Semmelweis Egyetem Doktori Iskola – Elméleti Orvostudományok Program: I/3. Ionizáló és nem ionizáló sugárzások biológiai hatásai
DNS alapú biológiai dozimetria kiterjesztése széles spektrumú UV hatásra
Készítette: dr. Hegedüs Márton
Témavezető: Programvezető:
Dr. Fekete Andrea, egyetemi docens Dr. Rontó Györgyi, professor emeritus
Hivatalos bírálók:
Dr. Sasvári Mária, egyetemi docens Dr. Török Szabina, tudományos főmunkatárs
Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Monos Emil, professor emeritus Dr. Csík Gabriella, egyetemi docens Dr. Török Szabina, tudományos főmunkatárs
Budapest 2006
1
Tartalomjegyzék 0. Rövidítések jegyzéke......................................................................................... 6 1. Bevezetés ............................................................................................................... 7 2. Irodalmi áttekintés ............................................................................................ 9 2.1. AZ ULTRAIBOLYA SUGÁRZÁS ................................................................. 9 2.1.1. Fizikai jellemzők ...................................................................................... 9 2.1.2. A spektrum felosztása............................................................................... 9 2.2. TERMÉSZETES ÉS MESTERSÉGES UV FORRÁSOK............................. 10 2.2.1. Napsugárzás............................................................................................ 10 2.2.2. Az ózon szerepe...................................................................................... 11 2.2.3. Az ózonlyuk............................................................................................ 12 2.2.4. Légköri tényezők hatása az UV dózisra ................................................. 13 2.2.5. Mesterséges UV források ....................................................................... 15 2.3. AZ UV SUGÁRZÁS BIOLÓGIAI HATÁSAI.............................................. 16 2.3.1. Az UV sugárzás és a földi élet kialakulása............................................. 16 2.3.2. Exobiológiai vonatkozások .................................................................... 18 2.3.3. A jelen ökoszisztémát érintő változások ................................................ 19 2.3.4. Az egészség és a napfény ....................................................................... 20 2.3.5. Immunszuppresszió ................................................................................ 21 2.3.6. Hóvakság, szürkehályog......................................................................... 23 2.3.7. Az UV sugárzás bőrre gyakorolt általános hatásai................................. 23 2.3.8. A bőrrákok epidemiológiája ................................................................... 25 2.3.9. A bőrrákok tumorbiológiája ................................................................... 27 2.4. MOLEKULÁRIS HATÁSOK, A DNS KÁROSODÁSA ............................. 29 2.4.1. Molekuláris fotobiológia ........................................................................ 29 2.4.2. Lipidek és fehérjék UV sérülései............................................................ 30 2.4.3. A fehérjék szerepe a DNS sérülésében................................................... 31 2.4.4. A DNS UV elnyelése.............................................................................. 32 2.4.5. A DNS gerjesztése.................................................................................. 34 2.4.6. Ciklobután-pirimidin-dimerek (CPD) .................................................... 36 2.4.7. Pirimidin-(6-4)-pirimidon fotoproduktumok (6-4 PD) .......................... 37 2.4.8. Pirimidinek egyéb sérülései.................................................................... 38 2.4.9. Oxidatív léziók ....................................................................................... 39 2.4.10. Lánctörések............................................................................................. 40 2.5. AZ UV SUGÁRZÁS DOZIMETRIÁJA........................................................ 41 2.5.1. Fizikai UV dózis..................................................................................... 41 2.5.2. A biológiai hatékonyság becslése........................................................... 43 2.5.3. Biológiai doziméterek............................................................................. 45 3. Célkitűzések ....................................................................................................... 46
2
4. Anyagok és módszerek................................................................................... 48 4.1. T7 BAKTERIOFÁG ...................................................................................... 48 4.1.1. A fágok tudományos jelentősége............................................................ 48 4.1.2. A fág életciklusa ..................................................................................... 49 4.1.3. A T7 fág tenyésztése............................................................................... 49 4.1.4. A T7 fág szerkezete ................................................................................ 50 4.1.5. „Fűtött fág” állapot ................................................................................ 51 4.1.6. T7 DNS................................................................................................... 52 4.1.7. T7 biológiai dózis és mérése .................................................................. 52 4.2. MINTAKÉSZÍTÉS......................................................................................... 53 4.2.1. Fág szuszpenzió...................................................................................... 53 4.2.2. DNS oldat ............................................................................................... 54 4.2.3. DNS és fág vékonyrétegek ..................................................................... 54 4.2.4. A DNS konformáció befolyásolása ........................................................ 56 4.3. A MINTÁK KEZELÉSE................................................................................ 57 4.3.1. Oldatok besugárzása ............................................................................... 57 4.3.2. Vékonyrétegek űrszimulációs kezelése .................................................. 58 4.4. A KIÉRTÉKELÉS MÓDSZEREI.................................................................. 60 4.4.1. Spektrofotometria ................................................................................... 60 4.4.2. Gélelektroforézis .................................................................................... 61 4.4.3. Specifikus enzimatikus emésztés............................................................ 63 4.4.4. DNS–fehérje keresztkötések meghatározása.......................................... 63 4.4.5. A DNS sérülése T7 fágok túlélése alapján ............................................. 64 4.5. POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ.................................................................... 65 4.5.1. A PCR működése ................................................................................... 65 4.5.2. A primerek.............................................................................................. 67 4.5.3. A QPCR paraméterei .............................................................................. 69 4.5.4. Kvantitatív kiértékelés............................................................................ 70
5. Eredmények ....................................................................................................... 71 5.1. POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ OPTIMALIZÁLÁSA................................ 71 5.1.1. A kiindulási DNS ................................................................................... 71 5.1.2. Az exponenciális amplifikáció tartománya ............................................ 72 5.1.3. DNS-koncentrációval arányos amplifikáció........................................... 73
3
5.2. UV DÓZIS HATÁSA A PCR TERMÉK MENNYISÉGÉRE ...................... 74 5.2.1. A cél fragmens szerepe........................................................................... 74 5.2.2. Öt különböző spektrumú UV sugárforrás hatása.................................... 77 5.3. A FÁG-FEHÉRJÉK JELENLÉTÉNEK HATÁSA ....................................... 78 5.3.1. T7 fág, „fűtött fág”, izolált DNS ............................................................ 78 5.3.2. UV fotosérülés különböző DNS konformációkban................................ 79 5.4. VÉKONYRÉTEGEK ÉS VÁKUUMKEZELÉS ........................................... 80 5.4.1. A fág és DNS vékonyrétegek szerkezete................................................ 80 5.4.2. Vákuum hatása a vékonyrétegekre ......................................................... 81 5.4.3. Hőmérséklet-ingadozás következményei ............................................... 83 5.5. VÉKONYRÉTEGEK ULTRAIBOLYA BESUGÁRZÁSA ......................... 84 5.5.1. UVC sugárzás hatása a vékonyrétegekre................................................ 84 5.5.2. A többszörös rétegek árnyékoló hatása .................................................. 87 5.5.3. Különböző fotoproduktumok keletkezése napszimulátor hatására ........ 88 5.5.4. Kombinált kezelések: vákuum és UV sugárzás együttes hatása ............ 89
6. Megbeszélés........................................................................................................ 91 6.1. T7 FÁG BIOLÓGIAI DOZIMÉTER KIÉRTÉKELÉSE............................... 91 6.1.1. PCR beállítása ........................................................................................ 91 6.1.2. T7 fág biológiai dózismérő hitelesítése .................................................. 92 6.1.3. A proteinek szenzibilizáló hatása ........................................................... 94 6.2. SZIMULÁLT VILÁGŰR HATÁSA ............................................................. 96 6.2.1. A minták minőségének ellenőrzése ........................................................ 96 6.2.2. A vákuum által okozott dehidráció......................................................... 98 6.2.3. Vákuum által okozott sérülések............................................................ 100 6.2.4. Az UVC fotoproduktumok DNS szerkezetét módosító hatása ............ 102 6.2.5. Telítődés az UVC sérülések mennyiségében........................................ 103 6.2.6. A rétegvastagság védő hatása ............................................................... 105 6.2.7. Különböző sérülés típusok megoszlása ................................................ 106 6.2.8. A vákuum és az UVC sugárzás szinergisztikus hatása......................... 108
7. Következtetések .............................................................................................. 110 8. Összefoglalás ................................................................................................... 117 9. Summary .......................................................................................................... 118
4
10.
Irodalomjegyzék ........................................................................................ 119
10.1.
FELHASZNÁLT IRODALOM ............................................................... 119
10.2.
FELHASZNÁLT INTERNETES FORRÁSOK ...................................... 132
11.
Saját publikációk jegyzéke ..................................................................... 133
11.1.
CIKKEK ................................................................................................... 133
11.2.
ELŐADÁSOK ÉS POSZTEREK ............................................................ 134
11.3.
ISMERETTERJESZTŐ TEVÉKENYSÉG.............................................. 137
12.
Köszönetnyilvánítás .................................................................................. 138
5
0. Rövidítések jegyzéke Az értekezésben többször előforduló rövidítések és magyarázatuk: 6-4 PD A AP bp BED C CFC CPD DLR DNS dNTP DU EDTA ESA EVT G HT7 ISS MED m / RNS NASA NMSC OD PUVA Q / PCR r.h. RPM SDS T UV UVA UVB UVC
6-4 fotodimer adenin apurinezett/apirimidinezett lézió bázispár biologically effective dose citozin klór-fluoro-karbon ciklobután-pirimidin-dimer Deutsches Zentrum für Luft- und Raumfahrt dezoxiribonukleinsav dezoxinukleozid-trifoszfát Dobson unit etilén-diamin-tetra-acetát European Space Agency Experiment Verification Test guanin T7 egyenérték dózis International Space Station minimal erythema dose messenger / ribo-nukleinsav National Astronautics and Space Administration non-melanoma skin cancer optikai denzitás pszoralén + UVA quantitative / polymerase chain reaction relative humidity rotation per minute sodium-dodecyl-sulfate timin ultraibolya 315–400 nm 280–315 nm 100–280 nm
6
1. Bevezetés
Az élőlényeket érő ultraibolya sugárzás legfontosabb forrása a Nap. Az ózonréteg vékonyodása, a napozási szokások változása és a mesterséges források elterjedése (pl.: szolárium, ipari és orvosi célú alkalmazások) miatt az emberi szervezetet érő ultraibolya sugárterhelés összességében növekszik. Emellett olyan nagy energiájú, az UV tartományba eső sugárzás hatásaival is fokozottan számolnunk kell, ami a légkör szűrő hatása miatt korábban nem képezte részét az élőlények természetes környezetének, és amely biológiai szempontból más hullámhosszaknál veszélyesebb. A változó UV sugárzás élővilágra kifejtett hatásainak felmérése és előrejelzése bonyolult feladat, ami biológiai doziméterek használatát teszi szükségessé. Az élő szervezetek sugárkárosodásában a fehérjékkel kölcsönhatásban álló nukleinsav kitüntetett szerepet játszik. A biológiai hatások közé tartozik többek között a sejthalál és a bőrrákok kialakulásában szerepet játszó mutációk megjelenése. Az ultraibolya sugárzás következményeinek jelentős része az örökítőanyagban kialakuló változatos sérülésekre vezethető vissza, ezért célszerű magát a DNS-t használni biológiai doziméterként. A DNS sérülések tanulmányozásához a T7 bakteriofág ideális modell rendszer, mert a fág izolált DNS-e mellett a kromoszóma modelljének tekintett intakt fágban a fehérjékkel való kölcsönhatás következményei is vizsgálhatóak. A T7 bakteriofág szerkezete ismert, laboratóriumi felhasználásának módszerei letisztultak és a Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézetében több évtizedes tapasztalat áll rendelkezésre a fágok felhasználásával kapcsolatban. A molekuláris biológiai technikák fejlődésével a DNS UV fotosérüléseinek detektálásában emellett új utak is megnyíltak. Ezért a jelen dolgozat témája a DNS alapú biológiai dozimetria kiterjesztése széles spektrumú UV hatásra T7 bakteriofág és molekuláris biológiai technikák felhasználásával.
7
Munkám természetéből következik, hogy az részben új módszerek kifejlesztésére, megbízhatóságuk ellenőrzésére, részben ezek gyakorlati felhasználására irányult. Kísérleteim során a kvantitatív polimeráz láncreakció segítségével meghatározott DNS sérülések és a biológiai dózis között kerestem kapcsolatot. Vizsgálataimat kiterjesztettem a széles biológiailag releváns dózistartományra, és egyes, az UV sérülések kialakulását befolyásoló tényezők hatásainak elemzésére. A DNS és egyszerűbb mikroorganizmusok világűrbeli sorsa fontos kérdés az élet kialakulásával és bolygók közti átvitelének lehetőségével kapcsolatban. Az élet szempontjából a világűrben uralkodó vákuum és a nagy energiájú UV sugárzás a legfontosabb limitáló tényezők, amik hozzátartoznak a Nemzetközi Űrállomásra küldendő fág és DNS vékonyrétegek űrszimulációs kezeléséhez is. A DNS sérülések detektálására szolgáló új eljárást – más módszerekkel kiegészítve – a gyakorlatban alkalmaztam a szimulált világűrbeli körülmények vékonyrétegekre kifejtett hatásainak tanulmányozásában.
8
2. Irodalmi áttekintés 2.1. AZ ULTRAIBOLYA SUGÁRZÁS 2.1.1. Fizikai jellemzők „Kezdetkor teremtette Isten az eget és a földet. ... és Isten szólt: „Legyen világosság”, és világos lett” (Genesis I, 1.1.). A Teremtés első mozzanatai között szükség volt a fényre, hiszen a földi élet a Nap nélkül elképzelhetetlen. A fény fizikailag elektromágneses sugárzás, a terjedési irányra és egymásra merőlegesen, szinkron oszcilláló elektromos és mágneses erőtér. Az energia adott mennyiségeit fotonokba csomagolva közvetíti. A fény természetének megértését sokáig nehezítette a fotonok kettős viselkedése. Az általuk szállított energiával fordítottan arányos, rövidebb hullámhosszakon a részecskékre jellemző tulajdonságokat mutatják, míg
az
alacsonyabb
frekvenciájú
sugárzás
hullámtermészettel
rendelkezik
(Rontó és Tarján 1997). E = h ν = h (c/λ), ahol: h : 6,626 · 10-34 Js, Planck-állandó; ν : frekvencia [Hz]; c : fénysebesség [m/s]; λ : hullámhossz [m]. 2.1.2. A spektrum felosztása Az optikai tartományt az elektromágneses spektrum 100 nm és 1 mm közé eső szakasza jelenti. Ide tartozik a nagyobb energiájú ultraibolya (UV), a 400–800 nm-es látható fény (VIS) és az infravörös (IR) sugárzás, ahogy azt az 1. ábra mutatja. Az élőlények megtanulták hasznosítani a Napból érkező energiát. A hősugárzásnak szerepe van az éghajlat meghatározásában. Az energia legnagyobb részét közvetítő látható fényt használják a növények a fotoszintézishez, ebben a hullámhossz-tartományban szemünk csapjai és pálcikái a frekvenciakülönbségeket színbeli eltérésként érzékelik. Egyes
9
állatok (pl.: méhek) a közeli ultraibolya tartományban is látnak, az embereknek azonban erre nincsen érzékszervük (Nilsson 1996). Az UV sugárzás káros hatásai ellen ezért csak akkor tudunk védekezni, ha a minket érő dózist méréssel meg tudjuk határozni.
1. ábra. Az elektromágneses spektrum tartományai (Nilsson 1996 nyomán)
2.2. TERMÉSZETES ÉS MESTERSÉGES UV FORRÁSOK 2.2.1. Napsugárzás A Wien-féle eltolódási törvény (λmax T = Wien-állandó) értelmében magasabb hőmérsékletű testek emissziós színképe a nagyobb energiák felé tolódik. Életünkben a legjelentősebb feketetest sugárzó 6000 K körüli felszíni hőmérsékletével a Nap. Ezen a hőmérsékleten már jelentős ultraibolya kisugárzással is számolni kell. Távoli galaxisok megfigyelésénél ezért a csillagászok UV felvételeket is készítenek. A Föld légkörének határára érkező teljes energiát a szolár konstans adja meg, átlagos értéke 1,37 kW/m2. A napfénynek mintegy 7%-a esik az ultraibolya tartományba (Nicholson és mtsai 2005), ennek azonban csak töredéke éri el a Föld felszínét. Az atmoszférában való elnyelődés szerint a nagy energiájú optikai sugárzás további felosztása lehetséges hullámhossza alapján. A 100 és 280 nm közötti UVC-t a légkör nitrogén és oxigén molekulái teljes mértékben elnyelik és szétszórják. A
10
280–315 nm-es UVB jelentős részét az UVC által generált ózon hivatott elnyelni. Az ennél nagyobb hullámhosszú UVA a látható fényhez hasonlóan gyakorlatilag akadály nélkül jut le a felszínre. 2.2.2. Az ózon szerepe A légkör molekuláinak a sugárzással való kölcsönhatása nem csak szűrőként fontos. 240 nm-nél rövidebb hullámhosszú fotonoknak oxigénnel való ütközésekor a molekula atomjaira hasad. A kialakuló, páratlan elektronnal rendelkező gyökök igen reakcióképesek és a kétatomos oxigénhez kapcsolódva exotherm folyamat során ózon (O3) alakul ki. A keletkezés helye szerint így jött létre a sztratoszférában, a Föld felszíne felett mintegy 25–40 km-rel az ózonréteg. Mára az ózon mennyisége átlagosan 0,5 pars pro million (ppm), a felszíni nyomáson mintegy 3 mm vastag réteget alkotna, ezt tekintik 300 Dobson-egységnek (DU). Az ózon kötései a 320 nm körüli fotonok energiáját elnyelve felszakadnak és a molekula kiindulási elemeire bomlik, ahogy az a 2. ábrán látható. Az ózonréteg magasságában a felszabaduló hőnek megfelelően ezért a sztratoszféra környező rétegeihez képest magasabb hőmérséklet uralkodik. Az O3 bomlása oxigén, hidrogén, nitrogén és klór szabad gyökök által közvetített láncreakcióban is létrejöhet. Az 1995-ös kémiai Nobel-díjat a nitrogén-oxidok és a klór-fluoro-karbonok (CFC) e folyamatban játszott szerepének tisztázásáért ítélték oda P.J. Crutzennek és munkatársainak.
2. ábra. Az UV sugárzás útja a Föld felszínére (Nilsson 1996 nyomán): Az oszlopok a Föld felszínét elérő sugárzás relatív intenzitását érzékeltetik
11
2.2.3. Az ózonlyuk A Nap által kibocsátott spektrum emberöltőnyi léptéken mérve nem változik. A felszínt elérő dózist meghatározó ózon megoszlásáért, keletkezéséért és bomlásáért felelős folyamatok azonban érzékeny egyensúly elemei. Az
1970-es
évek
óta
nem fér
kétség a
sztratoszféra
ózonrétegének
vékonyodásához. A jelenséget rövid távon és helyileg elősegítik természetes éghajlati változások és vulkánkitörések is (pl.: Mount Pinatubo, 1992) (Madronich és mtsai 1998), de a globális folyamatokra ezek nem adnak magyarázatot. Mára a magas légkörben közvetlenül kimutatott köztitermékek alapján bebizonyosodott a mesterséges kibocsátásból származó anyagok elsődleges szerepe. A többek között hűtőgépekben és dezodorok hajtógázaként használt klór-fluoro-karbonok (CFC), a tűzoltásban fontos halonok és a bromidok a magas légkörben UVC sugárzás hatására olyan aktivációs reakción eshetnek át, aminek termékei katalizálják az ózon bomlását eredményező láncreakciót. A vegyületek egy része hosszú életidejű, több mint 100 évig maradhat a légkörben. Az UV sugárzás hatására a CFC-ről leszakadó klór gyök megtámadja az O3-t és az abból lehasított egyik atommal a 3. ábrán mutatott módon kötésre lép. A klór-monoxiddal szabad oxigén reagál és O2 keletkezik. A folyamatot elindító klór változatlanul visszamarad, és újabb reakciót kezdeményez (Nilsson 1996).
3. ábra. Az ózon bomlása klór gyök katalizátorral (Nilsson 1996 nyomán)
Az ózonréteg vastagságát a Föld felszínéről Dobson-spektrofotométerekkel, magas légköri ballonos mérésekkel és a Total Ozone Mapping Spectroradiometer (TOMS) segítségével, műholdról folyamatosan követik. A vékonyodás évszaktól és földrajzi szélességtől való függést mutat. A legnépesebb mérsékelt égövben
12
évtizedenkénti 5%-os, gyorsuló tendenciájú fogyást mutattak ki. A trópusokat a jelenség alig érinti. Az Antarktisz, Új-Zéland és Ausztrália térségében azonban 20%-os kumulatív vékonyodás lépett fel. Ha az ózonréteg vastagsága 100 Dobson-egység alá csökken, ózonlyuk alakul ki. A magyarázat egy egyedülálló meteorológiai jelenségben rejlik. A telente kialakuló sarki légörvény elszigeteli az Antarktisz légterét. A sötétségben lehűlő levegőben jégkristályok csapódnak ki. Ezek felszíne felfogja a tavasz első napsugarait, így a gyöngyházfelhőkben fokozott a jégkristályokra adszorbeálódott CFC-k UVC okozta aktivációja. A légörvény felszakadásával a hőmérséklet emelkedik és a keletkezett ózonszegény levegő észak felé sodródik. Az ózonlyuk középpontjában a tél végén 75%-os hiány jön létre. 1995-ben európányi terület felett gyakorlatilag megszűnt a védő réteg (4. ábra). Az Arktiszon eddig ez a jelenség nem öltött ilyen mértéket, mert a levegő – környezetével keveredve – nem hűl le eléggé (Nilsson 1996).
4. ábra. Az Antarktisz feletti ózonlyuk alakulása 1979-től 1999-ig (NASA–TOMS): Megfigyelhető a sötétkék színkóddal jelölt ózonlyuk (<100 DU) növekedése
2.2.4. Légköri tényezők hatása az UV dózisra A fény és az ózon kölcsönhatásairól megfelelő mennyiségű ismeret áll rendelkezésünkre, de az ultraibolya sugárzás szempontjából a légkör egyéb adottságai sem elhanyagolhatóak. Fontos például az átszelendő légréteg vastagsága és összetétele. Az élővilágot érő UV sugárterhelés meghatározása ezért nem egyszerű és sok egymással kölcsönhatásban lévő tényező figyelembe vételét igényli.
13
A felhők vízcseppeket, jégkristályokat, részben ipari eredetű port és – többek között égés nyomán keletkező – kénsav-aeroszolt tartalmazhatnak. A fedettség vastagságát, optikai tulajdonságait, térbeli és időbeli megoszlását is figyelembe kell venni az UV-protektív hatás becsléséhez, ami igen jelentős is lehet (Bornman és van der Leun 1998). Ráadásul az emberi tevékenység nyomán a levegőbe kerülő aeroszolok és a troposzférikus ózon szintjében is erős ingadozások mutatkoznak. A gázmolekulák és részecskék hosszabb úton többet nyelnek el az egyes fotonokból. Következésképpen délben fokozott a nagy energiájú sugárzás. Nyáron a napi UVB dózis 75%-a reggel 9 és délután 3 óra között érkezik a Földre, a leégésnek ekkor legnagyobb a veszélye (Nilsson 1996). A jelenség szerepet játszik a dózis földrajzi szélességtől való függésében is. Ugyanakkor az Egyenlítőtől távolodva a napsugárzás beesési szöge egyre jelentősebb évszaki ingadozást mutat, a sarkokon szélsőséges viszonyokkal. Ez azonos intenzitás mellett a felszíni fluxus csökkenésében jelentkezik. A nyári napforduló tájékán így nem csak a nappalok hossza miatt könnyű barnulni, hanem azért is, mert a Nap magasan áll a horizont felett. A fényszórás a rövidebb hullámhosszú komponenseket érinti elsősorban, ami a felszínt érő UV spektrum minőségét is befolyásolja és azt az egyenlítő környékén a veszélyes, nagyobb energiájú tartomány felé tolja (Bérces és mtsai 1999). A tengerszint feletti magasság sem elhanyagolható tényező. Ha a hegycsúcsok kiemelkedését az atmoszféra teljes vastagságához viszonyítjuk, az arány csekélynek tűnhet,
de
számításba
kell
venni,
hogy
a
gravitációnak
és
a
gázok
összenyomhatóságának köszönhetően a légkör anyagának túlnyomó része az alsó 10 km-ben összpontosul. 300 méter emelkedés 4%-kal fokozza a napsugárzás leégést kiváltó hatását (Nilsson 1996). Egyes felületek, mint a hó, a víz, a homok ráadásul a sugárzás jelentős részét visszaverik, albedojuk közel 1 (Bornman és van der Leun 1998). A napozási szokások változását a sugárzás–légkör kölcsönhatás figyelembe vételével értékelve összességében egyre nagyobb dózisú és egyre rövidebb hullámhosszú UV sugárzás elszenvedésével lehet számolni.
14
2.2.5. Mesterséges UV források Ma
használt
mesterséges
fényforrásaink
egy
része
nemkívánatos
melléktermékként a látható mellett az UV tartományban is emittál. A fénycsövek mellett ilyenek a magas üzemi hőmérsékleten működő és ezért UV-ben is sugárzó kvarc-halogén izzók. Ez a dózis azonban a Nap fényéhez képest elhanyagolható. Kivételt egyes speciális alkalmazási területek képeznek, amiknek az elszenvedett UV dózis és a szükséges védekezés (pl.: hegesztő pajzs) szempontjából nagy jelentősége lehet. Széles körben elterjedt az UV fény alkalmazása az egészségügyben és a kozmetikai iparban. A szoláriumok kvarclámpáiban az UVA tartomány barnító hatását igyekeznek kihasználni. A bőrgyógyászatban használt PUVA kezelés során az UVA hatását fényérzékenyítő 8-metoxi-pszoralénnel potencírozzák. UVC-t kibocsátó germicid lámpákkal légterek és felületek csíramentesítése érhető el. Ez a hatás ívóvíz és szennyvíz tisztítására és élelmiszerek tartósítására is felhasználható. Egyes ragasztóanyagok polimerizációjának gyorsítására UV fényt használnak az ipar számos területén, a fogászatban, az ortopéd sebészetben, de még lovak patkolásánál is. A hegesztés során keletkező ívfény UVC-t is tartalmaz. Egyes nyomdai, lakkozó és gyorsszárító eljárások során szintén ultraibolya sugarakat használnak (Tenkate 1999). Széleskörűen elterjedt az ultraibolya sugárzás által keltett fluoreszcencia felhasználása. Biológiai minták szerves molekulái és egyes kristályok is mutathatják a jelenséget, így vér, vizelet nyomok és ásványok azonosíthatók. Láthatatlan festékekkel bankjegyek, műtárgyak jelölhetők meg. Terjedőben van az UV keltette fluoreszcencia szórakoztató ipari és művészeti felhasználása is, ami a szórakozóhelyek „fekete fényétől” a fluoreszkáló festékkel készített festményekig és látvány elemekig terjed. A mindennapi élet során ezért nem csak a napozási szokások változása és az ózonréteg vékonyodása, hanem a mesterséges források miatt is egyre többet találkozunk az ultraibolya sugárzással.
15
2.3. AZ UV SUGÁRZÁS BIOLÓGIAI HATÁSAI 2.3.1. Az UV sugárzás és a földi élet kialakulása Az UV sugárzás Janus-arcú jelenség. A sejtek örökítőanyagát roncsolja, így nem csoda, hogy az élet a részleges védelmet jelentő tengerekben fejlődött ki. Az ózonréteg megjelenését 2 milliárd évvel ezelőttre teszik, amikor a kékeszöld algák által termelt oxigén megfelelő szintet ért el. Feltételezhető, hogy az élet kialakulásának idején még számottevő UVB sugárzás érte a Föld felszínét. A biomolekulákban elnyelődő fotonoknak szerepe lehetett az élet kialakulásában és a korai evolúcióban. A vékonyodó ózonréteg alatt napjainkban ismét előtérbe kerül az UVB sugárzás immunszuppressziót, szürkehályogot, leégést és bőrrákot okozó hatása. Máig sem tisztázott kérdés, hogy hogyan kerültek az első biomolekulák a Földre. Ígéretes elképzelések szerint külső forrás is feltételezhető. A híres Miller-Urey kísérlet óta több sikeres próbálkozás történt szerves vegyületek, cukrok, amino- és nukleinsavak „őslevesből” történő előállítására. A kiindulási anyagok, H2O, CO, CO2, CH3OH, NH3 és szükséges energiaforrásként az elektromágneses sugárzás a bolygóközi térben megtalálhatóak (Munoz Caro és mtsai 2002). A mai tudományos vélemény szerint a fiatal Földön a légköri körülmények nem igazán kedveztek a szerves molekulák véletlenszerű szintézisének (Chyba 2005). A bolygóközi tér anyagát besűrítő porszemcsék, meteoritok és üstökösök azonban lehetséges helyszínei ilyen reakcióknak. A bolygóközi tér szerves anyagának egy része ma is eljut a Föld felszínére. A meteoritok egyik fajtájának, a szenes kondritok anyagának akár 5 súlyszázalékát is szerves vegyületek teszik ki. A Murchison meteoritból nukleinsav-analógokat, aminosavakat és cukrokat tudtak izolálni (Cooper és mtsai 2001, Epstein és mtsai 1987, Stoks és Schwartz 1982). A 4,5–3,8 milliárd évvel ezelőtt zajlott késői erős meteorit bombázás idején a jóval sűrűbb légkör (10 bar CO2) erősen lefékezte a belépő meteoritokat. 10 km/sec becsapódási sebesség alatt a szerves vegyületek sem szenvedtek teljes hőbomlást (Chyba és mtsai 1990). Az Antarktisz jegéből izolált 50– 100 µm átmérőjű mikrometeoritok jelentős tömeget képviselnek, nagy részük erősebb felhevülés nélkül érte el a Föld felszínét. A késői erős bombázás időszakában, ami
16
egybeesik az élet kialakulásának feltételezett időpontjával, így 106–107 kg/év szerves anyag érkezett a bolygóközi térből a Földre, ami bőven fedezhette a mai 1014 kg-os biomassza széntartalmát (Clancy és mtsai 2005). A Földre való megérkezés előtt a szerves anyagot a világűrben folyamatos ultraibolya sugárzás és vákuum hatás érte. A világűrbeli paraméterek biológiai mintákra kifejtett hatását számos tudományos kísérletben vizsgálták. Baktérium spórákkal folytatott kísérletek szerint a spórák egy része képes ellenállni a világűrben uralkodó szélsőséges körülményeknek (Rettberg és mtsai 2002). Az információt tároló DNS és RNS makromolekulák is elég stabilak, ha por vagy agyag szemcsékhez adszorbeálódva bizonyos védelmet kapnak (Scappini és mtsai 2004). A pánspermia elmélet az élet bolygók közti átvitelének lehetőségével foglalkozik. A meteorit becsapódások által a felszínből kilökött porszemcsék és kőzetdarabok más égitestekre is eljuthatnak. Modellszámítások alapján 109 nagyságrendbe teszik az elmúlt 4 milliárd év alatt a Marsról a Földre érkezett meteoritok számát (Mileikowsky és mtsai 2000). Ezeknek felszínén és repedéseiben a mikroorganizmusok kis százaléka képes lehet túlélni a kilőkődés, az utazás és a becsapódás viszontagságait. Az út során az élet szempontjából az egyik legkritikusabb tényező a világűrben uralkodó nagy energiájú UV sugárzás és az extrém vákuum (Horneck és Baumstark-Khan 2001). A világűrben a Nap UV sugárzása mellett a Napból származó részecske sugárzással is számolni kell. A napszél és a napkitörések anyaga 90–95%-ban protonokból, 5–10%-ban α-részecskékből és viszonylag kevés nehéz ionból áll. A Naprendszert elérő galaktikus kozmikus sugárzás protonokat (85%), elektronokat, αrészecskéket (14%) és 1% körüli arányban nehéz ionokat, ún. HZE – nagy (High) töltésű (Z>2) és energiájú (E) – részecskéket tartalmaz (Horneck 1998). Biológiai szempontból a HZE részecskék a legveszélyesebbek. Az elnyelő anyagban (kőzetdarabban) másodlagos sugárzást keltenek, ezért az általuk leadott energia nem a felszínen a legnagyobb, hanem hozzávetőleg 10 cm-es mélységben (Mileikowsky és mtsai 2000). A HZE részecskék fluxusa viszonylag alacsony (a kozmikus sugárzás ≈1%-át adják) és a Bacillus subtilis spórákkal folytatott kísérletekben elsősorban azokat a spórákat inaktiválták, amik az útjukba estek (vagy 0,2 µm távolságon belül voltak), de még a telibe talált spórák 27%-a is életképes maradt
17
(Horneck és mtsai 2001a). A számítások szerint olyan apró célpontok, mint a spórák (0,2 µm2) vagy bakteriofágok (0,004 µm2) sok egyedet tartalmazó populációiban több százezer év után is számottevő lehet a túlélők száma (Horneck 1998). Az élet a világűrön keresztül el is hagyhatja a Földet. Régóta ismert, hogy az űrjárművek nem sterilezhetők tökéletesen. Mikroorganizmusok millióit viszik magukkal a világűrbe és arra az égitestre, ahova leszállnak. Korábban feltételezték, hogy a világűr extrém körülményeit a potyautasok úgysem képesek túlélni. Alaposabb vizsgálat azonban rámutatott, hogy különösen a járművek rejtett zugaiban van esély biomolekulák ilyetén átvitelére (Nicholson és mtsai 2005). A kontamináció értékelhetetlenné teszi az élet nyomai után való kutatást. Ezért felvetődött a Marson nemzeti parkokhoz hasonló bolygóvédelmi övezetek kijelölése (Horneck és Cockell 2004). 2.3.2. Exobiológiai vonatkozások Az exobiológia az élet Földön kívüli lehetőségével foglalkozó tudományág. Közvetlen bizonyítékokra mind a mai napig nem támaszkodhat. Lehetőség nyílik viszont az élet világűrbeli sorsának tanulmányozására, az ehhez kapcsolódó elméletek mérésekkel történő alátámasztására. Az űrkutatás más területeihez hasonlóan az itt született eredmények nem csak elméleti jelentőséggel bírnak, hanem fontos következményekkel számolhatunk a földi élet sorsára vonatkozóan is. Ilyen jellegű kísérletekre a múltban többször sor került (pl.: Biopan, Perseus, LDEF – Long Duration Exposure Facility). A legújabb lehetőséget a Nemzetközi Űrállomás (International Space Station – ISS) jelenti. Az ISS felépítése 1998-ban kezdődött, elkészültével a legnagyobb űrbeli létesítménynek fog számítani. A 45 tonnás építmény 350–400 km magasságban, 90 perc alatt kerüli meg a Földet. 6 laboratóriumában 6–7 asztronauta állandó munkáját tervezik. Az Európai Űrügynökség (ESA) kifejlesztett egy asztrobiológiai kísérletek végzésére alkalmas berendezést, amit az űrállomás tartószerkezetére fognak rögzíteni. Az EXPOSE egység fő célja az űrbeli körülményeknek a mikroorganizmusokra és a biológiailag fontos makromolekulákra kifejtett hatásainak vizsgálata. A berendezés fedélzetére tervezett kísérletek segítségével további értékes adatokhoz juthatunk az örökítőanyag világűrbeli sorsát illetőleg (5. ábra).
