Inhoud
Startpagina
Clenbuterol
123–1
Clenbuterol door drs. R. Schilt, apotheker Sectie Groeibevorderaars Rijks-Kwaliteitsinstituut voor land- en tuinbouwprodukten (RIKILT-DLO) Postbus 230, 6700 AE Wageningen 1. 2. 2.1. 2.2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
Inleiding Chemische en farmacologische eigenschappen Chemische eigenschappen Farmacologische eigenschappen Groeibevorderaars Regelgeving en controle Acceptatie regelgeving Controlerende laboratoria Analytisch onderzoek Conclusies Ontwikkelingen Referenties
17 Chemische feitelijkheden
augustus 1996
123– 3 123– 3 123– 3 123– 5 123– 6 123– 6 123– 7 123– 8 123– 9 123–10 123–10 123–11
tekst/123
Inhoud
Startpagina
Clenbuterol
1.
123–3
Inleiding
Clenbuterol is een stof met een relatief grote bekendheid. Als vertegenwoordiger van een groep van geneesmiddelen toepasbaar bij mens en dier als gladde spierverslapper bij asthma-aanvallen of een dreigende abortus, bleek clenbuterol een interessante „groeibevorderende” bijwerking te vertonen. Bij runderen en schapen en in mindere mate bij varkens en pluimvee brengt clenbuterol een verschuiving teweeg in de verhouding aan vlees (spiervlees) en vet in het dier (het zogenaamde herverdelende effect). Het resultaat van behandeling is meer vlees en minder vet, wat resulteert in een beter economisch rendement. Bij kalveren is vastgesteld dat een meeropbrengst van ƒ 200,— tot ƒ 250,— per dier haalbaar is. Een meeropbrengst van ƒ 300,— of meer is wettelijk strafbaar gesteld. Er zijn vele aan clenbuterol verwante stoffen bekend die veel worden gebruikt. Clenbuterol is in het verleden bij de mens toegepast, maar momenteel niet meer vanwege de geringe therapeutische breedte (d.w.z. de kleine marge in dosering tussen gewenste en ongewenste (bij)werkingen). Bij de mens worden salbutamol (Ventolin®), terbutaline (Bricanyl®) en fenoterol (Berotec®) wel veel voorgeschreven als anti-asthmatica. 2. 2.1.
Chemische en farmacologische eigenschappen Chemische eigenschappen
Clenbuterol is een vertegenwoordiger van de groep van de sympathicomimetica (zie 2.2), afgeleid van het lichaamseigen epinefrine (adrenaline) en norepinefrine (noradrenaline). Clenbuterol (NAB 365; 4-amino-alpha-[(tert.-butylamino)methyl]3,5-dichlorobenzylalcohol hydrochloride of 4-amino-3,5-dichloroalpha-[(1,1-dimethylethyl)-aminomethyl]-benzeenmethanol; CA Index name; CAS no. 37148-27-9) heeft een molecuulgewicht van 277,2 Dalton en een smeltpunt van 115 °C. Het is verkrijgbaar in de vorm van het HCl-zout (molecuulgewicht 313,65 en een smeltpunt van 174 °C) als een wit kristallijne stof. In gedeprotoneerde vorm 17 Chemische feitelijkheden
augustus 1996
tekst/123
Startpagina
123–4
Clenbuterol
0886-052
CH — CH2 — NH — C — CH3 —
H2N
CH3
—
OH —
Cl
CH3
CI
HO
OH —
Inhoud
HO
Figuur 1.
CH — CH2 — NH — CH3
De chemische structuur van clenbuterol (1.) en epinefrine (r).
