Biotransformasi Metabolit Sekunder Utama (Senyawa X) dari Ekstrak n- Heksana Kencur (Kaempferia galanga L.) Oleh Jamur Aspergillus niger ATCC 6275

i

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Biotransformasi Metabolit Sekunder Utama (Senyawa X) dari Ekstrak n- Heksana Kencur (Kaempferia galanga L.) Oleh Jamur Aspergillus niger ATCC 6275

SKRIPSI

HENY SUKMAWATI 108102000039

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA JANUARI 2013

i

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Biotransformasi Metabolit Sekunder Utama (Senyawa X) dari Ekstrak n- Heksana Kencur (Kaempferia galanga. L) Oleh Jamur Aspergillus niger ATCC 6275

SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Far)

HENY SUKMAWATI 108102000039

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA JANUARI 2013

ii


iii

iii


iv

iv


v

v


vi ABSTRAK

Nama

: Heny Sukmawati

Program Studi

: Farmasi

Judul

: Biotransformasi Metabolit Sekunder Utama (Senyawa X) dari Ekstrak n- Heksana Kencur (Kaempferia galanga L.) Oleh Jamur Aspergillus niger ATCC 6275

Biotransformasi adalah proses pengubahan senyawa menjadi senyawa turunannya yang strukturnya berbeda dari senyawa asalnya akibat aktivitas metabolisme suatu mikroorganisme. Minyak atsiri dari kencur (Kaempferia galanga. L) mempunyai kandungan α-pinen, kamphen, karvone, benzen, eucalyptol, borneol, metil sinamat, penta dekana dan komponen utamanya etil-p-metoksi sinamat. Kencur telah diketahui mempunyai bioaktivitas seperti mengobati hipertensi, pengobatan angina, asma, dan kejang otot. Karena banyaknya aktivitas farmakologis dari komponen metabolit sekunder utama dari kencur ini, maka dilakukan penelitian untuk melihat kemampuan dari suatu mikroorganisme dalam melakukan biotransformasi metabolit sekunder utama dari kencur. Mikroorganisme yang digunakan adalah jamur Aspergillus niger ATCC 6275 yang ditumbuhkan dalam medium Potato Dextrose Agar (PDA). Proses biotransformasi dilakukan setelah jamur Aspergillus niger dikultur selama 5 hari dalam medium Czapek- pepton kemudian senyawa metabolit sekunder yang telah berhasil diisolasi dari kencur (senyawa x) ditambahkan. Suspensi campuran biotransformasi tersebut diinkubasi pada suhu 30°C dengan kecepatan agitasi 100 rpm selama 3 hari. Setelah 3 hari, selanjutnya hasil biotransformasi diekstraksi dengan menggunakan pelarut nheksana dan kemudian dikeringkan dengan menggunakan vacuum rotary evaporator. Analisa hasil biotransformasi dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Hasil analisa menunjukkan bahwa jamur Aspergillus niger tidak mampu mentransformasi kandungan metabolit sekunder utama kencur. Kata kunci : Jamur Aspergillus niger, kencur (Kaempferia galanga L.), metabolit sekunder, biotransformasi.

vi


vii ABSTRACT

Name

: Heny Sukmawati

Study Program

: Pharmacy

Tittle

: Biotransformation Main Secondary Metabolite (X– Compound) of Extract n- Hexane Kencur (Kaempferia galanga L.) By Fungi Aspergillus niger ATCC 6275

Biotransformation is the procces converting of compound into derivate compound in which the structure is different from the origin compound because of the result microorganism metabolism activity. Essential oil kencur (Kaempferia galanga L.) contains like α-pinene, camphene, carvone, benzene, eucalyptol, borneol, methyl cinnamate, pentadecane and the major compounds is etil-p-methoxy cinnamate. Kencur have bioactivity like to treat hypertension, angina, asthma and muscle spasm. Because many pharmacological activity of the major secondary metabolite component from kencur, the research was carried out of microorganism to biotransforme of the major compounds isolated from kencur. The microorganism used is fungi Aspergillus niger ATCC 6275 which is planted in the Potato Dextrose Agar (PDA). The biotransformation was carried out after Aspergillus niger was incubated for 5 days, and then after that the secondary metabolit compound was added. The mixture was further incubated at 30°C, at speed agitation 100 rpm for 3 days. The product biotransformation was extracted by using n-hexane to give crude extract. The crude extract was analyzed by using thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC). The result showed that Aspergillus niger ATCC 6275 unable to transform the major secondary metabolite of kencur. Keyword: Fungi, Aspergillus niger, kencur (Kaempferia galanga L.), secondary metabolite, biotransformation.

vii


viii KATA PENGANTAR/UCAPAN TERIMA KASIH

Puji syukur saya panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas berkat dan rahmat-Nya, saya dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulisan skripsi ini dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. Saya Menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, dari masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi ini, sangatlah sulit bagi saya untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, saya mengucapkan terima kasih kepada: (1)

Ibu Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D., Apt. selaku pembimbing pertama dan Ibu Ofa Suzanti Betha, M.Si., Apt selaku pembimbing kedua, yang memiliki andil besar dalam proses penelitian dan penyelesaian tugas akhir saya ini, semoga segala bantuan dan bimbingan ibu dan bapak mendapat imbalan yang lebih baik di sisi-Nya.

(2)

Bapak Prof. Dr. (hc) dr. MK. Tadjuddin, Sp. And selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

(3)

Bapak Drs. Umar, M.Sc, Apt selaku ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

(4)

Ibu Zilhadia, M.Si., Apt selaku pembimbing akademik penulis yang telah memberikan bimbingan dan bantuan selama saya menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

(5)

Bapak dan Ibu staf pengajar dan karyawan yang telah memberikan bimbingan dan bantuan selama saya menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

viii


ix (6)

Teman – teman angkatan 2008 yang telah memberikan motivasi dan bantuan selama penulis kuliah dan menyusun skripsi.

(7)

Teman – teman seperjuangan Dewa, Doni, Endah, Fitri, Vani yang telah membantu penulis selama penyusunan skripsi ini.

(8)

Teman – temanku Berty, Putri, Sekar, Via yang telah memberikan do’a, motivasi serta bantuan selama penulis kuliah dan menyusun skripsi.

(9)

Bayu Wibowo Novianto yang telah memberikan do’a, motivasi, selalu menemani dalam suka dan duka, dan mengajarkan kesabaran selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.

(10) Adikku tersayang Angga dan Anis yang telah memberikan do’a dan motivasi selama penulis melaksanakan penelitian dan menyusun skripsi ini. Tak lupa kepada kedua orang tua yang kusayangi, Ayahanda Parno dan Ibunda Saginem, yang telah membesarkan dan mendidik penulis dengan limpahan kasih sayang, yang selalu memberikan do’a,, dukungan moril dan materil. Semoga segala amalan dan jerih payah keduanya mendapat balasan yang jauh lebih baik disisi-Nya. Akhir kata, saya berharap Tuhan Yang Maha Esa berkenan mambalas segala kebaikan semua pihak yang telah membantu. Semoga skripsi ini membawa manfaat bagi pengembangan ilmu.

Jakarta, Januari 2013

Penulis

ix


x

x


xi DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ...................................................................................... HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ......................................... HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .......................................... HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................ ABSTRAK ...................................................................................................... ABSTRACT .................................................................................................... KATA PENGANTAR .................................................................................... HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ............... DAFTAR ISI ................................................................................................... DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................

ii iii iv v vi vii viii x xi xiii xiv

BAB 1. PENDAHULUAN ............................................................................ 1.1 Latar Belakang ............................................................................ 1.2 Rumusan Masalah ....................................................................... 1.3 Hipotesis ..................................................................................... 1.4 Tujuan Penelitian ........................................................................ 1.5 Manfaat Penelitian ......................................................................

1 1 3 3 3 3

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ................................................................... 2.1 Tumbuhan Kencur ...................................................................... 2.1.1 Klasifikasi .......................................................................... 2.1.2 Nama Daerah Indonesia ..................................................... 2.1.3 Bentuk dan Kultivarnya ..................................................... 2.1.4 Tempat Tumbuh ................................................................. 2.1.5 Kandungan Kimia Kaempferia galanga ............................ 2.1.6 Manfaat Kaempferia galanga ............................................ 2.2 Aspergillus niger ......................................................................... 2.3 Biotransformasi ........................................................................... 2.4 Metabolit Sekunder .....................................................................