18
5. ábra. A Nemzetközi Űrállomás és az EXPOSE egység (NASA–ESA)
Az ESA által támogatott első 8 exobiológiai kísérlet közül 6 a ROSE (Response of Organisms to the Space Environment) nemzetközi konzorcium tudományos kísérlete. Ezek egyike a magyar PUR (Phage and Uracil Response), melynek célja az űrbeli körülmények hatásainak vizsgálata nukleinsavakon és modelljeiken. Az adatok kiértékelése közelebb vihet számos alapvető kérdés megválaszolásához: – Lehetséges-e biológiailag releváns molekulák, vagy ezek darabjainak átvitele a világűrben egyik égitestről a másikra – esetleg meteoritokhoz kötődően? – Miként alakulhatott ki az élet a maitól eltérő összetételű ősi légkörben? – Fennmaradhat-e az élet akkor, ha az ózonpajzs tovább vékonyodik? 2.3.3. A jelen ökoszisztémát érintő változások A felszínt érő UV sugárzás nem csak az élet múltja és jövője szempontjából érdekes, hanem jelenét is befolyásolja. Az ózonréteg vékonyodása által okozott változások már ma is komoly hatással vannak a földi ökoszisztémára. Az élelmezési szempontból fontos gabona, kukorica terméshozamát az UVB terhelés csökkenti, jóllehet a jelenség csak igen súlyos ózon fogyásnál válna számottevővé. A besugárzás növekedésével a növények beporzási időszaka korábbra tolódik, az ezt végző ízeltlábúak fejlődési ciklusa azonban csak hosszabb idő alatt tud alkalmazkodni a megváltozott körülményekhez. A házi- és haszonállatoknál azonban már most leírták a szürkehályog és a szőrtelen testtájak daganatainak gyakoribb megjelenését, ami gazdasági károkat okoz. Elsősorban egyes fejlődő országokban a
19
tenger az élelem fő forrása. Az ultraibolya sugárzás megtizedelheti a tápláléklánc alapját képező planktonok állományát. Másfelől a csekély alkalmazkodó képesség miatt a tengeri állatok ikráinak és lárváinak jelentős részét is elpusztítja (Nilsson 1996), így éppen a legszegényebb területek juthatnak a nyugat CFC-kibocsátása miatt az éhínség szélére. Az
ipari
méretű
égetés
nyomán
felszaporodó
szén-dioxid
felelős
az
üvegházhatásért. Az UVB sugárzás emelkedésével az erdők biomasszája megcsappan, és a tengeri algák fotoszintézise is jelentősen csökken, így a szárazföldi és a vízi élővilág is kevesebb CO2-t tud megkötni. Az óceánok vizében felhalmozódó humuszsavak vagy a fában lévő lignin kevéssé vesznek részt a biológiai körforgásban. UV sugárzás hatására azonban bomlanak, a termékekből pedig a mikroorganizmusok már fel tudják szabadítani a szén-dioxidot (Nilsson 1996). Az ózon fogyatkozásának következményeit tehát nem elég a humán populáció szintjén és más jelenségektől (pl.: az üvegházhatástól) izoláltan felgöngyölíteni, hiszen a bolygó valamennyi élőlénye egymásra van utalva. 2.3.4. Az egészség és a napfény Az élet ma ismert formáinak többségét a napfény tartja fenn. Az ember létezéséhez szükséges éghajlat kialakításán kívül fontos, hogy a táplálék fotoszintézis útján keletkezik. Látásunk a földfelszínt legnagyobb mértékben elérő hullámhosszakra (400–800 nm) érzékeny csapokra és pálcikákra épül. A 7-dehidrokoleszterin B-gyűrűje a bőrben UV sugárzás hatására hasad, a keletkezett kolekalciferolból két további hidroxilációs lépés nyomán keletkezik a kalcium- és foszfor-anyagcserét irányító D-vitamin, aminek újabban rákellenes hatását is feltételezik (Ainsleigh 1993). Az UV sugárzás féken tartja a bőrfelületen és a környezetben élősködő mikroorganizmusokat (nyáron kevesebb az acne). A fény gyógyító hatását a dán Finsen felismerése óta a fototerápiában is alkalmazzák (Roelandts 2002). Az alvás-ébrenlét és a szteroid hormonok cirkadián ritmusa a napszakok váltakozásához kötött (Fonyó 1999). A téli depressziókért részben a napfény hiányát teszik felelőssé. A napfényre tehát előnyös hatásai miatt mindenképpen szükségünk van. Az 1. táblázat emellett azonban összefoglalja azokat a káros hatásokat is, amelyekkel az ultraibolya sugárzás kapcsán számolnunk kell.
20
1. táblázat. Az ultraibolya sugárzás hatásai egészségünkre
Előnyös hatások:
Káros hatások:
Molekuláris hatások:
D-vitamin szintézis
immunszuppresszió
oxidatív stressz
csíraszám csökkentés
hóvakság, cataracta
fehérje/lipid peroxidáció
fototerápia
leégés, bőrrákok
DNS károsodás
2.3.5. Immunszuppresszió Az immunrendszer UV okozta károsodása bőrtípustól függetlenül lép fel. Az addig sajátként felismert sejtfelszíni molekulák besugárzást követő megváltozása, a sejtek fotolízisével felszabaduló, addig elzárt antigének (pl.: DNS, hisztonok) és a membrán bomlásakor keletkező arachidonsav metabolit prosztaglandinok gyulladásos választ
(napallergia,
fotodermatitis)
indítanak
meg.
A
leégést
követő
immunszuppresszió feladata ennek kivédése lehet. A sugárzás elsődleges célpontja az epidermisben elhelyezkedő, vagy azon átvándorló antigént prezentáló Langerhans-sejt. Feladata a szervezet első védelmi vonalán áttört ágensek felkutatása és bemutatása a nyirokcsomókban. UV sugárzás hatására a sejtek eltűnnek a bőrből és dendritikus morfológiájuk is megváltozik. A jellegzetességüknek számító MHC-II, ICAM és ATP-áz expressziója csökken. Helyüket mononukleáris makrofágok veszik át (Vink és Roza 2001). Az urokaninsav izomerizációja és a DNS károsodása folytán megváltozhat a gyulladásban szereplő gének expressziója. A besugárzás hatásait utánozni képes radiomimetikum a stratum corneumban a hisztidin deaminációjával keletkezett izomerből UV sugárzás hatására kialakuló cisz-urokaninsav, ami TNF-α-t szabadít fel (Nilsson 1996). Végeredményképpen a drenáló nyirokcsomókban a T-sejtek aktiválódása zavart szenved, az antigén prezentáció kisiklik a T-szuppresszorok (Th2) felé, ahogy azt a 6. ábra is mutatja. A T-helper (Th1) sejtek működését a besugárzás hatására felszabaduló TNF-α és IL-10 gátolja. Mindkét sejttípus a másik funkcióját gátló cytokineket is termel (Th1: IL-12→ Th2↓, Th2: IL-10→ Th1↓). A celluláris immunválasz gyengül, a humorális immunválasz túlsúlyra jut, idegen anyagokkal szemben nő a tolerancia, amit a kontakt hyperszenzitivitás csökkenése jelez (Grossman és Leffell 1997).
21
6. ábra. Az immunválasz módosulása UV besugárzás hatására (Grossman és Leffell 1997 nyomán): Az áthúzott nyilak az adott hatás gátlását jelzik
Az autoimmun kórképek közül a humorális eredetű szisztémás lupus erythematodes (SLE) UV sugárzás hatására fellángol (vespertilio a fénynek kitett testtájakon). A celluláris immunitás hibájából kialakuló sclerosis multiplex (SM) vagy psoriasis remisszióba kerülhet (PUVA kezelés). A sejtes védekezés gyengülése túlérzékenységi reakciók csökkenésével és latens herpes labialis aktiválódásával jól követhető. Finsen (Nobel-díj, 1903) leírta, hogy a napfény gyógyítólag hat a bőr tuberculosisára, később viszont kiderült, hogy a pulmonális TBC-t rontja. A besugárzás csökkentheti az élő, attenuált kórokozókkal végzett vakcinálás hatékonyságát, sőt veszélyessé teheti azt (pl.: BCG). Az UV irradiáció immunszuppresszív hatása folytán fokozza a legtöbb fertőző betegségre (pl.: HIV, TBC, herpes, candidiasis, listeriosis) való fogékonyságot (Armstrong 1994). A lokális és generalizált immunszuppresszió a daganatok, bőrrákok kialakulásának is kedvez (Longstreth és mtsai 1998).
22
2.3.6. Hóvakság, szürkehályog A szembe jutó UV sugárzás nagy részét a cornea és a lencse nyeli el, így főleg ezek károsodása várható (Tenkate 1998). Az okulonegatív hatásokhoz a szervezet nem tud adaptálódni. A fotokeratitis, fotoconjunctivitis és a retinopathia tünetei akut sugárártalomként 24 órán belül jelentkeznek. A vörös szem, fájdalom, könnyezés, fénykerülés jellegzetes tünetegyüttesét hóvakságként emlegetik. Reflektáló környezetben – homokon, vízen vagy havon – folytatott tevékenység, védőpajzs nélküli hegesztés, szolárium használat kapcsán lép fel. Közegészségügyi és gazdasági szempontból a legjelentősebb késői szemhatás az UV sugárzás által kiváltott szürkehályog (kortikális cataracta). A cataracta világviszonylatban a vakság leggyakoribb oka. A szemlencsét felépítő hosszú kollagén rostokat az UV sugárzás széttördeli, ami a lencse átlátszóságának csökkenését eredményezi. Az UV sugárzás az alkoholizmussal és a cukorbetegséggel azonos súllyal latba eső rizikótényező! Szürkehályog műtét vagy látásélességet javító beavatkozás (CLEAR – Clear Lens Extraction and Replacement) során a műlencse (IOL – IntraOcular Lens) ma már UV-abszorbenssel dúsított sziloxán-akrilát kopolimerből készül. A pinguecula (a cornea transzparenciáját csökkentő burjánzás) és a pterygium (a conjunctivális nyálkahártya ráterjedése a corneára) vonatkozásában az UV sugárzás szintén hajlamosító tényező lehet (Longstreth és mtsai 1998). 2.3.7. Az UV sugárzás bőrre gyakorolt általános hatásai A bőr leggyakoribb akut léziója az UVB hatásra kialakuló napégés, ami a bőrpírtól a hólyagképződésig fokozódhat. Szövettani képét az epidermisben apoptotikus, dyskeratotikus keratinocyták (napégés-sejtek) megjelenése, a Langerhanssejtek eltűnése és kereksejtes infiltráció, később hyperproliferáció jellemzi. Legérzékenyebbek az ismételt expozíció után is kevéssé barnuló, világos bőrű (kevés eumelanin), az I-es bőrtípushoz tartozó, többnyire kaukázusi, gyakran szeplős, vörös (sok pheomelanin) vagy szőke hajú, kék szemű egyének. Náluk a legnagyobb a
23
bőrrákok kockázata is. A másik szélsőséget az V-ös bőrtípusú, sötét bőrű afrikaiak és afro-amerikaiak képezik (Moan és mtsai 1999). A hazai népesség legnagyobb része a II–III. bőrtípusba sorolható. A napfényre való érzékenységet a testfelület pigmentációja alapvetően meghatározza. Az egyedfejlődés során a mélybe vándorolt neuro-ektodermális eredetű melanocyták az általuk termelt pigmenteket a környező keratinocytáknak adják át (Szende 1999). A barna eumelanin fényelnyelése révén védi a bőr mélyebb rétegeit a sugárzástól. A narancssárga pheomelanin viszont UVB hatására oxigén gyököket hoz létre, sőt feltételezik közreműködését a melanomák kialakulásában is. A 7. ábrán a normalizált sérülési hatásspektrum melanin jelenlétében 320 nm felett jelentősen eltér a DNS sérülési hatásspektrumától. Ezeken a hullámhosszakon a melanin járulékos kromofórként igen jelentős elnyelést mutat (lásd a 9. ábrát is) és közvetett módon – például szabad gyökök révén – hozzájárulhat a sérülések kialakulásához (Setlow 1999).
7. ábra. DNS, DNS+melanin és epidermis modell elméleti sérülési hatásspektruma (Setlow 1999 nyomán): 20 µg/ml DNS és 12 ng/ml melanin abszorpciós spektrumának összegeként meghatározva, 270 nm-nél 1 értékre normálva, valamint az epidermis transzmissziós spektrumával súlyozva
24
Ma a Föld felszínére elsősorban a legkisebb energiájú UVA sugárzás jut el. Mivel a melanin szintézisét serkenti, ezért a szoláriumokban felhasználják a barnulás eléréséhez. A kellemetlen leégés kialakításában nem főszereplő, emiatt azonban veszélyes is, mert észrevétlenül nagy sugárterhelést okozhat, és egyértelműen szerepet játszik a legrosszabb indulatú bőrrákok, a melanomák kialakulásában (Gallagher és Lee 2006). Xiphophorus halakban sokszorosára nőtt a melanoma előfordulása UVA besugárzás után, amiben nem a DNS, hanem közvetett módon a melanin elnyelésének is szerepe lehet (Setlow és mtsai 1993). Elsősorban a krónikus UVA sugárzás bőröregedéshez vezet. Hatásait részben reaktív oxigén gyökök (ROS – Reactive Oxygen Species) közvetítik. Az abnormális elasztikus és a degenerálódó kollagén rostok miatt a bőr elveszti rugalmasságát és ráncosodik . Napjainkban az ózonréteg vékonyodása miatt egyre jelentősebb az UVB expozíció. Ezt a sugárzást a szoláriumok is felhasználják, mert a melanin felszabadítása révén gyorsítja a barnulást. Kellemetlen hatásai közé tartozik a bőrpír (erythema) és a leégés kiváltása. Közvetlen rizikófaktora a bőrrákoknak, de a szervezet védekezésének gyengítésével
közvetetten
is
kedvez
a
tumorok
kialakulásának
(Longstreth
és mtsai 1998). 2.3.8. A bőrrákok epidemiológiája Az UV sugárzás által okozott legsúlyosabb elváltozások a bőrtumorok. Az idősebb
korosztálynál
jelentkező
nem-melanomatikus
bőrrákok
(NMSC)
a
keratinocyták burjánzásai. Az ide tartozó laphámrák (squamous cell carcinoma, SCC) és a Krompecher Ödön által elsőként leírt bazálsejtes karcinoma (BCC, ulcus rodens) kiváltásában a p53 gén UVB okozta gátlásának tulajdonítanak szerepet. A melanocyták transzformációját a melanoma malignumban (cutaneous malignant melanoma, CMM) az UVA irradiácóhoz kötik (de Gruijl 1996). A fehér kaukázusi embercsoport daganatos megbetegedései között a BCC (basalioma), SCC (laphámrák) és a CMM (melanoma) igen gyakori, az Egyesült Államokban például az első helyen állnak (de Gruijl 1999). Előfordulásuk 1930 és 1990 között évi 5%-kal emelkedett! De ez csak részben köszönhető a megváltozott napozási szokásoknak. Incidenciájuk az Egyenlítőtől való távolság növekedésével – az UVB terhelés visszaesésével – csökken (Moan és mtsai 1999). Mivel a napsugárzás a
25
legelterjedtebb környezeti rákkeltő ágens, a bőrtumorok a leggyakoribb megelőzhető daganatos betegségeknek számítanak. Leginkább a napfénynek kitett felületeken, arcon, nyakon, kézháton jelentkeznek, és főleg az I–II-es bőrtípusúakat sújtják. Az egyes bőrrák típusok kialakulásában és tulajdonságaiban fontos különbségek mutatkoznak, amiket a 2. táblázat foglal össze. BCC és CMM esetében megfigyelték, hogy a korábbi feltételezésekkel ellentétben nem az elszenvedett összdózis, hanem annak időbeli sűrűsödései hozhatók kapcsolatba az átmenetileg exponált testtájak (pl.: törzs) érintettségével. A gyermekkori leégések hajlamosítanak a bőrrák kialakulására. A 18. életévet megelőző időszak fontosságát magyarázza egyrészt, hogy a gyermekek nem figyelnek magukra, bőrük igen érzékeny, ők szenvedik el az UV életdózis 80%-át és elég sokáig élnek ahhoz, hogy a késői káros hatások is manifesztálódjanak. A lökésekben érkező sugárzáshoz – a nem rendszeresen napoztatott testtájakon és a nem jól barnulóknál – a szervezet nem tud hatékonyan alkalmazkodni, így ez tovább fokozza a kockázatot (Armstrong 1994). 2. táblázat. Az egyes bőrrák típusok fontosabb tulajdonságai
Jellemző
BCC (NMSC)
SCC (NMSC)
CMM
Relatív előfordulás
gyakori (80%)
közepes (15%)
ritka (2%)
Incidencia kapcsolata a földrajzi szélességgel
közepes
erős
gyenge
Kiváltó tartomány
UVB
UVB
UVA
Kockázatos UV terhelés
gyermekkori leégés
kumulatív dózis
gyermekkori leégés
Prekancerózis lehet
nem ismert
actinicus keratosis, papilloma
dysplasiás naevus
Elsősorban károsodik
PTCH, p53
ras, p53
ras, INK4a
Áttétképző hajlam
szinte nincs
előfordul
igen agresszív
Prognózis
jó
közepes
rossz
26
2.3.9. A bőrrákok tumorbiológiája Tumorok kialakulásakor a sejtek osztódásának és működésének szabályozása felborul a folyamatokat irányító szignál transzdukciós útvonalak károsodása miatt. A sejtek biztosítják maguknak a növekedési szignált (proliferáció), amelyeket gátló faktorokat a sejtek figyelmen kívül hagynak (dedifferenciáció), kikerülik a programozott sejthalált (az apoptosist), korlátlan osztódási képességre tesznek szert (immortalizáció), fenntartják az angiogenezist és szöveti invázióra (metasztatizálás) válnak hajlamossá (Szende 1999). Az ultraibolya sugárzás elsődleges célpontja a sejtekben az örökítőanyag, amelyben az UV fotonok különböző károsodásokat hoznak létre. A jelátviteli utak maradandó károsodása a fehérjéket kódoló gének sérülésére vezethető vissza. Tumorok kialakulásához elengedhetetlen legalább egy protoonkogén (pl.: növekedési faktor vagy annak receptora) aktivációja (gain of function). Ez az állapot jellemző a malignomát megelőző, már osztódási előnnyel rendelkező sejteket tartalmazó prekancerózisokra (pl.: keratinocyta burjánzás papillomában SCC-nél). A rák kialakulásának ezen sebesség-meghatározó lépését a differenciációs szignálokra érzéketlen sejtek folyamatos szelekciója
uralja.
A
malignus
transzformációhoz
átlagosan
további
3–4
tumorszuppresszor gén (pl.: p53, Rb) inaktivációja (loss of function) is szükséges (Grossman és Leffell 1997). Genetikus prediszpozíció esetén már az őssejtek hordoznak egy mutációt, ami mellett egyetlen további sérülés (second hit) is elégséges lehet a transzformációhoz. A rákok kialakulásában a mutációk mellett legalább ilyen fontos szerep jut a kijavítás elmaradásának is. Egészséges sejtekben az S-fázis addig nem indul meg, amíg a DNS hibái fennállnak. Xeroderma pigmentosum A–G variánsaiban a CPD-k és 6-4 PD-k kijavításának autoszomális recesszív elégtelensége vezet a bőrrákok 1000-szeres incidenciájához (de Gruijl és mtsai 2001). Mindezek alapján a liposzómába zárt hibajavító enzimek (pl.: T4 endonukleáz V.) a fényvédő készítmények fontos alkotóelemeivé válhatnak (Yarosh és mtsai 2001). A bőrrákok esetében több olyan mutációt azonosítottak, amiknek kialakulása az UV sugárzással közvetlenül kapcsolatba hozható. A kis G-proteineket kódoló ras protoonkogének károsodását már egyes bőrrákmegelőző állapotokban is sikerült kimutatni. Ilyen esetek többségében UVB sugárzásra specifikus CC→TT tranzíciókat
27
találtak a ras génben. A mutáns ras a membrán belső oldalához asszociáltan GTP-t kötve aktiválódik és állandó osztódási szignálként bekapcsolva tartja a növekedési faktorok tirozin-kináz (TRK) kaszkádját. A PTCH gén hibáját mutatták ki BCC sporadikus eseteiben, de familiáris Gorlin- és Bazálsejtes naevus-szindrómában (BCNS) is. A mutációk nagy része itt is UVB-specifikus C→T, CC→TT csere, amiknek eredményeként felszaporodik az apoptosis egyik inhibitora, a bcl-2 (Mitchell és mtsai 1996). Tumorszuppresszorok UV sugárzás okozta mutációja valószínűsíthető az Rb és a p53 jelátviteli utakat is befolyásoló INK4a gén esetében (de Gruijl és mtsai 2001). A p53 tumorszuppresszor fehérje kontrollálja a sejtciklust, az apoptosist, a differenciációt és a DNS repairt is. A p53 mutációja a humán tumorok felében kimutatható (de Gruijl 1996). A sejtmag sérülése esetén G1-fázisban tartja a sejtet, amíg a DNS-t az enzimek teljesen ki nem javítják, vagy – túlzott mértékű károsodás esetén – sor nem kerül a programozott sejthalálra (Szende 1999). Ennek megfelelően besugárzás után magasabb a p53 koncentrációja. A gén működésének köszönhető a daganatok egy részének elkerülése és a leégést követően az apoptotikus napégés-sejtek kialakulása. A p53 mutációi SCC-ben és BCC-ben az UVB sugárzásra jellemző jegyeket mutatják, kisebb csoportokba tömörülnek a gén mentén, ami a pirimidin dimerek kijavításának helyi nehezítettségét tükrözheti. Egy-egy tumorban valamennyi sejt azonos típusú mutációt hordoz, bizonyítva, hogy egyetlen sejt klonális expanzója alakítja ki a daganatot. Egészséges és korai rákmegelőző állapotokban a mutációk változatosabbak, ami szelekciós folyamatok szerepére utal (Grossman és Leffell 1997). A 8. ábra röviden bemutatja, hogyan eredményezik a bőrrákokhoz kapcsolható károsodott ras, INK4a, PTCH és p53 proteinek a sejt bizonyos jelátviteli útjainak kóros serkentését, más utak esetében pedig azok kóros gátlását. Végeredményképpen a sejtciklust irányító ciklinek és ciklin-dependes-kinázok (cdk) aktivitásában történik változás, ami miatt a sejtosztódás és annak gátlása közötti finom egyensúly felborul.
28
8. ábra. A különböző jelátviteli utak szerepe a sejtciklus szabályozásában (Szende 1999 kiegészítésével)
2.4. MOLEKULÁRIS HATÁSOK, A DNS KÁROSODÁSA 2.4.1. Molekuláris fotobiológia Biológiai hatást a fotobiológia I. alaptörvénye értelmében csak az abszorbeált energia okoz. A sugárzás elnyelésében főszerepet játszó molekulák a kromofórok, amelyek rájuk jellemző abszorpcióval rendelkeznek. A sejt összetevői a melanin kivételével az UVA-t kölcsönhatás nélkül átengedik. Az ózon fogyatkozásával felszaporodó UVB-t a 9. ábrán bemutatottak szerint abszorbeálják, ezért az jelentős hatással van rájuk. A keletkező fotoproduktumok biokémiai változásokhoz, azok pedig a sejt reakciójához és az erre adott szervezeti szintű válaszhoz vezetnek (Longstreth és mtsai 1998) (9. ábra).
29
9. ábra. A sejtek kromofórjaitól indul a biológiai hatás megjelenéséhez vezető többlépcsős folyamat, a fő kromofórok közé tartozik az örökítőanyag mellett a melanin és az urokaninsav, továbbá a fehérjékben megtalálható két aminosav: a tirozin és a triptofán; 290 nm alatti komponenseket a természetes felszíni sugárzás nem tartalmaz (Longstreth és mtsai 1998 nyomán)
A sugárzás oki szerepének bizonyítéka, ha egy-egy biológiai végpontot (pl.: erythema, karcinogenezis, sejthalál) sikerül egyetlen molekuláris fotoproduktumra visszavezetni (pl.: DNS sérülések). Ebben az esetben a következmény hatásspektruma és a keresett, sérülő vagy szenzibilizátor kromofór (pl.: DNS) elnyelési színképe megegyezik. Hatásspektrumon az objektum által a vizsgált hatás szempontjából egyetlen beeső foton felé mutatott felület (hatáskeresztmetszet), vagy az átalakult molekulák és az elnyelt fotonok arányának (kvantumhatásfok) a hullámhossz függvényében való ábrázolását értjük (Rontó és Tarján 1997). 2.4.2. Lipidek és fehérjék UV sérülései A fehérjék egy része, a zsírszerű anyagok és egyéb sejtalkotók nem nyelnek el jelentős UV energiát, de károsodásuk reaktív oxigén gyökök útján kialakulhat. Kivételt képeznek a bőrben a fényelnyelésre specializálódott vegyületek, mint az urokanin és elsősorban a melanin. Az UV sugárzás arachidonsav felszabadulásához vezet
30
membránlipid peroxidáció és az ezt követő foszfolipáz-hidrolízis révén. Az arachidonsav metabolitjai a gyulladásos mediátorként ismert prosztaglandinok. Ez is hozzájárul a leégés alkalmával fellépő inflammáció kialakulásához (Grossman és Leffell 1997). A sejtváz érintettsége része lehet a karcinogenezisnek, mert a mikrotubulusok szerepet játszanak a sejt növekedésében és osztódásában. A proteinek a sejtek szárazanyag-tartalmának több mint 50%-át teszik ki. Az UV sugárzás okozta sejthatások hatásspektrumának a DNS elnyeléséhez viszonyított vöröseltolódása a fehérjék szerepére utal. Abszorpciójuk jelentősége egyértelmű az izokromatid törések és a fehérjékhez kapcsolt sejtfunkciók, mint a nátrium- és aminosav-transzport szempontjából. Megfelelő hullámhosszon végzett besugárzás az enzimaktivitás csökkenését eredményezi. A fehérjék fő kromofórjai az aromás aminosavak, a tirozin és a triptofán – elnyelésük csak 220 nm alatt és 300 nm felett közelíti meg a DNS-ét. 2.4.3. A fehérjék szerepe a DNS sérülésében A DNS–fehérje keresztkötések kialakulásának hatásspektruma a DNS elnyelését követi, majd egy második csúcsot mutat 400 nm-nél, amiben járulékos kromofóroknak lehet jelentőségük (Peak és Peak 1991). Anaerob körülmények között a keresztkötések száma megcsappan, ami reaktív oxigén szerepére utal (Distel és mtsai 2006). A hisztonokkal való keresztkötés
timin–lizin és uracil/timin–SH-csoport kapcsolatnak
tudható be. Az ilyen típusú sérülések kialakulása a besugárzást követően is folytatódik, amit részben a CPD-k kijavítására érkező enzimeknek a DNS-hez való kötődésével magyaráznak (Moan és mtsai 1999). A keresztkötések kijavítására az élő szervezetek igen hatékony mechanizmusokkal rendelkeznek (Peak és mtsai 1985). Támadáspontot az UV fény számára főleg a kromatinban elhelyezkedő DNS jelent. A promóter szekvenciákhoz kapcsolódó transzkripciós aktivátor és represszor fehérjék védhetik és érzékenyíthetik is a DNS-t (Pfeifer 1997). A DNS–fehérje kötődés fotoproduktumok keletkezését befolyásoló hatását elsőként a lac operon esetében tapasztalták (Becker és Wang 1984). Valószínűleg a fehérjék jelenléte árnyékolás révén nem csak védheti a genomot, hanem a B-DNS geometriájának torzításával megkönnyíti a szomszédos nukleotid bázisok kettős kötéseinek fedésbe kerülését is. A lánc görbítése számos átírási faktor funkciójához elengedhetetlen, ugyanakkor a legnagyobb sérülés
31
sűrűséget éppen ezeken a szakaszokon mérték. A lokálisan kialakuló konformáció jellege szabja meg, hogy melyik lézió milyen gyakorisággal keletkezik. A kötődő fehérje a hibák kijavítását is gátolhatja, így fokozva a mutagén hatást. Másfelől a fotoproduktumok erősen akadályozhatják a DNS-regulátor proteinek kötődését. A sejtciklus szabályozásának befolyásolásával ennek a tumorok kialakulásában is szerepe lehet (Pfeifer 1997). 2.4.4. A DNS UV elnyelése A dezoxiribonukleinsav kettős spirálban egymással szemben komplementer nukleotid bázisok helyezkednek el, a molekula kitekert szerkezete létrához hasonló képet mutat (10. ábra). A sejt örökítőanyaga szerencsétlen véletlenképpen az UV sugárzás fő kromofórja is. Elnyelési spektruma a sejthalál, a kromoszóma aberrációk és a transzformáció kialakulásának hatásspektrumához nagyon közel áll, vagyis sérülése e folyamatok megindítója. A DNS a legnagyobb energiájú UVC fotonokra a legérzékenyebb, abszorpciós maximuma 260 nm körül van, így a molekuláris hatások vizsgálatához ez a tartomány jól használható. Biológiai szempontból a Föld felszínén csak a DNS által szintén hatásosan abszorbeált UVB-vel kell számolni. A 220–300 nmes sávban valamennyi bázis elnyel, ellentétben a nukleinsav cukor és foszfát komponenseivel. UVA esetén endogén fényérzékenyítő anyagok közvetítésével a DNS fotooxidációja kerül előtérbe. Az UV sugárzás hatására igen változatos léziók keletkezhetnek, amelyek egy részét a 10. ábra mutatja be. A különböző típusú fotoproduktumok egymáshoz viszonyított aránya a sugárzás színképétől és a körülményektől
függ.
UVC–UVB
hatására
fotoproduktumok alakulnak ki két szomszédos és mtsai 1996).
32
túlnyomó pirimidin
többségben bázisból
dimer (Mitchell
10. ábra. A DNS sematikus ábrája és a különböző UV fotoproduktumok (Mitchell és mtsai 1996 nyomán)
A fotoproduktumok mutagenitása sejttenyészeteken, bőrrákok és szintetikus oligonukleotidok esetében jól követhető. A DNS öröklődő károsodásai többnyire tranzíciók (G↔A,C↔T), transzverziók (G/A↔C/T), tandem mutációk (két bázist érint) és frame shiftek (3-mal nem osztható számú bázis inzerciója vagy deléciója). A környezet is nagymértékben befolyásolja a DNS viselkedését, ezért erre is tekintettel kell lenni az örökítőanyagban lejátszódó folyamatok vizsgálatakor. Nem csak a nukleinsav denaturációját okozó hőmérséklet-, víztartalom-, ionerősség- vagy pHváltozások fontosak. A DNS stabilitása széles tartományban (pH 5–9; ionerősség 10-3–1; hőmérséklet: 0 °C–DNS olvadáspontja) nem mutat jelentős változást. Az életnek pontosan egy ilyen, szélsőségek között is megbízható információhordozóra van szüksége. A környezet változásaira az örökítőanyag konformáció-változással reagál, ami a DNS–UV fény kölcsönhatást, az elnyelési spektrumot is befolyásolja. A protonálódás és töltés-átrendeződés talaján meginduló denaturációt minden esetben hyperkrom effektus, a nukleotid bázisok „stacking” kölcsönhatásának csökkenése jelzi. Míg a normál
33
DNS-ben, 3,4 Å bázistávolság mellett a lánc elnyelési spektrumának minősége az azt felépítő mononukleotidokéhoz képest nem tér el (a λmax azonos), addig az abszorpció mértéke
≈30%-os
csökkenést
mutat.
A
helikális
konfigurációban
létrejövő
kölcsönhatások nem szolgáltatnak kielégítő magyarázatot, hiszen a hypokrom effektus akkor is fellép, ha nincs geometriai rendezettség. A nukleozidok elnyelése a hidrofób erőknek köszönhetően apoláros oldószerekben is csökken. Sőt, RNS, egyszálú DNS és szintetikus polimerek esetében kimutatták, hogy nem is a hidrogén-kötésektől függ. A hypokromia mértéke a lánc hosszával hozzávetőleg a 10. tagig növekszik. Magyarázattal az egymás közelében lévő bázisok elektrosztatikus kölcsönhatása és az ezt elősegítő – poláros közegben fellépő – hidrofób erők szolgálnak. Az alap és a gerjesztett állapot közötti elektronátmeneteket jellemző vektorok a fentieknek köszönhetően az egyes bázisok esetében részleges fedésbe kerülnek (Patrick és Rahn 1976). A bázisok egymásra rétegződésében bekövetkező változások a spektrumban ezért gyakran hyperkrom effektusként észlelhetők. 2.4.5. A DNS gerjesztése A DNS-ben elnyelt UV foton a nukleotid bázis kettős kötéseinek egyik π elektronját egy addig üres π* lazító pályára juttatja, így keletkezik a 260 nm-es abszorpciós csúcs. A σ elektronok hasonló viselkedése ritka. Átrendeződések, különböző gerjesztett állapotok érintettsége, kovalens kötések szakadása és létrejötte, valamint a molekula más részeinek való energiaátadás segítségével a végállapot három úton érhető el. Az alapállapotba az energiának foton (fluoreszcencia, τ<10-9 másodperc) vagy hő (sugárzásmentes átmenet) formájában való leadásával lehet visszatérni. Az elnyelt foton energiájának terhére létrejöhet kémiai reakció is. Más gerjesztett állapotok alakulhatnak ki sugárzás nélkül, intersystem crossing (ISC) révén. Szerves molekulák külső elektronpályáján többnyire két elektron helyezkedik el, így az eredő spinkvantumszám 0. Magasabb nívóra való átmenet akkor lehetséges, ha a spinkvantumszám nem változik, marad 0 – ez a szingulett gerjesztés. A környezettel való kölcsönhatásra az elektron spinje megfordulhat, az eredő 1 lesz, a nívó energiaszintje pedig lecsökken, ahogy azt a 11. ábra mutatja. Mivel a visszaalakuláshoz újabb kölcsönhatás szükséges, a metastabilis triplett nívó élettartama viszonylag hosszú (Schauder 1996).
