosphorylation in the mouse brain in vivo. J. Neuroendocrinology 18(8):621-8 imp.p. 2.92 91) Éva M. Szegõ, Klaudia Barabás, Júlia Balog, Nóra Szilágyi, Kenneth S. Korach, Gábor Juhász, and István M. Ábrahámm, Estrogen Induces Estrogen Receptor Dependent CREB Phosphorylation via MAPK Pathway in Basal Forebrain Cholinergic Neurons in vivo J. of Neuroscience 26(15):4104-10 imp. p. 7.907 92) I.M. Ábrahám, P. Meerlo: Concentration dependent actions of glucocorticoids on neuronal viability and survival, Dose-Response, 4:38-54, 2006 93) M. Lõrincz, M. Oláh, P. Baracskay, N. Szilágyi, G. Juhász: Propagation of spike and wave activity to the medial prefrontal cortex and dorsal raphe nucleus of Wag/Rij rats, Phys. Behaviour PHB8024 imp.p. 2.044 94) Hartai Z, Juhasz A, Rimanoczy A, Janaky T, Donko T, Dux L, Penke B, Toth GK, Janka Z, Kalman J.: Decreased serum and red blood cell kynurenic acid levels in Alzheimer's disease. Neurochem Int. 2006 Oct 3; [Epub ahead of print] imp.p. 3.261
MÉDIAMEGJELENÉSEK 2006-BAN • 2006. augusztus 25. Délmagyarország 6. oldal: Uniós mentõöv a Dél-Alföldnek • Business Class (internetes megjelenés): A régió élettudományi klaszterének alapja • Business Class (internetes megjelenés): Befektetési aktivitás, munkahely teremtés • 2006. január, II. évfolyam, 2. szám, Déli Riport 4. oldal: Gyógyszerkutatás Szegeden (rövidhír) • 2006. 06. 05. Rádió88: Átadták a Dél-alföldi Neurobiológiai Tudásközpontot (internetes és rádióhír) • 2006. 06.16. Délmagyarország: Saját otthonába költözött a DNT • 2006. 06.15. Juventus Rádió: Új székháza van a Neurobiológiai Tudásközpontnak (internetes és rádióhír) • 2006.06.15. Szegedi Napilap: A Parkinson-kór ellenszerét is keresik Szegeden • 2006. 06.14. Weborvos: A Parkinson-kór ellenszerét is keresik Szegeden • 2006. 06.15. Híradó.hu: Elkészült a Dél-Alföldi Neurobiológiai Tudásközpont új épülete • 2006. 06.15. Index.hu: Elkészült a Dél-Alföldi Neurobiológiai Tudásközpont új épülete • 2006. 06.15 Magyar Televízió Körzeti Stúdió 17 órás híradó második hír. Nyilatkozott: Prof. Szabó Gábor rektor és Prof. Telegdy Gyula konzorciumvezetõ (ismétlés: 2006. 06.16, reggel 6 óra) • 2006. 06.16.: Szeged Városi Televízió Híradó 18 és 23 órakor. Nyilatkozik: Prof. Szabó Gábor rektor és Prof. Telegdy Gyula konzorciumvezetõ, Dr. Botka László polgármester • 2006. szeptember 20. Rádió88: Alzheimer kongresszus Szegeden (hír) • 2006 szeptember. Klikk 14 oldal: A kutatás-fejlesztéstõl a piaci sikerekig • 2006. 10. 20. Magyar Televízió 1-es adó, reggel 6 órási hírek: NMR labor átadása • 2006. október 24. Szegedi Egyetem 4. oldal: A folyékony héliumtól az Alzheimer-kórig
46
ÖSSZEFOGLALÓ A 2006-OS GAZDÁLKODÁSRÓL
2005 (Ft.) Szegedi Tuidományegyetem NKTH Támogatás Önerõ
2006 (Ft.)
2005 (Ft.)
2006 (Ft.)