4 4 4 5 5 6 6 8 8 9 10

BAB 3. METODOLOGI PENELITIAN ..................................................... 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ..................................................... 3.1.1 Tempat ............................................................................... 3.1.2 Waktu ................................................................................. 3.2 Alat dan Bahan............................................................................ 3.2.1 Alat..................................................................................... 3.2.2 Bahan Uji ........................................................................... 3.2.3 Bahan Kimia ...................................................................... 3.3 Prosedur Penelitian ..................................................................... 3.3.1 Pengambilan Sampel.......................................................... 3.3.2 Determinasi Tumbuhan...................................................... 3.3.3 Penyiapan Bahan Untuk Ekstraksi .....................................

12 12 12 12 12 12 12 13 13 13 13 13

xi


xii 3.3.4 Ekstraksi Kaempferia galanga........................................... 3.3.5 Persiapan Kultur Aspergillus niger .................................... 3.3.6 Persiapan Media Biotransformasi ...................................... 3.3.7 Proses Biotransformasi ...................................................... 3.3.8 Ekstraksi Hasil Biotransformasi ........................................ 3.3.9 Analisa Hasil Biotransformasi ...........................................

13 14 14 15 15 15

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................ 4.1 Hasil Determinasi......................................................................... 4.2 Ekstraksi Kencur .......................................................................... 4.3 Proses Biotransformasi ................................................................ 4.4 Ekstraksi Hasil Biotransformasi .................................................. 4.5 Analisa Hasil Biotransformasi .....................................................

16 16 16 17 20 20

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................ 5.1 Kesimpulan ................................................................................. 5.2 Saran ...........................................................................................

25 25 25

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... LAMPIRAN ....................................................................................................

26 33

xii


xiii DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 2.1. Tumbuhan Kaempferia galanga (L.). ...................................... 4 Gambar 2.2. Stuktur senyawa etill sinamat, etil-p-metoksi sinamat, 3-karen, kamphen, borneol ......................................... 7 Gambar 4.1. Kristal metabolit sekunder utama kencur (Senyawa x) ............................................................................................... 17 Gambar 4.2. Jamur Aspergillus niger pada medium PDA berumur 3 hari. .......................................................................... 18 Gambar 4.3. Kultur Jamur Aspergillus niger pada medium Czapek –pepton. ........................................................................ 19 Gambar 4.4. Profil kromatogram KLT hasil biotransformasi ........................ 21 Gambar 4.5. Hasil kromatogram KCKT standar metabolit sekunder utama dari kencur (senyawa x) .................................. 21 Gambar 4.6. Hasil kromatogram KCKT campuran biotransformasi berumur 3 hari. ................................................ 22 Gambar 4.7. Struktur senyawa etil-p-metoksi sinamat (EPMS) .................... 23

xiii


xiv DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Kerangka Penelitian................................................................... 33 Lampiran 2. Penyiapan kristal metabolit sekunder utama (senyawa x) dari kencur (Kaempferia galanga L.) ................... 34 Lampiran 3. Sertifikat Hasil Determinasi ........................................................... 35 Lampiran 4. Sertifikat Aspergillus niger ATCC 6275 ...................................... 36 Lampiran 5. Hasil Perhitungan Rendemen ............................................................. 37

Lampiran 6. Komposisi Medium Yang Digunakan ....................................... 38 Lampiran 7. Kencur (Kaempferia galanga L.). ............................................. 39 Lampiran 8. Jamur Aspergillus niger ATCC 6275 ........................................ 40

xiv


BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Kencur merupakan suku jahe – jahean (Zingiberaceae) dengan nama latin Kaempferia galanga L. Kencur merupakan tumbuhan asli dari India yang penyebarannya meliputi kawasan Asia Tenggara termasuk Indonesia, Australia, dan Cina (Afriastini, 2002). Telah banyak dilakukan penelitian terhadap tumbuhan kencur ini seperti minyak atsiri kencur memiliki aktivitas terhadap bakteri Gram positif (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Streptococcus faecalis dan Bacillus subtilis), Gram negatif (Salmonella typhi, Shigella flexneri, dan Escherichia coli ATCC 25922) dan khamir (Candida albicans) (Tewtrakul et al., 2005). Ekstrak metanol Kaempferia galanga juga telah diketahui mempunyai efek toksisitas yang cukup besar terhadap larva dan pupa Anopheles stephensi (Dhandapani et al., 2011). Kandungan kimia kencur etil sinamat diketahui memiliki aktivitas farmakologis antara lain dapat mengurangi hipertensi. Efek terapeutik lainnya yaitu sebagai relaksan otot polos yang digunakan pada pengobatan angina, asma, dan kejang otot (Othman et al., 2006). Salah satu senyawa utama yang terdapat pada kencur adalah etil-pmetoksi sinamat (EPMS) (Tewtrakul et al., 2005). Banyak penelitian dilakukan untuk membuktikan kegunaan etil-p-metoksi sinamat (EPMS). Etil-p-metoksi sinamat (EPMS) yang didapatkan dari ekstrak metanol Kaempferia galanga

sangat sitotoksik terhadap sel Hela (Kosuge et al.,

1985). Senyawa ini juga telah diketahui memiliki aktivitas antiinflamasi (Umar et al., 2012) Metabolit

sekunder

tanaman

digunakan

untuk

meningkatkan

kemampuan mikroorganisme dalam menghasilkan produk yang bernilai tinggi seperti pada biotransformasi merupakan teknologi yang pada saat ini sedang berkembang. Potensi yang dimiliki metabolit sekunder tanaman dapat merangsang aktivitas mikroba dan memperluas kemampuan spektrum katabolik mereka (Singer et al., 2003). 1


2

Penggunaan mikroorganisme dalam kimia bukanlah hal baru. Bakteri dan jamur telah digunakan untuk memproduksi bahan kimia, farmasi dan parfum selama puluhan tahun (Boeventura et al., 2004). Penggunaan mikroorganisme dalam proses modifikasi senyawa lebih aman dan ramah lingkungan daripada menggunakan pereaksi kimia. Proses biotransformasi biasanya juga dilakukan menggunakan sistem berair pada pH netral. Mikroorganisme juga diketahui mampu melakukan berbagai macam reaksi bahkan yang tidak dapat diakses dengan cara kimia (Boeventura et al., 2004). Salah

satu

mikroorganisme

yang

bisa

dimanfaatkan

untuk

biotransformasi adalah Aspergillus niger yang dapat menyebabkan reaksi oksidasi atau reduksi (Esmaili et al., 2012). Penelitian biotransformasi dengan menggunakan Aspergillus niger telah banyak dilakukan antara lain progesterone dibiotransformasikan oleh Aspergillus niger menjadi 11αhidroksi progesteron dan 11α, 6β-hidroksi progesteron ( Fouad et al., 2009). Senyawa hasil biotransformasi diharapkan mempunyai aktivitas yang lebih baik dari senyawa asal. Seperti biotransformasi artemisin menjadi deoksiartemisin oleh Aspergillus flavus memiliki aktivitas antibakteri dua kali lebih tinggi daripada senyawa asalnya karena peningkatan polaritas dari senyawa tersebut (Srivastava et al., 2009). Mengingat banyaknya aktivitas farmakologis dari senyawa metabolit sekunder utama dari kencur salah satunya etil-p-metoksi sinamat (EPMS) maka perlu dilakukan modifikasi struktur senyawa metabolit sekunder utama dari kencur untuk nantinya dapat dimanfaatkan dalam penelitian lebih lanjut untuk mendapatkan senyawa yang lebih berpotensi sebagai obat. Modifikasi senyawa metabolit sekunder utama dari kencur dapat dilakukan dengan bantuan enzim pada mikroorganisme. Salah satu mikroorganisme yang berkemungkinan dapat mentransformasi suatu senyawa adalah jamur Aspergillus niger.

Alasan inilah yang melatarbelakangi

penelitian dengan judul biotransformasi metabolit sekunder utama (senyawa x) dari ekstrak n- heksana kencur (Kaempferia galanga L.) oleh jamur Aspergillus niger ATCC 6275 ini dilakukan.

2


3

1.2 Perumusan Masalah Apakah

Aspergillus

niger

ATCC

6275

dapat

melakukan

biotransformasi terhadap metabolit sekunder utama (senyawa x) yang telah diisolasi dari kencur?

1.3 Hipotesis Metabolit sekunder utama (senyawa x) yang diisolasi dari kencur dapat dibiotransformasikan menjadi produk turunannya dengan bantuan jamur Aspergillus niger ATCC 6275.

