Chem. Listy 106, 200205(2012)
Cena Merck
vesikulace13, založenou na rozpadu agregátů přítomných v koncentrovaném vodném zásobním roztoku fosfolipidu při jeho titraci do vodného prostředí a spontánní tvorbě nových, menších a v daném prostředí stabilnějších částic. Kritické koncentrace, při nichž dochází ke změnám ve velikosti a struktuře fosfolipidových agregátů, jsou parametry důležité z hlediska jejich praktické aplikace. Ke stanovení kritické micelární koncentrace (CMC) fosfolipidů se používají různé metody, např. měření indexu lomu14, rozptylu světla a povrchového napětí15, NMR (cit.16), diferenční skenovací kalorimetrie17 či měření fluorescence18. Proces formování liposomů byl sledován také konduktometrií13 a nefelometrií19. Pro charakterizaci velikosti, tvaru a lamelarity připravených liposomů se používá transmisní elektronová mikroskopie20,21. Tato metoda je využívána také ke studiu interakce mezi liposomy a surfaktanty22. K určení kritických agregačních koncentrací povrchově aktivních látek (PAL) lze využít i rychlých a experimentálně nenáročných elektroanalytických metod23. Vedle již zmíněné konduktometrie lze CMC určit adsorpční24 nebo cyklickou voltametrií25 nepřímo ze změn proudového signálu elektrochemicky aktivní látky (sondy) přidané do roztoku PAL. Přímé určení CMC pomocí AC polarografie (tenzametrie) využívá změny potenciálu nebo výšky kapacitních (obvykle desorpčních) píků PAL v závislosti na její koncentraci v roztoku26. Tato práce se zabývá studiem agregace fosfolipidu 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholinu (DSPC, obr. 1) v procesu spontánní revesikulace13 s cílem určit kritické agregační koncentrace DSPC. K tomuto účelu byla využita instrumentálně jednodušší a dostupnější modifikace tenzametrie založená na měření kapacitních proudů cyklickou voltametrií s visící rtuťovou kapkovou elektrodou. Tato metoda umožnila sledovat také rychlost tvorby agregátů. Pro porovnání byly kritické agregační koncentrace DSPC určeny i nefelometricky. K zobrazení micel a liposomů utvořených v různě koncentrovaných roztocích fosfolipidu byla použita transmisní elektronová mikroskopie.
STUDIUM AGREGACE FOSFOLIPIDOVÝCH MOLEKUL HANA ŠVECOVÁa*, JITKA SOUČKOVÁ a, JANA SKOPALOVÁ a, RADKO NOVOTNÝ b a PETR BARTÁK a a
Katedra analytické chemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci, 17. listopadu 12, 771 46 Olomouc, b Laboratoř mikroskopických metod, Lékařská fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci, I. P. Pavlova 25, 775 20 Olomouc
[email protected] Došlo 30.6.11, přijato 23.9.11. Klíčová slova: fosfolipidy, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholin, cyklická voltametrie, rtuťová kapková elektroda, nefelometrie, micely, liposomy, spontánní revesikulace Úvod Fosfolipidy jsou velmi důležitou skupinou lipidů, neboť jsou základním stavebním prvkem buněčných membrán. Hojně se nacházejí zejména v myelinových obalech nervových buněk, semenech či vejcích. Amfifilní molekuly fosfolipidů, tvořené dvěma hydrofobními řetězci mastných kyselin esterově vázanými na hydrofilní sn-glycero-3-fosfátový skelet, spontánně agregují ve vodném prostředí1. V závislosti na jejich koncentraci v roztoku se tvoří micely, dvojvrstvy či sférické duté váčky (vesikuly, liposomy)2, které nalezly široké uplatnění jako modely biologických membrán v mnoha vědních oborech a průmyslových odvětvích, především ve farmacii a lékařství3, kosmetice či potravinářském průmyslu4. Fosfolipidové liposomy mohou nabývat různých velikostí (25 nm až 150 m) a struktury (unilamelární, multilamelární)5 