BIOR1

Bioorganická chemie OCH/BIOR1 ZS 2016/2017

Přednáška 4 – Bioorganická chemie enzymů

[email protected] 1

4. hodina – 10. 10. 2016 - Bioorganická chemie enzymů    

Opakování obecných vlastností. Inhibice enzymů a drug design. Využití enzymů v organické syntéze, enzymové inženýrství. Látky inhibující enzymové reakce – syntéza a mechanismus účinku významných inhibitorů proteosyntézy, nukleosyntézy, strategie syntézy analog

koenzymů.  Antibody-catalyzed organické reakce.  Enzymové modely - biosyntéza skvalenu, biomimetické cykliazce polyenů.

2

Obecné vlastnosti enzymů  z řeckého "zymé" - kvasnice  specifické katalyzátory chemických reakcí v živých organismech  i v nejjednodušší buňce je více než 3000 enzymu, druhová specifita  zvyšují rychlost reakce oběma směry, neovlivňují složení rovnovážné směsi (směr je dán energetickými a koncentračními poměry)  různé proteiny / také RNA (ribozym)  s kovalentně vázanou prostetickou skupinou (kovem)  oligomerní / multienzymové komplexy / asociované s membránami atd.  tvoří izoformy - různá distribuce v těle i v buňce  specifické, vysoce účinné  fungují za mírných podmínek  in vivo - mohou být regulovány  in vitro - citlivé na vnější podmínky 3

Enzymy  biologické katalyzátory  od chemických katalyzátorů se odlišují:     

zvyšují reakční rychlost víckrát než chemické mírné reakční podmínky (teplota 20 - 400C, tlak 0,1 MPa, pH kolem 7) vyšší specifita reakce nejsou vedlejší produkty úcinek lze snadno regulovat, často na nekolika úrovních

 působí snížení energetické bariéry, reakce probíhá uvnitř aktivního centra, efekt přiblížení (vazba 2 substrátu těsně k sobe), specifické prostředí aktivního centra (ztráta hydratačního obalu, vyšší koncentrace substrátu ( až105x), reaktivnější skupiny), efekt orientace substrátu (snížení aktivační energie)

4

Historie enzymologie  19. stol. – pozorování kvašení a trávení  1810 – Gay-Lussac - kvasinky rozkládají cukr na ethanol a CO2  1897 – E. Buchner - extrakt z kvasinek byl schopný tvořit ethanol a glukózu  1894 – E. Fisher - enzymová specifita (hypotéza zámku a klíče)  1926 – J. Sammer - izolace prvního enzymu ureázy  1963 – zveřejněna první AK sekvence enzymu (hovězí pankreatická ribonukleáza)

5

Klasifikace enzymů  6 hlavních tříd 1. Oxidoreduktázy 2. Transferázy 3. Hydratázy 4. Liázy 5. Izomerázy 6. Ligázy

6

Kinetika enzymových reakcí Rychlost závisí na:  koncentraci substrátu a množství enzymu  fyzikálně-chemických vlastnostech prostředí  přítomnosti efektorů

7

Kinetika enzymových reakcí E+S

k1 k-1

ES

k2 k-2

E+P

 rovnice Michaelise a Mentenové  vo je počáteční rychlost (nejvyšší hodnota)  Vmax = maximální rychlost (pro danou koncentraci enzymu)  Km = Michaelisova konstanta

[S] vo  Vmax [S]  K m 8

Kinetika enzymových reakcí KM Michaelisova konstanta  nezávislá na [E]  závisí na: prostředí (pH, t, efektory), substrátu  charakterizuje katalytické vlastnosti enzymu vzhledem k příslušnému substrátu

 je úměrná disociační konstantě komplexu ES  čím nižší je KM, tím vyšší je afinita enzymu k danému substrátu  Hodnoty KM : 10-1 - 10-6 mol/l

9

Kinetika enzymových reakcí

vo

Vmax

enzym nasycen substrátem

Vmax 2

Km

[S] mol/l 10

Faktory ovlivňující rychlost enzymové reakce Teplota

 S rostoucí teplotou rychlost reakce vzrůstá, optimální je kolem 40C, při vyšších teplotách rychlost klesá – denaturace enzymu

pH

 Ovlivňuje stav ionizace skupin v aktivním místě enzymu a jeho okolí  konstatní pH v tělesných tekutinách udržují pufrační systémy  každý enzym má pH optimum, intracelulární enzymy kolem pH 7  trávicí enzymy mají odlišné: pepsin pH 2

Aktivátory

 Umožňují nebo urychlují enzymovou reakci  Často ionty dvojmocných kovů: Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+

Inhibitory

 Zpomalují nebo zastavují enzymovou reakci  Kompetitivní: podobné substrátu, soutěží o aktivní místo  Jiné: např. ionty těžkých kovů, pevně se vážou na důležité skupiny

Koncentrace substrátu

 Při vysoké koncentraci substrátu je enzym nasycen, reakce probíhá maximální rychlostí, graficky vyjadřuje saturační křivka 11

Efektory  přirozené (metabolity, koenzymy)  nepřirozené (léčiva, jedy)

 pozitivní = aktivátory (ionty kovu, organické látky, váží se vratně na molekulu)  snižující = inhibitory (látky nejrůznější povahy, polypeptidy-trypsin, srážení krve, léky)