1.4 Tujuan Penelitian Mengetahui apakah Aspergillus niger ATCC 6275 berumur 5 hari yang selanjutnya diinkubasi pada suhu 30°C dengan kecepatan agitasi 100 rpm selama

3

hari

pada

medium

Czapek-

pepton

mampu

melakukan

biotransformasi metabolit sekunder utama (senyawa x) yang telah diisolasi dari kencur.

1.5 Manfaat Penelitian Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai kemungkinan proses biotransformasi dengan mikroorganisme apa saja kandungan

metabolit

sekunder

yang

terdapat

pada

kencur

dapat

dibiotransformasi.

3


BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tumbuhan Kencur (Kaempferia galanga L.)

Gambar 2.1. Tumbuhan Kaempferia galanga (L). (Sumber: Koleksi Pribadi)

2.1.1 Klasifikasi (www.plantamor.com) Secara taksonomi Kaempferia galanga (L). dapat diklasifikasikan : Kingdom

: Plantae

Subkingdom

: Traecheobionta

Super Divisi

: Spermatophyta

Divisi

: Magnoliophyta

Kelas

: Liliopsida

Sub Kelas

: Commelinidae

Ordo

: Zingiberales

Famili

: Zingiberaceae

Genus

: Kaempferia

Spesies

: Kaempferia galanga L.

14


5

2.1.2 Nama Daerah Indonesia (Afriastini, 2002) Istilah kencur yang sekarang popular sebenarnya merupakan nama daerah dari suku Jawa. Nama daerah lainnya yaitu ceuko (Aceh), tekur (Gayo), kopuk (Mentawai), cakue (Minang), cokur (Lampung), cikur (Sunda), kencur (Madura), cekuh (Bali), cekur (Sasak- Lombok), cekir (Sumba), cakuru (Makasar), ceku (Bugis), suha (Seram), asauli, sahulu (Ambon), onegai (Buru), bataka (Ternate dan Tidore). Dalam Bahasa Inggrisnya adalah galangal

dan kaempferia. Sementara nama asing di

kawasan Asia Tenggara diantaranya dikenal dengan dusol (tagalongFilipina), cengkur (Malaysia), van hom (Laos), hom proh (Thailand Tengah), sown nai (Vietnam).

2.1.3 Bentuk dan Kultivarnya (Afriastini, 2002) Kencur termasuk jenis herba atau terna berbatang semu pendek, bahkan tidak berbatang. Memiliki jumlah daun antara 2 – 3 helai dan letaknya saling berlawanan. Rimpangnya kokoh, bercabang banyak, rapat seperti umbi, tidak berserat, dan diameter sampai 1,5 cm. Apabila rimpang dipotong melintang akan terlihat bagian tengahnya berwarna putih, berempulur dan transparan. Kulit rimpang berwarna coklat mengilap, licin, dan tipis sekali. Kencur termasuk tanaman yang memiliki akar yang banyak, berdaging, dan pada bagian ujungnya sering kali menggembung berbentuk lonjong seperti telur atau bulat. Daunnya berdaging agak tebal, mudah patah, berbentuk elips, melebar, atau bundar. Daun kencur tumbuh mendatar dan bertangkai sangat pendek sehingga terlihat hampir rata sejajar dengan permukaan tanah. Ukuran daun beragam antara 6-15 cm x (2-3 cm) 5-10 cm. Sering kali dijumpai daun – daun yang tepinya berwarna merah kecoklatan. Bunga tanaman kencur berwarna putih dengan bibir bunga berwarna ungu dan berbau harum. Bunga tersebut tumbuh di antara helaian daun yang letaknya di atas, berjumlah antara 4 – 12. Kelopak dan mahkota bunga

5


6

jumlahnya 3 helai dan bakal buah tenggelam. Buah kotak beruang 3, berkelep 3, dan bijinya beraril. Jika dilihat dari jenis daunnya, kencur terbagi dalam dua bagian, yaitu kencur berdaun lebar dan kencur berdaun sempit. Jenis kencur ini kultivarnya dapat ditemukan di Jawa Tengah yang dikenal, di antaranya kencur boro (daun lebar), kencur kalipare, kencur ketawang, kencur arjosari, dan kencur kopral. Di Cileungsi, Kabupaten Bogor (Jabar), dikenal tiga kultivar, yaitu kencur bangkok, kencur bastar, dan kencur paris. Ketiganya dapat dibedakan dari sistem percabangan rimpang, ukuran, dan aromanya. Kencur bangkok dan kencur bastar memiliki rimpang yang beraroma kurang menyengat dan ukuran rimpangnya besar. Namun, rimpang kencur bangkok lebih besar dibandingkan dengan kencur bastar, yaitu 1,5-2 kali lebih besar dibanding kencur bastar. Kencur paris berimpang kecil bila dibandingkan dengan kedua kultivar tersebut, tetapi memiliki aroma yang paling kuat.

2.1.4 Tempat Tumbuh Kencur dapat tumbuh baik di dataran rendah maupun di pegunungan sampai ketinggian sekitar 1.000 m di atas permukaan laut (dpl). Namun, tempat tumbuh yang paling sesuai adalah di dataran rendah di bawah ketinggian tersebut. Salah satu sentra penghasil kencur di Kabupaten Bogor yaitu di Kecamatan Cileungsi berada pada ketinggian antara 76-100 meter dpl. Sentra lain di Jawa Tengah yaitu di Kecamatan Nagasari Kabupaten Boyolali berada pada ketinggian sekitar 150 meter dpl.

2.1.5 Kandungan Kimia Kaempferia galanga Ekstrak minyak atsiri tumbuhan Kaempferia galanga L. mempunyai kandungan α-pinen (1,28%), kamphen (2,47%), karvon (11,13%), benzen (1,33%), eucalyptol (9,59%), borneol (2,87%), metil sinamat (23,23%), penta dekana (6,41%) dan etil-p-metoksi sinamat (31,77%) (Tewtrakul et al., 2005). Selain itu, konstituen lain dari rimpang adalah sineol, borneol, 3-

6


7

karen, kamphene, kaempferal, sinamaldehid, asam p-metoksi sinamat, etil sinamat dan p-metoksi sinamat (Mohanbabu et al., 2010).

O

OC2H5 a)

O

OC2H5 b)

CH3O

CH3 CH2

CH2 CH3 CH3

c) d) CH3

CH3

CH3

OH H2C-C-CH2

e) Gambar 2.2 Stuktur senyawa dari a) etil sinamat, b) etil-p-metoksi sinamat, c) 3-karen, d) kamphen, e) borneol (Barus, 2009).

7


8

2.1.6 Manfaat Kaempferia galanga Minyak atsiri kencur memiliki aktivitas terhadap bakteri Gram positif (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Streptococcus faecalis dan Bacillus subtilis), Gram negatif (Salmonella typhi, Shigella flexneri, dan Escherichia coli ATCC 25922), dan khamir (Candida albicans) (Tewtrakul et al., 2005). Ekstrak metanol Kaempferia galanga juga mempunyai efek toksisitas yang cukup besar terhadap larva dan pupa Anopheles stephensi (Dhandapani et al., 2011). Efek vasorelaksan dari etil sinamat yaitu komponen utama dari kencur dapat mengurangi hipertensi. Efek terapeutik lainnya yaitu sebagai relaksan otot polos yang digunakan pada pengobatan angina, asma, dan kejang otot (Othman et al., 2006). Ekstrak etanol dari Kaempferia galanga juga mempunyai aktivitas sebagai analgesik dan antiinflamasi (Mohanbabu et al., 2010). Selain itu, ekstrak heksan dari Kaempferia galanga mempunyai aktivitas sebagai sedatif (Huang et al., 2008).

2.2 Aspergillus niger Aspergillus niger mempunyai kelas Deuteromycetes, ordo Moniliales, famili Moniliaceae, genus Aspergilus, spesies Aspergillus niger (Anonym). Aspergillus niger mempunyai banyak manfaat, seperti memiliki kemampuan untuk memproduksi asam sitrat (Ali et al., 2002). Selain itu juga memiliki kemampuan memproduksi enzim amilase, protease, xelulase dan lipase (Suganthi et al., 2011; Oyeleke et al., 2011; Narasimha et al., 2006 ; Falony et al., 2006). Aspergillus niger dan Penicillium digitatum dimanfaatkan dalam meningkatkan produksi verbenol. Verbenol adalah senyawa makanan yang banyak digunakan pada minuman ringan, sup, daging, sosis, dan es krim (Rao et al., 2003). Pada indusri, Aspergillus niger dimanfaatkan untuk memproduksi asam oksalat dan asam glukonat ( Rymowicz and Lenart, 2003; Liu et al., 2003). Potensi Aspergillus niger telah banyak diketahui seiring dengan dilakukannya

penelitian

yang

membuktikan

kemampuannya

dalam

melakukan transformasi senyawa. Aspergillus niger yang diisolasi dari Allium sativum dapat mengubah senyawa flavon menjadi 2'-hidroksi dihidrokalkon 8


9

dan 2'-hidroksi fenil metil keton yang mempunyai aktivitas antioksidan yang lebih baik daripada flavon. Senyawa hasil biotransformasi juga memiliki aktivitas antimikroba terhadap Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus flavus dan Candida albicans (Mahmoud et al., 2008).

