BIOLÓGIAI OXIDÁCIÓK BIOMIMETIKUS MODELLEZÉSE

Ph. D. ÉRTEKEZÉS

BIOLÓGIAI OXIDÁCIÓK BIOMIMETIKUS MODELLEZÉSE

Balogh György Tibor

Készült a Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Szerves Kémia Tanszékén, a CHINOIN RT. Növényvédőszer Üzletág, Kémiai Kutatólaboratóriumában és a RICHTER GEDEON RT. Technológiai Fejlesztés Laboratórium II. osztályán

2003 Budapest

Köszönetnyilvánítás és ajánlás Ezúton szeretnék köszönetet mondani témavezetőimnek, Dr. Nógrádi Mihálynak, a preparatív szerves kémia elsajátításában nyújtott segítségéért, valamint Dr. Keserű György Miklósnak barátságáért, kutatói gondolkodásmódom formálásáért és a sok segítségért és támogatásért, ami sokszor túlmutatott a szakmai problémákon. Köszönetet mondok továbbá kollegáimnak és barátaimnak, akik közreműködésükkel segítették munkámat:

Dr. Bertók Béla Bielik Attila Dr. Bokotey Sándor Dr. Czudor Irén Dr. Fehér András Forrai Erika Gere Anikó Illés János Karancsi Tamás Kovári Zoltán Molnár László Székely Zsuzsanna Szölgyén Ibolya Volk Balázs

Köszönettel tartozom szüleimnek, akik tanulmányaimat mindig a legmesszebbmenőkig támogatták.

Zsuzsámnak és András fiamnak …

2

Tartalomjegyzék 1. Bevezetés

6

2. Növényvédőszer rezisztencia kialakulása, a citokróm P450 enzimrendszer és szerepe a rezisztencia kialakulásában

8

2.1 A rezisztencia kialakulása és jelentősége a növényvédőszer kutatásban

8

2.2 A citokróm P450 enzim szerkezete és funkciója

9

2.3 A citokróm P450 működési mechanizmusa

13

2.4 Citokróm P450 által katalizált folyamatok

15

2.5 A citokróm P450 szerepe az inszekticid rezisztenciában

19

3. Nitrogén monoxid (NO) és nitrogén monoxid szintetáz (NOS) 3.1 A NO bioszintézise

22 23

4. A szintetikus metalloporfirinek és alkalmazásuk

25

4.1 Szintetikus metalloporfirinek szerkezete, csoportosítása

25

4.2 Szintetikus metalloporfirinek előállítása

29

4.3 A metalloporfirin modellrendszer felépítése és működési mechanizmusa

30

4.3.1 Az axiális ligandum hatás

30

4.3.2 Oxigén donorok, a biomimetikus rendszer működési mechanizmusa

31

5. A hyaluronan (HA) és jellemző szabadgyökös folyamatai

34

5.1 A HA szerkezete, előfordulása

34

5.2 A HA biológiai szerepe

36

5.3 A HA gyulladásos, illetve szabadgyökös folyamatokban való részvétele

36

5.4 Reaktív oxigént tartalmazó metabolitok

37

5.5 Az antioxidáns hatások in vitro vizsgálata

40

6. Célkitűzések

43

7. Eredmények

44

7.1 Kémiai modell kifejlesztése karbamát inszekticidek CP450 által katalizált oxidatív metabolizmusának vizsgálatára

44

7.1.1 A karbofurán metabolitjainak szintézise

46

7.1.2 A biomimetikus katalizátor előállítása

48

7.1.3 Karbamát inszekticidek metabolizmusának biomimetikus modellezése

49

7.1.3.1 A karbofurán (1) biomimetikus oxidációja

49

7.1.3.2 A karbaril (2) biomimetikus oxidációja

51

3

7.1.3.3 A pirimikarb (3) biomimetikus oxidációja

52

7.2 Alkinil-benzil-éter típusú rovarszelektív citokróm P450 inhibitorok vizsgálata 54 7.2.1 A verbutin (22) és a perbutin (23) biomimetikus oxidációja 7.3 A citokróm P450 által katalizált NO képződés mechanizmusának vizsgálata

54 59

7.4 A hem-fehérjék biomimetikus modellezése során kapott eredmények összefoglalása

62

7.5 A különböző fémionokkal képzett hyaluronan asszociátumok antioxidáns viselkedésének vizsgálata

64

7.5.1 Hidroxil gyökkel (˙OH) szemben mutatott hatás

65

7.5.2 Szuperoxid gyökanionnal (˙O2-) szemben mutatott hatás

66

7.5.3 2,2’-Azino-bisz(2-aminopropán)-nal (AAPH) szemben mutatott hatás

67

7.5.4 Peroxinitrittel (ONOO-) szemben mutatott hatás

68

7.5.5 A HA asszociátumok antioxidáns hatásának értékelése és összefoglalása

69

7.6 Tézisek, összefoglalás

71

8. Kísérleti rész

74

8.1 A biomimetikus oxidációra vonatkozó kísérletek

74

8.1.1 mezo-Tetrakisz(2,6-diklór-fenil)-porfirin Fe(III)Cl (FeTPPCl8)

74

8.1.2 A karbofurán (1) metabolitainak szintetikus előállítása

75

8.1.2.1 7-Hidroxi-2,2-dimetil-2,3-dihidro-benzofurán (4)

75

8.1.2.2 2,2-Dimetil-2,3-dihidrobenzofuran-7-il benziloximetil-karbamát (5)

75

8.1.2.3 2,2-Dimetil-2,3-dihidrobenzofuran-7-il hidroximetil-karbamát (6)

75

8.1.2.4 2,2-Dimetil-7-metilkarbamoiloxi-benzofuran-3-on (7)

76

8.1.2.5 3,7-Dihidroxi-2,2-dimetil-benzofurán (8)

76

8.1.2.6 2,2-Dimetil-3-hidroxi-2,2-dimetil-2,3-dihidro-benzofuran-7-il metil-karbamát (9)

77

8.1.2.7 7-Hidroxi-2,2-dimetilbenzofuran-3-on (10)

77

8.1.2.8 2,2-Dimetil-3-oxo-2,3-dihidrobenzofuran-7-il benziloximetilkarbamát (11)

78

8.1.2.9 2,2-Dimetil-3-oxo-2,3-dihidrobenzofuran-7-il hidroximetilkarbamát (12)

78

8.1.2.10 2,2-dimetil-2,3-dihidrobenzofuranil-7-N-hidroximetil-karbamát (13)

79

8.1.2.11 A karbofurán (1) metabolitok analíziséhez felhasznált készülékek

79

8.1.3 A biomimetikus reakciók általános kivitelezése 4

80

8.1.4 A biomimetikus oxidáció során kapott termékek elválasztása és azonosítása

80

8.1.4.1 A pirimikarb (3) biomimetikus oxidációjával nyert két fő metabolit MS és NMR adatai

81

8.1.4.2 A Verbutin (22) és Perbutin (23) biomimetikus oxidációjával nyert metabolitok kitermelése és NMR adatai

81

8.2 A hyaluronan asszociátumokkal végzett vizsgálatokra vonatkozó kísérletek

82

8.2.1 A HA asszociátumok reaktív oxigént tartalmazó metabolitok (ROM) hatására végbemenő degradációjának vizsgálata

82

8.2.2 A HA asszociátumok antioxidáns hatásának vizsgálata

83

8.2.2.1 ˙OH gyökkel szemben mutatott antioxidáns hatás vizsgálata

83

8.2.2.2 ˙O2- gyökanionnal szemben mutatott antioxidáns hatás vizsgálata

83

8.2.2.3 AAPH-val szemben mutatott antioxidáns hatás vizsgálata

84

8.2.2.4 ONOO- -el szemben mutatott antioxidáns hatás vizsgálata

84

9. Irodalomjegyzék

85

10. Mellékletek (a dolgozatban felhasznált saját közlemények)

5

97

„Végtelen számú kísérlet sem képes bizonyítani az igazamat, egyetlen kísérlet is bizonyíthatja, hogy tévedtem.” (Albert Einstein)

1. Bevezetés Az elmúlt 20 év számítástechnikai és műszeres analitikai fejlődése lehetővé tette olyan in vitro kémiai és biológiai modellek kifejlesztését, amelyek egyidőben, nagy mintaszámon, jól reprodukálhatóan vizsgálnak egy adott biológiai hatást. Az in vitro modell hátterében minden esetben olyan rendszernek kell állnia, amely a vizsgálni kívánt jelenséget, az adott technikai megoldás határain belül a lehető legjobban megközelíti. A modellalkotás másik nagy előnye, hogy a modellrendszer paramétereinek optimálása során közelebb kerülhetünk a vizsgált objektumhoz, és így könnyebben megérthetjük a rendszer folyamatainak mechanizmusát és dinamikáját. Vizsgálataim célobjektuma az élőlényekben végbemenő egyik alapvető biokémiai folyamat, a biológiai oxidáció volt. A különböző oxidatív, illetve elektronátmenettel járó biokémiai folyamatok, az egyszerű prokariotáktól a magasabb rendű eukariotákig egyaránt megfigyelhetőek. Ezek közül jó néhány nélkülözhetetlen, néhány viszont kifejezetten káros az élő szervezetre. Így az élet elképzelhetetlen lenne például fotoszintézis vagy különböző anyagcsere és energiatermelő folyamatok nélkül. Ezzel szemben több, főként külső behatásra (sugárzás, toxikus anyagok, virális és bakteriális fertőzések) végbemenő oxidatív folyamat ismert, melyek hatására közvetlenül a genomra, de más sejtalkotókra nézve is káros, reaktív oxigént tartalmazó vegyületek (szabad gyökök, peroxovegyületek) keletkeznek. Ezek alapján nem meglepő, hogy a biológiai oxidációs folyamatok feltérképezésére és megértésére irányuló első kísérletek a biokémiai kutatások „hőskoráig”, a 19. század elejéig nyúlnak vissza (O. Warburg, H. Wieland, Th. Thunberg, Szent-Györgyi Albert) és az oxidációs folyamatok kutatása napjainkban is központi helyet foglal el a biokémiában. Kutatómunkám során, témavezetőimmel és kollégáimmal, ennek a szerteágazó területnek két szegmensét érintettük. Munkánk első részében a biológiai oxidációk jelentős részében szerepet játszó hem-fehérjék két képviselőjének, a metabolikus folyamtokban fontos szerepet játszó citokróm P450, valamint a számos, napjainkban felismert bioregulációs folyamatban résztvevő fehérje, a nitrogén monoxid szintetáz (NOS) működését vizsgáltuk. Első esetben a problémafelvetést, a CHINOIN Növényvédőszer Üzletág által kifejlesztett, növényvédőszerek

6

ellen, a rovarokban kialakuló fokozott citokróm P450 metabolizmus okozta rezisztencia adta, míg a NOS vizsgálatok esetén az aktualitás és a feltáratlan terület varázsa inspirálta a munkánkat. Munkám második részét a Richter Gedeon Rt. Technológiai Fejlesztési Laboratóriumában végeztem, ahol a Társaság lábszárfekélyre kifejlesztett originális termékében, a Curiosin-ban jelenlévő hyaluronannak és annak különböző fémionokkal létrehozott asszociátumainak antioxidáns viselkedését vizsgáltam. Az antioxidáns hatást, az emlős szervezetben végbemenő patológiás és ezt ellensúlyozó fiziológiás oxidatív folyamatokban keletkező gyökös, illetve peroxo típusú vegyületek in vitro modellezésének segítségével vizsgáltam. A biológiai rendszereket mindhárom esetben biomimetikus kémiai modellek segítségével vizsgáltam. Az első két esetben a hem-fehérjék családjába tartozó citokróm P450 és NOS enzimeket szintetikusan előállított vas-porfirinek segítségével modelleztem. A hyaluronan antioxidáns sajátságának vizsgálatába a szövetkárosító folyamatokban elsődlegesen jelenlévő, ˙OH (hidroxil gyök), ˙O2- (szuperoxidanion), RO2˙ (alkilperoxil gyök) és ONOO(peroxinitrit) reaktív oxigént tartalmazó vegyületeket vontam be. Vizsgálataim célja a kiválasztott biológiai oxidációs folyamatok megismerésén, illetve mechanizmusának magyarázatán túl, olyan modellrendszerek felállítása volt, amelyek viszonylag könnyen változtatható paramétereik és hozzáférhetőségük miatt alkalmassá tehetők hatóanyagjelöltek gyors, hatékony tesztelésére is.

7

2. Növényvédőszer rezisztencia kialakulása, a citokróm P450 enzimrendszer és szerepe a rezisztencia kialakulásában 2.1 A rezisztencia kialakulása és jelentősége a növényvédőszer kutatásban Napjainkban az egyre nagyobb mennyiségben felhasznált inszekticidek és ezek ismételt alkalmazása a rovarokban jelentős mértékben segíti a rezisztencia kialakulását. A fokozódó rezisztencia hatását a gazdaságok sajnálatos módon, egyre nagyobb mennyiségű növényvédőszer alkalmazásával próbálják orvosolni. Ez természetesen csak tovább erősíti a már kialakult rezisztenciát. A fokozott növényvédőszer alkalmazás azonban nemcsak a rezisztenciára van hatással; a feleslegben kibocsátott vegyszer súlyos környezetszennyezést is okozhat. Emiatt a rezisztencia kezelése nemcsak érdeke, de kötelessége is a növényvédőszert gyártóknak. Manapság több mint 600, különböző inszekticidekre rezisztens rovarfaj ismert. Habár a rezisztencia kialakulására számos mechanizmus ismeretes, ezek többsége mégis két alaptípusba sorolható. Az első típus szerint, a rovarokban megváltozik annak a makromolekulának (ez általában egy receptor fehérje) az aktív helye, ahová a hatóanyag kötődne (aktívhely rezisztencia). A másik típus esetében fokozódik a kérdéses hatóanyag detoxifikációs úton való kiürülése, azaz metabolizmusa (metabolikus rezisztencia) [1]. Az aktívhely rezisztenciával általában együtt jár az ún. keresztrezisztencia kialakulása. Ennek köszönhetően a rovar rezisztenciát mutathat olyan hatóanyaggal szemben is, amellyel még nem találkozott, ha előzőleg rezisztens volt hasonló szerkezeti részletet tartalmazó molekulákkal szemben. Ebben az esetben molekuláris szintű változások mennek végbe a hatóanyagot kötő receptor aktív helyén, aminek következtében a receptor-hatóanyag affinitása csökken. Ez a folyamat létrejöhet a struktúrgéneknél végbemenő egyszerű pontmutáció révén, de előfordulhat, hogy néhány egyéb gén száma, illetve aktivitása változik meg. Aktívhelyrezisztencia kialakulását figyelték meg, pl. karbamát inszekticidekkel szemben, ahol mutáció változtatta meg az acetilkolin-észteráz (AChE) receptor konformációját [2], míg az idegsejtek membránjában

található

nátriumcsatorna

nátrium

permeábilitás

szabályozásának

megváltozása a piretroidokkal szembeni rezisztencia kialakulását eredményezte [3]. Az aktívhely rezisztencia kezelésének egyik megoldását genetikailag immunizált haszonnövények létrehozásában látják [4]. Ebben az esetben a növény genetikai állományába beültetnek egy rovarokat károsító toxin termelésért felelős génszakaszt [5]. A másik megoldás

8

új,

hatékonyabb

inszekticidek

fejlesztése

vagy

alternatív

biológiai

mechanizmus

befolyásolása lehet, egy az eddigiektől eltérő receptoron. A metabolikus rezisztencia kezelése a legegyszerűbben a metabolikus folyamatért felelős enzim ellen kifejlesztett szelektív inhibitorok alkalmazásával érhető el. A detoxifikációs folyamat első lépése az ún. primer metabolizmus, amely során egy meghatározott enzimekből álló rendszer a kérdéses idegen anyagot (jelen esetben a növényvédőszert) oxidációs vagy hidrolitikus reakcióban, a könnyebb kiürülés érdekében, egyre hidrofilebbé alakítja. Az inszekticidek

oxidatív

metabolizmusában

legfontosabb

szerepe

a

citokróm

P450

enzimcsaládnak van. Emiatt a citokróm P450 enzim szelektív gátlása jelentős előrelépést jelenthet a rezisztencia elleni küzdelemben.