34
11. ábra. A gerjesztő foton energiájának sorsa (Jablonski-diagram)
A 12. ábrán látható módon az alapállapotból nincs közvetlen átmenet a triplett állapotba. Az elektron gerjesztett szingulett állapotának legalacsonyabb vibrációs szintjéről viszont már nagyobb valószínűséggel valósul meg az ábrán is jelölt spin– tiltott ISC a triplett állapotba. Az átmenet a fordított irányban is hasonlóképpen nehézkes. A triplett állapot lecsengése ezért lassabb, így foszforeszcenciára (τ>10-3 másodperc) képes és a gerjesztés hosszabb élettartama miatt kémiai reakcióra is jóval hajlamosabb! Egyes érzékenyítő molekulák (pl.: pszoralén a PUVA-ban) képesek a saját maguk által elnyelt energiát az alacsonyabban fekvő triplett állapotba pumpálni, ezzel kedveznek a DNS fotoproduktumok kialakulásának (Patrick és Rahn 1976).
12. ábra. Az energiaállapotok közötti lehetséges átmenetek; a szingulett állapotból inter-system crossing révén kialakuló triplett állapot a DNS fotoproduktumok előfutára lehet (Patrick és Rahn 1976 nyomán)
35
A kettős hélix szerkezet megváltoztatja a bázisok gerjesztett állapotának lecsengését és azok ilyen körülmények között egymásra is erősebben hatnak. Már dinukleotidokban is kialakulhatnak excimer állapotok, amiket egy szingulett gerjesztett és egy szomszédos, alapállapotú bázis hoz létre (Crespo-Hernandez és mtsai 2005). A köztük lévő távolság az energia minimumra való törekvés és a megváltozott körülmények miatt csökken, a gerjesztés következményein immár osztozik a két molekula. A kialakuló közös energiaszintek alacsonyabbak és valamivel hosszabb élettartamúak lesznek a szingulett állapotéinál. Így az excimerek a fotokémiai reakciók és a triplett állapotok előfutáraivá válhatnak. Bár a helikális stabilitás 10 tag fölött nem növekszik tovább, a lánc hosszával új lehetőségek nyílnak a többlet energiától való biztonságos megszabadulásra, így az abszorpció is változhat. A foton elnyelése és a gerjesztett állapot kialakulása közötti időben az energia egy része a közeli, szomszédos kromofór alacsonyabb energiaszintjeire átadható. Kétszálú DNS-ben az energia a fotont elnyelő szál gerince mentén eloszolhat. Ha sérülés alakul ki, azt az ép komplementer lánc segítségével a hibajavító enzimek ki tudják javítani (Crespo-Hernandez és mtsai 2005). A jelenség szétterjedésének a lánc teljes hossza felett még alacsony hőmérsékleten is gátat szab, hogy G–C bázispárokból kialakuló excimerek alacsony energiaszintjük miatt csapdaként működnek. Az A–T párok excimerjeiből triplett állapotú T jöhet létre, aminek révén a gerjesztés a szingulett energiával szemben, bár lassabban, de akár 5 bázis távolságra is elvándorolhat, éppen a nagyobb megoszlás miatt viszont kevesebb hatással van a DNS tulajdonságaira (Patrick és Rahn 1976). 2.4.6. Ciklobután-pirimidin-dimerek (CPD) Izolált pirimidinek oldatában a ciklobután-pirimidin-dimerek (CPD) triplett állapoton keresztül transz izomerként keletkeznek. A cisz változat előfutára a szingulett gerjesztés. Természetes DNS-ben a négy lehetséges diasztereomer közül csak a cis-syn variáns fordul elő, ami az UVC-UVB sugárzás fő fotoproduktuma (13. ábra). Kialakulásának leginkább a TT és a CT szekvencia kedvez, ahol a szomszédos bázisok C5-C6-os kettős kötései között a cikloaddíció nagyobb valószínűséggel történik meg (Ravanat és mtsai 2001).
36
13. ábra. Ciklobután-pirimidin-dimerek (CPD) (Ravanat és mtsai 2001)
A CPD-k kialakításában résztvevő fotonok a sérülések visszafordítására is képesek lehetnek, a folyamat a lézió létrehozásánál mintegy tízszer nagyobb kvantumhatásfokkal működik. A dimerek kialakulásának kvantumhatásfoka ≈20·10-4, míg a dimerek fotoreverziójáé ≈650·10-4 (Patrick és Rahn 1976). UVC-vel végzett besugárzás hatására a sejtekben a nagy molekulasúlyú DNS szintézisének csökkenését mérték, vagyis a CPD-k a DNS-polimeráz által végzett elongációt felfüggesztik. Besugárzás hatására a sejtek mitotikus indexe átmenetileg csökkent az S-fázis elhúzódásának köszönhetően. A jelenséget fotoreaktiváló fénnyel (UVC) végzett besugárzással – a hosszabb hullámhosszakkal ellentétben, ahol más fotoproduktumok dominálnak – meg lehetett szüntetni. Fotoreverziót okozó besugárzás után az eredeti citozin visszaalakulása mellett a C4-es amino-csoport hidrolítikus OH szubsztitúciójával is számolni kell. Az uracil megjelenése tranzíciót jelent, pirimidin bázist egy másik pirimidin helyettesít. A jelenség a megváltozott párosodás miatt mutagenezisre vezethet, mert guanin helyett adenin fog beépülni a komplementer láncba, majd az újabb replikáció alkalmával az adenin timinnel kapcsolódik és megtörténik a citozin lecserélése, ami az UVB-re jellemző elváltozás (Grossman és Leffell 1997). 2.4.7. Pirimidin-(6-4)-pirimidon fotoproduktumok (6-4 PD) A 6-4 PD-k keletkezése a DNS abszorpciójának vöröseltolódását okozza, ugyanis az UVC-hez képest elnyelési maximumuk (310 nm) a hosszabb hullámhosszak felé esik. Fotolízisüket ugyanez a hullámhossz-tartomány okozza. A párhuzamos keletkezés és bomlás terméke lehet a Dewar valencia-izomer (10%), ami a CC szekvenciákat preferálja (Taylor és mtsai 1990). A kialakuló sérülések lúgos közegben egyszálú
37
törésként manifesztálódhatnak. A 6-4 PD-k elsősorban a CC és TC szekvenciákat kedvelik (Pfeifer 1997). Szingulett gerjesztés nyomán az 5’ pirimidin C5-C6-os kettős kötése és a 3’ bázis C4 karbonil(T)- vagy imino(C)-csoportja között instabil oxetán vagy azetidin intermedier érintésével cikloaddíció jön létre a 14. ábrán szemléltetett reakcióban. A biológiai hatásokért elsősorban a szubsztituált pirimidon-gyűrű felelős. Az 5’ citozin itt is uracillá deaminálódhat, de a 3’ C érintett funkciós csoportja a kötés kialakításában vesz részt (Ravanat és mtsai 2001).
14. ábra. 6-4 PD és Dewar-izomer kialakulása (Ravanat és mtsai 2001)
Megállapították, hogy az 5’ T-t tartalmazó dipirimidinek 10-szer fotoreaktívabbak az 5’ C-oknál, és hogy a 3’ C a 6-4 PD-knek kedvez. Kialakulásukhoz a CPD-kkel (7˚) ellentétben a bázisok jelentős kitekeredése (44˚) szükséges, ami ritkábban valósul meg (Mitchell és mtsai 1996). Bár mennyiségük a CPD-kének csak 10–50%-a, a sejthalál, a testvérkromatid cserék, a mutagenezis és a nukleinsav-szintézis gátlása elsősorban a 6-4 PD-kre vezethető vissza (Ravanat és mtsai 2001). 2.4.8. Pirimidinek egyéb sérülései Az örökítőanyag dehidrált állapotában, elsősorban A-konformációban és vékonyrétegeken a pirimidin dimerek egy további változata, a spóra fotoproduktum is kialakulhat (15. ábra). A két timin bázis között létrejövő 5,6-dihidro-5-(α-timinil)-timin nem csak szomszédos bázisok között alakul ki számottevő valószínűséggel, hanem a láncon belül nagyobb távolságokat is áthidalhat, sőt különböző láncok között is létrejön (Douki és mtsai 2003).
38
A CC→TT tranzíció annak ellenére az UVB mutagenezis főszereplője, hogy a kérdéses szekvencia igen alacsony fotoreaktivitást mutat. Ez azt jelenti, hogy a DNS öröklődő megváltozását kiváltó hatása – részben a lehetséges deaminációnak köszönhetően – igen jelentős. A génexpresszió szabályozásában résztvevő 5-metilcitozin sérüléseinek a protoonkogének aktivációjában lehet szerepe. Szingulett gerjesztett citozinokon víz molekula nukleofil addíciójára kerülhet sor, aminek eredményeként citozin-fotohidrát keletkezik. Deaminációval ez a termék uracilfotohidráttá is átalakulhat (Ravanat és mtsai 2001), amit a 15. ábra mutat.
spóra fotoproduktum
15. ábra. Fotohidrát keletkezése (Ravanat és mtsai 2001); spóra fotoproduktum (Douki és mtsai 2003); jellegzetes oxidatív lézió: 8-oxodGua (Ravanat és mtsai 2001)
2.4.9. Oxidatív léziók Az UVA tartományban, ahol a DNS molekula elnyelése már kevésbé jelentős, oxidatív léziók és DNS–fehérje keresztkötések jutnak főszerephez az örökítőanyag károsításában. Purin bázisok sérülései főleg ezen az úton keletkeznek, de a teljes DNS UVB okozta károsodásához csak mintegy 1%-ban járulnak hozzá. Kivételt képez az adeninnek szomszédos adeninnel vagy timinnel kialakított dimerje, ami bizonyítottan mutagén. Az I. mechanizmusú reakciók egyelektronos oxidációt vagy H-elvonást jelentenek. A guanin-kationok képződése elsődleges az alacsony ionizációs potenciál és a máshol kialakult vándorló elektronhiány befogására való képesség miatt. A kialakuló produktum elsősorban 8-oxo-7,8-dihidro-2’-deoxiguanozin (8-oxodGua, 15. ábra), amely prolin vagy lizin peptidkötésben részt nem vevő szabad hidroxil-, vagy aminocsoportjával lépve kölcsönhatásba a DNS–protein keresztkötések létrejöttében játszik kulcsszerepet, de adeninnel is párosodhat (G→T transzverzió, UVA jellegzetesség).
39
A triplett gerjesztett fotoszenzibilizátorok elektron-transzferrel az adenin oxidációjára képesek. Levegőztetett vizes oldatban elsősorban 2’-deoxi-inozin és kisebb részben
4,6-diamino-5-formamidopirimidin
(FapyAde)
keletkezik
(Ravanat
és mtsai 2001). A purin bázisok C6-os hidratációját követően hidroperoxidok alakulnak ki, intramolekuláris átrendeződést követően glikolok, formamidok és hydantoinok a végtermékek. A képet a timinek uracillá történő demetilációja színesíti. A cukor komponens laktonná alakulása, és N1 deprotonálás során felszabaduló citozin és timin a hasonló bázisokkal biadduktumokat képezhet, másik lehetőségként guaninnal két bázist érintő tandem sérülés is kialakulhat. A
II.
típusú,
domináló
oxidáció
során
a
sejt
gerjesztett
állapotú
fotoszenzibilizátorai (riboflavin, porfirin, szteroid, benzofenon, kinonok) energia átadásával szingulett állapotú oxigént hoznak létre, de erre az eredményre vezet számos kémiai reakció is. O2-, OH· és H2O2 keletkezik a NADPH-, a xantin- és a flavin-oxidáz, a légzési lánc citokrómjai és nukleotid–Fe2+ komplexek működése nyomán is (Ádám és mtsai 1996). A DNS-ben az oxidáció legfőbb támadáspontja az elektron-gazdag guanin. A kettős láncban instabil endoperoxidokon keresztül főleg 8-oxodGua keletkezik. Ennek a molekulának a jelenléte tehát utal az oxidatív stresszre. Alacsony ionizációs potenciáljának köszönhetően másodlagosan is képes I-es és II-es típusú reakciókban részt venni (Ravanat és mtsai 2001). 2.4.10. Lánctörések Míg az UVC és UVB régiókban nem a lánctörések a domináns sérülések, addig az UVA és VIS tartományban a sejtekben több keletkezik belőlük, mint CPD-kből (Peak és Peak 1991). Itt ugyanis már nem a DNS az egyetlen kromofór, és az alacsony energiájú UV sugárzás által keltett reaktív oxigén gyököknek a száltörések kialakulásában nagy szerepe lehet. Biológiai jelentőségük nem szignifikáns, amíg gyors és teljes kijavításukra lehetőség van, de lánctörésekkel magyarázható a pontmutációk alapján várható mértéket meghaladó inaktiváció UVA esetében (Moan és Peak 1989).
40
A száltörések közvetlen kialakulásához az elnyelődött fotonnak igen nagy energiával kell rendelkeznie. Elméleti számítások alapján az egyszálú törések kialakításához szükséges energiát 20, a kettős szálú törésekhez szükségeset 50 eV környékén határozták meg (Nikjoo és mtsai 1999). Ilyen nagy energiával jellemzően a vákuum-UV / röntgen tartományba tartozó fotonok rendelkeznek. Ezekhez képest az UVC–UVB tartományban jóval kevesebb a száltörés. A kettős szálú törések keletkezése összefüggést mutat a sejthalállal. Besugárzás hatására kialakuló hosszú életidejű protein peroxil-gyökök kettős szálú DNS lánctörések kialakításában is részt vesznek. A fehérjék jelenléte nem csak védheti az örökítőanyagot, hanem gyökös mechanizmusú reakciókban is hozzájárulhat a sérülések kialakulásához (Distel és mtsai 2006). A DNS dehidrációja a száltörések kialakulásának különösen kedvez. A DNS kettős hélixet stabilizáló hidrátburokból vízmolekulák kivonása olyan szerkezeti változásokat okoz, amik a cukor–foszfát gerinc kötéseinek felszakadásához vezethetnek. A vízelvonás az UV sugárzás által kiváltott száltörések kialakulását is fokozhatja. Egyes fotoproduktumok helyén a dehidráció–rehidráció okozta stressz következtében alakulhatnak ki száltörések (Dose és mtsai 1996).
2.5. AZ UV SUGÁRZÁS DOZIMETRIÁJA 2.5.1. Fizikai UV dózis A földfelszínt elérő ultraibolya dózis meghatározására két eltérő, egymást kiegészítő módszert dolgoztak ki. Számítógépes matematikai számításokban a Nap sugárzási teljesítményét, a beesési szöget, a fotonokat szóró és elnyelő összetevők – mint például az ózon, por, vízgőz – koncentrációit veszik figyelembe. Eredményként elméleti térképek születnek, amiket a várható UV dózis előrejelzésére is fel lehet használni. A matematikai modellel számított UV-indexhez a W/m2-ben kapott irradianciát az erythema hatásspektrumával súlyozzák és 40-es szorzófaktort alkalmaznak (International Comission on Non-Ionizing Radiation, 1995).
41
A hatékony védekezéshez az érintett népesség tájékoztatása nélkülözhetetlen. Ma már a világ számos táján a Kanadában bevezetett UV-index az időjárás-előrejelzés részét képezi. A nemzetközi rendszer 0-tól 15-ig terjedő skálát használ, ahol a 8 feletti értékek már nagyon magasnak számítanak. Az előrejelzés segítségével a bőrtípus figyelembevételével az egyén számára elkerülhetővé válik a túlzott expozíció. A másik lehetőség az UV sugárzás direkt mérése, kémiai vagy fizikai hatásai alapján.
Megfelelő
aktiválási
energiával
és
hatáskeresztmetszettel
rendelkező
fotokémiai reakciók felhasználhatók erre a célra, például az aceton bomlása vagy poliszulfon rétegek sötétedése (Davis és mtsai 1976). Fizikai dózismérésre elsősorban Robertson-Berger (RB) dózismérőket használtak az 1970-es évek óta. A műszer kvarc buráján átlépő napsugárzás ultraibolya fotonjai a látható tartomány kiszűrése után CaWO4 bevonatban fluoreszcenciát keltenek. A bevonat által emittált, szűrt zöld fényt vákuumcsöves GaAsP fotodióda érzékeli és az intenzitással arányos elektromos jelet generál (Berger 1976). A műszerek érzékenységi spektruma a bőrpír hatásspektrumához állt közel, ezért segítségükkel az erythema dózist lehetett meghatározni, de a kalibráció megbízhatatlan, a hosszú távú eredmények ellentmondásosak és a globális hálózat ritkán kiépített volt (di Sarra és mtsai 2002). Mivel az egyes hullámhosszakon beérkező energiákat nem tudták megkülönböztetni, a nyert adatok az emberi bőrön kívül más biológiai rendszerekre nem alkalmazhatóak. 1990 óta mintegy 150 modern spektroradiométerrel követik részletekbe menően a spektrum minőségi változásait is. A mérések és a számítások kombinálásával az elmúlt évtizedekben az ózonfogyás következtében az UV sugárzás okozta DNS sérülés 5–10%-os emelkedése mutatható ki szélességünkön, aminek meghatározását a 16. ábra szemlélteti. Bár a sugárzás intenzitásának emelkedése a természetes fluktuáció nagyságrendjébe esik, nem szabad elfelejtenünk, hogy ahhoz hozzáadódik és így a csúcsdózisok
túllépik
az
élőlények
alkalmazkodási
és mtsai 1998).
42
képességét
(Madronich
16. ábra. DNS károsodás és ózonfogyás összefüggése (Nilsson 1996 nyomán): A felszínt elérő napsugárzás spektrumát a DNS sérülés hatásspektrumával súlyozva a görbe alatti terület a DNS károsodásával arányos; ennek mértékében 10% ózonfogyás igen jelentős növekedést eredményez
2.5.2. A biológiai hatékonyság becslése A Föld felszínét érő UV sugárzás növekedésének következményei nem csak a sugárzás mértékétől, hanem a biológiai rendszerek érzékenységétől is függnek (Nilsson 1996). A biológiai hatások számítással történő becslésére több módszer is született, ezek a biológiai UV dózisok, amiknek számításához az ún. hatásspektrumot kell ismernünk. Egy-egy biológiai következmény hatásspektrumát az adott hullámhosszakon érkező irradianciával súlyozva megkapjuk az egyes hatásokra való szenzitivitást (16. ábra). Ennek ózonfüggő változását veszi figyelembe a biológiai erősítési faktor (biological amplification factor, BAF). DNS esetében például az ózonlyuk éppen a legerősebben abszorbeált, így legkárosítóbb sugárzásnak nyit ablakot: a BAF 2-nek adódik. Mivel a leégésre a tovább nem emelkedő UVA is hatással van, itt az érték alacsonyabb lesz. Ezeknek a számoknak a segítségével az ózonfogyás következményei durván megbecsülhetőek (Madronich és mtsai 1998).
43
Az UV sugárzás legelrettentőbb következményei, a bőrrákok (NMSC) esetében a többváltozós epidemiológiai elemzés erős összefüggést tárt fel az előfordulás és a környezeti UV dózis között (Tenkate 1999): Kockázat ~ (napsugárzás évi UV dózisa)β (kor)α és: I = γ A H’β aα , ahol: H’ = H + H0 (a-as)/a I : kumulatív incidencia ’a’ éves korig [1/100 000 fő]; A : a testfelszín normálisan sugárzásnak kitetett hányada (pl.: arc, kezek); H : a bőrfelület évi karcinogén expozíciója a természetes UV-ből [MED]; H0 : évi foglalkozási átlagdózis (ha van) [MED]; a : életkor [év]; as : az életkor, amikor a foglalkozási expozíció megkezdődött [év]; γ : a populáció genetikai érzékenysége; β : biológiai erősítési faktor (általában 2); α : a kumulatív incidencia kortól való függése (általában 5). A Commission International d’Éclairage (CIE) ajánlása alapján az elszenvedett biológiai dózis a besugárzási idő és az effektív irradiancia szorzataként számítandó. BED = t Eeff Meghatározott sugárforrás esetén az effektív irradiancia megadható abszolút mennyiségként, vagy egy referencia sugárforráshoz viszonyított relatív értékben. A megengedhető expozíciós idő az adott hatás expozíciós határértéke és Eeff hányadosaként számítható.
44
Eeff = Σ Eλ Sλ Δλ, ahol: Eeff : effektív irradiancia [pl.: Wcm-2]; Eλ : spektrális irradiancia [pl.: Wcm-2nm-1]; Sλ : biológiai hatásosság súlyfaktora; Δλ : hullámhossz-tartomány [nm]. 2.5.3. Biológiai doziméterek A számítások bizonytalanságát kiküszöbölve a biológiailag effektív dózis (BED) közvetlen mérésére is van lehetőség. A biológiai doziméterek a különböző hullámhosszakon abszorbeált energiát annak eltérő biológiai hatásossága szerint súlyozva integrálják. A rövidebb hullámhosszú UV tartományban ráadásul a ma használt spektroradiométerek mérési hibája is jelentős, amit biológiai doziméterek használatával ki lehet küszöbölni. Mivel az ultraibolya sugárzás fő célpontja a magasabb rendű szervezetekben is a kromoszomális fehérjékkel kölcsönhatásban lévő DNS, ezért a célmolekulákat tartalmazó egyszerűbb organizmusok és ezek örökítőanyaga jól használhatók biológiai doziméterként. Baktériumok (pl.: Escherichia coli (Karentz és Lutze 1990)), baktérium spórák (pl.: Bacillus subtilis spórák (Munakata 1981)) és bakteriofágok (pl.: λ fág (Regan és Yoshida 1995), T1 fág (Furusawa és mtsai 1990), T7 fág (Rontó és mtsai 1992)) alkalmazása is ismert erre a célra. Szintén jól használhatónak bizonyult a DNS modelljeként az uracil kristályokból kialakított vékonyréteg. Kalcium-fluorid vagy kvarc korongra párologtatással körülbelül 70 nm vastag rétegek állíthatók elő. Ultraibolya sugárzás hatására ciklobután típusú uracil dimerek képződnek, amiknek kialakulása a 280 nm-en mért abszorpció csökkenésével követhető (Kerékgyártó és mtsai 1997). Bizonyos hullámhosszak fotoreverzióra is képesek, ami a dimerek monomerekre való szétesésével és az abszorpció emelkedésével jár (Rontó és mtsai 2004).
45
3. Célkitűzések
Az emberi tevékenységnek a környezetre kifejtett káros hatásai nehezen mérhetők fel. Ipari szennyezés miatt vékonyodik az ózonréteg, divatossá vált a napozás és a mindennapi életben is egyre többet találkozunk ultraibolya sugárzással. Figyelnünk kell a direkt sugárzás mellett a szórt napfényre és a mesterséges források kibocsátásából eredő sugárterhelésre is (pl.: szolárium, foglalkozási sugárártalom ipari és egészségügyi felhasználásoknál, fluoreszcens jelölések alkalmazásánál). Napjainkban fokozottan számolnunk kell az UV sugárzás emberi egészségre és az ökoszisztémára is káros hatásaival. A környezetet érő ultraibolya sugárzás spektrális összetétele és mennyisége függ a forrástól, az állandóan változó légköri paraméterektől és a besugárzás számtalan egyéb körülményétől. Az UV dózis közvetlen meghatározása ezért nem könnyű, a káros hatások pontos előrejelzése jól használható doziméterek alkalmazását teszi szükségessé. Mivel a legtöbb biológiai hatás elsődlegesen a DNS-ben okozott UV sérülésekre vezethető vissza, ezért célszerű magát a célmolekulát használni biológiai doziméterként. A T7 bakteriofág örökítőanyaga – az azzal kölcsönhatásban lévő fehérjék jelenlétében – az UV sugárzás molekuláris hatásainak tanulmányozását is lehetővé tevő biológiai doziméterként használható (Rontó és mtsai 1992). Korábban erre a célra elsősorban a fágok E. coli gazdasejten mutatott tarfoltképző képességének csökkenését használták, azonban molekuláris biológiai módszerekkel lehetővé válik az elszenvedett biológiai dózis gyorsabb és egyszerűbb meghatározása. Munkánk során célul tűztük ki: I.1.
Polimeráz
láncreakció (PCR)
kifejlesztését
a
fág-DNS
sérüléseinek detektálására; I.2.
A
polimeráz
láncreakció
kvantitatív
kiértékelésének
kidolgozását; I.3.
PCR
optimalizálását
különböző
használható fragmensek esetére;
46
dózistartományokban
I.4.
UVB,
UVC
és
polikromatikus
források
hatásának
tanulmányozását; I.5.
A T7 fág biológiai dózismérő hitelesítését;
I.6.
Különböző DNS konformációk UV sérülést befolyásoló hatásának vizsgálatát;
I.7.
A fág-fehérjék szerepének tisztázását a DNS UV sérüléseiben.
Az ultraibolya sugárzás nem csak a földi élet jelenére nyomja rá a bélyegét, hanem annak kialakulását is erősen befolyásolhatta. A Föld és meteoritok felszínén az esetleges biomolekulákat komoly UV dózis éri. Felvetődik a biomolekulák bolygók közti átvitelének lehetősége – a múltban kőzetdarabokhoz, a jövőben pedig űrjárművekhez kötődően is. Ebből a szempontból a világűrben uralkodó körülményeknek a DNS-re kifejtett hatása sarkalatos kérdés. A probléma vizsgálatára az ESA által a Nemzetközi Űrállomásra kifejlesztett EXPOSE egység ad lehetőséget. Az éles exobiológiai kísérleteket előkészítő mérések (Experiment Verification Test – EVT) előzik meg, amelyek irányadóak a minták stabilitását és kiértékelését illetően, valamint segítséget adnak a tényleges kísérletek megtervezéséhez. Ennek kapcsán tanulmányozni kívántuk a szimulált világűrbeli körülmények hatását, ezen belül: II.1.
Az EXPOSE-on használandó fág és DNS vékonyrétegek minőségét;
II.2.
A szimulált űrbeli vákuum hatását;
II.3.
A hőmérséklet-ingadozás hatását;
II.4.
Szimulált extraterresztriális sugárzás (monokromatikus UVC és napszimulátor) hatását;
II.5.
A DNS sérülések teljes számát és egyes típusainak megoszlását;
II.6.
A kombinált (vákuum + UV) kezelések következményeit;
II.7.
A vékonyrétegek vastagságának árnyékoló hatását és a hatás korrekciós számításba vételének lehetőségeit.
47
4. Anyagok és módszerek 4.1. T7 BAKTERIOFÁG 4.1.1. A fágok tudományos jelentősége A bakteriofágok baktériumokon élősködő vírusok. A megfertőzött gazdasejt anyagcseréjét önmaguk szaporítására használják és ezzel a baktérium pusztulását okozzák. A tudományos érdeklődés előterébe kerültek a XX. század elején, amikor bakteriális fertőzések kezelésére kísérelték meg felhasználásukat. Az antibiotikumok véletlenszerű felfedezésével ez a lehetőség vesztett jelentőségéből, de a gyógyszerekre rezisztens törzsek terjedésével a bakteriofágok alkalmazása napjainkban ismét érdekessé vált. A fágok örökítőanyag átvitelére való képessége és viszonylag egyszerű életciklusa a molekuláris biológia egyik kedvelt „kísérleti állatává” tette őket, nagyban hozzájárultak genetikai ismereteink fejlődéséhez. A fágok felépítését és örökítőanyagát hamar feltérképezték, ami további felhasználásukat tette lehetővé; tartalmazzák az élő szervezetekre
jellemző
két
biopolimert:
DNS-t
és
proteineket.
Egymással
kölcsönhatásban lévő fehérjéből és nukleinsavból állnak, amik szükség esetén különkülön is könnyen vizsgálhatóak. Ez az egyszerű szerkezet sok szempontból jó modellje a magasabb rendű élőlények kromoszómáinak. A fágok könnyen tenyészthetőek, dúsíthatóak és tisztíthatóak. Ha kell, élettelen állapotban a nukleoprotein komplexek fizikai, kémiai vizsgálatra alkalmasak, de más körülmények között (gazdasejteken) biológiai aktivitást is mutatnak. A Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézetében több évtizedes tapasztalat gyűlt fel a T7 bakteriofággal kapcsolatban. Korábban is sikerrel alkalmazták fizikai és kémiai környezeti hatások kvantitatív minősítésére (Rontó és mtsai 1989a, Rontó és mtsai 1989b, Rontó és mtsai 1992).
48
4.1.2. A fág életciklusa A T7 fág gazdabaktériuma az Escherichia coli B/r törzs, amelyet széles körben használnak a laboratóriumi gyakorlatban. A fágok a baktériumon kívül vegetatív állapotban vannak. A fehérjeburokba zárt DNS a fizikai és kémiai hatásoknak jól ellenáll, ami a biológiai doziméterként való felhasználás szempontjából előnyös. A fág gyors és hatékony adszorpciójában a fág farok fehérjéi és a baktérium membrán lipopoliszacharidjai közötti specifikus kölcsönhatás játszik szerepet. A megtapadás után a fág DNS-e aktív folyamattal, de viszonylag lassan jut be a gazdasejtbe és ott szinte azonnal megkezdődik róla a gének átírása, amit már az E. coli RNS-polimeráza végez. Az enzim véletlenszerűen találja meg a fág genom promoterét és kezdi meg az mRNS átírását. A korai gének termékei a sejt riboszómáin szintetizálódnak. Elkészültükkel ezen gének átírása leáll, ami biztosítja, hogy elegendő aminosav álljon rendelkezésre az érést elősegítő és a vázfehérjék szintéziséhez. Ekkor történik a gazdasejt inaktiválása (shutoff) RNS-polimeráza kikapcsolásával és a sejten belüli ion-háztartás eltolódásával. Az E. coli DNS-ét endo- és exonukleázok dezoxinukleozid-monofoszfátokká bontják, amik a fág-DNS szintézisének alapanyagai lesznek. A fág örökítőanyagát saját replikáza készíti. A nukleinsav végein lévő redundáns szekvenciák
segítségével
a
DNS-ek
szuperpolimerekké
kapcsolódnak,
majd
enzimatikusan feldarabolódnak. A fág fehérjéiből előzetesen egy mag áll össze, amire feltekeredik a DNS, majd a fág fej– és farok–fehérjéinek kapcsolódásával befejeződik a nukleinsav–fehérje komplex kialakulása és a fág érési folyamata. A sejt szétesésével a kész fágok szabaddá válnak, sejtenként pár száz fág szintézisével (burst size) lehet számolni (Módos 1993). 4.1.3. A T7 fág tenyésztése Az E. coli B gazdabaktérium elszaporítására glükózzal, kazaminosavval és a növekedés közben fellépő savanyodás pufferolására Na2HPO4-tal dúsított M9 szintetikus tápoldatban kerül sor. A törzs elszaporítása a fokozatos térfogatnövelés elvének alkalmazásával, steril edényekben, 37 °C-os termosztátban történik, a folyamat megfelelő keveréssel és levegőztetéssel hatékonyan gyorsítható. A baktériumok
49
szaporodását fotométerrel a kultúra extinkciójának növekedésével lehet követni. A fág hozam akkor optimális, ha a fertőzés időpontjában a baktériumok növekedési sebessége mellett nagy a baktérium koncentráció is. Ezért a fotométer segítségével az exponenciális szaporodási fázis végére célszerű a fággal történő oltást időzíteni, mégpedig a burst-idő ismeretében úgy, hogy két fág generáció kialakulására legyen lehetőség. Megfelelő multiplicitással (0,02) és jó időben végzett beoltással így a tenyésztés végére gyakorlatilag minden gazdasejt lízist szenved, amit intenzív habzás is jelez (Gáspár és mtsai 1981). A fágok koncentrálásának első lépése a kisózás, amelynek során a hozzáadott 280 g/l (NH4)2SO4 minden fehérje tartalmú részecskét kicsap. Ülepítés és a felülúszó eltávolítása után a baktérium törmelék eltávolítása centrifugálással történik. Ismételt mosást követően magasabb fordulatszámon a fágok kiülepítése után a felülúszóval együtt a kisebb szennyeződések is eltávolíthatóak. A fágok koncentrálása CsCl grádiens centrifugálással lehetséges (Stuber 1982). A centrifuga csőből leszívott kékes színű, viszkózus fágkoncentrátumból felhasználás előtt a CsCl-ot el kell távolítani. Ehhez a tömény oldatot Sephadex NAPTM-5 géloszlopon M9 pufferbe dializáltuk. Az első frakciók pontos fág tartalmát megfelelő higítás után spektrofotométerrel határoztuk meg, felhasználva a 260 nm-en mutatott abszorpciót. A későbbi frakciókkal távozott a CsCl döntő része, ezért használat után a géloszlopot M9 pufferrel alaposan átmostuk. 4.1.4. A T7 fág szerkezete A Podoviridae családba tartozó T7 fág kétszálú DNS-t tartalmazó fehérje struktúra. Mintegy 60 nm-es átmérőjével és 5·107 Da tömegével kis vírusnak tekinthető. Már elektronmikroszkópos felvételek alapján megállapították, hogy fejrészből és az ehhez csatlakozó rövid, hengeres farokból áll. A szerkezet pontosítására kis szögű röntgen és neutron szórás adott lehetőséget. Ismerve, hogy a fej hexagonális vetületet ad, a szóráskép elemzésével megállapítható volt, hogy az ikozahedrális felépítésű. Lehetővé vált a méretek pontosítása és elektron-sűrűség térkép elkészítése (Rontó és mtsai 1983). A 17. ábrán látható szemléltető modell ezen ismeretek alapján készült.
50
A DNS a fág feji részében tömörül és egy hengeres belső magra tekeredve párhuzamos rétegződést mutat. A nukleoszomálishoz hasonló DNS–fehérje kapcsolat miatt a bakteriofágok az eukarióta kromoszóma modelljének is tekinthetőek. A számítási eredmények alapján a DNS a fágon belül erősen hidratált állapotban van és az oldatbelihez közeli B-konformációt vesz fel (Rontó és mtsai 1983) (17. ábra).