2.3 Biotransformasi Biotransformasi adalah proses pengubahan suatu senyawa menjadi senyawa turunannya yang strukturnya berbeda dari senyawa asalnya akibat aktivitas metabolisme suatu mikroba (Lu et al., 2000). Proses ini berkaitan dengan penggunaan enzim untuk mengubah substrat menjadi produk. Pembentukan sebuah proses biotransformasi membutuhkan perkembangan optimal biokatalisator, media reaksi dan bioreaktor (Cabral, 2002). Pengertian biotransformasi menurut Walker adalah suatu proses dimana suatu senyawa dapat berubah menjadi senyawa turunannya yang lebih baik dengan menggunakan mikroorganisme sebagai katalis (Walker, 2002). Mikroorganisme adalah salah satu agen biokatalis yang paling efisien dengan kemampuan luas untuk memetabolisme berbagai substrat (Srivastava et al., 2009). Biotransformasi dengan menggunakan mikroba lebih spesifik daripada kimia murni dan memungkinkan penambahan, penghapusan atau modifikasi pada gugus fungsi tertentu molekul kompleks (Walker, 2002). Reaksi yang mungkin dikatalisis termasuk oksidasi, dehidrogenerasi, hidroksilasi, dehidrasi, kondensasi, dekarboksilasi, deaminasi, aminasi dan isomerisasi (Walker, 2002). Penelitian

mengenai

biotransformasi

telah

banyak

dilakukan.

Diantaranya seperti jamur Aspergillus niger memiliki kemampuan untuk melakukan biotransformasi senyawa asam imbricatolik menjadi asam 1αhidroksi imbricatolik (Hirschmann et al., 2007). Selain itu, Aspergillus niger ATCC 16404 juga mampu melakukan biotransformasi senyawa jatrophon diterpen menjadi 9β-hidroksi isabellion diterpen (Pertino et al., 2006). Contoh lainnya biotransformasi dengan menggunakan Aspergillus niger PTCC 50-11 selama 6 hari dapat mengubah senyawa citral menjadi aseton 9


10

(26,2%) dan hidroksi sitronelal (37,0%), sedangkan senyawa utama setelah periode 15-hari adalah aseton (15,0%) dan sitronelol (36,0%) (Esmaeili et al., 2011). Biotransformasi dengan Aspergillus niger menyebabkan reaksi oksidasi dan menghasilkan produk yang lebih stabil ( Esmaeili et al, 2011). Citral yang sebelum dibiotransformasikan tidak begitu banyak dimanfaatkan. Setelah diubah menjadi turunannya banyak orang yang memanfaatkannya. Seperti sitronelol digunakan untuk pembuatan kosmetik, parfum, shampoo, sabun dan pembuatan obat. Sedangkan hidroksi sitronelal digunakan untuk membuat rasa berri dan cherri (Esmaeili et al, 2011). Senyawa hasil biotransformasi diharapkan mempunyai aktivitas yang lebih baik dari senyawa asal. Seperti Simanjuntak et al.. (2002) membuktikan bahwa mikroba endofit yang diisolasi dari tumbuhan kina dapat melakukan biotransformasi senyawa kinkona menjadi kinkona N-oksida yang lebih aktif dalam mengobati malaria. Senyawa hasil biotransformasi juga memiliki aktivitas antibakteri dua kali lebih tinggi daripada kurkumin dengan konsentrasi yang sama yaitu 50 mg/mL (Rahman, 2009).

2.4 Metabolit Sekunder Tanaman mensintesis berbagai macam senyawa organik yang secara tradisional diklasifikasikan sebagai metabolit primer dan sekunder. Metabolit primer adalah senyawa yang memiliki peran penting terkait dengan fotosintesis, respirasi, dan pertumbuhan. Contohnya pitosterol, lipid asil, nukleotida, asam amino dan asam organik (Crozier et al., 2007). Metabolit sekunder dibiosintesis terutama dari banyak metabolit – metabolit primer seperti asam amino, asetil koenzim A, asam mevalonat, dan zat antara (intermediate) dari jalur shikimat (shikimic acid) (Herbert, 1995). Berdasarkan asal biosintesis mereka, metabolit sekunder tanaman dapat dibagi menjadi tiga besar kelompok yaitu flavonoid dan fenolik, terpenoid dan alkaloid (Crozier et al., 2007). Metabolit sekunder adalah senyawa metabolit yang tidak essensial untuk kehidupan, tetapi penting bagi organisme yang menghasilkannya (Herbert, 1995). Metabolit sekunder meskipun bersifat tidak essensial namun 10


11

sering berperan pada kelangsungan hidup suatu spesies dalam perjuangan menghadapi spesies – spesies lain. Misalnya, zat kimia untuk pertahanan, penarik seks serangga, dan feromon (Manitto, 1992). Metabolit sekunder juga menarik karena penggunaannya sebagai pewarna, serat, perekat, minyak, lilin, agen penyedap, obat-obatan dan parfum. Mereka juga dilihat sebagai potensi sumber obat alami yang baru, antibiotik, insektisida dan herbisida (Crozier et al., 2007). Dalam beberapa tahun terakhir peran beberapa metabolit sekunder sebagai penunjang diet

telah menjadi topik yang semakin penting dari

penelitian gizi manusia. Berbeda dengan vitamin, metabolit sekunder tidak menunjukkan aktivitasnya pada penggunaan jangka pendek. Namun, ada bukti bahwa

konsumsi pada jangka panjang

memiliki aktivitas pada

penderita kanker dan penyakit kronis, termasuk penyakit jantung dan diabetes tipe II (Crozier et al., 2007). Metabolit sekunder pada ekstrak rimpang Kaempferia galanga menunjukkan adanya sterol, triterpenoid, alkaloid, saponin, dan flavonoid (Rajendra et al., 2011).

11


12

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

3.1.1 Tempat Penelitian Biotransformasi Metabolit Sekunder Utama (Senyawa X) dari Ekstrak n- Heksana Kencur (Kaempferia galanga L.) oleh Jamur Aspergillus niger ATCC 6275 dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Laboratorium Natural Product Chemistry (PNA), dan Laboratorium Drug and Research (PDR) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.1.2 Waktu Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei 2012 sampai dengan Januari 2013.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah rotary evaporator Eyela, labu evaporator Eyela, vial, mikro pipet, tip, vortex Wiggen Hausen, mikro tub, cawan petri Pyrex, timbangan analitik, pH meter Horiba, lemari asam, corong Pyrex, corong pisah Pyrex, pipet tetes, pipa kapiler, erlemeyer Schoot Duran, gelas kimia Schoot Duran, gelas ukur Pyrex, tabung reaksi Pyrex, jarum ose, spatula, laminar airflow, autoklaf ALP, mikroskop Olympus, shaker incubator Taitec BR-40 LF, Freeze dry Eyela 1200 dan KCKT Dionex.

3.2.2 Bahan Uji Bahan yang diuji adalah metabolit sekunder utama (senyawa x) yang diisolasi dari ekstrak n-heksana kencur (Kaempferia galanga L.)

12


13

3.2.3 Bahan Kimia Bahan-bahan kimia yang digunakan pada penelitian ini adalah plat KLT (Silica gel 60 F254), kolom Acclaim C18 3µm 120A 4,6 x 150 mm, aquadest, n-heksana, metanol, etil asetat, medium Potato Dextrose Agar (PDA), dan medium Czapek-pepton (komposisi medium dapat dilihat pada lampiran).

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Pengambilan Sampel Sampel kencur (Kaempferia galanga L.) diperoleh dari kebun di sekitar wilayah Dukuh Jati Sari Desa Sobokerto Kecamatan Ngemplak Kabupaten Boyolali, Jawa Tengah. Pada tanggal 5 Mei 2012.