2.2 A citokróm P450 enzim szerkezete és funkciója Röviddel azután, hogy 1955-ben Mason [6] és Hayaishi [7a,b] felfedezték az oxigenázokat, Klingenberg [8] és Garfinkel [9] egymástól függetlenül írtak le egy máj mikroszómából izolált CO kötő pigmentet, amely differencia elnyelési spektrumában szokatlan, 450 nm körüli abszorpciós maximumot mutatott. A fehérje szerkezetére kilenc évvel később Omura és Sato [10] tettek javaslatot. Az enzim aktív helyén található központi vasatomot tartalmazó protoporfirin IX egység alapján az enzimet a hem-fehérjék közé sorolták (1. ábra) és jellegzetes 450 nm-nél kapott elnyelése miatt, citokróm P450-nek nevezték el.

N

N Fe

N

S

N

Cys Fehérje

1. ábra A citokróm P450 aktívhelyén található protoporfirin IX egység

9

Az enzim katalitikus sajátságára vonatkozó első megfigyelések közül a fontosabb eredmények Estabrook nevéhez fűződnek, aki egy citokróm P450 által katalizált C-21 hidroxilezést írt le a 17-hidroxiprogeszteron-kortizol átalakulása során [11]. A citokróm P450-függő monooxigenáz rendszer az endoplazmatikus retikulumban és majdnem minden élőlény mitokondriumában jelen van. A magasabb rendű állatok és az ember számos szervében megtalálható az enzim, legnagyobb koncentrációban azonban a máj mikroszóma frakcióban fordul elő (1. táblázat) [12]. 1. táblázat A citokróm P450 enzim eloszlása az emlősök egyes szerveiben Szerv Máj Mellékvesekéreg Vese Nyelv Lép Here Petefészek Agy Izom Bőr

Citokróm P450 tartalom (nmol/mg fehérje) Endoplazmatikus retikulum Mitokondrium (mikroszóma) 0,10-1,96 0,02-0,10 0,05-2,10 1,55-2,11 0,08-0,18 0,10-0,20 0,03-0,21 0,01-0,03 0,03 0,001-0,03 0,01-0,02 0,05-0,06 0,03 0,02-0,05 0,02-0,03 0,004 -

Napjainkig az enzim több mint 500 különböző izoformáját sikerült izolálni. Az egyes izoformák specifikusan fejtik ki hatásukat, átalakítva a nekik megfelelő xenobiotikumot vagy endogén vegyületet. A citokróm P450 fehérjék főként (kivéve a bakteriális enzimeket) a mikroszóma vagy a mitokondrium membránjához kötött formában találhatók meg. Ebben a formában a tiszta enzim izolálása meglehetősen problematikus. A baktériumokból könnyen izolálható oldékony és tiszta CP450 enzimek lehetővé teszik az enzimek atomi szintű szerkezetvizsgálatát. Elsőként, Poulos és munkatársai vizsgálták meg röntgendiffrakció segítségével egy citokróm P450 szerkezetét. Ez a Pseudomonas putidá-ból származó P450 kámfor monooxigenáz (P450cam) volt [13]. A hem (amelynek közvetlen környezete a 2. ábrán látható) a P450cam belsejében, egy hidrofób zsebben található. A protoporfirin IX egység síkjához viszonyított axiális elhelyezkedésű

cisztein

(Cys357)

kénatomja

10

a

hem

vasatomjával

koordinálódik.

Összehasonlítva a P450cam aminosav szekvenciáját más CP450 fehérjékkel, a hem közelében két erősen konzerválódott régió található: az axiális Cys357 ligandumon keresztül kapcsolódó hurok formájú (loop) és egy treonint (Thr252) tartalmazó fehérje részlet (I-hélix). Számos munka mutat rá arra, hogy a bakteriális CP450 fehérjék (P450BM3, P450terp, P450eryF) és a magasabb rendű élőlények membránhoz kötött CP450 fehérjéinek röntgendiffrakciós vizsgálatból származó háromdimenziós szerkezetei hasonlóságot mutatnak [14a,b,c]. Napjainkig ezt kihasználva a bakteriális CP450 enzimeket felhasználták az eukarióta CP450 enzimek modellezésére.

2. ábra A CP450cam aktívhelye és környezete Az első röntgendiffrakció segítségével meghatározott, emlős mikroszómából származó citokróm P450 szerkezet McRee és munkatársainak nevéhez fűződik [15]. Az általuk vizsgált CP450 enzim, a nyúlból származó 2C5 izoforma, ami egy progeszteron hidroxiláz. Megvizsgálva a mikroszomális 2C5 enzim szerkezetét, számos eltérést találtak a mikrobiális CP450 (BM3 és TERP) enzim szerkezetétől. Ez a felfedezés későbbiekben nagyban segítheti a nehezen izolálható emlős CP450 enzimek számítógépes modellezését. A következőkben röviden összefoglalom a McRee és munkatársai által tapasztalt legfontosabb eltéréseket a mikrobiális és emlős CP450 enzimek szerkezete között [16].

11

3. ábra A nyúl mikroszómából származó 2C5 izoenzim szerkezeti sajátosságai Habár az egyes típusjegyek mint pl. az aktívhely és annak környezete nagyban hasonlítanak a 2C5 és BM3 esetében, jelentős térszerkezetbeli eltéréseket figyeltek meg. A legnagyobb különbséget a két enzim szerkezetében, a főként β-redős szerkezetet mutató Nterminális, valamint az α-hélix szerkezetű, a hem csoportot is tartalmazó fehérjerészletek mutatnak (3/a ábra). Egymásra illesztve a 2C5 és a TERP enzim szerkezetét, a fenti régiókban a legnagyobb különbséget a szubsztrát-kötőhelyet is magába foglaló ún. FG-hélix rész esetében tapasztalták (3/b ábra). A CP450 enzimeknél hat szubsztrát kötőhelyet azonosítottak [17]. Ezek közül csak a 4-es számú (SRS-4) szerkezete, ami az I-hélix mentén helyezkedik el, hasonló az egyes CP450 enzimekben, a többi meglehetősen nagy változatosságot mutat. Az azonosított szubsztrát-kötőhelyek elhelyezkedése a 2C5 esetében a következők: SRS-1: Ala 113, Phe 114; SRS-2: Val 205, Leu 208; SRS-4: Ala 113; SRS-5: Leu 359, Leu 363 és SRS-6: Val 474. Az említett aminosavak közül a progeszteron kötődése szempontjából a legfontosabbakat a 3/c ábrán láthatjuk. A mikroszomális P450 enzimek esetében az oxidációhoz szükséges elektronok a citokróm P450 reduktáztól (CPR) származnak, ezért fontos a redox partner kötődési helyének ismerete. A vizsgálatok szerint a CPR a CP450 12

proximális oldalán kötődik. A mikroszomális P450-ek membrán-kötött enzimek, amelyeknél fontos a membránkötő felszín elhelyezkedésének ismerete is. A 2C5 esetében ezek a hidrofób felszínt biztosító, sok fenilanalint tartalmazó, N-terminális β-redő rendszer és a Cterminálison található ún. F-G hurok (3/d ábra). Összefoglalva, a különböző forrásból származó CP450 fehérjék szerkezeti adatait, a következőket mondhatjuk el a citokróm P450 izoenzim-családról: (i) molekulatömegük 45000 és 57000 Da közé esik; (ii) az enzim aktív helyén egy vas(III)-protoporfirin IX rész található; (iii) a hem vas-tiolát koordinációnak köszönhetően jellegzetes CO differenciaspektrumuk abszorpciós maximuma 450 nm környékén található; (iv) az egyes élőlényekben a CP450 fehérje több izoformája is jelen van; (v) az egyes izoformák jól jellemezhetőek szubsztrát- és kemospecifitásuk alapján. A prokarióták és eukarióták citokróm P450 rendszere, hidroxilezési, epoxidációs, dezalkilezési és egyéb oxidatív folyamatok katalízise révén (2. táblázat), fontos szerepet tölt be az idegen anyagok (gyógyszerhatóanyagok, növényvédőszerek, növényi toxinok és egyéb xenobiotikumok) eltávolításában és egyes endogén anyagok (zsírsavak, prosztaglandinok, D3 vitamin stb.) szintézisében [18]. 2. táblázat A CP450 enzim által katalizált főbb oxidatív folyamatok. Reakció típus Alkán hidroxilezés Alkén oxidáció

Reakcióséma −CH → −C − OH O CH CH

CH

CH

Alkin oxidáció

− C ≡ C − → − C = C = O → − CH2 − COOH

Aromás hidroxilezés N-hidroxilezés N-dezalkilezés N-dezalkilezés S-dezalkilezés N-oxidáció S-oxidáció

Ar − H → Ar − OH −C − NH 2 → −C − NH − OH R − NH − Me → R − NH 2 + HCHO R − O − Me → R − OH + HCHO R − S − Me → R − SH + HCHO = N − →= N (O) − R − S − Me → R − S (O) − Me

2.3 A citokróm P450 működési mechanizmusa A CP450 enzimek az elektrontranszport fehérjék családjába tartoznak, és mint ilyenek működésük NADH-t és/vagy NADPH-t igényel. Elektrontranszport rendszerüknek két típusa 13

ismeretes,

a

mitokondriális

(bakteriális)

és

a

mikroszomális.

A

mitokondriális

elektrontranszport, egy nem hem típusú vas-kén fehérje, a NADPH-ferredoxin reduktáz és a ferredoxin révén NADPH-ból szabadítja fel a folyamathoz szükséges elektronokat. Ezzel ellentétben a mikroszómális elektrontranszport működéséhez csak a NADPH-citokróm P450 reduktázra, illetve NADH-citokróm-b5 reduktázra van szükség (4. ábra) [19a,b]. Mitokondriális elektrontranszport

NADPH → NADPH-ferredoxin reduktáz → CP450 Mikroszomális elektrontranszport

NADPH → NADPH-citokróm P450 reduktáz → CP450 NADH → NADH-citokróm-b5 reduktáz → citokróm-b5 4. ábra A CP450 enzim elektrontranszport rendszerének két típusa

A citokróm P450 által katalizált oxidatív átalakulások jelenleg ismert és elfogadott mechanizmusa az 5. ábrán látható [20]. A mechanizmus egyes lépései a következők: (i) kialakul az enzim-szubsztrát komplex; (ii) az enzim aktív helyén levő vas redukciós folyamatban egy elektron felvételével FeIII-ból FeII-vé alakul át; (iii) a vas megköt egy molekula molekuláris oxigént és így kialakul a citokróm P450-dioxigén komplex; (iv) az enzimrendszer felvesz még egy elektront, kialakul a peroxo-vas(III) komplex; (v) protonálódás és O–O kötéshasadás megy végbe, a képződő két oxigénatom egyrészt vízzé, másrészt reaktív oxo-vas formává alakul, amely a spektroszkópiai mérések alapján a jellegzetes zöld színű oxo-vas(IV) porfirin gyökkation [21a,b,c,d]; (vi) a szubsztrát a reaktív oxo-vas formához kapcsolódik; majd (vii) a termék disszociál és visszakapjuk az enzimet az eredeti FeIII állapotban [22] (teljes ciklus). Az elmúlt néhány évben fedezték fel, hogy a citokróm P450 rendszernek van egy a peroxidázokhoz hasonló alternatív aktivációs mechanizmusa is. A NADPH különböző oxigén donorokkal, így alkil-hidrogénperoxiddal, hidrogén-peroxiddal, peroxosavakkal stb. való helyettesítésével levezethető alternatív mechanizmust, peroxid sönt-nek nevezték el [23]. Néhány esetben (pl. alkil-halogenideknél) megfigyelték, hogy a (4) lépést követően egy Fe–O–O–S intermedieren keresztül is végbemehet egy alternatív folyamat.

14

i

FeIII

FeIII S e-

[Fe-O-X S] "Peroxid sönt"

SO

XO

vi [Fe-O-S]

ii

X Fe=O S O2

FeIII-O-O-S

v

FeII S

FeIII Sred FeIII

O2

+ SO

H+

iii

[Fe-O-OH S] FeIII(O22-) S

iv

FeII(O2) S e-

5. ábra A CP450 enzim működési mechanizmusa az oxidatív átalakulásokban

2.4 Citokróm P450 által katalizált folyamatok A citokróm P450 által katalizált oxidatív átalakulások nagy része két lépésben játszódik le. Az első lépésben hidrogén gyök vagy elektron elvonása történik a szubsztráttól, majd a második lépésben, a keletkezett gyök rekombinálódik. Ennek megfelelően megy végbe az alkánok, alkének, alkinek és arének hidroxilációja. Az alkánok citokróm P450 által katalizált hidroxilezésének mechanizmusát a 6. ábrán mutatom be [24a,b]. A szubsztrátról történő hidrogénelvonást követően megkapjuk a megfelelő gyököt, valamint ezzel párhuzamosan az enzim aktív helyén kialakul a hidroxoferril-porfirin forma. Ezután a kialakult gyökös intermedier rekombinálódik a központi vasatomról lehasadó hidroxil gyökkel. A reakció eredményeként megkapjuk a megfelelő alkoholt és az alapállapotú vas(III) porfirint.

15

O

OH

N C H

+

N Fe IV

N

S

N

.+

+

C

N

N Fe IV

N

N

S

Cys

Cys

N C OH

+

N Fe III

N

S

N Cys

6. ábra Alkánok CP450 által katalizált hidroxilezésének mechanizmusa.

Abban az esetben, ha a reakció során keletkező hidroxilált termék instabil, a citokróm P450 enzim inhibitoraként is viselkedhet. Ilyenkor az instabil hidroxilezett metabolit átrendeződik a megfelelő nagy reaktivitású karbénné és kvázi-irreverzibilis kötéssel kapcsolódhat a hem vasatomjához. Ezen a mechanizmuson keresztül hatnak a metiléndioxi származékok, mint pl. a piperonil-butoxid (PBO) is [25]. Ebben az esetben a metiléndioxi rész szénatomjáról leszakad a hidrogén gyök, majd az oxidáció hatására létrejön az instabil hidroxil származék. Ez vízvesztést követően karbénné alakul, amely koordinálódik a hem vasatomjával (7. ábra). R

R

O

O

OH

C H

H

O

R

O

H

O N N

N

N H2O

Fe III

R

H

O

S

N Cys

R

O :

N

O

Fe II N

S

N Cys

7. ábra Metiléndioxi származékok kölcsönhatása a CP450 enzimmel

Az alkének oxidációjának mechanizmusát a 8. ábrán mutatom be [26]. Ebben az esetben töltésátmenet megy végbe a kettős kötés és a ferril-oxigén között, ez szolgáltatja a megfelelő

16

gyökös intermediert. Mint a 8. ábrán is látható, két pozícióban is kialakulhat a gyökös centrum, így a rekombináció után két metabolitot is kaphatunk. Abban az esetben, ha az olefin terminális gyökintermediert képez, az a porfiringyűrű egyik nitrogénatomjával reakcióba lépve képes dezaktiválni az enzimet. Ezt a folyamatot öngyilkos dezaktiválódásnak nevezik. Diszubsztituált alkének esetén a hidrogénatom távozását követően nem tud kialakulni a terminális gyök, ezért a rekombináció után a megfelelő epoxidot fogjuk megkapni, amely főterméke ennek az átalakulásnak. Szemben az alkánokkal és az alkénekkel, az alkinek oxidatív átalakulásának mechanizmusa még nem teljesen tisztázott és jelenleg is kutatás tárgyát képezi (9. ábra) [27]. A terminális alkinek oxidatív átalakulása a megfelelő szubsztituált ecetsavszármazékokhoz vezet. Az acetilénekből származó terminális gyök itt is képes reakcióba lépni a prosztetikus hem csoporttal. Összehasonlítva az alkének és alkinek oxidatív átalakulásakor kialakuló öngyilkos dezaktiválódást, megállapíthatjuk, hogy a terminális acetilének esetén ez sokkal egyértelműbb. A nem terminális gyökintermediert képző acetilének is képesek dezaktiválni az enzimet: vagy az előzőekhez hasonlóan reakcióba lépve a hem résszel, vagy a fehérje módosítása révén. H

R

C H

R'

H O

N

H

R

N

N N

N

S

N S

Cys

H N

O

R

R'

H R'

O N

N

Fe N

Cys

R

H2 C

R

N

Fe

Fe IV N

R' O

N

O

R' = H

N

N

N

S

S

N Fe

Fe N

N Cys

Cys

R

S

N Cys

H R'

O N

N

Fe N

S

N Cys

8. ábra Alkének CP450 által katalizált hidroxilezésének mechanizmusa

17

Ennek a folyamatnak a mechanizmusa ma még nem teljesen tisztázott. Az acetilének enzimdezaktiváló készsége lehetőséget nyújt specifikus és irreverzibilis CP450 enziminhibitorok kifejlesztésére [28]. Az alkinek oxidatív átalakulásának mechanizmusa a 9. ábrán látható. R1 R

R2

1

N

O

C

N

N

Fe N

S

R O

N

Fe N

N Cys

H

R2 N

O

S

N Cys

R1 = H

R1

N

C H

Fe N

N S

R2 = H

O különbözõ Nu Y= -OH, -SH

Ketén

H2O

Cys O R1

O OH

R1

Y

Fehérje

9. ábra Az alkinek CP450 által katalizált hidroxilezésének mechanizmusa

Az aromás származékok oxidatív átalakulása általában az ún. NIH shift mechanizmussal megy végbe [29]. Hasonlóan más π-elektron rendszert tartalmazó vegyületek oxidációjához, ebben az esetben is először epoxidáció megy végbe az aromás gyűrűn. A szomszédos oxirán gyűrűben található szénatomhoz történő hidridion-vádorlás után, az oxirán gyűrű felnyílásával kapjuk meg a karbonil formát. Az ezt követő oxo-enol tautomer átalakulás végül a megfelelő fenol kialakulásához vezet (10/a ábra). Abban az esetben, ha az aromás vegyület egy erős elektrondonor csoportot tartalmaz, a 10/b ábrán látható mechanizmus szerint epoxid intermedier nélkül is végbemehet az oxidáció [30]. Az aromás vegyületek nemrég felfedezett ún. ipszo szubsztitúcióval végbemenő oxidációja [31] az oxigén és az aromás szénatom közötti kötés hasításával történik egy, a fenolos hidroxil csoport hidrogénjének leszakadásával képződő, gyök-intermedieren keresztül. A keletkezett gyök az enzim központi vasatomjához kötődő hidroxil gyökkel rekombinálódva eredményezi a megfelelő kinont (10/c ábra).