17. ábra. A T7 fág felépítése (modell) és a DNS B-konformációja
4.1.5. „Fűtött fág” állapot A nukleoproteinek a hőmérséklet emelésével fázisátalakuláson esnek át, ami a szupramolekuláris szerkezet átrendeződésével jár és az abszorpció változását eredményezi. T7 fág esetében a 260 nm-en mért optikai olvadási görbén 50–60 °C között alakul ki az első lépcső, ami az abszorpció csökkenésében jelentkezik. Az átmenet során a fágok biológiai aktivitásukat is elvesztik. Szobahőmérsékleten sem az életképesség, sem az abszorpció nem áll vissza, az átalakulás tehát irreverzibilis. Az elnyelési spektrum változásai és kis szögű röntgen szórás eredményei alapján a fág szerkezet felbomlása feltételezhető. A szorosan csomagolt szuperhelikális szerkezetű DNS fellazul és a kapszidból fokozatosan kiszabadul. Az örökítőanyag a
51
fűtött fágban az izolált DNS-hez hasonló térszerkezetet vesz fel, de a fág-fehérjékkel való kapcsolata sem vész el teljesen („fűtött fág”) (Fekete és mtsai 1982). A fágfehérjék hatásának tanulmányozására kísérleteinkben M9 foszfát pufferben 30 perces 65 °C-os hőkezeléssel állítottunk elő „fűtött fág”-okat. 4.1.6. T7 DNS A T7 fág örökítőanyaga kettős szálú, lineáris DNS. Az egyik elsőként feltérképezett genom, szekvenciája 1983 óta teljes egészében ismert (Dunn és Studier 1983). Ma már az interneten is hozzáférhető a National Center for Biotechnology Information GenBank szerverén (accession number: NC_001604). 39 937 bázispárból áll és 60 proteint kódol. A gének mind ugyanarról a szálról íródnak át, így funkciójuk és átírásuk sorrendje alapján számozták be őket. Az I. osztályba tartozó gének íródnak át elsőként a gazdasejtben és annak anyagcseréjét módosítják. A II. osztály a T7 DNS replikációjáért felelős, míg a III. osztály tagjai szerkezeti és érési fehérjéket kódolnak. A sejtbe jutás után az E. coli RNS-polimeráz végzi a fág saját RNS-polimerázának (gp 1) átírását, ami aztán a további mRNS szintézist végzi. A genom 92%-át esszenciális géneket kódoló szekvenciák teszik ki, a fennmaradó rész főleg strukturális szerepet tölt be (Studier és Dunn 1983). A kis génszám és a kevés redundancia miatt ezért gyakorlatilag bármilyen lézió letálisnak tekinthető és a fág biológiai aktivitásának (tarfoltképző képességének) elvesztését okozza. Ezt támasztja alá, hogy a dózis–hatás görbék stochasztikus sérülésekre jellemzőek, egytalálatos jellegűek és a túlélés egyszerű exponenciális csökkenést mutat (Rontó és mtsai 1967). 4.1.7. T7 biológiai dózis és mérése A fág által elszenvedett biológiai dózist (HT7) a definíció értelmében az alábbi képlet szerint számíthatjuk (Rontó és mtsai 1992). BED = | ln (N/N0) | [HT7]
52
Ahol N0 és N az expozícó előtt és az expozíció után az aktív fágok száma. A T7 dózis (HT7) egységnyi, ha a fágok élőszáma e-ed részre csökken. Az aktív fágok számát az E. coli gazdasejten mutatott tarfoltképző képességgel, klasszikus Gratia-titrálással határoztuk meg (Rontó és mtsai 1992). A meghatározandó élőszámú mintából M9 pufferrel higítási sort készítettünk, az egyes lépésekben 100-szoros higítást alkalmazva. A minél pontosabb mérés kedvéért a feltételezett optimális higítás értéket 10-szeres lépésekkel közelítettük meg. Az előző éjszakán elszaporított gazdasejtek oldatához a fág higítási sor elemeiből azonos mennyiségeket mértünk. Megolvasztott táptalajjal keverve az elegyet azonnal korábban elkészített Bouillon-agar tartalmú Petri-csészékbe szélesztettük. 37 °C-os termosztátban 1,5–2 óra inkubáció után a baktériumok egyenletes fedettségű pázsitban elszaporodtak. A fágok által megfertőzött és lizált sejteknek megfelelően átlátszó udvarok alakultak ki. Ezeknek a tarfoltoknak a manuális megszámlálása és a használható tarfoltszámok átlagolása után a higítások ismeretében a minta élőszáma meghatározható volt. A mérési hiba csökkentése érdekében mindig három párhuzamos titrálást végeztünk, amit kívülről bekerült fágok hatásának kizárása végett negatív kontrollal egészítettünk ki.
4.2. MINTAKÉSZÍTÉS 4.2.1. Fág szuszpenzió A
dúsított,
dializált
fág
törzsoldat
koncentrációját
Unicam
UV/VIS
spektrofotométerrel határoztuk meg. 260 nm-en OD=1 megfelel 1012/ml fág partikulumnak. A mérésnél használt higítás ismeretében számítottuk ki a céloldat összeállításához szükséges fág oldat mennyiséget, amit a céltérfogatra M9 pufferel egészítettünk ki. Az itt használt M9 puffer összetétele: 20mM NH4Cl, 40 mM Na2HPO4, 20 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, pH 7,0.
53
4.2.2. DNS oldat A fágból DNS izolálására használt hagyományos fenol–kloroformos technikák nem bizonyultak minden esetben alkalmazhatónak. Az így nyert DNS kezeletlen állapotban is műtermékeket tartalmazott és a polimeráz láncreakcióban nem adott megbízható eredményeket. Ezért új, kíméletesebb eljárást dolgoztunk ki Na-dodecilszulfát (SDS) és KCl felhasználásával (Fekete és mtsai 1998). 500 µl OD=2–3 fág oldatot 50 µl 5%-os SDS oldattal 65 °C-on 30 percig rázógépben inkubáltunk. Az SDS a fág-fehérjékhez kötődött, ezt a komplexet 100 µl 4M-os KCl oldat hozzáadásával jégen 30 perc alatt kicsaptuk, majd 10 perces 13000 RPM centrifugálással eltávolítottuk. A DNS-t tartalmazó felülúszót tiszta Eppendorf csövekbe töltöttük át. A DNS-t kétszeres mennyiségű tömény alkohollal kicsaptuk. A csapadék képzést 50 µl 5M NaCl oldat hozzáadásával és/vagy pár perces jegeléssel lehet segíteni. 10 perces 13000 RPM centrifugálás után a felülúszót eltávolítottuk, a DNS csapadékot pedig 70%-os etanollal és újabb centrifugálással két lépésben mostuk. A DNS csapadékot egy éjszaka alatt szobahőn beszárítottuk, majd másnap 2–300 µl 0,1 TE (1 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,4) pufferben vettük fel. Megfelelő oldódási idő után az oldat koncentrációját a 260 nm-es hullámhosszon mért optikai denzitással (OD260) határoztuk meg. OD260=1 érték 50 ng/µl DNS-nek felel meg, a moláris extinkciós együttható: ε260=7,3·103 (mol/l) nukleotid bázis cm-1. A tisztaságot az izolátumban található fehérje/DNS arányra jellemző OD280/OD260=0,52 és OD230/OD260=0,45 arányokkal ellenőriztük. A kiindulási DNS sérülésmentességéről agaróz gélelektroforézissel győződtünk meg. A DNS oldatokat felhasználásig -14 °C-on tároltuk. 4.2.3. DNS és fág vékonyrétegek Mivel a világűrben az oldatokkal való munka nehezen kivitelezhető, és mert a vákuumkezelés hatásait is vizsgálni kívántuk, a kutatócsoport fág és DNS vékonyréteg készítési eljárást dolgozott ki. A módszer alapját a DNS vákuum-UV tartománybeli spektrumának méréséhez használt technológia jelentette (Földvári és mtsai 1982).
54
Fág vagy izolált DNS oldatát 0,01–0,1 M NaCl vagy LiCl oldattal higítottuk (≈5–20 ng/µl DNS). Etanol hozzáadásával megközelítettük a DNS kicsapásához szükséges koncentrációt (kb. 50%). A keletkezett kvázi–kolloid oldatban az etanol koncentrációját több lépésben, kb. 80%-ig emeltük (Potaman és mtsai 1980). A kicsapódó részecskéket erre a célra kialakított centrifuga csövekben centrifugálással (11000 g, 3x20 perc) teflongyűrűben elhelyezett kvarc lapkára ülepítettük. A
keletkezett
vékonyrétegek
homogenitását
és
egyenletes
fedettségét
spektrofotometriával, polarizációs és fáziskontraszt mikroszkóppal (Olympus SM20, Reichert Me F2) ellenőriztük. A vékonyrétegek vastagsága a kiindulási fág/DNS koncentráció függvényében változtatható 20–200 nm között. A vékonyrétegeket általában szendvics formában kezeltük. Légmentesen záródó mintatartó szelencékben a fág/DNS réteget két kvarc korong közé zártuk. A szelence házának két fele egymásba menettel illeszkedik, a tökéletes szigetelést gumi gyűrű biztosítja (18. ábra). A mintatartó megfelel a világűrbeli követelményeknek és illeszkedik az EXPOSE egység számára kialakított nyílásaiba.
18. ábra. Mintatartó szelence a valóságban (bal alsó sarok) és számítógépes modellje (nagy kép)
Különböző kezelések után a következmények vizsgálatához a fág vékonyrétegeket M9 pufferben (20mM NH4Cl, 40 mM Na2HPO4, 20 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, pH 7,0), a DNS-t TE pufferben (1 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,4) oldottuk. Ehhez rendszeres ellenőrzés mellett, zárt edényben gyakran napokra volt szükség. A kvarc korongon visszamaradt anyag mennyiségét spektrofotométerrel követtük. Az oldott minták minőségét azok spektrumával és gélelektroforézissel ellenőriztük.
55
4.2.4. A DNS konformáció befolyásolása A jelenlévő fág-fehérjék UV sérülést befolyásoló hatásának tisztázására kísérleteket végeztünk fágon belüli DNS, izolált DNS és „fűtött fág” felhasználásával. Az örökítőanyaggal kölcsönhatásban lévő fehérjék fontos szerepet játszanak a DNS térszerkezetének befolyásolásában, ezért megvizsgáltuk a DNS UV sérülését különböző konformációs állapotokban is. A T7 DNS oldatához emelkedő koncentrációban etanolt adva a DNS konformáció-változást
szenved.
0
tömegszázalék
etanol
tartalom
mellett
az
örökítőanyag B-konformációt vesz fel. 60%-nál a C-konformációhoz hasonló a struktúra, 80% etanol jelenlétében pedig A-konformáció alakul ki (Girod és mtsai 1973, Patrick és Gray 1976). Az izolált DNS-hez foszfát pufferben (10 mM Na2HPO4, 1 mM Na2EDTA, 180 mM NaCl, pH 7,0) a szükséges mennyiségű vegytiszta tömény alkoholt (Aldrich) hozzáadva készültek a besugárzandó minták. Denaturált DNS-t az M9-ben készített oldat 90 ºC-on 30 percig tartó hőkezelésével állítottunk elő. Vékonyrétegeken a DNS térszerkezetét a relatív páratartalom (relative humidity – r.h.) befolyásolja. NaDNS 92 % relatív páratartalom felett B-konformációt vesz fel. 45–92% r.h.-nál A-konformáció a jellemző, igen száraz levegőben pedig D-állapot (rendezetlen szerkezet) áll elő. A LiDNS film ettől eltérően viselkedik, a relatív páratartalom emelésével 65% r.h.-nál a C-konformáció B-be megy át, de további változás nem történik (Lindsay és mtsai 1988, Tao és mtsai 1989). Kísérleteink során az egyes konformációs állapotokat a relatív páratartalom és a Na/Li koncentráció módosításával állítottuk elő. Ehhez különböző szervetlen sók telített oldatát használtuk fel. Az oldatokkal egyensúlyt tartó légtérben a relatív páratartalom csak a só típusától (és kis mértékben a hőmérséklettől) függ (3. táblázat). A mintákat zárt edényben, szobahőmérsékleten az egyensúly beálltáig, legalább három napig a telített oldattal egy légtérben inkubáltuk (Falk és mtsai 1962, Maestre 1970).
56
3. táblázat. A DNS konformáció beállítása különböző relatív páratartalmat biztosító sóoldatokkal
Konformáció
Telített só
Páratartalom
NaDNS – B
NaH2PO4 x 12 H2O
95% r.h.
NaDNS – A
(NH4)2SO4
81% r.h.
NaDNS – D
P2O5
0% r.h.
LiDNS – B
(NH4)2SO4
81% r.h.
LiDNS – C
MgCl2
34% r.h.
4.3. A MINTÁK KEZELÉSE 4.3.1. Oldatok besugárzása A besugárzáshoz használt minták koncentrációját egységesen OD260=0,5-re vagy 1-re állítottuk be intakt T7 bakteriofág, „fűtött fág” és izolált DNS esetében is. 5 ml-es térfogatokat párhuzamosan sugaraztunk be 9 cm átmérőjű Petri-csészékben, amelyekben az oldatok vékony, kb. 0,7 mm vastagságú rétegben terültek szét. Esetenként a besugárzást küvettában, keverés mellet végeztük. A kezeléshez öt különböző UV sugárforrást használtunk. UVC forrásként egy 1 W/m2 -es teljesítmény-sűrűségű 15 W-os Tungsram germicid lámpa szolgált. UVB forrásként 100 W-os Philips TL01-es és 20 W-os FS20-as lámpákat használtunk. A napszimulátor 2,5 kW-os Oriel Xe lámpából és az ezt kiegészítő 5 mm-es WG 305-ös üveg szűrőből állt. Az így előállított sugárzás összetételében megközelítette a 200 DU vastagságú ózonrétegen áthaladó napsugárzás spektrumát. A környezeti napsugárzás hatását Budapest belvárosában, a Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézetének tetején besugárzott mintákon vizsgáltuk. Az egyes UV források biológiailag hatásos irradianciája az Eeff = Σ Eλ Sλ Δλ összefüggés felhasználásával volt meghatározható. A mesterséges források spektrális irradianciáját Optronic 742-es spektroradiométerrel, a Napét Brewer spektroradiométerrel a kutatócsoport korábban megmérte. A spektrális irradianciát a T7 fág hatásspektrumával súlyozva állt elő az Eeff (Fekete és mtsai 1998, Módos és mtsai 1999). Az egyes forrásokat jellemző effektív hullámhossz-tartományok (λeff értékek) a 4. táblázatban, valamint a 19. ábrán találhatóak.
57
19. ábra. Öt különböző UV forrás biológiai hatékonysági spektruma (Módos és mtsai 1999 nyomán)
Az alkalmazandó besugárzási idő meghatározásához a T7 fág biológiai doziméteren besugárzás után HT7 egységekben kapott BED értékeket használtuk fel. A különböző sugárforrások esetében kapott értékek (4. táblázat) ismeretében olyan besugárzási időket számítottunk, amik HT7= 2, 4, 6, 8, 10 biológiai dózisnak feleltethetők meg. 4. táblázat. Öt különböző UV forrás effektív hullámhossztartománya és dózis-teljesítménye
germicid
TL01
FS20
szimulátor
napsugárzás
λeff [nm]
254
275–315
280–300
285–305
300–320
HT7 / s
0,133
0,0055
0,024
0,0007
0,001
4.3.2. Vékonyrétegek űrszimulációs kezelése A Nemzetközi Űrállomás fedélzetére tervezett kísérleteknek előzetesen földi előkísérleteken kell átesniük. Az ESA által megkívánt Experiment Verification Test az EXPOSE egység esetében különösen fontos, mert a minták legalább egy évig a világűrben maradnak. A minták űrszimulációs kezelését a Deutsches Zentrum für Luft-
58
und Raumfahrt (DLR) kölni laboratóriumában és az Osztrák Tudományos Akadémia grazi Űrkutatási Intézetében végeztük, nemzetközi együttműködés keretében. A vákuum hatását vákuumkamrában egy hétig 10-4–10-6 Pa nyomáson, nyitott mintatartó szelencéken vizsgáltuk (EVT1). Egy kőzetdarab vagy egy űrjármű felszínén a hordozó test mozgása miatt a biomolekulák hol a nappali oldalra, hol árnyékba kerülnek. A Nemzetközi Űrállomáson is jelentős hőmérséklet különbség alakulhat ki a nappali és az éjszakai oldal között. Vákuum és emelkedett hőmérséklet kombinált hatásának vizsgálatához (EVT2) a minták az 1V2 program szerinti hőkezelésben részesültek: 1 hét 40 ºC, 1 nap 60 ºC, 1 hét 40 ºC. A 0 ºC körüli hőmérsékleti oszcillációt a 2V1 program szimulálta: 1 óra +20 ºC, 1 óra -20 ºC, 1 héten keresztül (20. ábra).
20. ábra. 1V2 és 2V1 kezelések hőmérsékleti profiljai
Az űrbeli UV sugárzás szimulálására sugárforrásként 1 W/m2-es teljesítménysűrűségű 15 W-os Tungsram germicid lámpát és egy λ = 200–400 nm között emittáló, 479,24 W/m2/nm irradianciájú napszimulátort (SOL 2000, 21. ábra) használtunk. A forrást semleges szűrőkkel kombinálva lehetőség nyílt a legkisebb detektálható és a legnagyobb tolerálható dózis meghatározására is (EVT3).
59
21. ábra. A SOL 2000-es napszimulátor spektruma (DLR)
4.4. A KIÉRTÉKELÉS MÓDSZEREI 4.4.1. Spektrofotometria A minták elnyelési színképét kétutas Unicam UV/VIS spektrofotométerrel határoztuk meg. A legtöbb mérés a 200–400 nm-es tartományban történt, ami tartalmazza a DNS 260 nm-nél mutatkozó elnyelési csúcsát és annak környezetét. Az oldatokat 1 ml-es vagy 3 ml-es kvarc küvettában mértük. A referencia fényútba az alkalmazott puffer, vagy differencia spektrumok esetében a kezeletlen minta került. Vékonyrétegeknél az alapvonalat üres mintatartó szelencével határoztuk meg. Az adatok kiértékelése részben Vision 3.4. programmal, részben Excel táblázatkezelővel történt. A spektrumokat a mérési műtermékek, elsősorban a fényszórás miatt korrigálni kellett. Erre részben a 350 és 400 nm-nél mért OD-t használtuk, ahol mintáink egyik komponense sem mutatott mérhető elnyelést, viszont a fényszórás gyengülést okozhatott a mintán áthaladó fénysugárban. A korrekcióra az irodalomban elterjedten használt Rayleigh-Mie képletet (E = kλ-n) alkalmaztuk ’k’ és ’n’ konstansok tapasztalati illesztésével (Fekete és mtsai 2003).
60
4.4.2. Gélelektroforézis A DNS épségét, száltöréseit és a polimeráz láncreakció eredményét agaróz gélelektroforézissel vizsgáltuk. A gélek készítéséhez nagy tisztaságú agarózt (Sigma) 0,5 µg/ml etídium-bromiddal (Sigma) kiegészített, forrásban lévő TBE (90 mM Tris, 90 mM bórsav, 2 mM EDTA, pH 8,0) pufferben oldottunk. Az oldatot a gélöntő formában hagytuk megdermedni. A felhasználási céltól függően 0,5 – 1 – 2 tömegszázalékos géleket kihűlés után használtuk (Sambrook és mtsai 1989). A megfelelően higított mintákat 40% szukrózt és brómfenolkéket tartalmazó házi vagy gyári géltöltő oldattal alaposan összekeverve 10–20 µl közötti végtérfogatban töltöttük a gél egyes lyukaiba. Mintáink mellett minden esetben egy standard „létrát” is futtattunk, amely különböző, ismert hosszúságú láncokat tartalmazott. Ez segítette a vizsgált mintában lévő fragmensek hosszának pontosabb megállapítását. Az 1 kB standard 500–10000 bp közötti szabályos hosszúságú fragmenseket tartalmazott, a λ HindIII pedig λ bakteriofág Hind III endonukleázzal emésztett DNS-ét (22. ábra, NEBcutter). A futtatást MINI-H800-as horizontális elektroforézis készülékben végeztük 85 V-on ≈1,5 óráig.
22. ábra. Hind III endonukleázzal emésztett λ fág – standard (NEBcutter)
A semleges gélen kettős szálú DNS törések vizsgálatára nyílik lehetőség. Emellett a közvetlenül a besugárzás/vákuum által keltett és az egyes hibahelyeknél specifikusan hasító enzimek által létrehozott egyszálú törések is meghatározhatóak; lúgos gélen a DNS denaturálódik és az egyes szálak egymástól függetlenül vizsgálhatóak. A szálak szétválását 37 °C-on 30 percig 50 mM NaOH-dal történő lúgosítással értük el, majd az oldatot gélelektroforézis előtt azonos mennyiségű HCl-dal semlegesítettük (Sambrook és mtsai 1989).
61
Az elektroforézis pufferben lévő etídium-bromid a DNS bázisai közé interkalálódik és UV átvilágító (Sigma T2201) felett a jelenlévő DNS mennyiségével arányos fluoreszcenciát mutat. A kvantitatív kiértékeléshez a gélekről megfelelő szűrővel készült fénykép felvételeket digitalizáltuk. DS-34 Polaroid kamerával Polapan 665 P/N filmre (Sigma) készített felvételek negatívját Bio-Rad GS-690 Densitometer Imaging System készülékkel beszkeneltük. A DNS mennyiségével arányos feketedések meghatározása MultiAnalyst/PC programmal történt. Később a felvételeket Olympus digitális fényképezőgéppel készítettük, a kiértékelést pedig az intézetben Dr. Módos Károly által írt szoftver segítette. A DNS-ben kialakult törések gyakoriságának meghatározását a mintát jellemző átlagos fragmenshossz számítására lehet visszavezetni (Sutherland és mtsai 2003). Φ az egy kilo/mega/bázispárra eső törések száma.
Ahol M a mintában kialakult törések száma, Nbp pedig a mintában megtalálható kilo/mega/bázispárok száma. NT (treated) és NU (untreated) a mintában kezelés után és kezelés előtt megtalálható fragmensek száma, tehát M = NT-NU. A kezelés utáni (LT) és a kezelés előtti (LU) mintákban az átlagos fragmenshossz:
Az átlagos fragmenshossz a futtatás irányában kialakult fluoreszcencia intenzitáseloszlás integráltjából számítható, ami ismert hosszúságú fragmensek vándorlási sebességének (a standard-ek mobilitásának segítségével) felhasználásával a felvételek alapján meghatározható (Freeman és mtsai 1986). A törések gyakoriságára tehát azt kapjuk, hogy:
62
4.4.3. Specifikus enzimatikus emésztés A kettős szálú és egyszálú DNS töréseken kívül más típusú fotosérüléseket is kimutattunk, ciklobután-pirimidin-dimerek (CPD) és apurinezett/apirimidinezett (AP) helyek meghatározásához specifikus endonukleázokat használtunk. A T4 bakteriofág endonukleáz V. enzime (Endo V., Epicentre Technologies) felismeri a CPD-ket és a foszfodiészter kötést a dimer közepén felhasítja. Az E. coli nfo génről klónozott endonukleáz IV. (Endo IV., Epicentre Technologies) pedig az AP helyek szomszédságában hasít. A mintákat feleslegben adott enzimmel 30 percig 37 ºC-on inkubálva biztosítható, hogy a hasítás valamennyi sérülésnél megtörténjen, de műtermékként ne keletkezzenek aspecifikus száltörések. Az enzimek inaktiválását proteináz-K és EDTA hozzáadásával végeztük. A DNS-hez kapcsolódó fehérje maradványokat végül SDS-sel történő inkubációval távolítottuk el (Sutherland és mtsai 2000). A vizsgált típusú fotosérüléseknél így kialakított egyszálú töréseket lúgos gélen kvantifikáltuk. Az eredményt az emésztetlen mintákban detektált száltörések figyelembe vételével értékeltük (Freeman és mtsai 1986). 4.4.4. DNS–fehérje keresztkötések meghatározása Az UV/vákuum kezelés hatására kialakult kovalens DNS–fehérje keresztkötések meghatározására
a
korábban
DNS–topoizomeráz
komplexek
kvantifikálására
kidolgozott módszer továbbfejlesztett változatát használtuk (Zhitkovich és Costa 1992). A mintákat 0,5 % SDS jelenlétében 65 °C-on rázógépben inkubáltuk. Az anionos detergens SDS a fehérjékhez kötődött, de a szabad DNS-hez nem. KCl hozzáadásával SDS–KCl csapadékot képeztünk, amit a fehérjével keresztkötött DNS-sel együtt centrifugálással elkülönítettünk. A fehérjével keresztkötésben lévő DNS így a csapadékba került és a felülúszóban maradt szabad DNS-től könnyen elválaszthatóvá vált. A csapadékkal távozó DNS mennyisége tehát megadta a DNS–fehérje keresztkötések számát.
63
4.4.5. A DNS sérülése T7 fágok túlélése alapján Az UV/vákuum kezelés a fágok életképességének csökkenését eredményezi. Definíció szerint egységnyi (HT7=1) a T7 biológiai dózis akkor, ha a fágok biológiai aktivitása, vagyis E. coli gazdasejten mutatott tarfoltképző képessége e-ed részére csökken, azaz –ln N/N0 = 1. A fágok biológiai aktivitását kezelés előtt (N0) és kezelés után (N) Gratia-titrálással határoztuk meg. A T7 fág örökítőanyagának több mint 90%-a esszenciális gén, ezért bármely sérülés letálisnak tekinthető. Az inaktiváció tehát egy találatos alapon történik. Ha a sérülések egymással egyenértékűek (valamennyi a fág pusztulását okozza), egymástól függetlenül alakulnak ki és véletlen eloszlást követnek a populációban, akkor a folyamatot Poisson-egyenlettel lehet leírni. A k darab sérülést tartalmazó fágok előfordulása:
ahol λ az átlagos fotoproduktum frekvencia. Mivel biológiai aktivitásukat csak a sértetlen fágok őrzik meg, ahol k = 0, ezért esetünkben az összefüggés nulladrendű formájára egyszerűsödik: f (0, λ) = e-λ. Mindkét oldal logaritmálása után a fágonkénti átlagos fotoproduktum frekvenciára kapjuk: λ = - ln N/N0. A fentiek értelmében tehát a biológiai dózis ebben az esetben éppen megadja a fágonkénti átlagos sérülésszámot. Ez is alátámasztja, hogy a T7 dózist célszerűen választották. Az összefüggés érvényességét megerősíti az a tapasztalati tény, hogy a fágok túlélése a dózis függvényében valóban egy találatos exponenciális csökkenést mutat (Rontó és mtsai 1992). Egységnyi T7 dózis ezért a populációban átlagosan 1 sérülés / fág -nak felel meg. A fágok önmagukban nem mutatnak biológiai aktivitást, ezért a sérülések felhalmozódnak. Az E. coli gazdasejtek azonban hatékony mechanizmusokkal rendelkeznek a DNS sérülések kijavítására. A gazdasejt repairt 400 mg% koffein hozzáadásával blokkolva és az inaktivációs görbéket analizálva a hibajavítás hatákonysága meghatározható volt: β ≈ 0,5. Vagyis 1 detektált sérülés megfelel 2 DNS sérülésnek a gazdasejt reparáció előtt (Rontó és mtsai 1967).
64
4.5. POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ 4.5.1. A PCR működése DNS sérülések detektálására polimeráz láncreakción alapuló kvantitatív módszert (QPCR) dolgoztunk ki. A reakció lényege, hogy viszonylag rövid idő alatt néhány molekula nukleinsav kiválasztott szakaszáról nagy számú másolat készül (Mullis és mtsai 1986). A sokszorosítás függ a minta bázissorrendjétől, például egyes hibahelyek meglététől vagy hiányától is, így a reakcióval a DNS szekvenciája is elemezhető. A PCR során a DNS hődenaturálással szétválasztott két szálához egymástól adott távolságra, alacsonyabb hőmérsékleten komplementer szekvenciájú, mesterségesen szintetizált rövid oligonukleotidok, primerek kapcsolódnak. Egy PCR-hoz két primer szükséges, ezeket úgy választjuk meg, hogy a sokszorozni kívánt szekvencia két végére essenek. A primerektől indulva a DNS-függő DNS-polimeráz elvégzi a kiegészítő szál szintézisét. A reakcióelegyet ismét felfűtve a kópiaszám minden ciklusban megduplázható. Kezdetben a DNS szintéziséhez az E. coli DNS-polimeráz-I Klenowfragmensét használták, ezt az enzimet azonban a DNS denaturálásához szükséges hőmérséklet inaktiválja, ezért minden ciklus friss enzim hozzáadását igényelte. Az eljárást a Thermus aquaticus-ból izolálható hőstabil Taq DNS-polimeráz (23. ábra, ExPASy) forradalmasította, amely 95 ºC-on is megőrzi aktivitását (Saiki és mtsai 1988). Mi a kísérleteinkhez AmpliTaq Gold enzimet használtunk.
23. ábra. A Taq DNS-polimeráz röntgen-diffrakcióval meghatározott térszerkezete (ExPASy)
65
A folyamat általában ≈35 ciklusból áll. Mindegyik ciklus 3 lépésre osztható (24. ábra):
24. ábra. A polimeráz láncreakció sémája
1. denaturálás: A DNS olvadáspontja feletti hőmérsékleten a hidrogén-hidak felhasadnak és a dupla szálú DNS szálai szétválnak egymástól, hőmérséklet 95 ºC körül, kb. 0,5 perc. 2. anneálás: A primerek a DNS szálakhoz kötődnek, 35–60 ºC-os hőmérsékleten, kb. 0,5 perc. A pontos hőmérséklet a választott primerek olvadáspontjához igazodik. Érdemes olyan primerekkel dolgozni, amiknek a hossza, GC-tartalma és olvadáspontja egymáshoz közel esik. Az anneálási hőmérséklet emelésével a reakció specificitása csökkenthető. 3. extenzió: Itt történik a DNS szintézise. A primerek képezik a kiindulási pontot, a reakció során ezek meghosszabbodva (extendálódva) képezik a DNS új komplementer szálát, így a kiindulási DNS megkétszereződik. A hőmérséklet 72 ºC körüli, pontos
66
értéke az alkalmazott polimeráz működési optimumától függ. Az extenziós lépés időtartamát nagyban befolyásolja az amplifikálni kívánt fragmens hossza. Több komplementer bázis beépítéséhez több időre van szükség. A PCR berendezés a reakcióelegyet előre megírt program alapján adott ideig adott hőmérsékleten tartja. Az egyik primer az egyik, a másik a másik DNS szálhoz tud kötődni. DNS-szintézis (írás) mindig 5’→3’ irányban történik, így a szétváló DNS mindkét láncán a keresett szakaszról készül kópia. Minden másolatról készül másolat, tehát a DNS mennyisége ciklusonként megkétszereződik, azaz a kívánt hosszúságú szálak száma exponenciálisan nő (Sambrook és mtsai 1989). A DNS-ben keletkező fotoléziók meghatározására a PCR kiválóan alkalmas, mert a replikációt a DNS sérülései gátolják, és mert a módszer exponenciális természetéből adódóan rendkívül érzékeny. A sérülések száma a kezeletlen DNS-sel való összehasonlításból számszerűleg megállapítható. A polimeráz láncreakciót már eddig is sikerrel alkalmazták sugárzás és vegyszerek által okozott DNS sérülések detektálására (Jean és mtsai 2001, Jenkins és mtsai 2000, Jennerwein és Eastman 1991, Kumar és mtsai 2004, McCarthy és mtsai 1996, Oshita és Eastman 1993, Yoshida és Regan 1997a, Yoshida és Regan 1997b). 4.5.2. A primerek A T7 fág 39 937 bázispárjának teljes DNS szekvenciája ismert (Dunn és Studier 1983), ezért internetes adatbázis felhasználásával egy rövidebb (≈500 bp) és egy hosszabb (≈4000 bp) fragmenshez kerestünk 20 bp körüli primereket az MIT (Massachusetts Institute of Technology) Primer3 program segítségével. A GenBank szerverről letöltött genomot FASTA formátumban vittük át a primer tervező programba. A javasolt primerek által közrefogott szekvenciát a European Bioinformatics Institute (EBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) programjával aminosav sorrenddé fordítottuk és a UniProt/SwissProt fehérje adatbázisból meghatároztuk, hogy a PCR a T7 genom mely génjeiben fog dolgozni.
67
A számítógép által választott különböző primer párokból végül is a fág 1. génjén elhelyezkedő 555 bázispár és a 2–4. gén közötti 3826 bázispár hosszúságú fragmenshez választott oligonukleotidokkal sikerült a PCR reakciót optimalizálni. 555 bp: 4453 – 5008 bp közti szekvencia, a választott primerek (25. ábra): 4453F: 5’– CTGTGTCAATGTTCAACCCG – 3’ 5008R: 5’– GTGCCCAGCTTGACTTTCTC – 3’
4441 4501 4561 4621 4681 4741 4801 4861 4921 4981
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> GTCGTGTTTACGCTGTGTCAATGTTCAACCCGCAAGGTAACGATATGACCAAAGGACTGC TTACGCTGGCGAAAGGTAAACCAATCGGTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGAAAATCCACG GTGCAAACTGTGCGGGTGTCGATAAGGTTCCGTTCCCTGAGCGCATCAAGTTCATTGAGG AAAACCACGAGAACATCATGGCTTGCGCTAAGTCTCCACTGGAGAACACTTGGTGGGCTG AGCAAGATTCTCCGTTCTGCTTCCTTGCGTTCTGCTTTGAGTACGCTGGGGTACAGCACC ACGGCCTGAGCTATAACTGCTCCCTTCCGCTGGCGTTTGACGGGTCTTGCTCTGGCATCC AGCACTTCTCCGCGATGCTCCGAGATGAGGTAGGTGGTCGCGCGGTTAACTTGCTTCCTA GTGAAACCGTTCAGGACATCTACGGGATTGTTGCTAAGAAAGTCAACGAGATTCTACAAG CAGACGCAATCAATGGGACCGATAACGAAGTAGTTACCGTGACCGATGAGAACACTGGTG AAATCTCTGAGAAAGTCAAGCTGGGCACTAAGGCACTGGCTGGTCAATGGCTGGCTTACG <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<
25. ábra. A 4453F és 5008R primerek által amplifikált 555 bp-os fragmens (Primer3)
3826 bp: 10119 – 13944 bp közti szekvencia, a választott primerek (26. ábra): 10119F: 5’– GTCGCTCACACAAGGGGTAT – 3’ 13944R: 5’– AACTTTAGGGTCACGCATGG – 3’ No mispriming library specified Using 1-based sequence positions OLIGO start len tm LEFT PRIMER 10119 20 60.00 RIGHT PRIMER 13944 20 59.99 SEQUENCE SIZE: 39937 INCLUDED REGION SIZE: 39937
gc% 55.00 50.00
any 2.00 4.00
3' seq 2.00 GTCGCTCACACAAGGGGTAT 2.00 AACTTTAGGGTCACGCATGG
PRODUCT SIZE: 3826, PAIR ANY COMPL: 3.00, PAIR 3' COMPL: 0.00
26. ábra. A Primer3 által javasolt 10119F és 13944R primerek (Primer3)
A primereket az Integrated DNA Technologies, Coralville, IA. szintetizálta gél tisztítással. A liofilizált formában szállított primereket steril desztillált vízben oldottuk, koncentrációjukat az abszorpciós spektrum alapján meghatároztuk, majd több részre osztottuk, és mélyhűtőben tároltuk.
