Chem. Listy 93, 128 - 137 (1999)
DEGRADACNI PLASMIDY GRAMNEGATIVNICH BAKTERII
výhody snadného konjugačního přenosu v přirozených ekosystémech, který ve svém důsledku vede k tvorbě nových metabolických drah. V tomto přehledném článku jsou shromážděny údaje o většině dosud popsaných degradačních plasmidů (D-plasmidů), které byly v bakteriích detegovány. Z hlediska jejich velkého počtu bohužel nebylo možné zabývat se velkými detaily. Dále je vhodné zdůraznit, že článek nepopisuje žádné plasmidy, které byly v laboratoři pozměněny (v odborné literatuře je přitom často těžké na první pohled rozeznat, mluví-li se o původním nebo již nějak pozměněném plasmidů).
JAN KOŠŤÁL a KATEŘINA DEMNEROVA Ústav biochemie a mikrobiologie, Vysoká škola chemickotechnologická, Technická 5, 166 28 Praha 6 Došlo dne 16.11.1998
Obsah 1. Úvod 2. Plasmid CAM 3. Plasmidy kódující metabolismus n-alkanů 4. Plasmidy kódující metabolismus toluenu 5. Plasmidy kódující utilizaci naftalenu 6. Plasmidy pro utilizaci dalších polyaromatických uhlovodíků a bifenylu 7. Plasmidy pro utilizaci chlorbenzoových kyselin, chlortoluenů a chlorovaných bifenylů 8. Plasmidy pro utilizaci dalších organických sloučenin 9. Plasmidy účastnící se degradace pesticidů 10. Plasmidy pro degradaci haloalifatických sloučenin 11. Plasmidy kódující utilizaci laktosy a citrátu 12. Závěr
2. Plasmid CAM Plasmid CAM, kódující část degradační dráhy kafru, je historicky prvním popsaným degradativním plasmidem. Byl objeven v roce 1971 (cit.1) na základě vysoké frekvence ztráty schopnosti bakterie Pseudomonas putida utilizovat kafr jako jediný zdroj uhlíku a energie jak spontánně, tak i po ošetření kultury antibiotikem mitomycinem C, které ve vhodné koncentraci způsobuje ztrátu bakteriálních plasmidů (tzv. „odléčení", ,,curing"). Dále byl pozorován konjugativní přenos této schopnosti do Pseudomonas aeruginosa i do jiných kmenů rodu Pseudomonas . Na rozdíl od většiny ostatních degradativních plasmidů, CAM plasmid nekóduje kompletní biodegradační dráhu kafru (obrázek 1), ale pouze jeho degradaci na isobutyrát, takže pro jeho úplnou utilizaci musí mít buňky chromozomálně kódováno odbourání isobutyrátu. Velikost plasmidů je asi 230 kb. Plasmid CAM patří do inkompatibilitní skupiny IncP2, do které patří kromě OCT plasmidů (viz dále) také větší množství R plasmidů (kódujících rezistenci vůči antibiotikům), jako například R931 (streptomycin, tetracyklin) nebo pMG5 (kanamycin, tobramycin).
1. Uvod Dlouhodobé průmyslové využívání ropných produktů, plastů, herbicidů a dalších chemikálií s sebou nevyhnutelně přináší nebezpečí jejich uvolňování do životního prostředí, přičemž většina z těchto látek je přírodě přinejmenším škodlivá. Jako vhodný příklad tohoto problému lze uvést pesticidy, které jsou toxické již z principu jejich účinku, a navíc téměř jediný způsob jejich aplikace je jejich záměrné uvolňování do biosféry. Jediný přirozený proces recyklace takových látek je jejich zapojení do různých metabolických drah, z nichž ty bakteriální patří v současnosti mezi nejlépe prostudované. Mnoho enzymů účastnících se těchto procesů je kódováno plasmidovými geny. Tento způsob představuje pro bakterie
3. Plasmidy kódující metabolismus n-alkanů Dosud je popsáno několik plasmidů nesoucích geny zodpovědné za degradaci n-alkanů. Buňky bakterie Pseu-
128
domonas oleovorans nesoucí plasmid OCT jsou schopny růst na kratších n-alkanech, jako např. hexan, oktan, děkan a na ethylbenzenu . P. oleovorans byl později identifikován jako P. putida, ale v literatuře se často objevuje i jeho 5 původní název . Velikost OCT plasmidu je přibližně 350 až 400 kb a jeho konjugační přenos probíhá jen s velmi malou frekvencí. Geny pro utilizaci n-alkanů (alk geny) jsou organizovány ve dvou operonech, alkB AC a alkST. Kromě alk genů kóduje plasmid OCT ještě další dvě funkce: katabolismus + D-lysinu a rezistenci k toxickým koncentracím Hg iontů . Plasmid OCX, nalezen také v P. putida, se údajně liší 6 od plasmidu OCT (cit. ). Alk systém pro degradaci alkanů má zde vyšší aktivitu a širší substrátovou specifitu než alk systém plasmidu OCT. Z kmene P. maltophilia N246 pochází 118 kb velký plasmid, rovněž podobný plasmidu OCT. Nukleotidové sekvěnce genů vykazují vysokou homologii s alk geny plasmidu OCT (cit. 7 ' 8 ). Z Pseudomonas C12B (cit.9) byl izolován plasmid pDEC. Tento plasmid kóduje geny pro utilizaci středně dlouhých K-alkanů (C 9 -C| 2 ) an-alkenů (C| 0 , C^). S vysokou frekvencí se konjugačně přenáší do odléčených kmenů, avšak přenos do jiných půdních bakterií nebyl pozorován. Jeho velikost byla odhadnuta na 200-300 kb. Plasmid pBS250, velký 148 kb, umožňuje buňkám P. aeruginosa BS316 růst na n-alkanech (Cg-C^) (cit. 10 ). Sám se nemůže konjugačně přenášet do jiných kmenů P. aeruginosa a P. putida. Dynamika i specifita indukce aktivity enzymů oxidujících n-oktan je srovnatelná s kmenem BS914, který nesl plasmid OCT (cit.5). Oxidace n-alkanů kódovaná plasmidempBS240 probíhá monoterminálním mechanismem bez účasti cytochromu P-450.