18

a,

P-Fe(IV)=O

O

H b,

H H

H

NHCOMe

H OH

O

NHCOMe

NHCOMe

P-Fe(IV)=O

HO

OEt c,

OR

OEt

O

OR

OR

.

OR

O*

P-Fe(IV)-*OH

P-Fe(IV)=O

OH

HO

O.

O

O

O

10. ábra Aromás vegyületek CP450 által katalizált oxidatív átalakulásának mechanizmusa

2.5 A citokróm P450 szerepe az inszekticid rezisztenciában Habár a rezisztencia kialakulására számos mechanizmus ismeretes, rovarokban e jelenség főként az aktív szubsztrátok fokozott metabolizmusára vezethető vissza [32]. Az inszekticidek, hasonlóan más lipofil karakterű xenobiotikumokhoz, viszonylag kevés enzim segítségével metabolizálódnak. Metabolikus folyamataik során a detoxifikációs folyamatban egyre hidrofilebbé és így könnyen üríthetővé válnak. Hasonlóan más xenobiotikumhoz, az inszekticidek lebomlási folyamata a 11. ábrán látható módon megy végbe. A primer metabolizmus következtében a molekulán növekvő polaritású csoportok (SH, OH, NH) jelennek meg. Az így kialakuló már hidrofil metabolitok közvetlenül kiürülnek a rovarból. Ha a primer metabolizmus során az anyag nem vált elég hidrofillé, akkor az ún. szekunder folyamatban különböző endogén molekulákkal (glükóz, glükuronsav vagy aminosavak) konjugálódik és így már képes kiürülni a szervezetből. Az inszekticidekkel szembeni rezisztencia visszaszorításának egyik legkönnyebben kivitelezhető módja, ha az aktív komponens primer metabolizmusát visszaszorítjuk.

19

Inszekticidek

Fázis Primer

Szekunder

Primer metabolitok

Primer fázis

Szekunder

Szekunder metabolitok

fázis

Kiválasztás

Reakciótípus Oxidáció Redukció Hidrolízis Csoportátalakítás Konjugáció

11. ábra Az inszekticidek metabolikus folyamatai

A

glutation-transzferáz

és

néhány

észteráz

mellett

az

inszekticidek

primer

metabolizmusában a citokróm P450 izoenzimeknek van fontos szerepük [33]. A metabolikus rezisztencia első sikeres leküzdése Eldefrawi és munkatársainak nevéhez főződik, akik a házilégyben karbarillal szemben létrejött rezisztenciát a Sesamex néven ismert metiléndioxifenil típusú CP450 inhibitorral szorították vissza [34]. További tanulmányok is arra utalnak, hogy a házilegyeken megfigyelt, egyes inszekticidekkel (pl. karbamátok) szemben mutatott rezisztencia a fokozott citokróm P450 által katalizált metabolizmusnak volt köszönhető [35]. A piretroidok vizsgálata során is azt tapasztalták, hogy bár több faktor határozza meg a rezisztencia kialakulását, az mégis döntően a fokozott CP450 által katalizált folyamatokra vezethető vissza [36]. Karbamátokra

érzékeny,

illetve

rezisztens

házilegyeken

végzett

összehasonlító

vizsgálatokban is a CP450 fokozott aktivitását figyelték meg. Ez az eredmény is megerősíti, hogy a rezisztencia főként a citokróm P450 enzimek fokozott aktivitásának köszönhető [36]. Emiatt a növényvédőszer kutatás egyik fő feladata és célja a CP450 izoenzimek rezisztens, illetve érzékeny típusainak izolálása, szekvenciájuk és szerkezetük meghatározása, ami nagy segítséget nyújthat a rezisztencia kialakulásának megértéséhez. A legfontosabb inszekticidek és ezek CP450 által katalizált oxidációra érzékeny pontjai a 12. ábrán láthatóak.

20

Piretroidok

Rotenoidok OR OR

O

O

R O O

O

O

Klórozott inszekticidek CCl3

Cl

Cl

Cl

Cl Cl

DDT

Cl

CCl3 Cl MeO

Cl Aldrin

OMe Metoxiklór Szerves foszfortartalmú inszekticidek

Karbamát inszekticidek

O O R P O S

Me O

O

Me N H Me

O Karbofurán

O

N H Me

O Karbaril

12. ábra Fontosabb inszekticidek CP450 által katalizált oxidációra érzékeny pontjai

21

3. Nitrogén monoxid (NO) és nitrogén monoxid szintetáz (NOS) Jóllehet már a XVII. század közepén több tanulmány is említést tesz a NO-ról, az első, kémiai sajátságaira vonatkozó pontosabb leírás Joseph Priestly (1772) nevéhez fűződik, aki a salétromsav rézzel történő reakciójával állított elő NO-ot [37]. Az 1980-as évek közepéig a NO-ot csak, mint az atmoszférában jelenlévő szennyező anyagot, illetve mint baktériumok metabolikus termékeit tartották számon. Az áttörés 1987-ben következett be, amikor első alkalommal sikerült eukariota sejtekből kimutatni a NO-ot. Ezt követően, a NO biokémiai szerepére irányuló fokozott kutatások számos olyan eredményt hoztak, amelyek forradalmasították a sejt szignál és toxicitás mechanizmusairól alkotott ismereteket. Az eredmények széleskörű elismeréseként a Science c. folyóirat 1992-ben az év molekulájának nevezte a NO-ot. A NO biológia hatásainak felismerésért Fruchgott, Ignarro és Murad 1998–ban orvosi Nobel-díjat kaptak. Napjainkban a NO-ot biológiai szempontból fontos szignál vegyületként tartják számon, ami felelős az érfal dilatációjáért [38], részt vesz a neuronális szignáltranszmissziós folyamatokban [39] és a sejt légzésben [40], citotoxikus hatással van különböző patogénekre és tumor sejtekre [41]. Alul- és túltermelődését számos patológiás folyamattal (endotoxikus sokk [42], cukorbetegség [43], szívizom bántalmak [44]) hozzák összefüggésbe. Az eukarióta sejtekben a NO szintézisét a NOS végzi, egy L-argininből kiinduló, O2mediált kétlépéses oxidatív folyamatban. Emlősökben a NOS-nak jelenleg négy izoformája ismert: a konstitutív, kalmodulin-függő neuronális NOS (nNOS), az endoteliális NOS (eNOS), mitokondriális NOS (mtNOS) és a kalmodulin-független, citokin-indukált NOS (iNOS). Mind a négy izoenzim dimer, az egyes monomerek mérete 130-160 kDa. A dimer szerkezetű NOS összes izoformájában az egyik monomer N-terminális doménében található az enzim aktív helye, a vas protoporfirin egység, így a NOS-ok is a hem-fehérjék családjába tartoznak. A másik monomer C-terminális doméne, ami egy-egy ekvivalens FAD-ot (flavin adenin dinukleotid) és FMN-ot (flavin mononukleotid) köt magához, funkcionális értelemben a P450 reduktáz homológja (13. ábra).

22

13. ábra Az iNOS röntgendiffrakciós vizsgálattal meghatározott szerkezete

3.1 A NO bioszintézise A NOS egy 5 elektronos, kétlépéses oxidációs reakcióban, az L-arginint citrullinná és NOdá alakítja (14. ábra) [45]. Az első lépésben a NOS egy NADPH és egy O2 (2 elektron) felhasználásával az arginint N-hidroxi-argininné (NHA) alakítja. Az ezt követő lépésében az NHA egy szokatlan, 3-elektronos oxidáció során fél NADPH és egy O2 felhasználásával NOdá és citrulinná alakul [46a,b]. Habár az első lépés könnyen értelmezhető a citokróm P450 által katalizált hidroxilálással és megfelel a 2.3 fejezetben bemutatott ún. teljes ciklussal végbemenő CP450 folyamatnak [47], a reakció második lépésének mechanizmusa még nem teljesen tisztázott. OH H2N

+

NH2 NH

NADP+

HN

NADPH

+

NH2

0,5 NADP+ 0,5 NADPH

NH

H2N

O NH

+ O2 +

H3N

COO-

L-Arginin

+

0,5 H + O2 H2O

+

H3N

COO-

H2O

N-Hidroxi-Arginin (NHA)

14. ábra A NO bioszintézise

23

+

H3N

COO-

Citrullin (CIT)

NO

18

O izotópjelzéssel végzett vizsgálatok rámutatnak arra, hogy a citrullin karbamid

oxigénje az O2-ből, míg a NO az NHA N-hidroxi csoportjából származik [48a,b]. Jelenlegi ismereteink szerint nem egyértelmű, hogy a reakció második lépésében a NADPH vagy maga az NHA felelős a NOS vas(III)-hemjének redukciójáért. Számos javaslat látott napvilágot a szokatlan redox folyamat magyarázatára. A vizsgálatok egyik része egy a citokróm P450 monooxigenáz mechanizmusra emlékeztető oxo-vas(IV) porfirin gyökkation [49a,b], a másik része egy nukleofil peroxo-vas(III) porfirin analóg [46a,50] jelenlétében végbemenő folyamattal magyarázza a különleges redox reakciót. A folyamat mechanizmusának pontosabb feltárása további vizsgálatokat igényel.

24

4. A szintetikus metalloporfirinek és alkalmazásuk Napjainkban a szintetikus metalloporfirinek által katalizált oxidatív folyamatok egyre fontosabb szerephez jutnak a különböző biológiai rendszerek modellezésében. Emellett sokrétű katalitikus tulajdonságuk miatt szerves szintézisekben is sikerrel alkalmazzák őket. Biológiai folyamatok tanulmányozása esetén a szintetikus metalloporfirin katalizátorokkal végzett vizsgálatok egyik fő iránya olyan rendszerek kifejlesztése, amelyek jól reprodukálják az aktív helyen protoporfirin IX egységet tartalmazó (1. ábra) hem-fehérjék (citokróm P450 [51a,b,c,d], lignin peroxidáz [52a,b,c], nitrogén monoxid szintetáz (NOS) [53,54*] stb. [55a,b,c]) által mediált oxidatív folyamatokat. Szerves kémiai folyamatokban olyan metalloporfirint tartalmazó rendszereket igyekeznek kifejleszteni, amelyek akár ipari méretekben is képesek szerves vegyületek sztereo-, illetve regiószelektív oxidációjára vagy szennyező anyagok detoxifikációjára [56a,b,c,d,e]. Más esetekben hasznosíthatóak Lewis savként oxaziridinek átrendeződésében [57a,b], epoxidok izomerizációjában [58a,b], de hidroxil csoportok szililezési reakciójában [59a,b] is alkalmazzák őket.

4.1 Szintetikus metalloporfirinek szerkezete, csoportosítása A biomimetikus reakciókban alkalmazott szintetikus metalloporfirineket szerkezetük alapján három csoportban oszthatjuk. A mezo-tetrafenilporfirin (H2TPP) különböző fémekkel képzett komplexei az ún. első generációs metalloporfirinek (15. ábra, I.). Ezekkel szemben két jelentős probléma is felmerült: (i) oxidációjuk során könnyen képeztek inaktív µ-oxo dimereket (16. ábra); X

X

X

X

X

X R

X R

M = Fe, Mn, Cr, Ru RX

R

N

X

N M

X X

X

N

N X R

RX R X

X

X X

X

R

I. generációs: X= H, R= H II. generációs: X= halogén, alkil, O-alkil, -SO3H X R= H III. generációs: X= halogén, alkil, O-alkil, -SO3H R= halogén

15. ábra Néhány szintetikus metalloporfirinek szerkezete

25

Fe O Fe porfiringyűrű

16. ábra Metalloporfirin µ-oxo dimerek szerkeze

(ii) a makrociklus meglehetősen érzékeny volt az oxidatív környezetre és könnyen szenvedett degradációt. Ezek az okok vezették a kutatókat további metalloporfirin származékok előállítására. A mezo-tetrafenilporfirinek második generációs vegyületei, az ún. αhelyettesített származékok, a porfirin makrociklus mezo-helyzetében található fenil csoportok orto-, meta-, vagy para- szubsztitúciójával vezethetők le. Ezen vegyületek közül a halogénnel (elsősorban F, Cl és Br), alkil, O-alkil és szulfonsav csoporttal helyettesített származékok (15. ábra, II.) bizonyultak jól használhatóknak. Az így kapott metalloporfirin származékok előnye, hogy szubsztituált fenil csoportok sztérikus hatásuk folytán gátolják a µ-oxo dimerek kialakulását, továbbá a fenil csoporton található elektronvonzó szubsztituensek növelik a oxofém forma elektrofil jellegét és így katalitikus hatékonyságát. További előnyt jelenthet, hogy míg az első generációs mezo-tetrafenilporfirinek kizárólag szerves oldószerben oldhatóak, a második generációs, szulfonsavval helyettesített származékok vízoldhatóak. Így lehetővé vált poláros, vízoldható szubsztrátok vizes közegben, szintetikus metalloporfirinekkel végzett reakciója is. A mezo-tetrafenilporfirinek harmadik generációja az előző gondolat kiterjesztésével jött létre. Ennek során a makrociklusban található pirrol gyűrűt különböző halogénekkel β-helyzetben szubsztituálták (15. ábra, III.). Az így kapott származékok tovább növelték a metalloporfirin aktivált oxo-fém formájának elektrofil karakterét, így tovább nőtt katalitikus hatékonyságuk is [60]. A fenti csoportosítás magában foglalja a szintetikus metalloporfirinek fejlődése során bekövetkezett főbb szerkezeti változásokat. Érdemes azonban kiemelni néhány egyedi megoldást, amelyek egyrészt a katalitikus hatás szelektivitását befolyásolják, másrészt a katalizátor regenerálhatóságát igyekeznek megoldani. A szerves kémikusok leleményességét bizonyítja az ún. összeszíjazott (strapped) [61a,b,c] és sapkás (capped) [62a,b,c] származékok (17. ábra) előállítása, amelyek jól alkalmazhatók különböző regiószelektív oxidációs reakciókban. Abban az esetben, ha az áthidaló lánc királis csoportot is tartalmaz, a kapott metalloporfirin származékok aszimmetrikus oxidatív átalakításokra is felhasználhatóak (18. ábra) [63a,b,c].

