CITOLÓGIA CITOMORFOLÓGIA

Szent-Györgyi Albert Orvostudományi Egyetem Anatómiai, Szövet- és Fejl déstani Intézete

Prof. Dr. Mihály András

CITOLÓGIA ÉS CITOMORFOLÓGIA orvostanhallgatók számára

Szeged 1999.

2

1. Bevezetés a citológiába Az els összetett nagyítót (mikroszkópot) Hans és Zacharias Janssen (apa és fia) alkották a 16. és 17. század fordulóján. A 17. században már használtak állványos mikroszkópot mesterséges világítással. Bár a mikroszkópos vizsgálatok kezdetét Leeuwenhoek

és

Robert

Hooke

tevékenységéhez

kapcsoljuk,

az

orvosi

mikroszkópizálás igazi megteremt je és els zseniális m vel je Marcello Malpighi volt, akinek munkássága a szövettan tudományának kezdetét is jelenti. Els jelent s munkájában (1659) leírta a kapillárisokat, a vörösvértesteket, a vese glomerulusait, a lép, a mellékvese és a mirigyek szerkezetét. A sejtelmélet és a citológia 150 évvel kés bb, a 19. század elején indult útjára, Lamarck, Dutrochet, Turpin és mások munkásságával, hogy végül a botanikus Schleiden (1838) és a zoológus Schwann (1839) munkáiban öltsön testet, akik megállapították hogy az él szövetek önálló egységei a sejtek. További lépés volt annak felismerése, hogy a sejtek osztódás folytán

magukhoz

hasonló

új

sejteket

hoznak

létre

(ahogyan

Virchow

megfogalmazta: omnis cellula e cellula ). Felfedezték az amitosist, vagy direkt sejtosztódást (Remak), majd pedig az indirekt osztódást a mitosist (Flemming). Waldeyer felfedezte, hogy a mitosisban kromoszómák (vagy magfonalak) alakulnak ki, Hertwig pedig leírta, hogy a megtermékenyítés alatt a petesejt és a spermium magjai (pronucleusai) összeolvadnak és így jön létre a zygota. A 19. század felfedezéseit 1892-ben Hertwig nagy monográfiában foglalta össze ( Die Zelle und das Gewebe ), amelynek megjelenése a citológiának (vagyis a sejtbiológiának) mint önálló tudományterületnek a megszületése is egyben. A sejtbiológia számos résztudomány összessége: ezek közül a citogenetika, a citofiziológia, a citokémia és a citomorfológia a legfontosabbak. Az anatómián belül a citomorfológia nemcsak önmagáért fontos, hanem alapul szolgál a hisztológia (szövettan) tanulmányozásához is. A citomorfológia orvosgyakorlati vonatkozásaival pedig a

kórszövettanban és a klinikai citológiában fogunk találkozni. A

citomorfológia klinikai jelent ségét nemcsak a hematológiában, hanem az ún. aspirációs citodiagnosztikában, a n gyógyászati citodiagnosztikában és a t biopsziás vizsgálatokban is viszontlátjuk majd.

3 1.1. Vizsgáló módszerek a citológiában A citológiai vizsgáló módszerek kiválasztásakor mindig ismernünk kell a vizsgálni kívánt struktúrák méretét. Ehhez nyújt segítséget az alábbi táblázat, amely az él organizmusok és alkotórészeik dimenzióit szemlélteti.

METRIKUS EGYSÉGEK

méter (m)

A MÉRTÉKEGYSÉG HATÁRAIN BELÜL VIZSGÁLHATÓ STRUKTÚRÁK emberi, állati test

deciméter (dm)

emberi végtagok

centiméter (cm)

szervek

milliméter (mm)

szövetek

100 mikrométer ( m)

emberi petesejt

10 mikrométer ( m)

sejtek

1 mikrométer ( m)

baktériumok

100 nanométer (nm)

vírusok

10 nanométer (nm)

fehérjék

1 nanométer (nm)

aminosavak

1 nm alatt

atomok

(a csökkenés mértéke 10x)

A citológiai vizsgálatok alapvet feloldóképessége

eszköze a mikroszkóp. A fénymikroszkóp

tehát a készüléknek az a tulajdonsága, hogy két egymás melletti

pontról különálló képet adjon

a megvilágításra használt fény hullámhosszától ( ) és

a tárgylencse numerikus apertúrájától (NA) függ. A numerikus apertúra az objektívlencse ún. belép pupillájára jellemz : az objektív optikai tengelye és a lencse fókuszából a lencse széle (a pupilla széle) felé haladó sugár által bezárt szög ( ) szinusza és az objektív valamint a tárgy közötti közeg (pl.: leveg ) törésmutatójának (n) szorzata (NA = n

sin

). A felbontóképesség (F) így a következ

módon

számítható ki:

F = 0.61 / NA A lencse numerikus apertúrája növelhet , ha az objektív lencse és a tárgy közé a leveg nél nagyobb törésmutatójú anyagot (pl.: immerziós olajat) helyezünk, vagy ha

4 csökkentjük a megvilágításra használt fény hullámhosszát (pl.: ibolya fényt használunk). Így a fénymikroszkóp feloldóképességének alsó határa kb. 0.17 µm lehet (ez a mitokondriumok átlagos vastagságával egyenl ). Fehér fény esetén a feloldóképesség kb. a duplája ennek (0.25 µm). Az emberi szem a fény hullámhosszát (színét) és a megvilágítás er sségét képes érzékelni. A sejtalkotórészek többsége színtelen (néhány pigment kivételével) és a sejt fényelnyel képessége minimális. Ezért a sejteket vizsgálat el tt meg kell festeni. Vannak olyan festékek, amelyekkel él sejteket festhetünk

ezeket vitális festési

módszereknek nevezzük. Vitális festékek a Janus zöld, a metilénkék, a kongóvörös, a neutrálvörös és a fekete tus. Ezeket az él sejtek felveszik és citoplazmájukban vagy sejtorganellumaikban tárolják egy ideig: ennek folytán a sejt bizonyos alkotórészei színessé válnak és a fénymikroszkópban jól láthatók. A legtöbb festési módszer azonban igényli a sejt el zetes fixálását (megölését), és fixálás utáni el kezelését. Ezen kívül olyan módszerek is vannak, melyek során a sejteket nem festjük, hanem festetlenül (él vagy fixált állapotban) vizsgáljuk. Ilyen módszerek a fáziskontraszt mikroszkópia, a polarizációs mikroszkópia, a sötétlátóteres- és az interferencia mikroszkópia. Ezek a módszerek bizonyos sejtalkotórészeket tesznek láthatóvá (pl.: polarizációs

mikroszkóppal

tanulmányozhatjuk

az

idegrostokat

körülvev

myelinhüvelyt. A fixált sejteken alkalmazott citológiai festések túlnyomó többsége szerves (aromás) vegyületeket alkalmaz. A festékek két nagy csoportra oszthatók: vannak bázikus és savanyú festékek. A bázikus festékekben a színt adó ún. kromofor-csoport kationos jelleg . Bázikus festékek az orcein, a metilénkék, a krezilibolya, a gallocianin, a brillant-krezilkék, az azúr, a bázikus fukszin és a toluidinkék. Savanyú festékek az eozin, a savanyú fukszin, a pikrinsav, a floxin, az alizarinvörös és a hematoxylin. A festékek általában fehérjéket és nukleinsavakat festenek. A fest dés mechanizmusa a fehérjék esetében többnyire a közeg, a fixálás, az el kezelések és a festékoldat pH értékét l függ. Minél több bázikus vagy savas csoport disszociál a fehérjékr l, annál több festékmolekula köt dhet só-kötések révén. A nukleinsavak esetében (minthogy izoelektromos pontjuk igen alacsony) a bázikus festékekkel történ

festés rendkívül szelektív

olyannyira, hogy pl.: a toluidinkék-festés

specifikus a ribonukleinsavra; és ezt ribonukleáz el kezeléssel ellen rizni is lehet.

5 A

sejtek

ultrastruktúráját

elektronmikroszkópot

elektronmikroszkóppal

Knoll

és

Ruska

vizsgálhatjuk.

készítették

Az

1932-ben.

els Az

elektronmikroszkópban a vákuumban haladó elektronsugarakat ízzított fémszál (pl.: volfrám) bocsájtja ki, amely az úgynevezett elektronágyúban helyezkedik el. Az izzószál által kibocsájtott elektronokat az elektronágyúban nagy feszültséggel (60-80 kV) gyorsítjuk, majd pedig elektromos fókuszáljuk.

A

lencsék

mágneses

lencsék

tekercsek,

segítségével irányítjuk és

amelyek

kondenzortekercsek,

objektívlencse-tekercsek és projektívlencse-tekercsek formájában a mikroszkóp kolumnájában találhatók. A kolumnában vákuum van, hogy az elektronok akadálytalanul haladjanak. A preparátum, amely speciálisan készült, igen vékony (50 80 nm) metszet, speciális preparátum tartó szerkezetben a kondenzor- és az objektív-tekercsek között található. Az elektronok kölcsönhatásba lépnek a metszettel és ezt követ en rugalmasan vagy rugalmatlanul szóródnak. Ha ütközéskor teljes energiájukat leadják, abszorpció következik be. Az elektronmikroszkópos kép e három folyamat következtében alakul ki. A szóródott elektronokat ugyanis a lencsék közelébe épített apertúrák kisz rik

amikor az elektron hiánya a kontraszt forrása. A

képet egy fluoreszkáló anyaggal bevont képerny n látjuk, vetítjük

vagy

televíziós

képerny re

visszük

és

fotóanyagra (filmre)

képer sít

segítségével

tanulmányozzuk.

2. A sejtmembrán szerkezete Az eukarióta sejteket membrán borítja, amely izolálja a sejtet a környezetét l, ugyanakkor

biztosítja

a

kommunikáció

lehet ségét

is.

A

sejtmembrán

elektronmikroszkóppal három réteg nek látszik, és ez a struktúra minden eml s sejtre jellemz

nemcsak a küls membránra, hanem az intracelluláris membránokra is.

Innen ered Robertson unit membrane koncepciója. A unit membrane vastagsága 7.5

10 nm. A sejtmembrán kémiai összetétele sejtfrakcionálással (ultracentrifugálás)

vizsgálható: minden membrán lipidekb l, fehérjékb l és szénhidrátokból áll. A biológiai membránok alapváza egy kett s foszfolipid réteg (bilayer), amelyben a foszfolipidek rendezetten, hidrofób rétegükkel kapcsolódnak össze. Poláris végeik ily módon a membrán felszíne felé rendez dnek. A sejtmembrán koleszterolt, foszfatidilkolint,

szfingomielint,

foszfatidiletanolamint,

foszfatidilinozitolt

és

foszfatidilszerint tartalmaz. A foszfolipidek testh mérsékleten mozgékonyak, laterális

6 irányokban (a membrán síkjában) elmozdulhatnak

a lipid kett sréteg tehát

dinamikus képz dmény. A membrán csak akkor stabil, ha hidrofób része vizes közeggel nem érintkezik

ezért ha megszakad, egy darabja lef z dik, gyorsan újra

záródik, vagyis a bilayer-végek összekapcsolódnak. Ez a folyamat legjobban a vezikula képz dés folyamán figyelhet meg. A foszfolipid kett sréteg egyik felszíne az extracelluláris, másik felszíne az intracelluláris tér felé néz. A két felszín foszfolipid összetétele különböz : vörösvértest membránban a szfingomielin és a legtöbb foszfatidilkolin az extracelluláris rétegben van, míg az intracelluláris réteg foszfatidilszerinben és foszfatidiletanolaminban gazdag. A membrán fehérjék a lipid kett srétegbe ágyazottan helyezkednek el: ez a membránmodell fluid mosaic néven vált ismertté és jelenleg is használatos. A fehérjék igen sok funkciót látnak el: ionokat és molekulákat szállítanak, receptorként szerepelnek, mechanikai szerepük van, meghatározzák a sejtek molekuláris identitását (antigénként szerepelnek) és enzimként is m ködnek. A membránfehérjék egyik csoportja a lipidrétegbe ágyazódik mert hidrofób szakaszokkal rendelkezik, amelyek kölcsönhatásba lépnek a lipidek apoláris szakaszaival. Ezek az ún. intrinsic vagy integrális membránproteinek. Ezek egy csoportja teljesen keresztüljárja a membránt a fehérjék két vége ugyanis hidrofil: kilógnak a membránból mindkét felszínen. Ezek a transzmembrán proteinek. Transzmembrán fehérjék például a vörösvértest glikoforin proteinjei, a retina fotoreceptorainak rodopszinja és az integrinek. Az integrinek olyan transzmembrán fehérjék, amelyek extracelluláris része az extracelluláris térben lév proteinekkel létesít kapcsolatot (ez az integrin-receptor). Az integrin citoplazmatikus része pedig a citoszkeleton fehérjéihez köt dik. Az Rh faktor (D antigén) a vörösvértest membrán integrális proteinje. Az ún. perifériás vagy extrinsic membránproteinek a membrán felszínén helyezkednek el: vagy integrális proteinekhez, vagy a lipidek poláris végéhez kapcsolódnak. A spektrin és az ankirin tipikus perifériás proteinek, amelyek a membrán citoplazmatikus (intracelluláris) felszínén találhatók. A membránproteinek a lipidekhez hasonlóan laterális mobilitással rendelkeznek ezek olyan molekuláris mozgások, amelyek a membrán fluid mosaic természetéb l (a lipid kett sréteg

folyékonyságából ) következnek. Bizonyos molekuláris

interakciók (antitest

antigén találkozások) a membránfehérjék csoportosulását

váltják ki (a jelenséget

capping

vagy

patching

néven ismerjük az

7 immunológiában). A fehérjék mobilitását azonban szabályozzák és befolyásolják a citoplazmatikus felszínen lév perifériás proteinek

azáltal, hogy a transzmembrán

fehérjéket citoplazmatikus fehérjékhez (ún. citoszkeletális fehérjékhez) kapcsolják. A membrán szénhidrátok mennyisége a lipidekhez és a fehérjékhez képest kicsi (4 8

%). Minden esetben fehérjékhez vagy a lipid poláris végeihez köt dnek. A

sejtmembrán szerkezetének igen fontos részét, a membrán küls

felszínén lév

glycocalyxot képezik. A glycocalyx tehát a membránt az extracelluláris oldalán borító, a membránnál többnyire vastagabb szénhidrát réteg. A glycocalyxot alkotó oligoszaharidok a membrán lipidjeihez, perifériás és integrális membránfehérjéihez köt dnek, és mivel sok sziálsav oldalláncuk van, jelent s mennyiség negatív töltést hordoznak. A vörösvértest membránokban található vércsoport antigének (ABO) komplex oligoszacharidok, amelyek szfingolipidekhez köt dnek. A glycocalyxban találhatók az integrinek receptor-részei is, amelyek fibronectint vagy laminint képesek kötni. A fibronectin extracelluláris fehérje, amely a sejteket egymáshoz illetve az extracelluláris matrixhoz kapcsolja (ez a sejtadhézió). A laminin pedig a bazális laminák egyik f alkotórésze, egyszersmind azokat a hámsejtekhez kapcsolja. 2.1. Receptorok és ioncsatornák A membránreceptorok többnyire alegységekb l álló transzmembrán proteinek, amelyek más proteinekkel (enzimekkel, ioncsatornákkal) m ködnek együtt a sejtkommunikációban. Vannak olyan receptorok, amelyek egyben ioncsatornák is vagyis a receptor ligandja az ioncsatorna szabályozója. Ilyen az ideg

izom

szinapszisban (neuromuscularis junctio) el forduló acetilkolin receptor, amely a motoros véglemezben, vagyis a posztszinaptikus oldalon található. Az acetilkolin receptorok acetilkolint kötnek és a receptor-ligand interakció hatására az alegységek által alkotott ioncsatorna megnyílik: nátrium és kálium halad át rajta, és az izomrost membránja depolarizálódik. A myasthenia gravis nev izombetegségben a motoros véglemezben lév

acetilkolin receptorok száma er sen csökken

emiatt az idegi

impulzus nyomán felszabaduló acetilkolin nem tudja kifejteni hatását: a betegség egyik tünete az izomgyengeség. Hasonlóan komplex receptor az idegszövetben lév glutamát receptor, amely 5 különböz típussal rendelkezik. Egyik típusa az NMDA (N-metil-D-aszpartát)

receptor, amelynek ligandja a glutaminsav

és amely a

receptor-ligand interakció hatására nátriumot és kalciumot enged a sejtbe. Az NMDA receptorok tartós és er s ingerlése az intracelluláris ionkoncentráció jelent s