68
4.5.3. A QPCR paraméterei A polimeráz láncreakció minden egyes paraméterét empírikusan optimalizálni kellett abból a célból, hogy a módszer kvantitatív legyen és alkalmazása megfeleljen a biológiailag
releváns
dózistartománynak.
Az
optimalizálást
az
irodalomban
megtalálható irányelvek (Robertson és Walsh-Weller 1998) figyelembevételével mindkét fragmensre elvégeztük: kiterjesztettük a primerek, a nukleotidok, a DNSpolimeráz és a MgCl2 koncentrációira, és a denaturálás, az anneálás és az extenzió hőmérsékletére és idejére. Mivel célunk kvantitatív PCR kidolgozása volt, ezért feltétlenül biztosítani kellett az optimális ciklusszámot, hogy a sokszorozás az exponenciális szakaszban érjen véget, ahol a termék mennyisége szempontjából a kiindulási DNS-koncentráció az egyetlen limitáló tényező. Az egyes reakciók összehasonlíthatóságának érdekében a kiindulási DNS épsége kritikus. A konvencionális DNS izolálási módszer nem eredményezett konzisztens PCR eredményeket, ezért a fenol–kloroformos eljárás helyett az újonnan beállított, kíméletesebb SDS–KCl-os módszert alkalmaztuk. 0,2 ml-es, vékony falú PCR csőben (Applied Biosystems), 12,5 μl térfogatban végeztük a reakciókat. Minden esetben master mix-et készítettünk: Amicon szűrőn szűrt steril desztillált víz, gyári PCR puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 1,5 mM MgCl2, 0,01 wt/vol% zselatin és 0,1%Triton X-100; Perkin Elmer Cetus, Budapest), 200 μM dNTP, 1 U AmpliTaq Gold polimeráz, és 2 μM 4453F és 5008R primer (555 bp fragmens), illetve 0,08 μM 10119F és 13944R primer (3826 bp fragmens). A PCR reagensek az Applied Biosystems-től érkeztek. A master mix-et szétosztottuk és hozzáadtuk a különböző mintákat: T7 DNS-t vagy intakt fágot (kezeletlen vagy kezelt). A csöveket Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2700 thermocycler központi helyeire tettük. Minden egyes reakciót 4 különböző csőben párhuzamosan futtattunk, amiket később átlagoltunk.
69
Az optimalizált program: 95 ºC, 12 perc (AmpliTaq Gold polimeráz aktiválás); 95 ºC, 30 s (denaturálás); 58 ºC, 30 s (anneálás); 72 ºC, 1 perc (555 bp fragmens) vagy 4 perc (3826 bp fragmens) (extenzió), 30 ciklus. A program lejárta után a hőmérséklet 4 ºC-ra állt be. A reakciót sikerült olyan robosztussá tenni, hogy teljes T7 fágot téve a reakcióelegybe is megbízható és reprodukálható eredményeket kaptunk mindkét fragmens esetében. 4.5.4. Kvantitatív kiértékelés A PCR termék kvantifikálását 2%-os agaróz gélen történt elektroforézis után a felvételek digitalizálásával végeztük. A kvantitatív PCR alapelve, hogy mivel a sérülések gátolják a polimeráz munkáját, az amplifikált DNS mennyisége csökken a nem sérült DNS-hez képest. Mindez akkor számszerűsíthető, ha a termék szempontjából a kiindulási DNS-koncentráció volt az egyetlen limitáló tényező. Ezt a reakció optimalizálásával igyekeztünk biztosítani, és érvényességét a kezeletlen minta és kétszeres higításának párhuzamos amplifikációjával ellenőriztük. A PCR termékeket a kezeletlen mintához viszonyítva normalizáltuk, azt véve 100%-nak. Több, egymástól független mérés PCR termékének átlagát és szórását a dózis függvényében ábrázoltuk. A szálankénti átlagos sérülésszám meghatározásához feltételeztük, hogy a sérülések egymással egyenértékűek, egymástól függetlenül és véletlenszerűen alakulnak ki. Ilyen esetben a valószínűségszámításból ismert nulladrendű Poisson-összefüggés a sérülést nem tartalmazó molekulákra: f (0, λ) = e-λ, vagyis a szálankénti átlagos sérülésszám a λ = - ln A/A0 képlettel számítható. Itt a kezelt (A) és kezeletlen (A0) DNS PCR termékének mennyiségét a gélről készített felvétel felhasználásával állapítottuk meg (McCarthy és mtsai 1996, Regan és Yoshida 1995).
70
5. Eredmények 5.1. POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ OPTIMALIZÁLÁSA 5.1.1. A kiindulási DNS A polimeráz láncreakció során a DNS kiválasztott szakaszáról milliónyi másolat készül. Ez a feldúsulás a kiindulási DNS minőségére rendkívül érzékeny, amit egy-egy fotosérülés detektálására fel is használunk. Az eljárás érzékenysége azonban a kiindulási DNS-sel szemben is különleges követelményeket támaszt. A felhasznált DNS minősége a PCR eredményét jelentősen befolyásolja (Cheng és mtsai 1995). A DNS fehérjéktől való izolálására használt SDS–KCl módszer megfelelően kíméletes ahhoz, hogy jó minőségű, nagy molekulasúlyú DNS-t eredményezzen. A kiindulási DNS minőségét spektruma alapján és agaróz gélelektroforézissel ellenőriztük. A 27. ábrán bemutatott gélen az SDS–KCl-dal izolált DNS jó minőségű, sérülésmentes, míg a fenol–kloroformos eljárás elmosódott csíkot eredményezett.
27. ábra. T7 DNS elektroforézise semleges gélen (Hegedüs és mtsai 2006a): 1,2: SDS-sel izolált T7 DNS; 3,4: fenol–kloroformmal izolált T7 DNS; 5: 1 kB standard; 6,7: vékonyrétegről leoldott T7 DNS; 8: 555 bp-os PCR termék; 9: 3826 bpos PCR termék
71
5.1.2. Az exponenciális amplifikáció tartománya A polimeráz láncreakció segítségével meghatározott DNS sérülés mennyiségileg akkor értékelhető (QPCR), ha a termék DNS mennyisége (Xn) arányos a kiindulási DNS mennyiségével (X0). Ez legkönnyebben úgy érhető el, ha a kópia szám növekedésének exponenciális tartományát célozzuk meg, ahol érvényes, hogy az n-edik ciklusban a termék mennyisége: Xn = 2n X0. Ennél nagyobb ciklusszámnál a szintézist végző enzim elfárad, a primerek elfogynak, esetleg a jelenlévő dNTP mennyisége válik a termék szempontjából limitáló tényezővé (Sambrook és mtsai 1989). A ciklusszám emelésének hatását 5–50 ng kezeletlen DNS-t tartalmazó reakcióelegyeken vizsgáltuk. A PCR termék mennyisége exponenciálisan nőtt, mígnem a 33. ciklus környékén telítésbe nem került. A 28. ábrán a termék mennyiségét féllogaritmikusan ábrázoltuk a ciklusszám függvényében. A 20–33. ciklusok között lineáris összefüggés volt kimutatható, ami azt jelzi, hogy itt valóban az exponenciális tartományban vagyunk. A megismételt mérések azonos eredményt adtak. Ennek megfelelően mindkét fragmens esetében a PCR-t a továbbiakban 30 ciklus végrehajtásával végeztük.
28. ábra. Az 555 bp-os fragmens PCR termékének mennyisége a ciklusszám függvényében (Hegedüs és mtsai 2003): Izolált T7 DNS (10 ng) PCR termékét különböző ciklusszámok lefutása után gélelektroforézissel vizsgáltuk, a PCR termék mennyiségét a polaroid felvételek negatívjának feketedése alapján határoztuk meg, és relatív egységekben fejeztük ki három független mérés átlaga alapján ± szórás; 1: 1 kB standard, 2–9: 20, 23, 26, 29, 33, 35, 38, 40 ciklus
72
5.1.3. DNS-koncentrációval arányos amplifikáció A ciklusszámhoz hasonlóan optimalizáltuk a PCR program többi paraméterét. Az AmpliTaq Gold polimerázt a gyártó utasításának megfelelően először 95 ºC-on aktiváltuk. Az anneálási hőmérsékletet a primerek összetételének ismeretében meghatározott olvadásponthoz (60 ºC) igazítva úgy választottuk, hogy a reakció nagy specificitással működjön. Az extenzió idejét tapasztalati úton határoztuk meg. Megkerestük az egyes reagensek (AmpliTaq Gold polimeráz, MgCl2, dNTP, primerek) optimális alkalmazási koncentrációját. Különböző minta DNS-koncentrációkkal futtatva az egyébként optimalizált reakciót azt vizsgáltuk, hogy a termék mennyisége szempontjából a kiindulási DNS mennyisége mennyiben limitáló tényező. 30 ciklus után meghatároztuk a 2,5, 5, 10, 20, 30, 45 és 50 ng kiindulási DNS-ből keletkezett termék mennyiségét. A kiindulási DNS és a PCR termék mennyisége között a 29. ábrán látható erős lineáris összefüggést tudtunk kimutatni, az illesztett egyenes korrelációs együtthatója 0,9998 volt.
29. ábra. A 3826 bp-os fragmens PCR termékének mennyisége a kiindulási DNSkoncentráció függvényében (Hegedüs és mtsai 2003): Különböző mennyiségű DNS-t tartalmazó minták PCR termékét gélelektroforézissel vizsgáltuk, a PCR termék mennyiségét a polaroid felvételek negatívjának feketedése alapján határoztuk meg, és relatív egységekben fejeztük ki három független mérés átlaga alapján ± szórás
Kísérleteink során ellenőriztük, hogy az amplifikáció valóban az exponenciális tartományban ért-e véget, és hogy a termék a minta DNS mennyiségével arányban képződött-e. Ehhez a kezeletlen DNS/fág mellett kontrolként annak kétszeres higítását
73
is amplifikáltuk. A keletkezett termék mennyisége az utóbbi esetben az előző feléhez volt közel. Hasonlóan jó eredmények születtek akkor is, ha a reakciókat intakt fág felhasználásával végeztük. Ez alátámasztja, hogy az optimalizálás eredményeként igen robosztus, megbízható amplifikciót értünk el (Hegedüs és mtsai 2003).
5.2. UV DÓZIS HATÁSA A PCR TERMÉK MENNYISÉGÉRE 5.2.1. A cél fragmens szerepe Ha feltételezzük, hogy a sérülések a DNS lánc mentén mindenütt azonos valószínűséggel alakulnak ki, akkor azt várjuk, hogy nagyobb vizsgált szakaszra több sérülés jut. Mivel a sérülések az amplifikáció meghiúsulását eredményezik, adott szintű DNS károsodás esetén hosszabb fragmensekben a PCR nagyobb arányú gátlása várható, mint rövidebb szakaszon. Ennek az elméleti összefüggésnek a kísérleti megfigyeléséhez izolált T7 DNS-t emelkedő dózisú 254 nm-es hullámhosszúságú UVC sugárzással kezeltünk. A 30. ábrán bemutatott eredmények szerint a hosszabb (3826 bp-os) fragmens esetében az amplifikáció nagyobb mértékben csökkent, mint a rövidebb (555 bp-os) fragmensnél. A PCR termék kvantifikálásával megállapítható volt, hogy a polimeráz inhibíciója – és ezzel a kialakult sérülések száma – arányos a célszekvencia hosszával. Ennek megfelelően 7-szer nagyobb sérülés sűrűség esetén várhatjuk az 555 bp-os fragmens amplifikációjának azonos mértékű gátlását, mint a 3826 bp-os fragmens esetében. Eredményeink ezzel az értékkel nagyon jó egyezést mutattak, a polimeráz gátlásában ≈6,5-szeres különbség mutatkozott (30. ábra). Ezáltal a léziók teljes genomra visszaszámított átlagos számának egyezését sikerült kimutatnunk. Ebben nyilván szerepe van annak is, hogy a két fragmensben a sérthető helyek, vagyis főleg a dipirimidinek aránya nagyon hasonló, ami a primerek szerencsés megválasztását és az eredmények következetességét bizonyítja. Az UVC által leginkább sérthető helyek a CPD-k kialakulásának kedvező TT, CT szekvenciák és a CC, TC –k, ahol a 6-4 PD-k gyakoribbak. Ezek megoszlása a két fragmensben (Dunn és Studier 1983 alapján):
74
555 bp: 26 TT (4,7%), 32 TC (5,8%), 21 CC (3,8%), 41 CT (7,4%), összesen 21,7%, A/T: 52,6%, G/C:47,4%; 3826 bp: 163 TT (4,3%), 229 TC (6,0%), 135 CC (3,6%), 247 CT (6,5%), összesen 20,4%, A/T: 51,6%, G/C: 48,4%.
75
A
B
30. ábra. UVC (254 nm) sugárzás hatása az 555 bp-os és a 3826 bp-os fragmens amplifikálására (Hegedüs és mtsai 2003): Különböző dózisú besugárzások után a PCR termékét gélelektroforézissel vizsgáltuk, a PCR termék mennyiségét a polaroid felvételek negatívjának feketedése alapján határoztuk meg, és a kontrol PCR termékére normalizálva relatív egységekben fejeztük ki három független mérés átlaga alapján ± szórás: ’A’ gél – 555 bp: 1: 1 kB standard, 2,3: 10 ng, 5 ng kontrol DNS, 4–9: 0, 50, 100, 200, 300, 400 J/m2; ’B’ gél – 3826 bp: 1 : 1 kB standard, 2,3: 10 ng, 5 ng kontrol DNS, 4–9: 0, 10, 20, 40, 80, 100 J/m2
76
5.2.2. Öt különböző spektrumú UV sugárforrás hatása A T7 bakteriofágot, mint biológiai dozimétert felhasználtuk napsugárzás és négy mesterséges
UV
forrás
által
különböző
körülmények
között
leadott
BED
meghatározására. A HT7 egységekben mért effektív biológiai dózis egységnyi értéke átlagosan 1 inaktivációt eredményező UV sérülést okoz fágonként. A különböző sugárforrások esetében a dózis-teljesítmény (HT7/s) felhasználásával a besugárzási időket úgy állapítottuk meg, hogy a kezelések HT7= 2, 4, 6, 8 dózisoknak feleljenek meg. Az immunodot-blot módszerrel történő DNS sérülés identifikáláshoz korábban felhasznált mintákból (Fekete és mtsai 1998) izoláltuk a fág-DNS-t és ezt használtuk a QPCR reakcióban a teljes sérülésszám meghatározásához. Annak érdekében, hogy tisztázzuk, hogy a -14 °C-on hosszabb ideig tárolt DNS változatlan maradt-e, UVC sugárzással megismételtük a kísérleteket és a fágokból frissen izolált DNS-en ±10%-os szórással azonos eredményeket kaptunk, emellett a gélelektroforézis és a spektroszkópia sem tudott elváltozást kimutatni. A teljes sérülésszámot a dózis függvényében a PCR termék csökkenéséből határoztuk meg az 555 bp-os és a 3826 bp-os fragmens esetében. Mindkét fragmens és mind az öt sugárforrás esetében a fotoproduktumok száma a besugárzási dózis (HT7= 2, 4, 6, 8) függvényében emelkedett (31. ábra).
A
31.
ábra.
Emelkedő
besugárzási
B
dózisok
hatása
a
3826
bp-os
fragmens
amplifikációjára (Hegedüs és mtsai 2003): ’A’ gél – TL01: 1 kB standard; 2,3: 10 ng; 5 ng kontrol DNS; 4–7: HT7=2, 4, 6, 8; 8: negatív kontrol; ’B’ gél – FS20: λHindIII standard; 2,3: 10 ng; 5 ng kontrol DNS; 4–7: HT7=2, 4, 6, 8; 8: negatív kontrol
77
QPCR-ral jó közelítéssel a várt sérülésszámot kaptuk. Például a legnagyobb dózis T7
H = 8 esetén 16 sérülés várható, minthogy a β ≈ 0,5 gazdasejt reparáció az adott kísérleti körülmények között nem játszik szerepet. A kísérletesen meghatározott értékek a különböző sugárforrások esetében: UVC: 17,42±0,60; TL01: 15,48±0,54; FS20: 14,89±0,52;
napszimulátor:
18,57±0,64;
napsugárzás
17,91±0,62
(32.
ábra).
Megjegyezzük, hogy mérési hibán belül azonos eredményeket kaptunk, ha az izolált DNS helyett magukat a besugárzott T7 fágokat használtuk a polimeráz láncreakcióban (Hegedüs és mtsai 2003).
32. ábra. QPCR-ral meghatározott átlagos fágonkénti sérülésszám HT7=8 dózisnál és a DNS–fehérje kölcsönhatás (izolált DNS, intakt fág vagy „fűtött fág” állapot) erre gyakorolt hatása öt különböző sugárforrás esetében (Hegedüs és mtsai 2003): A sérülésszámokat a kezelt és kezeletlen minták PCR termékének mennyiségéből Poisson-egyenlet felhasználásával határoztuk meg, 8 független mérés átlaga ± szórás
5.3. A FÁG-FEHÉRJÉK JELENLÉTÉNEK HATÁSA 5.3.1. T7 fág, „fűtött fág”, izolált DNS A fág-fehérjék hatását az UV sérülések kialakulásában intakt fágon belüli és izolált DNS-en, valamint „fűtött fág”-on vizsgáltuk. Utóbbi esetben a hőkezelés hatására a DNS részben kiszabadul a kapszidból, de a fág-fehérjékkel nem veszti el teljesen a kapcsolatát. Mindhárom minta esetében valamennyi sugárforrásnál HT7= 2, 4, 6, 8 dózisokat alkalmaztunk. A DNS-ben a fotosérülések számát QPCR-ral állapítottuk
78
meg. Fágon belüli DNS-hez képest az izolált DNS-ben a teljes sérülésszám jelentős csökkenését tapasztaltuk mind az öt UV forrás esetében (32. ábra). A csökkenés ≈3,5szeres volt és még „fűtött fág” esetében is szignifikáns, ≈2,5-szeres. Az 5. táblázatban feltüntetett egységnyi T7 dózisra jutó átlagos sérülési frekvencia lényegében az egy fotonnal való kölcsönhatáshoz tartozó átlagos effektív target méretet adja meg, azaz az abszorpciós hatáskeresztmetszetet. 5. táblázat. Egységnyi T7 dózis által kiváltott átlagos sérülésszám (sérülési hatáskeresztmetszet) HT7=8 dózis esetén fágon belüli és izolált DNS-ben
Sugárforrás
Fág
DNS
Arány (fág/DNS)
UVC
1,746±0,043
0,626±0,015
2,786
TL01
1,570±0,037
0,443±0,016
3,543
FS20
1,439±0,039
0,463±0,011
3,107
napszimulátor
1,914±0,048
0,535±0,013
3,575
Nap
1,978±0,043
0,696±0,017
2,840
5.3.2. UV fotosérülés különböző DNS konformációkban A fehérjékhez való kötődés erősen befolyásolhatja az örökítőanyag térszerkezetét, aminek az UV fotoproduktumok kialakulásában betöltött szerepét különböző konformációjú DNS oldatokban vizsgáltuk. Ehhez meghatároztuk a keletkezett sérülések gyakoriságát. A mintákat az etanol koncentráció emelésével alakítottuk ki. 0% etanolnál B-konformációt, 60%-nál C-szerűt, 80%-nál A-konformációt vesz fel az örökítőanyag. A denaturált DNS-t hőkezeléssel állítottuk elő. A mintákat HT7=10 dózisú besugárzásnak tettük ki germicid és FS20 lámpák felhasználásával. A teljes sérülésszámot az 555 bp-os és a 3826 bp-os fragmens PCR termékének csökkenéséből is meghatároztuk. A 33. ábrán bemutatott eredmények alapján a fotosérülések gyakoriságában nem mutatkozott jelentős különbség az egyes konformációs állapotok között. Ehhez hasonló eredmény született és mtsai 2003).
79
HT7=5 dózis esetén is (Hegedüs
33. ábra. QPCR-ral az 555 és a 3826 bp-os fragmens felhasználásával meghatározott átlagos sérülésszám HT7=10 dózisnál különböző DNS-konformációk esetében (Hegedüs és mtsai 2003): A sérülésszámokat a germicid vagy FS20-as lámpákkal kezelt és kezeletlen minták PCR termékének mennyiségéből Poisson-egyenlet felhasználásával határoztuk meg, 8 független mérés átlaga ± szórás
5.4. VÉKONYRÉTEGEK ÉS VÁKUUMKEZELÉS 5.4.1. A fág és DNS vékonyrétegek szerkezete A centrifugális depozícióval készített fág és DNS vékonyrétegek minőségét polarizációs és fáziskontraszt mikroszkóppal ellenőriztük (Olympus SM20, Reichert Me F2). A 34. ábrán látható felvételek 640:1 nagyítással és a kontraszt fokozása érdekében Nomarski feltéttel készültek. A filmek egyenletes fedettségűek és jó minőségüket különböző relatív páratartalmak mellett is megtartották. A fág film mikrokristályos szerkezetet mutat, ahol a fág partikulumok feltehetőleg sókristályokba ágyazódtak. A NaDNS vékonyrétegen nem láthatók mikroaggregátumok (34. ábra).
80
34. ábra. Izolált NaDNS és intakt T7 fág vékonyréteg mikroszkópos felvétele (Fekete és mtsai 2003): Reichert Me F2 mikroszkóp Nomarski feltéttel, nagyítás 640:1
A mikroszkópos képeken megfigyelhető homogén szerkezet magyarázatul szolgál az abszorpciós spektrumok alapján meghatározott szórt fény kis mennyiségére is. A felhasznált filmek vastagsága 20–200 nm között változott a kiindulási fág/DNS koncentráció függvényében. A minőséget az abszorpciós spektrum alapján is ellenőriztük. A különböző pozíciókban (90°-os elforgatással) felvett spektrumok nem mutattak jelentős eltérést, ami szintén homogén fedettség mellett szól. 5.4.2. Vákuum hatása a vékonyrétegekre A vákuumban elszenvedett vízvesztés az egyik legkritikusabb világűrbeli körülmény az élet szempontjából. 1 hétig 10-6 Pa űrszimulációs kezelés után a nyitott szelencében kezelt fág és DNS vékonyrétegek a vákuum hatására kiszáradtak. A filmek zsugorodtak és valószínűleg a DNS hélixek közötti távolság is lecsökkent. A kialakult kristályos minta ellenére a fedettség továbbra is viszonylag egyenletes maradt (35. ábra).
81
35. ábra. Izolált NaDNS és intakt T7 fág vékonyréteg mikroszkópos felvétele egy hetes vákuumkezelés után (Fekete és mtsai 2005, Hegedüs és mtsai 2006b): Reichert Me F2 mikroszkóp Nomarski feltéttel, nagyítás 640:1
Összehasonlítottuk a vákuumkezelés hatását a relatív páratartalom változtatásával kialakított DNS konformációk spektrumában tapasztalt különbséggel. A DNS oldatának és erősen hidratált vékonyrétegeinek abszorpciója nagyon hasonló egymáshoz. 81%, 95% r.h.-nál elég vízmolekula kötődik az örökítőanyaghoz ahhoz, hogy a DNS a vizes oldatban megszokott helikális szerkezetet vegye fel (B-konformáció). A vákuum hatása nagyon hasonló a dehidrációéhoz (0% r.h.), ahogy az a 36. ábrán is látható. 260 nm-en 20–30%-os hyperkromia mérhető a spektrum jellegének változása nélkül. A jelenség nagy hasonlóságot mutat a DNS oldat olvadáspont körüli viselkedésével. Ez arra utal, hogy mindkét esetben a bázisok egymásra rétegződésében, az ún. „stacking”-ben következik be változás. A vákuummal kezelt filmek magas páratartalomban történt ekvilibrációja (95% r.h., 3 nap) után az abszorbancia csökken és a spektrum felveszi eredeti OD-ját és alakját.
82
36. ábra. T7 DNS vékonyréteg abszorpciós spektrumának változása – 1 hét 10-6 Pa vákuumkezelés és különböző DNS konformációkat eredményező relatív páratartalom változtatás hatása (Fekete és mtsai 2004, Hegedüs és mtsai 2006b): Négy független, szendvics formában végzett mérés átlaga fényszórás korrekció után
5.4.3. Hőmérséklet-ingadozás következményei A vákuumkezeléssel párhuzamosan folytatott 1V2 (1 hét 40 ºC, 1 nap 60 ºC, 1 hét 40 ºC) és 2V1 (1 óra +20 ºC, 1 óra -20 ºC, 1 héten keresztül) hőkezelés hasonló változást okozott az abszorpciós spektrumban, mint a vákuumkezelés. A sérülések kvantifikálásával megállapítottuk, hogy elsősorban egyszálú és kettős szálú lánctörések keletkeztek. A lúgos és semleges gélek kiértékelése alapján azonban ezek száma nem jelentős (37. ábra). Általában ezek a minták a vizsgált tartományba eső hőmérsékletingadozást jól viselik.
83
37. ábra. 1V2 és 2V1 kezelés által okozott száltörések a vékonyrétegekről leoldott mintákban (Fekete és mtsai 2005)
5.5. VÉKONYRÉTEGEK ULTRAIBOLYA BESUGÁRZÁSA 5.5.1. UVC sugárzás hatása a vékonyrétegekre A nukleinsavak bázisai erős elnyelést mutatnak az UV tartományban, az abszorpciós maximum 260 nm környékére esik. A sejtek ultraibolya sugárzás által kiváltott pusztulása a DNS-re kifejtett hatásnak tudható be, ezért a 260 nm körüli UV sugárzás az élet szempontjából kritikus tényező, amivel a világűrben mindenképpen számolni kell. A vékonyrétegekre kifejtett hatását 254 nm-en emittáló germicid lámpa felhasználásával vizsgáltuk. Különböző expozíciós idők elteltével meghatároztuk a vékonyrétegek abszorpciós differencia-spektrumát a kezeletlen mintához képest, így kis változások is jól láthatóvá tehetők. A 38. ábrán bemutatott differencia-spektrumokból látható, hogy a legnagyobb változás 264 nm-en következett be, ezért a továbbiakban ezt használtuk a folyamat jellemzésére.
84
38. ábra. NaDNS vékonyréteg szendvics formában meghatározott differenciaspektrumai UVC (254 nm) besugárzás után (Fekete és mtsai 2003)
UV sugárzás hatására (254 nm) a DNS-ben CPD-k és 6-4 PD-k mellett egyéb fotosérülések is kialakulnak. Ezek közé tartoznak a DNS–fehérje keresztkötések, száltörések, spóra fotoproduktumok (Cadet és mtsai 1992, Fekete és mtsai 1998, Varghese 1970), emellett vékonyrétegeken szálak közti fotoproduktumok is jelentős mennyiségben keletkeznek (Douki és mtsai 2003). A spektrumban a 39. ábrán látható módon 264 nm-nél abszorpció növekedés figyelhető meg, ami a DNS részleges denaturációjára utal. Míg a dimerek keletkezése nyomán csökken az elnyelés, addig a kialakuló hyperkrom effektus más, denaturáló fotoproduktumok nagy számú megjelenését valószínűsíti (Fekete és mtsai 2003).
39. ábra. T7 fág és DNS vékonyréteg OD264 változása százalékban kifejezve a besugárzási dózis (254 nm UVC) függvényében (Fekete és mtsai 2003)
85
A fág/DNS vékonyrétegekben keletkező teljes sérülésszám meghatározásához a QPCR-t alkalmaztuk. A fragmenshossztól függően a módszerrel igen széles dózistartomány felölelhető. Az 555 és a 3826 bp-os PCR termék mennyiségének csökkenését T7 fág és DNS vékonyrétegen is meghatároztuk az UV dózis függvényében. Az ebből számított sérülésszám eleinte emelkedett az elszenvedett dózis növekedésével. Nagyobb dózisoknál (30–40 kJ/m2 felett) a sérülések keletkezésében mindkét dózis–hatás függvény telítődést mutat, ami egy dinamikus egyensúly beállására utalhat; a károsodást létrehozó fotonok ugyanis a sérülések visszafordítására is képesek. Emiatt a DNS-ben egy bizonyos dózis felett nem nő tovább a sérülések száma. A 40. ábrán bemutatott QPCR eredményeink szerint vékonyrétegeken is fágon belül keletkezik több sérülés, ami ismételten a fehérjék DNS-t érzékenyítő hatása mellett szól.
40. ábra. A QPCR-ral meghatározott teljes sérülésszám fágon belüli és izolált DNSben a korrigált UVC (254 nm) dózis függvényében (Hegedüs és mtsai 2006b): A sérülésszámokat a kezelt és kezeletlen minták PCR termékének mennyiségéből Poissonegyenlet felhasználásával határoztuk meg, 8 független mérés átlaga ± szórás
86
5.5.2. A többszörös rétegek árnyékoló hatása Mivel a fágok és a DNS molekulák az ultraibolya tartományban jelentős elnyelést mutatnak, ezért az UV sugárzás hatásaival kapcsolatban megbízható mérések csak elhanyagolható vastagságú vékonyrétegeken végezhetők. Vastagabb filmek esetében a fág/DNS mennyiség növekedésével a részecskék egyre több rétegben rakódnak egymásra. Ez a rétegződés azt eredményezi, hogy a felső rétegek az alattuk lévőket leárnyékolják és bizonyos fokig védik azokat a sérülésektől. Az árnyékoló hatás mértékének számszerű jellemzésére a következő kísérletet végeztük. A kiindulási fág/DNS koncentráció változtatásával 20–500 nm közötti vastagságú vékonyrétegeket állítottunk elő, amelyeket a 260 nm-en mért abszorbanciával jellemeztünk. A filmeket UVC sugárzás különböző dózisaival kezeltük. Az 555 bp-os fragmens PCR termék mennyiségének csökkenése adott dózisú besugárzásnál vékonyabb réteg esetében jóval nagyobb volt, mint vastagabb rétegeknél. A kezelt (A) és kezeletlen (A0) minta PCR termékének aránya (A/A0) a dózis függvényében csökkent. De például 60 kJ/m2-es besugárzás után a csökkenés mintegy 70%-os volt OD260=0,1 réteg esetében, míg OD260=0,5 esetében csak ≈30%-os (41. ábra).
41. ábra. A rétegvastagság hatása az 555 bp-os PCR termék mennyiségének csökkenésére különböző dózisú UVC (254 nm) besugárzások során
87
5.5.3. Különböző fotoproduktumok keletkezése napszimulátor hatására Az ultraibolya sugárzás által a DNS-ben kialakított sérülések természetének feltérképezésére több módszer kombinálásával tettünk kísérletet. A fág vékonyrétegeket SOL 2000 napszimulátorral sugaraztuk be. A besugárzási dózist neutrális szűrőkkel 0,0001–100% között változtattuk. A ciklobután-pirimidin-dimerekre és az apurinezett/ apirimidinezett léziókra specifikus endonukleázokkal való emésztés eredményét lúgos gélelektroforézissel vizsgáltuk. Az UV sugárzással kezelt vékonyrétegekről visszaoldott minták kettős szálú töréseit semleges, egyszálú töréseit lúgos gélen kvantifikáltuk. A DNS–fehérje keresztkötések számát az SDS–KCl módszerrel határoztuk meg. A teljes sérülésszámot pedig QPCR eredményei alapján számítottuk. Tapasztalataink szerint a semleges szűrőkkel felölelt dózistartomány a legkisebb detektálható és a legnagyobb tolerálható dózis közé esik. A T7 fág vékonyrétegen kialakult különböző típusú sérülések megoszlását a 42. ábra szemlélteti. A fotoproduktumok között ≈57% a DNS–fehérje keresztkötések, ≈18% a CPD-k, ≈9% az egyszálú és ≈2% a kettős szálú törések aránya. Az AP helyek a teljes sérülésszám ≈0,5%-át teszik ki. Az azonosított léziók tehát az összes sérülésnek mintegy 85%-át alkotják, ami arra utal, hogy a vékonyrétegeken ezeken kívül más típusú sérülések is számottevő mennyiségben keletkeznek. Az egyes fotoproduktumok mennyiségét meghatároztuk monokromatikus UVC besugárzást követően is. A 254 nmes sugárzás szűkebb specificitású; ez a CPD-k kialakításának optimális hullámhossza. A sérülések megoszlásában egy lényeges különbség mutatkozott, ≈61%-kal a CPD-k váltak a domináns termékké, a DNS–fehérje keresztkötések ≈11%-kal a második helyre szorultak, a többi lézió a két különböző sugárforrás esetében hasonló arányban keletkezett (254 nm-en: ≈4% egyszálú, ≈2% kettős szálú törés, ≈0,5% AP) (Hegedüs és mtsai 2006b).
88
42. ábra. SOL 2000 napszimulátor által keltett fotoproduktumok megoszlása T7 fág vékonyrétegekben a besugárzási dózis függvényében (Fekete és mtsai 2005)
5.5.4. Kombinált kezelések: vákuum és UV sugárzás együttes hatása A vákuumkezelés által okozott dehidráció miatt a DNS térszerkezete erősen torzul. A bázispárok szabályos rendezettsége megbomlik, amit az elnyelési spektrumban észlelhető hyperkromia is jelez. Magasabb páratartalom mellett a DNS hidrátburka ismét kialakul és a spektrum felveszi eredeti alakját, ami azonban csak a nukleotid bázisok rétegződésének, az eredeti „stacking” kölcsönhatásnak a visszaállására utal. Kialakulnak olyan sérülések is, amiket spektrális változás nem jelez és rehidráció után is megmaradnak, bár számuk nem jelentős. 1 hetes vákuumkezelés után a fág/DNS vékonyrétegeken 5–10 sérülés/részecske keletkezett és a fágok ≈85%-a megtartotta biológiai aktivitását. A vákuumban kialakuló rendezetlen, D-konformációjú DNS struktúra kedvezhet UV sérülések kialakulásának és a különböző hullámhosszú UV besugárzás is fokozhatja a vákuum dehidráló hatását. Kombinált vákuum és UVC kezelés során mértük az abszorpciós spektrum változását és QPCR-ral meghatároztuk a sérülések számát. Eredményeink szerint mindkét módszerrel a vákuum és az ultraibolya sugárzás szinergisztikus hatása igazolható. A 43. ábrán látható, hogy a kombinált kezelés minden esetben az egyes kezelések hatásának összegénél nagyobb effektust ért el.
89
Vékonyrétegekről a minta csekély térfogata miatt igen nehéz a fágok élőszámának meghatározása. A túlélésre kapott előzetes eredményeink azonban alátámasztják az egyéb módszerekkel kapott eredményeket: vákuum ≈85%, 5,4 kJ/m2 UVC ≈51%, vákuum + 5,4 kJ/m2 UVC ≈10% (± 25%) (Hegedüs és mtsai 2006b).
