Návod k použití REF: PMP 018/PMP 017/ PMP 016/ PMP 020
Chromoprobe Multiprobe- CLL
Pouze pro profesionální použití Fluorescenční In Situ Hybridizace (FISH) je technika, která umožňuje detekci DNA sekvencí na kultivovaných metafázních chromozomech a interfázních jádrech z kultivovaných nebo nekultivovaných cytogenetických vzorků. Tato technika využívá DNA sondy, které hybridizují buď s celými chromozomy nebo s jednotlivými jedinečnými sekvencemi a slouží jako efektivní doplněk ke klasické cytogenetice. Cílová DNA je po fixaci a denaturaci připravená na vpuštění podobně denaturované fluorescenčně značené DNA sondy, která má komplementární sekvenci. Následuje hybridizace. Pomocí série rychlých bez-formamidových omytí se odstraní nenavázaná a nespecificky navázaná DNA sonda. Provede se podbarvení pro vizualizaci. Fluorescenční mikroskop umožňuje pozorování nahybridizované sondy na vybraném vzorku. Informace o sondě Souprava Chromoprobe Multiprobe CLL bylo vyrobená k detekci del(6q), trisomie 12, del (13q), del (17p), del (11q) a přestaveb IGH, které vedou k markerům 14+, k souběžnému provedení testu se vzorkem pacienta v jedné reakci FISH. Sondy byly vyrobené tak, aby dávaly jasné výsledky na nehezkých buňkách. Destička může být použitá pro počáteční stanovení diagnózy, konfirmaci nálezů v rutinní cytogenetice a rovněž pro monitorování pacienta. Destička rovněž obsahuje sondy k detekci t(11;14) umožňující rozlišení mezi pacienty s abnormální CLL a Centrocytickým lymfomem.
Specifikace sondy MYB Deletion MYB, 6q23, červená D6Z1, 6p11.1-q11.1, zelená
Sondy MYB je dlouhá 183Kb, značená červeně a pokrývá celý gen MYB a telomerickou oblast genu 173Kb dlouhou, náležící markeru AFMA074ZG9. Směs sond rovněž obsahuje sondu k detekci centr. 6 (D6Z1), značenou zeleně. Sonda pro výčet chromozomů 12 D12Z3, 12p11.1-q11.1, červená
Alfa satelitní sonda k detekci chromozomu 12 je značená červeně.
ATM Deletion ATM, 11q22.3, červená 11q12.1, zelená
Sonda ATM je dlouhá 180Kb, značená červeně a pokrývá telomerický konec genu NPAT a centromerický konec genu ATM, který náleží markeru D11S3347. Směs sond rovněž obsahuje kontrolní sondu 11q12.1, značenou zeleně, pokrývající oblast 122Kb včetně SHGC-154780 markeru a oblast 130Kb dlouhou včetně SHGC-110550 markeru. IGH/BCL2 Translocation, Dual Fusion BCL2, 18q21, červená IGH, 14q32.3, zelená
Produkt IGH/BCL2 se skládá ze sond značených zeleně, pokrývající konstantní a variabilní segmenty genu IGH a sondy 585Kb dlouhé značené červeně, pokrývající geny BCL2 a KDSR. IGH Breakapart IGHC, 14q32.3, červená IGHV, 14q32.3, zelená
IGH produkt se skládá ze sondy 124Kb dlouhé, značené červeně, pokrývající konstantní oblast genu a zeleně značené sondy dlouhé 617Kb, pokrývající variabilní segmenty genu. P53 Deletion P53, 17p13, červená D17Z1, 17p11.1-q11.1, zelená
Sonda P53 je 159Kb dlouhá, značená červeně, pokrývá celý gen P53 a je dále prodloužená o 66Kb telomericky ke genu a pokrývá centromerickou oblast ke genu, které náleží marker D17S655. Směs sond obsahuje kontrolní sondu pro centromerickou oblast chromozomu 17 (D17Z1), značenou zeleně. IGH/CCND1 Translocation, Dual Fusion CCND1 (BCL1), 11q13, červená IGH, 14q32.3, zelená
Produkt IGH/CCND1 se skládá ze sond značených zeleně pokrývající konstantní a variabilní segmenty genu IGH a CCND1 sond, značených červeně. Směs sond CCND1 obsahuje sondu dlouhou 155Kb centromericky od genu CCND1, pokrývající oblast mezi markery D11S2663 a D11S4095 a druhé sondy (159Kb) pokrývající telomerický konec genu CCND1 a oblast až ke gemu FGF3.