8 megemelkedése miatt az idegsejt pusztulását okozza. Ezek a receptorok epilepsziában és a krónikus degeneratív idegrendszeri betegségekben fontos

pathogenetikai

szerepet játszanak. 2.2. A sejt felszíni specializációi és a sejtkapcsoló struktúrák Mikrovillusok (kefeszegély, kutikula) A mikrovillusok (mikrobolyhok) a hámsejtek apikális felszínének membránnal borított ujjszer citoplazma nyúlványai: kb. 0.1

m vastag és 0.6

m hosszú

bolyhok, amelyekben actin filamentumokból álló kötegek vannak. A filamentum kötegek a citoplazma felé haladnak és az apikális sejtfelszínhez közeli, ún. terminal web mikrofilamentum rendszerében rögzülnek. Egy-egy sejt felszínén akár 3000 mikrovillus is lehet

a sejtfelszínt jelent sen megnövelve. A mikrovillusokat borító

glycocalyx számos ektoenzimet tartalmaz, amelyek az anyagtranszportban játszanak szerepet: a bél hámsejtjeinek kutikulája alkalikus foszfatázt, aminopeptidázt és glükozidázokat is tartalmaz. Desmosomák A desmosomák mechanikai szerepet játszó sejtkapcsoló struktúrák: a szövet sejtjeit egymáshoz er sítik. Desmosomák a többréteg laphámokban, a simaizomban és a szívizomban találhatók. A desmosoma területén a szomszédos membránok egymással párhuzamosak (távolságuk kb. 30-40 nm), és közöttük elektrondenz extracelluláris anyag van, amely filamentumokból áll és a két sejtet er síti egymáshoz. A membránok bels oldalán elektrondenz, filamentózus plaque található, amelyhez ún. tonofilamentumok kapcsolódnak: ezek a citoplazma intermedier filamentumai. A plaque és az extracelluláris anyag között transzmembrán

linker

proteinek

létesítenek kapcsolatot. A desmosomákat kiterjedésük alapján osztályozzuk: 1. Övszer

desmosoma vagy zonula adherens (záróléc): a hámsejtek apikális

régiójában található, a terminal web szintjében. A terminal web filamentumai ehhez kapcsolódnak, körkörösen, a sejt egész kerületén. A záróléc speciális festésekkel (pl.: vashematoxilinnal) fénymikroszkópos metszeten is látszik

ez a Heidenhain-féle

záróléc: leírója a század elején egy német hisztológus. 2. Spot

desmosoma: a membránokat körülírt régiókban, foltszer en köti össze.

Ilyen desmosomák vannak a többréteg laphámok stratum spinosumában. 3. Hemidesmosoma: fél desmosoma, amely a hámsejtet a basalis laminához er síti.

9 Gap junction (GJ) Ez a junkció a két sejtet összeköt makromolekuláris csatornák rendszere, amelyen át ionok és kisebb molekulák akadálytalanul juthatnak át egyik citoplazmából a másikba. A két sejtmembrán párhuzamos, és köztük mindössze 2-3

nm

az

extracelluláris tér szélessége. A két membránt nagy transmembrán fehérjekomplexek csoportjai kötik össze úgy, hogy a komplex belsejében csatorna képz dik az anyagtranszport fenntartására. A komplexek alegységei egy connexin nev fehérjéb l épülnek fel. A simaizomsejtek, az osteocyták, a gliasejtek és bizonyos fejl d sejtalakok (pl.: myoblastok) között számos GJ

található. A

GJ

a központi

idegrendszer neuronjai között is el fordulhat: ezek az ún. elektromos szinapszisok (ephapsisok). Tight junction (TJ, zonula occludens) Ez a junkció teljesen elzárja az extracelluláris teret (az angol terminológia emiatt sealing junction -ként említi). A két sejtmembrán összeolvad ami azt jelenti, hogy a két szomszédos unit membrane küls

lipidrétegei a TJ területén elt nnek: nagy

nagyítású elektronmikroszkópos felvételeken csak két ozmiofil réteg figyelhet meg. Ezeken a helyeken olyan transzmembrán proteinek vannak, amelyek áthidalják mindkét membránt, és az asztalosok által használt csapolás elve alapján egymáshoz rögzítik a membrán lipidrétegeit. A

TJ

zonuláris formájában a sejtek apikális

felszíneihez közeli laterális sejtmembránokat egész kerületükön folyamatosan összekapcsolja

ezzel teljesen lezárja az extracelluláris teret. Vannak olyan TJ

k is,

amelyek (a spot-desmosomához hasonlóan) csupán membrán szakaszokat kapcsolnak össze. A zonula occludens a bélhám sejtjei között fordul el és megakadályozza, hogy a bél lumenéb l bármilyen anyag a sejtek közötti résekben jusson a hám alatti köt szövetbe. Az agyi kapillárisok endothel sejtjei között zonula occludens található, amelynek szintén az a feladata, hogy az extracelluláris anyagtranszportot gátolja. Ezért az agyi kapillárisokban lév A szívizomsejteket összeköt

TJ a vér-agy-gát egyik morfológiai jellemz je. komplex kapcsoló struktúrák, az Eberth-féle

vonalak sokféle membránkapcsolatot tartalmaznak. Az interdigitáló sejthatárok mentén gap junction (GJ), spot-desmosoma és zonula adherens egyaránt található. A zonula adherenshez actin filamentumok haladnak. A GJ funkciója az ingerületvezetés segítése az ionmozgások lehet vé tétele révén. A szív ún. ingerképz -ingervezet izomsejtjei között számos GJ található.

10

3. Az endoplazmás retikulum és a Golgi apparátus 3.1. Az endoplazmás retikulum (ER) lapos ciszterna-szer

és tubuláris alakú

membránképz dményekb l áll. A membránrendszer összefügg a sejtmagot borító dupla membránnal, az ún. perinukleáris ciszternával. Az ER két formában létezik: mint durva felszín ER (rER) és mint sima felszín ER (sER). Az rER felszínét riboszómák borítják és itt folyik a fehérjeszintézis. A szintetizált fehérjék az rER lumenébe kerülnek és onnan a Golgi apparátusba transzportálódnak. A riboszómák kett , egy kisebb és egy nagyobb alegységb l állnak, méretük kb. 20-25 nm. A riboszómák

szabadon

is

el fordulnak

a

citoplazmában,

de

ahhoz

hogy

fehérjeszintézist végezzenek legalább 10-20 riboszómának kell összekapcsolódnia: ezeket poliriboszómáknak (poliszómáknak) nevezzük. Az sER olyan sejtekben fordul el , amelyek nagy mennyiségben szintetizálnak triglicerideket, koleszterolt és szteroid hormonokat

az sER tartalmazza az összes enzimet ami a szintézishez kell

(májsejtek, a mellékvese kéreg sejtjei). Az sER speciális formája a szarkoplazmás retikulum, a harántcsíkolt izomban található: funkciója az intracelluláris kalcium szint szabályozása. A riboszómák miatt, a nagy mennyiség rER jelenléte citoplazmatikus bazofíliát okoz az illet

sejtekben. A nagy neuronok citoplazmájában az rER ciszternái

párhuzamos kötegekbe rendez dnek, amely bazofil citoplazmatikus szemcsék formájában már fénymikroszkóppal is látható: ezek a Nissl-féle szemcsék. Homogenizált sejtek ER-a feltöredezik és differenciál-centrifugálás után az ún. mikroszóma frakciót alkotja. További centrifugálással a riboszómákat is izolálni tudjuk. Az izolált riboszómák mRNS jelenlétében képesek fehérjéket szintetizálni. Az rER fehérjében gazdag szekrétumot szintetizáló mirigyekben (szerózus nyálmirigyek, pancreas,

gyomor

f sejtjei),

plazmasejtekben

és

nagy

neuronokban

nagy

mennyiségben van jelen és a citoplazmának bazofíliát kölcsönöz. 3.2. A Golgi komplex vagy apparátus (GA) az intracelluláris membránrendszerek másik formája. A sejtmag közelében helyezkedik el, és fénymikroszkóppal látható ha ezüsttel vagy ozmiummal impregnáljuk, illetve ha a benne lév

enzimeket

hisztokémiai úton kimutatjuk. A GE párhuzamosan elhelyezked , lapos membrán ciszternák és membrán tubulusok rendszere, amelyek végeiken gyakran kiszélesednek és vezikulák válnak le róluk. A GA legnagyobb mennyiségben a szekretáló sejtekben található. Ezekben a sejtekben a GA a sejtmag és az apikális sejtfelszín között

11 helyezkedik el. A ciszterna rendszer strukturálisan és funkcionálisan is polarizált, ami azt jelenti, hogy alakilag és enzimtartalmát illet en három zóna különíthet el: 1. Az ún, cis zóna, ami anasztomizáló tubulusokból áll. 2. Az ún. stack (köteg) zóna, amely lapos ciszternákból, zsákocskákból áll. 3. Az ún. trans zóna, amely megint tubuláris és összeköttetésben van a stack zónával. A trans zóna membránjaiban savi pH uralkodik. A trans zóna közelében mindig található rER és sER ciszterna és primér lizoszómák. Ezért ezt a GA régiót GERL (Golgi

Endoplasmic Reticulum

Lysosomes) névvel is illetik. A GERL régió

citokémiai markerei a savi foszfatáz és a tiamin pirofoszfatáz enzimek. Feltételezhet en ez az a régió, amely a lizoszómák, a peroxiszómák, a melanin granulumok és az egyéb szekréciós vezikulák el készítésével és tartalmuk csomagolásával

kapcsolatos. Az egyes zónák között transzport vezikulák

közlekednek, illetve a stack zóna zsákocskáit tubulusok kapcsolják össze, s az anyagok ezeken keresztül haladnak ciszternáról ciszternára. A transzport illetve az egyes molekulák átalakulása és szekrécióra való el készítése a cis zóna fel l a trans zóna felé halad. A GA-ban számos olyan enzim van, amelyek a fehérjékre cukor oldalláncokat és szulfátcsoportokat helyeznek, vagy más módon módosítják ket: szialiltranszferáz, fukoziltranszferáz, galaktoziltranszferáz, savi foszfatáz, tiaminpirofoszfatáz és 5 -nukleotidáz. A GA funkciója azonban nem merül ki a glikozilálásban és csomagolásban: a GA az intracelluláris membrán-forgalom központi irányítója. A különféle eredet intracelluláris vezikulákat (transzport vezikula, endocitotikus vezikula, szétkapcsoló vezikula, primér lizoszóma, peroxiszóma, melanin szemcse, multivezikuláris test, szekréciós vezikula) megjelöli a GA, és ezek a jelek (feltehet en a vezikulák membránjaiba épített molekulák) meghatározzák a vezikulába csomagolt anyagok további sorsát. Feltehet en hasonló mechanizmussal (vagyis membrán vezikulák irányított transzportjával) történik a membrán reciklizáció és a receptorok membránba való visszaépülése a receptor-mediálta endocitózis folyamán.

12

4. Lizoszómák, peroxiszómák, multivezikuláris testek. Citoplazma zárványok. 4.1. A lizoszómákat De Duve fedezte fel 1955-ben, amikoris a mitokondriumoktól különböz

sejtfrakciót talált, amely különösen sok savi pH-n m köd

enzimet

tartalmazott. A felfedezés azért váratott magára ilyen sokáig, mert a lizoszómák sokféle alakban és nagyságban vannak jelen a citoplazmában és átlagos fénymikroszkópos festésekkel nem detektálhatók. A primér lizoszómák a GA-ból lef z d

újszülött organellumok, kerek 0.5 µm átmér j , er sen elektrondenz,

membránnal borított részecskék. A szekundér lizoszómák nagysága akár 2 µm is lehet, alakjuk pedig szabálytalan. A szekundér lizoszóma autofág és heterofág vakuola lehet, attól függ en, hogy a sejt saját anyagát vagy idegen anyagot emészt. Az autofágia speciális formája a krinofágia, amely mirigysejtekben fordul el . A szekundér lizoszóma bár elektrondenz, sokszor világos bels

struktúrákat,

membránmaradványokat tartalmaz. Az emésztés végs stádiumában reziduális testek keletkeznek, amelyek a végtermékeket, a lebonthatatlan maradványokat tartalmazzák. A lipofuscin szemcsék (fusca = sötétbarna) öreged sejtekben található zárványok, feltehet en összeolvadt reziduális testek, amelyek raktározzák a tovább már nem bontható anyagokat. Lipid tartalmukat bizonyítja ozmiofíliájuk, fluoreszcens mikroszkópban

pedig

sárga-aranybarna

fluoreszcenciát

mutatnak.

Fénymikroszkóppal, hematoxilin-eozin festés mellett sárgásbarna szemcsék. Öreged nagy idegsejtekben (pl.: érz ganglionokban) gyakoriak. A lizoszómák kb. 50 különféle enzimet tartalmaznak, amelyek mind savi pH mellett m ködnek (pl.: savi foszfatáz, szulfatidáz, galaktozidáz, fukozidáz, nukleázok, proteázok, foszfolipázok). Ha a lizoszóma a sejten belül bocsájtja ki enzimeit, a sejt elpusztul

ez az ún. programozott sejthalál vagy apoptózis alapja. Az embrionális

fejl dés során ez igen gyakori és normálisnak tekinthet . Egyes sejtféleségek (legf képpen az osteoclastok) lizoszómáik tartalmát az extracelluláris térbe ürítik. Ez a folyamat segíti az extracelluláris anyagok lebontását (a csont alapállománya elt nik ezért hívják

ket

csontfaló

sejteknek). Makrofágok arra is képesek, hogy

lizoszómáikat átadják olyan sejteknek (pl.: daganatsejteknek), amelyeket el akarnak pusztítani. A peroxiszómák alakilag a primér lizoszómákhoz hasonlóak, ám kevésbé elektrondenzek és a kataláz nev enzimet tartalmazzák. F leg a májsejtekben és a

13 vese hámsejtjeiben fordulnak el . A multivezikuláris testek membránnal borított 0.5 1 µm átmér j hólyagocskák, amelyekben kis vezikulák (0.05

0.08 µm) találhatók.

Savi foszfatáz aktivitásuk miatt úgy gondoljuk, hogy a lizoszómák egyik fajtájáról van szó. Funkciójuk nem világos. A lizoszómák enzimei fontos szabályozó szerepet játszanak a citoplazma anyagháztartásának fenntartásában. Egy-egy enzim elvesztése (genetikai okok miatt) súlyos szindrómákhoz vezet, amelyek oka az enzimhiány miatt elbontatlan anyagok citoplazmatikus felhalmozódása. Ezek az anyagok el bb a sejt funkcióit gátolják, végül pedig a sejt pusztulásához vezetnek. Az alábbi táblázat ezekkel, az ún. veleszületett lizoszómális betegségekkel foglalkozik.