43. ábra. Kombinált vákuum (10-4 Pa, 3 nap) és UVC (254 nm) kezelés hatása az OD264 változására és a teljes sérülésszámra nyitott szelencékben kezelt fág vékonyrétegekben (Hegedüs és mtsai 2006b)
90
6. Megbeszélés 6.1. T7 FÁG BIOLÓGIAI DOZIMÉTER KIÉRTÉKELÉSE 6.1.1. PCR beállítása A T7 fág biológiai dózismérő kiértékelésére polimeráz láncreakción alapuló módszert dolgoztunk ki. Az eljárás lehetővé teszi a DNS-ben kialakult sérülések érzékeny és számszerű detektálását. A minta DNS sokszoros másolása rendkívül érzékeny a hibákra, függetlenül attól, hogy azokat a vizsgálni kívánt kezelés vagy egyéb műtermék okozza. Ezért az eredmények összehasonlíthatóságának feltétele a kiindulási DNS sérülésmentessége, amit gélelktroforézissel ellenőriztünk. Megállapítottuk, hogy bár a hagyományos fenol–kloroformos technika elég nagy mennyiségű DNS-t eredményez, annak minősége nem felel meg a polimeráz láncreakció rendkívüli érzékenysége által támasztott követelményeknek. Az általunk alkalmazott SDS–KCl-os izolálás megfelelően kíméletes volt és magas molekulatömegű, műtermékektől mentes DNS-t eredményezett, amivel a QPCR során is megbízható eredmények születtek (5.1.1. fejezet, 27. ábra). A polimeráz láncreakció paramétereinek optimalizálásánál felhasználtuk az erre vonatkozó általános irányelveket (Robertson és Walsh-Weller 1998, Sambrook és mtsai 1989) és más kutatócsoportok tapasztalatait (Jean és mtsai 2001, Jenkins és mtsai 2000, Jennerwein és Eastman 1991, Kumar és mtsai 2004, McCarthy és mtsai 1996, Oshita és Eastman 1993, Yoshida és Regan 1997a, Yoshida és Regan 1997b). Az egyes reagensek koncentrációját, a ciklusszámot és a reakció lépéseinek hőmérsékletét és idejét sikerült úgy beállítani, hogy a QPCR eredményeként a sértetlen minta DNS mennyiségével arányos amplifikációt kapjunk (5.1.2, 5.1.3. fejezet, 28, 29. ábra). A gélen végzett kvantifikálás adatai jó reprodukálhatóságot és 10%-on belüli szórást mutattak. A két legmegbízhatóbb primer pár felhasználásával az 555 bp-os és a 3826 bp-os fragmens esetében a PCR-ral pontosan meg lehetett határozni a fotoproduktumok számát, az adatokban az átlag szórása 3,5% volt (5.2.1. fejezet, 30. ábra).
91
A reakciót mindkét fragmens esetében sikerült olyan robosztussá optimalizálni, hogy megbízható eredmények születtek akkor is, ha izolált DNS helyett intakt T7 fágot használtunk a reakcióelegyben (5.1.3. fejezet). Korábbi irodalmi leírások mind izolált DNS alkalmazásáról számolnak be, sőt a fehérjék Taq-polimerázt gátló hatását is leírták (Denissenko és mtsai 1994). A mi esetünkben a fág-fehérjék nem gátolták az amplifikációt, ami részben annak köszönhető, hogy 95 ºC-on, a T7 nukleoprotein komplex fázisátalakulási hőmérséklete felett a DNS kiszabadul a kapszidból (Fekete és mtsai 1982). 6.1.2. T7 fág biológiai dózismérő hitelesítése A DNS alapú biológiai dozimetria alapja, hogy számos biológiai hatás, például a bőrrákok, sejtpusztulás, mutáció kialakulásában bizonyítottan a DNS sérülése az első lépés (Cadet és mtsai 1992). Biológiai doziméterként számos DNS-t (Karentz és Lutze 1990, Munakata 1981, Regan és Yoshida 1995) vagy annak analógját (Rontó és mtsai 2004) tartalmazó struktúra felhasználása ismert. A T7 bakteriofág jól használható erre a feladatra, mert fehérje magra tekeredett örökítőanyaga hasonló szerkezetű a kromoszomális DNS-hez, és maga a fág könnyen kezelhető (Rontó és mtsai 1992). Nagy előnye, hogy a besugárzás és a kiértékelés időben és térben szétválasztható, emiatt a gyakorlatban könnyen alkalmazható. A módszer hátránya, hogy a hagyományos laboratóriumi technikákkal végzett tarfoltszámos kiértékelés igen idő- és munkaigényes. A modern molekuláris biológiai módszerek új lehetőséget jelentenek a DNS-re kifejtett hatás meghatározásában. A kvantitatív polimeráz láncreakcióval a teljes sérülésszám könnyen mérhető. Az egyes doziméterekkel meghatározott biológiai dózisok összehasonlíthatóságához a dozimétereket hitelesíteni kell. Különböző besugárzások után meg kell határozni a doziméter spektrális érzékenységét, a mért és más biológiai dózisok egymáshoz való viszonyát és a fotoproduktumok mennyiségét és minőségét (Bérces és mtsai 1999). T7 fág esetében a spektrális szenzitivitás ismert (Módos és mtsai 1999), és megtörtént az összehasonlítás más biológiai doziméterekkel is (Bérces és mtsai 1999), de a fotoproduktumok vizsgálata eddig csak a CPD-k és 6-4 PD-k immunodot-blot módszerrel történt meghatározására terjedt ki (Fekete és mtsai 1998, Fekete és mtsai 1999).
92
A QPCR eredményei alapján számított UV sugárzás okozta sérülésszám öt különböző sugárforrás alkalmazásánál jó egyezést mutat a T7 fág biológiai dózisa (BED) alapján kapott sérülésszámmal. A fotoproduktumok számában azonos BED-nél nem tudtunk szignifikáns különbséget kimutatni a különböző sugárforrások esetében (5.2.2. fejezet, 31, 32. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy minden UV sugárzás által kiváltott DNS sérülés képes a Taq-polimeráz által végzett szintézis gátlására, vagyis a QPCR technika megfelelő érzékenységgel rendelkezik ahhoz, hogy UV sugárzás biológiailag releváns dózisainak meghatározásához használhassuk (Hegedüs és mtsai 2003). Korábban a különböző sérülésekre specifikus antitestek felhasználásával UVC (254 nm) és TL01 lámpa esetében viszonylag jó egyezés mutatkozott a CPD-k és 6-4 PD-k száma, valamint a tarfoltszám-csökkenéssel meghatározott biológiai dózis között. Hosszabb hullámhosszakon is sugárzó forrásoknál azonban a CPD-k és 6-4 PD-k száma elmaradt a várható érték mögött (Fekete és mtsai 1998). Az immunodot-blot módszerrel kapott eredmények szerint hosszabb hullámhosszakon valószínűleg más sérülések, például Dewar-izomerek (Taylor és mtsai 1990), pirimidin-hidrátok (Ravanat és mtsai 2001), száltörések és DNS–fehérje keresztkötések (Distel és mtsai 2006, Peak és Peak 1991) kerülnek előtérbe és járulnak hozzá a fágok pusztulásához. A munkánk során széles hullámhossz-tartományban meghatározott egyezés a sérülésszám és fág inaktiváció között azt jelzi, hogy a QPCR alkalmas ezeknek a sérüléseknek a detektálására is. Mivel az eljárással a léziók ilyen széles spektruma kimutatható, az alkalmazás más területeken is lehetséges, például genotoxikus vegyületek hatásának vizsgálatánál. Más biológiai doziméterek csak adott dózistartományok mérésére alkalmasak, vannak olyanok, amik percekben és vannak mások, amik hónapokban mérhető expozíciók esetén használhatóak. Sikerült kimutatnunk, hogy a polimeráz láncreakció érzékenysége fotosérülések detektálására egyenesen arányos a választott amplifikált fragmens hosszával. Különböző fragmensek esetében a DNS-polimeráz gátlása alapján a teljes genomra meghatározott átlagos sérülésszám egyezését tudtuk kimutatni, ezért a fragmenshossz célszerű megválasztásával igen széles dózistartomány felölelhető (5.2.1. fejezet, 30. ábra). λ fág DNS-ében 0,5 kb-os és 1,08 kb-os fragmens esetében hasonló lineáris összefüggést tudtak kimutatni, de a 2,24 kb-os fragmens esetében már
93
nem (Yoshida és Regan 1997b). Ez is felhívja a figyelmet arra, hogy a célfragmens tulajdonságai a sérülésre való érzékenység szempontjából meghatározóak. A T7 fág biológiai doziméter 555 bp-os és 3826 bp-os fragmensének kiválasztása szerencsés, mert ezen nukleinsav szakaszok esetében a legsérthetőbb dipirimidin szekvenciák megoszlása közel azonos (5.2.1. fejezet). Eredményeink bizonyítják, hogy a kiértékelés kvantifikálásában felhasznált módszerek a célnak megfelelnek. A ma már szintén elérhető, költséges real-time PCR (RT-PCR) technikák alkalmazása elkerülhető. A sérülések számításában alkalmazott Poisson-eloszláson alapuló matematikai modell képes a jelenség megfelelő leírására. Ebben szerepe van annak is, hogy a fágon belül igen nagy számú, egymástól független sérthető hely létezik, amiknek a jellemzésére statisztikai módszerek használhatóak (Rontó és mtsai 1967). 6.1.3. A proteinek szenzibilizáló hatása Az élő szervezetben a DNS szerkezetét strukturális fehérjék stabilizálják és az örökítőanyagban tárolt információ kiolvasását is fehérje enzimek végzik, amiknek a munkáját a DNS-hez kötődő aktivátorok és represszorok szabályozzák. A DNS sorsát a fotosérülések kialakulásakor is befolyásolja a fehérjékkel való kölcsönhatás, aminek vizsgálatára a T7 fág ideális modell. A fágon belüli és izolált DNS fotosérülései közti különbség alapján a fehérjék hatása specifikusan vizsgálható. A „fűtött fág” átmeneti állapotot jelent, amikor a proteinek hő hatására denaturálódnak, de a DNS környezetében maradnak, a DNS térszerkezete pedig az izolált örökítőanyagéhoz lesz hasonló (Fekete és mtsai 1982). A CPD-k és 6-4 PD-k keletkezésében az immunodot-blot módszerrel jelentős különbség volt kimutatható a fágon belüli és izolált DNS esetében. A kialakuló dimerek mennyisége izolált DNS-ben és „fűtött fág”-ban minden esetben jelentősen csökkent a fágon belülihez képest. A csökkenés mértéke azonban jelentősen függött az alkalmazott sugárforrástól (Fekete és mtsai 1999). Ugyanezeknek a besugárzott mintáknak a felhasználásával a QPCR segítségével a teljes sérülésszámot is meg tudtuk határozni. Mindkét fragmens esetében hasonló eredményeket kaptunk: fágon belüli DNS-hez képest izolált DNS-ben ≈3,5-szer, „fűtött fág”-ban ≈2,5-szer kevesebb sérülés keletkezik (5.3.1. fejezet, 32. ábra, 5. táblázat). Az értékek között öt különböző
94
sugárforrás esetében nem volt számottevő különbség. A korábbi eredményekkel összevetve feltételezhető, hogy a fehérjék jelenlétének DNS-t érzékenyítő hatása CPD-k és 6-4 PD-k esetében ellentétes hullámhossz-függést mutat, mint más sérüléseknél. Izolált DNS és „fűtött fág” sérülésszáma kétmintás t-próbával szignifikánsan alacsonyabbnak (p<0,05) adódott, mint az intakt fágé (Hegedüs és mtsai 2003). Különböző DNS konformációk között azonban nem volt szignifikáns különbség a teljes sérülésszámban (5.3.2. fejezet, 33. ábra), ugyanúgy, ahogy a CPD-k és 6-4 PD-k számában sem (Fekete és mtsai 1999). A DNS-hez kötődő fehérjék fotosérülést befolyásoló hatására elsőként a lac operon esetében figyeltek fel lac represszor és RNS-polimeráz bekötődése kapcsán (Becker és Wang 1984). Sőt, a módszert később regulátor fehérjék kötőhelyeinek azonosítására is felhasználták, többek között humán c-jun gén esetében (Tornaletti és Pfeifer 1995). Kimutatták, hogy nem csak a funkcionális, hanem a strukturális fehérjék jelenléte is befolyásolja a sérülések kialakulását. A gyöngyfüzérre hasonlító nukleoszomális szerkezetben az örökítőanyag 1,75 fordulattal az oktamer hisztonokra tekeredik, amiket változó hosszú kapcsoló régiók kötnek össze. Ultraibolya besugárzás után a nukleoszomában a CPD-k 10 bázisos periodicitást és a hiszton felszínétől távolabb fokozott előfordulást mutatnak, amiért a DNS görbülete felelős. Predilekciós hely a 3’ pozíció attól a ponttól, ahol a görbület a lánc nagy árka felé néz. Ezzel szemben a kapcsoló régiókban a CPD-k eloszlása egyenletes, és a nukleoszomális szerkezet kitekerésekor a fotosérülések eloszlása az izolált DNS-belihez válik hasonlóvá. Ugyanakkor a CPD-k is hatnak a DNS-nek a hisztonon való elhelyezkedésére. A 6-4 PD-k a kapcsoló régiókban jelennek meg nagyobb mennyiségben a nukleoszóma magjához képest (Pfeifer 1997). Annak a valószínűsége, hogy egy-egy UV foton a DNS adott helyén sérülést váltson ki, nagyban függ a bázissorrendtől, például dipirimidin szekvenciák a dimerek kialakulásának kedveznek. Hasonlóan fontos tényező a DNS szál rugalmassága, a dimerek ott alakulnak ki nagyobb valószínűséggel, ahol az eredeti térszerkezet módosulására nagyobb lehetőség van, és a pirimidinek egymáshoz képest kitekeredve reakcióképesebb állapotba kerülhetnek (Becker és Wang 1989). Kísérleteink során intakt és „fűtött fág”, valamint izolált DNS esetében a DNS szekvencia nem változott, az egyes vizsgált konformációkban a DNS térszerkezete és a bázisok elrendeződése
95
azonban különböző volt. Utóbbi esetben a fotoproduktumok kialakulásában nem találtunk lényeges különbséget, ami arra utal, hogy nem a DNS térszerkezete a meghatározó tényező a sérülések kialakulása szempontjából (5.3.2. fejezet, 33. ábra). Az izolált DNS kisebb sérülékenységének magyarázataként szóba jöhet még a fágon belüli DNS szuperhelikális szerkezetének, a fehérjékkel való kölcsönhatásnak, és az összecsapzódó izolált DNS árnyékoló hatásának szerepe is. A hosszú DNS láncokat a biológiai rendszerekben tömött struktúrává felgöngyölítve találjuk meg (nukleoszóma, kromoszóma). A fágon belüli DNS is egy fehérje mag és a kapszid burok közé csomagolódik. Ha az izolált DNS oldatában aggregáció alakul ki, akkor ezekben a gócokban a DNS hasonlóan besűrűsödik, mint a fágon belüli szerkezetben és az árnyékoló hatás sem lesz különböző. A
fotosérülések
gyakoriságában
tapasztalt
különbségek
legvalószínűbb
magyarázata ezért az, hogy a fág-fehérjékhez való kötődés olyan lokális szerkezeti változásokat okoz a DNS-ben, amik a sérülések kialakulásának kedveznek. Baktérium spórák DNS-ére vonatkozó irodalmi adatok alátámasztják ezt a feltételezést (Nicholson és mtsai 1991). Egy másik elképzelhető magyarázat lehet az a relatíve új kísérleti tapasztalat, hogy az elnyelt gerjesztési energia a kétszálú DNS-ben a fotont elnyelő szál gerince mentén mindkét irányban eloszolhat, a fotosérülés szempontjából kiszökhet (Crespo-Hernandez és mtsai 2005). A fágon belüli fehérjékhez kötött, szuperhelikális szerkezetű DNS-ben azonban erre valószínűleg nincsen lehetőség. A „fűtött fág”-oknál mutatkozó kisebb arányú különbség is a DNS-sel kölcsönhatásban lévő fehérjék szerepére utal. A jelenlévő proteinek a várakozásokkal szemben árnyékoló hatásukkal nem csak védhetik a genomot, hanem tapasztalataink szerint a kötődés helyén kitekeredő pirimidinek UV sérülésre esendőbekké is válhatnak.
6.2. SZIMULÁLT VILÁGŰR HATÁSA 6.2.1. A minták minőségének ellenőrzése A fág és DNS vékonyrétegekről készült mikroszkópos felvételek alapján megállapítottuk, hogy az általunk használt módszerrel egyenletes fedettségű, homogén vékonyrétegek készíthetők (5.4.1, 5.4.2. fejezet, 34, 35. ábra). A fág rétegen látható
96
NaCl mikrokristályok megjelenésére a temészetes módon beszáradó oldatok kialakulásakor is számítani lehet, azonban ott lényegesen nagyobb aggregátumok alakulhatnak ki. A fág/DNS partikulumok mindig valamilyen hordozóra tapadnak: a meteoritok ásványi anyaga például szerepet játszhat a világűrben uralkodó körülmények átvészelésében. Az űrszimulációs kezelések eredményeinek befolyásolása kapcsán a vékonyrétegek
sókristályainak
elsősorban
csekély
mértékű
védő
hatásával
számolhatunk a fág partikulumok extrém körülményektől való részleges elszigetelése miatt. Beszárított Bacillus subtilis spórákon a vékonyréteg meteorit porral vagy annak analógjával való kiegészítése igen jelentős védelmet nyújtott és sokszorosára fokozta a spórák túlélését (Horneck és mtsai 2001b). A mi fág rétegeink esetében jelenlévő sókristályoknak a rajtuk áthaladó sugárzást gyengítő képességénél lényegesebb a DNS környezetében megtalálható kationok struktúrát stabilizáló hatása. Agyag kristályok (montmorillonit, kaolinit) felszínén kialakuló töltés-megoszlás kedvez a DNS molekulák stabil adszorpciójának, ami a DNS szálnak járulékos stabilitást biztosít, ezen felül pedig az UV sugárzással szembeni védő hatást is tapasztaltak. A világűrbeli viszonyokkal szembeni ellenállásban e jelenségnek a szerepe feltételezhető (Scappini és mtsai 2004). Saját tapasztalataink alapján a NaDNS filmen mikrokristályok csak elvétve lehetnek jelen és a mikroszkópos felvételeken nem mutathatók ki (5.4.1. fejezet, 34. ábra), míg LiDNS esetében erősebb hajlam mutatkozott asszociátumok kialakulására. A DNS rendezettsége adott hidratáltság mellett az egyes filmekben várhatóan nem mutat különbségeket. A fág és DNS vékonyrétegek fedettsége nyitott szelencéken végzett vákuumkezelés után is megfelelő volt (5.4.2. fejezet, 35. ábra). A fág és DNS részecskék elég erősen adszorbeálódnak a kvarc korongok felszínéhez ahhoz, hogy ilyen erőteljes kezelésnek is ellenálljanak. Ezzel szemben a hasonló kvarc lemezekre felvitt uracil vékonyrétegek vákuumban percek alatt teljesen szublimálódnak. Az abszorpciós spektrumokat a minta felszínéről visszavert és a szórt fény miatt korrigálni kellett. Az irodalmi gyakorlatnak megfelelően ehhez a klasszikus RayleighMie formula tapasztalati illesztésére és extrapolációjára volt szükség. A szórt fény mennyisége: E = kλ-n. Bár ez a közelítés elhanyagolja a törésmutatónak az abszorpciós csúcs közelében mutatott anomáliás viselkedését, a speciális UV fotométerekkel végzett mérések tanúsága szerint az eltérés nem számottevő. A ’k’ és ’n’ konstansok értékét
97
tapasztalati úton határoztuk meg. Ha a szórócentrumok mérete a hullámhossz nagyságrendjébe esik, ’n’ várható értéke 4-hez közeli (Földvári és mtsai 1982). Ha azonban a fényvisszaverődés dominál a fényszórás felett, akkor ’n’ értéke kisebbnek adódik. A vékonyrétegek esetében ez akkor fordul elő, ha a film tömör és sima (Fekete és mtsai 2003). Ennek megfelelően a spektrumok korrekciójakor az E = kλ-n egyenletben szereplő ’n’ érték meghatározásakor filmjeink esetében az elméletinél alacsonyabb, 1,5–2,8 közötti ’n’ értékeket mértünk (5.4.1. fejezet). 6.2.2. A vákuum által okozott dehidráció A vákuumkezelés vékonyrétegekre kifejtett hatását az abszorpciós spektrum változásával követtük (5.4.2. fejezet, 36. ábra). A nukleotidok elnyeléséhez képest a belőlük felépülő DNS szál hypokrom effektust mutat, mert az egymáshoz kovalensen kapcsolódó nukleotidok olyan szabályos rendezettséget vesznek fel, ami a molekulák π elektron felhőjének módosulását eredményezi – ez az ún. „stacking” kölcsönhatás (Patrick és Rahn 1976). Ebben a szabályos rendben bekövetkező változások az abszorpciós spektrumban is megmutatkoznak. A DNS térszerkezetét számos tényező befolyásolja, többek között a DNS hidratációja, a fehérjékbe való csomagolódás módja és a jelenlévő sók és ionok koncentrációja (Shakked és mtsai 1989). A vékonyrétegek típusának (NaCl vagy LiCl) és a relatív páratartalomnak a változtatásával különböző konformációs állapotok között a spektrumban egyértelmű különbségek figyelhetők meg (Fekete és mtsai 2003). A LiDNS-ben 65% r.h.-nál bekövetkező C→B konformáció váltás a spektrumokban nem okoz számottevő különbséget. Ennek az a magyarázata, hogy a sejteken belüli, fiziológiás és a T7 fágra is jellemző B-konformáció szerkezetileg nem sokban különbözik az alacsonyabb víztartalom mellett kialakuló C-konformációtól. Mivel a fágban a nukleoszomális szerkezethez hasonlóan fehérjékre tekert DNS és az izolált DNS is B-konformációt vesz fel (Rontó és mtsai 1983), ezért a fág és a B-DNS vékonyrétegek spektruma is nagyon hasonló, egyedül 220 nm alatt van különbség, ahol a proteinek már jelentős elnyelést mutatnak. A NaDNS filmen 92% r.h. alatt megjelenő A-konformáció a magasabb hidratáltságú B-konformációhoz sokkal kevésbé hasonlít. Az A-konformációban a bázisok rendje torzul, felnyílik a nagy árok és a bázisok a
98
nagyobb szögű elfordulás miatt részleges fedésbe kerülnek (Lindsay és mtsai 1988), ami a spektrumban is nagyobb változással (5–15%) jár. Igen alacsony páratartalomnál, ha a DNS a hozzá asszociált vízmolekulák jelentős részét elveszti, D-konformáció alakul ki, ami a spektrumban 260 nm-nél ≈30%-os hyperkromiát eredményez. A vákuumban a víz elpárolgása miatt kialakuló dehidráció hasonló módon hat, és a spektrumban is hasonló változást okoz (5.4.2. fejezet, 36. ábra). A hyperkrom effektust úgy magyarázhatjuk, hogy a bázisok szabályos rendje a száradás során felbomlik. Teljes hidratáltság (95% r.h.) mellett a DNS nukleotidonként 20–30 vízmolekulát tartalmaz. Vákuumkezelés hatására ennek a víznek jelentős része azonban elvész és csak a belső hidrátburok nukleotidonkénti 2–6 vízmolekulája marad meg (Swarts és mtsai 1992). Ilyen körülmények között a konformáció erősen torzul és ezzel párhuzamosan a DNS merevsége is fokozódik, amint megkezdődik a DNS szerkezetének kristályos rendbe való átalakulása. A fágon belül a DNS erősen hidratált formában található, a kis szögű röntgen szórással meghatározott 1,1g H2O / g DNS szárazanyag tartalom megfelel a B-konformáció hidratáltásági igényének (Rontó és mtsai 1983). A vákuum által okozott vízvesztés mértékét a fág vékonyrétegben jelenlévő kapszid fehérjék és sókristályok mérsékelhetik, vastagabb rétegekben pedig a fág/DNS részecskék még nagyobb védelmet élveznek. Nagy relatív páratartalom (95% r.h., 3 nap) mellett a vákuummal kezelt DNS vékonyrétegek abszorpciója lecsökken, és a spektrum felveszi eredeti alakját. A bázisok rendezettségében bekövetkező változás, amit a spektrumok tükröznek, ezek szerint teljesen reverzibilis (5.4.2. fejezet36. ábra). A DNS szálai a vékonyrétegeken feltételezhetően nem tudnak kitekeredni és szétválni. Az oldatokban kialakuló denaturációval ellentétben DNS/fág vékonyrétegeken a dehidráció alkalmával kialakuló D-konformációban a kettős hélix intakt maradhat. A beszáradt DNS-ben a bázisok rendezettsége felborul, de a merev, rögzült szerkezet megakadályozza a struktúra teljes felbomlását. Ennek köszönhetően megfelelő rehidráció során a komplementer bázisok közötti párosodás spontán helyreállhat. A DNS egészében felveszi a vákuumba helyezés előtti állapotát, eltekintve a kezelés során kialakuló lokális lézióktól.
99
6.2.3. Vákuum által okozott sérülések A vákuumkezelés után a vékonyrétegekről visszaoldott mintákat semleges és lúgos gélen vizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy a kezelés hatására kevés számú kettős szálú és egyszálú törés keletkezett a DNS-ben és a fágokban (5.4.3. fejezet, 37. ábra). A fág vékonyrétegeken a fehérjével együtt csapadékba vihető DNS mennyisége alapján DNS–fehérje keresztkötéseket is találtunk. A száltörések kialakulásának a dehidráció által kiváltott konformáció-változás különösen kedvez. A natív DNS nukleotidonkénti 20–30 vízmolekulájából 0% páratartalomnál már csak 5–6 marad meg. A 44. ábra összefoglalja a dehidráció száltörésekhez vezető hatásának lehetséges mechanizmusait. A vízelvonás miatt egy bázis módosulhat, vagy ki is szakadhat, ami később egyszálú töréshez vezethet. Vákuumban
a
vízvesztés
miatt
létrejövő
konformáció-változás
megfeszíti
a
foszfodiészter kötéseket, amiknek felhasadása szintén lánctörést okoz. A vízelvonás a proteinekre is hatással van, és a hidrofób összetartó erők felbomlását okozza, a dehidrációkor kovalensen kötődő fehérje szomszédságában rehidrációkor alakulhat ki törés, nem túl távoli egyszálú törések pedig a vizsgálatkor kettős szálú törésekként mutatkozhatnak (Dose és mtsai 1996). A felsorolt változásokat elősegíti az extrém hőmérséklet, amely fokozza a dehidrációt, fixálja a sérüléseket. Az 1V2 és a 2V1 kezelés során alakultak ki száltörések, de nem jelentős mennyiségben.
DNS
vékonyrétegeken
átlagosan
≈3
száltörés/részecske,
fág
vékonyrétegeken ≈2 száltörés/részecske volt kimutatható (5.4.3. fejezet, 37. ábra). Az eredmény felveti a fág-fehérjék és sókristályok szerepét az örökítőanyag fizikai stresszel szembeni stabilizálásában, de nem csak a T7 fág, hanem a DNS is súlyosabb sérülés nélkül el tud viselni ilyen hőmérséklet-ingadozásokat. A nyílt világűrben uralkodó igen alacsony állandó hőmérsékleten más kémiai reakciókhoz hasonlóan a DNS sérülések kialakulása is jóval lassabb. UV besugárzott Haemophilus influenzae DNS-ben több fotoproduktum számának jelentős csökkenését tapasztalták -180 °C-on (Rahn és mtsai 1969).
100
44. ábra. Dehidráció következtében kialakuló lánctörések létrejöttének lehetséges mechanizmusai (Dose és mtsai 1996 nyomán): 1: intakt DNS; 2: dehidráció vagy UV sugárzás
hatására
kialakuló
bázis
vesztés
vagy
DNS–fehérje
keresztkötés
(P – protein); 3: rehidráció során a sérülések helyén száltörések alakulnak ki; 4: a szemközti szálakon egymás közelében kialakuló két egyszálú törés az analíziskor kétszálúként is jelentkezhet
Bár a spektrum változása reverzibilisnek mutatkozott (5.4.2. fejezet), voltak olyan sérülések, amiket rehidráció után QPCR-ral detektálni tudtunk. 1 hetes vákuumkezelés után csak 5–10 ilyen sérülést találtunk (Fekete és mtsai 2005). Hosszabb idejű vákuum expozíció során azonban a dehidrációs folyamatnak két fázisa feltételezhető. Az első fázisban a szabad víz és a hidrátburok egy része távozik, ami konformációs változást eredményez. Rehidráció során ez a lépés akár teljesen visszafordítható lehet. A második fázisban kovalens kötések létrejöttét eredményező kémiai reakciók is lezajlanak: ide tartoznak a víz kilépésével járó, kondenzációs folyamatok, amilyen például a Maillard-reakció. Ennek során az amino–karbonil keresztkötések a biomolekulák irreverzibilis polimerizációját okozzák (Cox 1993). A dehidráció által okozott károsodás egyik fő célpontja a DNS. A kialakuló sérülések közé tartozik a depurineződés/depirimidineződés, a száltörések és a keresztkötések kialakulása (Billi és Potts 2002). Az örökítőanyagban bekövetkező ilyen változások sejthalált vagy mutációt okozhatnak. Vákuummal kezelt hisztidin auxotróf Bacillus subtilis spórák esetében a normálisnál tízszer nagyobb mutációs rátát figyeltek meg a vad fenotípus visszatérése alapján. Tartósabb vákuum hatás alatt a DNS sérülések
101
felhalmozódhatnak. A leghosszabb megfigyelés közel 6 évig tartott az LDEF (Long Duration Exposure Facility) program keretében. Az itt szerzett tapasztalatok szerint a spórák 30%-a túlélte a világűr vákuumának hatását akkor, hogyha sókristályokba ágyazták őket (Horneck 1993). 6.2.4. Az UVC fotoproduktumok DNS szerkezetét módosító hatása Kísérleteink
során
a
világűrben
uralkodó
körülmények
közül
az
élet
szempontjából legkritikusabbakat szimuláltuk. A viszonylag alacsony pályán keringő Nemzetközi Űrállomás EXPOSE egységére küldött mintákat a Föld geomágneses mezeje hatékonyan védi a napszél és a kozmikus sugárzás töltött részecskéi okozta károsodásoktól (Horneck 1998). A vákuum mellett biológiai szempontból kritikus másik tényező a Nap nagy energiájú UV sugárzása, aminek hatását a napszimulátor mellett 254 nm-en emittáló germicid lámpával tanulmányoztuk. A DNS ebben a tartományban elnyelési csúccsal rendelkezik, ezért ezekre a hullámhosszakra fokozottan érzékeny. Az UVC sugárzás fő fotoproduktumai a pirimidin dimerek (CPD és 6-4 PD), amik más sérüléseknél nagyságrendekkel nagyobb számban keletkeznek. Vékonyrétegeken és a DNS kisebb mértékben hidratált állapotaiban a száltörések és DNS–fehérje keresztkötések mellett (Cadet és mtsai 1992) a nem szomszédos pirimidinek dimerjei, a spóra fotoproduktumok is jelentős számban képződnek, akár különböző DNS láncok között is (Douki és mtsai 2003). A nagy energiájú UV sugárzás hatásaira vonatkozó kísérletek jelentős része exobiológiai vonatkozású, különösen a Bacillus subtilis spórákkal kapcsolatban született sok eredmény. Ezek alátámasztják, hogy a világűrben uralkodó körülmények között is a DNS az UV sugárzás fő célpontja (Horneck 1993). A fág és DNS vékonyrétegek UVC besugárzását a szendvics elrendezésű zárt mintatartó szelencékben végeztük. Az UV besugárzás hatására a vékonyrétegek 264 nm-en mért abszorpciója a dózis függvényében kis mértékben növekedett, amit csak differencia-spektrumokon tudtunk kimutatni (5.5.1. fejezet, 38. ábra); a DNS filmek esetén a változás sokkal kifejezettebb, mint a fág filmeken. Ez az eredmény a fehérjék és a sókristályok DNS-t stabilizáló szerepére utal (5.5.1. fejezet, 39. ábra). A domináló fotodimerek megjelenése a monomerek számának csökkenése miatt az abszorpció csökkenését eredményezi. Az ennek ellenére megjelenő hyperkrom effektus
102
ettől eltérő, az irodalomban említett denaturáló sérülések megjelenésére utal. E sérülések kialakulásának kedvezhet az a körülmény, hogy a vékonyrétegeken a DNS molekulák szorosan egymásra préselődnek, és a hélixek közötti távolság csupán töredéke az oldatbelinek. A 45. ábra sematikusan ábrázolja a dimerek és denaturáló fotoproduktumok hatását az abszorpcióra. Azonban hangsúlyozni kell, hogy az UV spektrum csak a nukleotid bázisok „stacking” kölcsönhatás által befolyásolt gerjeszthetőségét tükrözi, ami lényegében a DNS szerkezetére, konformációjára utal, nem pedig közvetlenül a fotoproduktumokra.