26

cisz

capped transz

strapped

17. ábra Szintetikus porfirinek „strapped” és „capped” származékai

18. ábra Királis transz-strapped funkcióval ellátott szintetikus vasporfirin

Ismertek olyan megoldások is, amelyek elsősorban a metalloporfirinek regenerálhatóságát célozzák meg, igaz ezek a változtatások sok esetben törvényszerűen együtt járnak a katalitikus hatás szelektivitásának megváltozásával is. Ezekben az eljárásokban a felhasználni kívánt metalloporfirin származékot fizikai vagy kémiai úton hozzákötik valamilyen segédanyaghoz (ioncserélőgyanta [64a,b,c], zeolit [65a,b,c], szilikát [66a,b,c]) és az így immobilizált porfirin 27

származékkal végzik el a heterogén katalízist. A reakció végén a kötött metalloporfirin könnyen újra aktiválható, ellenállóbb az oxidációval szemben, valamint a szilárd hordozó környezete szelektívebbé teheti az oxidatív átalakítást [67]. A metalloporfirinek csoportosítása elvégezhető a központi fématom jellege alapján is. Leggyakrabban a porfirinek Fe2+, Mn2+, Cr2+ és Ru2+ ionokkal képzett komplexeit alkalmazzák. A szintetikus vas-, mangán- és króm-porfirin származékokat főként hemfehérjék

biomimetikus

katalizátoraként

[51a,b,52a,55a,68*,69*],

továbbá

olefinek

epoxidálásában [51a,70a,b,c] és alkánok hidroxilálásában[51c,71a,b,c] használják. Ezzel szemben a ruténium származékokat más, speciális esetekben alkalmazták nagyobb sikerrel, mint például foszfinok [72a,b,c], fenolok [73], alkoholok [74], aminok [75a,b] és tioéterek [76] oxidációs folyamatainak katalízisében, egyes olefinek epoxidációjában [77a,b,c] és alkánok hidroxilezésében [78a,b]. A vas-, mangán- és króm-porfirin komplexekkel aktiválódásuk során monooxo-M(IV) állapotba kerülnek. Ezzel szemben a ruténium származék aktivált állapotban, transz-dioxo-Ru(VI) komplexé alakul. A transz-dioxo-Ru(VI) komplex képes a mono- és dioxigenáz enzimeknél megfigyelt O2 indukált oxidációra, ami számos, eddig csak enzimeknél megfigyelt kemo-, regio- és enantioszelektív oxidatív átalakulást tesz lehetővé [79]. A metalloporfirineket oldhatóságuk alapján is csoportokba sorolhatjuk. Itt két fő csoportot érdemes megkülönböztetni, a poláros, elsősorban vízben és szerves poláros (halogénezett alkánokban, elsősorban diklórmetán, diklóretán) oldószerben oldódó származékokat. Azt, hogy a biomimetikus reakciót milyen oldószerben érdemes elvégezni, elsősorban a szubsztrát oldhatósági viszonyai határozzák meg. Bár a metalloporfirinek (I. generációs, II. és III. generációs halogén atommal, alkil csoporttal szubsztituált származékok) túlnyomó része inkább szerves poláros oldószerben oldódik, sok esetben sikeresen alkalmazták ezeket vízoldható szubsztrátok oxidációjában. Ezekben az esetekben vagy heterogén rendszerben hajtották végre a katalízist [80a,b,c], vagy oldószerkeverék (pl. diklórmetán-etanol elegye) alkalmazásával értek célt [81,54*,68*,69*]. Abban az esetben, ha a szubsztrát oldhatósága vagy az oldószernek a reakció szelektivitására gyakorolt hatása miatt nem lehet elkerülni a vizes

rendszer

alkalmazását,

vízoldható

metalloporfirinek

(II.

és

III.

genarációs

metalloporfirinek szulfonsavval helyettesített származékai) alkalmazása válik szükségessé [52a,82a,b,c].

28

4.2 Szintetikus metalloporfirinek előállítása A mezo-szubsztituált tetraaril-porfirinek előállításánál alkalmazott klasszikus szintézisutak meglehetősen problematikusak és viszonylag alacsony kitermelés mellett mennek végbe. Ennek ellenére a szerves kémikusok napjainkban is ezen az úton állítják elő a különböző metalloporfirin származékokat. A Rothemund-féle eljárás során a megfelelő aldehidet pirrol felesleggel reagáltatják piridinben 220 oC-on, 48 órán keresztül, a reakció termelése 9%-os (19. ábra) [83].

Ar H N

+

N

N Ar-CHO

H

Ar

Ar

H

N

N

Ar 19. ábra Porfirinek előállítása Rothemund eljárással

Ezt a reakciót Adler fejlesztette tovább, aki az aromás aldehidet pirollal hozta reakcióba 140 oC-on, propionsav jelenlétében. A reakció termelése 20%-ra nőtt [84]. Igazi áttörést a porfirinek szintézisében a Lindsey és munkatársai [85] által kidolgozott eljárás jelentette. Az általuk kifejlesztett kétlépéses szintézisben először trifluor-ecetsav vagy bór-trifluorid katalizátor jelenlétében aldehidből és pirrolból a megfelelő porfirinogén keletkezik, majd a kapott porfirinogén 2,3-diklór-5,6-diciano-1,4-benzokinon (DDQ) segítségével porfirinné oxidálódik (20. ábra). A reakció mindkét lépése szobahőmérsékleten megy végbe, a termelés 20-40%-os. A központi fématom beépítése ezt követően a megfelelő fém sójának segítségével aprotikus-dipoláris oldószerben történik.

29

H

Ar

H N

+

Ar-CHO

H+

Ar H

N

H H HH

N

H

N

Ar

Ar H Porfirinogén

O Cl

N

CN

DDQ, oxidáció Cl

CN

Ar

O DDQ N

N H

Ar

Ar

H

N

N

Ar

20. ábra Porfirinek Lindsey-féle szintézise

4.3 A metalloporfirin modellrendszer felépítése és működési mechanizmusa Hasonlóan más modellrendszerekhez, a metalloporfirin modellrendszer esetén is fontos a rendszert felépítő elemek és azok rendszerre gyakorolt hatásának pontos ismerete. A következőkben ezeket az építőelemeket fogom bemutatni. Magára a metalloporfirin katalizátorra és az alkalmazott közegre (oldószerre) itt már nem térek ki, hiszen szerepüket 4.1 részben már ismertettem.

4.3.1 Az axiális ligandum hatás Más enzimekhez hasonlóan, a hem-fehérjék aktív helyének környezete fontos szerepet játszik az enzim aktiválódásában, valamint az enzim-szubsztrát kölcsönhatás kialakulásában. Ezeknek a kölcsönhatásoknak jó része a szintetikus metalloporfirinek mezo helyzetben található fenil csoportjának különböző szubsztituciójával modellezhető. Jó példa erre a már említett capped és strapped származékok. Hem-fehérjék katalitikus folyamataiban a protoporfirin IX egység központi vasatomjához kapcsolódó, axiális helyzetben található aminosav is igen fontos szerepet játszik (2. ábra). Bár

30

az axiális helyzetű aminosav az egyes enzimcsaládokon belül konzerválódott, a különböző enzimcsaládok esetében más és más lehet. Így a citokróm P450 és a NOS esetében cisztein, lignin peroxidáz és mangán peroxidáz esetében hisztidin, kataláz esetében pedig tirozin az axiális ligandum. Számos tanulmány foglakozik az axiális ligandum hem-fehérjék működésére gyakorolt hatásával. Az axiális ligandumoknak fontos szerepe van a hemfehérjék aktív helye és a szubsztrátok vagy inhibitorok között kialakuló kölcsönhatás létrejöttében, valamint az oxidatív folyamatok során a fém-oxigén kölcsönhatás kialakulásában, illetve megszűnésében. Az axiális ligandum aktív helyre gyakorolt hatása egyrészt sztérikus, másrészt elektronikus hatásokra vezethető vissza [86a,b,c,d,e,87]. Hasonló kölcsönhatást szintetikus metalloporfirinekkel végzett biomimetikus reakcióban is sikerült kimutatni. Így Meunier és Tabushi [88a,b] alkének epoxidációjára kifejlesztett biomimetikus rendszerében, piridin hozzáadásával jelentősen megnőtt a reakció kemo- és szetereoszelektivitása. Mint később kiderült a modellrendszer megváltozását a piridin központi fématomhoz való axiális koordinációja okozta. A szintetikus metalloporfirinek esetében a piridin, illetve más aromás nitrogént tartalmazó vegyületeken kívül különböző anionokat (X-, OH-, CH3COO-, OAc-, ClO4-, NO3-) alkalmaztak az axiális ligandum hatásának modellezésére [89a,b,c,d,e].

Megfigyelések

szerint a biomimetikus rendszerben az axiális ligandumok két módon képesek kifejteni hatásukat. Egyrészt, hasonlóan a II. generációs szintetikus metalloporfirinek esetében tapasztaltakhoz, elektronvonzó hatásuk folytán növelik a oxo-fém forma elektrofil jellegét. Ez a hatás párhuzamosan nő az egyre nagyobb elektronegativitású ligandumok alkalmazásával (pl. F->CH3COO->Cl->OH->Br->I-) [90a,b]. Másrészt megfigyelték, hogy míg a nagyobb méretű axiális ligandumok, mint pl. a I- síkon kívüli (out-of-plane), addig a kisebb ligandumok, mint pl. a fluorid síkban (in-plane) típusú szerkezeti kölcsönhatásban áll a porfirin gyűrűvel. Ez a kölcsönhatásbeli különbség jól korrelál a biomimetikus rendszerek eltérő szubsztrát szelektivitásával [91a,b].

4.3.2 Oxigén donorok, a biomimetikus rendszer működési mechanizmusa A szintetikus metalloporfirinek első, biomimetikus rendszerben való alkalmazása (1979) Groves és munkatársai nevéhez fűződik, akik mezo-tetrafenil vasporfirin-jodozilbenzol rendszer segítségével sikeresen modellezték a citokróm P450 által katalizált hidroxilációs és

31

epoxidációs reakciókat [70b]. Napjainkban három metalloporfirin által katalizált oxidációs rendszer különböztethető meg. Az első rendszerben a vas, mangán és króm tartalmú metalloporfirin mellett, különböző oxigén donorokat (H2O2, m-klórperbenzoesav, jodozilbenzol, NaOCl, amin N-oxidok, perjodátok) alkalmaznak. Az így létrehozott biomimetikus rendszer a citokróm P450 ún. peroxid sönt mechanizmusához hasonló katalitikus viselkedést mutat [92a,b,c,d,e]. A második rendszer metalloporfirint, molekuláris oxigént és redukáló ágenst (pl. NaBH4, aszkorbinsav, Zn(Hg), kolloidális Pt/H2) tartalmaz, ami a citokróm P450 teljes ciklusát modellezi (5. ábra, 2.3 rész) [93a,b,c]. A harmadik rendszer, amit elsősorban olefinek epoxidációjára használnak, transz-dioxo-Ru(VI) porfirin katalizátort és molekuláris oxigént tartalmaz. Ebben az esetben nincs szükség redukáló ágens alkalmazására [72b,c,94]. A szintetikus metalloporfirinek működési mechanizmusa röviden a következő. Az alapállapotú, +3 oxidációs állapotú központi fématommal rendelkező metalloporfirin, a fentiekben leírt oxidálószer, illetve oxidatív rendszer hatására reaktív, magas oxidációs állapotú oxo-metalloporfirinné alakul. NMR, EPR, Mössbauer és EXAFS (Extended X-ray Absorption Fine Structure) vizsgálatok alapján, az aktiválódás során két fajta oxometalloporfirin is keletkezhet. Az esetek nagyobb részében a jellegzetes zöld színű oxofém(IV) porfirin gyökkation keletkezik [21]. Ritkábban, ha sem axiális ligandumnak megfelelő vegyület, sem ionok nincsenek a rendszerben a torma peroxidáz aktivált állapotával analóg oxo-fém(IV) porfirin keletkezik [95a,b,c]. Az így kapott reaktív oxo-metalloporfirin a rendszerben található szubsztrátot a megfelelő oxidatív temék(ek)ké alakítja, majd visszaalakul az eredeti alapállapotba (21. ábra). Oxidálószer O N N N

N Fe III

N

N FeIV .+

X vagy

N

O

N

N

N Fe IV

N

N

Oxidatív termék(ek)

Szubsztrát

21. ábra A szintetikus metalloporfirinek működési mechanizmusa

32

Bár az oxo-metalloporfirin–szubsztrát kölcsönhatás mechanizmusaira számos elmélet alakult ki, ezek nagy része nem bizonyított. Éppen ezért az értekezés keretein belül, csak a két leginkább tisztázott és az esetek nagy részében helytálló mechanizmust mutatom be, egy-egy tipikus példán keresztül. Az első esetben oxo-fém(IV) porfirin gyökkation és valamilyen szénhidrogén reakciójának első lépésében hidrogén atom elvonás történik a szubsztrátról (R-H). Ezt egy gyors hidroxil gyök vándorlás követi a porfirin központi fématomjáról a reakció intermedierjeként keletkező alkil gyökre (R˙) (2.4. rész 6. ábra) [22,96a,b]. Többek között ezzel a reakció mechanizmussal, amit az angolszász szakirodalom „oxygen rebound” mechanizmusnak hív, írható le a norbornán, kámfor és ciklohexén modellvegyületek citokróm P450 által katalizált oxidatciója is [97a,b]. Jó példa a második mechanizmusra, amikor az N-demetilezési reakcióban, az oxo-fém(IV) porfirin gyökkation és az N-metil származék között létrejött elektrontranszfer hatására a megfelelő N-metil gyökkation és oxo-fém(IV) porfirin származékok képződnek. Az ezt követő két lépés megfelel az előzőekben leírt, hidrogénatom transzferrel végbemenő folyamatnak. Végül az N–C kötés hasadása következtében kialakul a megfelelő amin és oxo származék (22. ábra) [98a,b,c].

N

+

P

+

(IV)

Fe

O

ET

N

+

+

N H

(IV)

P

Fe

+

O

O CH2

N CH2

N

+

+

(IV)

P

Fe

(III)

P

Fe

OH

22. ábra Szintetikus metalloporfirinek jelenlétében végbemenő N-demetileződés

33

OH

5. A hyaluronan (HA) és jellemző szabadgyökös folyamatai 5.1 A HA szerkezete, előfordulása A hyaluronsav a glükózaminoglikán vegyületcsaládba tartozó, ismétlődő N-acetilglükózamin–glükuronsav diszacharid egységekből felépülő homopolimer (23. ábra). Monoszacharid egységei β(1→3), a diszacharidok β(1→4) kötéssel kapcsolódnak, így a lineáris poliszacharidban β(1→3) és β(1→4) kötések váltakoznak [99].

23. ábra A HA diszacharid egysége

A hyaluronsav az élőlényekben mindig valamilyen kationnal, általában Na+-nal alkotott só formájában fordul elő. Emiatt és mivel a hyaluronsav szabad sav formája meglehetősen bomlékony általában a só, illetve komplex formát jelölő hyaluronan elnevezést szokás alkalmazni. A továbbiakban a HA (hyaluronan) rövidítés a hyaluronsav valamilyen kationnal képzett formáját fogja jelezni. A HA molekulatömege 10-20 kDa-tól több ezer kDa-ig terjedhet. A HA szerkezetében található glükuronsav karboxil csoportja, a glükózamin Nacetil csoportján található karbonil és amino csoport, valamint a hidroxil csoportok számos Hhidas kötés kialakítására adnak lehetőséget. Az intramolekuláris H-hidas, illetve a biológiai rendszerekben jelenlevő vízzel való H-hidas kölcsönhatásoknak köszönhetően a HA meglehetősen bonyolult, rendezetlen háromdimenziós szerkezetet mutat (24. ábra) [100a,b,c,d]. Rendkívüli vízmegkötő sajátsága révén még viszonylag híg vizes oldata (0,5%) is magas viszkozitású. Vizes oldatban tapasztalható reológiai viselkedése jelentősen függ a molekula méretétől [101]. Így pl. egy 1000 kDa molekulaméretű HA 1%-os vizes oldatának 3000 mPas, míg egy 4000 kDa molekulaméretű HA hasonló töménységű oldatának 400000 mPas a viszkozitása [102]. Ennek megfelelően a HA két legfontosabb fizika jellemzője a viszkozitása

és

a

molekulatömege.