3.3.2 Determinasi Tumbuhan Determinasi tumbuhan kencur (Kaempferia galanga L.) dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Puslit Biologi, LIPI Cibinong.

3.3.3 Penyiapan Bahan Untuk Ekstraksi Sebanyak 4,6 kg kencur segar dibersihkan dari tanah – tanah yang menempel dan dicabut akar – akar yang menempel, dicuci dengan air kemudian dirajang. Setelah itu dilakukan pengeringan dan penghalusan dengan menggunakan blender sampai halus kemudian diayak.

3.3.4 Ekstraksi Kaempferia galanga Sebanyak 754 g serbuk rimpang kering dimaserasi dengan menggunakan pelarut n-heksana yang telah didestilasi sebanyak 2,5 L dengan waktu perendaman 5 hari sambil sesekali dilakukan pengocokan. Setelah 5 hari disaring sehingga diperoleh ampas dan filtrat. Ampas ditambah kembali n-heksana sebanyak 2,5 L. Proses maserasi dilakukan sebanyak 3 kali. Seluruh filtrat hasil maserasi dipekatkan dengan vacuum 13


14

rotary evaporator. Kemudian filtrat pekat ini diendapkan pada suhu kamar sampai terbentuk kristal. Kristal yang terbentuk pada filtrat dipisahkan dengan penyaringan. Kristal yang diperoleh dimurnikan dengan pencucian menggunakan n-heksana dan rekristalisasi dengan cara melarutkan kristal dalam n-heksana dan beberapa tetes metanol dan kemudian dibiarkan pada suhu kamar sehingga terbentuk kristal kembali. Kristal dipisahkan dengan penyaringan (Afrizal et al., 1999; Huang et al., 2008). Kemudian dihitung rendemennya. % rendemen

berat kristal yang didapat g berat serbuk simplisia awal g

x 100 %

3.3.5 Persiapan Kultur Aspergillus niger Pada pembiakan Aspergillus niger media yang digunakan Potato Dextrose Agar (PDA). Medium PDA dibuat dengan cara melarutkan potatoes infusion 200 g, dekstrosa 20 g, agar 15 g dilarutkan dalam 1000 mL aquadest dan dipanaskan sampai mendidih. Kemudian di sterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Medium PDA diambil sebanyak 20 mL dituang ke dalam cawan petri (Ali et al., 2002). Sebanyak 1 ose kultur jamur Aspergillus niger pada agar miring diremajakan kembali pada medium PDA dengan cara digoreskan dengan zig zag, kemudian kultur di inkubasi pada suhu 30°C selama 3 hari (Haq et al., 2001).

3.3.6 Persiapan Media Biotransformasi Medium kultivasi yang digunakan adalah medium Czapek- pepton. Medium Czapek- pepton terdiri dari 1,5 g sukrosa, 1,5 g glukosa, 0,5 g peptone water, 0,1 g K2HPO4, 0,05 g KCl, dan 0,001 g FeSO4.7H2O dilarutkan ke dalam 100 mL aquadest pH 7. Setelah semua komponen larut, medium tersebut dituang ke dalam erlemeyer 250 mL kemudian ditutup dan disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Esmaili et al., 2012). 14


15

3.3.7 Proses Biotransformasi Sebanyak 3 ose Jamur

Aspergillus niger dimasukkan ke dalam

medium Czapek- pepton 100 mL. Medium yang telah berisi jamur Aspergillus niger diinkubasi pada suhu 30°C dengan kecepatan agitasi 100 rpm. Setelah 5 hari, sebanyak 100 mg kristal metabolit sekunder utama kencur (senyawa x) yang dilarutkan dengan 25 mL n-heksana, dimasukkan ke dalam kultur Aspergillus niger. Proses inkubasi dilanjutkan sampai dengan 3 hari pada suhu 30°C dengan kecepatan agitasi 100 rpm (Esmaili et al., 2012).

3.3.8 Ekstraksi Hasil Biotransformasi Suspensi campuran biotransformasi yang telah diinkubasi selama 3 hari pada suhu 30°C dengan kecepatan agitasi 100 rpm diekstraksi dengan pelarut organik n-heksana. Ekstrak yang didapat selanjutnya dikeringkan dengan vacuum rotary evaporator. Kemudian di freeze dry sampai diperoleh ekstrak kental.

3.3.9 Analisa Hasil Biotransformasi

3.3.9.1 Analisa dengan KLT Ekstrak di analisis menggunakan KLT dengan fase diam Silica gel 60 F254 dan fase gerak n- heksana : etil asetat = 9:1 (10 mL). Noda yang muncul diamati dibawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm.

3.3.9.2 Analisa dengan KCKT Senyawa hasil biotransformasi dianalisis menggunakan KCKT dengan kondisi KCKT kolom Acclaim C18 3µm 120A 4,6 x 150 mm, fase gerak metanol 100%, laju alir 1mL/menit, lama aliran 15 menit, detektor UV pada panjang gelombang 254 nm (Sirisangtragul dan Sripanidkulchai, 2011). 15


16

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Determinasi Tumbuhan Tumbuhan kencur yang didapatkan dari daerah Boyolali Propinsi Jawa Tengah dideterminasi terlebih dahulu di Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Puslit Biologi, LIPI Cibinong. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tumbuhan yang digunakan adalah kencur (Kaempferia galanga L.) (Lampiran 3).

4.2 Ekstraksi Kencur (Kaempferia galanga L.) Pada ekstraksi kencur dilakukan dengan cara maserasi dengan menggunakan n- heksana yang telah didestilasi. Destilasi pelarut bertujuan untuk menghilangkan pengotor pada pelarut. Maserasi disaring dengan corong saring menghasilkan filtrat berwarna kekuning – kuningan. Kemudian residu dari hasil penyaringan dicampur dengan n- heksana dan setelah itu disaring kembali dengan corong saring. Sedangkan filtratnya dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator sehingga diperoleh larutan yang berwarna lebih gelap dan lebih kental dari larutan awal. Filtrat pekat diendapkan pada suhu kamar sampai terbentuk kristal yang kemudian disaring. Kristal yang diperoleh direkristalisasi dengan menggunakan n- heksana dan beberapa tetes metanol. Rekristalisasi bertujuan untuk memurnikan suatu zat padat dari campuran atau pengotornya dengan cara mengkristalkan kembali zat tersebut setelah dilarutkan dalam pelarut yang cocok. Metanol yang digunakan dalam proses rekristalisasi digunakan untuk melarutkan atau membersihkan pengotor yang ada. Kristal yang didapatkan berbentuk jarum berwarna putih, transparan dan mengkilat (Gambar 4.1.). Kemudian kristal yang didapatkan ditimbang dan dihitung rendemennya. Hasil rendemen kristal yang didapatkan adalah 2,86 %.

16


17

Gambar 4.1. Kristal metabolit sekunder utama kencur (senyawa x)

4.3 Proses Biotransformasi Aspergillus niger ATCC 6275 didapatkan dari IPB Culture Collection, Departemen Biologi Fakultas Matematika dan IPA, IPB Bogor. Aspergillus niger terlebih dahulu diremajakan yang bertujuan untuk mempertahankan sifat alami jamur yang diisolasi. Media yang digunakan untuk pertumbuhan adalah Potato Dextrose Agar (PDA). Aspergillus niger akan tumbuh dengan baik pada media yang mengandung kadar gula dan garam yang cukup tinggi. Hasil pengamatan makroskopis terhadap jamur Aspergillus niger yang ditumbuhkan pada medium Potato Dextrose Agar (PDA) setelah 3 hari membentuk misellium berwarna putih dan konidia berwarna hitam. Pada permukaan belakang koloni berwarna putih kekuningan (Gambar 4.2.).

17


18

a

b

Gambar 4.2. Jamur Aspergillus niger pada medium PDA berumur 3 hari. a) tampak depan, b) tampak belakang Selain pengamatan secara makroskopis dilakukan juga pengamatan secara

mikroskopis.

Lactophenol

Pada

Cotton Blue

pewarnaan (LPCB).