BETEGSÉG

FELHALMOZÓDÓ VEGYÜLET Gaucher-kór: a máj és lép glükocerebrozida beteg szfingomielin Niemann-Pick betegség: demencia és hepatosplenomegalia szulfatált cerebrozidok Metakromáziás leukodisztrófia: súlyos idegrendszeri tünetek gangliozida GM2 Tay-Sachs kór: idegrendszeri betegség, mentális retardációval

ENZIMDEFEKTUS béta-glükozidáz szfingomielináz

arilszulfatáz

hexózaminidáz A

4.2. A citoplazma zárványai sokfélék lehetnek: zárványok mindazok a membránnal borított vagy membrán nélküli szemcsék, amelyek nem tartoznak a fent említett vezikula típusok közé. Membránnal borított inklúziók a következ k: 1. Lipidcseppek: különböz méret , membránnal borított ozmiofil, kerek képletek, amelyek f ként a szteroidokat szintetizáló sejtekben, valamint a barna zsírszövetben fordulnak el . A sárga zsírszövet egyetlen óriási lipid vakuolumot tartalmaz. 2. Melanin: a melanocitákban található melanoszómákban lév

pigment. A

melanoszómák er sen ozmiofil, membránnal borított képletek, amelyeket a melanocyta GA csomagol, a melanint pedig a sejt szintézissel állítja el . 3. Lipofuszcin: a lizoszómáknál említettük, öregedési pigment.

14 4. Hemosziderin: vastartalmú pigment, amely reziduális testekben található, a mononukleáris fagociták citoplazmájában. Vörösvértesteket fagocitáló sejtekben fordul el . 5. Glikogén: apró (0.02 µm) elektrondenz partikulumok formájában, a citoplazmában szabadon fordul el . Májsejtekben és vázizom rostokban igen sok glikogén szemcse található. 6. A vér granulocitáinak specifikus granulumai fénymikroszkóppal is láthatók. Membrán borítja ket és a granulocita típusokra jellegzetesek. A neutrofil specifikus granulumok elliptikus képz dmények, mérsékelten elektrondenzek és bázikus proteineket (fagocitinek) tartalmaznak. Az eozinofil specifikus granulumokban elektrondenz kristályszer anyag van, amely peroxidáz enzimet és egy Major Basic Protein (MBP) nev fehérjét tartalmaz. A bazofil specifikus granulumokban, amelyek nagyok (1.2 µm) peroxidáz, hisztamin és heparin található.

5. A mitokondriumok és a sejtmag 5.1 A mitokondriumokat Altmann fedezte fel a XIX. század végén és találóan bioblastoknak

nevezte

ket.

Michaelis

1900-ban

festette

meg

el ször

a

mitokondriumokat Janus-zölddel, él sejtekben. A mitokondriumok vitális Janus-zöld fest déséért a citokróm oxidáz rendszer felel s, mert a festék a citoplazmában színtelen leukobázissá redukálódik, azonban a mitokondrium felveszi és újra oxidálja, miáltal a festék visszanyeri zöld színét. A mitokondriumokat differenciál centrifugálással izolálni lehet, ezért könnyen tanulmányozhatók. Fénymikroszkópos festésükre az Altmann által használt savanyú fukszin módszer és a Regaud-féle vashematoxilin módszer alkalmas. A mitokondrium 0.1

0.5 µm vastag és akár 7 µm

hosszú is lehet. Egyenletesen oszlanak el a citoplazmában, vannak azonban kivételek: a vese hámsejtjeben a mitokondriumok ún. bazális csíkolatot alkotnak, vagyis a hámsejt bazális pólusára rendez dnek. Egy átlagos sejt néhány ezer mitokondriummal rendelkezik. Elektronmikroszkóppal vizsgálva két membránrendszert figyelhetünk meg: a küls

membrán egyenletesen borítja, a bels

membrán pedig felület

nagyobbító betüremkedéseket, ún. cristákat képez. A két membrán között keskeny (6-8 nm) tér található. A bels membrán terét homogén, enyhén elektrondenz matrix tölti ki. A matrixban er sen elektrondenz szemcsék lehetnek, amelyek kalciumot,

15 magnéziumot és foszfort tartalmaznak. A mitokondrium képes a citoplazma kalcium szintjének szabályozására

ha sok kalcium kerül a citoplazmába, a mitokondrium

kalcium pufferként m ködik, és védi a sejtet az ionizált kalcium toxikus hatásaitól. A cristákon ún. submitochondriális részecskék találhatók: ezek 8-10 nm nagyságú, kalapos gombára emlékeztet alakú részecskék, amelyek az oxidatív foszforiláció enzimrendszereit tartalmazzák. Egyes sejtekben nem cristák hanem membrán tubulusok vannak a mitokondrium bels

terében

a mellékvese kéregállomány

sejtjeiben ilyen, ún. csöves mitokondriumok vannak. A mitokondriumok osztódnak: DNS és RNS molekulákat tartalmaznak

ennek ellenére önállóan nem életképesek;

szerkezeti integritásuk a sejtmagtól és a rER szintetizáló aktivitásától függ. A mitokondriumok igen érzékenyek és szerkezetük, morfológiájuk nagyon h en tükrözi az egész sejt fiziológiai állapotát. A sejt károsodásakor a mitokondriumok duzzadnak majd degenerálódnak. Ennek alapja a mitokondriumok túlzott mérték kalcium (Ca) felvétele. A mitokondriális Ca felvétel vagy leadás egyetlen szabályozója a citoplazma ionizált Ca koncentrációja. A sejt toxikus károsodásakor (bizonyos károsodási típusokban

pl.: a glutamát neurotoxikus hatásában) a citoplazmatikus Ca

koncentrációja megnövekszik, ami kiváltja a mitokondriális Ca akkumulációt

a Ca

protonnal cserél dik és egyid ben víz is beáramlik, vagyis a mitokondrium duzzad. A folyamat energiaigényes, ami igénybe veszi a mitokondrium energiatermel kapacitását, és a folyamat végén (ha a sejt Ca terhelése túlzott) a mitokondrium is és maga a sejt is energia nélkül marad és elpusztul. 5.2 A sejtmag (nucleus) a legnagyobb sejtorganellum. Alakja változó és sok esetben igen jellemz az illet sejtre. Legtöbb esetben kerek, vannak azonban vese alakú, ovális, pálca-szer , végein kihegyezett, lebenyes és bef z déseket mutató sejtmagok is. A vér granulocitáiban lebenyezett sejtmagot, a monocitákban vese alakó sejtmagot találunk. A simaizomsejt magja pálcika alakú, a fibrocytáé megnyúlt, hegyes. Egyes idegsejtek maghártyáján mély behúzódás (invagináció) figyelhet meg. A legtöbb sejtben egy sejtmag található

vannak azonban fontos kivételek is. A

harántcsíkolt izom rostjai sok sejtmagot tartalamzó képletek, amelyek syncytiumot (= a sejtek összeolvadása) alkotnak. A syncytium sorozatos sejtfúziók eredménye. Hasonló módon keletkeznek bizonyos sokmagvú óriássejtek és más a patológiában ismertetend tartalmaznak sejtmagot

pl.: az osteoclastok

óriássejtek is. Az érett vörösvértestek nem

sejtmagjuk az érési folyamat során szétesik. A sejtmagot

16 kett s membrán borítja, amelyet sejtmag membránnak, maghártyának vagy perinukleáris ciszternának nevezünk. A perinukleáris ciszterna összefüggésben áll az

endoplazmás

nucleoplasmában

retikulummal. kromatin

és

A a

nucleus

plazmája

sejtmagvacska

a

nucleoplasma.

(nucleolus)

található.

A A

perinuclearis cisterna nem folytonos, hanem ún. magpórusok szakítják meg. A magpórusok szabályos, hengeres, alegységekb l álló képz dmények. A magpórusok fehérjekomplexei sajátos szerkezetük révén szabályozzák a citoplazma és a sejtmag közötti anyagforgalmat. A szabályozás feltehet en energiaigényes transzport révén történik, amelyben bizonyos karrier-tulajdonságú fehérjék is részt vesznek. A maghártya bels

felszínén speciális polipeptidek vannak, amelyek 60-70,000

mólsúlyúak és a sejtosztódás telofázisa folyamán segítik a maghártya újraképz dését. A sejtmag genetikai anyaga kromoszómákban található. Nyugvó sejtekben a kromoszómák kromatinként látszódnak és felel sek a sejtmag bazofíliájáért. Elektronmikroszkóppal a kromatin kétféle: eukromatin és heterokromatin. Az eukromatin világos és laza szerkezet és az éppen aktív kromoszóma-részeket jelzi. A heterokromatin elektrondenz (sötét) és funkcionálisan az inaktív kromatin. A kromatin fibrilláris szerkezet , 10 nm átmér j

filamentumokból áll, ezek pedig

alegységekb l, amelyeket nukleoszómáknak nevezünk. A nukleoszóma fehérjét és DNS-t tartalmaz. Az apoptózis (fiziológiás sejthalál) folyamán el ször a sejtmag pusztul el

nukleinsav lebomlása miatt a mag degenerálódik.

A magvacska fénymikroszkóppal is látható er sen bazofil kerek képlet. Egyetlen sejtben 1-4

nukleólusz lehet. A magvacska ribonukleoproteint tartalmaz és

elektronmikroszkóppal fonalas szerkezet nek látszik. A magvacska részt vesz a riboszóma alegységek szintézisében. Osztódáskor szétesik, majd pedig újra szervez dik a kromoszómák ún. nukleólusz organizációs központja körül. Az ivari kromoszómák kromatinja alkotja az ún. Barr-testecskét. Barr és Bertram 1949-ben n stény macska idegsejtjeiben látta meg el ször ezt az ún. sex

chromatin

testecskét, amely az egyik X kromoszóma piknotikus, fest d formája. Az emberi szájnyálkahártya hámsejtjeiben a maghártyához rögzül, a neutrofil granulocitában dobver

alakú

magfüggeléket

alkot.

Jelenlétét

felhasználhatjuk

a

humán

citogenetikában a nem meghatározására. Több sex-chromatin jelenlétéb l pedig számfeletti X kromoszómákra lehet következtetni.

17

6. A citoszkeleton. Centriolumok, csillók és ostorok. Sejtmozgás és transzport. 6.1. A citoszkeleton a sejt citoplazmájában található filamentózus fehérjék összessége. A citoszkeleton négy sejtfunkcióban alapvet fontosságú: 1. meghatározza a sejt alakját és nagyságát; 2. a sejtmozgás mediátora; 3. a sejtosztódáshoz nélkülözhetetlen; 4. az intracelluláris transzportban részt vesz. A citoszkeleton filamentózus fehérjéi három kategóriába sorolhatók: A. mikrofilamentumok: az actin és myosin kontrakción alapuló citoplazmatikus mozgásokat mediálnak. A sejtmembrán citoplazmatikus felszínén rendezett, actintartalmú mikrofilament réteg van (ez a citoplazma ún. cortexe). Az actin jelenléte regulálja a transzmembrán- és perifériás proteinek membránon belüli mozgását és a sejtfelszín alakváltozásait (lásd: fagocitózis). Az actin filamentumok m ködését ún. actin-köt

fehérjék sora szabályozza

az actin-köt

fehérjéket pedig ciklikus

nukleotidák, foszforiláció, kalcium és más ionok szabályozzák. B. Intermedier filamentumok: vázfehérjék, els sorban a sejt alakját határozzák meg. Az intermedier filamentumok kémiai összetételükben kissé különböznek és egyegy filamentum típus egy-egy sejtfajtára jellemz . Az alábbi táblázat néhány intermedier filamentum el fordulási körét mutatja be. Az intermedier filamentumokat a sejt foszforiláció és proteázok révén szabályozza.

FILAMENTUM

SEJTTÍPUS

PÉLDÁK

Cytokeratinok

Hámsejtek

Vimentin

Mesenchymalis eredet sejtek Izomsejtek

Elszarusodó és el nem szarusodó laphámok Fibroblast, chondroblast, endothelium Harántcsíkolt izom, simaizom Astrocyta

Desmin

Gliális fibrilláris acidikus Gliasejtek protein (GFAP) Neuronok Neurofilamentumok

A legtöbb idegsejtben el fordul

18 C. Mikrotubulusok: a mikrotubulusok rendezett, tubuláris formációt mutató fehérje polimerek. Alapegységük a tubulin nev globuláris fehérje, amely ún. alfa és béta tubulin formájában szintetizálódik. Az alfa és béta globulusok dimert alkotnak és a dimerek hossztengelyükkel párhuzamosan, spirálisan egymás mellé rendez dve polimerizálódnak, tubuláris képletet alkotva. A tubulus falát a körkörösen elhelyezked

13 dimer alkotja: a tubulus átmér je 25 nm.

Mivel a dimer két

különböz molekulából áll (alfa és béta) és azok egyformán, hossztengelyükkel a tubulus tengelyében rendez dnek, a tubulus polarizált képlet lesz

egyik végén alfa

egységek, másik végén béta egységek találhatók. A dimerek colchicint képesek kötni, amely megakadályozza a dimerek polimerizációját. A colchicin ezért megállítja a mitózist, mégpedig abban a fázisban, amelyben a mikrotubulusok (húzófonalak) kialakulnak és a kromoszómákhoz köt dnek (metafázis). Hasonló hatású a vincristin és a vinblastin is. Az utóbbi alkaloidokat használják a rosszindulatú daganatok gyógyításában, mert az osztódást gátló hatásuk miatt akadályozzák a daganatsejtek szaporodását. A mikrotubulusok másik alkotórésze az ún. mikrotubulus asszociált protein (MAP). A MAP számos formában épül a mikrotubulusba: vannak olyan formák amelyek foszforilálódnak,

vannak

enzimtulajdonságú

MAP-ok,

és

olyanok

amelyek

keresztkötéseket létesítenek a mikrotubulus és más sejtfehérje vagy organellum között. Mindegyik MAP valamilyen regulátoros szerepet játszik: a mikrotubulus interakciókat és a polimerizációt

depolimerizációt szabályozzák.