4.
Plasmidy kódující metabolismus toluenu
Všechny tyto plasmidy umožňují svým nositelům růst na xylenu, toluenu a m- a p-toluátu. První objevený byl nazván TOL, avšak po zjištění, že těchto plasmidů je více druhů, zůstal název TOL v obecnějším smyslu pro celou skupinu příbuzných plasmidů, zatímco typový TOL plasmid byl přejmenován na pWWO. Tyto dva názvy jsou bohužel v literatuře často zaměňovány, Plasmid pWWO byl popsán u kmene Pseudomonas arvilla mt-2. Nese všechny geny kódující enzymy pro přeměnu toluenu, xylenů a toluátů na katechol a enzymy 11>12 meta dráhy metabolismu katecholu . Prvním enzymem tohoto metabolismu je xylenmonooxygenasa (xylA), která oxiduje methylové substituenty aromatického kruhu na odpovídající alkoholy (obrázek 2). Dále probíhá degradace přes katechol nebo substituované katecholy meta drahou (obrázek 3). V kmenech P. putida nesoucích TOL plasmid se tedy při růstu na uvedených substrátech indukují enzymy meta dráhy. Enzymy ortho dráhy (obrázek 3) jsou kódovány na chromozomu a k jejich indukci dochází při růstu na benzoové kyselině (jeden z intermediátů metabolismu toluenu) u buněk, které nemají plasmid. Utilizace benzoátu ortho drahou je rychlejší, což vede k rychlejšímu růstu buněk neobsahujících plasmid. Bylo zjištěno, že pWWO se může konjugačně přenášet do jiných kmenů rodu Pseudomonas a též do E. colii3. pWWO je tedy plasmid se širokým spektrem hostitelů (broad-host-range). Zatímco replikační a konjugační funkce byly exprimovány v obou hostitelích, schopnost růstu na m-toluátu se projevila jen u rodu Pseudomonas.
Obr. 1. Biodegradační dráha kafru popsaná u bakterií Pseudomonas putida , CamA, CamB, CamC, CamD, CamE a CamGjsou enzymy kódované jednotlivými geny A-G přítomnými na plasmidu CAM
129
Xylenmonooxygenasa katalyzuje oxidaci styrenu na styrenepoxid. Zde se nabízí srovnání s alkanmonooxygenasovým komplexem z Pseudomonas oleovorans , který katalyzuje oxidaci terminálních alkenů na odpovídající 1,2-epoxidy. I když alkanmonooxygenasaje schopna epoxidace některých aromatických substrátů, tyto dva enzymové komplexy nemají navzdory své široké substrátové specifitě žádný společný substrát. Namísto toho se zajímavě doplňují - xylenmonooxygenasa katalyzuje pouze oxidaci methylové skupiny připojené k aromatickému kruhu, zatímco prostřednictvím alkanmonooxygenasy jsou atakovány
pouze ethylové nebo větší substituenty benzenového jádra. Z půdních mikroorganismů bylo později izolováno množství dalších plasmidů, označených pWWl-pWW21 (cit. " ). Nesou geny stejné nebo podobné genům xyl plasmidů pWWO. Mají však různou velikost (nejmenší 7,4 kb a největší 311 kb) a v některých případech jejich spojitost s utilizací toluenu nebo podobných substrátů nebyla zcela prokázána. Z Pseudomonas sp. TA8 pochází 230 kb velký plasmid pKJl (cit. 17 ). Kóduje enzymy pro utilizaci toluenu ap-xylenů meta drahou (obrázek 3). Tento plasmid nese rovněž
Obr. 2. Biodegradační dráhy toluenu a xylenů popsané u bakterií P. putida mt-2 (cit. )
130
5. Plasmidy nesoucí geny pro utilizaci naftalenu
geny pro resistenci vůči streptomycinu a sulfonamidu. Je schopný konjugačního přenosu do jiných kmenů rodu Pseudomonas. Plasmid pKJl nepatří do žádné z inkompatibilitních skupin IncPl, IncP2, IncP3 a IncP9, do kterých patří většina D-plasmidů rodu Pseudomonas. Plasrnid XYL byl popsán u Pseudomonas sp. Pxyl8. Jeho funkce je analogická s plasmidy TOL (cit. ), a liší se od nich hlavně tím, že není konjugativní.
