Biotechnologické syntézy - Aerobní fermentory

Biotechnologické syntézy Aerobní fermentory

Úvod Růst biomasy ve vsádkovém systému Přenos hmoty v bioreaktoru Měření a regulace základních veličin biotechnologického procesu 5. Separace biomasy 1. 2. 3. 4.

Antibiotika • Rozdělení: – přírodní – metabolické produkty bakterií, hub, řas, lišejníků, případně vyšších rostlin – syntetické a polosyntetické deriváty

• Působení: – blokují růst a rozmnožování bakterií

• Výroba: – biotechnologickým způsobem ve velkých fermentorech s použitím produkčních mikroorganismů

Růst biomasy ve vsádkovém systému • Fáze růstu: I: lag-fáze II: exponenciální III: stacionární IV: odumírání

• Rychlost tvorby biomasy: přírůstek počtu jedinců populace, nebo přírůstek jejich koncentrace v časovém intervalu, nebo přírůstek hmotnosti biomasy v časovém intervalu dn dm dc   d d d

n … počet jedinců populace m …hmotnost biomasy c … koncentrace biomasy

Růst biomasy ve vsádkovém systému • Rychlost tvorby biomasy: dn  f (n) d

(předpoklad: rychlost je funkcí pouze počtu jedinců populace)

• Ricatiho diferenciální rovnice - popisuje přechod z exponenciální na stacionární fázi růstu dn  kn(1  n) d

β…faktor inhibice

analytické řešení (pro počáteční podmínky:  = 0, n = n0) n0e k n 1  n0 (1  e k )

• Ricatiho rovnice s integrálním členem 

dn  kn(1  n)  k0  n( )d d 0

Růst biomasy ve vsádkovém systému • Specifická rychlost růstu biomasy μ 1 dc .  c d

předpoklad: μ=konst. => ln c = ln c0 +  2 

ln 2



(kinetika 1. řádu) 2 … čas potřebný ke zdvojení množství biomasy

m =  / 2

m … počet generací

c / c0 = 2m

koncentrace biomasy

Růst biomasy ve vsádkovém systému • Kinetické modely růstu biomasy – exponenciální rx … rychlost růstu biomasy μ … specifická růstová rychlost cx … koncentrace biomasy (platnost modelu je omezena, protože koncentrace biomasy nemůže růst neomezeně)

dcx rx    .cx dt

– Monodova rovnice -popisuje rychlost růstu biomasy, který je řízený jediným substrátem

rx 

 max cx cs K s  cs

=>



1 dcx  max cs  cx dt K s  cs

cS … koncentrace substrátu; μmax, KS … parametry

Růst biomasy ve vsádkovém systému • Vliv podmínek na růst biomasy – Teplota: závislost specifické růstové rychlosti na teplotě 1  Ea    RT  1  K exp   Ed    o RT  

 max  a1 exp  

Ea … aktivační energie růstu biomasy Ed … aktiv. energie denaturace biomasy

– pH (vliv pH není jednoznačně objasněn) závislost specifické růstové rychlosti na pH  max 

*  max

1

cH K 2  K1 cH

cH … koncentrace vodíkových iontů

Přenos hmoty v bioreaktorech • Bioreaktor = vícefázový reaktor (biomasa, g a l fáze) • Přestup kyslíku z plynné do kapalné fáze

Schéma přestupu kyslíku do kapalné fáze v bioreaktoru

Přenos hmoty v bioreaktorech – Rychlost přestupu kyslíku: dc1  k1ac1*  c1  dt

cl … konc. kyslíku v l fázi cl* … rovnovážná konc. kyslíku v l fázi kl… koeficient přestupu kyslíku a … měrný povrch mezifáz. rozhraní l-g

(rychlost procesu je limitována odporem přestupu kyslíku v kapalné fázi)

– Veličiny ovlivňující rychlost transportu kyslíku: • Kla - hodnota je podmíněna velikostí bublin plynu a charakterem kapalinového filmu • (cl*-cl) - hnací síla

Přenos hmoty v bioreaktorech – Velikost bublin: • Průměry bublin bývají někdy velmi malé (0,1-1 mm), za velké jsou považovány bubliny s průměrem > 6 mm • Rozměr bublin závisí na jejich tvorbě v distributoru plynu

Závislost koeficientu přestupu hmoty na průměru bubliny pro systém voda- kyslík

Přenos hmoty v bioreaktorech – Rozpustnost kyslíku ve vodě: • (cl*-cl) - hnací síla transportu kyslíku cl*-rovnovážná koncentrace rozpuštěného kyslíku (viz Henryho zákon)

• Rozpustnost kyslíku ve vodě klesá s teplotou Typická rovnovážná rozpustnost kyslíku ve fermentačním médiu je přibližně 0,25 mmol/l (při 20°C)