A mikrotubulus egyik vége polimerizálódik (ez a P szegmentum) és így hosszában növekszik; a másik vége depolimerizálódik (ez a D szegmentum) vagyis dimerekre esik szét. A polimerizációhoz

GTP (guanozin trifoszfát)

szükséges, a depolimerizáció kalcium ionok miatt következik be. A depolimerizációt így egy kalcium köt

fehérje (kalmodulin) képes szabályozni. A mikrotubulus

proteolitikus bontását egy calpain nev

kalcium-függ

proteáz is végezheti: ez

esetben a kalcium szerepe a tubulust bontó enzim aktiválása. A calpain bizonyos MAP molekulákat (MAP I és MAP II) is bontani képes. A tubulus folyamatos növekedése azt eredményezi, hogy a tubulushoz kötött anyagok, részecskék a tubulus mentén transzportálódni képesek: a transzport iránya a D-szegmentum. A mikrotubulusok rendezett csoportjai, más vázfehérjék valamint MAP-ok

fontos

sejtorganellumokat képeznek: ezek a citocentrum, a csillók és a bazális testek, az

19 ostorok és az oszlási orsó. A citocentrum és a bazális test a mikrotubulusok képz dését is szabályozzák

ezért mikrotubulus organizációs centrum (MTOC) a

nevük. 6.2. A citocentrum, kinetocentrum (centriolum) és a bazális test A centriolum a sejt mozgásközpontja: nevét azért kapta, mert a mozgásban részt vev mikrotubulus rendszerek bel le n nek ki. Hasonló szerkezet és funkciójú képletek a bazális testek, amelyek a csillók és a flagellumok citoplazmatikus végén találhatók. A centriolum és a bazális test mikrotubulus tripletekb l áll: három közös falú mikrotubulus alkot egy pálca szer tripletet. Kilenc darab, enyhén megcsavarodott triplet alkotja a centriolumot, úgy, hogy a tripleteket kereszthidak kapcsolják össze ily módon egységes cs szer képletet kapunk, amelynek átmér je kb. 0.15 m. A bazális testben a kilenc triplet által bezárt kör közepén elektrondenz és hozzá haladó kilenc elektrondenz

küll

gerinc látszik,

ezek er síthetik illetve rögzíthetik a

bazális testet. A centriolum helyzete a nyugvó sejtben állandó

többnyire a sejt

valamelyik tengelyében helyezkedik el, a Golgi apparátus közelében. 6.3. Csillók és ostorok (cilia et flagella) A csillók és az ostorok kilenc pár mikrotubulusból állnak, amelyek a csilló/ostor kerületén helyezkednek el. A tubuluspárok egyik fala közös és az óra járásának irányába mutató karokkal rendelkeznek: ezek a karok MAP-jelleg fehérjék, dynein a nevük és ATPase aktivitást mutatnak. Ezen kívül a tubuluspárokat egy nexin nev struktúrfehérje köti össze. A csilló/ostor középpontjában újabb tubuluspár található, ezek azonban különállóak és kis elektrondenz perifériás pároktól elektrondenz

híd

kapcsolja

ket össze. A

küll k (kilenc darab) mutatnak a középs pár felé.

Ez a kilenc plusz kettes konfiguráció az ún. axonema. A csillót a plazmamembrán borítja

a tubuluspárokat keskeny citoplazma szegélyezi. A csillók mozgása a dynein

révén valósul meg: a szomszédos tubuluspárokat a dynein ATP jelenlétében összekapcsolja, majd elengedi

és ezek a kötések úgy haladnak végig a tubulus

mentén, hogy az egyik tubuluspár elcsúszik a másikon ( sliding mechanizmus). A tubuluspár mozgásának iránya a csilló vége

a sliding rendezettsége miatt a mozgás a

csilló egyik felében következik be és a küll k húzó hatása miatt a csilló ebbe az irányba mozdul el

a csilló csapásának iránya ez. A folyamat fenti magyarázata

izolált axonema komplexek in vitro tanulmányozásán alapul

fel kell tételeznünk,

hogy az él sejtben bonyolultabb interakciók hatnak. A citoplazmatikus kalcium-szint

20 változásai és a tubulusok polimerizációja/depolimerizációja hozzájárulnak a mozgások rendezettségéhez. Egy örökl d

betegségben, amelyet Kartagener

szindrómának nevezünk, a csillók és ostorok axonemájából hiányzik a dynein. Ezért a csillók és ostorok mozgásképtelenek: a betegek légutaiban felhalmozódik a nyák, mert a csillós hám csillói nem mozognak; a férfi betegek spermiumai mozgásképtelenek

ezért megtermékenyítési képtelenség (impotentia generandi) is

kíséri a betegséget. A csillók és flagellumok regenerációra képesek

a leszakadt

axonema a bazális testb l regenerálódik. Az axonemával rendelkez

csillót a

szövettanban kinociliumnak nevezzük. Egyes hámokban stereociliumokkal (vagyis nem mozgó

csillókkal)

is

találkozunk:

ezek

tulajdonképpen

nagyra

n tt

mikrovillusok, amelyekben actin váz található. 6.4. Az oszlási orsó (mitotic spindle) Az osztódás folyamán a kromoszómák elmozdulnak és az utódsejtekbe kerülnek. A kromoszómák rendezett mozgását a hozzájuk rögzül mikrotubulusok hajtják végre: ezek hozzák létre az oszlási vagy mitotikus orsót. A mitotikus orsó a centriolumok körül alakul ki: a centriolumokat a mitózis idején egy sajátos zóna veszi körül, amit centrospherának nevezünk

a tubulusok nem közvetlenül a centriolumokhoz,

hanem a centrospherához kapcsolódnak. A centrosphera elektronmikroszkóppal is amorf, elektrondenzitást mutató képlet. A centriolum, a centrosphera és az orsó alkotják az ún. mitotikus apparátust. 6.5. A sejt mozgása A sejtek csillói és ostorai a mozgás szolgálatában állnak. Az emberi testben a csillók szerepe a hámfelületek tisztítása

a csillók egyirányú csapkodással továbbítják a hám

felszínén lév nyákréteget és minden idegen anyagot ami a nyákhoz tapad. Egyetlen emberi sejt mozog ostora segítségével: a spermium. A köt szöveti sejtek másfajta mozgásra képesek

ez a mozgás am boid mozgás és ún. pseudopodiumok (állábak)

segítségével történik. A mozgás egyik fontos eleme a sejtadhézió, vagyis a sejt letapadási képessége. Az adhézióban egy extracelluláris fehérje, a fibronectin játszik szerepet, amely a mozgó sejtet az extracelluláris tér kollagén rostjaihoz kapcsolja. A sejtadhézió fixálja a sejtet, amely ezután állábakat bocsájt ki, az állábak letapadnak, eközben az el bbi adhéziók megsz nnek

sejt mászik a kollagén rostokon. Az

állábak képz dését a citoplazma cortex gel-sol átalakulásai kísérik

az actin,

kalcium és a citoplazma pH fontos szerepet játszanak a mozgás szabályozásában.

21 6.6. CELLULÁRIS TRANSZPORT Az anyagtranszport celluláris jelenségei: 1. a sejt és az extracelluláris környezet közötti kommunikáció bizonyos formái; 2. a membránrendszerek közötti transzport; 3. a sejt távoli részei közötti anyagforgalom lebonyolítása; 4. a citoplazma és a sejtmag közötti kommunikáció egyes folyamatai. Egyes sejt- illetve szövettípusokban ez vagy az a jelenség dominálhat

a sejtek

mérete, alakja és funkciója szerint. Azok a folyamatok, amelyek révén a sejtmembránokon keresztül különböz anyagok transzportálódnak, a membrántranszport (Lásd: sejtélettan) körébe tartoznak, ezért csupán felsoroljuk ket. I. Passzív transzport I.1. Egyszer

diffúzió: a mesterséges membránok vizet, oxigént, széndioxidot,

nitrogént és kisméret zsírban is oldódó molekulákat (pl.: ethanol) átengednek, ezért ezek az anyagok az él szervezetekben is gyorsan transzportálódnak. I.2. Facilitált diffúzió: Az ionok, a glükóz, az aminosavak azonban speciális membrán molekulák jelenlétében transzportálódnak. Ezek a carrier vagy transzporter molekulák (permeázok) a membrán integrális proteinjei. II. Aktív transzport ATP hidrolízissel m köd

ionpumpák (Na, K, Ca, H). Az ionpumpák szintén

membránprotein komplexek, amelyekhez ATPase kapcsolódik. III. Ko-transzport Facilitált diffúzió kapcsolódása aktív transzporttal (symport és antiport rendszerek).

6.6.1. A SEJT ÉS AZ EXTRACELLULÁRIS KÖRNYEZET KÖZÖTTI TRANSZPORT A makromolekulák és nagyobb részecskék transzportját a membránnal borított sejtorganellumok bizonyos fajtái endocytosis és exocytosis révén végzik. A jelenségeket több csoportra osztjuk. I. Phagocytosis Nagy extracelluláris részecskék bekebelezése, többnyire makrofágok végzik. A folyamat során a sejtmembrán és egy keskeny citoplazma lebeny körülöleli a részecskét, miközben a citoplazmatikus aktin filamentumok a citoplazma lebenyt

22 mozgatják és irányítják. A folyamat kezdetén a sejt felszíne és a részecske felszíne között specifikus interakciók zajlanak, amelyek során a sejt felismeri a részecskét. A makrofágok phagocytosisa esetében a komplement és az immunglobulinok Fc fragmentuma fontos szerepet játszanak az interakciók beindításában mert a makrofág komplement receptorokkal és Fc receptorokkal rendelkezik. A folyamatot a receptorligand interakciók indítják be. A részecske bekebelezése után a membránnal borított phagosoma jön létre, amelyet lysosomákkal való fúzió követ, végül pedig a phagosoma tartalmát az enzimek lebontják. A phagocytosis során több membrán fúzió is történik. II. Endocytosis II.1. Pinocytosis: nem specifikus folyadék felvétel a környezetb l membránnal borított vezikulumok segítségével. Az endocytotikus vezikula max. 0.1 m átmér j . A vezikula többnyire lysosomával egyesül és a bejutott anyagot az enzimek lebontják. Az endothelsejtekben a pinocytosis sajátos formája játszódik le: a vesicula áthalad a citoplazmán és a sejt másik felszínén újra a külvilágba kerül. Ez tulajdonképpen transcytosisnak nevezhet : a bekebelezett anyag nem kerül kapcsolatba a lysosomákkal. II. 2. Receptor-mediálta endocytosis: szelektív anyagfelvétel, amely receptor-ligand interakción alapszik. A folyamatban a sejtmembrán megfelel régióján a receptor ligand interakció miatt endocytosis indul el, amelynek eredménye az ún. tüskés vezikula. A tüskés vezikula tulajdonképpen olyan vezikula, amelyet speciális fehérjeháló borít. A fehérjeháló a képz d vezikula citoplazmatikus felszínéhez tapad és segíti a vezikula internalizációját. A fehérjehálót egy clathrin nev

fehérje

polimerjei képeznek. A clathrin molekula egy háromláncú vázfehérje, amely polimerizáció révén hálószer rácsot képez a vezikula körül: ez a tüskés vezikula (átmér je 0.05 - 0.1

m). A tüskés vezikula a citoplazmában hamarosan elveszíti

clathrin burkát és mint sima vezikula (endosoma vagy receptosoma) folytatja útját. Az endosoma következ lépésben egy szétkapcsoló vezikulával (uncoupling vesicle) egyesül, és ebben a folyamatban a vesicula belsejében a részecske és a receptor szétválnak. A receptorokat egy kis lekapcsolódó vesicula tartalmazza, visszaviszi és újra beépíti a sejtmembránba (receptor recycling). A részecskét tartalmazó vesicula lysosomával egyesül, és a másodalgos lysosomában az enzimek feldolgozzák az endocytosissal bevitt anyagot. A lekapcsoló vezikula azonban közvetlenül a Golgi

23 apparátushoz (GA) is kapcsolódhat

ilyenkor a tartalma egyenesen a GA cisternákba

kerül. Receptor-mediálta endocytosis révén kerülnek a sejtbe a transferrinhez kötött vas (ferri-ion), az LDL-hez (Low Density Lipoprotein) kötött koleszterol, növekedési faktorok, insulin és immunglobulinok. III. Exocytosis Exocytosis révén kerül ki a sejtb l minden szekrétum, és a membrán alkotóelemei (pl.: a receptorok) az exocytosis segítségével épülnek a membránba. Az exocytosis során a foszfolipid membránok fúziója játszódik le, amit valószín leg megel znek a közeled

membránokban lév

protein interakciók (foszforiláció, konformáció

változások). Ez a folyamat a mirigysejtek esetében a merokrin szekréció. Az apokrin szekréció tulajdonképpen a phagocytosishoz hasonló folyamat, csak éppen fordított irányú: az eml

mirigysejtjeiben a kiürülö nagy lipidcseppet eleinte a

cytoplasma kitüremkedése veszi körül, majd a citoplazma visszahúzódik és a membránnal borított nagy szekretoros lipid vacuolum lef z dik a sejtr l.

6.6.2. A MEMBRÁNNAL BORÍTOTT SEJTORGANELLUMOK INTRACELLULÁRIS TRANSZPORTJA A sejtmembrán, az endoplazmás reticulum és a Golgi apparátus között számos molekula folyamatos transzportja figyelhet

meg. Ebben a folyamatban a Golgi

apparátus központi szerepet játszik, mint a transzport irányulásának meghatározója. A lapos Golgi cisternák nemcsak vesiculába csomagolják az újonnan szintetizált anyagokat, hanem a vesiculák további útirányát is meghatározzák. A cis GA zóna fogadja az endoplazmás reticulum fel l érkez

vesiculákat, anyagaikat és

membránjukat inkorporálja. Mindezt valószín leg specifikus membránreceptoraik révén tudják megtenni. A receptor mediálta endocytosis endosomáit a trans és a stack régiók is fogadhatják

az endosoma membrán köt dését a GA specifikus zónáihoz

valószín leg a membránok felületén lév

poliszacharida láncok töltéseloszlása

határozza meg. Jelenleg a következo f bb intracelluláris útirányokat ismerjük:

A. plasmalemma

endocytosis

Golgi apparátus (a secretio után visszanyert

üres vesicula útja, vagy a receptor-mediálta endocytosis egyik lehetséges útja).

24 B. endoplazmás reticulum

Golgi apparátus

secretoros vesicula

(az

exocytosis útja). Ezen az úton haladnak a primer lysosomák és a peroxisomák is azzal a különbséggel, hogy k a citoplazmában maradnak és nem lesz exocytosis.

C. endoplazmás reticulum

Golgi apparátus

secretoros vesicula

lysosoma

(crinophagia útja).

D. endocytosis

lysosoma

Golgi apparátus (receptor-mediálta endocytosis

útja).

6.6.3. A SEJT TÁVOLI RÉSZEI KÖZÖTTI ANYAGFORGALOM Az idegrendszer egyes neuronjai hosszú nyúlványokkal rendelkeznek

a nyúlvány

hossza akár 0.6-0.7 m is lehet. Ezek a sejtek alkalmasak arra, hogy az intracelluláris transzportnak ezt a speciális formáját elemezzük. A hosszú nyúlvány és az idegvégz dések intracelluláris transzport révén folyamatosan kapcsolatban vannak a sejt testével, a szómával. A transzport biztosítja a nyúlványok és a végz dések anyagellátását és szerkezeti funkcionális épségét és integritását. Az intraneuronális transzport formái 1. Dendrit transzport. 2. Axon transzport. Mindkét folyamat két irányú, egyik komponense a szómától az idegvégz dések felé halad (orthograd), a másik az idegvégz désektöl a szóma felé tart (retrograd). Az idegvégz désekben (akár dendritikus akár axonális végz désröl van szó) exocytosis és endocytosis folyik, vagyis bizonyos anyagok kiürülnek a sejt környezetébe, másokat onnan felvesz a sejt. Ezek a folyamatok végs soron a sejt kommunikációs csatornáihoz tartoznak

a neuron neurosecretio és neuroresorptio révén folyamatos

kapcsolatban van mikrokörnyezetével. Az axontranszport az áramlás sebessége alapján három komponensb l tev dik össze 1. Gyors transzport (200

400 mm nap).

2. Közepes transzport (2

50 mm nap).

3. Lassú transzport (0.2

1 mm nap).