12

Výskyt enzymu v organismu  buněčná lokalizace (mitochondrie, jádro, cytoplazmatické retikulum) Buněčné (intracelulární) enzymy  mají svou funkci uvnitř buňky, v místě vzniku  při poškození buňky se uvolní a dostanou se do krve, kde lze zjistit jejich zvýšenou aktivitu (za patologických stavů - změna permeability buněčné membrány - vyplavení enzymu do krve - vyšší koncentrace  příklady: ALT, AST, CK, GMT, LD ... Sekreční enzymy  působí jinde  enzymy velkých žláz (pankreas) – lipasa, amylasa ...  jaterní enzymy na export: koagulační faktory 13

Enzymy jsou stereospecifické katalyzátory existují dva typy přeměn:  achirální substrát  chirální produkt(jeden enantiomer) např. pyruvát  L-laktát, fumarát  L-malát

 chirální substrát(jeden enantiomer)  produkt L-alanin

 pyruvát (D-alanin nereaguje)

D-glukosa

  pyruvát (L-glukosa nereaguje)

chirální signální molekula  komplex s receptorem  biologická odpověď chirální léčivo(ant)agonista  komplex s receptorem  farmakologická odpověď

14

Význam enzymu v medicíně  Diagnostická funkce - měření katalytické koncentrace enzymu v krevní plazmě:  sekrecní enzymy - dodávány z orgánu, aby plnily fyziologické funkce, aktivita klesá při poškození orgánu  enzymy intracelulární - aktivita mnohonásobně vzroste při poškození orgánu, rozlišení postižení pomocí izoenzymu  Chemická funkce - stanovení různých analytů (specifičtější, citlivější, rychlejší, jednodušší)  Léčiva - trávicí enzymy, hydrolasy (čištění nekrotických ran, rozpouštění trombu )

15

Mnohá léčiva jsou inhibitory enzymů  Acetylsalicylová kyselina (cyklooxygenasa)  Ibuprofen (cyklooxygenasa)  Statiny (HMG-CoA reduktasa) – hypolipidemika, snižují syntézu cholesterolu (lovastatin)  Inhibitory ACE (angiotensin konvertující enzym) – léčba hypertenze (enalapril)  Reverzibilní inhibitory acetylcholinesterasy (neostigmin) – nervosvalové choroby, pooperační atonie střev  Selektivní inhibitory mozkové acetylcholinesterasy (rivastigmin, galantamin) Alzheimerova choroba

16

Antibiotika inhibují enzymy nutné pro určitý životní děj bakterií  Peniciliny – inhibují transpeptidasy (výstavba buněčné stěny)

 Tetracykliny, makrolidy, chloramfenikol – inhibice proteosyntézy  Fluorované chinolony (ciprofloxacin) – inhibice bakteriální gyrasy (topoisomerasy II) (rozplétání DNA během replikace)

17

Enzymy jako analytická činidla Enzym

Původ enzymu

Stanovení

Glukosaoxidasa

Aspergillus niger

glukosa

Peroxidasa

křen (Armoracia sp.)

glukosa

Lipasa

Candida sp.

triacylglyceroly

Cholesteroloxidasa

Pseudomonas sp.

cholesterol

Urikasa

Candida sp.

kyselina močová

Bilirubinoxidasa

Myrothecium sp.

bilirubin

Ureasa

bob (Canavalia sp.)

močovina

Laktátdehydrogenasa

Pediocus sp.

ALT, AST

Taq polymerasa

Thermus aquaticus

PCR metoda

18

Proteasy v terapii Lokální působení:  fibrinolyzin, chymotrypsin, kolagenasa  po lokální aplikaci vedou k lýze nekrotické tkáně, nepoškozují zdravé buňky (obsahují inhibitory proteas)  hnisavé rány, bércové vředy, diabetické gangrény, dekubity apod. Celkové působení:  trypsin, chymotrypsin, rostlinné proteasy - papain (papaya), bromelain (ananas)  některé studie naznačují protizánětlivý účinek, ovlivnění imunity u autoimunitních onemocnění  indikace: pomocná léčiva při revmatoidní artritidě, traumatické záněty a otoky, lymfedémy, apod., volně prodejné přípravky (Wobenzym, Phlogenzym aj.) 19

Pankreatické enzymy v terapii  směs enzymů (lipasy, amylasy, proteinasy) získaná z vepřových pankreatů  indikace: sekreční nedostatečnost pankreatu různé etiologie, cystická fibróza  užívání: 3 × denně při jídle

 řada přípravků volně prodejných

20

Asparaginasa v terapii leukémie  Katalyzuje hydrolýzu amidové skupiny asparaginu  Asn + H2O  Asp + NH3 

L-asparagin

je nezbytný pro proteosyntézu některých nádorových buněk,

Hydrolýza Asp vede k omezení proliferace  Indikace: akutní lymfoblastické leukemie

21

Enzymová fibrinolytika  léčiva, která rozpouštějí krevní sraženiny v cévách

 urokinasa (lidská)  štěpí plazminogen na plazmin – ten vyvolá degradaci fibrinu a trombolýzu  indikace: žilní trombóza, plicní embolie, akutní IM

22

Enzymová inhibice a drug design

23

Enzymová inhibice a drug design  Drug = léčivo – malá organická molekula, která ovlivňuje celulární aktivitu ve smyslu terapeutického efektu (váží se na cíl v buňce, kde blokují fyziologické funkce cíle nebo mimikují jeho efekt).  Léčivo musí interagovat specificky se specifickou biomolekulou (se specifickým cílem).