Prvním popsaným plasmidem kódujícím degradaci naftalenu je NAH7 (cit. 19), který byl původně označován pouze NAH, než se zjistilo, že podobných plasmidů je větší množství. Byl objeven u bakterie Pseudomonas putida PpG7 na základě spontánní a indukované ztráty schopnosti
Obr. 3. Srovnání meta a ortho dráhy metabolismu katecholu
131
růstu na naftalenu. Plasmid se konjugačně přenášel do testovaných kmenů P. putida. Obrázek 4 ukazuje začátek metabolické dráhy, které se účastní enzymy kódované tímto plasmidem. Vzniklý katechol je dále odbourán ortho nebo meta drahou (obrázek 3). Odpovídající geny jsou organizovány ve dvou operonech nah\ a nahl, oddělených úsekem o délce 7 kb, který obsahuje regulační gen, jehož produkt je vyžadován pro expresi obou operonů . U různých kmenů rodu Pseudomonas byly objeveny další plasmidy kódující utilizaci naftalenu: NAH2 a NAH3 (cit 2 1 ), pWW60 (87 kb) (cit. 22 ), pNDl 40, pND160 (cit. 23 ), pBS2, pBS3 (cit. 24 ), pBS4 (177 kb), pBS211-219, pBS240, pBS242-244, pBS248 (cit. 2 5 ' 2 6 ), NPL-1 (cit.27) (89 kb). Patří k jedné z inkompabilitních skupin IncP2, IncP7 nebo IncP9. Většinou se od NAH7 liší jen způsobem regulace, vlastnostmi a specifitou enzymů. Plasmid NPL-1 {P. putida 12A) se liší od plasmidu NAH tím, že NPL-1 nese pouze geny pro konverzi naftalenu na salicylovou kyselinu (obrázek 4), jejíž další utilizace je zajištěna odpovídajícími geny přítomnými na chromozomu.
Při teplotách nad 41 °C mají plasmidy NAH7, pBS2 a pBS3 inhibiční efekt na růst některých druhů rodu Pseudomonas, což vede k vysokým frekvencím jejich ztráty při těchto teplotách, jelikož za neselektivních podmínek jsou zvýhodněny ty buňky, které plasmid ztratily28. Mechanismus inhibičního působení plasmidu nebyl zatím objasněn, avšak tento důležitý poznatek by se měl brát v úvahu tam, kde se schopnost růstu za vyšších teplot používá jako taxonomický znak.
6. Plasmidy pro utilizaci dalších polyaromatických uhlovodíků a bifenylu Většina bakterií schopných biodegradace bifenylu má tuto vlastnost kódovanou chromozomálně. Po oxidaci katalyzované bifenyldioxygenasou je jeden kruh bifenylu otevřen a po několika dalších krocích se tvoří kyseliny benzoová a 2-hydroxy-2,4-pentadienová. Kyselina benzoová
..
Obr. 4. Dráha biodegradace naftalenu kódovaná plasmidem NAH (cit. kyselinu. Taje následně odbourávána přes katechol meta dráhou
19.
). Naznačena je metabolická dráha až po salicylovou
Obr. 5. Biodegradační dráha isopropylbenzenu popsaná u bakterií P. putida RE204 (cit. ); Intermediáty biodegradace isopropylbenzenu: 2,3-dihydro-2,3-dihydroxyisopropylbenzen, 3-isopropylkatechol, 2-hydroxy-6-oxo-7-methylokta-2,4-dienoát, 2-oxopent-4-enoát + isobutyrát, 4-hydroxy-2-oxopentanoát, pyruvát + acetaldehyd
132
je oxidována a dekarboxylována na katechol, který je pak utilizován ortho nebo meta drahou (obrázek 3). 29 PlasmidpBS241 (cit. ), popsaný u kmene P.putidaBS 893, kóduje nezvyklou metabolickou dráhu bifenylu, která zahrnuje kyselinu benzoovou, kyselinu w-hydroxybenzoovou a kyselinu skořicovou. Kromě kyseliny benzoové se tyto látky nevyskytují jako meziprodukty biodegradace bifenylu v metabolismech jiných kmenů degradujících bifenyl. Plasmid pKG2 (32 kb) umožňuje u kmene Beijerinckia sp. růst na bifenylu, fenantrenu a dalších polyaromatických a heterocyklických uhlovodících . Pseudomonas fluorescens LP6a obsahuje 63 kb velký plasmid pLP6a, který nese geny kódující enzymy pro utilizaci naftalenu . Specifita těchto genů je velmi široká, což umožňuje degradaci většího spektra polyaromatických uhlovodíků a heterocyklických sloučenin.
8.