+ | 45. ábra. Dimerek és denaturáló fotoproduktumok hatása a DNS abszorpciójára Két szomszédos pirimidinből kialakuló dipirimidin dimerek a monomerek számának csökkentésével befolyásolják az abszorpciót, ezzel szemben a denaturáló fotoproduktumok miatt a „stacking” kölcsönhatás módosul, csökken a hypokrom effektus és az OD nő; a két folyamat egyidejű jelenléte esetén a tényleges abszorpció változást az ellentétes hatások eredője szabja meg
6.2.5. Telítődés az UVC sérülések mennyiségében A Taq-polimeráz működését gyakorlatilag minden DNS sérülés gátolja (Hegedüs és mtsai 2003), ezért a polimeráz láncreakcióval meg tudtuk határozni a teljes sérülésszámot mind a fág, mind a DNS filmeken (5.5.1. fejezet, 40. ábra). Vékonyrétegekben, csakúgy mint korábban bemutatott eredményeink szerint az oldatokban (5.3.1. fejezet, 32. ábra, 5. táblázat), a T7 fágon belüli DNS-ben jóval több
103
sérülés keletkezett. Ennek oka az lehet, hogy a DNS-hez kötődő fág-fehérjék az örökítőanyag térszerkezetét módosítják a kapcsolódási helyeken, és így kedveznek az UV sérülések kialakulásának. Az is lehetséges, hogy a gerjesztési energia a DNS vékonyrétegekben is kiszökik a DNS gerince mentén a láncból, míg fágokban a fehérjékkel való kölcsönhatás ezt megakadályozza. Míg oldatokban a fágon belüli és az izolált DNS sérülésében a germicid lámpa esetében közel 3-szoros különbséget mértünk (Hegedüs és mtsai 2003), addig vékonyrétegeken ennél jelentősen kisebb eltérést tapasztaltunk, ami még a legnagyobb dózisoknál sem érte el a 2-es szorzót (Hegedüs és mtsai 2006b). Az izolált DNS-hez képest a fágot tartalmazó minták nagyobb érzékenységének vékonyrétegeken történő csökkenése alátámasztja azt, hogy a vékonyrétegekben a sókristályok jelenléte a DNS-t stabilizáló védő faktor lehet. Tapasztalataink azt mutatják, hogy kisebb UV dózis esetén a sérülésszám egyenletesen növekszik, míg nagyobb dózisoknál (30–40 kJ/m2 felett) a fág és a DNS vékonyrétegek esetében a sérülésszám telítést mutat, azaz a léziók száma egy adott értéken túl lényegében nem nőtt tovább (5.5.1. fejezet, 40. ábra). A jelenség hátterében dinamikus egyensúlyi helyzet kialakulása állhat, amit az egyes UV fotonok földi körülmények között megszokott hatásainak additív figyelembe vételével nem lehet megmagyarázni (Sutherland 2002). Az UVC fotonok az ép DNS-ben elnyelődve a nukleotid bázisok gerjesztését okozzák. A többlet energia egy része kémiai kötések átrendeződésére fordítódhat, ami a fotoproduktumok kialakulását eredményezi. Ha a sérülések száma a DNS-ben elég nagy, akkor megnő annak a valószínűsége, hogy a fotont ne ép, hanem károsodott (dimer formában lévő) bázisok nyeljék el. Ilyenkor előfordul, hogy a kötések ismételt átrendeződése az eredeti, energetikailag igen stabil állapot
visszaállítására
vezet.
A reverziós
folyamat
valószínűségét
jellemző
kvantumhatásfok a dimerek kialakításáénál egy-két nagyságrenddel nagyobb: 254 nmes sugárzás esetén a timin dimerek kialakulásának kvantumhatásfoka ≈20·10-4, míg a dimerek fotoreverziójáé ≈650·10-4 (Görner 1994, Patrick és Rahn 1976). Feltételezhető, hogy a telítés beálltakor a sérülések kialakulása és visszaalakulása egyensúlyra jut. Ha a sérülések kialakulása valóban statisztikai esemény, akkor a populációban véges számú átlagos sérülést tartalmazó molekulák mellett lesznek nagyobb, de jóval kisebb mértékben sérült példányok is. Ez lehetőséget teremt arra, hogy a fág vagy DNS átvészeljen egy akár hosszabb interplanetáris utazást is.
104
6.2.6. A rétegvastagság védő hatása A 20–500 nm közötti vastagságú fág és DNS vékonyrétegeken a rétegek jelentős árnyékoló hatását tapasztaltuk. Az egymás alatt elhelyezkedő részecskék viszonylagos UVC védettsége miatt a besugárzás hatására bekövetkezett PCR termék csökkenés a vastagabb minták esetében kisebbnek adódott, mint a vékonyaknál. Különböző kiindulási DNS mennyiségek felhasználásával azonos méretű kvarc korongokon változtatni tudtuk a készített vékonyréteg vastagságát, amit a 260 nm-en mért OD-val követtünk. Az 555 bp-os fragmens kezelt és kezeletlen mintákból kapott PCR termékének arányát (A/A0) a besugárzási dózis függvényében ábrázoltuk (5.5.2. fejezet, 41. ábra). A rétegvastagság szűrő hatásának számszerű figyelembe vételéhez korrekciós faktort számítottunk. Az OD260=0,05–0,6 közötti vékonyrétegek esetén megvizsgáltuk az A/A0 – dózis függvényeket. Tapasztalataink szerint a rétegvastagsággal a vizsgált függvények meredeksége csökken. A korrekciós faktor meghatározásához a dózis–hatás függvények meredekségének reciprok értékét (’m’) használtuk. A 46. ábra az ’m’ érték rétegvastagságtól való függését mutatja be. Legvékonyabb rétegeink OD260=0,05-osak, és feltételeztük, hogy ilyen vékony – 2 nm vastag DNS monolayerből (Folkard és mtsai 1993) kb. 10 molekularéteget tartalmazó – filmeken az árnyékoló hatás minimális. Ennélfogva
az
összes
többi
vékonyréteget
ehhez
hasonlítottuk.
A
vizsgált
rétegvastagságok korrekciós faktor értékeit a vizsgált és a referencia réteg ’m’ értékeinek hányadosaként határoztuk meg. OD260 = 0,1; 0,25; 0,35; 0,5 és 0,6 -re rendre 0,94; 0,65; 0,55; 0,40 és 0,35 adódott ±5% szórással. A minta felszínére érkező dózist megszorozva a korrekciós faktorral megkapjuk azt az átlagos UVC dózist, amivel a réteg teljes vastagsága mentén számolhatunk. Az irodalomban hasonló korrekció alkalmazására található példa (Yoshida és Regan 1997a).
105
46. ábra. DNS vékonyrétegen meghatározott ’m’ érték a rétegvastagság függvényében (Hegedüs és mtsai 2006b): UVC-vel (254 nm) besugárzott (A) és kezeletlen (A0) NaDNS vékonyrétegek 555 bp-os PCR termék aránya (A/A0) alapján számított dózis– hatás görbék kezdeti meredekségének reciproka kJ/m2-ben a vékonyréteg OD260 értékének függvényében ábrázolva
A minták vastagsága a világűrbeli körülmények között a túlélésben nagyon fontos lehet. Eredményeink szerint hozzávetőleg 60 egymásra rakódott rétegnél az önárnyékoló hatás már felére csökkenti az átlagos dózist, vagyis az alsó rétegeket érő károsító hatás töredéke annak, amit a felszínt érő dózis alapján várhatnánk (Hegedüs és mtsai 2006b). A természetes úton kialakuló mintákban is sok egymásra rétegződő organizmussal, összecsapzódott csomókkal kell számolni. Különösen további védő faktorok – például meteorit por – jelenlétében a mikroorganizmusok egy része egészen extrém külső hatások során sem veszti el életképességét, ahogy azt Bacillus subtilis spórákon többszörösen bizonyították (Horneck és mtsai 2001b). 6.2.7. Különböző sérülés típusok megoszlása Mind vákuum, mind UVC kezelés során kapott eredményeink utalnak arra, hogy a világűrben uralkodó körülmények között a domináns dimerek mellett egyéb sérülések is jelentős számban keletkeznek (5.5.1. fejezet, 39. ábra). Sem az abszorpciós spektroszkópia, sem a polimeráz láncreakció felhasználásával nem lehet számszerű
106
különbséget tenni az egyes sérülés típusok között. Mindkét vizsgáló módszerrel csak a különböző természetű léziók eredőjét tudjuk meghatározni. Ezért molekuláris biológiai módszerek kombinációjával kvantifikáltunk egyes fontosnak tartott fotoproduktumokat. A kezeléshez használt SOL 2000 napszimulátor széles tartományban emittál, amely a dimerek kialakításában leghatékonyabb UVC (Cadet és mtsai 1992) mellett egyéb hullámhosszakat is tartalmaz. A különböző száltörések a QPCR-ral meghatározott teljes sérülésszámnak hozzávetőleg egy tizedéért felelősek. Specifikus fotoproduktumoknál hasító enzimekkel meghatároztuk a CPD-k mennyiségét és az apurinezett/apirimidinezett helyeket. Az előbbiekből a várakozásoknak megfelelően igen sok keletkezett, míg az utóbbiakat nem tudtuk számottevő mennyiségben kimutatni (5.5.3. fejezet, 42. ábra). 254 nm-es UVC besugárzás után az enzimatikus emésztés alapján még egyértelműen a CPD-k voltak a domináló fotoproduktumok és a teljes sérülésszám több mint 60%-át tették ki (Hegedüs és mtsai 2006b). A széles spektrumú napszimulátor esetén a CPD-k kialakulásának kedvező hullámhosszak aránya jelentősen csökkent. Mind az ennél nagyobb, mind az ennél kisebb energiájú komponensek hatásosak azonban más sérülések kialakításában (Patrick és Rahn 1976). Különösen igaz ez a DNS–fehérje keresztkötésekre, amik vékonyrétegeken a nukleoprotein partikulumok szoros rendezettsége miatt is nagyobb mennyiségben várhatóak (Peak és Peak 1991). Ez magyarázza, hogy eredményeink szerint nagy mennyiségű DNS–fehérje keresztkötés (napszimulátorral ≈57%, germicid lámpával ≈11%) alakult ki fág vékonyrétegeken (Fekete és mtsai 2005, Hegedüs és mtsai 2006b). Azt tapasztaltuk, hogy a számszerűen meghatározott léziók összességükben sem napszimulátorral, sem monokromatikus UVC forrással végzett besugárzás után nem adják ki a QPCR-ral meghatározott teljes sérülésszámot, hanem annak csak 80–85%-át. A fennmaradó részt a nem vizsgált, részben denaturáló további fotoproduktumok teszik ki. Ezek közül irodalmi adatok alapján vékonyrétegeken a spóra fotoproduktumok (5-timinil-5,6-dihidrotimin) és keresztkötések fokozott előfordulására lehet számítani (Douki és mtsai 2003, Varghese 1970).
107
6.2.8. A vákuum és az UVC sugárzás szinergisztikus hatása A világűrben a korábban külön-külön vizsgált vákuum és UV hatás egyszerre éri a vékonyrétegeket. A különböző mechanizmusú károsodások egymásra hatásának tanulmányozásához a mintákat nyitott szelencékben részesítettük kombinált kezelésben. A bekövetkező változást a minta abszorpciós spektruma és a QPCR eredményei alapján meghatározott
sérülésszám
segítségével
követtük
(5.5.4.
fejezet,
43.
ábra).
Megállapítottuk, hogy a kombinált kezelés nagyobb hatással van, mint ami a csak vákuum vagy csak UV kezelések összegeként várható lenne. Az élet szempontjából igen kritikus két faktor közti szinergizmust nem csak a spektroszkópiai és QPCR eredmények mutatják, hanem a fágok túlélésében is ilyen tendencia mutatkozik (Hegedüs és mtsai 2006b). Feltételezzük, hogy a vákuum hatásának kialakulása során a dehidráció hatására a DNS részleges denaturációt szenved, ami a nukleotid bázisok kitekeredésével járhat. A kitekeredés miatt egymás közelségébe kerülő kettős kötések UV sugárzással könnyebben reagálnak, ami a fotoproduktumok fokozott kialakulásának kedvez (Mitchell és mtsai 1996). Az ultraibolya sugárzás fokozza a vákuum szárító hatását és egyes fotoproduktumok a dehidráció-rehidráció folyamán más, súlyosabb sérülésekké alakulhatnak (Dose és mtsai 1996). Vákuumban vagy száraz argon atmoszférában végzett ultraibolya besugárzás fokozott hatását tapasztalták Bacillus subtilis spórák, Deinococcus radiodurans sejtek és Aspergillus ochraceus konídiumok esetében is. Az EVT3 keretében végzett hasonló kísérleteink alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy – az irodalmi adatokkal összhangban – T7 fágnál sincs jelentős különbség a vákuum és a száraz argon hatásában (Fekete és mtsai 2005). A vizsgált mikroorganizmustól függ az, hogy pontosan milyen domináns sérülések alakulnak ki. Deinococcus radioduransban sok DNS–DNS keresztkötést figyeltek meg, Aspergillus ochraceusban a kettős szálú törések dominálnak, Bacillus subtilis spórákban a kettős szálú törések mellett DNS–fehérje keresztkötések is jelentős mennyiségben keletkeznek (Dose és mtsai 1995, Dose és mtsai 1996).
108
Az exobiológia fokozott érdeklődéssel fordul az extrém körülményeket is elviselni képes mikroorganizmusok felé, amilyenek a fokozott szárazságot is eltűrő anhidrobióták vagy a sugárzásnak ellenálló radiorezisztens törzsek. A T7 fág világűrbeli sorsa ezen felül azért különösen érdekes, mert a fágon belüli DNS elrendeződése a kromoszomális szerkezethez hasonló és a T7 fágon, mint modellen kapott eredmények extrapolációját teszi lehetővé. A T7 fágot és DNS-ét fel lehet használni széles körű környezeti hatások okozta örökítőanyag károsodás vizsgálatára.
109
7. Következtetések
Napjainkban erősen növekszik az emberi szervezetet érő ultraibolya sugárzás mennyisége, aminek hátterében az emberi tevékenység áll. A minket érő UV sugárzás nem csak mennyiségében, hanem minőségében is változik. A napozás és a szoláriumok használata sokszorosára növeli az UV dózist. A rövidebb hullámhosszúságú komponenseket kiszűrő ózonréteg elvékonyodása és egyes mesterséges források következtében olyan nagy energiájú UV sugárzással is számolni kell, ami korábban nem volt számottevő, de fokozottan veszélyes az élőlényekre. Az élő szervezetek a különböző hullámhosszúságú sugárzásokkal szemben eltérő érzékenységet mutatnak. A minket érő ultraibolya spektrumtól és az egyes energiákra jellemző, hullámhosszanként különböző érzékenységtől függ az, hogy a környezetünkben történő változások milyen hatásokat váltanak ki. A biológiailag hatásos dózis meghatározása ezért rendkívül összetett feladat. A megoldást biológiai doziméterek használata jelentheti, amik a különböző hullámhosszakon abszorbeált energiát annak biológiai hatásossága szerint súlyozva integrálják. Az ultraibolya sugárzás nagy energiájú tartományára (UVB, UVC) az élőlények fokozottan érzékenyek, mert az örökítőanyag itt jelentős elnyelést mutat. A DNS-ben kialakuló dimerek, száltörések, DNS–fehérje keresztkötések és sok más fotoproduktum más-más arányban keletkeznek az egyes hullámhosszakon, de mutagén hatásuk általánosan ismert. Bizonyított, hogy a bőrrákok szempontjából a DNS sérüléseinek van elsődleges szerepe. Mindezen folyamatok szükségessé teszik a DNS alapú biológiai dozimetria kiterjesztését széles spektrumú UV hatásra. Ebben a témában folytatott kutatómunkám során a DNS-re kifejtett hatások tanulmányozásához a T7 bakteriofágot használtam, mert a fág könnyen kezelhető és mert a fehérjékkel kölcsönhatásban lévő DNS a kromoszóma modelljeként használható. A T7 bakteriofág biológiai doziméterként való felhasználásával kapcsolatban az alábbi eredményekre jutottam:
110
I.1. A fág sérülések élőszám-csökkenésre alapozott, közvetett meghatározása helyett a fág-DNS sérülésének közvetlen mérésére alkalmas módszert, kvantitatív polimeráz láncreakciót (QPCR) fejlesztettem ki. A QPCR optimalizálásával elértem, hogy a termék szempontjából reakcióról reakcióra a sértetlen kiindulási DNS mennyisége legyen az egyetlen limitáló tényező. A DNS-ben bárhol kialakuló sérülés gátolja a Taq-polimerázt, ezért a termék mennyisége
a
sérülések
következésképpen
a
teljes
polimeráz
számával
arányosan
láncreakcióban
csökken,
szintetizált
DNS
mennyiségéből a kiindulási DNS mintában lévő sérült molekulák arányára tudtam következtetni. A kvantitatív polimeráz láncreakció gyakorlatilag valamennyi
DNS
sérülés
detektálására
képes,
ezért
különböző
örökítőanyagot károsító hatások következményeinek mérésére is alkalmas. Ezek közé tartozik a széles spektrumú UV hatás, de a gyakorlati alkalmazás más területeken is lehetséges, például genotoxikus vegyületek vagy ionizáló sugárzás hatásainak vizsgálatánál. A reakció annyira stabil, hogy a DNS megtisztítását nem igényli, a teljes fágon való közvetlen mérés lehetősége a munkafolyamat
egyszerűsödése
miatt
a
gyakorlati
alkalmazást
is
megkönnyíti. I.2. Az eljárás kvantitatív kiértékelése lehetővé teszi a sérülésszám pontos meghatározását. A kezelt és kezeletlen nukleinsav PCR termékének arányából a mintában található ép és sérült DNS láncok mennyiségére következtettem.
A
léziók
véletlenszerű
kialakulását
feltételezve
a
sérülésszám a populáción belül Poisson-eloszlást követ. A sértetlen molekulák kísérletesen meghatározott mennyiségéből nulladrendű Poissonösszefüggés alapján számoltam az átlagos sérülésszámot. A DNS-ben kialakult teljes sérülésszámot ennek ismeretében kaptam. Az így született eredményeket a hagyományos mikrobiológiai módszerek (biológiai aktivitás csökkenése) alapján számított értékekkel is alá tudtam támasztani.
111
I.3. A polimeráz láncreakció az exponenciális amplifikáció miatt megfelelően hosszú
fragmensek
esetén
a
DNS
sérülések
rendkívül
érzékeny
meghatározására alkalmas. Rövidebb fragmensekben azonos sérülésszám kialakításához jóval nagyobb dózisra van szükség. A T7 fág 555 bp-os és 3826 bp-os fragmensére történt optimalizáció után bebizonyítottam, hogy az átlagos sérülésszám és a fragmenshossz egymással egyenesen arányos. Ennek alapján megállapítottam, hogy a két reakció esetében a teljes genomra számított sérülésszám megegyezik. A QPCR-ral kiértékelt fág/DNS biológiai
dózismérő
különböző
fragmenshosszak
esetében
eltérő
dózistartományokban használható. A hosszabb fragmens rövid expozícióra, a rövidebb pedig hosszú expozícióra alkalmas. A fág/DNS doziméter használható, mint rövid-, közép- és hosszútávú doziméter természetes napfény monitorozásakor, és kis, közepes és nagy dózisok mérésére mesterséges sugárforrások esetén. Ezért a T7 fág DNS-én végzett QPCR segítségével – szemben más dózismérőkkel – a teljes biológiailag releváns dózistartomány felölelhető. I.4. Öt különböző sugárforrás felhasználásával kísérleteinkben felöleltük az UVA–UVB–UVC tartományt. Azonos biológiai dózis hatására a polimeráz láncreakcióval meghatározott sérülésszám a különböző sugárforrások esetében nem változott. Bizonyos egyedi sérülések (CPD-k és 6-4 PD-k) kialakulásában munkacsoportunk korábban erős hullámhossz-függést tudott kimutatni a kezelések azonos biológiai hatása ellenére is. Ebből arra következtettem, hogy a QPCR nagy előnye, hogy a sugárzás összetételétől függetlenül, a DNS-ben kiváltott fotosérülések többségét – tekintet nélkül azok természetére – detektálni tudja. I.5. Hitelesítettem a T7 fág biológiai dózismérőt a QPCR alapján. A T7 fág biológiai doziméterben a biológiai dózis egységét a definíciónak megfelelően az élőszám-csökkenés alapján határozzák meg. Kimutattam az összefüggést az élőszám-csökkenésből számítható sérülésszám és a két fragmentumban
kísérletileg
mérhető
112
teljes
sérülésszám
között.
Bizonyítottam, hogy a QPCR-ral kapott értékek a biológiai UV dózis alapján számított értékeknek jól megfelelnek. A két fragmentum alapján meghatározott sérülésszám között nincs szignifikáns eltérés. Ezzel lényegében igazoltam, hogy a T7 fágban igen nagyszámú sérthető hely található és ezek közül már egynek a sérülése is a fág inaktivációját okozza, a sérülések valóban véletlenszerűen, Poisson-eloszlás szerint történnek. I.6. A DNS ultraibolya sugárzás által okozott sérüléseinek kialakulásában általában szerepet játszik az, hogy az örökítőanyagot felépítő bázisok mennyire vannak kedvező helyzetben fotoproduktumok kialakítására. QPCR segítségével megállapítottam, hogy a DNS különböző térszerkezetű állapotaiban (A-, B-, C- és D-konformációban) nincs szignifikáns különbség az UV sugárzás által okozott léziók keletkezésében, vagyis a DNS általános térszerkezete nem játszik döntő szerepet a sérülések kialakulásában. I.7. Vizsgáltam a fág-fehérjék szerepét a DNS UV sugárzás által előidézett fotosérüléseinek
létrejöttében.
A
várakozások
szerint
a
fehérjék
örökítőanyagot stabilizáló és az UV sugárzás gyengítésére való képessége miatt a proteinek védő hatása volt feltételezhető. Ezzel ellentétben a fágon belüli DNS-ben minden UV forrás esetében jóval több sérülés keletkezett, mint izolált DNS-ben és „fűtött fág”-ban. A DNS konformáció szerepét előzőleg
kizártam
az
eltérő
sérülésszámok
kialakulásában.
Ezért
valószínűsíthető, hogy a fágon belüli fokozott DNS sérülékenység oka, hogy a proteinekhez való kötődés környezetében kitekeredő pirimidinek kettős kötései egymással fedésbe kerülnek és UV sérülésre esendőbbekké válnak. Emellett a fehérje kötődése meggátolhatja a DNS-ben az elnyelt gerjesztési energia eloszlását is a szál gerince mentén.
113
A fentiekben vázolt eredmények alapján a T7 fág biológiai dozimétert és a kiértékeléshez használt polimeráz láncreakciót alkalmasnak tartom bármilyen eredetű DNS sérülés tanulmányozására, beleértve szélsőséges UV sugárzási viszonyok, ionizáló sugárzások, extrém körülmények, vagy genotoxikus vegyületek hatásainak vizsgálatát. Ezt az új eljárást további módszerekkel kiegészítve a gyakorlati alkalmazhatóságra extraterresztriális körülmények DNS-re és T7 fágra kifejtett hatásainak vizsgálatával mutattam példát. A DNS és egyszerűbb mikroorganizmusok világűrbeli sorsa fontos kérdés az élet kialakulása és bolygók közti átvitelének lehetősége szempontjából. A régmúltban ezekben a folyamatokban meteorit kőzetdaraboknak lehetett szerepe. Ma az űrjárművek fedélzetén utazó „potyautasok” jelentenek problémát a világűr mikrobiológiai biztonsága szempontjából. A kérdéssel foglalkozó exobiológiai kutatásokra ad lehetőséget a Nemzetközi Űrállomásra kifejlesztett EXPOSE egység. Az ESA által támogatott kísérletek között szerepelnek a PUR (Phage and Uracil Response) program T7 fág, fág-DNS és uracil vékonyrétegei. A világűrbeli kísérleteket földi szimulációs méréseknek (EVT) kell megelőznie, amiknek eredményei a tapasztalatszerzést szolgálják, és segítik a felkészülést arra, hogy a világűr körülményeinek milyen következményeivel kell számolni. Ennek a kísérletsorozatnak az eredményeként az alábbi megállapításokra jutottam: II.1. A munkacsoport által kifejlesztett mintatartó szelencék és fág/DNS vékonyrétegek az űrszimulációs kezelésre alkalmasak. A centrifugális ülepítéssel készített T7 fág/DNS vékonyrétegek jó minőségűek, a mikroszkópos felvételek és spektrofotometriás mérések tanúsága szerint egyenletes
fedettségűek.
Utóbbi
mérések
eredményeként
azt
is
megállapítottam, hogy a mintákon tapasztalható fényszórás a vártnál kisebb mértékű és ez a vékonyrétegek homogén szerkezetével magyarázható. A vizsgált filmek a hordozó anyagra erősen adszorbeálódnak és a világűr vákuumát szimuláló alacsony nyomáson is stabilak.
114
II.2. A vákuumkezelés (10-4–10-6 Pa) következményei alapján megállapítottam, hogy a fág és DNS vékonyrétegek viszonylag jól viselik ezt a szélsőséget. A vákuum a vékonyrétegeken vízvesztést okoz, ami az örökítőanyag konformációjának változását eredményezi. Eredményeim szerint az erőteljes dehidráció a DNS részleges denaturációját okozza, de a vékonyrétegeken beszáradt, rögzült szerkezet miatt ez a változás rehidráció során reverzibilis. A maradandó sérülések száma nem jelentős, köztük elsősorban száltöréseket és DNS–fehérje keresztkötéseket találtam. II.3. Az űrállomás környezetében várható hőmérséklet-ingadozások esetén a minták stabilak. A vizsgált hőkezelés kedvez a DNS denaturációjának, de csak elvétve okoz száltöréseket. II.4. Monokromatikus UVC (254 nm) sugárzás hatására az oldatokban is domináló dimer fotoproduktumok mellett a fág/DNS vékonyrétegben egyéb fotosérülések meghatározott
kialakulására teljes
is
találtam
sérülésszámban
bizonyítékot.
nagy
UVC
A
QPCR-ral
dózisoknál
telítés
mutatkozik mind a fág, mind a DNS vékonyrétegekben. Ennek hátterében a sérülések kialakulása és fotoreverziója közötti egyensúly feltételezhető. A sérülések száma egy idő után nem emelkedik tovább, ami lehetővé teszi igen nagy elszenvedett dózisok ellenére is a fágok vagy DNS molekulák egy részének épségben maradását. Vékonyrétegekben a fágok UV sérülésre való – izolált DNS-énél lényegesen nagyobb – érzékenysége az oldatokéhoz képest csökken, mert valószínűleg a filmeken jelenlévő sókristályok a DNS stabilizálásában szerepet játszanak. II.5. A monokromatikus UVC forrás (254 nm) és a széles tartományban emittáló napszimulátor (200–400 nm) által okozott egyes sérülések típusai közötti megoszlás alapján megállapítottam, hogy míg előző esetben a dimer fotoproduktumok dominálnak, addig más hullámhosszak jelenlétében (polikromatikus UV) ez a dominancia csökken és egyéb, köztük vékonyrétegekre jellegzetes sérülések kerülnek előtérbe. Ide tartoznak
115
többek között a DNS–fehérje keresztkötések, valamint az egyszeres és kétszeres száltörések, amiknek kialakulásában a vékonyrétegeken jellemző szoros rétegződés is szerepet játszhat. II.6. Együttesen alkalmazott vákuum és UV besugárzás során a két hatás közötti szinergizmust tapasztaltam mind spektroszkópiai mérések, mind a QPCR alapján. A kombinált kezelés a komponensek izolált hatásához képest a vártnál nagyobb sérülésszámot okozott, ami nem adódott egyszerűen az egyes részfolyamatok összegeként. Ez felhívja a figyelmet arra, hogy a valóságos viszonyok szimulációjakor nem elég az egyes paraméterek hatását izoláltan vizsgálni, hanem tekintettel kell lenni a köztük kialakuló esetleges kölcsönhatásokra is. A nagy energiájú UV sugárzás nem-additív hatására utal a fotosérülést kiváltó és revertáló fotoreakció. Míg a Föld felszínét elérő napsugárzásban az egyes hullámhosszak hatását additív módon lehet figyelembe venni, addig a világűr viszonyai között ez az egyszerűsítés elveszítheti létjogosultságát. II.7. Megállapítottam, hogy vastagabb fág és DNS vékonyrétegeken a felsőbb rétegek az alattuk lévőket leárnyékolják. Ennek a védelemnek az eredményeképpen a vastagabb rétegekben kevesebb sérülés keletkezik. A védő hatás a réteg vastagságával arányos. A QPCR adatok alapján kidolgoztam egy korrekciós faktor számítását, aminek segítségével a minta felszínét érő dózis alapján a vastagság ismeretében a vékonyrétegen eső átlagos dózis meghatározható. A rétegvastagság védő hatása más protektív faktorokkal együtt a fágok világűrbeli túlélését segítő jelentős tényező.
116
8. Összefoglalás Napjainkban az emberi tevékenység nyomán változó sugárzási környezetben élünk, amibe beletartozik az ultraibolya tartomány egyre szélesebb spektruma is. A biológiai rendszerek az egyes hullámhosszakra különböző érzékenységgel reagálnak. Az ultraibolya sugárzás fő támadáspontja az élő szervezetekben az örökítőanyag, ezért hatásainak
tanulmányozásához
célszerű
magát
a
DNS-t
használni
biológiai
doziméterként. A DNS sérüléseknek alapvető szerepe van a bőrrákok kialakulásában, ami az ultraibolya sugárzást a leggyakoribb környezeti rákkeltő ágenssé teszi. Munkám során széles UV spektrum (200–400 nm) által kiváltott DNS sérülések számszerű meghatározásának módszerét dolgoztam ki és alkalmaztam. Erre a célra T7 bakteriofág DNS-ének két fragmensére polimeráz láncreakciót optimalizáltam (QPCR). A termék mennyisége alapján Poisson-egyenlet segítségével kvantitatíven meg tudtam határozni az átlagos sérülésszámot. A reakció teljes fágban is működik, és érzékenysége a célszekvencia hosszától függ, ami a gyakorlatban az 555 bp-os fragmenst nagyobb, a 3826 bp-osat kisebb dózisok meghatározására teszi alkalmassá. Az UVA–B–C tartományt felölelő öt sugárforrás esetében a fág biológiai aktivitásának csökkenése alapján számítható és a PCR-ral meghatározott sérülésszám között jó egyezést találtam. Ez arra utal, hogy a QPCR valamennyi UV sérülés detektálására képes és a T7 fág biológiai dózismérő hitelesítésére alkalmas. Izolált és fágon belüli DNS sérülésének összehasonlítása alapján megállapítottam, hogy a fehérjékhez való kötődés jelentősen fokozza a DNS sérülékenységét, és ebben nem a DNS konformációjának van szerepe. Az ultraibolya sugárzás a világűrben is a biomolekulák sorsát meghatározó egyik döntő tényező. Az ISS EXPOSE egységére küldendő
T7 fág / izolált DNS
vékonyrétegek az űrszimulációs kísérletekre alkalmasnak bizonyultak. A vákuum dehidráló hatása és a várható hőmérséklet-ingadozás viszonylag alacsony sérülésszámot eredményezett. UVC sugárzás hatására a sérülések keletkezésében telítődés mutatkozik, aminek hátterében a fő fotoproduktumok, a dimerek fotoreverziója állhat. Szélesebb extraterresztriális
spektrum
hatására
a
vékonyrétegekre
jellemző
egyéb
fotoproduktumok is előtérbe kerülnek. Vákuummal kombinált UVC kezelés szinergista hatású. A sérülések ellen azonban a vastag rétegeken jelentkező árnyékolás – például ásványi anyagok protektív hatásával kiegészülve – számottevő védelmet jelenthet.
117
9. Summary Extension of DNA based dosimetry to broad-band UV radiation Human activity is leading to a changing radiation environment, including the broadening spectrum of ultraviolet radiation. The main target of ultraviolet rays in the living organisms is the genetic material, therefore it seems reasonable to use the DNA itself as a biological dosimeter. The DNA damage in skin cancer makes UV radiation the most ubiquitous environmental carcinogenic agent. The aim of this work was the development and application of a method for the quantitative determination of DNA damages caused by a wide spectrum of UV radiation by polymerase chain reaction (QPCR). QPCR was optimized for two fragments of bacteriophage T7 DNA. Based on the amount of the PCR product Poisson-equation was used to calculate the average lesion frequency. The QPCR works also on intact phages; and its sensitivity dependens on the fragment length used. Routine use of the 555 bp fragment is possible for the determination of large doses, while the 3826 bp fragment is suited for smaller ones. In the case of five various sources of UVA–B–C radiation a good agreement was found between the lesion frequencies determined by QPCR and calculated from biological activity data. This indicates that the QPCR method is capable of detecting practically all UV photoproducts and it can be used for the validation of the phage T7 biological dosimeter. The comparison of total lesion frequencies in intact phage and isolated DNA led to the conclusion that protein binding to DNA can increase its UV sensitivity due to local structural changes, where protein binding is the decisive factor and not DNA conformation. High-energy ultraviolet radiation is also one of the deleterious parameters in space survival of biomolecules. Our T7 phage / DNA thin layers to be sent to the EXPOSE unit of ISS proved to be suitable for space simulation experiments. The dehydrating effect of vacuum and on-board temperature fluctuation resulted in low lesion frequencies. Interestingly UVC irradiation led to a saturation tendency in lesion formation both in phage T7 and DNA, which can be explained by the photoreversion of dimer photoproducts. A broader spectrum of extraterrestrial radiaton caused a significant amount of other photoproducts as well. UVC radiation combined with vacuum treatment showed a synergistic effect. However, shielding by thicker layers and e.g. mineral material may result in substantial protection of phage / DNA from extraterrestrial damages.
118
10. Irodalomjegyzék 10.1. FELHASZNÁLT IRODALOM
1.
Ádám V, Faragó A, Machovich R, Mandl J. 1996: Orvosi Biokémia; Semmelweis Kiadó, Budapest: 262-265.
2.
Ainsleigh HG. 1993: Beneficial Effects of Sun Exposure on Cancer Mortality; Prev Med. 22 (1): 132-140.
3.
Armstrong BK. 1994: Stratospheric Ozone and Health; Int J Epidemiol. 23 (5): 873-885.
4.
Becker MM, Wang Z. 1989: Origin of Ultraviolet Damage in DNA; J Mol Biol. 210 (3): 429-438.
5.
Becker MM, Wang JC. 1984: Use of Light for Footprinting DNA in Vivo; Nature. 309 (5970): 682-687.
6.
Bérces A, Fekete A, Gáspár S, Gróf P, Rettberg P, Horneck G, Rontó G. 1999: Biological UV Dosimeters in the Assessment of the Biological Hazard from Environmental Radiation; Journal of Photochemistry & Photobiology.B - Biology. 53 (1-3): 36-43.
7.
Berger DS. 1976: The Sunburning Ultraviolet Meter: Design and Performance; Photochemistry & Photobiology. 24 (6): 587-593.
8.
Billi D, Potts M. 2002: Life and Death of Dried Prokaryotes; Res Microbiol. 153 (1): 7-12.
9.
Bornman JF, van der Leun JC. 1998: Frequently Asked Questions (FAQ); Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 46 (I-IV)
119
10.
Cadet J, Anselmino C, Douki T, Voituriez L. 1992: Photochemistry of Nucleic Acids in Cells; Journal of Photochemistry & Photobiology.B - Biology. 15 (4): 277-298.
11.
Cheng S, Chen Y, Monforte JA, Higuchi R, Van Houten B. 1995: Template Integrity is Essential for PCR Amplification of 20- to 30-Kb Sequences from Genomic DNA; PCR Methods & Applications. 4 (5): 294-298.
12. Chyba CF. 2005: Atmospheric Science. Rethinking Earth's Early Atmosphere; Science. 308 (5724): 962-963. 13.
Chyba CF, Thomas PJ, Brookshaw L, Sagan C. 1990: Cometary Delivery of Organic Molecules to the Early Earth; Science. 249: 366-373.
14.
Clancy P, Brack A, Horneck G. 2005: Looking for Life - Searching the Solar System; Cambridge University Press, New York: 33-61.
15.