25 A dendrit transzport sebessége szerint gyors és lassú komponensekböl áll. Mindkét transzport két irányban halad van orthograd és retrograd komponense. Molekuláris mechanizmusát tekintve az intraneuronális transzporttal kapcsolatban két elmélet alakult ki, amelyeket bár az axontranszport tanulmányozására alapoztak, azonban alkalmasak arra hogy a dendrit transzportot is megmagyarázzák. Mindkét elmélet egyetért abban, hogy mikrotubulusok nélkül nincsen axonális vagy dendritikus transzport. 1. Mikroáramlás elmélet (Gross, 1975) a mikrotubulusokhoz kapcsolódó ATPázok az ATP bontás energiája miatt jelent sen csökkentik az axoplazma viszkozitását a mikrotubulus körül. Ahogyan távolodunk a tubulustól úgy növekszik a viszkozitás (nagyjából exponenciálisan). Emiatt az axoplazmában a mikrotubulusok körül alacsony viszkozitású áramlási csatornák alakulnak ki, mert a viszkozitásbeli különbségek a citoplazmában áramlást indukálnak. Ezek az áramlási csatornák a gyors transzport helyei. 2. Transzport filamentum hipotézis (Ochs, 1982) a mikrotubulusokhoz kapcsolódó kinesin és dynein típusú molekulák ATPáz tulajdonságokkal rendelkeznek és képesek arra, hogy a tubulushoz kapcsolódó ún. transzport filamentumot mozgassák. A transzport filamentumhoz kötödik minden ami az áramlással halad (makromolekula, sejtorganellum). A transzport filamentum maga is mikrotubulus

vagyis az elmélet

szerint két mikrotubulus mozdul el egymáson az axon tengelyében. A mozgás sebessége a gyors transzporthoz hasonló. A lassú transzport sebessége tulajdonképpen azonos a mikrotubulusok növekedésének sebességével

vagyis valószín , hogy a lassú transzport a mikrotubulus ún.

treadmilling aktivitásának a következménye. Ez tulajdonképpen a mikrotubulus egyik végének folyamatos (GTP függ ) polimerizációs tevékenysége itt a tubulus a tubulin alegységek hozzáadódása miatt növekszik. A tubulus másik végén hasonló ütemben depolimerizálódik vagyis abszolút hossza nem változik, viszont anyaga és a hozzá csatolt molekulák folyamatosan haladnak a depolimerizációt folytató végdarab irányába. 6.6.4. A CITOPLAZMA ÉS A SEJTMAG KÖZÖTTI KOMMUNIKÁCIÓ A citoplazma és a sejtmag közötti transzport helye a maghártya póruskomplexe. A citoplazmából fehérjék (pl.: a génexpresszió regulátorai), hormonok és enzimek kerülhetnek a sejtmagba. Kifelé nukleinsavak, ribonukleoprotein komplexek

26 transzportálódnak. Mindkét transzport folyamatot karrier fehérjék szabályozzák ezek a fehérjék a póruskomplex részei. A transzport energiaigényes és feltehet en GTP-t használ.

7. A sejtciklus. Regeneráció. Mitózis és meiózis. Az emberi sejtek élettartama eltér . A sejt életútja a sejtciklus, amelynek során osztódások és nyugalmi szakaszok (interfázisok) figyelhet k meg. A sejt életútjának vége a sejt halála, amely lehet fiziológiás, vagyis genetikailag programozott (apoptózis) és lehet toxikus hatások következménye A sejthalál szabályozása alapvet degeneratív

betegségekben

fordul

ezt necrosisnak nevezzük.

fontosságú: a sejt id el

(pl.:

Apoptózisban el ször a sejtmag pusztul el

el tti halála az ún.

Alzheimer-kór,

Parkinson-kór).

ez a folyamat akár egyetlen sejtre

korlátozódhat, és nem kíséri gyulladásos reakció. Nekrózisban el ször a citoplazma károsodik

egyszerre több sejtet érint és gyulladásos sejtek megjelenése kíséri. Az

apoptózis többnyire normális jelenség, és a szövetek homeosztázisának velejárója. Az apoptózis gátlásával (kísérleti körülmények között), bizonyos esetekben a sejtek malignus burjánzását érhetjük el. A sejtciklus szabályozása tehát a szöveti homeosztázis szerves része, a regenerációnak, illetve az elöregedett sejtek eltüntetésének (apoptózis)

alapvet

feltétele

ilyen módon a szövetek normális

m ködésének az alapja. A szövetek sejtjeinek élettartama változó: vannak sejtek (pl.: felszíni hámsejtek) amelyek csak napokig élnek differenciálódott új sejtek. A vörösvértestek

helyüket elfoglalják a frissen 100-120 napig életképesek. Az

idegsejtek és a szív izomsejtjei hosszú élet ek (évtizedekig); pusztulásukat nem követi a pótlásuk, mert ezek a sejtek a feln tt szövetben nem képesek osztódni. A szöveti pusztulás egyes esetekben (betegség, szöveti sérülés) a szokásosnál nagyobb fokú

ilyenkor a sejtek regenerációs készsége határozza meg a szöveti gyógyulást.

7.1. A sejtciklus négy fázisból áll: 1. a mitózis fázisai: profázis, prometafázis, metafázis, anafázis, telofázis. Az utódsejtek a következ szakaszba lépnek. 2. G 1 fázis, vagy posztmitotikus szakasz, amelyben a sejt differenciáltsági fokának megfelel en funkcionál. Tovább nem osztódó sejteknél (idegsejt, szívizomsejt) a sejt élete további részét ebben a szakban tölti.

27 3. S fázis: a DNS replikáció szakasza. 4. G 2 fázis: az ún. premitotikus szakasz. Ezt a mitózis követi. A legtöbb emberi sejt minden fázison végighalad, mert a szövetek többségében a sejtek pusztulása folyamatos sejt újraképz déssel jár együtt. Az osztódó sejtek egyidej leg differenciálódnak is, és ez a két folyamat differenciálódás

a sejt proliferáció és a

a szöveti regeneráció alapja. Az egyes szövetek eltér

regenerációs kapacitással rendelkeznek. A regeneráció azért lehetséges mert a szövetekben embryonális tulajdonságokkal rendelkez differenciálatlan sejtek vannak ezeket törzs sejteknek vagy progenitor sejteknek nevezzük. A progenitor sejtek blaszt jelleg ek, ami azt jelenti, hogy sejtmag/citoplazma hányadosuk nagyobb mint a differenciált sejteké. Unipotens és pluripotens progenitor sejteket különböztetünk meg

ez azt jelenti, hogy differenciálódásuk menete eltér . Az unipotens sejtek

osztódásakor egy progenitor sejt és egy differenciálódó sejt keletkezik, és a differenciálódó sejt egyetlen irányba fejl dik, egy bizonyos sejtféleség lesz belöle. A pluripotens sejt differenciálatlan

úgynevezett kolónia formáló sejteket hoz létre,

amelyek mindegyikéb l egy egy speciális sejtvonal alakul ki (tehát a differenciálódás csak a második vagy harmadik osztódás után indul meg). Az ilyen kolónia formációk különösen a vérképz

rendszerben és az immunrendszerben gyakoriak. A sejt

újraképz dés folyamatát különféle szöveti faktorok, úgynevezett növekedési faktorok szabályozzák. Ezek a faktorok receptorok révén befolyásolják a sejteket. A reguláció másik módja az, amikor a szomszédos sejtek között membrán kapcsolatok (gap junctions) alakulnak ki, amelyeken át a sejtek információ hordozó molekulákat adhatnak át egymásnak. Mivel a közvetlen szöveti környezet a regeneráció mértékét, sebességét er sen befolyásolja, feltételezhetjük, hogy a sejt sejt interakciók utóbbi formája szabályozza a progenitor sejtek szaporodását és differenciálódását. 7.2. Regeneráció A kültakaró hámjának progenitor sejtjei a basalis membránhoz közeli stratum germinativumban vannak. Ezek a progenitorok unipotens sejtek, amelyek a b rhám keratinocytáit pótolják. Az epidermális növekedési faktor (EGF) szükséges a hámsejtek

újraképz déséhez

és

növekedéséhez

(bár

az

EGF

nemcsak

a

hámszövetekre hat). A laza rostos köt szövetek regenerációs képessége igen nagy. A köt szövetben fibroblastok vannak, amelyek a fibrocytákat pótolják és szintetizálják a köt szöveti

28 alapállományt és kollagén rostokat. A fibroblast növekedési faktor (FGF) a fibroblastok szaporodását szabályozza. Olyan szövetekben, amelyek nem képesek regenerációra (pl. szívizom) az elpusztult szöveti sejtek helyét proliferáló köt szövet tölti ki ez a köt szövet a hegszövet. A porcszövetek regenerációs képessége rossz

ez azt jelenti, hogy a porc

elpusztulása, degenerációja után nem képzödik újjá. A szövet csupán arra képes, hogy elöreged sejtjeit pótolja. Ez a folyamat a porchártyában lévö chondroblastok révén lehetséges. A chondroblast unipotens progenitor sejtnek tekinthetö. A chondroblastok növekedését és differenciálódását a hipofízis növekedési hormonja (somatotropin) szabályozza. A somatotropin nem közvetlenül, hanem a bel le képz d somatomedin C

révén hat a porcra. A somatomedin C a májban képz dik a

somatotropin hatására. A csontszövet igen jól regenerálódik. A csontot finom köt szöveti hártya borítja, amelyet periosteumnak (kívül) illetve endosteumnak (belül) nevezünk. A periosteum és az endosteum osteoprogenitor sejteket tartalmaz, amelyekb l osteoblastok majd pedig osteocyták (a csont sejtjei) differenciálódnak. A progenitor sejtek fontos

szerepet játszanak a csonttörések gyógyulásában

proliferációjuk

nyomán alakul ki a csont kallusz, vagyis az a burjánzó szövet ami a törött csontvégeket összeköti és majd elcsontosodva meggyógyítja a törést. Az izomszövet három fajtája (simaizom, szívizom, vázizom) közül a simaizom regenerációja gyors és tökéletes. A szívizom feln tt korban nem regenerálódik, a vázizomzat regenerációja pedig attól függ, hogy milyen mérték a szövet pusztulása. Nagy szövethiányokat a vázizomzat nem képes helyrehozni

ilyenkor hegszövet

foglalja el az izomrostok helyét. A vázizom rostjai között differenciálatlan progenitor sejtek, myoblastok vannak és a regeneráció ezeknek köszönhet . A regeneráció során tulajdonképpen megismétl dik az embryonális fejl dés

a myoblastokból sorozatos

sejtfúzió révén lesz izomrost. Fiatal korban a testedzés is el idézi a myoblastok differenciálódását, vagyis az izom tömege azért növekszik mert az izomrostok szaporodnak. Az izomrostok hosszanti növekedése a sarcomerek számának növekedése miatt következik be. Ez tulajdonképpen az izomrost fehérjeszintetizáló aktivitásának köszönhet . Számos hormon és növekedési faktor segíti az izomzat fejl dését és regenerációját a pubertás idején a tesztoszteron és a növekedési hormon (somatotropin) a fent említett somatomedinek révén. A motoneuron fel l

29 axontranszporttal érkez

neurotrofikus faktorok nélkülözhetetlenek az izomrost

normális anyagcseréjéhez és növekedéséhez. A vérképz

rendszer és az immunrendszer sejtjei folyamatosan újraképz dnek

mert a kering sejtek élettartama maximum 3 4 hónap. A vér sejtjei és a limfociták egyaránt

a

vörös

csontvel ben

keletkeznek.

A

sejtképz

folyamat

neve

hematopoiesis. A pluripotens ssejt alapvet en két típusú multipotens sejtvonalat hoz létre, ezek a lymphoid és a myeloid sejtvonalak. A lymphoid sejtvonal

ssejtjéb l a

limfocita kolónia formáló progenitor sejtek jönnek létre, amelyekbol majd a B és T limfociták keletkeznek. Ezek népesítik be a limfoid szerveket (thymus, lép, nyirokcsomók).

A

myeloid

sejtvonal

progenitorai

az

erythrocyta ,

megakaryocyta , monocyta és granulocyta kolónia formáló sejtek, amelyekb l a hasonló nev vérsejtek fejl dnek ki. A folyamat a vörös csontvel ben játszódik le. Ezeket a folyamatokat számos szöveti faktor szabályozza, amelyek növekedési faktorok (Growth Factors GF), kolónia stimuláló anyagok (Colony Stimulating Factors CSF) és hematopoietinek (lásd az alábbi Táblázatot).

FAKTOR NEVE

TERMEL

SEJTJEI

BIOLÓGIAI HATÁSA

makrofágok, fibroblast, endothel Granulocyta és makrofág T limfocita, fibroblast, endothel CSF makrofág, endothel, Makrofág CSF fibroblast

granulocyta képz dést szabályozza granulocyta és monocyta képz dést szabályozza a makrofágok immunológiai funkcióit szabályozza minden myeloid sejtvonalra hat a vörösvértest képzés regulátora

Granulocyta CSF

Interleukin 3

T limfocita

Erythropoietin

a vese intestitialis sejtjei

Az idegrendszer regenerációjával kapcsolatos jelenségek teljesen eltér ek a fenti szövetekét l. El ször is el kell különíteni a perifériás és a központi idegrendszert, mert a periférián teljes érték regeneráció lehetséges, azonban az eml s központi idegrendszer struktúrális regenerációra képtelen. A perifériás és a központi idegrendszer neuronjai nem osztódnak és nincsenek progenitorok sem, amelyek differenciáció útján a neuronok pótlását végeznék. A gliasejtek azonban képesek a proliferációra és vannak glia progenitorok is amelyekbol új gliasejtek képz dhetnek.

30 Nyilvánvaló azonban, hogy a glia nem tudja átvenni a neuronok funkcióját és a struktúrában betöltött helyét sem. A perifériás idegrendszer regenerációja abból áll, hogy az idegsejtek képesek sérült axonjuk pótlására, vagyis nyúlványok növesztésére. Az axonok újraképz dnek és az axonok végz dései, vagyis a receptorok és az effektorok is tökéletesen regenerálódnak. A neuron nyúlványának regenerációja során ún. növekedési kúp képzodik, amely filopódiumok (állábak) révén mozog, halad el re és igyekszik megtalálni eredeti helyét. A növekedési kúpot mozgásában segítik a perifériás gliasejtek (Schwann sejtek), a basalis membránok és a célsejtek valamint az általuk termelt kémiai anyagok neurotrofikus faktorok (pl. idegnövekedési faktor NGF), más trofikus faktorok (pl. fibroblast növekedési faktor

FGF) és

sejtadhéziós molekulák. A célsejtet (pl. izomrostot) elérve az idegnyúlvány és a célsejt köcsönhatásai segítik a végkészülék (pl. motoros véglemez) differenciálódását és az eredeti struktúra regenerációját. A központi idegrendszerben az axonok sérülését követoen gliaproliferáció kezd dik és a keletkez glia heg megakadályozza az axonok visszanövését és a strukturális regenerációt. Vannak azonban olyan agyterületek, ahol az idegrendszer kísérletet tesz a regenerációra az axonok ún. terminális proliferációja és kollaterális sarjadzása formájában. Ez a proliferáció és sarjadzás azonban rendszerint nem éri el a célját, mert a megüresedett posztszinaptikus membránokat glia nyúlványok foglalják el, megakadályozva a kinöv axonok célba érését. A központi idegrendszerben ennek ellenére számos növekedési faktor található idegnövekedési faktor (Nerve Growth Factor NGF), agyi eredet

növekedési

faktor (Brain Derived Neurotrophic Factor BDNF), neurotrofinok, epidermális növekedési faktor (EGF), fibroblast növekedési faktor (FGF) és vérlemezke növekedési faktor (Platelet Derived Growth Factor PDGF). Ezek feltehet en részt vesznek az említett abortív regenerációban és a glia proliferációjában. További fontos szerepük az ún. neurotrofizmus, ami azt jelenti, hogy jelenlétük szükséges az idegi struktúrák szerkezeti funkcionális épségének fenntartásához. 7.3. MITÓZIS A mitózis a szomatikus sejtek ún. számtartó osztódása. A profázisban a citoplazma fizikokémiai változásokon megy keresztül

a sejt legömbölyödik és a sejtmagban

láthatóvá válnak a kromoszómák. Minden profázis kromoszóma filamentumszer , ún.