Plasmidy pro utilizaci dalších organických sloučenin
Plasmid SAL byl historicky v pořadí třetím objeveným 38 degradačním plasmidem (po CAM a OCT) (cit. ). Byl nalezen u bakterieP. putida Rl. Umožňuje utilizaci salicylové kyseliny přes katechol s následným meta štěpením aromatického kruhu (obrázek 3). Plasmid pMWD-1 o velikosti 170 kb umožňuje utilizaci salicylové kyseliny u Pseudomonas putida PMD-1 stejným sledem reakcí. Plasmid pHMT112, popsaný u Pseudomonas putida ML2, kóduje benzendioxygenasu (bedClC2BA) a dehyd39 rogenasu (bedD) (cit. ). Tyto geny jsou nezbytné pro konverzi benzenu na katechol. 180 kb velkýplasmidpNLl, který byl popsán u chemoheterotrofní bakterie Sphingomonas sp. F199 (cit. ), kóduje enzymy, které se účastní degradace benzenového jádra benzenu a dalších aromatických sloučenin. Plasmid pPGHl 1 z kmene Pseudomonas putida H nese sadupM genů, které umožňují utilizaci fenolu41. V kmenech Alcaligenes faecalis KSV21 a Pseudomonas alcaligenes KO] byly nalezeny plasmidy o velikosti 45-60 kb, které rovněž umožňují utilizaci fenolu42. Pseudomonas cepacia G4 obsahuje plasmid TOL o velikosti 108 kb, který umožňuje růst na fenolu a toluenu43. První reakce biodegradační dráhy toluenu je katalyzovaná toluenorthomonooxygenasou. Plasmid pND50, který patří do inkompatibilitní skupiny IncP9, kóduje počátek metabolické dráhy utilizace /7-kresolu44. Plasmid pEG o velikosti 37 kb, objevený u bakterie P. fluorescens ST, kóduje enzymy nezbytné pro utilizaci styrenu . Plasmidově kódované kroky přeměny styrenu zde zahrnují vnik 2-fenylethanolu a jeho přeměnu na fenylacetát.
7. Plasmidy pro utilizaci chlorbenzoových kyselin, chlortoluenů a chlorovaných bifenylů Plasmid pPBl 11 (75 kb), popsaný u Pseudomonas putida P l i l , nese strukturní geny pro chlorbenzoát-l,2-dioxygenasu, která katalyzuje přeměnu ortAo-chlorbenzoátů na odpovídající katecholy32. Další přeměnu těchto katecholů katalyzují chromozomálně kódované enzymy cle operonu (2,3-dioxygenasa, cykloisomerasa a maleylacetáthydrogenasa). Plasmid pAC25, velký 105 kb, byl nalezen u kmene P. putida AC858, izolovaného ze vzorků odpadních vod 33 . Kóduje kompletní dráhu degradace 3-chlorbenzoové kyseliny, probíhající přes 4-chlorkatechol s následným štěpením aromatického kruhu v poloze ortho. U bakterie Pseudomonas sp. B13 byl objeven plasmid, který umožňuje degradaci 3-chlorbenzoátu a různých chlorkatecholů34. Buňky kmene P. cepacia HCV obsahují 97 kb velký plasmid umožňující růst na 2-, 3- a 4-chlortoluenu, 2,6- a 3,4- -dichlortoluenu a 2-, 3- nebo 4-chlorbenzoové kyselině35. U Klebsiella pneumoniae byl popsán plasmid pAC21, velký 100 kb, který nese geny potřebné pro utilizaci p-chlorbifenylu jako jediného zdroje uhlíku a energie .
Plasmid pYAl, popsaný u Acinetobacter sp. YAA, obsahuje gen atdA kódující anilinoxygenasu . Anilin je u tohoto kmene odbouráván přes katechol a dále meta cestou (obrázek 3). Plasmid pTDNl, pocházející z Pseudomonas putida UCC22, nese geny tdnAl, tdnA2, tdnB a regulační gen tdnR nezbytné pro konverzi anilinu na katechol . Plasmid ABS, nalezený u kmenů Pseudomonas testosteroni H8 a 4B, nese některé geny nezbytné pro utilizaci alkylbenzensulfonátů, konkrétně enzym katalyzující desulfonační krok (vznik katecholu) a minimálně tři enzymy meta dráhy (obrázek 3) katabolismu katecholu . Kmen Pseudomonas putida RE204 obsahuje 105 kb velký plasmid pRE4 kódující enzymy pro utilizaci isopropylbenzenu 4 9 (obrázek 5).