 K získání potenciálního kandidáta na nový lék proti specifické nemoci – drug design – „rational drug design“ nebo „structure based drug design“ – design malých molekul, které jsou komplementární ve tvaru a náboji k cílové biomolekule.  Agonista - léčivo, které je schopné po navázání na receptor vyvolat fyziologickou odpověď.  Antagonista - ten, který je schopen se vázat, ale odpověď nespouští (redukují působení agonisty v cílovém místě).

24

Enzymová inhibice a drug design Co je Cíl léčiv?  Paul Ehrlich - německý vědec, jako první navrhl vztah mezi interakcí léčiva a jeho vazbou na „receptor“ (resp. biologický cíl léčiva).

 Předpokládá se, že potenciálních cílů využitelných v terapii je 2 až 3 tisíce (někdy je uváděno až 8 tisíc).  Současná léčiva využívají cca 330 molekulárních cílů, z nichž 270 je kódováno lidským genomem a 60 patogenními organismy.  Hlavní biologické cíle můžeme rozdělit podle umístění a funkce na: 1) Cíle uvnitř buněk – enzymy, jaderné (nukleární) receptory, nukleové kyseliny 2) Cíle na povrchu buněk - přenašeče (transportéry), iontové kanály, receptory 3) Další mechanismy účinků (např. antacida - neutralizují HCl v žaludku) 25

Enzymová inhibice a drug design Typy cílů léčiv 1. Enzymy 2. Substráty, metabolity a proteiny 3. Receptory/jaderné receptory hormonů 4. Iontové kanály 5. Transportní proteiny 6. DNA/RNA a ribosom

7. Cíle monoklonálních protilátek 8. Cíle různých fyziochemických mechanismů 9. Neznámé cíle některých látek 26

Enzymová inhibice a drug design Enzymové cíle léčiv

27


28


29


30


31


32


33


34


35


36


37


38

Enzymová inhibice a drug design Enzymové cíle léčiv 1. Analoga substrátu 2. Inhibitory tranzitního stavu 3. Irreversibilní inhibitory - 25 enzymů, které jsou irreversibilně inhibovány (1) Serine Type D-Ala-D-Ala Carboxypeptidase; (2) β-Lactamase; (3) Acetylcholinesterase; (4) UDP-N-acetylglucosamine 1-Carboxyvinyltransferase (Fosfomycin); (5) Prostaglandin-Endoperoxide Synthase (Aspirin); (6) Unspecific Monooxygenase; (7) Amine Oxidase (Flavin-Containing); (8) Thymidylate Synthase; (9) Ornithine Decarboxylase; (10) Alanine Racemase; (11) H+/K+ ATPase; (12) Triacylglycerol Lipase; (13) Ribonucleoside-Diphosphate Reductase; (14) Iodide Peroxidase; (15) Thyroxine 5´-Deiodinase; (16) Aldehyde Dehydrogenase; (17) Thrombin; (18) Factor Xa; (19) 4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase; (20) Vitamin K Epoxide Reductase; (21) Ile tRNA Synthetase; (22) DNA-Directed DNA Polymerase; (23) 3-Oxo-5-α-steroid 4-Dehydrogenase; (24) Enoyl-Acyl Carrier Protein Reductase; (25) Xanthine Oxidase.

4. Reaction Intermediate Traps 5. Boronic Acid-Based inhibitory 6. Nekompetitivní inhibitory 7. Aktivátory

39

Enzymová inhibice a drug design Enzymové cíle léčiv Analoga substrátu

40


41


42

Enzymová inhibice a drug design Enzymové cíle léčiv Inhibitory tranzitního stavu

43

Enzymová inhibice a drug design Enzymové cíle léčiv Inhibitory tranzitního stavu Inhibice HIV-1 proteázy (aspartátové) pomocí analog tranzitního stavu  HIV-1 proteáza štěpí polyprotein z HIV genomu za produkce funkčního proteinu  Je to homodimer, aktivní místo je dvojnásobně symterické  Obsahuje 2 Asp rezidua, jedno s vysokým pKa a jedno s názkým pKa

44

45

Enzymová inhibice a drug design Enzymové cíle léčiv Irreversibilní inhibitory

46


47


48


49


50


51

Enzymová inhibice a drug design Enzymové cíle léčiv Reaction Intermediate Traps

52

Enzymová inhibice a drug design Enzymové cíle léčiv Reaction Intermediate Traps

53

Enzymová inhibice a drug design Enzymové cíle léčiv Nekompetitivní inhibitory

54

Antibody Catalyzed Organic Reaction

55

Antibody Catalyzed Organic Reaction Antibody – protilátky  Protilátky (imunoglobuliny) jsou glykoproteiny, které jako součást imunitního systému obratlovců slouží k identifikaci a zneškodnění tělu cizích látek (bakterií, virů).  Jedná se o proteiny ve tvaru Y, které jsou produkovány B-lymfocyty.  Protilátky formují vícenásobné nekovalentní vazby s antigenem.