(pH > 9.5) is clenbuterol goed oplosbaar in organische oplosmiddelen. De synthese is beschreven in de octrooiliteratuur en door Keck et al (1972). Uitgaande van 4-amino-3,5-dichloor-acetofenon wordt het 4-amino-alpha-broom-3,5-dichloor-acetofenon gevormd. Dit wordt met t-butyl-amine tot 4-amino-alpha-t-butyl-amino-3,5dichloor-acetofenon omgezet, dat vervolgens met natriumboorhydride wordt gereduceerd tot de gewenste aminoëthanol-vorm. In feite is er sprake van een „blokkendoos”-synthese. Door het variëren van het acetofenon en het (primaire of secundaire amine) is het relatief eenvoudig chemische varianten te maken, hetgeen ook is gebleken in de praktijk. Clenbuterol is – als enig zogenaamd sympathicomimeticum (zie 2.2. Farmacologische eigenschappen) – in Nederland geregistreerd als dierbehandelingsmiddel voor toepassing als „hoestmiddel” en bij dreigende abortus bij runderen en paarden. Naast de reguliere door de farmaceutische industrie geproduceerde clenbuterol bevattende toedieningsvormen, zijn ook andere preparaten in wisselende samenstelling beschikbaar op de „zwarte markt”. De toxiciteit wordt in de literatuur omschreven als matig. Langetermijnstudies bij ratten en honden gaven bij de rat geen beschadigingen te zien. Bij de hond werden lichte beschadigingen aan de hartspier geconstateerd. Clenbuterol is geen carcinogene stof, maar is door het werkingsmechanisme wel in staat de groei van cellen te beïnvloeden. 17 Chemische feitelijkheden
augustus 1996
tekst/123
Inhoud
Startpagina
Clenbuterol
2.2.
123–5
Farmacologische eigenschappen
Het zenuwstelsel bestaat uit een willekeurig (sympathisch) en onwillekeurig (para-sympathisch) deel. Sturing aan de vele organen en weefsels vindt plaats via zenuwgeleiding en signaaloverdracht via het bloed m.b.v. hormonale stoffen. Deze hormonen binden aan specifieke receptoren die op de celmembraan of in de cel aanwezig zijn. Na binding aan de receptor vindt in de cel een reactie plaats die uiteindelijk leidt tot het gewenste effect. Deze hormonen worden mimetische stoffen genoemd; voor het sympathisch zenuwstelsel de sympathicomimetische stoffen. Binnen de groep van epinefrine-afgeleide, sympathicomimetische stoffen wordt op basis van de sterkte van de binding aan de receptor onderscheid gemaakt tussen verschillende typen. In tabel 1 is de verdere onderverdeling van de β-receptoren weergegeven met de belangrijkste effecten. De effecten zijn niet absoluut gescheiden, soms leidt een hoge dosering van β2-sympathicomimeticum ook tot β1-effecten. In de praktijk worden de β-sympathicomimetica ook β-agonisten genoemd. Tabel 1.
Overzicht van de verschillende typen β-receptoren.
Receptor
Orgaan
Effect
β1 β2
hart longen baarmoeder vetcellen
verhoging frequentie en toename slagvolume rontspanning gladde spieren van de bronchiën ontspanning gladde spieren van de baarmoeder vetafbraak (lipolyse)
intermediair β2 of β3
De verschillende effecten worden verkregen na activatie van de β-receptor. Clenbuterol wordt als een stof met hormonale werking beschouwd omdat het werkingsmechanisme analoog is aan dat van door de bijnier als hormoon afgescheiden epinefrine. Clenbuterol en salbutamol zijn bewezen β2-receptor activerende stoffen (beta(2)-agonisten); in hogere dosering treedt ook β1-stimulatie op hetgeen aanleiding geeft tot bijwerkingen als hartkloppingen, trillingen en hoofdpijn. Over een mogelijke werking van clenbuterol als β3-agonist is weinig bekend. Alhoewel veel onderzoek is uitgevoerd met clenbuterol en andere sympathicomimetica is het precieze mechanisme van de groeibevor17 Chemische feitelijkheden
augustus 1996
tekst/123
Inhoud
Startpagina
123–6
Clenbuterol
dering nog niet opgehelderd. Er is invloed op zowel de eiwitaanmaak als afbraak; het nettorendement is een toename. Sterker is het effect op de vetafbraak: de hydrolyse van vet wordt duidelijk gestimuleerd. De effectiviteit als herverdeler/groeibevorderaar verschilt per stof en diersoort. 3.
Groeibevorderaars
Er bestaan verschillende type groeibevorderaars, die afzonderlijk of in combinatie kunnen worden toegepast om vleesproducerende dieren beter en/of sneller te laten groeien (zie tabel 2). Tabel 2.
Overzicht van de verschillende typen groeibevorderaars.