Ze vzorků kontaminovaných vodních sedimentů byly izolovány kmeny Alcaligenes sp. A2, A5 a A2D a Acinetobacter sp. A8, všechny obsahující plasmid o velikosti 53 kb, umožňující kompletní mineralizaci některých monochlorovaných bifenylů přes odpovídající chlorbenzoové kyseliny 37
133
Plasmid NIC, objevený u Pseudomonas convexa 1, umožňuje degradaci nikotinu, která probíhá přes pseudooxynikotin, 3-sukcinoylpyridin a 6-hydroxy-3-sukcinoylpyridin na 2,5-dihydroxypyridin, který je dále postupně metabolizován až na maleinovou a fumarovou kyselinu . Plasmid umožňuje i degradaci nikotinové kyseliny. Kmen Pseudomonas acidovorans 9 obsahuje dva plasmidy o velikostech 170 a 200 kb, které umožňují transformaci a-methylsterolu na acetofenon5'. U kmene Pseudomonas ovalis CFT1 byl nalezen plasmid o velikosti asi 50 kb, umožňující utilizaci hexachlorcyklohexanu (HCH) jako jediného zdroje uhlíku a energie '. Plasmidy pBS271, pBS272, pBS273, pBS274 a pBS275, izolované z různých kmenů rodu Pseudomonas, nesou geny pro utilizaci e-kaprolaktamu . Jejich velikost se pohybuje okolo 460 kb. Bakteriální metabolismus této sloučeniny zahrnuje e-aminokapronát, e-aldehydokapronát, adipát a acetát + sukcinát. U kmene Alcaligenes sp. D-2 byly pozorovány náznaky přítomnosti biodegradačního plasmidu, který nese geny pro první dva kroky odbourávání cyklického dimeru 6-aminokapronové kyseliny (hydrolasa cyklického dimeru a hydrolasa lineárního oligomeru)55. Plasmid pMOP (230 kb) z Pseudomonas cepacia Pc701 nese geny umožňující utilizaci 4 methyl-o-ftalátu a 4-hydroxy-wo-ftalátu . U kmene Moraxella sp. VG45 byl popsán přibližně 60 kb velký plasmid, který této bakterii umožňuje růst na o-ftalátu a salicylátu . Syntéza enzymů pro obě tyto metabolické cesty je regulována nezávislými systémy. Acyklické isoprenoidy citronelol a geraniol se mohou uvolňovat do půdy z odpadků po zpracování citrusových plodů. Ze vzorků kontaminovaných půd byl izolován 77 kb velký plasmid pSRQ50, umožňující u kmene Pseudomonas putida PPU2 využívat tyto látky jako jediný zdroj uhlíku a energie .
rophus byly izolovány čtyři plasmidy60, označené pJP3, pJP4, pJP5 a pJP7, které, kromě degradace 2,4-D, umožňují svým nositelům degradovat 4-chlor-2-methylfenoxyoctovou kyselinu (MCPA), a také m-chlorbenzoovou kyselinu61. Velikost těchto plasmidu je 78 kb a patří do inkompabilitní skupiny IncPl. Jiný zdroj ' ovšem uvádí pro plasmid pJP4 velikost 83 kb. Rovněž plasmidy pJP2 (cit 6 0 ) a pJP9 (cit. 61 ) svým hostitelům umožňují degradaci MCPA. Od výše uvedených plasmidu se liší svou velikostí (57 kb) a tím, že nepatří do skupiny IncPl. Plasmidy pEMTl až 8 jsou další plasmidy umožňující degradaci 2,4-D (cit. 64 ). pEMT2-pEMT7 patří k inkompatibilní skupině IncPl. pER2a je 120 kb velký plasmid z gram negativního, methylotrofního, blíže nezařazeného kmene ER2 (cit. 65 ). Umožňuje hydrolýzu N-methylkarbamátových insekticidů, při které vzniká methylamin, který je tímto kmenem následně využíván pro růst jako jediný zdroj uhlíku a dusíku. Plasmid pPDLl 1 o velikosti 100 kb umožňuje u kmene Achromobacter sp. WM111 hydrolýzu karbofuranu66. Sphingomonas sp. CF6 obsahuje pět plasmidu, z nichž alespoň některé jsou nezbytné pro schopnost utilizace karbofuranu jako jediného zdroje uhlíku . Buňky bakteriálního kmene P. cepacia ACH00, schopného degradace 2,4,5-trichlorfenoxyoctové kyseliny (2,4,5-T), obsahují plasmid pDG3 (170 kb) a někdy ještě plasmid pDG4 (40 kb) a směs dalších. Není ovšem známo, jak se tyto plasmidy konkrétně účastní metabolismu 2,4,5-T. Parathion patří mezi hojně užívané organofosfátové insekticidy. Pseudomonas diminuta je schopen hydrolyzovat parathion (PAR) za vzniku diethylthiofosforečné kyseliny a paranitrofenolu, k čemuž je nezbytná přítomnost plasmidu pCSl velkého 68 kb (cit. 68 ). Herbicidbromoxynil (3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitril), spolu s ioxynilem a dichlobenilem, patří do skupiny aromatických pesticidů, které obsahují nitrilovou skupinu. Půdní bakterie Klebsiella ozaenae, která je schopna utilizovat bromoxynil jako zdroj dusíku, obsahuje 82 kb velký plasmid pBrxl, který je pro utilizaci bromoxynilu nezbytný . Pseudomonas sp. PXM obsahuje 250 kb velký plasmid, umožňující degradaci herbicidu Dicamba (3,6-dichlor-2-meťhoxybenzoová kyselina) .