 Vazebné místo je obvykle komplementární k cílovému antigenu, přesto může docházet ke křížové reakci pokud antigeny sdílejí části molekul. 56

Antibody Catalyzed Organic Reaction Antibody – protilátky  Základní strukturou protilátek jsou dva identické krátké polypeptidy (lehké řetězce) a dva identické dlouhé polypeptidy (těžké řetězce), které jsou propojeny disulfidovými můstky.  Oba typy řetězců mají konstantní a variabilní část.  Horní část tzv. Fab (fragment, antigen binding) region je tvořen konstantní a variabilní částí lehkého i těžkého řetězce, zatímco základna tzv. Fc (fragment, crystallizable) region tvoří konstantní část dvou těžkých řetězců.  Ačkoli je obecná struktura protilátek velmi podobná, malý region variabilní část i je vysoce specifický pro každou protilátku a vytváří vazebné místo pro jeden konkrétní antigen.  There are five different antibody isotypes, based on heavy chain they possess, are known in mammals, which carry out different roles, and help direct the appropriate immune response for each different type of foreign object they encounter 57

Antibody Catalyzed Organic Reaction Antibody – protilátky  Antigeny jsou molekuly, které v organismech vyvolávají tvorbu specifických protilátek (antibody) nebo specifickou imunitní buněčnou odpověď.  Jedná se většinou o proteiny, polysacharidy nebo nukleové kyseliny.  Reakcí imunitního systému je snaha antigen zničit nebo neutralizovat.  Příkladem antigenů jsou i vakcíny, které po aplikaci vyvolají tvorbu protilátek.

 Exogenní antigeny pocházejí z vnějšího prostředí, např. alergeny, viry.  Do organismu se pak dostávají vdechnutím, pozřením, vypitím nebo přes kůži.  Endogenní antigeny vznikají v organismu jako výsledek buněčného metabolismu (normálního nebo poškozeného u autoimunitních nemocí – revma, diabetes atd.) nebo po infekci buňky viry nebo bakteriemi.

58

Antibody Catalyzed Organic Reaction Transition-State Theory of Catalytic Antibodies  Víme, že většina chemických transformací v biologickém světě je katalyzovaná enzymy a mnohé jsou katalytické ribozymy.  Enzymy jsou proto důležité biokatalyzátory, vykazují vysokou selektivitu a specifitu.  Proto vyvstala idea, že pokud budeme schopni vytvořit proteinový katalyzátor, který bude mimikovat enzymovou selektivitu a specifitu, usnadní nám to porozumět tomu jak enzymy pracují, atd.  1940 - Linus Pauling – navrhl myšlenku, že enzymová katalýza je důsledek selektivního rozpoznání tranzitního stavu.  Ve stejném roce pak publikoval první protilátku, kde diskutoval první mechanismus rozpoznání v immunokomplexech.  „In order to catalyze a reaction an enzyme must recognize the transition state in a selective way, i.e. it must stabilize it better than the substrate.”

59

Antibody Catalyzed Organic Reaction Transition-State Theory of Catalytic Antibodies  Koncept tranzitního stavu u protilátek – rozšíření stávající teorie transitního stavu vyvinuté Evansem et al. a Eyring et al. k vysvětlení chemické katalýzy.

 Základní návrh je ten, že rychlost reakce souvisí s rozdílem i Gibsově volné energii (G0) mezi základním stavem a tranzitním stavem reakce.  Katalýza probíhá snadno snížením energie tranzitního stavu (i.e. by transition state stabilization or by elevating the energy of the substrate i.e. by substrate destabilization).  Pauling has applied this concept to enzyme catalysis by stating that an enzyme preferentially binds to and thereby stabilizes the transition state for a reaction relative to the ground state of substrate(s).  This has become a classical theory in enzymology and is widely used to explain the rate accelerations of an enzyme catalyzed reaction.  The idea of creating catalytic proteins along with the transition state analogues directs the generation such designer protein catalysts popularly known as „Catalytic Antibodies“ or „Abzymes“. 60

Antibody Catalyzed Organic Reaction Abzymy – protilátky s enzymovou aktivitou  Donedávna se mělo za to, že protilátky působí pouze pasivním způsobem a že samy nejsou schopny cizorodé molekuly ani mikroby ničit.  Když se před třiceti lety zjistilo, že některé protilátky mohou mít kromě vazebné aktivity i aktivitu enzymatickou, považovalo se to za kuriozitu bez většího významu.  Postupně však vycházelo najevo, že enzymaticky aktivní protilátky neboli abzymy (z antibody-enzyme) mohou mít jak fyziologický význam, tak praktické využití.  Enzymatická aktivita některých protilátek vlastně není příliš překvapivá.  Uvážíme-li, jaké obrovské množství rozličných vazebných míst protilátek existuje, dá se očekávat, že v některých z nich bude uspořádání kritických aminokyselin obdobné jako u nějakých enzymů.

61

Antibody Catalyzed Organic Reaction Abzymy – protilátky s enzymovou aktivitou  Abzymy tak mohou kombinovat vysokou selektivitu protilátek se schopností pozměňovat (nejčastěji štěpit) navázaný antigen.  Postupně bylo objeveno mnoho přirozených abzymů.  Vysoce čištěné preparáty imunoglobulinů připravených ze séra zdravých lidí obsahují proteázové, fosfatázové či DNAzové aktivity.  Abzymy jsou mnohem hojnější u pacientů, kteří trpí autoimunitními, nádorovými či alergickými chorobami.  Některé z nich mohou přispívat k patologii těchto onemocnění, protože poškozují důležité makromolekuly nebo z nich vytvářejí produkty podporující růst nádorových buněk.