A

molekulatömegét

34

általában

méretkizárásos

kromatográfiával [103], illetve újabban lézerszórásos (laser light scattering) [104] módszerekkel határozzák meg. CH3 H O

H HN

O

H

H

HH

H

O

O O

H

O H

H O

H

O

O

O HO H

CH2OH H O

H O

O

H H

H

HH O

NH

H

O

O H

vízmolekulákkal képzett H-híd

H

H

CH2OH H O

H O

O

O

H

O

H O

O HO

CH3

OH O H

O

H

H

O H

O

O

H

O

H

H

O

H

O

H

H H

O HH O

intramolekuláris H-híd

NH H

CH3

random-coil 24. ábra Hyaluronan 3D szerkezetének felépülése

A HA az extracelluláris mátrix egyik fő alkotóelemeként a szervezet minden pontján jelen van [105]. Egyes szervek, illetve szövetek (kötőszövet, bőr, izületi folyadék, szem csarnokvize, érfal) fokozott mennyiségben tartalmaznak HA-at [106a,b]. A HA-at elsőként Karl Meyernek sikerült izolálnia a szem csarnokvizéből [107]. Az állati eredetű szövetek közül kiemelkedően nagy mennyiségben található a kakastaréjban [108], ipari méretű előállítása

is

elsősorban

kakastaréjból

való

izolálással

történik

[109].

Egyes

mikroorganizmusok (Aerobacter aerogenes, a Streptococcus pyogenes és a Pseudomonas

35

aeruginosa) képesek a hyaluronan fokozott bioszintézisére, ez teremt lehetőséget a HA fermentációs úton való előállítására [110a,b,c].

5.2 A HA biológiai szerepe A HA biológiai szerepét sokáig fizikai tulajdonságaiban látták. Így pl. reológiai tulajdonsága révén képes mechanikai védelmet nyújtani az izületeknek [111a,b]. Rendkívüli vízmegkötő képességének köszönhetően, ozmózisnyomásán és áramlási ellenállásán keresztül szabályozni tudja a vízháztartási egyensúlyt, de fontos szerepet játszik az intersticiális tér kitöltésében és a sejtek védelmében különböző fizikai behatások esetén [112]. Az utóbbi évek kutatásai rávilágítottak arra, hogy számos élettani folyamat összefüggésbe hozható a HA és egyes, a szervezetben előforduló makromolekulák között kialakuló kölcsönhatással. Ilyenek például az extracelluláris mátrixban található proteoglikánok (aggrekán, verzikán, brevikán stb.), amelyek fő feladata a sejtek közötti tér kitöltése és az anyagtranszport biztosítása [113a,b,c]. A HA-val kölcsönható makromolekulák ugyanakkor lehetnek

intracelluláris

transzmembrán

(CD44,

RHAMM)

[114a,b,c],

valamint

a

citoplazmában jelen levő (C1q, P-32, TSG-6 stb.) receptor-fehérjék is [115a,b,c,d], amelyeknek fontos szerepe van számos sejt és szervezet szintű szabályozási folyamatban. Ennek

megfelelően

a

HA

szerepet

játszik

immunfolyamatok

szabályozásában,

sejtregenerálódási folyamatokban, tumor sejtek inváziójában és angiogenikus folyamatokban [116]. A HA-t a fenti élettani folyamatokban való részvételének felismerése következtében már számos terápiában alkalmazzák sikeresen (sebgyógyítás, krónikus gyulladások, szemészeti műtétek) [117a,b,c]. A HA terápiás alkalmazása kiterjeszthető, illetve egyes esetekben hatása fokozható a glükuronsav rész karboxil csoportja és különböző fémionok (Na+, Zn2+, Co2+, Cu2+, Mn2+, stb.) között létrejövő asszociátumok kialakításával [118a,b,c,d,e]. Jó példa erre, a Richter Gedeon Rt. lábszárfekélyes megbetegedésekben egyedülállóan hatékony, originális hatóanyaga a cink-hyaluronát[109], amit Curiosin néven hoznak forgalomba.

5.3 A HA gyulladásos, illetve szabadgyökös folyamatokban való részvétele Számos gyulladásos megbetegedés (reumatoid artritisz, krónikus sebek, vaszkulitisz, hepatitisz) jár együtt a HA szérumszintjének emelkedésével, valamint fokozott degradációval,

36

ami reológiai tulajdonságainak jelentős romlását eredményezi [119a,b,c,d]. Így pl. az igen intenzív reumás fájdalom egyik fő oka, az izületi folyadék fő komponensét adó HA viszkozitásának romlása, amely így nem képes a két izületi végződés között megfelelő közeget biztosítani. Megfigyelések szerint a HA fent említett gyulladásos megbetegedések hatására végbemenő szerkezeti változását a patológiás folyamatok során keletkező reaktív oxigént tartalmazó metabolitok (továbbiakban ROM: a hidroxil gyök (˙OH), a szuperoxid gyökanion (˙O2-), a peroxil gyök (RO2˙) és a peroxinitrit (ONOO-)) okozzák [120a,b,c,d]. Napjainkig a hyaluronan ROM-ok hatására végbemenő folyamatokkal kapcsolatos vizsgálatok a molekulaméret csökkenés folyamatának mechanizmusára [121a,b,c], valamint az ezzel szoros összefüggésben levő reológiai tulajdonságok megváltozásának kinetikájára irányultak [122a,b,c]. Viszonylag keveset tudunk a ROM-ok és a HA kölcsönhatásának biológiai hatásairól. Munkámban a HA eddig még feltáratlan, farmakológiai szempontból is fontos tulajdonságát, az antioxidáns sajátságot vizsgáltam. Ezért a következőkben az egyes ROM-okat, illetve azok in vitro modellezésének lehetőségét mutatom be.

5.4 Reaktív oxigént tartalmazó metabolitok Egy olyan komplex, több sejtből felépülő aerob szervezet, mint pl. az emlősöké, meglehetősen sokoldalúan képes felhasználni a levegő oxigénjét. Vannak fehérjéi, amelyek egyszerűen csak az O2 szállításáért (hemoglobin) vagy a raktározásáért (mioglobin) felelősek, mások viszont különböző oxidációs folyamataikban használják fel a levegő oxigénjét. Ez utóbbiakat oxigenázoknak hívjuk [123]. Az oxigenázok katalitikus hatásukat egy koenzim vagy kofaktor segítségével fejtik ki. A koenzimek vagy másképpen prosztetikus csoportok általában egy vagy több fématomot tartalmazó, a fehérjéhez kovalens kötéssel kapcsolódó részek. Ilyen prosztetikus csoport a hem-fehérjék esetében a protoporfirin IX egység. A kofaktorok nem kovalensen kötődő, elektron, illetve hidrogén donorként vagy akceptorként jelenlevő vegyületek. A biológiai oxidációs folyamatokban általánosan felhasznált kofaktorok a NAD (nikotinamid-adenin-dinukleotid), NADP (nikotinamid-adenin-dinukleotid foszfát) és a FAD (flavian-adenin-denukleotid), illetve ezek redukált formái. Az oxigenázok működése során különféle ROM-ok is képződnek (3. táblázat). A keletkező ROM-ok fontos szerepet játszanak a szervezetbe bekerülő idegen anyagok, illetve mikroorganizmusok eliminálásában [124a,b,c]. Mivel azonban igen reaktívak és gyakorlatilag bármilyen vegyülettel képesek

37

reakcióba lépni, így a saját sejteket felépítő molekulák (lipidek, fehérjék, nukleinsavak) degradációja révén igen károsak is lehetnek [125a,b,c]. 3. táblázat Reaktív oxigént tartalmazó metabolitok

Gyökös típusúak

Nem-gyökös típusúak

Szuperoxid gyökanion,˙O2-

Hidrogén peroxid, H2O2

Hidroxil gyök, ˙OH

Hipoklórossav, HOCl

Peroxil gyök, RO2˙

Ózon, O3

Alkoxi gyök, RO˙

Szinglet oxigén

Hidroperoxil gyök, HO2˙

Peroxinitrit, ONOO-

A ROM-ok közül az élettani folyamatok során elsődlegesen ˙O2- gyökanion és a H2O2 keletkezik. A többi ROM képződése ezekből kiindulva megy végbe. A ˙O2- gyökanion és a H2O2 könnyen levezethető O2-ból többlépcsős elektron-redukciós folyamattal (25. ábra). A ˙O2- és H2O2 egyik legfontosabb forrása a mitokondriális elektrontranszport lánc [126a,b,c].

O2

O2

egy-elektron redukció két-elektron redukció

.

O2

H2O2

+

+ 2H

O2

négy-elektron redukció

2 H2O

+

+ 4H

25. ábra O2 metabolizmus

Az itt jelenlévő flavin-kötött enzimek a FAD→FADH2 kétlépéses folyamatban H2O2-ot állítanak elő, az első lépésben egy elektron-redukció és egy proton felszabadulással (FAD→FADH) O2-ból ˙O2- gyökaniont, majd a második lépésben (FADH→FADH2) további

38

egy elektron-redukció és egy proton felszabadulásával. A koenzim Q-ból hasonló mechanizmus alapján keletkezik ˙O2- gyökanion és H2O2. Egy másik fontos mitokondriális elektrontranszport-lánc enzim a citokróm c, amely összesen négy elektronátmeneten keresztül az O2-t vízzé képes alakítani. Természetesen a köztes lépések során ebben az esetben is keletkezik ˙O2- gyökanion és H2O2 [127]. A mikroszómális elektrontranszport lánc két fontos tagja a NADPH-citokróm P450 és a fagocitákban jelenlévő NADPH oxidázok is képesek elektronátmenettel járó folyamatokban ˙O2-gyökaniont és H2O2-ot előállítani [128]. A többi fontos ROM keletkezése különböző ingerek (főként immunológiai folyamatok) hatására, a fagocitákban megy végbe. Mint azt a 26. ábrán is láthatjuk, a ˙OH gyök a számos fehérjében (transzferrin, ferritin stb.) megtalálható vas(II) jelenlétében az ún. Fenton reakció során, illetve ˙O2- gyökanion jelenlétében H2O2-ból képződik. ˙OH gyök ezen felül keletkezhet a mieloperoxidáz (MPO) által katalizált folyamatban keletkező HOCl (hipoklórossav) és ˙O2- gyökanion reakciójából is. A ONOO- a 3. pontban már ismertetett módon képződő NO és ˙O2- gyökanion reakciójából keletkezik. Az alkoxi-, illetve lipidperoxil gyökök a környező molekulák (főként lipidek, nukleinsavak) és a ROM-ok reakciójából származnak.

H2O2 + O2

H2O

Fenton reakció 3+ . OH + Fe 2+

SOD Fagociták

.

CAT -

Fe

.

H2O2

O2

Cl

MPO

HOCl . NO

O2 ONOO

-

O2

.

.

OH

O2 .

lipid peroxidáció DNS degradáció enzim dezaktiválás

OH

NH és SH csoportok oxidációja

26. ábra ROM-ok képződése fagocitákban

Természetesen a szervezetnek vannak megfelelő védekező mechanizmusai a keletkező ROM-ok eliminálására. Ennek megfelelően a ˙O2- gyökanion és H2O2 eliminálásáért a peroxidázok családjába tartozó kataláz (CAT) és szuperoxid diszmutáz (SOD) felelősek

39

[129a,b] (26. ábra). Emellett ismertek olyan endogén anyagok is, amelyek ROM-ok hatására stabil, a szövetekre nem káros oxidatív termékeket képeznek és így képesek megvédeni a sejteket. Ilyenek, pl. a glutation (GSH), melatonin, bilirubin, nemi hormonok, stb. Ha azonban valamilyen betegség (reumatoid artritisz [130a,b], Alzheimer-kór [131a,b], multiplex szklerózis [132a,b]) vagy külső hatásra (hő, sugárzás [133a,b]) következtében a természetes egyensúly megbomlik, a ROM-ok túlsúlyba kerülnek. Ilyen esetekben célszerű a ROM-okat a szervezetből

elimináló

ún.

antioxidáns

hatással

rendelkező

vegyület

segítségével

helyreállítani az egyensúlyt. Az ismertebb és széles körben alkalmazott antioxidánsok közül fontosak a C- és E-vitamin, valamint a növényekből nyerhető fenol származékok.

5.5 Az antioxidáns hatások in vitro vizsgálata Mivel számos betegség jár együtt a ROM-ok szintjének emelkedésével, valamint a gyógyulás jelentősen előremozdítható ezek eliminálásával, napjainkban igen intenzív kutatások folynak újabb és újabb, egyre hatásosabb antioxidánsok után. Ahhoz viszont, hogy egy anyag antioxidáns hatását megbecsüljük, definiálnunk kell a vizsgálandó hatóanyag hatásosságának mértékét. Ebben az esetben az in vivo módszerek alkalmazása igen nehézkes. Egyrészt a biológiai rendszerek nagy tehetetlensége miatt, másrészt a szervezetben önállóan is végbemennek olyan gyógyulási folyamatok, amelyek a szabad gyökök számát csökkentik, végül pedig a gyógyulási késség egyénenként is változik. Emiatt az antioxidánsok hatását különböző, a biológiai folyamatokat jól modellező kémia modellek segítségével célszerű mérni. A modellben az összehasonlíthatóság kedvéért egy, az adott gyökre specifikus ismert endogén vagy exogén antioxidáns hatását is mérik. Az ismert antioxidánsok esetében kapott mérőszám ismeretében jellemzik a vizsgált anyagokat. A következőkben a fent említett ROMokra kifejlesztett és a későbbiekben általam is használt modellrendszereket ismertetem. A ˙O2- gyökanion in vitro modellben, hasonlóan a már ismertetett elektrontranszport lánc mechanizmusához, a vízben oldott O2 és a fenazin metoszulfát–NADH rendszer kölcsönhatásából keletkezik. A vizsgálandó anyag ˙O2- gyökanion fogó hatása, a nitrobluetetrazolium (NBT)-˙O2- gyökanion reakciójából származó színanyag, az 560 nm-en elnyelést mutató formazán segítségével mérhető.

Egy anyag antioxidáns hatása a jelenlétében és

elhagyása esetén kapott abszorbancia értékek hányadosával jellemezhető (27. ábra). A vizsgálathoz referenciaként a mannit hatását szokás figyelembevenni [134].

40

(R1) N

+

+

N

CH3

pH=7.4

NADH

.

O2

N N

CH3SO4-

+

N

(R2)

N

O +

N

O

(R3)

Fenazin metoszulfát Teszt vegyület

O

NBT

O (R3)

O +

R1

R3 " R3

λ = 560 nm

N

N

N

N

N

+

N

N

O

(R2)

N R2

"

N

+

(R1)

R2

N

N

N

N

R1 Formazán

27. ábra In vitro modell ˙O2- gyökanionnal szemben mutatott antioxidáns hatás vizsgálatára

A ˙OH gyök kémiai modellrendszerben a Fenton-reakció (H2O2 – Fe(II) rendszer) segítségével állítható elő. Biológiai rendszerben a DNS dezoxiribóz része és a ˙OH gyök között végmenő reakció malondialdehid keletkezésével jár. In vitro rendszerben is kihasználható ez az átalakulás. A keletkező malondialdehid (MDA) a tiobarbitursavval (TBS), jellegzetes, 535 nm-en elnyelést mutató kromogént eredményez. A mérendő anyag ˙OH gyökfogó hatása, a dezoxiribóz gyök-indukálta bomlásának gátlásán keresztül jellemezhető (28. ábra). A vizsgálathoz referenciaként az nordihidroguaiaretin sav (NDGA) hatását szokás figyelembevenni [135].