9. Plasmidy účastnící se degradace pesticidů Alcaligenes paradoxus JMP116 obsahuje 90 kb velký plasmid pJPl, který umožňuje utilizaci 2,4-dichlorfenoxyoctové kyseliny (2,4-D) (cit. ). Snadným přenosem plasmidu mezi buňkami byl vysvětlen fakt, že po aplikaci herbicidu 2,4-D do půdy nastala po střední prodlevě jeho rychlá degradace a po dalších přídavcích se prodleva progresivně zkracovala, přestože mezi jednotlivými aplikacemi byla dlouhá, někdy i roční přestávka. Buňky nesoucí plasmid pJPl jsou citlivé na infekci bakteriofágem PRII. Z dalších kmenů bakterií Alcaligenes paradoxus a A. eut-
10. Plasmidy pro degradaci haloalifatických sloučenin Společným rysem těchto plasmidu je přítomnost genů pro různé dehalogenasy, které s různou specifitou kataly-
134
zují hydrolytickou dehalogenaci halogenkyselin a dalších substrátů. Plasmid pUOl (67 kb) byl nalezen v bakteriálním kmeni, který byl předběžně určen jako Moraxella sp. 71 . Kromě rezistence vůči iontům rtuti plasmid kóduje dva druhy dehalogenas, haloacetáthalidohydrolasy H-l a H-2. Plasmidy pUU202 (230 kb), pUU206 (152 kb), pUU204 (294 kb), pUU220 (220 kb) a pUU222 (222 kb) umožňují různým půdním bakteriím utilizaci 2-monochlorpropionové (2MCPA) a monochlorctové kyseliny . Plasmid pFL40 obsahuje gen dhlW, kódující halidohydrolasu umožňující utilizaci halogenkyselin . Byl objeven u kmene Alcaligenesxylosoxidans ssp. denitrificans ABIV. Plasmid pXAUl byl objeven u bakterie Xanthobacter autotrophicus GJ10 (cit. X Jeho velikost je 200 kb a obsahuje gen dhlA, kódující haloalkandehalogenasu, která v tomto kmeni iniciuje degradaci 1,2-dichlorethanu. Vzniká 2-chlorethanol, který je postupně přeměněn na 2-chloracetát, který je dále haloalkanoátdehalogenasou převeden na glykolát. Plasmid dále obsahuje gen ald, kódující chlorethanoldehydrogenasu, která se rovněž účastní popsané degradace 1,2-dichlorethanu.
Všechny velké plasmidy znamenají velké množství přebytečné DNA a tím i velkou zátěž pro nositelskou buňku. Například, velikost plasmidu OCT je odhadována na 300 kb (cit. ). Při velikosti chromozomu asi 6 x 106 párů baží a za předpokladu, že takto velký plasmid je v buňce přítomen jen v jedné kopii, to představuje celou dvacetinu genomu buňky. Buňka spotřebuje více energie a materiálu pro zdvojení své energetické výbavy, což současně růst buněk zpomaluje. Pokud by neexistovaly speciální mechanismy pro ochranu těchto plasmidu před ztrátou, v bakteriální populaci by za neselektivních podmínek došlo k jejich rychlému vymizení v důsledku selekčního tlaku. Enormní velikost D-plasmidů bývá vysvětlována přítomností velkého počtu genů nutných pro konjugační přenos. To však stále nevysvětluje potřebu stovek tisíc bází. Proto se v současné době uvažuje o projektech sekvenace celých plasmidu, které by pomohly objasnit funkci dlouhých plasmidových úseků s neznámou funkcí.
11. Plasmidy kódující utilizaci laktózy a citrátu
1.
LITERATURA
2. 3.
Je zajímavé, že i pro katabolismus těchto sloučenin existují bakteriální plasmidy. Plasmid pGCl o velikosti 50 kb, izolovaný z bakterie Yersinia enterocolitica, obsahuje geny lad (lac represor), lacZ ((3-galaktosidasa) a lacY (permeasa), které umožňují původně lac" hostiteli utilizovat laktosu. Několik dalších laktosových plasmidu bylo izolováno z kmenů patřících k bakteriálním rodům Klebsiella, Salmonella, Enterobacter a Próteus .
4. 5. 6.
Plasmid pOH3001 umožňuje kmenům E. coli utilizaci 76 citrátu . Z různých izolátů E. coli bylo izolováno dalších celkem 57 konjugativních Cit plasmidu (umožňujících utilizaci citrátu jako zdroj uhlíku a energie) . Podle inkompatibility byly rozděleny mezi skupiny IncW, IncHl a nezařaditelné, které byly inkompatibilní se všemi skupinami. Kromě utilizace citrátu propůjčují tyto plasmidy hostitelským buňkám schopnost utilizace cw-akonitátu a trikarballylátu.
7. 8. 9. 10. 11.
12. Závěr
12.
Biodegradační plasmidy jsou z dosud neznámých důvodů, pokud nějaký důvod vůbec existuje, nezvykle velké.
13.