62

Antibody Catalyzed Organic Reaction Abzymy – protilátky s enzymovou aktivitou  Zvláštní kapitolou je nedávno zjištěná schopnost většiny protilátkových molekul katalyzovat oxidační reakce, při nichž vzniká za fyziologických podmínek z vody a peroxidu vodíku malé množství ozonu.  Tento vysoce reaktivní plyn může ničit mikroorganizmy, na něž jsou navázány specifické protilátky.  Produkce ozonu však zřejmě není spojena s vazebným místem protilátek – enzymově aktivní místo je v jiné části protilátkové molekuly.  Zvláštním případem jsou protilátky, které nejprve vytvoří s cizorodou látkou obvyklý nekovalentní komplex, a později s ním reagují tak, že vznikne pevné kovalentní spojení.  Takové protilátky jsou pak ideální pro detekci příslušných cizorodých látek.

63

Antibody Catalyzed Organic Reaction Abzymy – protilátky s enzymovou aktivitou  Velké úsilí bylo věnováno přípravě abzymů s žádoucími enzymovými aktivitami.  Jejich tvorbu lze podpořit syntetickými antigeny, které svou konformací napodobují přechodné produkty enzymatické reakce.  Připraveny již byly stovky monoklonálních protilátek s nejrůznějšími aktivitami. Jedny jsou schopny vázat a degradovat v těle kokain či nikotin, jiné katalyzují přeměnu biologicky neaktivního derivátu na účinné cytostatikum, další likvidují nežádoucí oxidační produkty vznikající v kůži po osvitu ultrafialovým zářením.  Velká pozornost se věnuje zdokonalování abzymů schopných štěpit povrchový glykoprotein HIV nebo agregáty β-amyloidového peptidu způsobující Alzheimerovu chorobu.  Takové protilátky se vyskytují i přirozeně a mohou být součástí obranných mechanizmů proti těmto chorobám.  Systematické obměňování detailů jejich struktury by mělo vést k lepším, terapeuticky použitelným protilátkovým enzymům.

64

Antibody Catalyzed Organic Reaction Abzymy – protilátky s enzymovou aktivitou

65

Antibody Catalyzed Organic Reaction Transition-State Theory of Catalytic Antibodies

“If complementarity between the active site and the transition state contributes significantly to enzymatic catalysis, it should be possible to synthesize an enzyme by constructing such an active site. One way to do this is to prepare an antibody to a haptenic group, called “Hapten” which resembles the transition state of a given reaction. The combining site of such antibodies should be complementary to the transition state and should cause an acceleration by forcing bound substrates to resemble the transition state.”

(William p. Jencks, Catalysis in Chemistry and Enzymology, 1969, p.288) 66

Antibody Catalyzed Organic Reaction Transition-State Theory of Catalytic Antibodies  První příklady antibody catalyzed reakcí jsou založeny na TS hydrolýzy ester/amidové vazby, která zahrnuje:  Zahrnuje formaci vysokoenergetického tetraedrálního intermediátu.  Mimikaci TS tohoto tetraedrálního intermediátu použitím fosfonátů nebo fosfonoamidátů.  Protilátky specificky vážou analoga TS a stabilizují více ve srovnání se substrátem v základním stavu.  Zlepšení rychlosti reakce – stabilizace tranzitního stavu.

67

Antibody Catalyzed Organic Reaction Transition-State Theory of Catalytic Antibodies  Mechanismus hydrolýzy esterové / amidové vazby

68

Antibody Catalyzed Organic Reaction Transition-State Theory of Catalytic Antibodies KS = Dissociation constant for the antibody − substrate complex; KTS = Dissociation constant for the antibody − transition-state complex; Kcat = Rate constant for the reaction of the antibody − substrate complex; Kuncat = Rate constant for the reaction without antibody.

69

Antibody Catalyzed Organic Reaction Transition-State Theory of Catalytic Antibodies

70

Antibody Catalyzed Organic Reaction Transition-State Theory of Catalytic Antibodies Vazebné místo antigenu se váže komplementárně na protilátku, bez další reakce.

Naopak aktivní místo enzymu nejen že rozpozná substrát, ale také komplementárně umožňuje vznik přechodového stavu a stabilizuje ho.

X 71

Antibody Catalyzed Organic Reaction Monoklonální protilátky  Specifickou formou protilátek jsou tzv. monoklonální protilátky (mAb – monoclonal Antibody).  Jedná se o chemicky čisté látky, které reagují jen s jedním epitopem v molekule antigenu.

 Dříve se protilátky získávaly z imunizovaných zvířat, kterým byla podána cizorodá látka.  Kromě požadované protilátky (například proti hadímu jedu) však sérum obsahovalo velké množství jiných protilátek, což způsobovalo řadu komplikací.  Dnes se průmyslově vyrábějí protilátky vytvářené jedním buněčným klonem (monoklonální protilátky) zaměřené specificky proti jednomu antigenu, například proti buněčnému receptoru.  Protilátka je však bílkovinné povahy, pokud člověku podáme protilátku vytvořenou zvířecími buňkami, může být lidským organismem rozpoznána jako cizí antigen. To vede k nežádoucím reakcím. 72

Antibody Catalyzed Organic Reaction Monoklonální protilátky  Vědci již umí kombinovat malou část zvířecí protilátky (část rozpoznávající antigen) a větší část lidské protilátky - takovým protilátkám se říká humanizovaná protilátka.  Při jejím použití je riziko reakce na danou protilátku výrazně sníženo.