Aspergillus

Pengamatan

niger

digunakan

secara mikroskopis

Aspergillus niger mempunyai hifa bersepta dengan kepala konidia berbentuk bulat berwarna coklat tua (Lampiran 8). Isolat jamur Aspergillus niger yang telah diremajakan diambil 3 ose dimasukkan ke dalam erlemeyer 250 mL yang berisi medium Czapek- pepton 100 mL yang telah disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit kemudian selanjutnya medium diinkubasi selama 5 hari pada shaker incubator pada suhu 30°C dengan kecepatan agitasi 100 rpm. Penggunaan shaker inkubator bertujuan mempercepat transfer nutrient ke dalam sel, untuk mensuplai oksigen bagi aktivitas metabolik sel dan untuk meratakan mikroorganisme dalam medium sehingga semua mikroorganisme mendapat kesempatan yang sama kontak dengan oksigen. Medium Czapek- pepton sebelum dikultur jamur Aspergillus niger bewarna kuning jernih. Kultur jamur setelah berumur 1 hari terlihat terbentuk seperti butiran butiran berwarna putih yang banyak. Ini membuktikan bahwa Aspergillus niger dapat tumbuh baik pada medium kultur Czapek- pepton karena Aspergillus niger memperoleh nutrisi yang cukup. Pada kultur jamur yang berumur 5 hari butiran putih semakin banyak dan besar (Gambar 4.3.).

18


19

ga

a

b

c

d Gambar 4.3.

Kultur Jamur Aspergillus niger pada medium Czapek– pepton. a) saat kultivasi, b) 1 hari kultivasi c) 5 hari kultivasi (sebelum penambahan metabolit sekunder utama kencur (senyawa x)), d) 3 hari (setelah ditambahkan metabolit sekunder utama kencur (senyawa x)). Penambahan metabolit sekunder utama yang diisolasi dari kencur (senyawa x) dilakukan pada hari ke 5. Kristal metabolit sekunder utama kencur (senyawa x) yang digunakan dilarutkan terlebih dahulu dengan nheksana. n-heksana dipilih karena dapat melarutkan kristal metabolit sekunder utama kencur (senyawa x) dengan sempurna dan menjadikannya dapat larut pula dalam kultur sehingga memudahkan interaksi dengan sel jamur. Kemudian proses biotransformasi dilanjutkan dengan menginkubasi campuran biotransformasi pada shaker inkubator selama 3 hari pada suhu 30°C dengan kecepatan agitasi 100 rpm. 19


20

4.4 Ekstraksi Hasil Biotransformasi Setelah 3 hari penambahan metabolit sekunder utama yang diisolasi dari kencur (senyawa x) suspensi campuran biotransformasi diekstraksi dengan menggunakan pelarut organik n-heksana yang dimasukkan ke dalam corong pisah dan dikocok kuat. n-heksana dipilih karena dapat menarik sempurna hasil biotransformasi. Setelah dikocok, didiamkan sampai didapatkan 2 lapisan. Kemudian lapisan atas diambil. Pengocokan dilakukan sebanyak 3 kali. Selanjutnya filtrat yang didapat di keringkan dengan vacuum rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental. Karena ekstrak yang diperoleh belum kental dan masih mengandung air maka dilanjutkaan pengeringan dengan freeze dry yang sebelumnya ekstrak dibekukan dahulu di freezer selama semalam. Ekstrak yang didapatkan di analisis dengan menggunakan Kromatografi

Lapis Tipis (KLT) dan KCKT untuk

membuktikan bahwa senyawa hasil biotransformasi telah terbentuk.

4.5 Analisa Hasil Biotransformasi Plat KLT dielusi dengan menggunakan fase gerak n-heksana : etil asetat = 9 : 1 (10 mL). Hasil KLT memperlihatkan bahwa jamur Aspergillus niger pada medium Czapek- pepton tidak menghasilkan produk biotransformasi. Terlihat dari spot yang terbentuk tidak ada perbedaan. Spot yang dihasilkan sejajar dengan standar. Nilai Rf dari senyawa hasil biotransformasi 0,425 sedangkan nilai Rf standar metabolit sekunder utama yang diisolasi dari kencur (senyawa x) adalah 0,425. Nilai Rf tersebut menunjukkan bahwa substrat tidak di ubah menjadi produk baru, sehingga dikatakan tidak terjadi proses biotransformasi (Gambar 4.4.).

20


21

E

EM

AM

E

EB

a

EM

AM

EB

b

Gambar 4.4. Profil kromatogram KLT. E = kristal metabolit sekunder utama yang diisolasi dari kencur (senyawa x), EM = metabolit sekunder utama yang diisolasi dari kencur (senyawa x) + medium Czapek- pepton, AM = Aspergillus niger + medium Czapek- pepton, EB = campuran biotransformasi 3 hari setelah penambahan metabolit sekunder utama yang diisolasi dari kencur (senyawa x) dengan fase diam Silica gel 60 F254, fase gerak n-heksana : etil asetat = 9 : 1(10 mL). a) di bawah sinar UV 254 nm, b) di bawah sinar UV 366 nm.

Gambar 4.5.

Hasil kromatogram standar metabolit sekunder utama yang diisolasi dari kencur (senyawa x) atau menggunakan KCKT dengan kolom Acclaim C18 3µm 120A 4,6 x 150 mm, fase gerak metanol 100%, laju 21


22

alir 1mL/menit, lama aliran 15 menit, detektor UV dengan panjang gelombang 254 nm.

Gambar 4.6. Hasil kromatogram kultur jamur campuran biotransformasi berumur 3 hari dengan KCKT menggunakan kolom Acclaim C18 3µm 120A 4,6 x 150 mm, fase gerak metanol 100%, laju alir 1mL/menit, lama aliran 15 menit, detektor UV dengan panjang gelombang 254 nm. Analisa diperkuat dengan hasil kromatogram KCKT (Gambar 4.5. dan Gambar 4.6.) yang puncaknya juga tidak ada perbedaan antara standar dengan campuran biotransformasi berumur 3 hari. Substrat tidak dikonversi menjadi produk yang artinya tidak terjadi proses biotransformasi pada metabolit sekunder utama kencur (senyawa x) oleh jamur Aspergillus niger. Biotransformasi

senyawa

onopordopicrin

dengan

menggunakan

Aspergillus niger selama 3 hari dapat menghasilkan 4 produk baru yaitu 11 α H- dihidroonopordopicrin, 11 β H- dihidroonopordopicrin, 3 β- hidroksi- 11 β H- dihidroonopordopicrin, dan 14 hidroksi- 11 β H- dihidroonopordopicrin (Esmaili et al., 2012). Biotransformasi dengan menggunakan Aspergillus niger menunjukkan bahwa jamur ini menyebabkan reaksi oksidasi dan reaksi reduksi yang menghasilkan produk yang lebih stabil (Esmaili et al., 2012).

22


23

Etil-p-metoksi sinamat (EPMS) merupakan komponen utama dari kencur yang dengan mudah dapat diisolasi dan dimurnikan (Barus, 2009). Penelitian lain juga menyebutkan bahwa ekstrak n- heksana yang telah diisolasi dari kencur (kaempferia galanga L.) mempunyai komponen utama etil-p-metoksi sinamat (EPMS) sebesar 46 % (Huang et al., 2008). Pada penelitian ini, metabolit sekunder utama (senyawa x) ekstrak n- heksana yang telah diisolasi dari kencur kemungkinan adalah senyawa etil-p-metoksi sinamat (EPMS).

O

OC2H5 CH3O Gambar 4.7. Struktur senyawa etil-p-metoksi sinamat (EPMS).

Etil-p-metoksi sinamat (EPMS) mempunyai gugus fungsi yang reaktif sehingga sangat mudah ditransformasikan menjadi gugus fungsi yang lain (Barus, 2009). Biotransformasi menggunakan Aspergillus niger ATCC 6275 diharapkan mengalami sedikit modifikasi yaitu perpanjangan rantai dimana etil dari ester ini diganti oleh oktil, etil heksil maupun heptil (Taufikkurohman, 2005). Modifikasi yang dilakukan diharapkan mengurangi kepolaran etil-p-metoksi sinamat (EPMS) sehingga kelarutannya dalam air berkurang yang merupakan salah satu syarat senyawa sebagai tabir surya, selain

itu

juga

untuk

mengurangi

tingkat

bahaya

terhadap

kulit

(Taufikkurohman, 2005). Biotransformasi etil-p-metoksi sinamat (EPMS) tidak di ubah menjadi produk baru atau tidak terjadi proses biotransformasi yang disebabkan karena berbagai faktor yaitu kemungkinan substrat tidak dapat merangsang aktivitas 23