13q14.3 Deletion 13q14.3, červená 13qter, 13q34, zelená
Sonda 13q14.3, značená červeně, je zhruba 600Kb dlouhá a pokrývá oblast mezi markery D13S319 a D13S25. Subtelomericky specifická sonda 14qter ( klon 163C9) je značená zeleně a umožňuje identifikaci chromozomu 13 a slouží jako kontrolní sonda. Materiál obsažený v soupravě Každá souprava obsahuje následující reagencie, které jsou vhodné pro vyšetření 2 ( PMP018), 5 ( PMP017 ) nebo 10 ( PMP016) vzorků pacientů :
2, 5 nebo 10 destiček Chromoprobe Multirpobe –CLL obsahujících přímo značené sondy 4, 7 nebo 12 skleněných sklíček, potištěných speciální šablonou 500l hybridizačního činidla ( Formamid, Dextran Sulfát, SSC) 500l podbarvení ((DAPI antifade ES : 0.125g/ml DAPI (4,6 diamidino-2-phenylindole)) 1 destičkový povrchový teploměr 1 hybridizační komůrka
Souprava pro 20 stanovení se dodává ve formátu 4x5 destiček
Bezpečnostní opatření 1. Pouze pro diagnostické použití in vitro. Pouze pro profesionální využití. 2. Noste rukavice pokud manipulujete s DNA sondami a DAPI. 3. Hybridizační roztok obsahuje formamid, který je teratogen; nevdechujte výpary a zabraňte styku s kůží. Noste rukavice, laboratorní kabát a pracujte při zapnutém odsávači par. Po použití spláchněte velkým množství vody. 4. DAPI je potencionální karcinogen; zacházejte s opatrností, noste rukavice a laboratorní kabát. Po použití spláchněte velkým množstvím vody. 5. Všechen nebezpečný material by měl být zlikvidován dle vašich interních předpisů o likvidaci nebezpečného odpadu. Skladování a manipulace Souprava Chromoprobe Multiprobe-CLL by měla být skladována při 2-8°C do data expirace, uvedeného na etiketě výrobku. Nemrazte. Zkumavka obsahující DAPI musí být uskladněná v temnu. Materiál potřebný, nedodaný v soupravě 1. Ohřívací plotýnka (s pevným povrchem a přesnou kontrolou teploty do 80C) 2. Mikropipety a špičky různé velikosti – rozsah 1l - 200l 3. Vodní lázeň s přesnou kontrolou teploty při 72C 4. Mikrocentrifugační zkumavky (0.5 ml)
5. Fluorescenční mikroskop ( viz sekce doporučení pro fluorescenční mikroskop ) 6. Plastové nebo skleněné nádoby 7. Kleště 8. Kvalitní imerzní olej pro fluorescenční mikroskop 9. Ohřívací plotýnka s pevným povrchem 10. Krycí sklíčka ( 24x50mm) 11. Stopky 12. Vodní lázeň s přesnou kontrolou teploty při 37*C bez míchání Doporučení fluorescenčního mikroskopu Pro optimální vizualizaci sondy doporučujeme 100 watovou rtuťovou výbojku a planapochromatické objektivy 63x nebo 100x. Trojpásmový filtr DAPI/FITC/Texas Red je optimální pro prohlížení všech fluorochromů a DAPI současně. Příprava vzorků Souprava Chromoprobe Multiprobe – CLL je určená pro použití se vzorky kultivovaných fixovaných buněk periférní krve a kostní dřeně. Tyto by měly být připravené dle laboratorních směrnic. Naneste připravené vzorky ( volně uschnuté ) na skleněnou desku se sondami Chromoprobe Multiprobe-CLL dle níže uvedeného návodu. Zapékaní nebo zestaršování sklíček se nedoporučuje, může způsobit slabší fluorescenční signál. Chromoprobe Multiprobe protokol Nezapomeňte: Sondy použité na destičce Chromoprobe Multiprobe-CLL jsou přímo značené pomocí fluorochromů, které jsou citlivé na světlo. Zabraňte zbytečnému kontaktu se světlem ( není potřeba pracovat ve tmě ). 