31 kromatidákból áll (ezekb l lesznek az utód kromoszómák). A kromatidák megvastagodnak és megrövidülnek, a centroméra jól látható. A kromoszómák a maghártya felé vándorolnak. A centriolum osztódik és a két centriolum körül kialakul a mitotikus orsó (eleinte cytaster formájában, vagyis a centriolumokat sugárszer en körülvéve). A centriolumok a sejt két pólusa felé vándorolnak és az orsófonalak is megnyúlnak. A prometafázisban a maghártya felszakadozik és az orsó egyes fonalai (a centroméra fonalak) a kromoszómákhoz tapadnak, más fonalak megszakítás nélkül összekötik a két centriolumot (poláris fonalak), végül a legrövidebb fonalak a centriolumok körül maradnak mint a cytaster maradványa (asztrális fonalak). Megkezd dik a metafázis, amelyben a kromoszómapárok elkülöníthet k bár még együtt vannak és sejt equatorában találhatók. Ez az ún. equatoriális lemez. Az anafázisban a centromérák elkülönülnek és az utód kromoszómák megkezdik vándorlásukat a sejt két pólusa felé. A telofázis akkor kezd dik, amikor az utód kromoszómák

a

centriolumok

szomszédságában

csoportba

rendez dnek.

Megkezd dik a nukleoplazma és a maghártya kialakulása és beindul az utódsejtek citoplazmájának kettéválása az ún. citokinesis. Kialakul a nucleolus, a kromoszómák fellazulnak és újra kialakul az interfázisra jellemz kromatinállomány. A mitózis a kés i metafázisban és az anafázisban colchicinnel megállítható. A kromoszómák ilyenkor már elkülönültek és lehet ség van arra, hogy a sejteket hipotóniás oldatban roncsoljuk és a kromoszómákat megfestve nagy nagyítású fénymikroszkópos

felvételeket

készítsünk

a

kromoszóma

párokat

a

fényképfelvételb l kivágjuk és alakjuk (a centroméra helyzete), nagyságuk alapján osztályozzuk. A karyotípus a normális szomatikus sejtb l nyert kromoszómák összessége alkotják.

az osztályozott, sorbarakott kromoszómák pedig az ún. idiogramot Az

idiogram

megmutatja

a

kromoszómák

alaki

és

számbeli

rendellenességeit, és alkalmas bizonyos kromoszóma rendellenességek felismerésére.

7.4. MEIÓZIS A meiózis az ivarsejtek szaporodási módja. Lényege az, hogy egy sejtb l négy egymástól eltér

genetikai állományú, haploid sejt (22 + 1 kromoszómával

rendelkez sejt) keletkezik. Minden szül i kromoszóma csak egyszer fordul el , egyetlen ivari kromoszóma van és a crossing over miatt az utódsejt kromoszómái az apai és anyai kromoszómák váltakozó szegmentumaiból tev dnek össze. Az els

32 meiotikus osztódás profázisa igen hosszú

a n i petesejt oogoniuma a pubertás

idejéig az els profázisban van: a tüsz érés megindulásakor folytatódik a meiózis is. A hosszú, kb. 10 évig tartó profázis miatt az oogonium igen sugárérzékeny profázisban ugyanis a kromoszómák kialakulása, osztódása és

a

crossing over -e

történik. Bármilyen ionizáló sugárzás igen könnyen károsíthatja ket. Az els profázis öt szakaszra osztható (leptoten, zygoten, pachyten, diploten és diakinesis): ezalatt a homológ kromoszómák párosodása és a génkicserél dés történik meg

a szakaszok

elkülönítése azáltal válik lehet vé, hogy a duplikálódó és keresztez d kromoszómák alakja, vastagsága és láthatósága szakaszonként változik. A centriolum osztódik és kialakul az oszlási orsó. Az els metafázisban a maghártya elt nik, kialalkul az equatoriális lemez, a kromoszómák azonban még nem válnak szét. Az els anafázisban a homológ apai és anyai kromoszómák kettéválnak

génösszetételük

azonban ekkorra már jelent sen megváltozott. Az els telofázisban a kromoszómák elkülönülnek, kialakulnak az utód

magok és a sejtek szétválnak. Az els meiotikus

osztódás eredménye a herében két másodrend spermiocyta, az ováriumban egy másodrend oocyta és egy polocyta (ún. sarki test). A kromoszómák megmaradnak és rövid interfázis után megkezd dik a második meiózis. A második profázis igen rövid, mert a kromoszómák nem válnak szét kromatidákra

kialakul az oszlási orsó

és megindul a második metafázis. Az equatoriális lemezben azonban profázis miatt

a rövid

feleannyi kromoszóma van mint a mitózis alkalmával. A második

anafázisban a haploid kromoszóma garnitúra a sejtek pólusai felé vándorol, a második telofázisban pedig haploid sejtmagok alakulnak ki. A herében négy haploid spermatida, az ováriumban egy haploid petesejt (ovum) és három haploid polocyta keletkezik. A polocyták egyedüli funkciója a kromoszómák elosztása - petesejthez képes rendkívül apró sejtek, hamarosan el is pusztulnak. A petesejt második meiotikus osztódása csak a megtermékenyítéskor (fertilisatio) fejez dik be: kialakul a pronucleus és a polocyta kilök désével már háromra n a polocyták száma, amelyek a zygota zona pellucidája alatt rövid ideig még láthatók. Ha nincs megtermékenyítés, akkor a második meiozisában megakadt petesejt rövid id (kb. 24 óra) alatt elpusztul. Mivel a haploid sejtben csak egy ivari kromoszóma van, a petesejtben csak X kromoszóma lehet, a spermatidák és a spermiumok pedig vagy X vagy Y kromoszómát tartalmaznak. Ily módon a megtermékenyítés során a zygota nemét a spermium határozza meg. A petesejtbe behatoló spermium sejtmagja

33 megduzzad és pronucleusszá alakul, majd a két pronucleus egyesül (amphimixis), megindul a DNS replikáció és a zygota els mitózisa.

FÜGGELÉK Vizsgáló módszerek a citológiában és hisztológiában A SZÖVETTAN TECHNIKAI ALAPFOGALMAI ÉS LEGGYAKORIBB ELJÁRÁSAI Hisztológiai munkánk során el re tudnunk kell, hogy az adott szövetben mit kívánunk kimutatni, láthatóvá tenni, és milyen eszközt (fény- és/vagy elektronmikroszkóp) szeretnénk igénybe venni a vizsgálat során. Ezek határozzák meg, hogy a feldolgozandó mintát milyen eljárással készítjük el , és milyen festési technikát alkalmazunk. Szövettani mintavétel A vizsgálandó anyag eredetét tekintve rendkívül sokféle lehet: patológiai vagy igazságügyi boncolások alkalmával nyert szerv, szövet, m téttel eltávolított szervrészlet, szövet, biopszia révén nyert szövetminta, kísérleti állatból származó szervrészlet, citológiai kenet és szövettenyészet. RÖGZÍTÉS Rögzítésnek vagy fixálásnak nevezzük azokat a kémiai és fizikai behatásokat, melyek f leg a fehérjék denaturálására irányulnak és eközben egyéb szöveti összetev knek a hisztológiai procedúra során esetlegesen bekövetkez veszteségét csökkentik vagy akadályozzák. A rögzítés segítségével több célt igyekszünk elérni: (1) a szövet "eredeti" szerkezetének és molekuláris összetételének biztosítása a sejthalál után felszabaduló autolitikus-lizoszómális enzimek inaktivációjával; (2) a minták kezelhet ségének megkönnyítése a szövet konzisztenciájának meger sítésével. A rögzítés formái az immerzió és a perfúzió. Az immerzió esetén a szövetdarabot fixáló oldatba merítik és a fixáló reagens diffúzió révén átjárja szövetet. A perfúziós fixálás esetén a kísérleti állat vagy a vizsgálni kívánt szerv véredény-rendszerén keresztül áramoltatjuk át a rögzít oldatot. Ennek hatásfoka érthet en sokkal jobb, hiszen a vegyszer a kapilláris hálózaton keresztül éri el a sejteket.

34 Az általánosan használt fixálószerek a fehérjéket denaturálják, azaz konformációjukat irreverzibilisen megváltoztatják és keresztkötéseket hoznak létre. A fixálószereket kémiai természetük szerint szokás csoportosítani: 1. Kémiai rögzít szerek, melyek kémiai reakcióba lépnek a szövet molekuláival, és hatásukra molekuláris átrendez dések történnek, a fehérjék denaturálódnak és keresztkötések keletkeznek, vagyis a szöveti molekulák immobilizálódnak. A koaguláció révén ható vegyületek (methanol, ethanol, aceton, triklórecetsav, pikrinsav) hatása nagyon eltér

az alkoholok és az aceton nemcsak rögzítenek

(precipitálják a fehérjéket), hanem víztelenítik is a szövetet, ami a szövet és a sejtek zsugorodásához vezet. A methanolt vérkenetek rögzítésére használjuk. A nemkoaguláló rögzít k (aldehidek, ecetsav, ozmium tetroxid) a vázfehérjék között keresztkötéseket létesítenek és így immobilizálják a citoplazmát és az extracelluláris teret. A formaldehid és a glutáraldehid 1

4 %-os pufferezett oldatait széles körben

használjuk: kíméletes hatásuk miatt (jól meg rzik az enzimek aktivitását, az antigéneket és a citoplazma szerkezetét), a hisztokémiában, az immunhisztokémiában és az elektronmikroszkópiában is alkalmazhatók. 2. A fizikai úton ható módszerek közül a fagyasztást kell megemlíteni. A 70o C-ra történ

50o

leh tés minden enzimm ködést meggátol, és meg rzi a sejtek

szerkezetét. A leh tött szövet évekig tárolható anélkül, hogy a sejt szerkezete és összetétele jelent sen változna. Mivel a leh tött szövet könnyen törik, a gyors h téssel történ

rögzítést használjuk a fagyasztva töréses elektronmikroszkópos

módszer során. Fontos megjegyezni, hogy nincsen "univerzális" rögzít szer. Mindig számolnunk kell szövettani technika során különböz molekulák elvesztésével, valamint azok kémiai sajátosságainak megváltozásával. Ezért a fixáló reagensek természete, koncentrációja, h mérséklete, beviteli módja, behatási ideje stb. dönt

lehet a kérdéses anyag

kimutathatóságának sikere szempontjából. BEÁGYAZÁS A fixálás hatására a minta kezelhet vé válik, de még mindig nem eléggé kemény ahhoz, hogy jó min ség , megfelel en vékony metszeteket nyerhessünk. Ezért a szövetdarabokat egy valamely magasabb h mérsékleten olvadó (>= 60oC) anyaggal, rendszerint paraffinnal kezeljük. A paraffin azonban nem elegyedik vízzel, ezért a paraffinnal történ beágyazást víztelenítésnek, dehidrálásnak kell megel znie ún.

35 felszálló alkoholsorban (pl. 70, 80, 90, 96, 100% etanol). Ezután az alkoholt paraffinnal jól elegyed benzolra cseréljük, melyet a paraffinba történ beágyazás követ. A beágyazást termosztátban, 60oC-on végezzük. A keletkezett blokkban, mely szobah mérsékleten szilárd halmazállapotú, a paraffin körbeveszi a szövetdarabot, illetve teljesen kitölti az extra- és intracelluláris tereket. A szövetdarab ilymódon megkeményített, "beágyazott" blokkjából 4-12 m vékony, ún. paraffinos metszetek készíthet k szánka- vagy rotációs mikrotómmal. A metszeteket tárgylemezre szárítjuk. A fagyasztással rögzített szövetekb l fagyasztó mikrotómmal vagy kriosztáttal készítünk metszeteket. A kriosztát bels

h mérséklete

- 20 oC körül van. A

mélyh tött metszeteket tárgylemezre szárítjuk. FESTÉSI ELJÁRÁSOK Hisztológiai festések Vannak olyan fénymikroszkópos módszerek, amelyek nem igényelnek festést a sejtek vizsgálatához. A fáziskontraszt mikroszkóppal él bizonyos

sejtalkotórészek

(mitokondriumok,

sejtek is vizsgálhatók, és

vacuolumok)

jól

felismerhet k.

Másrészt, az él sejt bizonyos festékeket felvesz és így fixálás nélkül festhet : ezek a vitális festékek, amelyek közül a Janus-zöld a mitokondriumokat, a neutrálvörös a Golgi apparátust festi. A festés úgy is lehetséges, hogy a festéket él kísérleti állatba injektáljuk. Az él

állapotban lév

szövet a festéket felveszi és felhalmozza. A

szövetet ezután rögzítjük, ha kell metszetet készítünk és megvizsgáljuk a festék lokalizációját. A metilénkék így alkalmazva jól festi a perifériás idegrendszer rostjait, a fekete tus pedig (miután fagocitózissal a sejt felvette) a mononukleáris fagocita rendszer sejtjeit (pl.: histiocytákat és Kupffer-sejteket) tünteti fel. A szövettani metszeteket és citológiai keneteket azonban legtöbbször meg kell festeni ahhoz, hogy a szövetekr l és a sejtekr l szakszer véleményt adhassunk. A paraffinba ágyazott metszeteket el ször deparaffinálni kell, mert a festékek rendszerint vízben oldódó szerves anyagok. A deparaffinálást xilolban kezdjük és alkoholsorban folytatjuk (100 %

50 %), majd desztillált vízben fejezzük be. Ezután festünk, majd

festés után ismét víztelenítjük a metszetet, végül valamilyen szerves oldószerben oldódó szintetikus gyantával fedjük, ami megszilárdulva a festett metszetet konzerválja.

36 Rendkívül sokféle festési eljárás ismeretes. A festékek azonban alapvet en kétféle csoportra oszthatók: bázikus és savanyú kémhatású vegyületekre. A szövettani festékek túlnyomó többsége aromás szerves vegyület, amelyben a színt adó molekularész (kromofor csoport) kationos (bázikus) vagy anionos (savi) töltése határozza meg a festék szöveti köt dését. A bázikus kromoforok rendszerint a szöveti fehérjék aminocsoportjaihoz, a savi kromoforok pedig a fehérjék hidroxil-, karboxilvagy szulfitcsoportjaihoz kapcsolódnak. Mivel azonban a fehérjék iker-ionként viselkednek, a citoplazma és az extracelluláris állomány (pl.: köt szöveti rostok) fest dését mindig a fixálás és az azt követ

(festést megel z ) kezelések által

kialakított sejt- és szöveti pH határozza meg. A nukleinsavak viszont mindig bázikus festékekkel fest dnek, mert izoelektromos pontjuk igen alacsony. Egyes bázikus festékek (pl.: toluidinkék) a nukleinsavak specifikus kimutatására alkalmasak. A hisztológiában alkalmazott festésekkel a sejtben bazofil és acidofil struktúrákat tudunk elkülöníteni

ami azt jelenti, hogy a sejt bizonyos részei (pl.: sejtmag, rER)

bázikus festékkel, mások (pl.: a citoplazma) savi festékkel festhet k. Ez azt is jelenti egyben, hogy a sejtalkotók olyan szín ek lesznek mint az alkalmazott festék. Az leggyakrabban használt festési módszer, a hematoxilin

eozin festés során a piros

eozin a citoplazmát, a mélybíbor szín hematoxilin pedig a sejtmagot és az RNS tartalmú struktúrákat festi. Vannak olyan (kék szín ) bázikus festékek, amelyek egyes sejtalkotókat és néhány szövet sejtközötti állományát nem kékre, hanem vöröses-ibolyára festik. A festéknek eme színváltozását, amelyet a szöveti köt dés után látunk, metakromáziának nevezzük. A metakromázia oka az, hogy a festékmolekulák rendezetten és szabályos távolságokra (egymástól kb. 0. 5 nm-re) köt dnek

metakromáziát mutat a

kondroitinszulfát és a heparin. A technikai lehet ségeink nem korlátozódnak hidrofil szöveti komponensek kimutatására. A lipid cseppeket és lipidet tartalmazó anyagokat (pl. lipofuscin, myelinhüvely) színes lipofil festékekkel (Sudan Red, Sudan Black) és reagensekkel (ozmium-tetroxid) tehetjük láthatóvá. Nagy gyakorlati jelent sége van annak, hogy a paraffinos beágyazáshoz szükséges víztelenítéskor a zsírszer

anyagok - ritka

kivételt l eltekintve, mint pl. a lipofuscin zárványok - elvesznek a metszetb l, és rendszerint csak a sejteken belüli kontúrjuk marad meg. A lipidek fénymikroszkópos kimutatásához ezért fagyasztott metszetekre van szükség.