Fe

2+

+

H2O2

Fe

HO

3+

+ HO +

Fenton reakció

OH

O OH

CHO

HH

CH2 MDA

H H OH H

CHO

Dezoxiribóz

N

HS TBS

OH

N

Teszt vegyület OH N

S

OH HO

SH

N N

N

λ = 535 nm

OH

OH

28. ábra In vitro modell ˙OH gyökkel szemben mutatott antioxidáns hatás vizsgálatára

Mivel egyes biomolekulákból, főként endogén zsírsavak és ROM-ok hatására sokféle peroxil típusú gyök keletkezik, az in vitro rendszerekben a teljes peroxil gyökfogó 41

(TRAP=total peroxyl radical trapping antioxidant parameter) képességet célszerű megadni. Ennek modellezésére jó lehetőséget nyújt az 2,2’-azino-bisz(2-aminopropán) (AAPH). Az AAPH 37 oC-on lineáris kinetika szerint bomlik a megfelelő alkil gyökké, ami a vizes közegben oldott O2-nel alkil peroxil gyököt képez. A kapott gyök ezután a rendszerben található 2,2’-azino-bisz(3-etilbenztiazolin-6-szulfonsav)-t (ABTS) egy-elektronos oxidáció révén 417 nm-en elnyelést adó gyökkationná alakítja. Az antioxidáns hatás ebben az esetben az ABTS-ból képződő gyökkation megjelenésének csökkenésével jellemezhető (29. ábra). A vizsgálathoz referenciaként a glutation (GSH) hatását szokás figyelembevenni [135,136a,b]. -o3s CH3

+

H2N

NH2 CH3

so3-

N N

CH3

N N

S

S

Et

Et

CH3 NH2

ABTS

AAPH N2

A N N A

N

N

+

NH2

+

. 2A

O2

. AO2

Teszt vegyület

-o3s

S

S

λ = 417 nm

+

so3-

N N N

N

Et

Et

29. ábra In vitro modell TRAP meghatározására

A ONOO- -et kémiai rendszerben a NO2- és a H2O2 savas közegben történő pillanatszerű reakciójával állítják elő. Mivel a ONOO- szobahőmérsékleten és savas közegben igen bomlékony, a reakciót jeges hűtés és a sósav hozzáadása után pillanatszerű semlegesítés mellett végzik. A ONOO- az in vitro rendszerben található 542 nm-en elnyelést adó pirogallol-vörös kromogént degradálja, ezért a ONOO- -tel szembeni antioxidáns hatást a pirogallol-vörös degradációjának gátlásán keresztül lehet megadni (30. ábra). A vizsgálathoz referenciaként itt is a GSH (glutation) használható [137a,b]. -

NO2

+

+

H

ONOH + H2O2

OH ONOO

-

peroxinitrit

SO3H

Teszt vegyület HO

O OH

O OH

Pirogallol-vörös

λ = 542 nm

Intenzitás változás

30. ábra In vitro modell ONOO- -tel szemben mutatott antioxidáns hatás vizsgálatára

42

6. Célkitűzések A biológiai oxidáció kémiai modellezésére irányuló munkám két részből áll. Az első részben a hem-fehérje család két tagjának a citokróm P450 és a NOS folyamatait szintetikus metalloporfirin modellrendszerek segítségével vizsgáltuk. Munkánk első lépésében a növényvédőszerekkel szembeni rezisztencia kialakulásában fontos szerepet játszó citokróm P450 által katalizált folyamatokat kívántuk modellezni. A modellrendszer beállításához a karbamát inszekticidek családját választottuk. Vizsgálataink segítségével a következő kérdésekre kerestünk választ: (i) képes-e a kémiai modell utánozni a karbamát inszekticideknek citokróm P450 által katalizált oxidatív metabolizmusát; (ii) lehetőségünk van-e a modell segítségével meghatározni a molekulák metabolikusan érzékeny csoportjait; (iii) képes-e modellrendszerünk reprodukálni az in vivo kísérletek által szolgálatott metabolitprofilt? Az általunk kifejlesztett kémiai modell felhasználásával ezután a CHINOIN Növényvédőszer Üzletág kutatói által kifejlesztett rovarszelektív citokróm P450 inhibitorokat vizsgáltuk. Célunk az inhibitorok és a citokróm P450 között kialakuló kölcsönhatás és az esetleges biomimetikus átalakulások mechanizmusának megismerése volt. A következőkben a szintén hem-fehérje NOS által katalizált NO szintézist vizsgáltuk arginin, N-hidroxi-arginin és ezek szerkezeti analógjainak segítségével. Vizsgálatunk célja, a NO szintézis mechanizmusának pontosabb megértése, illetve olyan modellrendszer kifejlesztése volt, ami képes lehet előre jelezni egy hatóanyag NO donor sajátságát. Munkám második felében a Richter Gedeon Rt. originális hatóanyaga, a cink-hyaluronát, valamint a hyaluronsav egyéb fémkationokkal (Na+, Co2+, Cu2+, Mn2+) képzett asszociátumai és a patológiás szempontból legfontosabb ROM-ok közötti kölcsönhatást vizsgáltam. Vizsgálataim a következő problémakörök megválaszolására irányultak: (i) a HA önálló antioxidáns hatásának bemutatása; (ii) az ROM-ok HA-ra gyakorolt degradációs és a HA önálló antioxidáns hatása közötti összefüggés feltárása; (iii) a fémkation szerepének bemutatása a HA asszociátum antioxidáns hatásában és lehetséges védő hatásának bemutatása ROM-okkal szembeni degradációs folyamatokban.

43

7. Eredmények 7.1 Kémiai modell kifejlesztése karbamát inszekticidek CP450 által katalizált oxidatív metabolizmusának vizsgálatára [68*] Növényvédőszerek citokróm P450 által katalizált metabolizmusának biomimetikus modellezéséhez a karbamát inszekticidek családját választottuk. A karbamát inszekticidek növényekben, rovarokban és emlősökben végbemenő oxidatív metabolizmusát Kuhr és Dorough munkájának felhasználásával ismertük meg [138]. Az általunk választott és kereskedelmi szempontból is legfontosabb inszekticideket 31. ábrán láthatjuk. 4

4

3a

5 6 7

3

O1

7a

O

NH

CH3

2

7

CH3

1

O

CH3

H3C

6

H3C

5

N

H3C

CH3 N N3

O

NH

CH3

CH3

O Karbaril (2)

O Karbofurán (1)

1

5

N

CH3 CH3

H3C

CH3 N

O

NH

CH3 O Mexakarbát (16)

CH3

O Pirimikarb (3)

CH3

CH3 O

O

CH3 O N CH3 O S N O CH O(CH2)3CH3

CH3 N CH3

O O

S[(CH2)3CH3]2

3

Karboszulfán

Furotiokarb

31. ábra A biomimetikus modell kifejlesztéséhez felhasznált karbamát inszekticidek

A karbofurán (1) metabolitjait a Metcalf és munkatársai által végzett, radioaktív jelzésen alapuló in vivo vizsgálatok alapján térképeztük fel. Ez alapján a karbofurán oxidatív metabolitjai a 3-hidroxi-karbofurán (9), N-hidroximetil-karbofurán (6) és a 3-oxo származék 44

(7) [139]. Ezen felül a karbofurán (1) a tápcsatornában hidrolitikus folyamatok révén a 7hidroxi (4), 3,7-dihidroxi (8) és 3-oxo-7-hidroxi (10) származékokká alakul (32. ábra).

CH3 O

O H N

CH3 CH3

O Karbofurán (1)

OH CH3 CH3

O

CH3

CH3

OH

O

7-OH (4)

O H N

CH3 O CH3

O 3-OH (9)

OH CH3 O

O H N

O H N

CH3 O

OH 3-OH, 7-OH (8)

CH3

C OH H2 O N-CH2-OH (6)

O

O

CH3

CH3

CH3

O

CH3

OH

CH3

3-oxo, 7-OH (10)

O 3-oxo (7)

32. ábra A karbofurán (1) CP450 által katalizált oxidatív metabolizmusa (1→6,9; 9→7) és a

tápcsatornában végbemenő hidrolitikus folyamatok (1→4; 9→8; 7→10) A karbaril (2) oxidatív metabolitjai Dorough és Casida, valamint Knaak munkái alapján az N-hidroximetil-karbamát (14) és a karbaril aromás gyűrűn hidroxilezett származékai (33. ábra) [140a,b]. (OH)n

+ H N

O O 2

CH3

H N

O O

14

C OH H2

H N

O

CH3

O n=1,2

33. ábra A karbaril (2) CP450 által katalizált oxidatív metabolizmusa

45

A pirimikarb (3) oxidatív metabolizmusa során a dimetilamino csoport demetileződését (15),

valamint

a

C6-szénatomon

található

metil-csoporton

végbemenő

oxidatív

átalakulásoknak megfelelő metabolit (17) megjelenését tapasztalták (34. ábra) [141]. CH3 H3C

N

N

3

N

H3C O

H

+

CH3 N

CH3

OH

CH3

O 15

H 2C

N

N N

H3C O

CH3 CH3

N

CH3

O 17

34. ábra A pirimikarb (3) CP450 által katalizált oxidatív metabolizmusa

Munkánkat a karbofurán (1) vizsgálatával kezdtük. Első lépésként szintetikus úton előállítottuk a 32. ábrán ismertetett metabolitokat. A szintetikus metabolitokat a kémiai modellreakciókban kapott termékek HPLC-s azonosítására, standardként használtuk.

7.1.1 A karbofurán metabolitjainak szintézise Az első, karbofurán-metabolitok szintézisére irányuló munka Balba és munkatársai nevéhez fűződik [142]. Az általunk kialakított szintézisutat a 35. ábrán mutatom be. A karbofuránból (1) kiindulva alkoholos KOH segítségével hidrolitikus reakcióban kaptuk 4-et, majd ezt benziloxi-izocianáttal reagáltatva jutottunk 5-höz. A benziloxi védőcsoport eltávolítását kétféle módon végeztük el. A 10%-os Pd/C katalizátorral végzett hidrogénezés következtében csak N–CH2 kötéshasadás ment végbe és a megfelelő 13 molekulát kaptuk. Az O–CH2 kötés hasításából származó 6 terméket trimetilszilil-jodid (Me3SiI) alkalmazásával nyertük [143]. A 8, 9, 10 és 12 metabolitokat 3-oxo-karbofuránból (7) állítottuk elő, amelyet a karbofurán (1)

CrO3-al végzett regioszelektív oxidációjával kaptunk. A 3-oxo-7-hidroxi (10) metabolitot 7 hidrolízisével kaptuk a megfelelő benziloxi származékon (11) keresztül, melyet Me3SiI segítségével 12-vé alakítottunk. A fő metabolitot, a 3-hidroxi-karbofuránt (9) először Metcalf [144] munkája alapján, ecetsav segítségével 3-acetoxi-karbofuránon keresztül kívántuk előállítani, de a reakció csak nyomokban szolgáltatta a várt terméket. Ezért (9)-et 3-oxokarbofuránon (7) keresztül, a karbonil-csoport nátrium-cianoborohidrid (NaBH3CN), segítségével savas körülmények között végzett redukciójával állítottuk elő. A 3,7-dihidroxi46

karbofuránt (8) (7) nátrium-borohidriddel végzett redukciójával kaptuk a szimultán folyamatban végbemenő karbamát oldallánc hidrolízisének köszönhetően. CH2-O-CH2-N=C=O

BOIC

CH3 O O

NH O

CH3

CH3 OCH2Ph

O OH

Me3SiI

KOH/EtOH

CH3

CH3 O

NH2 O

O

CH3

O

NH O

13

CH3 O

CH3 OH

O

6

CH3 OH

CH3 O O

10

NH

O NH O

OH

NaBH4

CH3 O OH

OH

O

Me3SiI

CH3

CH3 O

CH3 OCH2Ph

O

NH O

11

12

CH3 OH

CH3

8

Raney-Ni, H2 v. NaBH3CN

7

BOIC

O

CH3 1

CH3 CH3

O

CH3

CH3

O KOH/EtOH

CH3

O

NH O

CrO3

O

O

4

5

Pd/C, H2

O

CH3

O O

NH O

CH3 CH3

9

35. ábra A karbofurán (1) metabolitjainak szintézise

A kapott metabolitokat 1H- és

13

C-NMR spektroszkópia segítségével azonosítottuk és

elvégeztük mindegyik vegyület HPLC vizsgálatát is. A kapott HPLC-s retenciós időket kívántuk felhasználni a karbofurán biomimetikus oxidációjából származó termékek azonosítására. Ezt követően előállítottuk a citokróm P450 folyamatokat modellező, biomimetikus hatással rendelkező metalloporfirint.

47

7.1.2 A biomimetikus katalizátor előállítása Az irodalmi részben leírtak alapján a citokróm P450 által katalizált oxidatív metabolikus folyamatok modellezésére az egyik legalkalmasabb porfirin származéknak a Dolphin és munkatársai által is ajánlott mezo-tetrakisz(2,6-diklórfenil) vas(III) porfirin (FeTPPCl8) mutatkozott. Ennek megfelelően elsőként ezt a katalizátort állítottuk elő, amit az 4.2 részben leírt, Dolphin és Gonsalez által módosított szintézisút alapján végeztük (36. ábra) [145a,b]. Első lépésben a 2,6-diklór-benzaldehidet pirrollal és cink-acetáttal, 2,6-lutidinben reagáltattuk, így a mezo-tetrakisz(2,6-diklórfenil) cinkporfirint (ZnTPPCl8) kaptuk. A következő lépésben a kapott cink-komplexet trifluor-ecetsav segítségével a megfelelő szabad porfirin bázissá (H2TPPCl8) alakítottuk. A szükséges vas-komplexet (FeTPPCl8), a H2TPPCl8 FeCl2-dal végzett reakciójából kaptuk. A termékeket a porfirin származékok karakterisztikus UV spektruma segítségével azonosítottuk.

Cl Cl

O

Cl

Cl

N

(CH3COO)2Zn

H

+ N H

N Zn

2,6-lutidin, Na2SO4

Cl

Cl

N

N

Cl

Cl Cl

Cl

ZnTPPCl8 CF3COOH

Cl

Cl

Cl

N

Fe +3

N

Cl

N

DMF

N

N HN

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

NH

FeCl2 . 4 H2O

N

Cl Cl

Cl

Cl

Cl

CH2Cl2, DDQ

H2TPPCL8

FeTPPCl8

36. ábra A FeTPPCl8 porfirin előállítása

48

7.1.3 Karbamát inszekticidek metabolizmusának biomimetikus modellezése Mint azt már korábban is említettem, a porfirinek aktív oxo-fém(IV) intermedierjét számos oxidálóágens, így alkil-peroxidok, persavak, aromás jodozil származékok és szervetlen oxidálószerek (nátrium-hipoklorit, hidrogén-peroxid) segítségével állíthatjuk elő. Az alkil-peroxidok hatására végbemenő oxidációs folyamatokat vizsgálva MacFaul rámutatott arra, hogy a reakcióban képződő RO˙ (alkoxi gyök) erősebben képes oxidálni a vizsgált szubsztrátot, mint az aktív állapotú oxo-metalloporfirin [146]. Ezért az alkil-peroxidok alkalmatlanok az oxidatív metabolikus folyamatok modellezésére. Figyelembe véve, hogy a nagy oxidációs készségű aromás jodozil vegyületek esetleg könnyebben oxidálják a karbamátokat mint a katalizátor, ezek alkalmazását is elvetettük. Ezen megfontolások alapján a karbofurán (1), a karbaril (2), valamint a pirimikarb (3) biomimetikus oxidációját az általunk előállított FeTPPCl8 katalizátorral és három különböző oxidálószer: m-klórperbenzoesav (m-CPBA), NaOCl és H2O2 segítségével végeztük. Vakpróbaként a karbamátok oxidációját katalizátor nélkül is elvégeztük. A karbofuránnal (1) végzett modellreakciókat HPLC-vel követtük. A képződő metabolitokat a szintetikusan előállított karbofurán metabolitok, mint belső standardok segítségével azonosítottuk. A karbaril (2) és pirimikarb (3) esetében a reakcióelegy komponenseit HPLC/MS segítségével azonosítottuk. A pirimikarb (3) esetén kapott metabolitok pontos azonosításához 1H- és

13

C-NMR spektroszkópiás vizsgálatra is szükség

volt. Minden egyes oxidációt 3-4 alkalommal megismételtünk. A kapott értékeket átlagoltuk és ezt hasonlítottuk össze az in vivo adatokkal. A többször megismételt reakciók eredményei között az eltérés ± 0,5 %-on belül volt. A metabolit eloszlásokat a katalizátorral és katalizátor nélkül végzett reakcióban kapott metabolit mennyiségek különbsége alapján határoztuk meg.

7.1.3.1 A karbofurán (1) biomimetikus oxidációja A karbofuránon (1) kívül a kereskedelmi szempontból szintén fontos furatiokarb és a karboszulfán is a kiválasztott szubsztrátok között voltak. Ezek metabolizmusuk során karbofuránná alakulnak [141], így a karbofuránnal (1) végzett vizsgálat szükségtelenné tette ezek tanulmányozását.