 Postup výroby monoklonálních protilátek byl vyřešen technikou fúze myelomu a B-lymfocytu, za kterou Kohler, Milstein a Kaj Jerne získali v roce 1975 Nobelovu cenu.  V roce 1988 Greg Winter a jeho tým objevili metodu humanizace monoklonálních protilátek a tím odstranili nežádoucí reakce pacientů na tyto protilátky.

73

Antibody Catalyzed Organic Reaction Přístupy k designu haptenů  Hapten je látka o nízké molekulové hmotnosti, která dokáže vyvolat imunitní odpověď pouze po navázání na látku s vyšší molekulovou hmotností (např. bílkovinu).  Samotná makromolekula (bez navázaného haptenu) může, ale nemusí způsobit imunitní reakci.  Hapteny se mohou těsně navázat na přenosovou molekulu (nejčastěji protein) kovalentní vazbou.  Sám hapten nevyvolává imunitní odpověď z důvodu své malé velikosti (<5kDa). Jakmile je protilátka vytvořena, může se navázat na hapten.  Proto mohou být hapteny využity při konstrukci nákladově efektivních detekčních kitů v široké oblasti využití (pesticidy, herbicidy, léčiva, vitamíny, steroidy, hormony, toxiny, barviva, výbušniny).  Například databáze haptenů „HaptenDB“ obsahuje přes 2000 protilátek k haptenům.

74

Antibody Catalyzed Organic Reaction Přístupy k designu haptenů

75

Antibody Catalyzed Organic Reaction Přístupy k designu haptenů

76

77

Antibody Catalyzed Organic Reaction Přístupy k designu haptenů  Catalytic Antibodies Generated Against Transition-State Analogs (TSAs)       

Antibody-catalyzed acyl transfer reactions Antibody-catalyzed cationic cyclization Antibody-catalyzed disfavoured ring closure Antibody-catalyzed Diels–Alder reaction Antibody-catalyzed oxy-Cope rearrangement Antibody-Catalyzed Hydride Transfer Reaction Disadvantages with TSA-Based Approaches

 ‘Bait-and-switch’ Strategy  The Reactive Immunization Strategy  Cofactor Approaches 78

Antibody Catalyzed Organic Reaction Přístupy k designu haptenů Antibody-catalyzed acyl transfer reactions

79


80


81

Antibody Catalyzed Organic Reaction Přístupy k designu haptenů Antibody-catalyzed cationic cyclization

82

Antibody Catalyzed Organic Reaction Přístupy k designu haptenů Antibody-catalyzed disfavoured ring closure

83

Antibody Catalyzed Organic Reaction Přístupy k designu haptenů Antibody-catalyzed Diels–Alder reaction

84

Antibody Catalyzed Organic Reaction Přístupy k designu haptenů Antibody-catalyzed Diels–Alder reaction

85

Antibody Catalyzed Organic Reaction Přístupy k designu haptenů Antibody-catalyzed oxy-Cope rearrangement

86

87

88

Antibody Catalyzed Organic Reaction Přístupy k designu haptenů Antibody-Catalyzed Hydride Transfer Reaction

89

Biomimetické polyenové cyklizace

90

Biomimetické polyenové cyklizace Biomimetická syntéza nebo syntéza biogenního typu  Biomimetická syntéza může být definována jako design a provedení laboratorních reakcí založené na stanovených nebo předpokládaných biochemických transformacích.  Zahrnuje totální syntézu přírodních látek.  Van Tamelen’s Definition: A specific reaction or a sequence of reactions that mimic a proposed biological pathway is defined as biomimetic synthesis.  Miguel A. Sierra’s Definition: The term biomimetic synthesis is also used to describe a sequence of reaction carried to support a biogenetic hypothesis.

Biosynthesis or Biogenetic Synthesis  Dirk Trauner - The reaction or reaction sequence occurred in organism or its immediate environment will be viewed as biosynthesis. 91

Biomimetické polyenové cyklizace Vzájemný vztah mezi biosyntézou a syntézou biomimetik

92

Biomimetické polyenové cyklizace Historie syntézy biomimetik

93

Biomimetické polyenové cyklizace Robinsonova syntéza tropinonu

94

Biomimetické polyenové cyklizace Biosyntéza skvalenu / cholesterolu  Skvalen je prekurzor sterolů a polycyklických triterpenů  G. Stork a A. Eschenmoser - v 50. letech – navrhli, že biogenní konverze skvalenu na lanosterol zahrnuje synchronní oxidativní cyklizaci  Transformace je kysele katalyzovaná a probíhá přes sérii karboniových iontů umožňující zavření všech 4 kruhů  První krok je selektivní epoxidace dvojné vazby za tvorby 2,3-oxidoskvalenu  Následující kroky zahrnují biosyntézu skvalenu a poté lanosterolu

95

Biomimetické polyenové cyklizace Biosyntéza skvalenu / cholesterolu

Biomimetické polyenové cyklizace Biosyntéza skvalenu / cholesterolu hydroxymethylglutaryl-koenzyme A (HMG-CoA) - prekurzor pro syntézu cholesterolu

97

Biomimetické polyenové cyklizace Biosyntéza skvalenu / cholesterolu Biosyntéza mevalonátu  HMG-CoA redukzáza katalyzuje produkci mevalonátu z HMG-CoA  Tento enzym je vysoce regulován a proto také cílem pro farmaceutické intervence  Karboxyl HMG, který je vázán esterovou vazbou ke CoA je redukován na aldehyd a poté na alkohol (NADPH slouží jako reduktant ve dvou krokové reakci)  Tvorba mevalonátu z HMG-CoA je rychlost-urřující krok syntézy cholesterou.