37 Egyes szövetelemek és sejtalkotók krómsókkal és ezüstvegyületekkel festhet k. Ezek az ún. kromaffin és argentaffin struktúrák. Kromaffin szemcsék bizonyos endokrin sejtekben és neuronokban vannak, az ezüstözési módszerek (ezüstimpregnációk) pedig f leg az idegrendszer kutatásában használatosak. HISZTOKÉMIA A hisztokémia és a citokémia egymással felcserélhet fogalmak: mindkett azt jelenti, hogy mikroszkópos technika segítségével elemeket és vegyületeket lokalizálunk és láthatóvá teszünk a szövetben és a sejtben. A hisztokémia körébe tartozó festési módszerek kémiai- vagy enzimreakción alapulnak és alapvet

tulajdonságuk a

specificitás. A hisztokémia segítségével elemeket (pl.: kalcium, vas), szervetlen vegyületeket (pl.: mészkristályok) és szerves molekulákat (pl.: enzimeket) tudunk detektálni. A hisztokémiai módszerek sok esetben segítik a diagnosztikai munkát: biopsziával nyert szövetmintákban (pl.: vékonybél) enzimek jelenléte vagy hiánya alapján betegségekre lehet következtetni. Az egyszer hisztokémiai módszerek közé tartozik a poliszacharidok 1,2-glikol csoportjainak kimutatására használt perjódsav

Schiff (PAS) reakció. A pejódsav

oxidálja a glikolcsoportot és a keletkezett aldehideket kénsavval elszíntelenített bázikus fukszinnal (Schiff-reagens) reagáltatják. A színtelen leukofukszint az aldehid csoportok visszaszínezik , azaz vörös szín vegyületté alakítják. A PAS reakció segítségével mucint, mukoproteineket esetleg hialuronsavat lehet kimutatni. Az enzimek specifikus katalitikus kémiai aktivitását kihasználó eljárásokat enzimhisztokémiai módszereknek szokás nevezni. Az általánosan elfogadott enzimosztályokból a hidrolázok és oxidoreduktázok nagy csoportjába sorolt számos enzim szelektív és megbízható kimutatására sikerült már hisztokémiai módszereket kidolgozni. Az enzimhisztokémiai technikák közös sajátsága, hogy a szöveti metszetet mesterséges szubsztrátumot tartalmazó vizes oldatban, általában 35

37oC-

on inkubáljuk és az enzimreakció nyomán az inkubáló vizes közegben oldhatatlan, színes reakció-termék képz dik. A reakciótermék fénymikroszkópban fest dés formájában látható. Immunhisztokémia Olyan eljárásokat sorolunk e csoportba, melyek során a szövettani metszetben kimutatandó anyag antigén és a reagens antitest természet

immunoglobulin,

amelyek specifikus és nagy affinitású antigén-antitest molekuláris kölcsönhatás révén

38 kapcsolódnak

össze

a

szövettani

vagy

citológiai

preparátumban.

Az

immunhisztokémia rendkívüli sokoldalúságát az immunreakció érzékenysége és szelektivitása magyarázza

ezért az immunhisztokémia fontosságát tekintve

kiemelkedik a többi hisztokémiai módszer közül. Az immunhisztokémia alapja az in situ antigén-antitest köt dés. Az antigén kimutatásához használt antitestet primér antitestnek nevezzük.

A direkt

immunhisztokémiai módszerekben primér antitestet kovalens kötéssel kötött szövetidegen festékmolekulával jelöljük meg, amely a mikroszkóppal látható. Az indirekt módszerekben a primér antitest jelöletlen marad, és a jelölést egy második, ún. szekundér antitest hordozza majd. A szekundér antitest a primér antitest immunglobulinja ellen termelt tisztított immunsavó. Az antitesteket vizes oldatok formájában helyezzük a metszetre. A direkt módszerek ma már nincsenek használatban,

viszont

az

indirekt

immunhisztokémia

számtalan

variációját

fejlesztették ki. Ezek közül jónéhányat a patológiai diagnosztikában is széleskör en alkalmazunk. A szekunder antitesthez többféle jelz anyag köthet : tormagyökér peroxidáz enzim (HRP), biotin (H-vitamin), fluorokróm (fluoreszcein-izotiocianát, Texas Red), 140 nm (!) átmér j aranyszemcse. Tercier immunreagensnek nevezzük azokat az anyagokat, amelyek a szekundér antitesthez egy további lépésben köt dnek és a jelölt (vagy jelöletlen) másodlagos antitest szöveti kimutatását segítik. Fontos harmadlagos immunreagens a peroxidáz anti-peroxidáz komplex (PAP), amelyet kémcs ben állítanak el HRP és anti-HRP molekulák megfelel

arányú (3:2) vegyítésével. Az adott immunhisztokémiai

procedúrában az anti-HRP-t ugyanabból az állatfajból nyerik, mint a primér antitestet. Egyéb tercier reagensek közül fontos a négy biotin-köt hellyel rendelkez avidin, vagy a Streptomyces griseusból nyert streptavidin fehérje. Az avidint és a streptavidint jelölni kell (HRP-vel vagy fluorokrómmal).

39

A direkt (A) és az indirekt (B és C) immunhisztokémiai módszerek összehasonlítása. A B rajz a PAP-technikát, míg a C rajz HRP-avidin technikát ábrázolja sematikusan. Immunfluoreszcencia illetve az immunarany jelölés esetén a fluorokrómmal illetve az aranyszemcsével jelölt immunreagensekkel történt inkubálással, majd az azt követ mosással befejez dik az immunhisztokémiai procedúra. A PAP reakció esetében, az addig láthatatlan szöveti immunreakciót egy enzimhisztokémiai eljárásnak tekinthet

el hívással mutatjuk ki. A metszeteket a

HRP természetes szubsztrátja a hidrogén peroxid és 3,3'-diaminobenzidin (DAB) jelenlétében

inkubáljuk.

Az

enzimreakció

eredményeként

a

szövetben

az

immunreakció helyén barna szín , vízben és szerves oldószerben egyaránt oldhatatlan reakció-végtermék

(ún.

DAB

polimer)

keletkezik.

fénymikroszkóppal és elektronmikroszkóppal is vizsgálható.

A

DAB

polimer

40

Lépé-

PAP technika

sek 1. 2.

nyúlban

Avidin/streptavidin

Immunfluoreszcens

technika

technika

termelt egérben termelt anti-GFAP egérben termelt anti-

anti-inzulin IgG

IgG

laminin IgG

kecskében termelt

biotinnal jelölt, nyúlban

Texas Reddel-jelölt,

anti-nyúl IgG

termelt anti-egér IgG

nyúlban termelt antiegér IgG

3.

nyúl PAP komplex HRP-streptavidin komplex

-

4.

DAB el hívás

-

DAB el hívás

TÁBLÁZAT: Példák az indirekt immunhisztokémiára. A táblázat a különféle módszerek során alkalmazott metodikai lépéseket (inkubálásokat) tartalmazza (IgG immunglobulin G)

TRANSZMISSZIÓS ELEKTRONMIKROSZKÓPIAI ELJÁRÁSOK Az

elektronmikroszkóppal

megfigyelhet

sejtorganellumok

és

citoplazma

alkotórészek a setjek és szövetek ultrastruktúráját alkotják. Az elektronmikroszkóp segítségével a fénymikroszkópos képt l eltér új dimenzió tárul fel, amely lehet vé teszi a sejtorganellumok funkcionális tanulmányozását. A hisztokémia és az immunhisztokémia az elektronmikroszkóp szintjén is alkalmazható

ezek

segítségével intracelluláris enzimek, vagy membránreceptorok pontos lokalizációja lehetséges. A diagnosztikában máj- és vese biopsziák értékelésében nyújthat segítséget. A minta el készítésének egyik legfontosabb lépése a megfelel rögzítés. Az élet megsz ntével a sejtek ultrastruktúrája igen gyorsan deteriorálódik, ezért a legjobb eredményeket a perfúziós fixálással lehet elérni. A biopsziák esetében a minta igen kicsiny szövetdarab ( 1 mm3), ami azt jelenti, hogy az immerziós rögzítés során a fixáló oldat gyorsan penetrál és átjárja a szövetmintát. A rögzítéssel szemben támasztott elvárásainkat leginkább a vegyes aldehid fixálók teljesíthetik, melyek közül gyakran alkalmazzuk a Karnovsky-féle fixálót: ebben 5 % glutáraldehid és 4

41 % paraformaldehid van foszfát pufferben, a pH 7.4. A mintákat 1-2 napos fixálás után piciny (1-3 mm3) darabokra vágjuk. A szövetdarabokat ezután ozmiumozzuk: OsO4 1 %-os vizes, pufferezett oldatában tartjuk 1-2 órán át. Az ozmium mint nehézfém megfesti a membránokat és egyéb, ún. ozmiofil struktúrákat és biztosítja az elektronmikroszkópban elengedhetetlen kontrasztot. A szövetet ezután felszálló alkoholsorban (50 % - 100 %) víztelenítjük. A dehidrálás folyamatába rendszerint beiktatunk egy telített uranil-acetáttal történ

kezelést is a kontraszt fokozása

érdekében. Az uranil ionok az ozmium által már megfestett helyekre köt dnek (f leg a sejtmembránokhoz) és így fokozzák az elektronmikroszkópos kép kontrasztját. A víztelenítés után a szövetet szintetikus, h n (60 oC- on) polimerizálódó szintetikus gyantával (pl.: Durcupan) infiltráljuk. A beágyazószer viszonylag kis molekulájú anyag, amely tökéletesen átitatja a szövetet, 60

o

C-on

polimerizálódik és a

paraffinnál jóval keményebb blokkokat képez. A m gyantába ágyazott szövetb l ultramikrotómmal készítünk vizsgálatra alkalmas metszeteket. A gyanta keménysége miatt az ultramikrotómban üvegkést és gyémántkést használunk. Az üvegkéseket különleges min ség üvegcsíkokból, ún. késtör

készülék ("knife maker") segítségével készítjük. A készülék m ködése

közben az üvegcsíkot el bb megkarcolja, majd a karcolás mentén alátámasztva egy hirtelen mozdulattal eltöri. A keletkezett négyzet alakú üveglapocskát ismét befogjuk, és ezúttal átlója mentén törjük el. Így háromszög alakú késeket nyerünk, amelyeken egyetlen olyan él keletkezik ami metszésre alkalmas. Ez az él olyan finom, hogy segítségével 50-80 nm vékonyságú metszeteket tudunk vágni. A gyémántkésekben a vágásra használt él ipari gyémántból készül gyári eljárással. A metszeteket nem tárgylemezre, hanem 2-3 mm átmér j , kerek rézrostélyokra vesszük fel. A további m veletek során (beleértve a mikroszkopizálást is) a metszet ezen a rostélyon marad.

AUTORADIOGRÁFIA Az autoradiográfia izotópok sejten belüli, vagy szöveti lokalizációjára törekszik. A fénymikroszkópos autoradiográfia során a metszeteket fénymikroszkópban értékeljük, elektronmikroszkópos autoradiográfia során pedig az ultrastruktúra szintjén. A kísérleti állatnak beadott és a sejtek és szövetek által felvett izotóp (legtöbbször izotóppal jelzett szerves molekula

pl.: aminosav) nagyobb molekulákba épül (pl.:

42 fehérjékbe), amelyeket a szokásos hisztológiai fixálással immobilizálunk illetve a szövetben tartunk. Az izotóp sugárzást bocsájt ki, amely a legtöbb biológiai kísérletben béta sugárzás (pl.: a trícium esetén). A szövetb l metszeteket készítünk, a metszeteket tárgylemezre húzzuk emulzióréteg vékonyabb mint 1

majd fényérzékeny emulzióval fedjük. Az m. Az emulzióval fedett metszetet sötétben,

h t szekrényben exponáljuk, vagyis id t hagyunk arra, hogy elegend sugárzás érje a szövetb l az emulziót. A szövet sugárzása az emulzióban fotokémiai változást idéz el : az emulzióban lév ezüstbromid kristályokat ezüstté redukálja. A folyamatot fotográfiai el hívással tesszük láthatóvá tartalmaz. A metszet felett lév

az el hívó oldat is redukáló anyagokat

emulzióban így fekete ezüstszemcsék válnak ki,

amelyek a mikroszkópban (fény- és elektronmikroszkópban egyaránt) jól láthatók. A mikroszkópos vizsgálat alatt tehát az emulziót és a metszetet együtt vizsgáljuk. Az autoradiográfia egy másik formájában, a receptor autoradiográfiában, a metszetet olyan izotóppal jelzett vegyülettel inkubáljuk, amely feltehet en specifikus receptorokhoz köt dik (ez lehet a receptor természetes ligandja, vagy éppen specifikus gátlója). A feltételezett köt dést követ en a metszetet pufferrel mossuk, hogy az aspecifikusan kötött anyagot eltávolítsuk. A specifikusan kötött, izotóppal jelzett ligandot ezután autoradiográfiával mutatjuk ki

ez történhet a fent részletezett

emulzió módszerrel, vagy úgy, hogy a metszeteket fényérzékeny autoradiográfiás filmre helyezzük, s a filmet (a röntgenfilmhez hasonlóan) kazettában exponáljuk. Ezt követ en a filmet el hívjuk és a metszett l függetlenül vizsgáljuk

általában

denzitometria segítségével elemezzük az ezüstszemcsék eloszlását és s r séget

AZ IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ Az

in situ hibridizáció során hisztokémiai vagy autoradiográfiás módszerekkel

specifikus nukleinsav szekvenciákat próbálunk kimutatni sejtekben, szövetekben vagy kromoszómákban. A módszer alapja az, hogy mesterségesen el állított DNSvagy RNS szekvenciákat izotóppal, enzimmel, biotinnal vagy digoxigeninnel jelölünk. A jelölt, egyszálú nukleinsav specifikusan kapcsolódik a sejtmag vagy a citoplazma nukleinsavjaihoz és ez a jelenség a hibridizáció . A módszer segítségével vírusfert zések szöveti diagnózisára, specifikus tumorok felismerésére és örökl d

43 betegségek génjeinek kromoszómális lokalizálására is lehet ség nyílik. A nukleinsav próbák specifikussága miatt az in situ hibridizáció a molekuláris patológia igen fontos módszerévé lépett el . A szövetek és sejtek el készítésének lényege, hogy a vizsgálni kívánt nukleinsavak a helyükön maradjanak és minél kisebb veszteség érje ket a hibridizálást megel z lépések során. Ugyanakkor az is követelmény, hogy a szövetek és a sejtek szerkezete vizsgálható legyen. Mivel az mRNS könnyen bomlik, a szövetet gyors fagyasztással konzerváljuk, és kriosztáttal készítünk metszeteket. A fagyasztott metszeteket h vel (80

100

o

C-os fémlapon), vagy

4 %-os paraformaldehiddel rögzítjük (a

paraformaldehid némi ribonukleáz gátló hatással rendelkezik). Bizonyos esetekben perfúziós fixálás is lehetséges, ekkor azonban az oldatot sterilizálni kell és ribonukleáz gátló vegyületet kell az oldatba tenni. A metszeteket ezután olyan kezeléseknek vetjük alá, amelyek denaturálják a nukleinsavakat

a DNS-t egyszálúvá

alakítják, az RNS feltekeredését pedig megakadályozzák. Így lehetséges az, hogy a szintetikus próba hibridizációs reakcióba lépjen a szöveti nukleinsavval, vagyis megjelölje azokat a helyeket ahol a vizsgált bázisszekvencia található. A hibridizációt általában 37 oC körüli h mérsékleten, termosztátban végezzük. A hibridizáció után az izotópos jelölések esetében autoradiográfiát végzünk, egyéb jelöléseket pedig hisztokémiai úton teszünk láthatóvá. Bizonyos esetekben lehet ség van arra, hogy az in situ hibridizációt immunhisztokémiával kombináljuk: ilyenkor a génexpresszió egyidej vizsgálata mellett a sejtek fenotípusáról is nyerünk információt. A módszer jól használható a neuropatológiai diagnosztikában mert az az agyi mRNS halál utáni bomlása lassú folyamat (feltehet en azért mert a ribonukleázok gyorsabban lebomlanak)

hasonlóképpen a DNS is meg rzi szerkezetét. Az

agytumorok diagnosztikájában tumorgének vagy vírusok expresszióját vizsgáljuk az in situ hibridizáció segítségével. A kromoszóma preparátumokban betegség-gének lokalizációjára nyílik lehet ség, a kromoszómákon végzett in situ hibridizációval.