135
Chakrabarty A. M., Gunsalus I. C: Bacteriol. Proč. 7977,46(1972). Trevors J. T.: FEMS Microbiol. Rev. 32, 149 (1986). Rheinwald J. G., Chakrabarty A. M., Gunsalus I. C: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 70, 885 (1973). Chakrabarty A. M., Chou G., Gunsalus I. C: Proč. Nat. Acad. Sci. USA 70, 1137 (1973). Beilen J. B. van, Wubbolts M. G., Witholt B.: Biodegradation5, 161 (1994). Eggink G., Lelyveld P. H. van, Witholt B., v knize: Innovations in Biotechnology (Houwink E. H., Meer R. R. van der, ed.), str. 373. Elsevier, Amsterdam 1984. Choi S., Kim C, Lee M., Hwang M., Min K.: Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 19, 82 (1991). Lee N., Hwang M, Jung G., Kim Y., Min K.: Biochem. Biophys. Res. Comm. 218, 17 (1996). Košťál J., Suchánek M., Klierová H., Demnerová K., Králová B., McBeth D. L.: zasláno k publikaci. Andreyeva A. L., Ilchenko A. P., Boronin A. M.: Mikrobiologia 54, 944 (1985). Williams P. A., Murray K.: J. Bacteriol. 120, 416 (1974). Worsey M. J., Williams P. A.: J. Bacteriol. 124, 1, (1975). Benson S., Shapiro J.: J. Bacteriol. 135, 278 (1978).
14. Duggleby C. J., Bayley S. A., Worsey M. J., Williams P. A., Broda P.: J. Bacteriol. 130, 1274 (1977). 15. Sharp P. A., Cohen S. N., Davidson N.: J. Mol. Biol. 75,235(1973). 16. Williams P. A., Worsey M. J.: J. Bacteriol 125, 818 (1976). 17. Yano K., Nishi T.: J. Bacteriol. 143, 552 (1980). 18. ChakrabartyA. M.,FrielloD. A.: Proč.Nat. Acad. Sci. USA 77, 3410(1974). 19. Dunn N. W., Gunsalus I. C: J. Bacteriol. 114, 974 (1973). 20. Yen K. M., Gunsalus I. C: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79,874(1982). 21. Connors M. A., Barnsley E. A.: J. Bacteriol 149,1096 (1982). 22. Cane P. A., Williams P. A.: J. Gen. Microbiol. 128, 529(1980). 23. Dunn N. W., Dunn H. M., Austen R. A.: J. Gen. Microbiol. 7i7, 2281 (1982). 24. Boronin A. M., Kočetkov V. V., Starovojtov I. I., Skrjabin G. K.: Dokl. Akad. N. SSSR 237,1205 (1977). 25. Kočetkov V. V., Boronin A. M.: Mikrobiologia 53, 639(1984). 26. Kočetkov V. V., Boronin A. M.: Genetika 27, 522 (1985). 27. Boronin A. M., Starovoytov I. I., Borisoglevskaja A. N., Skrjabin G. K.: Dokl. Akad. N. SSSR 228, 962 (1976). 28. Kočetkov V. V., Boronin A. M.: Mikrobiologia52,27 (1983). 29. Starovoytov I. I., Selifonov S. A., Nefedova M. Yu., Adanin V. M.: Mikrobiologia 54, 914 (1985). 30. Kiyohara H., Sugiyama M., Mondello F. J., Gibson D. T., Yano K.: Biochem. Biophys. Res. Comm. 777,939 (1983). 31. Foght J. M„ Westlake D. W.: Biodegradation 7, 353 (1996). 32. Brenner V., Hernandez B. S., Focht D. D.: Appl. Environ. Microbiol. 59, 2790 (1993). 33. Chatterjee D. K„ Kellogg S. T., Hamada S., Chakrabarty A. M.: J. Bacteriol. 146, 639 (1981). 34. Weineke W., Wessels S. W., Rubio M. A., Lattore J., Schwien U., Schmidt E., Schlomann M, Knackmuss H. J.: FEMS Microb. Lett. 14, 291 (1982). 35. Vandenbergh P. A., Olsen R. H., Colaruuotolo J. F.: Appl. Environ. Microbiol. 42, 737 (1981). 36. Kamp P. F., Chakrabarty A. M„ v knize: Plasmids of Medical, Environmental, and Commercial Importan-
ce (Timmis K. N., Puhler A., ed.), str. 275. Elsevier/ North-Holland Biomedical Press, Amsterdam 1979. 37. Shields M. S., Hooper S. W., Sayler G. S.: J. Bacteriol. 763,882(1985). 38. Chakrabarty A. M.: J. Bacteriol 772, 815 (1972). 39. Fong K. P., Goh C. B., Tan H. M.: J. Bacteriol. 178, 5592(1996). 40. Stillwell L. C.,Thurston S. J., SchneiderR. P., Romine M. F., Fredrickson J. K., Saffer J. D.: J. Bacteriol. 777, 4537(1995). 41. Burchhardt G., Schmidt I., Cuypers H., Petruschka L., Volker A., Herrmann H.: Mol. Gen. Genet. 254, 539 (1997). 42. Korzhenevich V. I., Shub G. M.: Mikrobiologia 54, 910(1985). 43. Shields M. S., Reagin M. J., Gerger R. R., Campbell R.,SomervilleC: Appl. Environ. Microbiol. 