Kromat Kft. 280 990 000 0
396 907 000 0
NKTH Támogatás Önerõ
6 500 000 54 704 000
14 500 000 5 204 000
MTA - Szegedi Biológiai Kutatóközpont NKTH Támogatás Önerõ
42 893 000 0
65 551 000 0
Creative Labor Kft. NKTH Támogatás Önerõ
1 000 000 1 000 000
3 000 000 3 000 000
MTA - Támogatott Kutatóhelyek Irodája NKTH Támogatás Önerõ
15 942 000 0
24 363 000 0
NKTH Támogatás Önerõ
2 000 000 2 000 000
3 000 000 3 000 000
EGIS Gyógyszergyár NyRt. NKTH Támogatás Önerõ
0 49 000 000
0 53 000 000
Kation Europa Bt. NKTH Támogatás Önerõ
1 500 000 1 500 000
2 249 000 2 249 000
NKTH Támogatás Önerõ
2 160 000 2 000 000
4 000 000 4 000 000
NKTH Támogatás Önerõ
1 000 000 2 000 000
2 000 000 2 000 000
Diagnosticum ZRt NKTH Támogatás Önerõ
4 000 000 4 000 000
4 000 000 4 000 000
NKTH Támogatás Önerõ
1 000 000 1 000 000
2 000 000 2 000 000
Rytmion Kft.
SOLVO ZRt.
QualiCont Kht.
DABIC Kht.
Altémák költségvetése 2006-ban
Nagyobb mûszerberuházások listája idõrendben 2006-ban: Gyártó
Megnevezés
Bruttó érték
Genév Kft, Architekton Kft. Flextra-Lab Kft Bio-Science Kft Experimetria Kft Auro Science Kft Auroscience Kft
DNT Kutatóközpont és Inkubátorház (összesen) NMR berendezés (részösszeg) CO2 incubator Conductometer Mikroszkóp Vegyifülke
253 960 102 Ft. 25 000 000 Ft. 1 295 256 Ft. 1 561 920 Ft. 2 400 000 Ft. 1 320 000 Ft.
47
TELJESÍTMÉNYINDIKÁTOROK Termék: 4 Beküldött hazai szabadalom: 4 Beküldött nemzetközi szabadalom PCT: 1 Új szolgáltatás: 10 Új technológia: 5
MONITORING ÉRTÉKELÉSI RENDSZER Munkacsoportok értékelési rendszere Háromhavonta minden munkacsoport beszámol az operatív vezetõknek az elvégzett munkáról. Nem megfelelõ beszámoló esetén a DNT vezetése jogosult elõször utófinanszírozottá tenni a csoportot, újabb nem teljesítés esetén pedig kizárhatja a munkacsoportot. Altémák értékelési rendszere Minden altémavezetõ félévente beszámol az altémához tartozó munkacsoportok munkájáról. Az értékeléshez a következõ szempontrendszert alkalmazzuk: 1. Tudományos eredmények: A kutatócsoport annyi pontot kap, amennyi a DNT kutatási/fejlesztési témáiból írt cikkek impakt faktora. Kongresszusi elõadásokat, összefoglalókat nem számítjuk be. 2. Benyújtott szabadalmak: Minden egyes benyújtott szabadalomért 20 pontot kap a munkacsoport 3. Spin-off cégek alapítása: A kockázatvállalást jutalmazva minden spin-off cégbe való belépésért, amelyet a munkacsoport vagy valamelyik tagja alapít, 30 pont jár. 4. Részvétel EU-6 vagy EU-7 keretprogramban: Minden egyes sikeres EU-network pályázatért 30 pont jár. Ha a nyertes pályázat benyújtója és koordinátora a DNT adott munkacsoportja, akkor ezt 40 ponttal jutalmazzuk. A kapott pontszám alapján dönt az IT a projekt erdményességérõl és mérlegeli a támogatás folyamatosságát.
48
RÖVIDÍTÉSEK: ABC „ATP-Binding Casette" transzportfehérjék AL50 „Abszolut Letális 50%" dózis ÁOK Általános Orvostudományi Kar DABIC Dél-Alföldi Bio-Innovációs Centrum Kht. DNT Délalföldi Neurobiológiai Tudásközpont GGC Global Growth Companies GLP Good Laboratory Practice GYTK Gyógyszerésztudományi Kar IT Igazgató Tanács JGYTFK Juhász Gyula Tanárképzõ Fõiskolai Kar K+F Kutatás és Fejlesztés KKV Kis- és Középnagy Vállalat MTA Magyar Tudományos Akadémia MTA-SZBK Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központ MTA-TKI Magyar Tudományos Akadémia Támogatott Kutatóhelyek NKTH Nemzeti Kutatási és Technológiai Hivatal NO Nitrogén monoxid PCR Polinucleotid Chain Reaction SZBK Szegedi Biológiai Központ SZTE Szegedi Tudományegyetem TTK Természettudományi Kar