v závislosti na způsobu jejich přípravy. Liposomy připravené z roztoků fosfolipidů v organických rozpouštědlech (např. metodou vypařování reverzní fáze6, injekční metodou7, metodou rychlé výměny rozpuštědla8 nebo mechanickými metodami9) nebo s přídavkem tenzidů10 mohou obsahovat zbytky rozpouštědel a pomocných látek, které jsou nežádoucí pro některé aplikace v medicíně, biologii či analytické chemii (např. při použití liposomů jako stacionární a pseudostacionární fáze v kapalinové chromatografii a kapilární elektroforéze11,12). K přípravě „čistých“ liposomů nekontaminovaných stopami pomocných látek lze použít metodu tzv. spontánní re-
CH3 H3C N
+
CH3
O
O C (CH2)16CH3
O
O
P O
O C (CH2)16CH3 O
O
-
Obr. 1. Strukturní vzorec 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholinu (DSPC)
* Hana Švecová tuto práci úspěšně prezentovala na soutěži O cenu firmy Merck 2011 za nejlepší studentskou vědeckou práci v oboru analytická chemie 200
Chem. Listy 106, 200205(2012)
Cena Merck
Experimentální část
Kinetické měření Pro sledování kinetiky formování micel, resp. liposomů během procesu spontánní revesikulace cyklickou voltametrií byl použit následující postup: do voltametrické nádobky s 10 ml 1·103 mol l1 fosfátového pufru (pH 7,0) byl postupně nadávkován zásobní koloidní roztok DSPC (1·103 mol l1) do výsledné koncentrace 1,4·104 mol l1, resp. 3,3·104 mol l1. V průběhu 60 min byly v pravidelných časových intervalech zaznamenávány cyklické voltamogramy za experimentálních podmínek uvedených výše.
Reagencie 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholin (DSPC, 99%, Sigma-Aldrich), voda redestilovaná (z roztoku KMnO4 v křemenné aparatuře), kyselina fosforečná (p.a., 85%, Lachema, Brno), hydroxid sodný (p.a., Lach-ner, Neratovice), dusík (99,99%), 1% roztok octanu uranylu (p.a., Fluka-Chemika, Švýcarsko). Aparatura Cyklické voltamogramy byly zaznamenávány na přístroji Eco-Tribo-Polarograf (Polaro-Sensors, Praha). Měření probíhalo v tříelektrodovém zapojení s pracovní visící rtuťovou kapkovou elektrodou (HMDE, Polaro-Sensors, Praha), referentní argentchloridovou elektrodou (Ag/ AgCl/1M-KCl, Monokrystaly, Turnov) a pomocnou platinovou elektrodou (Elektrochemické Detektory, Ohrazenice). K homogenizaci zásobního koloidního roztoku DSPC byla použita třepačka Vortex Genius 3 (IKA Werke, Staufen, Německo) a ultrazvuková lázeň Sonic 6 (Polsonic, Varšava, Polsko). Vzorek byl dávkován automatickou byretou (ABU 80, Radiometer, Kodaň, Dánsko). Konstantní teplota byla udržována termostatovou lázní Haake B3 s ponorným oběhovým čerpadlem C1 (vše Haake, Karlsruhe, Německo). Pro nefelometrické studium byl použit turbidimetr TN-100 (Eutech Instruments, Singapur). Fosfolipidové agregáty byly pozorovány a fotografovány mikroskopem JEOL JEM 2010 s kamerou MORADA a programem iTEM (Olympus SIS) s urychlovacím napětím 100 kV.
Elektronová mikroskopie Vzorky pro pozorování transmisním elektronovým mikroskopem byly připraveny metodou negativního kontrastování následujícím způsobem: na kapku (50 l) zásobního koloidního roztoku DSPC (1,4·104 mol l1, resp. 3,3·104 mol l1 v 1·103 mol l1 fosfátovém pufru, pH 7,0), odebranou z objemové fáze roztoku, byla položena měděná síťka (s hustotou 200 ok na čtvereční palec) pokrytá nosnou formvarovou blankou. Po 5 min byla síťka na 1 min přenesena na kapku destilované vody a následně na 5 min na kapku kontrastovacího roztoku (1% roztok octanu uranylu). Přebytečný roztok byl odsát filtračním papírem a po zaschnutí byl vytvořený tenký film pozorován a fotografován mikroskopem.