98

Biomimetické polyenové cyklizace Biosyntéza skvalenu / cholesterolu Syntéza isopentenyl pyrofosfátu  Mevalonát je fosforylován dvěma následnými Pi přenosy z  Následná ATP-dependentní dekarboxylace s dehydratací poskyzuje isopentenyl pyrofosfát  Isopentenyl pyrofosfát je první ze sledu sloučenin v cestě vedoucí k isoprenoidům

99

Biomimetické polyenové cyklizace Biosyntéza skvalenu / cholesterolu Isomerace  Isopentenyl pyrofosfát ismeruje inter-konverzí na dimethylallyl pyrofosfát  Mechanismus – protonace následovaná deprotonací

100

Biomimetické polyenové cyklizace Biosyntéza skvalenu / cholesterolu Přeměna IPP a DMAPP  Prenyl transferáza katalyzuje kondenazci DMAPP a IPP za vzniku geranyl pyrofosfátu  Další kondenazce pak vede ke vzniku farnesyl pyrofosfátu  Každá kondenazce pravděpodobně zahrnuje tvorbu kabokationtu za současné eliminace PPi.

101


102


103

Biomimetické polyenové cyklizace  Ve srovnání se staršími metodami syntézy, které zahrnovaly postupnou anelaci, biomimetické polyenové cyklizace představují využití jednoduchých reakcí za tvorby několika kruhů kationtovým mechanismem.  Pokud se podíváme na biosyntézu skvalenu, progesteronu a dalších vyšších sterolů, bude zřejmé, že klíčové kroky cyklizace lineárních polyenů zahrnují následující kroky: 1. tvorba karbokationtu 2. kontrola konformace substrátu

3. stabilizace intermediátu 4. quenching finálního karbokationtu

104

Biomimetické polyenové cyklizace

105

Biomimetické polyenové cyklizace  Tato fakta jsou dále zřejmá z obecného postupu a cyklizace lineárních polyenů pomocí cykláz stejně tak jako z biosyntézy skvalenu:  Potenciální kontrola stereochemie – jeden krok produkuje 4 kruhy, 8 stereogenních center a pouze 1 ze 128 možných isomerů  Ochota s jakou se vysoce substituovaná C-C vazba formuje  Formace pouze trans kruhů  Cyklizace skvalenu na lanosterolu poutala pozornost mnoha výzkumných skupin.

 Profesor Adolf Windaus v jeho Nobelové přednášce v roce 1928 správně zhodnotil: „The synthesis of such a substrate appears to the chemist particularly difficult, and up till now I have not dared to attempt it.“

106

Biomimetické polyenové cyklizace  Corey et al. – korelace mezi funkcí enzymů cykláz a cílem biomimetické syntézy - Wendt, K.U.; Schulz, G.E.; Corey, E.J.; Liu, D.R. Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 2812-2833.

107

Biomimetické polyenové cyklizace  V přírodní enzymatické syntéze jsou enzymy schopné aktivovat relativně nereaktivní substráty, jako jsou olefiny, podléhat mnohonásobné formaci nových vazeb s vysokou selektivitou.  V kontrastu se syntetickým systémem, ve kterém si s karbocyklizací konkurují mnohé další reakce, enzymy využívají neskutečné úrovně kontroly produkovat pouze několik málo možností – vysoká selektivita během celé transfromace.  Polyenové karbocyklizace poskytují enzymový model pro pozoruhodné mnohostranné selektivity ve velikosti kruhu, počtu vytvořených kruhů, stereochemii při tvorbě spojených kruhů a stupni přesmyků jednotlivých atomů/skupin.

108

Biomimetické polyenové cyklizace  Příklady studia cyklizací polyolefinů, ve kterých existuje vzájemné propojení biosyntéza – totální syntéza: 1. 1950s – Studium stereochemie kationických cyklizací lineárních polyenů použitím jednoduchých modelů (Stork a Eschenmoser) 2. 1980s – Vývoj iniciátorů, terminátorů a kation-stabilizujících skupin pro cyklizace biomimetických pentacyklů (Johnson) 3. 1990s – Aplikace chirálních LBAs v enantioselektivní cykliazci lineárních polyenů (Yamamoto)

109

Biomimetické polyenové cyklizace 1. Modely Storka a Eschenmosera  Adice karbeniových iontů na olefiny

110

Biomimetické polyenové cyklizace 1. Modely Storka a Eschenmosera  1,5-Diene cyklizace katalyzovaná Broenstedovou kyselinou

111

Biomimetické polyenové cyklizace 1. Modely Storka a Eschenmosera  Kysele katalyzovaná cyklohexanulace: stereochemie a mechnismus

