DNS-helikáz domének táncrendje A kulcstól a bulldózerig: szárnyas hélix domének funkcionális plaszticitása
Kovács Mihály ELTE TTK Biológiai Intézet, Biokémiai Tanszék ELTE-MTA Lendület Motorenzimológiai Kutatócsoport
www.mk-lab.org
Motiváció Motorenzim-aktivitások szerepe a DNS-ben kódolt információ karbantartásában ATP-hidrolízis Helikáz enzimfunkciók sokasága transzlokáció szálszétválasztás szálillesztés nukleoprotein lebontás szálvándoroltatás
Komplex fehérje-architektúra
Helikáz architektúra Hexamer helikázok (Superfamily 3-6):
Egy RecA domén / monomer Oligomerizáció abszolút szükségszerű
hexamer helikáz
„Monomer” helikázok: (Superfamily 1-2)
Két RecA domén / monomer Oligomerizáció többletfunkciót hordozhat
PcrA (SF1 helikáz)
RecQ (SF2 helikáz)
Araszoló helikáz-működés
Ábra: Berg et al. alapján
RecQ család Archaea E. coli Élesztő
Humán
Szárnyas hélix (winged helix, WH) domén Szerkezeti konzervativitás - Funkcionális plaszticitás Szekvencia-specifikus dsDNS felismerés („kulcs”-funkció) Transzkripciós faktorok Szekvencia-aspecifikus dsDNS tolólapát („bulldózer”-funkció) DNS-helikázok Szálstruktúra-felismerés és specificitás? Fehérje-fehérje kölcsönhatások Interdomén és alegységek közötti
WH domén felépítés Helix-Turn-Helix H L H T H*
CarB (Transzkripciós faktor) Topoizomeráz I (katalitikus funkció)
*felismerő (recognition) hélix
WH domén H S H T H* S W1 S W2 β-szálak általában antiparalel W2 hiányozhat
H: helix S: strand L: loop T: turn W: wing (loop)
AGT (metilguanin-metiltranszferáz) GH5 (linker hiszton) RPA (ssDNS-kötő fehérje) Transzkripciós faktorok (HNF3-γ, E2F4-DP2, Rfx1, Cap/Crp, SmtB)
W2
H* HNF3-γ W1
Felismerő funkciójú DNS-kötési módozatok HNF3-γ típus Fő kölcsönhatás: H* - nagy árok
HNF-3γ
Minor kölcsönhatás: szárny-kis árok
Rfx1 típus Fő kölcsönhatás: szárny - nagy árok Minor kölcsönhatás: H* - kis árok Rfx1
WH szerepe RecQ-helikázokban: a kirajzolódó két csoport WH esszenciális
WH nem esszenciális
WRN, RecQ1: W1 „ék” funkció, terminális DNS-bázispár szétválasztása
Hel308: WH nem köti a DNS-t, hanem a RecA domént pozicionálja BLM: saját adatok
W1 mutációk hatására elvész a szálszétválasztó aktivitás
RecQ1
WRN
Hel308
WH konformáció-váltás RecQ helikázokban? E. coli RecQ (apo, AMPPNP)
WH domén
Humán RecQ1 (ADP, DNS)
BLM helikáz anatómiája N-terminális domén
Zn2+-kötő domén
WH domén
Teljes (FL) BLM (1417 aa) RecA domének
BLM 1005 BLM 1077 BLM 1290 (kontroll) Teljes (FL) E. coli RecQ
HRDC domén
BLM1005
ATPase activity (s-1)
40
30 20 10 0
Gyimesi et al (2012) Nucleic Acids Res - 1OYY_BLM_model.pdb
Csak a RecA-doméneket tartalmazza Nincs DNS-aktivált ATPáz aktivitása
BLM1077 RecA + ZnBD domének (nincs WH) DNS-aktivált ATPáz aktivitás, ssDNS transzlokáció, processzivitás megmarad
Transzlokációs sebesség (nt/s)
Kötőhely-méret (nt) Lépésnagyság (nt/ATP)
BLM1290
BLM1077
33 2
40 5
14
10
1.1 0.1
1.2 0.2
mol Pi / mol BLM
30 BLM1290
25 20
BLM1077
15 10 BLM.m13 ATP+HEP
5 0
0
2
4 Time (s)
6
8
BLM1077: dsDNS szálszétválasztás és D-hurok szétválasztás megmarad BLM1290
BLM1077
*
-
*
*
BLM1077
-
BLM1077
*
-
*
*
BLM1077
80 BLM1290
60 40 20 0
Disrupted D-loop (%)
Unwound strand (%)
100
100 80 60 40 20 0
0
200
400 600 [BLM] (nM)
800
1000
0
5
10 15 20 [BLM1077] (nM)
25
BLM1077 : Rad51 nukleoprotein lebontás megmarad
D-hurok szétválasztás detektálása DNS szubsztrátok és termékek, natív PAGE
D-hurok szétválasztás Single turnover kinetika FL BLM Koordinált szétválasztás
BLM1077
Koordinálatlan szétválasztás
Összegzés WH domén – Szerkezetileg konzervált, funkcionálisan plasztikus – DNS-kötésmódok változása, kulcs vs. tolólapát funkció (szekvencia vs. szálstruktúra-specificitás) WH domén RecQ helikázokban – Egyes enzimekben szükséges a szálszétválasztáshoz, másokban nem – Potenciális domén-mozgás felderítetlen (folyó munkák) – WH-mentes BLM helikáz: aktív motor, de bonyolultabb DNS-struktúrák koordinált átalakítására nem képes (folyó munkák) – Elágazó DNS-szálak felismerése?
Résztvevők, támogatók Nagy Nikolett
2005-
TDK, M.Sc., (Ph.D.)
Sarlós Kata
2006-
TDK, M.Sc., (Ph.D.)
Bibó András Dr. Jelinek Balázs Dr. Takács Balázs Sarankó Hajnalka Dr. Gyimesi Máté Harami Gábor Gervai Judit Molnár Eszter Kocsis Zsuzsa Szabó Judit Debasish Roy Ferenczi Veronika Krajcsi Anikó
2006-
(Ph.D.)
ELTE ELTE, NIH (USA), Univ. of Copenhagen BME
2006-2009
posztdoktor
ELTE
2006-2011
Ph.D.
ELTE
2007-2009
M.Sc.
ELTE
2007-2012
posztdoktor
ELTE, UC Davis (USA)
2008-
TDK, M.Sc., (Ph.D.)
ELTE
2009-
B.Sc., TDK, (M.Sc.)
ELTE
2009-
B.Sc., TDK, (M. Sc.)
ELTE
2009-
(Ph.D.)
ELTE
2009-2010
B.Sc.
ELTE
2011
M.Sc.
ELTE, VIT (India)
2011-
(Ph.D.)
ELTE
2011-
asszisztens
ELTE
Ricardo Pires, Módos Károly, Kellermayer Miklós (Semmelweis Egyetem) Mario Spirek, Lumir Krejci (Masaryk Univ., Brno, Csehország) Keir Neuman (NIH, Bethesda, MD, USA)