1.Příprava skla a, Očistěte skleněné sklíčko se speciálním potiskem. Ponořte na 2 minuty do 100% metanolu a utřete jemnou čistou tkaninou b, Zajistěte správný mitotický index. Je důležité, aby měl vyšetřovaný vzorek dostatečně vysoký mitotický index k umožnění detekce chromozomálních abnormalit. Pro ověření hustoty vzorku použijte mikropipetu ( např. Gilson P10 nebo P20) – napipetujte 4µl buněčné suspenze na jeden ze čtverců natištěného sklad a nechte volně uschnout. Malé množství použitého vzorku znamená, že je potřeba jemně se dotknout pipetou skla a vzorek rozetřít. Pozorujte pod fázovým kontrastním mikroskopem. Pokud je hustota buněk příliš vysoká, nařeďte suspenzi s čerstvým fixativem. Pokud je mitotický index příliš nízký, odstřeďte fixovanou buněčnou suspenzi při 160xg 10 minut. Najděte supernatant, odstraňte a vložte buněčný sediment do malého množství čerstvého fixativu. Pokud se hustota používaného vzorku změnila, naneste 4µl koncentrovaného vzorku na další čtverec potištěného skla a znovu ověřte pod fázovým kontrastním mikroskopem. Nezapomeňte: 50µl je minimální množství potřebné k provedení testu c, Kontrola kvality vzorků. Mělo by být ověřené množství cytoplasmy ve vzorku, protože může narušit in situ protokol. Pokud se chroromozomy při pozorování pod fázovým mikroskopem jeví jako uzavřené granulovaným materiálem, může to způsobit horší výsledky. Jedna z metod vedoucí k odstranění cytoplasmy je: naneste 4µl vzorku na potištěné sklíčko a pozorujte jak se fixativ rozprostírá – v normální situaci se fixativ rozprostře na maximum, ustoupí a poté se vypaří. Pro vyčištění cytoplasmy jsme zjistili, že můžeme dosáhnout efektivních výsledků, když čerstvá kapka fixativu spadne na čtverec v bodě, ve kterém dosáhlo rozprostření fixativu maxima. Nechte fixativ vypařit a opět zkontrolujte pod mikroskopem. d, Nanášení vzorku na speciálně potištěné sklo. Napipetujte 4µl buněčné suspenze na všech 8 ploch ve sledu jak je popsáno níže. Toto zamezí rozprostření buněk jedné přes druhou.
3
1
6
8
e, Jakmile uschne první skupina nanesených kapek, nakápněte na zbývající čtverce stejným způsobem 4µl suspenze. Jakmile sklo uschne, ověřte pod fázovým kontrastním mikroskopem jestli jste nezapomněli nakápnout některý ze čtverců. Pokud jste na některý ze čtverců zapomněli nebo je na některých pouze několik málo buněk, jednoduše napipetujte tyto místa znovu; není potřeba nanášet suspenzi na nové sklo. Pokud po ověření skla zjistíte, že čtverce mají nedostatečné množství buněk/metafází, můžete přidat další suspenzi k dosažení větší hustoty buněk. Nezapomeňte: Pokud jsou metafáze buněk rozprostřené do jiných čtverců, omyjte nové speciálně potištěné sklo v metanolu a znovu naneste suspenzi a nechte každou kapku uschnout před nanesením další. Příprava multisondy a skla se vzorky a, Vložte hybridizační komůrku obsaženou v soupravě do vodní lázně při 37°C a nechte ji zahřát na tuto teplotu. Může to trvat až hodinu než se vodní lázeň po zapnutí zahřeje. b, Promíchejte hybridizační roztok pipetou a předehřejte 25µl na 37°C alikvotně na destičku. Rovněž předehřejte každou destičku tak, že ji položíte na ohřívací plotýnku při 37°C potištěnou stranou dolů. Nedotýkejte se povrchu destičky. c, Ponořte skleněné potištěné sklíčko obsahující fixované vzorky do 2xSSC na 2 minuty při pokojové teplotě bez třepání. d, Zatímco se stále destička předehřívá při 37°C, vysušte sklíčko se vzorky v etanolové řadě ( každý 2 minuty, 70%, 85% a 100% ) při pokojové teplotě. Nechte volně uschnout a položte na ohřívací plotýnku při 37°C. e, Přidejte 2µl předehřátého hybridizačního roztoku na každý z 8 čtverců předehřáté destičky pomocí P10 mikropipety. Při tomto korku je destička stále položená na ohřívací plotýnce při 37°C. Spojení skla se vzorky s destičkou se sondami a, Opatrně obraťte sklo se vzorky nad destičku se sondami tak, aby číslo 1, které je nyní převrácené směrem dolů, bylo umístěné nad povrch pravé strany destičky se sondami – viz. obrázek