Výsledky a diskuse Jak je patrné ze strukturního vzorce DSPC (obr. 1), molekula tohoto fosfolipidu neobsahuje elektrochemicky aktivní centrum, které by se mohlo redukovat na visící rtuťové kapkové elektrodě ve vodném prostředí. Proto lze předpokládat, že proudové píky na cyklických voltamogramech (obr. 2) mají kapacitní charakter. K potvrzení tohoto předpokladu byla v roztoku DSPC (5·105 mol l1) zaznamenána série voltamogramů s rychlostí polarizace pracovní elektrody v rozsahu od 0,01 V s1 do 1 V s1. Vynesením hodnot proudů jednotlivých katodických i anodických píků proti polarizační rychlosti byly získány lineární závislosti charakteristické pro kapacitní proudy. Podobně i závislosti logaritmu proudu píků na logaritmu polarizační rychlosti byly lineární se směrnicemi v rozmezí 0,83–0,98, tedy blízkými teoretické hodnotě 1,0 pro kapacitní proud28. Pozorované proudové píky na cyklických voltramogramech (obr. 2) tedy souvisejí se změnami kapacity elektrické dvojvrstvy v důsledku adsorpce fosfolipidu na povrch pracovní rtuťové elektrody, reorientace adsorbovaných částic a jejich desorpce z elektrodového povrchu. Při zvyšování koncentrace DSPC v roztoku byl pozorován nárůst výšky jednotlivých píků a také posun jejich potenciálů. Tento trend byl nejlépe patrný u adsorpčních píků v katodickém směru polarizace (výřez na obr. 2) a anodických desorpčních píků v potenciálové oblasti +100 až 100 mV. Závislosti potenciálu (obr. 3a) a proudu (obr. 3b) těchto anodických desorpčních píků na koncen-
Pracovní postupy Studium agregace Ze studované látky 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholinu byl připraven zásobní koloidní roztok o koncentraci 1·103 mol l1 (0,8 g l1) v redestilované vodě třepáním (30 min) a následným působením ultrazvuku (40 min) při kontrolované teplotě, která nepřesáhla 38 °C (teplota fázové přeměny DSPC je 54,5 ± 1,5 °C, cit.27). Takto připravený asociativní koloidní systém byl stabilní vůči koagulaci po dobu nejméně 24 hodin. Koloidní roztok DSPC byl postupně dávkován automatickou byretou do plášťové voltametrické nádobky se základním elektrolytem (1·103 mol l1 fosfátový pufr, pH 7,0). Po každém přídavku byl roztok důkladně po dobu 1 min promíchán a probublán dusíkem a po 20s klidové době byl zaznamenán cyklický voltamogram. Pracovní elektroda byla polarizována v rozsahu +0,1 až 2,0 V rychlostí 0,5 V s1. Všechna měření byla prováděna při teplotě 25,0 ± 0,5 °C. Při nefelometrickém sledování agregace DSPC byl použit stejný postup dávkování zásobního roztoku do fosfátového pufru. Po každém přídavku byla změřena intenzita rozptýleného světla pod úhlem 90°. 201
Chem. Listy 106, 200205(2012)
Cena Merck
Obr. 2. Cyklické voltamogramy pro různé koncentrace DSPC v roztoku: 6,6·105 mol l1 (1, ); 1,4·104 mol l1 (2, ---); 2,4·104 mol l1 (3, ···) a 3,2·104 mol l1 (4, -·-). Základní elektrolyt: 1·103 mol l1 fosfátový pufr, pH 7,0; rychlost polarizace HMDE 0,5 V s1. Výřez: úsek voltamogramu v katodickém směru polarizace v rozmezí potenciálů +0,1 až 0,15 V
regační koncentrace (CAC1) kolem 1·104 mol l1 neodpovídá počátku tvorby sférických micel z monomerů DSPC, ale může odpovídat kritické koncentraci, při které se mění velikost a tvar (morfologie) micel. Taková kritická agregační koncentrace byla popsána např. u dipalmitoylfosfatidylcholinu31. Druhá pozorovaná kritická agregační koncentrace (CAC2) může souviset s počátkem formování fosfolipidových dvojvrstev. Pro porovnání s výsledky voltametrického měření byla agregace DSPC během spontánní revesikulace sledována i nefelometricky. Postupně byla v prostředí fosfátového pufru (pH 7,0) zvyšována koncentrace této látky a měřena intenzita rozptýleného světla ve směru kolmém ke směru dopadajícího záření. Světlo se méně rozptyluje na malých částicích a více na částicích větších. S rostoucí koncentrací fosfolipidu roste počet částic, které rozptylují světlo, a tím se zvětšuje i turbidita. Na křivkách koncen-