112

Biomimetické polyenové cyklizace 1. Modely Storka a Eschenmosera  Polyalkeny reagují v definovaných konformacích.  Mohou predikovat stereochemii cyklizačních produktů:  Z-alkene - cis-ring fusion, cis-decalin  E-alkene - trans-ringf usion, trans-decalin

113

Biomimetické polyenové cyklizace 1. Modely Storka a Eschenmosera

114

Biomimetické polyenové cyklizace 1. Modely Storka a Eschenmosera  vysoká stereospecifita  probíhá přes neklasický tříčlenný tranzitní stav

115

Biomimetické polyenové cyklizace 1. Modely Storka a Eschenmosera  Biomimetická studie 1,5-dien kationických cyklizací - Storkova cyklizace farnesyloctové kyseliny

116

Biomimetické polyenové cyklizace 1. Modely Storka a Eschenmosera  Biomimetická studie 1,5-dien kationických cyklizací - Eschenmoser's Demonstration of Olefin Cyclization

117

Biomimetické polyenové cyklizace 1. Modely Storka a Eschenmosera  Schinz−Eschenmoser – anti-adice

118

Biomimetické polyenové cyklizace 1. Modely Storka a Eschenmosera  Coreyho biomimetická cyklizace

119

Biomimetické polyenové cyklizace 1. Modely Storka a Eschenmosera  Coreyho biomimetická cyklizace

120

Biomimetické polyenové cyklizace 2. Johnsonovy modely Vývoj iniciátorů, terminátorů a kation-stabilizujících skupin pro cyklizace biomimetických pentacyklů Iniciace cyklizace – iniciační skupiny:  Pomocí tvorby karbokationtu – elektrofilní adice nebo ionizace  Indukovaná mírnými podmínkami, které neovlivňují samotný olefin nebo jeho funkční skupiny  Většina účinných iniciátorů je stabilizována heteroatomem nebo dvojnou vazbou. “Unless an initiator gives nearly quantitative yields in bicyclization, it will not be satisfactory for promoting polycyclizations.” W.S. Johnson 121

Biomimetické polyenové cyklizace 2. Johnsonovy modely - iniciátory  Johnsonův chirální acetal jako iniciátor

122

Biomimetické polyenové cyklizace 2. Johnsonovy modely - iniciátory  Johnsonovy allylické alkoholy jako iniciátory

123

Biomimetické polyenové cyklizace 2. Johnsonovy modely - terminátory Terminace cyklizace    

eliminace nebo atak nukleofilu jeden mechanismus – jeden produkt Terminace cyklizace je regioselektivní Terminace cyklizace vytváří příslušnou funkcionalitu

124

Biomimetické polyenové cyklizace 2. Johnsonovy modely  Johnsonův alkyn silan jako terminátor

125

Biomimetické polyenové cyklizace 2. Johnsonovy modely  Johnsonův alkyn silan jako terminátor

126

Biomimetické polyenové cyklizace 2. Johnsonovy modely Johnsonova biomimetická polyen-alkohol cyklizace  Před syntézou progesteronu nebyl nikdy v polyenové cyklizaci použita trojná vazba  Johnson ukázal, že alkyny mohou být použity při exo cyklizaci za vzniku vinyl kationtů

127

Biomimetické polyenové cyklizace 2. Johnsonovy modely

128

Biomimetické polyenové cyklizace 2. Johnsonovy modely  Konverze 2,3-oxidoskvalenu na lanosterol je kaskáda reakcí ve kterých epoxid s jedním stereogenním centrem je transformován na tetracyklický steroid obsahující sedm stereogenníc center.  Průkopnická syntetická práce van Tamelena a Johnsona demonstrovala, že neenzymatická, biomimetická totální syntéza založena na polykarbocyklizaci může být provedena relativně snadno.  V roce 1961 - van Tamelen – použil termín biomimetický (nebo biogenní)  Předtím – biomimetická karbocykliazce epoxyskvalene byla dost složitá vzhledem k nutnosti vytvořit 6-ti členný kruh (C-ring closure) přes 5-exo Markovnikovu adici.  1982 - van Tamelen – vužil alkyn jako terminační skupinu

129

Biomimetické polyenové cyklizace 2. Johnsonovy modely  1982 - van Tamelen – vužil alkyn jako terminační skupinu

130

Biomimetické polyenové cyklizace 2. Johnsonovy modely

131

Biomimetické polyenové cyklizace 3. Yamamotovy modely  Aplikace Yamamotových chirálních LBA v enantioselektivní cyklizaci polyenů  Yamamoto vyvinul první enanatioselektivní biomimetickou cyklizaci polypreonoidů použitím LBA = Lewis acid-assisted chiral Broensted acid v roce 1999 jako umělé cyklázy a použil ji k syntéze (-)-ambroxu (ambrox je syntetická náhražka ambry).

132

Biomimetické polyenové cyklizace 3. Yamamotovy modely  Aplikace Yamamotových chirálních LBA v enantioselektivní cyklizaci polyenů

133

Biomimetické polyenové cyklizace 3. Yamamotovy modely  Aplikace Yamamotových chirálních LBA v enantioselektivní cyklizaci polyenů  Př. cykliazce homofarnesolu řízená pomocí LBA probíhá se 42% ee.  Tato enantioselektivní syntéza byla vylepšena v roce 2002 použitím LBA jako promoteru.

134

BIOR1

Recommend Documents