Obrázek 1. Poloha sond na destičce Chromoprobe Multiprobe – CLL b, Ujistěte se, že sklíčko se sondami je důkladně spojené s odpovídajícími čtverci na destičce. Opatrně spusťte sklo nad destičkou tak, aby kapky hybridizačního roztoku byly v kontaktu s destičkou a sklem. Jemně přitiskněte k sobě a ujistěte se, že je hybridizační roztok rozprostřený i na koncích každého ze čtverců. c, Opatrně obraťte destičku, tak, že uchopíte matné konce skleněné destičky a otočíte – takže sklo se vzorky je pod destičkou se sondami. Ujistěte se, že destička nepřesahuje přes sklo se sondami – toto by mohlo způsobit cross-kontaminaci sond. d, Položte na ohřívací plotýnku nebo do inkubátoru na 10 minut při 37°C. Návod k použití destičkového teploměru a, Před provedením denaturace, by měla být ověřená teplota plotýnky 75°C pomocí destičkového teploměru, který je součástí soupravy. b, Pro správné použití teploměru položte na povrch ohřívací plotýnky a vyčkejte až různé segmenty teploměru přestanou měnit barvu. Aktuální teplota je indikována pomocí tmavě modrého zbarvení.
Nezapomeňte: a, Pokud segmenty vypadají granulovaně a barvy nejsou stejnoměrné a pravidelné, měl by být teploměr zlikvidován, protože uplynula doba jeho použití. Životnost každého teploměru by měla být dostačující pro provedení 10 testů s multisondou. b, tento teploměr je destička s kapalnými krystaly vhodná pro více použití. Mělo by se sním zacházet s opatrností pro zajištění rozumné životnosti. Teploměr by se měl používat pouze k ověření teploty ohřívací plotýnky, nesmí se používat k monitorování výkonu plotýnky po celou dobu práce.
Denaturace Nezapomeňte: PCR cykler NENÍ vhodný k použití namísto pevného povrchu ohřívací plotýnky a, Položte destičku na ohřívací plotýnku. Zvláště dbejte nato, abyste ji přemístili v rovnoměrné hladině. Ujistěte se, zda je destička ve správném kontaktu s ohřívací plotýnkou . b, Denaturujte na ohřívací plotýnce při 75°C 2 minuty. Hybridizace Vložte destičku do předehřáté hybridizační komůrky, zakryjte víčkem a nechte komůrku plavat ve vodní lázni při 37°C přes noc. Nezapomeňte: a, Nezalepujte víko na hybridizační komůrce b, Nezakrývejte vodní lázeň víkem c, Nehybridizujte v inkubátoru d, Zajistěte, aby hybridizační komůrka byla zcela suchá ( tzn. žádná voda nebo vlhká tkanina uvnitř komůrky ). Vlhkost uvnitř komůrky je nezbytná pro optimální hybridizaci. Post-hybridizační omytí Nezapomeňte: Neomývejte více než 2 destičky najednou a, Sejměte opatrně destičku ze skla b, Ponořte sklo do 0.4xSSC ( pH 7.0) při 72°C na 2 minuty bez třepání c, Nechte odtéci přebytečnou kapalinu a ponořte do 2xSSC, 0.05% Tween-20 při pokojové teplotě ( pH 7.0) na 30 sekund bez třepání Nanesení DAPI a vizualizace výsledků a, Nechte odtéci přebytečnou kapalinu a napipetujte 20µl DAPI na každý konec skla. b, Přikryjte krycím sklíčkem ( 24x50mm), odstraňte všechny bubliny a nechte vyvinout barvu v temnu 10 minut. c, Pozorujte pomocí fluorescenčního mikroskopu Nezapomeňte: Některé typy mikroskopů mají držák sklíček, který ztěžuje pozorování krajních konců skla. V tomto případě jednoduše otočte sklo o 180°, což pomůže při pozorování skla. Stabilita výsledných sklíček Nafishované skla by měly být analyzovatelné až 1 měsíc, pokud jsou uložené v temnu a při pokojové teplotě. Doporučení při postupu 1. Zapékání nebo zestaršování sklíček se nedoporučuje, může to způsobit slabší fluorescenční signál. 2. Hybridizační podmínky mohou být nepříznivě ovlivněné použitím jiných reagencí které doporučuje nebo dodává Cytocell Ltd. 3. Používejte kalibrovaný teploměr pro měření teploty roztoků, vodní lázně a teploty inkubátorů. Tyto teploty jsou rozhodující pro optimální provedení testu.