Cooper G, Kimmich N, Belisle W, Sarinana J, Brabham K, Garrel L. 2001: Carbonaceous Meteorites as a Source of Sugar-Related Organic Compounds for the Early Earth; Nature. 414 (6866): 879-883.
16.
Cox CS. 1993: Roles of Water Molecules in Bacteria and Viruses; Origins of Life & Evolution of the Biosphere. 23 (1): 29-36.
17.
Crespo-Hernandez CE, Cohen B, Kohler B. 2005: Base Stacking Controls Excited-State Dynamics in A.T DNA; Nature. 436 (7054): 1141-1144.
18.
Davis A, Deane GH, Diffey BL. 1976: Possible Dosimeter for Ultraviolet Radiation; Nature. 261 (5556): 169-170.
19.
de Gruijl FR, van Kranen HJ, Mullenders LH. 2001: UV-Induced DNA Damage, Repair, Mutations and Oncogenic Pathways in Skin Cancer; Journal of Photochemistry & Photobiology.B - Biology. 63 (1-3): 19-27.
20.
de Gruijl FR. 1999: Skin Cancer and Solar UV Radiation; Eur J Cancer. 35 (14): 2003-2009.
120
21.
de Gruijl FR. 1996: Environmental UV-Radiation, Risk of Skin Cancer and Primary Prevention Biological Weighting of UV-Radiation; Veröffentlichungen der Strahlenschutzkommission Band 34, Gustav Fischer, Hamburg: 65-76.
22.
Denissenko MF, Venkatachalam S, Yamasaki EF, Wani AA. 1994: Assessment of DNA Damage and Repair in Specific Genomic Regions by Quantitative ImmunoCoupled PCR; Nucleic Acids Res. 22 (12): 2351-2359.
23.
di Sarra A, Disterhoft P, DeLuisi JJ. 2002: On the Importance of Spectral Responsivity of Robertson-Berger-Type Ultraviolet Radiometers for Long-Term Observations; Photochem Photobiol. 76 (1): 64-72.
24.
Distel L, Schwotzer G, Schüssler H. 2006: Radiation-Induced DNA DoubleStrand Breaks in Dependence on Protein Concentration and Under Aerobic and Anaerobic Conditions Radiation Physics and Chemistry. 75 (2): 210-217.
25.
Dose K, Bieger-Dose A, Dillmann R, Gill M, Kerz O, Klein A, Stridde C. 1996: UV Photobiochemistry Under Space Conditions; Advances in Space Research. 18 (12): 51-60.
26.
Dose K, Bieger-Dose A, Dillmann R, Gill M, Kerz O, Klein A, Meinert H, Nawroth T, Risi S, Stridde C. 1995: ERA-Experiment "Space Biochemistry"; Advances in Space Research. 16 (8): 119-129.
27. Douki T, Laporte G, Cadet J. 2003: Inter-Strand Photoproducts are Produced in High Yield within A-DNA Exposed to UVC Radiation; Nucleic Acids Res. 31 (12): 3134-3142. 28.
Dunn JJ, Studier FW. 1983: Complete Nucleotide Sequence of Bacteriophage T7 DNA and the Locations of T7 Genetic Elements; J Mol Biol. 166 (4): 477-535.
29.
Epstein S, Krishnamurthy RV, Cronin JR, Pizzarello S, Yuen GU. 1987: Unusual Stable Isotope Ratios in Amino Acid and Carboxylic Acid Extracts from the Murchison Meteorite; Nature. 326 (6112): 477-479.
121
30.
Falk M, Hartman KA, Lord RC. 1962: Hydration of Deoxyribonucleic Acid., I. A Gravimetric Study; J Am Chem Soc. 84: 3843-3846.
31.
Fekete A, Módos K, Hegedüs M, Kovács G, Rontó G, Péter Á, Lammer H, Panitz C. 2005: DNA Damage Under Simulated Extraterrestrial Conditions in Bacteriophage T7; Advances in Space Research. 36 (2): 303-310.
32.
Fekete A, Rontó G, Hegedüs M, Módos K, Bérces A, Kovács G, Lammer H, Panitz C. 2004: Simulation Experiments of the Effect of Space Environment on Bacteriophage
and
DNA
Thin
Films;
Advances
in
Space
Research.
33 (8): 1306-1310. 33.
Fekete A, Hegedüs M, Módos K, Földvári I, Péter A, Rontó G, Kovács G, Bérces A. 2003: Study of the Effect of Simulated Space Environment on Phage T7 and Isolated T7 DNA Thin Films; Journal of Luminescence. 102-103 (SPEC): 469-475.
34.
Fekete A, Vink AA, Gáspár S, Módos K, Bérces A, Rontó G, Roza L. 1999: Influence of Phage Proteins on Formation of Specific UV DNA Photoproducts in Phage T7; Photochemistry & Photobiology. 69 (5): 545-552.
35.
Fekete A, Vink AA, Gáspár S, Bérces A, Módos K, Rontó G, Roza L. 1998: Assessment of the Effects of various UV Sources on Inactivation and Photoproduct Induction in Phage T7 Dosimeter; Photochemistry & Photobiology. 68 (4): 527-531.
36. Fekete A, Rontó G, Feigin LA, Tikhonychev VV, Módos K. 1982: Temperature Dependent Structural Changes of Intraphage T7 DNA; Biophysics of Structure & Mechanism. 9 (1): 1-9. 37. Földvári I, Fekete A, Corradi G. 1982: Prospects and Difficulties in the Far- and Vacuum-Ultraviolet Spectroscopy of DNA; Journal of Biochemical & Biophysical Methods. 5 (6): 319-327.
122
38. Folkard M, Prise KM, Vojnovic B, Davies C, Roper MJ, Michael BD. 1993: Measurement of DNA Damage by Electrons with Energies between 25 and 4000 eV; International Journal of Radiation Biology. 64 (6): 651-658. 39.
Fonyó A. 1999: Az Orvosi Élettan Tankönyve; Medicina, Budapest: 696-7, 975-6.
40.
Freeman SE, Blackett AD, Monteleone DC, Setlow RB, Sutherland BM, Sutherland JC. 1986: Quantitation of Radiation-, Chemical-, Or Enzyme-Induced Single Strand Breaks in Nonradioactive DNA by Alkaline Gel Electrophoresis: Application to Pyrimidine Dimers; Anal Biochem. 158 (1): 119-129.
41. Furusawa Y, Suzuki K, Sasaki M. 1990: Biological and Physical Dosimeters for Monitoring Solar UV-B Light; J Radiat Res. 31 (2): 189-206. 42.
Gallagher RP, Lee TK. 2006: Adverse Effects of Ultraviolet Radiation: A Brief Review; Progress in Biophysics and Molecular Biology. 92 (1): 119-131.
43.
Gáspár S, Módos K, Rontó G. in Fedina L, Kanyar B, Kocsis B and Kollai M. 1981: Advances in Physiological Sciences, Complex Method for the Determination of the Physiological Parameters of Bacterium-Phage Systems; Pergamon, Oxford: 141-147.
44.
Girod JC, Johnson WC,Jr, Huntington SK, Maestre MF. 1973: Conformation of Deoxyribonucleic Acid in Alcohol Solutions; Biochemistry (NY). 12 (25): 5092-5096.
45.
Görner H. 1994: Photochemistry of DNA and Related Biomolecules: Quantum Yields and Consequences of Photoionization; Journal of Photochemistry & Photobiology.B - Biology. 26 (2): 117-139.
46.
Grossman D, Leffell DJ. 1997: The Molecular Basis of Nonmelanoma Skin Cancer: New Understanding; Arch Dermatol. 133 (10): 1263-1270.
47.
Hegedüs M, Fekete A, Módos K, Kovács G, Rontó G, Lammer H, Panitz C. 2006a: Response of Bacteriophage T7 Biological Dosimeter to Dehydration and Extraterrestrial Solar UV Radiation; Acta A., doi:10.1016/j.actaastro.2006.09.010.
123
48.
Hegedüs M, Kovács G, Módos K, Rontó G, Lammer H, Panitz C, Fekete A. 2006b: Exposure of Phage T7 to Simulated Space Environment: The Effect of Vacuum and UV-C Radiation; Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. (82): 94-104.
49.
Hegedüs M, Módos K, Rontó G, Fekete A. 2003: Validation of Phage T7 Biological Dosimeter by Quantitative Polymerase Chain Reaction using Short and Long Segments of Phage T7 DNA; Photochemistry & Photobiology. 78 (3): 213-219.
50.
Horneck G, Cockell C. 2004: A Planetary Park System for Mars; Space Policy. 20: 291-295.
51.
Horneck G, Baumstark-Khan C. 2001: Astrobiology: The Quest for the Conditions of Life; Springer-Verlag, Berlin: 57-76.
52.
Horneck G, Rettberg P, Reitz G, Panitz C, Rabbow E. 2001a: Studies on Microorganisms in Space: A Contribution to the Discussion on Panspermia, Serach for Life on Mars and Interaction of Life with its Environment; Proc. First European Workshop on Exo-/Astro-Biology, Frascati, 21-23 May 2001. (ESA SP-496): 105-112.
53.
Horneck G, Rettberg P, Reitz G, Wehner J, Eschweiler U, Strauch K, Panitz C, Starke V, Baumstark-Khan C. 2001b: Protection of Bacterial Spores in Space, a Contribution to the Discussion on Panspermia; Origins of Life & Evolution of the Biosphere. 31 (6): 527-547.
54.
Horneck G. 1998: Exobiological Experiments in Earth Orbit; Advances in Space Research. 22 (3): 317-326.
55.
Horneck G. 1993: Responses of Bacillus Subtilis Spores to Space Environment: Results from Experiments in Space; Origins of Life & Evolution of the Biosphere. 23 (1): 37-52.
124
56.
Jean S, Bideau C, Bellon L, Halimi G, De Meo M, Orsiere T, Dumenil G, BergeLefranc JL, Botta A. 2001: The Expression of Genes Induced in Melanocytes by Exposure to 365-Nm UVA: Study by cDNA Arrays and Real-Time Quantitative RT-PCR; Biochim Biophys Acta. 1522 (2): 89-96.
57. Jenkins GJ, Burlinson B, Parry JM. 2000: The Polymerase Inhibition Assay: A Methodology for the Identification of DNA-Damaging Agents; Mol Carcinog. 27 (4): 289-297. 58. Jennerwein MM, Eastman A. 1991: A Polymerase Chain Reaction-Based Method to Detect Cisplatin Adducts in Specific Genes; Nucleic Acids Res. 19 (22): 6209-6214. 59.
Karentz D, Lutze LH. 1990: Evaluation of Biologically Harmful Ultraviolet Radiation in Antarctica with a Biological Dosimeter Designed for Aquatic Environments; Limnology & Oceanography. 35 (3): 549-561.
60. Kerékgyártó T, Gróf P, Rontó G. 1997: Production and Basic Application of Uracil Dosimeters for Measuring the Biologically Effective UV Dose; Centr Eur J Occup Environ Med. 3: 142-153. 61.
Kumar A, Tyagi MB, Jha PN. 2004: Evidences Showing Ultraviolet-B RadiationInduced Damage of DNA in Cyanobacteria and its Detection by PCR Assay; Biochemical & Biophysical Research Communications. 318 (4): 1025-1030.
62. Lindsay SM, Lee SA, Powell JW, Weidlich T, DeMarco C, Lewen GD, Tao NJ, Rupprecht A. 1988: The Origin of the A to B Transition in DNA Fibers and Films; Biopolymers. 27 (6): 1015-1043. 63.
Longstreth J, de Gruijl FR, Kripke ML, Abseck S, Arnold F, Slaper HI, Velders G, Takizawa Y, van der Leun JC. 1998: Health Risks; Journal of Photochemistry & Photobiology.B - Biology. 46 (1-3): 20-39.
125
64.
Madronich S, McKenzie RL, Bjorn LO, Caldwell MM. 1998: Changes in Biologically Active Ultraviolet Radiation Reaching the Earth's Surface; Journal of Photochemistry & Photobiology.B - Biology. 46 (1-3): 5-19.
65.
Maestre MF. 1970: Circular Dichroism of DNA Films: Reversibility Studies; J Mol Biol. 52 (3): 543-556.
66.
McCarthy MJ, Rosenblatt JI, Lloyd RS. 1996: A Modified Quantitative Polymerase Chain Reaction Assay for Measuring Gene-Specific Repair of UV Photoproducts in Human Cells; Mutat Res. 363 (1): 57-66.
67.
Mileikowsky C, Cucinotta FA, Wilson JW, Gladman B, Horneck G, Lindegren L, Melosh J, Rickman H, Valtonen M, Zheng JQ. 2000: Natural Transfer of Viable Microbes in Space; Icarus. 145 (2): 391-427.
68. Mitchell DL, Pederson M, Ghosh R. 1996: Environmental UV-Radiation, Risk of Skin Cancer and Primary Prevention UV-Induced DNA Damage and Skin Cancer; Veröffentlichungen der Strahlenschutzkommission Band 34, Gustav Fischer, Hamburg: 117-136. 69.
Moan J, Dahlback A, Setlow RB. 1999: Epidemiological Support for an Hypothesis for Melanoma Induction Indicating a Role for UVA Radiation; Photochemistry & Photobiology. 70 (2): 243-247.
70.
Moan J, Peak MJ. 1989: Effects of UV Radiation on Cells; Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 4 (1): 21-34.
71. Módos K, Gáspár S, Kerékgyártó T, Vink AA, Roza L, Fekete A. 1999: The Role of the Spectral Sensitivity Curve in the Selection of Relevant Biological Dosimeters
for
Solar
UV
Monitoring;
Journal
of
Photochemistry
&
Photobiology.B - Biology. 53 (1-3): 20-25. 72.
Módos K. 1993: Modellezés És Folyamatirányítás Egy Mikrobiológiai Mérőrendszerben; Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola, Budapest: 2-20.
126
73.
Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. 1986: Specific Enzymatic Amplification of DNA in Vitro: The Polymerase Chain Reaction; Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 51 (Pt 1): 263-273.
74.
Munakata N. 1981: Killing and Mutagenic Action of Sunlight upon Bacillus Subtilis Spores: A Dosimetric System; Mutat Res. 82 (2): 263-268.
75. Munoz Caro GM, Meierhenrich UJ, Schutte WA, Barbier B, Arcones Segovia A, Rosenbauer H, Thiemann WH, Brack A, Greenberg JM. 2002: Amino Acids from Ultraviolet Irradiation of Interstellar Ice Analogues; Nature. 416 (6879): 403-406. 76.
Nicholson WL, Schuerger AC, Setlow P. 2005: The Solar UV Environment and Bacterial Spore UV Resistance: Considerations for Earth-to-Mars Transport by Natural Processes and Human Spaceflight; Mutat Res. 571 (1-2): 249-264.
77.
Nicholson WL, Setlow B, Setlow P. 1991: Ultraviolet Irradiation of DNA Complexed with alpha/beta-Type Small, Acid-Soluble Proteins from Spores of Bacillus Or Clostridium Species Makes Spore Photoproduct but Not Thymine Dimers; Proc Natl Acad Sci USA. 88 (19): 8288-8292.
78.
Nikjoo H, O'Neill P, Terrissol M, Goodhead DT. 1999: Quantitative Modelling of DNA Damage using Monte Carlo Track Structure Method; Radiation & Environmental Biophysics. 38 (1): 31-38.
79.
Nilsson A. 1996: Ultraviolet Reflections: Life Under a Thinning Ozone Layer; John Wiley & Sons, Chichester: 1-140.
80.
Oshita F, Eastman A. 1993: Gene-Specific Damage Produced by Cisplatin, Ormaplatin and UV Light in Human Cells as Assayed by the Polymerase Chain Reaction; Oncol Res. 5 (3): 111-118.
81.
Patrick MH, Gray DM. 1976: Independence of Photoproduct Formation on DNA Conformation; Photochemistry & Photobiology. 24 (6): 507-513.
127
82. Patrick MH, Rahn RO. in Wang SY. 1976: Photochemistry and Photobiology of Nucleic Acids, Photochemistry of DNA and Polynucleotides: Photoproducts; Academic Press, New York: 35-97. 83. Peak JG, Peak MJ. 1991: Comparison of Initial Yields of DNA-to-Protein Crosslinks and Single-Strand Breaks Induced in Cultured Human Cells by Farand Near-Ultraviolet Light, Blue Light and X-Rays; Mutat Res. 246 (1): 187-191. 84.
Peak JG, Peak MJ, Sikorski RS, Jones CA. 1985: Induction of DNA-Protein Crosslinks in Human Cells by Ultraviolet and Visible Radiations: Action Spectrum; Photochemistry & Photobiology. 41 (3): 295-302.
85.
Pfeifer GP. 1997: Formation and Processing of UV Photoproducts: Effects of DNA Sequence and Chromatin Environment; Photochemistry & Photobiology. 65 (2): 270-283.
86.
Potaman VN, Bannikov YA, Shlyachtenko LS. 1980: Sedimentation of DNA in Ethanol-Water Solutions within the Interval of B to A Transition; Nucleic Acids Res. 8 (3): 635-642.
87.
Rahn RO, Setlow JK, Hosszu JL. 1969: Ultraviolet Inactivation and Photoproducts of Transforming DNA Irradiated at Low Temperatures; Biophys J. 9 (4): 510-517.
88. Ravanat JL, Douki T, Cadet J. 2001: Direct and Indirect Effects of UV Radiation on DNA and its Components; Journal of Photochemistry & Photobiology.B Biology. 63 (1-3): 88-102. 89. Regan JD, Yoshida H. 1995: DNA UVB Dosimeters; Journal of Photochemistry & Photobiology.B - Biology. 31 (1-2): 57-61. 90.
Rettberg P, Eschweiler U, Strauch K, Reitz G, Horneck G, Wanke H, Brack A, Barbier B. 2002: Survival of Microorganisms in Space Protected by Meteorite Material: Results of the Experiment 'EXOBIOLOGIE' of the PERSEUS Mission; Advances in Space Research. 30 (6): 1539-1545.
128
91.
Robertson JM, Walsh-Weller J. 1998: An Introduction to PCR Primer Design and Optimization of Amplification Reactions; Methods in Molecular Biology. 98: 121-154.
92.
Roelandts R. 2002: The History of Phototherapy: Something New Under the Sun? J Am Acad Dermatol. 46 (6): 926-930.
93.
Rontó G, Bérces A, Fekete A, Kovács G, Gróf P, Lammer H. 2004: Biological UV Dosimeters in Simulated Space Conditions; Advances in Space Research. 33 (8): 1302-1305.
94. Rontó G, Tarján I. 1997: A Biofizika Alapjai; Semmelweis Kiadó, Budapest: 76-77, 95-98. 95.
Rontó G, Gáspár S, Bérces A. 1992: Phage T7 in Biological UV Dose Measurement; Journal of Photochemistry & Photobiology.B - Biology. 12 (3): 285-294.
96. Rontó G, Fekete A, Gáspár S, Módos K. 1989a: Action Spectra for Photoinduced Inactivation of Bacteriophage T7 Sensitized by 8-Methoxypsoralen and Angelicin; Journal of Photochemistry & Photobiology.B - Biology. 3 (4): 497-507. 97. Rontó G, Fekete A, Gróf P, Bilger C, Buisson JP, Tromelin A, Demerseman P. 1989b: Genotoxicity Testing: Phage T7 Inactivation Test of various Furan and Arenofuran Derivatives; Mutagenesis. 4 (6): 471-475. 98.
Rontó G, Agamalyan MM, Drabkin GM, Feigin LA, Lvov YM. 1983: Structure of Bacteriophage T7. Small-Angle X-Ray and Neutron Scattering Study; Biophys J. 43 (3): 309-314.
99.
Rontó G, Sarkadi K, Tarján I. 1967: On the Analysis of UV-Dosage Effect Curves of T7-Phages; Strahlentherapie. 134 (1): 151-157.
100. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. 1988: Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase; Science. 239 (4839): 487-491.
129
101. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989: Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York: 6.4-6.7., 14.1-14.35. 102. Scappini F, Casadei F, Zamboni R, Franchi M, Gallori E, Monti S. 2004: Protective Effect of Clay Minerals on Adsorbed Nucleic Acid Against UV Radiation: Possible Role in the Origin of Life; International Journal of Astrobiology. 3 (01): 17-19. 103. Schauder S. 1996: Environmental UV-Radiation, Risk of Skin Cancer and Primary Prevention Sunscreens; Veröffentlichungen der Strahlenschutzkommission Band 34, Gustav Fischer, Hamburg: 235-253. 104. Setlow RB. 1999: Spectral Regions Contributing to Melanoma: A Personal View; Journal of Investigative Dermatology.Symposium Proceedings. 4 (1): 46-49. 105. Setlow RB, Grist E, Thompson K, Woodhead AD. 1993: Wavelengths Effective in Induction of Malignant Melanoma; Proc Natl Acad Sci USA. 90 (14): 6666-6670. 106. Shakked Z, Guerstein-Guzikevich G, Eisenstein M, Frolow F, Rabinovich D. 1989: The Conformation of the DNA Double Helix in the Crystal is Dependent on its Environment; Nature. 342 (6248): 456-460. 107. Stoks PG, Schwartz AW. 1982: Basic Nitrogen-Heterocyclic Compounds in the Murchison Meteorite; Geochimica et Cosmochimica Acta. 46 (3): 309-315. 108. Stuber G. 1982: Fágpreparátumok Előállítása Szekezetvizsgálati Célokra; Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola, Budapest: 28-47. 109. Studier FW, Dunn JJ. 1983: Organization and Expression of Bacteriophage T7 DNA; Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 47 (Pt 2): 999-1007. 110. Sutherland BM, Bennett PV, Sidorkina O, Laval J. 2000: Clustered DNA Damages Induced in Isolated DNA and in Human Cells by Low Doses of Ionizing Radiation; Proc Natl Acad Sci USA. 97 (1): 103-108.
130
111. Sutherland BM, Georgakilas AG, Bennett PV, Laval J, Sutherland JC. 2003: Quantifying
Clustered
DNA
Damage
Induction
and
Repair
by
Gel
Electrophoresis, Electronic Imaging and Number Average Length Analysis; Mutat Res. 531 (1-2): 93-107. 112. Sutherland JC. 2002: Biological Effects of Polychromatic Light; Photochemistry & Photobiology. 76 (2): 164-170. 113. Swarts SG, Sevilla MD, Becker D, Tokar CJ, Wheeler KT. 1992: RadiationInduced DNA Damage as a Function of Hydration. I. Release of Unaltered Bases; Radiat Res. 129 (3): 333-344. 114. Szende B. 1999: Pathologia; Medicina, Budapest: 48-49, 147-188. 115. Tao NJ, Lindsay SM, Rupprecht A. 1989: Structure of DNA Hydration Shells Studied by Raman Spectroscopy; Biopolymers. 28 (5): 1019-1030. 116. Taylor JS, Lu HF, Kotyk JJ. 1990: Quantitative Conversion of the (6-4) Photoproduct of TpdC to its Dewar Valence Isomer upon Exposure to Simulated Sunlight; Photochemistry & Photobiology. 51 (2): 161-167. 117. Tenkate TD. 1999: Occupational Exposure to Ultraviolet Radiation: A Health Risk Assessment; Rev Environ Health. 14 (4): 187-209. 118. Tenkate TD. 1998: Ultraviolet Radiation: Human Exposure and Health Risks; Environmental Health. 61 (2): 9-15. 119. Tornaletti S, Pfeifer GP. 1995: UV Light as a Footprinting Agent: Modulation of UV-Induced DNA Damage by Transcription Factors Bound at the Promoters of Three Human Genes Journal of Molecular Biology. 249 (4): 714-728. 120. Varghese AJ. 1970: 5-Thyminyl-5,6-Dihydrothymine from DNA Irradiated with Ultraviolet Light; Biochemical & Biophysical Research Communications. 38 (3): 484-490.
131
121. Vink AA, Roza L. 2001: Biological Consequences of Cyclobutane Pyrimidine Dimers; Journal of Photochemistry & Photobiology.B - Biology. 65 (2-3): 101-104. 122. Yarosh D, Klein J, O'Connor A, Hawk J, Rafal E, Wolf P. 2001: Effect of Topically Applied T4 Endonuclease V in Liposomes on Skin Cancer in Xeroderma Pigmentosum: A Randomised Study. Xeroderma Pigmentosum Study Group; Lancet. 357 (9260): 926-929. 123. Yoshida H, Regan JD. 1997a: UVB DNA Dosimeters Analyzed by Polymerase Chain Reactions; Photochemistry & Photobiology. 66 (1): 82-88. 124. Yoshida H, Regan JD. 1997b: Solar UVB Dosimetry by Amplification of Short and Long Segments in Phage Lambda DNA; Photochemistry & Photobiology. 66 (5): 672-675. 125. Zhitkovich A, Costa M. 1992: A Simple, Sensitive Assay to Detect DNA-Protein Crosslinks in Intact Cells and in Vivo; Carcinogenesis. 13 (8): 1485-1489.
10.2. FELHASZNÁLT INTERNETES FORRÁSOK National Center for Biotechnology Information (NCBI) URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ European Bioinformatics Institute (EBI) URL: http://www.ebi.ac.uk/ Expert Protein Analysis System (ExPASy) URL: http://www.expasy.ch/ New England Biolabs (NEBcutter) URL: http://tools.neb.com/ Massachusetts Institute of Technology (Primer3) URL: http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi
132
11. Saját publikációk jegyzéke 11.1. CIKKEK 1.
Fekete A., Módos K., Hegedüs M., Rontó Gy., Kovács G., Bérces A, Lammer H., Kargl G., Kömle N. I.: Study of the effect of simulated space environment on nucleoprotein and DNA thin films, Proceedings of the 2nd European Workshop on Exo/Astrobiology, Graz, Austria, September 16-19, 2002, ESA-SP-518, 67-70
2.
Fekete A., Földvári I., Hegedüs M., Módos K., Rontó Gy., Kovács G., Bérces A., Péter Á.: Study of the effect of simulated space environment on phage T7 and isolated T7 DNA thin films, Journal of Luminescence, 2003, 102-103, 469-475 IF: 1,314
3.
Hegedüs M., Módos K., Rontó Gy., Fekete A.: Validation of phage T7 biological dosimeter by quantitative polymerase chain reaction using short and long segments of phage T7 DNA, Photochemistry and Photobiology, 2003, 78, 213-219 IF: 1,929
4.
Kovács G., Fekete A., Módos K., Hegedüs M., Rontó Gy., Panitz C., Lammer H.: Experiments of the effects of space environmental factors on DNA and nucleoproteins, Proceedings of the III. European Workshop on Exo/Astrobiology, Mars: the search for life, Madrid, Spain, 18-20 November 2003, ESA-SP-545, 229-230
5.
Fekete A., Rontó Gy., Hegedüs M., Módos K., Bérces A., Kovács G., Lammer H., Panitz C.: Simulation experiments of the effect of space environmnet on bacteriophage and DNA thin films, Advances in Space Research, 2004, 33, 1306-1310 IF: 0,548
133
6.
Fekete A., Módos K., Hegedüs M., Kovács G., Rontó Gy., Péter Á., Lammer H., Panitz C.: DNA damage under simulated extraterrestrial conditions in bacteriophage T7, Advances in Space Research, 2005, 36/2, 303-310 IF: 0,706
7.
Hegedüs M., Kovács G., Módos K., Rontó Gy., Lammer H., Panitz C., Fekete A.: Exposure of phage T7 to simulated space environment: The effect of vacuum and UV-C radiation, Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 2006, 82/2, 94-104 IF: 1,597
8.
Hegedüs M., Fekete A., Módos K., Kovács G., Rontó Gy., Lammer H., Panitz C.: Response of bacteriophage T7 biological dosimeter to dehydration and extraterrestrial solar UV radiation, Acta Astronautica, 2006, doi: 10.1016/ j.actaastro.2006.09.010 IF: 0,209
11.2. ELŐADÁSOK ÉS POSZTEREK 1.
Hegedüs M., Módos K., Fekete A.: DNS sérülések detektálása PCR-ral DNS-ben és
nukloproteidekben,
Magyar
Biofizikai
Társaság
XX.
Kongresszusa,
Budapest, 2001 2.
Földvári I., Fekete A., Hegedüs M., Rontó Gy., Kovács G., Péter Á.: Study of the effect of simulated space environment on phage T7 and isolated T7 DNA thin films, International Conference on Luminescence and Optical Spectroscopy of Condensed Matter (ICL '02), Budapest, 2002
3.
Hegedüs M., Fekete A.: DNS sérülések detektálása polimeráz láncreakcióval, Semmelweis Egyetem, Orvos- és Gyógyszerésztudományi Diákköri Konferencia, Budapest, 2002
134
4.
Fekete A., Módos K., Hegedüs M., Rontó Gy., Kovács G., Bérces A., Lammer H., Kargl G., Kömle N. I.: Study of the effect of simulated space environment on nucleoprotein and DNA thin films, 2nd European Workshop on Exo/Astrobiology, Graz, 2002
5.
Fekete A., Rontó Gy., Hegedüs M., Módos K., Bérces A., Kovács G., Lammer H.: Simulation experiments of the effect of space environment on bacteriophage and DNA thin films, 34th Cospar Congress, Houston, 2002
6.
Hegedüs M., Módos K., Rontó Gy., Fekete A.: Szimulált világűr hatása T7 bakteriofág
DNS-ére,
Magyar
Biofizikai
Társaság
XXI.
Kongresszusa,
Szeged, 2003 7.
Fekete A., Hegedüs M., Módos K., Rontó Gy., Csík G.: Validation of phage T7 biological dosimeter by quantitative chain reaction using short and long segments of phage T7 DNA, 10th Congress of the European Society for Photobiology, Bécs, 2003
8.
Hegedüs M., Fekete A.: A világűrben uralkodó viszonyok hatása a DNS-re, Semmelweis Egyetem, Orvos- és Gyógyszerésztudományi Diákköri Konferencia, Budapest, 2003
9.
Hegedüs M., Fekete A.: A világűrben uralkodó viszonyok hatása a DNS-re, XXVI. Országos Tudományos Diákköri Konferencia, Orvostud. Szekció, Debrecen, 2003
10.
Kovács G., Fekete A., Módos K., Hegedüs M., Rontó Gy., Panitz C., Lammer H.: Experiments of the effects of space environmental factors on DNA and nucleoproteins, III. European Workshop on Exo/Astrobiology, Madrid, 2003
135
11.
Fekete A., Kovács G., Hegedüs M., Módos K., Rontó Gy., Lammer H., Panitz C.: DNA damage under simulated extraterrestrial conditions in bacteriophage T7, 35th Cospar Scientific Assembly, Párizs, 2004
12.
Fekete A., Módos K., Hegedüs M., Kovács G., Rontó Gy., Lammer H., Panitz C.: The effect of simulated extraterrestrial conditions on bacteriophage and DNA thin films, 33rd European Radiation Research, Budapest, 2004
13.
Hegedüs M., Módos K., Kovács G., Rontó Gy., Fekete A.: Világűrbeli ultraibolya sugárzás és vákuum hatása T7 baktriofág biológiai dózismérőre, VII. Ph.D. Tudományos Napok, SE Doktori Iskola, Budapest, 2005
14.
Hegedüs M., Fekete A., Módos K., Kovács G., Rontó Gy., Lammer H., Panitz C.: Response of bacteriophage T7 biological dosimeter to dehydration and extraterrestrial solar UV radiation, 15th Humans in Space Symposium, Graz, 2005
15.
Rontó Gy., Bérces A., Kovács G., Fekete A., Hegedüs M., Panitz C., Lammer H.: Solar UV radiation and the life on Earth and other planets, 15th Humans in Space Symposium, Graz, 2005
16.
Hegedüs M., Módos K., Kovács G., Rontó Gy., Fekete A.: Világűrbeli ultraibolya sugárzás és vákuum hatása T7 bakteriofág biológiai dózismérőre, Magyar Biofizikai Társaság XXII. Kongresszusa, Debrecen, 2005
17.
Hegedüs M., Fekete A., Módos K., Kovács G., Rontó Gy., Lammer H., Panitz C.: Exposure of phage T7 to simulated space environment – The effect of vacuum and simulated solar UV radiation, Joint European and National Astronomy Meeting, Liége, 2005
136
18.
Hegedüs M., Fekete A., Módos K., Kovács G., Rontó Gy., Lammer H. Panitz C.: Chance of nucleic acid molecules to survive the extraterrestrial UV radiation, 5th European Workshop on Astrobiology, Budapest, 2005
19.
Hegedüs M., Módos K., Kovács G., Rontó Gy., Fekete A.: T7 fág károsodása szimulált extraterresztriális körülmények hatására, VIII. Ph.D. Tudományos Napok, SE Doktori Iskola, Budapest, 2006
11.3. ISMERETTERJESZTŐ TEVÉKENYSÉG 1.
Hegedüs M.: UV-sugárzás hatása a bakteriofágokra – mi történik a DNS-sel a világűrben? (ISS-EXPOSE előkísérletek kiértékelése alapján), MŰI Ifjúsági Fórum, Budapest, 2005
2.
Hegedüs M.: Ultraibolya az űrben, Semmelweis Egyetem, 2005, 6/2, 11
3.
Hegedüs M.: QPCR of T7 DNA in UVC – From where we come and where we go?, Science Essay and Communication Competition of the School of Ph.D. Studies, Semmelweis University and the British Council, 2005, 11-12
4.
Hegedüs M.: Mi van az ibolyán túl? Barát vagy ellenség?, Biztonságos napozás – A Magyar Vöröskereszt egészségvédő programja, Budapest, 2006
137
12. Köszönetnyilvánítás
Szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik segítségemre voltak a munkámban és a doktori dolgozat elkészítésében. Köszönöm Dr. Fekete Andreának, hogy már egyetemi hallgatói éveim alatt, tudományos diákkörösként bevezetett a laborban folyó elméleti és gyakorlati munkába. Később, a doktori képzés során témavezetőmként a közös kutatás minden részletére kiterjedő maximális segítségére számíthattam. Dr. Rontó Györgyi professzor asszonynak, programvezetőmnek köszönöm a téma iránti lelkesedését, hasznos tanácsait és mindazt az odafigyelést, amivel végigkísérte munkámat. Köszönöm Dr. Fidy Judit és Dr. Rontó Györgyi professzor asszonyoknak, hogy a Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet jelenlegi és volt igazgatóiként lehetővé tették számomra, hogy az Intézetben dolgozhassak. Köszönettel tartozom Dr. Módos Károlynak az eredmények kiértékelésében nyújtott segítségéért, Dr. Bérces Attila és Kovács Gáspár kollégáimnak, valamint német és osztrák partnereinknek a vékonyrétegekkel folytatott kísérletekért. Köszönetem fejezem ki Komárné Drabbant Mónika és Völgyi Edit asszisztenseinknek, továbbá többi munkatársamnak, akik az Intézetben folytatott kísérletek kivitelezésében segítettek.
138