• Rozpustnost kyslíku výrazně závisí i na složení fermentačního média • Clk … kritická koncentrace rozpuštěného kyslíku (tj. minimální koncentrace kyslíku, pod kterou je růst mikroorganismů přímo závislý na koncentraci rozpuštěného kyslíku)

Přenos hmoty v bioreaktorech • Určení objemového koeficientu přestupu kyslíku – Určení kla - experimentálně - pomocí korelačních vztahů – Přestup kyslíku z bubliny vzduchu do prostředí s vlastnostmi blízkými vodě: • Laminární režim (Re 1) Sh = 0,39Gr1/3Sc1/3

• Turbulentní podmínky (Re 1) Sh = 2,0 +0,6Re1/2Sc1/3 Charakteristickým geometrickým rozměrem je průměr bublin plynu a za rychlost se dosazuje rychlost pohybu bubliny.

Přenos hmoty v bioreaktorech př. vztah pro výrobu antibiotik ve vsádkovém bioreaktoru s turbínovým míchadlem: N kl a  4.10   V  3

0, 65

 vg .103     V   

0 , 45

 ms    H / D  

0, 65

N … výkon míchadla V … objem reakční směsi vg … rychlost průtoku plynu D … průměr reaktoru H … výška kapalné směsi mS … počet sekcí míchadel

Přenos hmoty v bioreaktorech • Určení mezifázové plochy – Určení měrného povrchu pro kulovité bubliny plynu: 6Z a db

Z … zádrž plynu

• Přestup tepla – Všechny aerobní fermentační pochody jsou spojené s produkcí tepla. – Výměna tepla mezi obsahem vsádkového bioreaktoru a chladící nebo vyhřívací soustavou je obvykle neustálený děj X izotermní děj (odvádí se pouze generované teplo)

Přenos tepla v bioreaktorech – Nusseltovo číslo promíchávané kapaliny:    Nu   m Rebm Pr c    w  D Nu  a  Re m 

d m2 n



e

D … vnitřní průměr nádoby dm … průměr míchadla n … otáčky

Přenos tepla v bioreaktorech – Stanovení hodnoty koeficientu přestupu tepla na straně temperačního média (proudění v trubkách) • turbulentní proudění • pro Re 2300

   Nu  0,027 Re 0,8 Pr1/ 3    w 

   Nu  1,86Gz1/ 3    w 

0,14

0,14

– Pro probublávané reaktory přestup tepla ze suspenze biomasy na stěnu zařízení závisí na mimovrstvové rychlosti plynu a prakticky nezávisí na geometrických parametrech systému.     9391v 0, 25  w    

0, 35

empirická rovnice

Přenos hybnosti v bioreaktorech • Hydrodynamické podmínky Předpoklad: limitující složka je do systému trvale dodávána, její přenos k vnějšímu povrchu buněk je v rovnováze s úbytkem způsobeným biosyntézou.

nmax cs k 2 (c  cs )  k s  cs

k2 … koeficient sdílení hmoty jednotkovou plochou fázového rozhraní

bezrozměrné veličiny:

1 x x koncentrace: x = cs / c  Da x parametr:  = ks / c Damköhlerovo číslo: Da =max / k2c (charakterizuje míru vlivu difuze na rychlost procesu)

Přenos hybnosti v bioreaktorech Faktor účinnosti hydrodynamiky: ( = skutečná rychlost procesu / rychlost bez vlivu odporu proti přestupu hmoty)

x   x x(   1)   1 1 x  1

Pokud převládá vliv difuze na rychlosti procesu, pak

1   Da (o rychlosti procesu rozhoduje přenos hmoty a rychlost procesu nezávisí na parametrech kinetické rovnice a rovněž vliv teploty a pH je nevýrazný).

Měření a regulace základních veličin • Veličiny fyzikální povahy Teplota, tlak, hmotnost, výška hladiny, výška pěny, otáčky a příkon míchadla, vizkozita, průtok vzduchu, průtok kapaliny, … • Veličiny chemické povahy pH, redox potenciál, koncentrace rozpuštěného kyslíku, parciální tlak kyslíku a CO2 ve výdechových plynech, koncentrace některých iontů, ethanolu, methanolu, glukosy, …

Měření a regulace základních veličin • Veličiny biologické povahy celkové množství a koncentrace biomasy, primární a sekundární metabolity, nukleotidy, DNA/RNA, aminokyseliny, celkové množství proteinů, ATP/ADP, lipidy,… • Odvozené veličiny Objemový koeficient přestupu kyslíku kLa, rychlost spotřeby kyslíku, rychlost vývoje CO2, specifická rychlost růstu biomasy, …

Měření a regulace základních veličin

Měření a regulace základních veličin • Měření fyzikálních parametrů – Teplota - termistor, platinový odporový teploměr, termočlánek; – Tlak - membránový snímač s převodem na elektrický signál, tenzometry; – Hmotnost - tenzometrické snímače, vážení; (hmotnost vsádky lze určit z diference údajů membránových manometrů)