61,1352 (1995). 44. Hewetson L., Dunn H. M., Dunn N. W.: Genet. Res. Camb. 32, 249 (1978). 45. Bestetti G„ Galii E., Ruzzi M., Baldacci G„ Zennaro E., Frontali L.: Plasmid 12, 181 (1984). 46. Fujii T., Takeo M., Maeda Y.: Microbiology 143, 93 (1997). 47. Fukumori F., SaintP. C: J. Bacteriol. 779, 399 (1997). 48. Cain R. B., Murray K., Sagoo G. S.: Proč. Soc. Gen. Microbiol. 4, 99(1977). 49. Eaton R. W., Timmis K. N.: J. Bacteriol 168, 123 (1986). 50. Thacker R„ Rorvig O., Kahlon P., Gunsalus I. C: J. Bacteriol 735, 289 (1978). 51. Boronin A. M., Anisimova L. A., Golovleva L. A., Dzhusupova D. B., Skryabin G. K.: Mikrobiologia 54, 854(1985). 52. Johri S., Qazi G. N„ Chopra C. L.: J. Biotechnol. 20, 73(1991). 53. Karanth N. G. K., Srimathi M. S., Majumder S. K.: Pěst. Management 3, 3 (1984). 54. Boronim A. M., Griščenkov V. G., Kulakov L. A., Haumovsa R. P.: Mikrobiologia 55, 231 (1986). 55. Fukumura T., Takeuchi M., Banno I.: European. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 14, 120 (1982). 56. Saint C. P., Ribbons D. W.: FEMS Microbiol. Lett. 57, 323(1990). 57. RániM.,PrakashD., SobtiR. C,JainR. K.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 220,111 (1996). 58. Vandenbergh P. A., Wright A. M.: Appl. Environ. Microbiol. 45, 1953(1983).
136
59. Fisher P. R., Appleton J„ Pemberton J. M: J. Bacteriology 735, 798 (1978). 60. Pemberton J. M., Fisher P. R., v knize: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (Timmis K. N., Píihler A., ed.), str. 287. Elsevier/ North-Holland Biomedical Press, Amsterdam 1979. 61. Don R. H., Pemberton J. M: J. Bacteriol. 145, 681 (1981). 62. Ghosal D., You I. S., Chatterjee D. K., Chakrabarty A. M, v knize: Plasmids in Bacteria (Helinski D., Cohen S. N., Clewell D., Jackson D., Hollaender A., ed.), str. 667. Plenům, New York 1975. 63. Ghosal D., You I. S., Chatterjee D. K., Chakrabarty A. M.: Science 228, 135(1985). 64. Top E. M., Holben W. E., Forney L. J.: Appl. Environ. Microbiol. 61, 1691 (1995). 65. Topp E., Hanson R. S., Ringelberg D. B., White D. C, Wheatcroft R.: Appl. Environ. Microbiol. 59, 3339 (1993). 66. Tomášek P. H., Karns J. S.: J. Bacteriol. 171, 4038 (1989). 67. Feng X., Ou L. T., Ogram A.: Appl. Environ. Microbiol. 63, 1332(1997). 68. Serdar C. M., Gibson D. T., Munnecke D. M., Lancaster J. H.: Appl. Environ. Microbiol. 44, 246 (1982). 69. Stalker D. M., McBride K. E.: J. Bacteriol. 169, 955 (1987). 70. Cork D. J„ Khalil A.: Adv. Appl. Microbiol. 40, 289 (1995).
71. Kawasaki H., Tone N., Tonomura K.: Agric. Biol. Chem. 45, 29(1981). 72. Hardman D. J., Gowland P. C, Slater J. H.: Appl. Environ. Microbiol. 51, 44 (1986). 73. Brokamp A., Happe B., Schmidt F. R.: Biodegradation 7, 383 (1996-97). 74. Tardif G., Greer C. W., Labbé D., Lau P. C. K.: Appl. Environ. Microbiol. 57, 1853 (1991). 75. Guiso N., Ullmann A.: J. Bacteriol. 127, 691 (1976). 76. Ishiguro N., Sáto G., Sasakawa C, Danbara H., Yoshikawa M.: J. Bacteriol. 149, 961 (1982). 77. Ishiguro N., Hirose K., Asagi M., Sáto G.: J. Gen. Microbiol. 123, 193(1981).
J. Košťál and K. Demnerová (Department of Biochemistry and Microbiology, Institute of Chemical Technology, Prague): Degradative Plasmids of Gram-negative Bacteria The review sumarizes up-to-date information on majority of published degradative plasmids found in Gram-negative bacteria. Different plasmids are compared which code for similar or identical properties, that may, however, differ in many features such a size, conjugative properties, stability and number and properties of coded enzymatic activities, metabolic pathways of degraded chemicals are also discussed. The history of research on bacterial degradative plasmids is also briefly described.
137