Stofgroep
Hoofd-effect
Toegestaan
stoffen met anti-microbiële werking (antibiotica) β-agonisten (hormonaal actief)
verandering maagdarmflora vergroting vlees/ vetverhouding toename spierweefsel (vlees)
een aantal stoffen is geregistreerd nee
ondersteunend effect op andere stoffen vergroting vlees/ vetverhouding vocht vasthouden
nee
anabole steroïden: stoffen identiek aan of afgeleid van geslachtshormonen (testosteron, estradiol en progesteron) stoffen identiek aan of afgeleid van de glucocorticoïden (cortisol) bovine somatotropine (rundergroeihormoon) „anti-hormonale” schildklierremmers (thyreostatica)
4.
nee
nee nee
Regelgeving en controle
Het gebruik van stoffen met groeibevorderende werking is in de Europese Unie niet toegestaan, met uitzondering van een aantal geregistreerde stoffen met anti-microbiologische werking (antibiotica), zie tabel 1. Samenvattend kan worden gezegd dat gebruik van hormonaal actieve groeibevorderende stoffen (zoals anabole steroïden en β-agonisten) op ieder moment van de produktiefase verboden is. 17 Chemische feitelijkheden
augustus 1996
tekst/123
Inhoud
Startpagina
Clenbuterol
123–7
Binnen de 15 lidstaten van de EU wordt controle uitgeoefend op de naleving van dit verbod via monitoring (regelmatig steekproefsgewijs onderzoek, het zogenaamde nationale plan) en – per land verschillend – gericht survey-onderzoek. De controle maakt onderdeel uit van de nationale wetgeving. In Nederland is een aantal wetten en zogenaamde produktschapsverordeningen van kracht. De belangrijkste zijn de Vleeskeuringswet, de Diergeneesmiddelenwet, de Wet economische delicten en de produktschapsverordeningen „Stoffen met hormonale werking” en „Stoffen met sympathicomimetische werking”. 5.
Acceptatie regelgeving
Er bestaat een steeds terugkomende discussie over de toelaatbaarheid van groeibevorderaars. Hierbij spelen economische aspecten (concurrentie), ethische aspecten (diervriendelijkheid) en de mogelijke schadelijkheid van eventuele residuen in vlees voor de consument een rol. Van een drietal lichaamseigen en twee synthetische groeibevorderaars is recent door de Codex Alimentarius (onderdeel van de World Health Organization (WHO) en de Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO)) vastgesteld dat – bij correcte toepassing – geen risico bestaat voor de consument. Wel is bekend dat consumenten na het eten van lever met hoge gehalten aan clenbuterol de werking en bijwerkingen van dit middel aan den lijve hebben ondervonden (symptomen als nervositeit, hartkloppingen, spiertrillingen, spierpijn en hoofdpijn). In de Verenigde Staten is een aantal groeibevorderaars identiek aan en afgeleid van de steroïden toegestaan bij de vleesproduktie. Door een in april 1994 in Urugay afgesloten GATT overeenkomst (General Agreement on Tariffs and Trade) mogen geen belemmeringen bestaan in de handel van vlees van deze legaal met groeibevorderaars behandelde runderen. In de EU wordt o.a. door de consumentenorganisaties sterk bezwaar gemaakt tegen de import van dieren die met groeibevorderaars zijn behandeld. In 1996 zal door de EU een besluit moeten worden genomen over het al dan niet toelaten van dit importvlees, waarbij ook het mogelijk toestaan van het ge-
17 Chemische feitelijkheden
augustus 1996
tekst/123
Inhoud
Startpagina
123–8
Clenbuterol
bruik van (bepaalde) groeibevorderaars in de EU zelf aan de orde komt. 6.