– Výška hladiny - kontaktní čidla - vodivostní či kapacitní sonda; – Výška pěny - kontaktní čidla - vodivostní či kapacitní sonda, snímač hydrostatického tlaku zabudovaný do stěny nádrže;

Měření a regulace základních veličin – Otáčky míchadla - indukčně citlivé prvky (tachodynamo), pulsní čítače, dynamometr; – Příkon míchadla - torzní dynamometr, tenzometr zabudovaný na hřídel míchadla; – Průtok vzduchu - rotametr s převodníkem, který poskytuje elektrický signál (optický, indukční, nebo odporový snímač), clonka s vysílačem tlakové diference; – Průtok kapalin - podobné snímače jako při měření průtoků plynů;

Měření a regulace základních veličin • Měření chemických parametrů – pH - skleněné elektrody; – Redox potenciál - platinová elektroda v kombinaci s referentní elektrodou; – Obsah rozpuštěného kyslíku - galvanické (potenciometrické) a polarografické (ampérometrické) elektrody; – Rozpuštěný CO2 - iontově selektivní elektrody opatřené membránou propustnou pro plyny, tepelně sterilované elektrody se zakrytou membránou;

Měření a regulace základních veličin – Anorganické ionty - iontově selektivní elektrody; – Analýza plynů - paramagnetická rezonance, IČ spektrometrie, měření tepelné vodivosti, hmotové spektrometry;

Měření a regulace základních veličin • Měření fyziologických veličin – Nejdůležitější údaje o stavu a vývoji procesu z hlediska optimálního řízení. – Většina veličin není průběžně měřitelná (koncentrace biomasy, produktu, substrátu; specifické a absolutní rychlosti růstu biomasy, tvorby produktu).

Měření a regulace základních veličin • Měření fyziologických veličin – Metody založené na nových principech měření: optoelektronika a užití optických vláken (měření světelné absorpce, fluorescence, reflexe, barvy, turbidity, luminiscence) – Polovodičové křemíkové senzory - iontově selektivní senzory na bázi iontově selektivních FET (Field Effect Transistors) – Enzymové elektrody - stanovení některých organických sloučenin (glukosa, laktosa, maltosa, aminokyseliny, ethanol, methanol, acetaldehyd, penicilin, …)

Měření a regulace základních veličin • Řízení biotechnologického procesu Řídící systémy: – systémy řízení pro stabilizaci podmínek kultivace, nebo s postupnou změnou kultivačních podmínek podle zadané trajektorie • regulační smyčky teploty, pH, tlaku, míchání, aerace, rozpuštěného kyslíku a odpěňování;

– systémy řízení s aplikací tzv. pokročilých algoritmů řízení • algoritmy již vyžadují znalost dalších stavových veličin jako je koncentrace biomasy, produktu, substrátu a umožňují konkrétní proces optimalizovat;

Měření a regulace základních veličin • Regulace základních kultivačních podmínek – Regulace teploty • Regulace přes duplikátor s teplosměným médiem cirkulujícím v uzavřeném temperačním okruhu. Chlazení se zajišťuje zaváděním chladící vody z rozvodu do temperačního okruhu, ohřev pak průtočným elektrickým topidlem nebo přiváděním páry do okruhu.

– Regulace pH • Regulace se provádí přídavkem kyseliny, nebo zásady ze zásobníku. Problémem je značná nelinearita mezi elektrickým signálem pH elektrody a regulačním zásahem.

Měření a regulace základních veličin – Obsah rozpuštěného kyslíku (regulace je možná 4 způsoby) • změna kLa (objemový koeficient přestupu hmoty v systému) - změny ve frekvenci otáčení míchadla • změna průtoku kyslíku - mění se buď poměr kyslíku k inertnímu plynu dodávanému do fermentoru, nebo průtok vzduchu • změna přívodu substrátu • změna tlaku - zvyšováním pracovního tlaku dojde ke zvýšení rozpustnosti kyslíku ve fermentačním médiu

Měření a regulace základních veličin – Odpěňování • Tvorba pěny je nežádoucí (z tenkých kapalinových filmů je kyslík rychle buňkami vyčerpán a neúčinná pěna zaujímá značný prostor v reaktoru). Pěna strhávaná výstupním vzduchem zanáší sterilizační filtry a zvyšuje možnost zarůstání mikroorganismů v potrubí, nebo dokonce jejich nežádoucí únik do okolí. • Metody odpěňování: – Mechanické - rozbití pěny rotačním pohybem speciálně tvarovaného kotouče, odpěňování ultrazvukovými vlnami, zrychlený průtok pěny zúženým otvorem; – Chemické - odpěňovací prostředky vytěsňují povrchově aktivní látky způsobující pěnění;

Separace biomasy • Mikroorganismy tvoří s kultivačním prostředím v bioreaktoru suzpenze • Používané chemicko-inženýrské operace: – Filtrace – Sedimentace – Odstřeďování – Ultrafiltrace