24

mikroba. Menurut Singer et al., (2003) pemilihan tanaman yang tepat dapat meningkatkan tingkat reaksi. Selain itu, faktor lain yang mempengaruhi keberhasilan biotransformasi adalah pemilihan mikroorganisme yang cocok atau enzim/ katalis yang dibutuhkan. Kondisi optimal untuk pertumbuhan kultur dan kondisi optimum reaksi juga mempengaruhi keberhasilan proses biotransformasi (Ghisalba et al., 2010). Sebagai contoh, biotransformasi (-)EGCG oleh jamur endofit Diaporthe sp. E dengan peningkatan suhu inkubasi sampai 30°C tidak menghasilkan produk (-)-(2R,3S)-dihidromirisetin, akan tetapi proses biotransformasi ini masih dapat berlangsung jika suhu diturunkan sampai 10°C. Faktor cahaya juga sangat berpengaruh terhadap proses biotransformasi ini. Pada proses biotransformasi yang dilakukan pada kondisi ruangan dengan kondisi terang pada siang hari dan gelap pada malam hari, gagal memberikan produk (-)-(2R,3S)-dihidromirisetin. Produk ini hanya dapat diperoleh jika proses biotransformasi dilakukan pada kondisi gelap sepanjang reaksi berlangsung (Agusta, 2007). Waktu inkubasi jamur Aspergillus niger 3 hari setelah penambahan substrat pada suhu 30°C dengan kecepatan agitasi 100 rpm mungkin belum cukup optimum untuk melakukan biotransformasi sehingga substrat tidak di ubah menjadi produk baru. Konsentrasi substrat juga menentukan keberhasilan biotransformasi. Seperti yang dilakukan Shibuya et al., (2003) penambahan substrat kina alkaloid dalam jumlah besar (20 mg) ke dalam 200 ml kultur jamur Xylaria sp. berumur 3 hari gagal untuk menghasilkan produk biotransformasi. Produk biotransformasi baru akan terbentuk setelah dilakukan penambahan sejumlah kecil (2 mg) substrat (kina alkaloid) pada kultur jamur endofit Xylaria sp. berumur 1 hari, dan kemudian dilanjutkan dengan penambahan 20 mg substrat pada hari ketiga dan diinkubasi pada suhu 27°C, 120 rpm, selama 20 hari.

24


25

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan Dari penelitian yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan sebagai berikut: Metabolit sekunder utama (senyawa x) dari ekstrak n- heksana kencur tidak terjadi biotransformasi pada kondisi kultur jamur Aspergillus niger ATCC 6275 berumur 5 hari yang selanjutnya diinkubasi selama 3 hari pada suhu 30°C

dengan kecepatan agitasi 100 rpm pada medium Czapek- pepton

dengan konsentrasi substrat 1mg/mL medium.

5.2 Saran Perlu dilakukan identifikasi metabolit sekunder utama (senyawa x) hasil isolasi dari ekstrak n- heksana kencur, selanjutnya diujikan proses biotransformasi dengan menggunakan mikroba jenis lainnya atau kondisi inkubasi yang berbeda.

25


26

DAFTAR PUSTAKA

Afriastini, J.J. 2002. Bertanam kencur. Jakarta. Penebar Swadaya.

Afrizal., Fahmi, R., Osmeli, D. 1999. Sintesis Isoamil Trans-p-Metoksisinamat Dari Etil Trans-p-Metoksisinamat. Jurnal Kimia Andalas. Vol.5 (2):75-79.

Agusta, A. 2009. Biologi dan Kimia Jamur Endofit. Bandung: ITB Press.

Agusta, A. 2007. Biotransformasi (-)-Epigalokatekin-3-O-galat Menjadi (-)2R,3S-Dihidromirisetin oleh Fungi Endofit Diaporthe sp. Isolat E dari Tumbuhan Teh. Hayati Journal Of Biosciences. Vol.14 (4): 150-154.

Ali, S., Haq, I., M. A. Qadeer., Iqbal, J. 2002. Production of Citric Acid by Aspergillus niger Using Cane Molasses in a Stirred Fermentor. Electronic Journal of Biotechnology. Vol.5 (3) : 259-271.

Anonim.

2009.

Food

and

Drug.

21:

Parts

170-199.

Diambil

dari

http://books.google.co.id/books. Diakses tanggal 18 Juni 2012.

Barus, R. 2009. Amidasi Etil-p-Metoksi Sinamat Yang Diisolasi Dari Kencur (Kaempferia galanga. L). Tesis. Universitas Sumatra Utara.

Boaventura, M. A. D., Lopes, R. F.A.P., Takahashi, J. A. 2004. Microorganisms as tools in modern chemistry: the biotransformation of 3-indolylacetonitrile and tryptamine by fungi. Brazilian Journal of Microbiology. 35 (4).

Cabral, J. M. S. 2002. Basic Biotechnology. Edisi ke-2. Cambridge: Cambridge University Pr.

26


27

C. E, Rajendra., Magadum, G. S., Nadaf, M. A., Manjula. 2011. Phytochemical Screening of The Rhizome of Kaempferia Galanga. International Journal of Pharmacognosy and Phytochemical Research. 3(3): 61-63.

Crozier, A., Clifford, M. N., Ashihara, H. 2007. Plant Secondary Metabolites: Occurrence, Structure and Role in the Human Diet. Blackwell Publishing Ltd.

Dhandapani, A., Kumar, S., Kadarkarai, M. 2011. Larvacidal, pulpicidal and smoke toxicity effect of Kaempferia galanga

to the malarial vector, and

Anopheles stephensi. The bioscan. 6(2) : 329-333.

Esmaeli, A., Moazami, N., Rustaiyan, A. 2012. Biotransformation of germacranolide from Onopordon leptolepies by Aspergillus niger. J. Pharm. Sci., Vol.25(1): 155-159.

Esmaeili, A., Rohany, S., Safaiyan, S., Amir, Z. S. 2011. Microbial transformation of citral by Aspergillus niger-PTCC 5011 and study of the pathways involved. Czech J. Food Sci. 29: 610–615.

Falony , G., Armas , J. C., C. Julio., Mendoza, D and Hernandez, J. L. M. 2006. Production of Extracellular Lipase from Aspergillus niger by Solid-State Fermentation. Food Technol. Biotechnol. 44(2): 235–240.

Fouad, W. A., I. H. Abbas., K. M. Elwan., M. A. Swellum and Kh. A, ElDougdoug. 2009. Biotransformation of Progesterone by Microbial Steroids. Journal of Applied Sciences Research. 5(1): 137-143.

Ghisalba, O., Meyer, H. P., Wohlgemuth, R. 2010. Industrial Biotransformation. 1- 18.

27


28

Haq, I., Ali, S., Ashraf, H., Butt, A.W., M. A. Qadeer., Shafiq, K., Iqbal, J. 2001. Effect of Mineral Nutrients on The Biosynthesis of Citric Acid by Aspergillus niger UV-6, Using Sucrose Salt Media. Pak. J. Bot. 33: 535-540.

Herbert, R. B. 1995. The Biosynthesis of Secondary Metabolites. Semarang. IKIP Semarang Press.

Hirschmann, G. S., Aranda, C., Kurina, M., Rodriguez, J. A., Theoduloz, C. 2007. Biotransformations of Imbricatolic Acid by Aspergillus niger and Rhizopus nigricans Cultures. Molecules. 12: 1092-1100.

Huang, L., Yagura, T., Chen, S. 2008. Sedative activity of hexane extract of Kaempferia galanga L. and its active compound. Journal of Ethnopharmacology. 120 : 123–125.

Kaempferia galanga L. Diakses 20 April 2012 dari www.plantamor.com.

Kosuge, T., Yokota, M., Sugiyama, K., Saito, M., Iwata, Y., Nakura, M. and Yamamoto, T. 1985. Studies on anticancer principles in Chinese medicines. II. Cytotoxic principles in Biota orientalis (L. ) Endl. And Kaempferia galanga L. Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 33(12): 5565-5567.

Liu, Z. J., Weng, L. P., Zhang, Q. L., Xu, H., and Ji, L. N. 2002. A Mathematical Model For Gluconic Acid Fermentation By Aspergilus niger. Biochemical Engineering Journal. 14: 137-141.

Lu, H., Zou, W. X., Meng, J. C., Hu, J., Tan, R. X. 2000. New bioactive metabolites produced by Colletrotricum sp, an endophytic fungus in Artemisia annua. Plant Sci. 151: 67-73.

28


29

Mahmoud, Y. A. G., Assawah, S. W., El-Sharkawy, S. H. and Salam, A. A. 2008. Flavone Biotransformation by Aspergillus niger and the Characterization of Two Newly Formed Metabolites. Mycobiology 36(2): 121-133.

Manitto, P. 1992. Biosynthesis Of Natural Products. Semarang. IKIP Semarang Press.