Controlerende laboratoria
In Nederland wordt de controle op het mogelijk gebruik van groeibevorderaars reeds meer dan 20 jaar uitgevoerd door de rijksoverheid, te weten het ministerie van Volksgezondheid, Welzijn en Sport (VWS) en het ministerie van Landbouw, Natuurbeheer en Visserij (LNV). De actieve laboratoria zijn voor VWS het Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu (RIVM) en voor LNV het RijksKwaliteitsinstituut voor land- en tuinbouwprodukten (RIKILTDLO) en de Rijksdienst voor de Keuring van Vee en Vlees (RVV). Het RIVM en het RIKILT-DLO zijn door de EU erkend als nationale referentielaboratoria en daardoor verantwoordelijk voor de toegepaste onderzoeksmethoden en de kwaliteit van het onderzoek. Het RIVM is recent benoemd tot communautair referentielaboratorium voor de steroïden voor de gehele EU. Het overgrote deel van de genomen urine- en lever-monsters wordt routinematig onderzocht door het Centraal Laboratorium van de RVV. Gericht opsporingsonderzoek in opdracht van de Algemene Inspectiedienst (AID) van LNV vindt plaats bij het RIKILT-DLO, bewakingsonderzoek in opdracht van de Veterinaire Hoofdinspectie (VHI) van VWS bij het RIVM. De kwaliteit van het laboratoriumonderzoek is van groot belang; de drie overheidslaboratoria hebben allen een erkend kwaliteitssysteem (zogenaamde Sterlab-erkenning). Sinds een aantal jaren worden ook controles verricht bij kalveren en runderen door het producerende bedrijfsleven, verenigd in de Produktschappen. Voor de controle van kalveren is de Stichting Kwaliteitsgarantie Vleeskalversector (SKV) opgericht en voor de controle van de runderen de Kwaliteitscontrole Rundersector (KCR). Het monsteronderzoek wordt uitgevoerd door TNO. Zowel op beleidsmatig als het keuringstechnisch vlak werken overheid en bedrijfsleven samen om tot een goede afstemming te komen. De analytische facetten en kwaliteitsbewaking (quality assurance en quality control, QA&QC) worden maandelijks door de 4 genoemde laboratoria besproken.
17 Chemische feitelijkheden
augustus 1996
tekst/123
Inhoud
Startpagina
Clenbuterol
7.
123–9
Analytisch onderzoek
Voor het meer routinematige onderzoek wordt waar mogelijk gebruik gemaakt van screeningsmethoden. Screeningsmethoden kunnen worden gezien als methoden die snel en goedkoop grotere aantallen monsters kunnen onderzoeken op de aanwezigheid van een bepaalde stof of stofgroep. In het algemeen wordt het eindresultaat gezien als indicatief en is nog onvoldoende „hard” om tot een definitieve uitspraak te komen. Een techniek die zeer geschikt is voor screeningsonderzoek is de immuno-assay. Deze test is zodanig opgezet dat de te onderzoeken stof aanwezig in een monster, na een eventuele eenvoudige monsterbewerking, een competitie aangaat met een zeer sterk op de stof lijkende „gelabelde” stof om een beperkte hoeveelheid, specifiek tegen de stof opgewekte antilichamen (immunoglobulinen). Hoe meer stof in het monster aanwezig is hoe minder van de gelabelde stof kan binden aan de antilichamen. Dit label is vaak een enzym dat, nadat de nog niet gebonden in de test aanwezige gelabelde stof is verwijderd, een kleuromzetting teweeg kan brengen. Meer stof betekent dan minder kleur. Met behulp van bekende hoeveelheden van de standaardstof wordt een kalibratiecurve gemaakt, waarna de schijnbare gehalten in het monster kunnen worden berekend. Alle stoffen die een zekere mate van binding vertonen met de antilichamen dragen bij aan het gemeten signaal. Voordat tot afkeuring wordt overgegaan wordt bevestigingsonderzoek m.b.v. gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) uitgevoerd. Door de lage gehalten van de β-agonisten in urine of lever, in de orde van µg per kg (ppb-niveau), worden methoden toegepast met een hoge mate van monster-opzuivering. Voor de β-agonisten bestaan hiervoor enkele mogelijkheden. Een o.a. door het RIKILTDLO ontwikkelde en bij meerdere laboratoria toegepaste extractie en opzuiverings-procedure, is het gebruik maken van specifieke, in eigen beheer opgewekte, antilichamen gekoppeld aan een dragermateriaal, immuno-affiniteitschromatografie (IAC) genaamd. Het resulterende extract wordt vervolgens gederivatiseerd, waarbij de vluchtigheid van de β-agonisten toeneemt en de gaschromatische analyse wordt verbeterd. Bij het onderzoek wordt gebruik gemaakt van zogenaamde door de EU voorgeschreven kwaliteits- en identificatie criteria (93/256/EU). In het kort komt het neer op het meten 17 Chemische feitelijkheden
augustus 1996
tekst/123
Inhoud
Startpagina
123–10
Clenbuterol
van vier karakteristieke massafragmenten, die op de juiste retentietijd in een bepaalde verhouding moeten voorkomen. Omdat het voor clenbuterol moeilijk is om bij lage gehalten aan deze criteria te voldoen wordt een combinatie van twee derivaten gemeten of worden twee ionisatietechnieken toegepast. 8.