4. Koncentrace omývacích roztoků, jejich pH a teplota jsou důležité, protože nízká stringence může způsobit nespecifické navázání sondy a vysoká stringence může způsobit chybění signálu. 5. Nekompletní denaturace může mít za výsledek chybění signálu nebo dlouhá denaturace může rovněž způsobit nespecifické navázání sondy. Očekávané výsledky MYB Deletion V normální buňce by měly být viditelné 2 červené a dva zelené signály (2R, 2G ). Zatímco v buňce s delecí MYB byste měli vidět jeden červený a dva zelené signály ( 1R, 2G ). Chromosome 12 Enumeration V normální buňce by měly být vidět dva červené signály ( 2R ), v buňce s trizomií 12 by měly být vidět tři červené signály ( 3R ). ATM Deletion V normální buňce by měly být viditelné 2 červené a dva zelené signály (2R, 2G ). Zatímco v buňce s delecí ATM byste měli vidět jeden červený a dva zelené signály ( 1R, 2G ). IGH/BCL2 Translocation, Dual Fusion V normální buňce by měly být viditelné samostatně červený a zelený signál, jeden pro každý homolog ( ve výsledku 2R, 2G ). Při t(14;18)(q32.3;q21) vzorku pacienta by měly být vidět dva žluté fúzní signály a dále jeden zelený a jeden červený signál z normálních chromozomů ( 1R, 1G, 2Y ). IGH Breakapart V normální buňce by měly být viditelené dva červeno/zelené ( nebo žluté-fúzní ) signály. V buňce s monoalelickou translokací IGH by měl být zřetelně vidět jeden červený a jeden zelený signál a dále jeden červeno/zelený ( nebo jeden fúzní-žlutý) signál normálního chromozomu 14 ( 1R, 1G, 1Y ). V případě bialelické translokace by neměly být vidět žádné fúzní signály a měly by být jasně vidět 2 červené a dva zelené signály ( 2R, 2G ), P53 Deletion V normální buňce by měly být viditelné 2 červené a dva zelené signály (2R, 2G ). Zatímco v buňce s delecí P53 byste měli vidět jeden červený a dva zelené signály ( 1R, 2G ). IGH/CCND1 Translocation, Dual Fusion V normální buňce by měly být viditelné samostatně červený a zelený signál, jeden pro každý homolog ( ve výsledku 2R, 2G ). Při t(11;14)(q13;q32.3) vzorku pacienta by měly být vidět dva žluté fúzní signály a dále jeden zelený a jeden červený signál z normálních chromozomů 11 a 14 ( 1R, 1G, 2Y ). 13q14.3 Deletion V normální buňce by měly být viditelné 2 červené a dva zelené signály (2R, 2G ). Buňka s hemizygotní delecí 13q14.3 by měla vykazovat jeden červený a dva zelené signály ( 1R, 2G). Buňka s homozygotní delecí by neměla vykazovat žádný červený signál a dva zelené signály ( 0R, 2G ).