traci DSPC v roztoku vykazují dva zřetelné zlomy, a to ve stejných koncentračních oblastech první kolem 1·104 mol l1, druhý při 2·104 mol l1 (přesnější hodnoty vypočítané jako průsečíky regresních křivek proložených experimentálními body jsou uvedeny v tab. I). Tyto zlomy mohou být způsobeny kvalitativními změnami v elektrické dvojvrstvě u pracovní elektrody, např. v důsledku změn ve vzájemných interakcích a uspořádání molekul adsorbovaných v mezifází elektroda/roztok. Podobné zlomy na závislostech potenciálů polarografických desorpčních vln na koncentraci tenzidů v roztoku byly pozorovány a využity k určení kritických micelárních koncentrací již dříve29. Kritické micelární koncentrace fosfatidylcholinů se dvěma nasycenými acylovými řetězci klesají s rostoucím počtem uhlíkových atomů v řetězci od desítek nmol l1 u dilauroylfosfatidylcholinu po desetiny nmol l1 u dipalmitoylfosfatidylcholinu30. Je tedy zřejmé, že nalezená kritická ag-
Tabulka I Stanovené kritické agregační koncentrace (CAC) 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholinu vyjádřené intervaly spolehlivosti na hladině významnosti = 0,02 (kritická hodnota Studentova rozdělení tα = 4,54) Metoda
CAC1 1
Cyklická voltametrie Nefelometrie
E = f (c) I = f (c)
[mmol l ] 0,101 ± 0,020 0,094 ± 0,010 0,066 ± 0,025 202
CAC2 1
[mg l ] 80 ± 16 74 ± 8 52 ± 20
1
[mmol l ] 0,222 ± 0,023 0,191 ± 0,010 0,237 ± 0,023
[mg l1] 175 ± 18 151 ± 8 187 ± 18
Chem. Listy 106, 200205(2012)
Cena Merck
a
b
Obr. 4. Závislost zákalu na koncentraci DSPC v roztoku fosfátového pufru (pH 7,0). Hodnoty zákalu jsou vyjádřeny v nefelometrických jednotkách zákalu (NTU)
a Obr. 3. Závislost potenciálu (a) a proudu (b) anodického desorpčního píku v potenciálové oblasti 20 až 70 mV na koncentraci DSPC v roztoku fosfátového pufru (pH 7,0)
trační závislosti turbidity jsou také patrné zlomy (obr. 4), a to ve stejných oblastech koncentrace jako v závislostech získaných cyklickou voltametrií. Hodnoty kritických agregačních koncentrací vypočítané z průsečíků regresních křivek jsou uvedeny v tab. I. Uvedené výsledky potvrzují, že agregace DSPC sledovaná cyklickou voltametrií jako změny v kapacitě elektrodové dvojvrstvy probíhá nejen na povrchu elektrody, ale i v celém objemu roztoku fosfolipidu při stejných koncentracích. Cyklickou voltametrií byla dále sledována rychlost ustalování rovnováhy ve studovaném systému obsahujícím DSPC v koncentracích 1,4·104 mol l1 (mezi CAC1 a CAC2) a 3,3·104 mol l1 (nad CAC2). Na voltamogramech zaznamenaných v řádově minutových intervalech v průběhu 60 min (obr. 5a) se projevil výrazný pokles kapacitního proudu v katodickém směru polarizace v potenciálové oblasti kolem 0,25 V. Vynesením hodnot kapacitního proudu odečtených při tomto potenciálu proti času byly získány závislosti (obr. 5b), z nichž je patrné, že v roztoku, který obsahoval menší agregáty fosfatidylcholinu, došlo k ustálení rovnováhy po 35 min, kdežto v roztoku s vyšší koncentrací DSPC bylo rovnováhy dosaženo již po 20 min. Předpokládáme, že při dávkování zásobního roztoku do vodného prostředí dochází k rozpadu velkých agregátů (liposomů) přítomných v zásobním roztoku. Formování malých částic při nižších koncentracích DSPC je časově náročnější proces než tvorba částic větších, neboť při něm dochází k rozsáhlejším strukturálním změnám