49

Összehasonlítva a karbofurán (1) biomimetikus reakciókban kapott metabolitprofilját a házilégyen (Musca domestica) végzett vizsgálatok eredményével megállapítható, hogy a klórozott porfirinszármazék jelenlétében végzett oxidáció során a hidrolízisre érzékeny karbamát oldallánc az enzimatikus folyamatokkal ellentétben minden esetben lehasadt. Ez a mellékreakció a m-CPBA és H2O2 jelenlétében végzett reakciókra kevésbé volt jellemző. A NaOCl esetén tapasztalt fokozott mellékreakció feltehetőleg az oxidálószer alkalikus tulajdonságának köszönhető. Aromás hidroxilezett termékek megjelenését nem tapasztaltuk. A 3-as helyzetű oxidáció a kémiai rendszerben nem állt meg alkohol szinten, hanem minden esetben izoláltuk a megfelelő 3-oxo metabolitot (7) is. A karbofurán (1) 3-as helyzetű szenén és a karbamát oldallánc oxidációjának hatására 12 vegyülethez jutottunk. Emellett a karbofurán (1) 3-as helyzetű szenén végbemenő oxidációt követő, a karbamát oldallánc hidrolízisének köszönhető 8-as vegyületet is sikerült azonosítani. 4. táblázat A karbofurán biomimetikus oxidációja során kapott eredmények. FeTPPCl8

FeTPPF20

Musca domestica

Rt

Metabolitok

NaOCl

m-CPBA

H2O2

m-CPBA

H2O2

in vivo

3.1

3-OH,N–CH2OH (6)

35,7%

1,2%

-

-

9,7%

5,4%

3.4

3-OH,7-OH (8)

12,9%

9,1%

18,3%

-

-

-

3.7

3-OH (9)

14,8%

6,2%

14,0%

0,5%

23,7%

22,1%

4.6

3-oxo,7-OH (10)

-

15,7%

6,8%

0,2%

-

-

5.5

3-oxo (7)

-

-

-

-

4,6%

3,4%

6.8

3-oxo,N–CH2OH(12)

3,7%

-

-

34,1%

2,2%

-

7.8

Karbofurán (1)

-

67,0%

54,7%

64,0%

52,8%

42,3%

Ennek tükrében olyan porfirinszármazékot kellett keresnünk, amely alkalmasabb a karbamátok metabolikus folyamatainak modellezésére. Irodalmi adatok alapján a 90-es évek második felében leírt új, fluorozott metalloporfirineket választottuk, amelyek egyes biomimetikus reakciókban igen szelektív katalitikus hatás mutattak [147]. Ennek megfelelően a karbofurán biomimetikus reakcióját, a Sigma-Aldrich cégtől beszerezhető, mezotetrakisz(pentafluoro) vas(III)porfirin [FeTPPF20] segítségével is elvégeztük. A reakciót az előzőekkel teljesen egyező módon végeztük. A kapott eredményeket a FeTPPCl8 katalizátor alkalmazásával nyert eredményekkel együtt a 4. táblázatban foglaltam össze. A NaOCl-ot, a

50

tapasztalt mellékreakciók miatt a továbbiakban nem használtuk. Abban az esetben, amikor a m-CPBA volt az oxidálószer, a fő metabolit 12 volt, emellett nyomokban 9 és 10 is keletkezett. H2O2 alkalmazása esetén viszont jó egyezést tapasztaltunk az in vivo vizsgálatokban kapott metaboliteloszlással. Ez feltehetőleg annak köszönhető, hogy biológiai rendszerekben a citokróm P450 is képes oxidáló ágensként H2O2-ot felhasználni. Ebben az esetben az irodalmi részben ismertetett peroxid sönt mechanizmussal megy végbe az oxidatív átalakulás. A FeTPPF20 és FeTPPCl8 katalizátorok alkalmazásakor tapasztalható különbséget a FeTPPF20 katalizátor oxidatív degradációval szemben mutatott nagyobb ellenállása és így a katalitikus hatás jobb kifejeződése okozhatja. A fentiekben leírt tapasztalataink alapján a karbaril (2) és a pirimikarb (3) biomimetikus oxidációját már csak FeTPPF20 katalizátor jelenlétében vizsgáltuk. Oxidáló ágensként a m-CPBA-at és a H2O2-ot alkalmaztuk.

7.1.3.2 A karbaril (2) biomimetikus oxidációja A karbaril (2) FeTPPF20/H2O2 rendszerben végezett biomimetikus reakciójában csak nyomokban keletkeztek oxidációs termékek, míg a m-CPBA alkalmazása esetén fokozott oxidatív átalakulást tapasztaltunk. A reakciókban képződő metabolitok gyors azonosítására vékonyréteg-kromatográfiát (VRK) alkalmaztunk (eluens: dietil-éter/hexán 4:1). Standardként csak a főmetabolitként ismert, N-hidroxi karbamát (14) állt rendelkezésünkre. A VRK alapján, a legnagyobb mennyiségben jelenlevő karbaril (2) mellett, csak N-hidroxi karbamátot (14) találtunk. A reakcióban keletkező 14 és a nyomnyi mennyiségű, gyűrűben hidroxilezett metabolitokat (33. ábra) HLPC/MS vizsgálattal azonosítottuk. Összehasonlítva az in vivo és a biomimetikus oxidációval kapott metabolitok eloszlását, azt találtuk, hogy a biomimetikus reakciókban, az in vivo eredményekkel ellentétben, csak nyomokban keletkeznek gyűrűben hidroxilezett metabolitok (4-hidroxi, 5-hidroxi, 5,6dihidroxi). Irodalmi tapasztalatok [148] és saját vizsgálataink [69*] alapján csak aktivált aromás vegyületek esetében történik aromás hidroxilálás. Meg kell állapítanunk, hogy a karbarilhoz (2) hasonló csökkent aktivitású aromás vegyületek oxidatív átalakulásainak modellezésére az általunk felállított rendszer csak bizonyos határok között alkalmas.

51

7.1.3.3 A pirimikarb (3) biomimetikus oxidációja A biomimetikus átalakításokat ebben az esetben is FeTPPF20 katalizátorral, H2O2 és mCPBA oxidálószerek jelenlétében végeztük. A kapott oxidatív metabolitok eloszlását az 5. táblázatban foglaltuk össze. Az oxidatív metabolitok kimutatására a korszerű, nyomnyi mennyiségek kimutatatására alkalmas, HPLC/ „electrospray” MS technikát alkalmaztuk. 5. táblázat A pirimikarb (3) biomimetikus oxidációja során kapott termékek

M+1 (MS) Metabolitok

Oxidálószer m-CPBA

H2O2

253

(18)

47,5%

23,8%

255

(21)

4,9%

-

255

(20)

13,9%

-

241

(19)

13,0%

-

225

(15)

20,7%

-

271

1,3-N-oxid

-

9,1%

239

(3)

-

67,1%

A FeTPPF20/ H2O2 rendszerben végzett reakció során a termékben a fő komponens a megfelelő N-formil származék (18) volt (37. ábra). Habár a pirimikarb (3) oxidatív metabolitaként in vivo körülmények között még nem mutatták ki 18-at, a hasonló szerkezetű mexakarbát (16) (30. ábra) oxidatív metabolizmusánál ilyen termék azonosítható volt (Benezet és Matsumura, 1974) [149]. Ebben az esetben a mexakarbát (16) oxidatív metabolizmusa során keletkező N-demetilezett analóg képződése a megfelelő N-formil intermedieren keresztül megy végbe. Az általunk izolált N-formil metabolit azt sugallja, hogy a pirimikarb (3) in vivo metabolizmusa során a dimetil-amino csoporton végbemenő demetilezés is ezen a mechanizmuson keresztül mehet végbe. A FeTPPF20/m-CPBA rendszerben végzett biomimetikus reakció esetén a reakcióelegyből az előzőekben megismert N-formil (18) származék mellett az N-demetilezett (15) származékot is sikerült izolálni és 1H-, valamint 13C-NMR spektroszkópiával azonosítani.

52

CH3 H3C

N

N

3

N

H3C O

O

H

N

H3C O

CH3

N O

15 O

H3C

+

N

N

H3C

CH3 N

CH3 N CH3

N N

H3C

O

CH3

O

CH3 N

O

H3C

+

CH3

N

H3C O

CH3

CH3 N CH3 N

O

N

O CH3

O 21

CH3 N

O

N

H3C

20

N

18

+

CH3

H3C

CHO

CH3 N H

19

O

CH3 N CH3

N

H3C

+

CH3

N

H3C O

CH3

N

O CH3 CH3

O 1,3 N-oxid

37. ábra A pirimikarb (3) biomimetikus oxidatív átalakulásai

Az eredmények alapján megállapíthatjuk, hogy bár a pirimikarb (3) in vivo vizsgálatai során csak az N-demetilezett (15) származékot sikerült kimutatni, (3) N-demetileződése feltehetőleg az (18) N-formil intermedieren keresztül megy végbe. Ezt támasztja alá a pirimikarb (3) és a mexakarbát (16) szerkezetének, valamint in vivo metabolikus folyamatainak összevetése is. Látható, hogy a pirimikarb (3) metabolikusan legérzékenyebb pontja a dimetil-amino csoport. Ezzel szemben a mexakarbát (16) molekulán a dimetil-amino csoporton kívül a karbamát oldallánc nitrogénjéhez kapcsolódó metilcsoport is alternatív támadási pontként szolgálhat az oxidatív metabolikus folyamatokban. Ezek alapján feltételezhető, hogy a pirimikarb (3) dimetil-amino csoportján olyan gyorsan megy végbe Ndemetileződés az in vivo folyamatban, hogy emiatt nem sikerült kimutatni (18) N-formil származékot. A biomimetikus reakció során, a fentiek mellett, a pirimikarb (3) megfelelő N-oxidjait 19, 20 és 21 is sikerült kimutatni. Ez az átalakulás sokkal jobb hatásfokkal ment végbe abban az

esetben, amikor oxidálószerként m-CPBA-at alkalmaztunk, ilyenkor 20 mellett a megfelelő N-demetilezett N-oxidot 21 is sikerült izolálni. Figyelembe véve, hogy a m-CPBA jól használható heterociklusos vegyületek N-oxidációs folyamataiban [150], a kapott eredmény nem meglepő, jóllehet 1,3-N-oxidokat ilyen fenti körülmények között nem sikerült kimutatni. Habár a H2O2 nem alkalmas heterociklusos vegyületek N-oxidációjára, a FeTPPF20/H2O2 rendszerben végzett biomimetikus reakcióban jelentős mennyiségű 1,3-N-oxid származék 53

keletkezett. Ez az eredmény arra utal, hogy az általunk alkalmazott biomimetikus oxidáció általánosan alkalmazható eljárás lehet 1,3-N-oxidok előállítására.

7.2 Alkinil-benzil-éter típusú rovarszelektív citokróm P450 inhibitorok vizsgálata [69*] A Chinoin Rt. Növényvédőszer Üzletágának egyik legfontosabb kutatási iránya a rovarszelektív CP450 inhibitorok kifejlesztése volt. Kutatásaik eredményeképpen sikerült két, in vivo vizsgálatokkal is alátámasztott, szelektív és jó hatékonyságú vegyületet kifejleszteniük. Ezek a verbutin (22) és perbutin (23) (38. ábra) fantázianevű alkinil-benziléter típusú vegyületek [151]. E kutatásba bekapcsolódva a két inhibitor és az előző részben ismertetett kémiai modellrendszer kölcsönhatását vizsgáltuk és az eredmények alapján kíséreltünk meg javaslatot tenni az inhibitorok és a citokróm P450 enzim között kialakuló kölcsönhatás(ok) mechanizmusára. CH3 CH3O

O C H2

O

CH3

O

CH3O

O C H2

CH3

Perbutin (23)

Verbutin (22)

38. ábra A CHINOIN által kifejlesztett rovarszelektív CP450 inhibitorok szerkezete

7.2.1 A verbutin (22) és a perbutin (23) biomimetikus oxidációja A modellreakciókat a karbamát inszekticideknél kifejlesztett FeTPPF20/H2O2 rendszerben végeztük. A verbutinnal (22) végzett biomimetikus oxidáció során keletkezett termékeket először gázkromatográfia (GC) segítségével analizáltuk. A reakcióelegyből két ismert degradációs terméket, az acetoveratrolt (24) és a butinolt (25) (39. ábra) sikerült kimutatni. Ezek megjelenése összhangban a Baciocchi és Belvedere megfigyelésével, akik FeTPPF20/jodozilbenzol biomimetikus rendszer alkalmazásakor az α−alkilbenzil alkoholok esetén szintén a benzil helyzetű szénatomon végbemenő oxidációt figyelték meg [152]. A biomimetikus reakcióban keletkeztek olyan, GC segítségével nem azonosítható termékek is, amelyek eltértek a benzil helyzetű szénatomon végbemenő folymatoktól. Ezeket 54

1

a termékeket preparatív VRK segítségével elválasztottuk, majd

H- és

13

C-NMR

spektroszkópiával azonosítottuk. A spektrális adatok alapján az aromás gyűrűn végbemenő oxidáció eredményeként keletkező metoxikinont (26) és ennek acetálját (27) (40. ábra) sikerült kimutatnunk. Ez összhangban van Mansuy és munkatársai megfigyeléseivel, akik metalloporfirin katalizátorok alkalmazásával magnézium-peroxoftalát jelenlétében 1,2-dimetoxi-benzol

analógokat

reagáltattak

és kizárólag

kinonszármazékok

keletkezését

tapasztalták [153]. Hasonló körülmények között, a perbutinnal (23) is elvégeztük a biomimetikus oxidációt. A reakcióelegy GC-vel történő vizsgálata során itt is megkaptuk a benzil helyzetű szénatomon végbemenő folyamatoknak megfelelő piperonált (28) és a butinolt (25). NMR spektroszkópiai vizsgálatokkal ebben az esetben is sikerült azonosítani az aromás gyűrűn végbemenő oxidatív átalakulásból származó terméket, a megfelelő kinon-acetált (29). A kapott eredményeket a következőképpen értelmeztük. A 39. ábrán az általunk, valamint Baciocchi és Belvedere által is tapasztalt [152], a benzil helyzetű szénatomon végbemenő átalakulásoknak megfelelő reakciómechanizmust láthatjuk. A reakció mechanizmusa megfelel az elméleti részben (4.3.2) bemutatott „oxygen rebound” folyamatnak. A reakcióban keletkező instabil hemiacetál, ezt követően gyors hidrolitikus folyamatban, a megfelelő karbonil származékokká (24,28) alakul. Ez az oxidatív folyamat egy oxigénatom átadással járó oxidáció, ami megfelel a citokróm P450 által katalizált hidroxilációnak és összhangban van a Baciocchi és Belvedere által tapasztalt átalakulásokkal is.

[TPPF20-Fe(IV)=O].+ + Ar

R

1

R TPPF20-Fe(III)-OH + Ar

1

.

O

O

22 Ar = 3,4-dimetoxifenil, R1 = CH3 23 Ar = 3,4-metiléndioxifenil, R1 = H H2O2 R TPPF20-Fe(III)

Ar HO

+

R

1

O

1

+

Ar

O HO 24 Ar = 3,4-dimetoxifenil, R1 = CH3 Butinol (25) 28 Ar = 3,4-metiléndioxifenil, R1 = H

39. ábra A verbutin (22) és a perbutin (23) benzilhelyzetű szenén végbemenő CP450 által

katalizált oxidatív átalakulások mechanizmusa 55

Bár Baciocchi és Belvedere is kimutatott további oxidációs termékeket, ezeket nem sikerült azonosítaniuk és az oxidatív folyamatokat a benzil helyzetben kialkuló hidroxil csoporton végbemenő hidrogén lehasadással magyarázták. Mivel a mi esetünkben a benzil helyzetű OH csoportot az alifás éter oldallánc maszkírozza, ilyen típusú átalakulás esetünkben nem képzelhető el. Az általunk azonosított, aromás gyűrűben végbemenő oxidációból származó termékek kialakulása csak ennél jóval bonyolultabb mechanizmus szerint magyarázható. CH3

CH3 CH3O CH3O R=

O

R

CH3O

P-Fe(IV)=O

22 CH2

O

C

32

CH3

CH3 O O

CH3O

+

O

C

.

CH3O

H2O

CH3O

+ P-Fe(III)-O

OFe(III)-P

CH3

O 34

R

H

CH3O

26

CH3O

CH3

OH

R

CH3

R

.

CH3O

O CH3O

+

R

+

CH3O

O

O

C

33

R

O CH3OH CH3

CH3O

O

CH3O CH3O

O

O

O 23

R

P-Fe(IV)=O

O

+

O

C

R

O

.

O 35

+ P-Fe(III)-O

OH O

O

O 37

O

R

.