44

VÁZLATOS ÁBRÁK

45

1. ÁBRA: Az állati sejtek alakja és nagysága igen változatos. Alakja és a sejtmag formája alapján felismerhet többek között a hengerhámsejt (a), a primér érz neuron (b), a neutrofil granulocita (c), a mikroglia sejt (d), a simaizomsejt (e), a spermium (f), és a fibrocita (g).

46

2. ÁBRA: Az emberi sejt általános szerkezetét és szöveti viszonyait egy hengerhámsejten mutatjuk be. A sejt polarizált: apicalis (ap) és basalis (b) részein eltér organellumok vannak. Az apicalis felszín alatt a lateralis sejtmembránokat junkcionális komplexusok (jc) kapcsolják össze: felül tight junction (zonula occludens), alatta övdesmosoma (zonula adherens) található. A basalis sejtfelszínt hemidesmosomák (HD) kapcsolják a basalis laminához (vastag nyíl). A sejt középs régiójában sejtmag (NU), mellette centriolumok (CT) vannak. A citoplazmában filamentumok (FIL), endoplazmás retikulum (rER), lysosomák (LY), mitokondriumok (M), Golgi apparátus és szekretoros vezikulák (SV) figyelhet k meg. A sejt alatti köt szövetben kapillárisok vannak (cap), amelyeket basalis lamina (vastag nyíl) választ el a szövett l, és amely pinocitotikus vezikulák révén transzportálja a kisebb molekulákat.

47

3. ÁBRA: A sejtmembrán vázlatos szerkezete. A fehérjék a foszfolipid rétegekbe (f) ágyazódnak, és helyzetük alapján integrális (i) és perifériás (p) proteinek. Az egész membránt átér fehérjék a transzmembrán proteinek (t). A membránfehérjék extracelluláris oldalán különféle oldalláncok lehetnek, amelyek sejtfelszíni antigéneket (a) és a glycocalyxot (b) alkotják. A receptor-ioncsatorna komplexek (c) transzmembrán fehérjék komplex csoportosulásai. Ozmiumozott elektronmikroszkópos metszeteken a membrán (unit membrane) elektrondenz vonalak formájában mutatkozik (um).

48

4. ÁBRA: Az integrinek (vastag nyíl) szerepe a sejtmembránban. Az integrin a citoplazmában (cito) lév actin molekulákhoz és az extracelluláris (ex) integrin receptorokhoz (üres nyilak) köt dik. Az integrin receptorok (a rajzon ezek az integrin receptorok tulajdonképpen fibronectin molekulák) kollagénrostot kötnek. Ezzel a mechanizmussal a sejt köt dik az extracelluláris tér makromolekuláihoz: ez a sejtadhézió molekuláris mechanizmusa.

49

5. ÁBRA: Sejtkapcsoló struktúrák vázlata. A desmosoma (A) esetében a két sejt (1, 2) közötti tér kitágul és az extracelluláris térben a sejteket összekapcsoló makromolekulák elektrondenz, sötét lemezt (plaque) képeznek (nyilak). A membránok citoplazmatikus felszínén hasonló plaque-ok vannak, ezekhez pedig citoplazmatikus filamentumok tonofilamentumok haladnak (T). A gap junction (B) esetében a két sejt közötti tér minimálisra sz kül és szomszédos sejtek (1, 2) membránjait connexin-komplexek (nyilak) hidalják át, amelyek ioncsatornaként is funkcionálnak.

50

6. ÁBRA: A szívizomsejtek közötti komplex intercelluláris kapcsolatok alkotják az Eberth-féle vonalat. Az Eberth-vonalban elektronmikroszkóppal legalább háromféle junkció található: a hullámosan egymáshoz illeszked sejtmembránokat gap junction (GJ), spot-desmosoma (DES), és a desmosomához kissé hasonló, ún. fascia adherens (nyilak) kapcsolják össze. A szívizomsejt actin myofilamentumai (A) a fascia adherenshez rögzülnek.

51

7. ÁBRA: Az idegsejtben található durva felszín endoplazmás retikulum (rER) fénymikroszkópos (A) és elektronmikroszkópos (B) képei. Az rER fénymikroszkóppal vizsgálva citoplazmatikus bazofíliát okoz és képen ábrázolt neuronban Nissl-féle szemcsék formájában látható. A Nissl-szemcsék szabályosan (többé-kevésbé párhuzamosan) elhelyezked rER ciszternák kötegeib l állnak. Az ellapult membrán zsákocskák felszínén riboszómák sorakoznak.

52

8. ÁBRA: A Golgi apparátus és a rER kapcsolata bonyolult vezikuláris transzport (T) révén valósul meg. A Golgi cis felszíne (CIS) a rER-hoz közeli felszín, utána a stack régió (ST) következik, végül a Golgi trans felszíne (TRA) felel s a lysosomák (LY) és a secretoros vesiculák (SV) képzéséért. Az endocitózisban képz d tüskés vezikulák (coated vesicles CV) szintén a Golgi felé tartanak. A Golgi-apparátus részt vesz a membrán reciklizációban is (R). A Golgi trans felszínén speciális régiót alkot a GERL, amely Golgi-, rER-ciszternákból és lizoszómákból áll. A nyilak a vezikulák haladási irányát jelzik.

53

9. ÁBRA: Lizoszómák (LY), szekunder lizoszóma (SLY), peroxiszómák (PER) és multivezikuláris test (MVB) májsejtben. A citoplazmában glikogén zárványok (GL) és sima felszín endoplazmás retikulum ciszternák (sER) láthatók.

54

10. ÁBRA: A lizoszómák típusai és intracelluláris forgalma. A szekretoros vezikulák nagy része exocitózissal kiürül a sejtb l (1). Vannak olyan vezikulák, amelyeket a sejt krinofágia (2) formájában megsemmisít a lizoszómák segítségével. Az autofágia (3) során intracelluláris sejtorganellumok megemésztése folyik, szintén lizoszómák segítségével. A fenti folyamatok szekunder lizoszómákat (SL) eredményeznek, amelyek végül reziduális testekké s r södnek (4) és kiürülhetnek a sejtb l (5). A pinocitózissal bekerül anyagok multivezikuláris testekbe (MVB) kerülhetnek (7): a MVB maga is lizoszóma-szer képlet és feltehet en szekunder lizoszómává alakul majd. A fagocitózis során (8) bekebelezett részecskék lizoszómákkal kerülnek kapcsolatba, és a fagoszóma (9) emészt vakuólummá (ami tulajdonképpen a szekundér lizoszóma egyik változata), majd pedig reziduális testté alakul. Végül, sajátos mechanizmussal, egyes sejtek primér lizoszómáik tartalmát az extracelluláris térbe üríthetik (10). Ilyen sejttípus az osteoclast. NU: sejtmag; ER: endoplazmás retikulum.

55

11. ÁBRA: A mitokondrium elektronmikroszkópos vázlata. A két unit membrane közötti teret nyilak jelölik. A bels térben a matrix található (pontozott terület). A matrixban helyenként elektrondenz szemcsék t nnek el , amelyekben többnyire kalcium és foszfor mutatható ki. A bels membrán cristákat képez.

56

12. ÁBRA: A vese proximális kanyarulatos csatornáiban a sejtek basalis részében rendezetten sorakozó nagy mitokondriumok alkotják a basalis csíkolatot (vastag nyilak). A hosszúkás mitokondriumokat a basalis sejtmembrán septumai választják el egymástól. A hámsejtek apicalis felszínén kefeszegély van. A szomszédos vese hámsejtek (vékony nyilak) bonyolult módon interdigitáló (id) laterális sejtmembránjai között jelent s anyagtranszport folyik. A hámsejt alatt basalis lamina (BL) helyezkedik el, a hámsejtek közelében pedig fenestrált capillarisok (fcap) vannak. A capillaris endothel fenestráit nyilak jelölik.

57

13. ÁBRA: A sejtmagot borító maghártya ún. perinuclearis cisternát (CT) alkot, amelynek citoplazmatikus felszínén ribosomák vannak. A maghártyát helyenként magpórusok (nyíl) szakítják meg ezek a nucleocytoplasmaticus transport helyei. H: heterochromatin; E: euchromatin.

58

14. ÁBRA: A magpórus bonyolult makromolekuláris komplexekb l áll, amelyek GTP-dependens mechanizmussal transzportálnak. A pórust globuláris komplexek alkotják, amelyek megkötik és egyben továbbítják a molekulákat (nyíl). CT: perinuclearis cisterna; NU: nucleoplasma; CITO: cytoplasma.

59

15. ÁBRA: A mikrotubulus felépítése vázlatosan. Az - és a -tubulin molekulák (a, b) heterodimert alkotnak és egymáshoz való viszonyuk ( a proximalis; b distalis) meghatározza a tubulus polaritását. A heterodimerek spirálisan rendez dnek tubulussá egy tubulust 13 dimer (illetve az azokból létrejöv hosszú protofilamentum) hoz létre a rajzon látható módon. A protofilamentum tengelyét szaggatott vonal jelzi. A mikrotubulus átmér je 24 nm.

60

16. ÁBRA: Az ostorok és csillók (kinociliumok) vázlatos keresztmetszete. A sejtmembránnal borított képlet mikrotubulusok rendszeréb l épül fel, amelyet axonema néven ismerünk. Az axonemában két egymáshoz kapcsolódó tubulus (TA és TB) van, amelyekhez különböz fehérjerendszerek köt dnek. Talán a D jel dynein a legfontosabb, mert ATPase tulajdonsága miatt a csillók mozgásáért felel s. A dynein karok párosával kapcsolódnak a tubuluspárokhoz: egy kívül, egy pedig belül van. A tubuluspárokat a nyíllal jelzett helyeken a nexin nev fehérje köti össze. A centrális tubuluspár (CT) és a perifériás 9 pár között a küll k (K) létesítenek kapcsolatot.

61

17. ÁBRA: A centriolum vázlatos szerkezete. A centriolum mikrotubulus tripletekb l (nyilak) áll, amelyeket összeköt hidak kapcsolnak egymáshoz. Ezek a hidak strukturálatlan elektrondenz képletekként vesszik körül a mikrotubulusokat. A csillók basalis testecskéi hasonló szerkezet ek.

62

18. ÁBRA: Neutrofil granulocita mozgása a köt szöveti alapállományban állábak (pseudopodiumok P, nyilak) segítségével. A pseudopodiumok sejtadhézió révén az extracelluláris kollagén rostkötegekhez (C) tapadnak (a molekuláris mechanizmust illet en lásd a 4. ábrát).

63

19. ÁBRA: A macrophag phagocytosis révén pusztítja el az extracelluláris térben lév idegen részecskéket (pl.: baktériumokat). A nyilakkal jelzett cytoplasma lebenyek körbeveszik az idegen testet, majd a csillaggal jelzett helyen a membránok fúziója következik be és a részecske internalizálódik. Számos lysosoma üríti enzimeit a phagosomába (PHS) és megkezd dik a lebontás. Végül egy ún. emészt vacuolum keletkezik (DV digestive vacuole), amely a secunder lysosomának majd pedig a residualis testnek felel meg.

64

20. ÁBRA: A receptor mediálta endocytosis lépései a low-density-lipoprotein (LDL) részecske példáján bemutatva. 1: az LDL membránreceptoraihoz köt dik, és a membrán citoplazmatikus oldalához clathrin molekulák kapcsolódnak a membrán kissé besüpped és létrejön az ún. coated pit . 2: a clathrinnal borított vezikula fokozatosan lef z dik, és; 3: a citoplazmába kerül mint tüskés (coated) vesicula, amelynek belsejében ott van a receptorhoz kötött LDL részecske. 4: a clathrin burok leválik és az endosoma folytatja útját. 5: az endosomához egy szétkapcsoló vesicula csatlakozik és az endosoma bels pH-ja csökken; emiatt szétkapcsolódik: a receptorokat tartalmazó membránrész leválik és visszavándorol a felszíni membránhoz (7), azzal exocytosis útján egyesül (8) és a receptorok visszakerülnek a sejt felszínére. 6: az endosoma lysosomával (9) egyesül. 10: a lysosoma enzimei az LDL részecskét összetev ire bontják a zsírsavak, a koleszterol és az aminosavak különválnak.

65

21. ÁBRA: Az emberi kromoszómák idiogramja: a kromoszóma párok osztályozása nagyság, alak és a kinetocentrum elhelyezkedése szerint. A nemi kromoszómákat bekereteztük.

66 IRODALOMJEGYZÉK

Darnell, J., Lodish, H., Baltimore, D.: Molecular Cell Biology. Scientific American Books, 1986. De Robertis, E.D.P., Nowinski, W.W., Saez, F.A.:

Sejtbiológia. Akadémiai

Kiadó, 1974. Fawcett, D.W.: A Textbook of Histology. Saunders, 1986. Johnson, K.E.: Histology and Cell Biology. Williams & Wilkins, 1991. Junqueira, L.C., Carneiro, J., Kelley, R.O.: Basic Histology. Appleton & Lange, 1998.

Köszönetnyilvánítás A szerz ezúton mond köszönetet az ábrák elkészítésében nyújtott segítségért Dr. Dobó Endre egyetemi adjunktusnak, Bohata Csaba V. éves orvostanhallgatónak és Kara Mónika asszisztensn nek: mindannyian az Anatómiai Intézet munkatársai.