b
Obr. 5. (a) Cyklické voltamogramy DSPC (c = 1,4·104 mol l1) zaznamenané v časech 25 min (―), 30 min (---), 35 min (···) a 40 min (-·-·) od přípravy roztoku. Základní elektrolyt: 1·103 mol l1 fosfátový pufr, pH 7,0; rychlost polarizace HMDE 0,5 V s1. (b) Závislost kapacitního proudu DSPC na čase. Koncentrace DSPC: 1,4·104 mol l1 (●) a 3,3·104 mol l1 (○); hodnoty proudu odečítány při potenciálu 250 mV
203
Chem. Listy 106, 200205(2012)
Cena Merck
dávkovaných fosfolipidových agregátů. Proto je formování malých agregátů pomalejší a rovnováha v roztoku se ustaví po delší době. K určení velikosti a zastoupení agregátů DSPC zformovaných při postupné titraci koncentrovaného roztoku DSPC do vodného prostředí bylo použito transmisního elektronového mikroskopu. Pro pozorování byly vybrány stejné koncentrace DSPC jako pro kinetická měření: první v oblasti mezi CAC1 a CAC2 (1,4·104 mol l1), druhá nad CAC2 (3,3·104 mol l1). Příprava vzorků byla provedena metodou negativního kontrastování, která se běžně používá pro studium struktury buněčné membrány. Snímek pořízený s roztokem 1,4·104 mol l1 DSPC (obr. 6) zobrazuje vedle velmi malých agregátů (micel) s průměrem do 10 nm i velké množství větších micel s přibližně dvojnásobným průměrem kolem 20 nm. To potvrzuje naši hypotézu vytvořenou na základě výsledků voltametrického a
nefelometrického měření, že při CAC1 se začínají přeměňovat menší micely DSPC ve větší agregáty. Kromě nich lze na snímku pozorovat i několik původních liposomů z koncentrovaného zásobního roztoku (velikost do 500 nm). Snímek roztoku s vyšší koncentrací DSPC (3,3·104 mol l1) na obr. 7 ukazuje značné množství liposomů různých velikostí (100–500 nm) a větší micely (s průměrem kolem 20–25 nm). Toto pozorování je v souladu s výsledky voltametrických a nefelometrických experimentů a tedy s předpokladem, že při CAC2 dochází k formování liposomů. Autoři děkují za finanční podporu tohoto výzkumu Ministerstvu školství, mládeže a tělovýchovy České republiky (projekt MSM 6198959216) a Univerzitě Palackého (projekt PrF_2011_025). LITERATURA 1. Holmberg K., Jönsson B., Kronberg B., Lindman B.: Surfactants and Polymers in Aqueous Solution. J. Wiley, Chichester 2003. 2. Weissman G., Sessa G.: J. Lipid Res. 9, 310 (1968). 3. Torchilin V. P., Weissig V. (ed.): Liposomes: A Practical Approach. Oxford University Press, New York 2003. 4. Lasic D. D., Barenholz Y. (ed.): Handbook of Nonmedical Applications of Liposomes. CRC Press, Boca Raton 1996. 5. Bilek G., Kremser L., Blaas D., Kenndler E.: J. Chromatogr., B 841, 38 (2006). 6. Hope M. J., Bally M. B., Mayer L. D., Janoff A. S., Cullis P. R.: Chem. Phys. Lipids 40, 89 (1986). 7. Vemuri S., Rhodes C. T.: Pharm. Acta Helv. 70, 95 (1995). 8. Buboltz J. T., Feigenson G. W.: Biochim. Biophys. Acta 1417, 232 (1999). 9. Bangham A. D.: Prog. Biophys. Mol. Biol. 18, 29 (1968). 10. Enoch H. G., Strittmatter P.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 145 (1979). 11. Wiedmer S. K., Jussila M. S., Riekkola M. L.: Trends Anal. Chem. 23, 562 (2004). 12. Pascoe R. J., Foley J. P.: Electrophoresis 24, 4227 (2003). 13. Megová M., Müller L., Barták P.: Acta Univ. Palacki Olomuc., Fac. Rerum Natur. Chemica 47, 1 (2007). 14. Roholt O. A., Schlamowitz M.: Arch. Biochem. Biophys. 94, 364 (1961). 15. De Haas G. H., Bonsen P. P. M., Pieterson W. A., van Deenen L. L. M.: Biochim. Biophys. Acta 239, 252 (1971). 16. Allgyer T. T., Wells M. A.: Biochemistry 18, 4354 (1979). 17. Johnson R. E., Wells M. A., Rupley J. A.: Biochemistry 20, 4239 (1981). 18. Burns Jr. R. A., Friedman J. M., Roberts M. F.: Biochemistry 20, 5949 (1981).