Conclusies
Groeibevorderaars geven de mogelijkheid, in combinatie met een goed voedselaanbod, een extra spieraanzet en/of een meerwaarde te geven bij runderen. De groep van de β-agonisten, waarvan clenbuterol de bekendste is, haalt regelmatig de pers. Een vaak gehoord argument hierbij is dat clenbuterol het verschil uitmaakt tussen verlies of enige winst in de rundveemesterij, die economisch gezien onder grote druk staat. Tussen deze niet toegestane groeibevorderaars en de toegestane groeibevorderaars (stoffen met anti-microbiële werking) moet een duidelijk onderscheid gemaakt worden. Het keuringsonderzoek in Nederland is intensief en van hoge kwaliteit. Er zijn vele bekende en potentieel bruikbare groeibevorderaars. Bij de controle wordt daarom meer en meer gebruik gemaakt van de detectie op basis van de biologische werking i.p.v. uitsluitend een gerichte analytisch-chemische bepaling. 9.
Ontwikkelingen
Het gebruik van groeibevorderaars is aan sterke ontwikkelingen onderhevig. Vooral het type stoffen en stofgroepen wisselt relatief snel. Voor de effectieve controle en opsporing betekent dit een noodzaak tot continue aanpassing van procedures en analysemethoden. Zeker ook door de lage gehalten die moeten kunnen worden gemeten in bijvoorbeeld vlees, lever of de uitscheidingsprodukten zoals urine of mest. Bovendien wordt een belangrijk deel van de stoffen als metaboliet uitgescheiden, d.w.z. de toegediende moederstof is in het lichaam chemisch veranderd om de uitscheiding te bevorderen. De huidige sterk stofgerichte aanpak is minder flexibel als het gaat
17 Chemische feitelijkheden
augustus 1996
tekst/123
Inhoud
Startpagina
Clenbuterol
123–11
om in te spelen op de vroegtijdige detectie van nieuw toegepaste, vaak chemisch afwijkende stoffen. Bij het onderzoek is een aantal richtingen aan te geven. Enerzijds kan effectiever worden gekeken naar de bekende stoffen door andere monstermaterialen te onderzoeken. Zo hoopt clenbuterol op in het pigment van het netvlies en de haren en is hierin langer aantoonbaar na de laatste toediening. Anderzijds is het mogelijk testen uit te voeren op ieder moment tijdens de produktie, eventueel op de boerderij zelf m.b.v. test kits. Ook worden er nieuwe procedures ontwikkeld. Het merendeel van de groeibevorderaars oefent een hormonaal effect uit, waarvan bij de opsporing gebruik kan worden gemaakt. Binnen het RIKILTDLO wordt in samenwerking met de Vrije Universiteit in Amsterdam (door de EU medegefinancierd) onderzoek verricht naar een screeningsmethode gebaseerd op de bij alle β-agonisten voorkomende receptor-activerende eigenschappen. Door een stukje weefsel van de luchtpijp of darm in een orgaanbad-opstelling bloot te stellen aan een extract van bijvoorbeeld een urinemonster, is het mogelijk het spierverslappend effect te meten zelfs op het lage residu-niveau. Een andere aanpak is de door TNO toegepaste screeningsmethode met geïsoleerde receptoren. Het bevestigingsonderzoek moet wat betreft de mogelijkheden aansluiten op het screeningsonderzoek. Naast GC-MS zijn de mogelijkheden voor vloeistofchromatografiemassaspectrometrie (LC-MS) toegenomen. Onderzoek spitst zich hier toe op het type interface tussen LC en MS en de gebruikte monstervoorbewerking.
10. Referenties Geïnteresseerden kunnen voor een uitgebreide literatuurlijst contact opnemen met de auteur (zie p. 1 van deze Feitelijkheid). –
Hanrahan, J. P., „Summary and Conclusions”. In: Beta-agonists and their effects on animal growth and carcass quality; Hanrahan, J. P. (ed.); Elsevier Applied Science, London and New York (1987).
17 Chemische feitelijkheden
augustus 1996
tekst/123
Inhoud
Startpagina
123–12 –
Clenbuterol
Vandemeulenbroucke, J., De hormonenmaffia, Uitgeverij Fontein (1993). ISBN 90-5240-028-8.
Dr. H. Herstel wordt bedankt voor het kritisch doorlezen van het manuscript.
17 Chemische feitelijkheden
augustus 1996
tekst/123