Mohanbabu, V. A., Shanbhag, T., K. Kumari M., Bairy K. L., and Shenoy S. 2011. Evaluation of Antiinflammatory and Analgesic Activities of Alcoholic Extract of Kaempferia Galanga In Rats. Indian J Physiol Pharmacol. 55 (1): 13– 24.

G. Narasimha., A. Sridevi, Viswanath, B., M. Chandra, S., Reddy, R. 2006. Nutrient effects on production of cellulolytic enzymes by Aspergillus niger. African Journal of Biotechnology Vol. 5 (5): 472-476.

Noro, T., Miyase, T., Kuroyanagi, M., Ueno, A., Fukushima, S., 1983. Monoamine oxidase inhibitor from the rhizomes of Kaempferia galanga L. Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 31: 2708–2711.

Othman, R., Ibrahim, H., Mohd, M. A., Mustafa, M. R. and Awang, K. 2006. Bioassay-guided isolation of a vasorelaxant active compound from Kaempferia galanga L. Phytomedicine. 13: 61-66.

Pertino, M., Hirschmann, G. S., Santos, L. S., Rodriguez, J. A., Theoduloz, C. 2007. Biotransformation of Jatrophone by Aspergillus niger ATCC 16404 : 275279.

Priede, M. A., Vanags, J. J., Viesturs, U. E. 2002. Performance of Aspergillus niger Cultivation in Geometrically Dissimilar Bioreactors Evaluated on the Basis of Morphological Analyses. Food Technol. Biotechnol 40 (1): 57-66.

29


30

Rao, S. C. V., Rao, R., and Agrawal, R. 2003. Enhanced production of verbenol, a highly valued food flavourant, by an intergeneric fusant strain of Aspergillus niger and Penicillium digitatum. Biotechnol. Appl. Biochem. 37: 145–147.

Radji, M. 2005. Peranan bioteknologi dan mikroba endofit dalam pengembangan obat herbal. Ilmu Kefarmasian. 3: 113-126.

Rahman, M. N. 2009. Aktivitas Anti Bakteri Senyawa Hasil Biotransformasi Kurkumin Oleh Mikroba Endofit Asal Kunyit. skripsi. FMIPA Institute Pertanian Bogor.

Rymowicz, W and Lenart, D. 2003. Oxalic acid production from lipids by a mutant of Aspergillus niger at different pH. Biotechnology Letters Vol. 25(12): 955-958.

S. B. Oyeleke., O. A. Oyewole., E. C. Egwim. 2011. Production of Protease and Amylase from Bacillus subtilis and Aspergillus niger using Parkia biglobossa (Africa Locust Beans) as Substrate in Solid State Fermentation. Advances in Life Sciences. 1(2): 49-53.

Shibuya, H., Kitamura, C., Maehara, S., Nagahata, M., Winarno, H., Simanjutak, P., Kim, H.s., Wataya, Y., Ohashi, K. 2003. Transformation of Cinchona Alkaloids into 1-N-Oxide Derivates by Endophytic Xylaria sp. Isolated from Cinchona pubescens. Chem Pharm Bull. 51(1): 71 – 74.

Simanjuntak, P., Bustanussalam., Prana, T. K., Ohashi, K., Shibuya, H. 2002. Biotransformasi senyawa alkaloid kinkona oleh kapang Xylaria sp. Menjadi alkaloid kinkona N-oksida. Majalah Farmasi Indonesia. 13: 95- 100.

Singer, A. C., Crowley, D.E., Thompson, I. P. 2003. Secondary Plant Metabolites and Phytoremediation and Biotransformation. TRENDS in Biotechnology. Vol 21 (3): 123-130. 30


31

Sirisangtragul, W., dan Sripanidkulchai, B. 2011. Effects of Kaempferia galanga L. and ethyl-p-methoxycinnamate (EPMC) on hepatic microsomal cytochrome P450s enzyme activities in mice. Songklanakarin Journal of Science and Technology. Vol 33 (4) : 411-417.

Srivastava, S., Luqman, S., Fatima, A., Darokar, M. P., Negi, A. S., Kumar, J. K., Shanker, K., Chanotiya, C. S., Tandon, S., Khanuja, S. P. S. 2009. Biotransformation of artemisinin mediated through fungal strains for obtaining derivatives with novel activities. Pharm Sci. 77: 87-95.

Suganthi, R., Benazir, J. F., Santhi, R., Ramesh, K. V., Anjana, H., Nitya M., Nidhiya, K. A., Kavitha, G., Lakshmi, R. 2011. Amylase Production By Aspergillus niger Under Solid State Fermentation Using Agroindustrial Wastes. International Journal of Engineering Science and Technology (IJEST). Vol 3(2): 1756-1763.

Taufikkurohmah, T. 2005. Synthesis Of p-Methoxy-Cynnamil p-Metoxycinamate From Ethyl p-Methoxycinamat Was Isolated From Dried Rhizome Kaempferia galanga L. As Sunscreen Compound. Indo. J. Chem. Vol 5 (3): 193 – 197.

Tewtrakul, S., Yuenyongsawad, S., Kummee, S. and Atsawajaruwan, L. 2005. Chemical components and biological activities of volatile oil of Kaempferia galanga Linn. Songklanakarin Journal of Science and Technology. 27(Suppl. 2): 503-507.

Umar, M. I., Asmaw, M. Z., Sadikun, A., Atangwho, I. J., Yam, M. F., Altaf, R. and Ahmed, A. 2012. Bioactivity-Guided Isolation of Ethyl-p-methoxycinnamate, an Anti-inflammatory Constituent, from Kaempferia galanga L. Extracts. Molecules. 17: 8720-8734.

31


32

Walker, J. M. and Rapley, R. 2002. Molekuler Biology and Biotechnology. Britain: Athenaeum Pr.

32


33

LAMPIRAN

Lampiran 1. Kerangka Penelitian

Metabolit Sekunder Utama (Senyawa x)

Kultur jamur Aspergillus niger dengan penambahan Metabolit Sekunder Utama (Senyawa x)

Proses biotransformasi

Ekstraksi hasil biotransformasi

Hasil biotransformasi dianalisa dengan KLT dan KCKT

Analisis data

33


34

Lampiran 2. Penyiapan Kristal Metabolit Sekunder Utama (Senyawa x) Yang diisolasi dari Kencur (Kaempferia galanga L.) Rimpang kencur segar 4,5 kg

Dibersihkan dari tanah yang menempel dan dicabut akar – akar yang menempel dengan dicuci dengan air

Dirajang dan dikeringkan dengan diangin-anginkan di udara yang terbuka

Serbuk rimpang kering kencur 754 g

Dihaluskan dengan blender

Maserasi 3x5 hari dengan n-heksana 2,5 L

Filtrasi

Filtrat

Ampas

Dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator

Filtrat pekat diendapkan pada suhu kamar

Kristal yang terbentuk disaring

Kristal direkristalisasi dengan n-heksana dan metanol

Kristal

34


35

Lampiran 3. Sertifikat Hasil Determinasi

35


36

Lampiran 4. Sertifikat Aspergillus niger ATCC 6275

36


37

Lampiran 5. Hasil perhitungan Rendemen

Berat simplisia awal

: 754 g

Berat kristal yang didapat

: 21,58

% rendemen

% rendemen

berat kristal yang didapat g berat serbuk simplisia awal g

,

x 100 %

x 100 %

= 2,86 %

37


38

Lampiran 6. Komposisi Medium Yang Digunakan

Nama Medium No. 1. PDA (Potato Dextrose Agar) Neogen

2.

Czapek- pepton

Komposisi Potatoes infusion Dektrosa Agar Aquadest Sukrosa Glukosa Peptone Water K2HPO4 KCl FeSO4.7H2O Aquadest

38

Jumlah 4g 20 g 15 g 1000 mL 15 g 15 g 5g 1g 0,5 g 0,01 g 1000 mL


39

Lampiran 7. Kencur (Kaempferia galanga L.)

Tumbuhan kencur (Kaempferia galanga L.)

Kencur (Kaempferia galanga L.) yang telah dikeringkan (Sumber : Koleksi Pribadi)

39


40

Lampiran 8. Jamur Aspergillus niger ATCC 6275

Aspergillus niger ATCC 6275

Jamur Aspergillus niger ATCC 6275 Perbesaran 40x (Sumber : Koleksi Pribadi)

40


Biotransformasi Metabolit Sekunder Utama (Senyawa X) dari Ekstrak n- Heksana Kencur (Kaempferia galanga L.) Oleh Jamur Aspergillus niger ATCC 6275

Recommend Documents