Obr. 6. Snímek roztoku DSPC (c = 1,4·104 mol l1) z transmisního elektronového mikroskopu. Elektrolyt: 1·103 mol l1 fosfátový pufr, pH 7,0; negativní kontrastování 1% roztokem octanu uranylu. Měřítko 500 nm
Obr. 7. Snímek roztoku DSPC (c = 3,3·104 mol l1) z transmisního elektronového mikroskopu. Elektrolyt: 1·103 mol l1 fosfátový pufr, pH 7,0; negativní kontrastování 1% roztokem octanu uranylu. Měřítko 0,5 m
204
Chem. Listy 106, 200205(2012)
Cena Merck
H. Švecováa, J. Součkováa, J. Skopalováa, R. Novotnýb, and P. Bartáka (a Department of Analytical Chemistry, Faculty of Science, Palacký University, Olomouc, b Laboratory of Microscopy Methods, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacký University, Olomouc): Study of Aggregation of Phospholipid Molecules
19. Stuart M. C. A., Boekema E. J.: Biochim. Biophys. Acta 1768, 2681 (2007). 20. López-Pinto J. M., González-Rodríguez M. L., Rabasco A. M.: Int. J. Pharm. 298, 1 (2005). 21. Genc R., Ortiz M., O'Sullivan C. K.: Langmuir 25, 12604 (2009). 22. de la Maza A., Parra J. L.: Biochem. J. 303, 907 (1994). 23. Nesměrák K., Němcová I.: Anal. Lett. 39, 1 (2006). 24. Ma Ch., Li G., Xu Y., Wang H., Ye X.: Colloids Surf., A 143, 89 (1998). 25. Mandal A. B., Nair B. U., Ramaswamy D.: Langmuir 4, 736 (1988). 26. Vollhardt D.: Colloid Polym. Sci. 254, 64 (1976). 27. Koynova R., Caffrey M.: Biochim. Biophys. Acta 1376, 91 (1998). 28. Gosser D. K. Jr.: Cyclic Voltammetry: Simulation and Analysis of Reaction Mechanisms. VCH Publishers, New York 1993. 29. Shinozuka N., Suzuki H., Havano S.: Kolloid Z. Z. Polym. 248, 959 (1971). 30. http://www.avantilipids.com, staženo 14. března 2011. 31. Li J. B., Miller R., Vollhardt D., Möhwald H.: Thin Solid Films 327-329, 84 (1998).
The behavior of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DSPC) was studied in spontaneous revesiculation used in preparation of liposomes uncontaminated with residues of organic solvents or surfactants. Cyclic voltammetry at hanging Hg drop electrode, nephelometry and transmission electron microscopy were used to study the aggregation of DSPC. Changes in current and potential of voltammetric charging peaks, similar to those due to formation of micelles in surfactant solutions, were investigated at certain concentrations of phospholipids in neutral phosphate buffer. Simultaneously, changes in turbidity of DSPC solutions were recorded. These concentrations have been characterized as critical aggregation concentrations (0.07–0.10 and 0.19–0.24 mmol l1).
205