H2O

O 27 +

O

C

R

H

O

O

R

OFe(III)-P

+

O

C

O 36

R

O CH3OH

CH3O O

O

O 29

R

O

40. ábra A verbutin (22) és a perbutin (23) aromás gyűrűben végbemenő hidroxileződésének

mechanizmusa

56

Az aromás gyűrűben végmenő oxidatív átalakulások mechanizmusát a következőképpen magyarázzuk (40. ábra) [69*]. A reakció első lépésében - egy oxo-vas(IV) porfirin indukálta folyamat során - az aromás gyűrű 6-os helyzetű szénatomjáról lehasad egy hidrogén atom, ami a megfelelő gyökkation (32) képződéséhez vezet. Ezzel analóg intermediert hasonló folyamatban EPR spektroszkópia segítségével már detektáltak [154]. Ezt követően a 32 gyökkation reagál a ferriloxi porfirinnel, ami a megfelelő kationos intermedier (33) kialakulásához vezet [155]. Az így kapott 33 köztitermék elektrofil centruma képes reakcióba lépni a reakcióelegyben található nukleofilekkel. Abban az esetben, ha a reakcióelegyben levő vízzel lép kölcsönhatásba, akkor első lépésben hemiacetállá (34), majd a metoxi csoport lehasadásával a megfelelő kinonná (26) alakul. A reakció oldószereként használt metanol is képes reakcióba lépni az elektrofil centrummal. Ebben az esetben a megfelelő kinon-acetált (27) kapjuk. A verbutinhoz (22) hasonlóan, a perbutinnál (23) is végbement a fenti folyamat. Így az előzőekhez hasonlóan, az első lépésben megkapjuk a 35 gyökkationt, majd analóg módon megfelelő 36 kationhoz jutunk, amely szintén képes reakcióba lépni a reakcióelegyben levő vízzel és metanollal. A vízzel történő reakció eredményeként megkapjuk a 37 hemiacetált. Ebben az esetben azonban a metiléndioxi csoport miatt a verbutinnál (22) tapasztalt metoxicsoport lehasadása nem következik be, így nem alakul ki a kinonos forma. A metanollal végbemenő reakcióban a verbutinhoz (22) hasonlóan, megkaptuk a megfelelő 29 terméket. Mivel ebben a reakcióban 23-ból nem képződött a megfelelő kinon származék, feltételezhető, hogy a keletkező kinon-acetál is a reakcióelegyben levő nukleofil oldószer támadása révén jöhetett létre. Ebből arra is következtethetünk, hogy az enzimatikus folyamatokban fontos szerepe lehet az aktív hely környezetében levő vízmolekuláknak. Látható az is, hogy oldószer hatására végbemenő biomimetikus átalakulások eltértek a fő metabolitok (24, 25, 28) kialakulásának mechanizmusától. Azonban, mint azt már az irodalmi részben is ismertettem, a CP450 rendszer képes O-demetilezési és aromás oxidációs folyamatok katalizálására. Az aromás oxidációk lehetséges mechanizmusát a 10. ábrán mutatom be [156]. Áttekintve a lehetséges citokróm P450 által katalizált aromás oxidációs folyamatokat (lásd 2.4 rész), megállapítható, hogy az oxigénatom átmenettel járó (ipszo szubsztituciós) folyamatok kizárják az oldószer bevonásával végbemenő metabolikus átalakulások lehetőségét. Ezért az alkalmazott biomimetikus oxidációval kapott eredmény nem értelmezhető a CP450 által katalizált folyamatokkal. Ezzel ellentétben megfelel a táplálkozási lánc lebontási folyamataiért felelős peroxidázok által katalizált átalakulásoknak. A következőkben ismertetem az erre utaló bizonyítékokat. 57

Az összehasonlító elméleti vizsgálathoz a peroxidáz enzimcsalád egy jellemző tagját, a lipid peroxidázt (LiP) választottuk. Megvizsgálva a citokróm P450cam [157] és a LiP [158] háromdimenziós szerkezetét két szembetűnő különbség látható (41. ábra), ami a működési mechanizmusban tapasztalható különbségekre is visszavezethető.

CP450cam

LiP

41. ábra A CP450cam és LiP háromdimenziós szerkezete

Habár mindkét enzim aktív helyén egy protoporfirin IX egység található, az aktív hely elhelyezkedése különbözik. A citokróm P450 esetében az aktív hely az enzim belsejében, míg a LiP esetében az enzim felületén található. Figyelembe véve, hogy a fehérjék nagyobb mértékben szolvatálódnak a felületükön, mint a belsejükben, elmondható, hogy az oldószermolekulák bevonásával végbemenő folyamatok könnyebben elképzelhetők a LiP esetén. Ezen felül, míg a LiP katalitikus folyamata viszonylag nagy hatótávolságú elektrontranszferrel megy végbe, addig a citokróm P450 esetében a hem résszel közvetlen kapcsolatot igénylő oxigénatom-transzfer mechanizmus kedvezményezett [159]. Ez alapján a LiP esetében 3,4dimetoxi-benzil-alkoholnak elég a fehérje felületéhez vagy a felületen található hem közelében kötődni, míg a citokróm P450 esetében közvetlen kölcsönhatásba kell kerülnie a ferriloxi-porfirin résszel. A két enzim oxidatív mechanizmusában a hemhez kapcsolódó axiális ligandumnak is fontos szerepe van [160]. A citokróm P450 esetében cisztein, míg LiP esetében hisztidin az

58

axiális ligandum. A citokróm P450 esetén az általunk vizsgált perbutin (23), hasonlóan a metiléndioxi-fenil inhibitorokhoz [161], a hem vasatomjához való kötődésének következtében az axiális helyzetben levő tiolát elmozdul. Ennek hatására a további metabolikus folyamatok nem tudnak végbemenni. Ezzel ellentétben, ha az inhibitor a LiP hem vasatomjához kötődik, az axiális helyzetű imidazol nem gátolja az enzim katalitikus hatását. Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a két enzimnél az aktív hely eltérő elhelyezkedése és a hem vasatomjához kötődő eltérő tulajdonságú axiális ligandum együttesen eredményezik, hogy a verbutin (22) és a perbutin (23) a citokróm P450 enzimnek szelektív inhibitorai, míg a LiP enzimnek potenciális szubsztrátjai lehetnek. Megfigyelésünket támasztja alá, hogy Panerochaete chrysosporiumból nyert lignin peroxidáz a veratril alkoholt 2-hidroximetil-5metoxi-1,4-benzokinonná alakította [162]. További kinon származékokat sikerült izolálniuk kutatóknak LiP [163], MnP [164] és egyéb agrobaktérium fajokból [165] nyert peroxidázok által katalizált folyamatokban. Mivel a peroxidázok elsősorban a táplálkozási lánc lebontási folyamatában résztvevő növényekben, gombákban és baktériumokban vannak jelen, a kapott eredmény jelentősége, hogy a verbutin (22) és perbutin (23) potenciális peroxidáz szubsztrátként igen könnyen lebomlanak a környezetben és így környezetvédelmi szempontból is kedvezőek lehetnek.

7.3 A citokróm P450 által katalizált NO képződés mechanizmusának vizsgálata [54*] Az irodalmi részben (3.1) leírtaknak megfelelően a NO a szervezetben egy kétlépéses, NOS által katalizált folyamatban keletkezik. Az első lépés, az NHA keletkezése, a citokróm P450 „teljes ciklusának” megfelelő mechanizmus szerint zajlik. Mint korábban is említettem, a következő háromelektronos oxidációs lépés mechanizmusa már kevésbé ismert. Mansuy és munkatársai ugyanakkor megfigyelték, hogy egyes citokróm P450 izoenzimek által katalizált folyamatban NHA-ből és ezzel analóg N-hidroxi vegyületekből kiindulva NO keletkezhet [166a,b]. Ez a folyamat azonban a „teljes ciklus” mechanizmusával nem magyarázható, viszont megfelel a már ismertetett, H2O2 mediált „peroxid sönt” mechanizmusnak. További bizonyíték erre, hogy iNOS esetében a NADH helyett H2O2-ot alkalmazva, az NHA NO-dá és citrullinná alakult [167]. Ennek tükrében az általunk kifejlesztett és már sikerrel alkalmazott, a citokróm P450 „peroxid sönt” mechanizmusát jól modellező FeTPPF20/H2O2 rendszert, a NO bioszintézisének vizsgálatára is felhasználtuk.

59

Vizsgálatainkhoz arginint és NHA-t, valamint ezekkel analóg szubsztrátokat választottunk (42. ábra). Az arginin típusú szubsztrátok közül az imid részletet tartalmazó nikotinamidint (NA), a teljes guanidin struktúrát magában foglaló piperidin-karbimidet (PCI) és arginint (Arg) használtunk. Az NHA típusú vegyületek az előzőek N-hidroxi származékai voltak; Nhidroxi-nikotinamidin (NHNA), piperidin-karbamidoxim (PCAO), és a NO szintézis intermedierjeként ismert NHA. A reakciókat HPLC/MS segítségével követtük, a keletkező NO-ot a spontán bomlásából származó NO2- alapján, Griess-Ilosvay reagens alkalmazásával mutattuk ki. A

NH2

NH2 NH

N

NH

N NA B

PCI OH

OH

NH

NH

NH

N

NH

N PCAO

NHNA

42. ábra (A) Arg típusú és (B) NHA típusú szubsztrátok

Vizsgálatainkban az arginin és arginin analógok (NA, PCI) esetében nem tapasztaltunk átalakulást. Az NHA és NHA analógok vizsgálata során már jelentős átalakulás ment végbe. NHNA modellrendszerünkben, a NOS által katalizált folyamat második lépésének megfelelően, NO keletkezése közben a citrullinnal analóg nikotinsavamiddá (NSA) alakult. A reakcióelegyből kisebb mennyiségben nikotinsavnitrilt (NSN) is izoláltunk (43/a ábra). Hasonló átalakulást tapasztaltunk a természetes szubsztráthoz szerkezetileg közelebb álló piperidinszármazék, a PCAO esetében is. A PCAO NO keletkezése mellett piperidinkarboxamid (PCA) és karbonitril (PCN) közel 1:1 arányú keverékévé alakult (43/b ábra).

60

A NH2

NH2

N OH

O

N

CN

+

NO

+

N

NHNA B

N

NSA (61%)

NH2 N

NSN (39%)

NH2

N OH

N

PCAO

O

+

NO

N

+

CN

PCN (52%)

PCA (48%)

43. ábra NHNA és PCAO biomimetikus oxidációja

Végül az NHA-nal is elvégeztük a biomimetikus oxidációt.

Ebben az esetben is

megkaptuk a természetes átalakulásnak megfelelő citrullint (CIT), ciano-ornitint (CNO) és NO-ot. További érdekes megfigyelésünk, hogy ebben a reakcióban több nitril típusú CNO keletkezett, mint az amidoknak megfelelő CIT keletkezett (44. ábra).

OH N

NH2

O

NH2

CN

NH

NH

NH

+ H2N NHA

COO-

H2N

NO

+

COO-

CIT (37%)

H2N

COO-

CNO (63%)

44. ábra NHA biomimetikus oxidációja

Az iNOS hidrogénperoxid által katalizált átalakulásai [167] a kémiai modell eredményeivel jó egyezést mutatnak (45. ábra). NO ez esetben is csak NHA-ból képződött és a biomimetikus oxidációhoz hasonlóan itt is több CNO keletkezett, mint CIT.

61

70

63

60

55

50 40

45 37

Biomimetikus iNOS

30 20 10 0 CIT

CNO

45. ábra Termékeloszlások az NHA biomimetikus és biológiai oxidációjában

Összefoglalva elmondható, hogy biomimetikus modellrendszerünk új lehetőséget nyújt guanidin származékok biomimetikus oxidációjára, valamint jó modellje lehet az iNOS H2O2 jelenlétében végbemenő NO szintézisének. Ennek köszönhetően lehetővé válik új, pontenciális NO-donor vegyületek azonosítása is. Bár ezt a feladatot iNOS alapú biológiai teszttel is meg lehet oldani, a biomimetikus modellre épülő kémiai környezet jórészt mentes a biológiai rendszerekre jellemző mérési bizonytalanságoktól és kevésbé érzékeny a mérési körülményekre. Ennek következtében a teszt reprodukálhatósága várhatóan meghaladja a hasonló biológiai rendszerét.

7.4 A hem-fehérjék biomimetikus modellezése során kapott eredmények összefoglalása A karbamát inszekticidek vizsgálatai során kapott eredmények alapján, megállapítható, hogy az általunk kifejlesztett FeTPPF20/m-CPBA és FeTPPF20/H2O2 biomimetikus modellrendszer alkalmas a citokróm P450 által katalizált folyamatok modellezésére. Sikerült rámutatnunk mindhárom karbamát inszekticid metabolikusan érzékeny pontjaira, a kapott

62

metabolitprofilok jó egyezést mutattak az in vivo adatokkal. Vizsgálatainkban a karbaril (2) és pirimikarb (3) oxidációs mechanizmusának egyes termékeit is sikerült pontosítanunk. A kifejlesztett modellrendszer a két CHINOIN-ban előállított rovarszelektív CP450 inhibitor, a verbutin (22) és a perbutin (23) vizsgálata esetén is hasznosnak bizonyult. A biomimetikus rendszer alkalmazása révén sikerült megmutatni a két inhibitor citokróm P450 által katalizált folyamatokra érzékeny pontjait. Az inhibitorok a kémiai modellreakciókban olyan alternatív átalakulásokat is elszenvedtek, amelyek csak a peroxidázok (LiP, MnP) által katalizált

folyamatokkal

magyarázhatóak.

Így

sikerült

rámutatni

a

két

inhibitor

alkalmazásának lehetséges környezetvédelmi előnyeire is. A FeTPPF20/H2O2 biomimetikus rendszert a NOS által katalizált NO szintézis modellezésére is sikerrel alkalmaztuk. Eredményeink jó egyezést adtak az iNOS H2O2 jelenlétében végbemenő folyamatával. Az eredmények alapján megállapítható, hogy modellrendszerünk alkalmas lehet guanidin származékok biomimetikus oxidációjára, valamint potenciális NO-donorok azonosítására. A

hem-fehérjék

biomimetikus

modellezése

során

kapott

eredményeket

három

közleményben foglaltuk össze: Chemical Models of Cytochrome P450 Catalysed Insecticide Metabolism. Application to the Oxidative Metabolism of Carbamate Insecticides. (1999) J. Agric. Food. Chem. 47(1-2), 762-769. [68*]; Metalloporphyrin Catalyzed Biomimetic Oxidation of Aryl Benzyl Ethers. Implications of Lignin Peroxidase Catalysis. (1999) Tetrahedron 55, 4457-4466. [69*]; Metalloporphyrin Catalyzed Oxidation of NHydroxyguanidines: A Biomimetic Model for the H2O2-Dependent Activity of Nitric Oxide Synthase. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 1775-1777. [54*].

63

7.5 A különböző fémionokkal képzett hyaluronan asszociátumok antioxidáns viselkedésének vizsgálata [168*] Az 5. fejezetben leírtak alapján látható, hogy a hyaluronan számos, ROM-ok képződésével járó betegséggel hozható kapcsolatba. Az ismeretek jelenlegi szintjén a HA-at elsősorban, mint ROM hatására degradálódó molekulát veszik figyelembe. A vizsgálatok főként a HA fizikai, egyes esetekben kémiai tulajdonságában végbemenő változásai felé irányulnak. A HA ROM-okkal való kölcsönhatásának biológiai szerepéről keveset tudunk. Számos eredmény tanúskodik a HA terápiás hatásáról ROM-ok fokozott megjelenésével járó betegségekben, így vizsgálataink alapján szerettünk volna párhuzamot húzni, a HA ROM indukált degradációja és esetleges antioxidáns hatása között. Mivel a szabad sav meglehetősen bomlékony, vizsgálatainkban a HA önálló hatását a Na-HA asszociátum segítségével modelleztük. Ez azért nem okoz gondot, mert a Na+ jelenlegi ismereteink szerint nem rendelkezik önálló antioxidáns hatással. Emellett a terápiás gyakorlatban alkalmazott, a Richter Gedeon Rt. által kifejlesztett Zn-HA, valamint további, az antioxidáns hatást befolyásolható

Co-,

Cu-,

Mn-HA

asszociátumok

viselkedését

is

megvizsgáltuk.

Kísérleteinkbe az 5.3 részben már kiemelt ROM-okat, a ˙OH gyököt, ˙O2- gyökaniont, RO2˙ öt és ONOO- -et vontuk be. A kísérletekhez szükséges HA asszociátumok előállítása Na-HA-ból történt. A Na-HA-ot a Richter Gedeon Rt.-nél kakastarélyból vonják ki. A különböző HA asszociátumokat NaHA-ot és a megfelelő elleniont ekvivalens mennyiségben tartalmazó oldatból nyertük etanolos kicsapással. Ez Burger és munkatársainak korábbi megfigyelése alapján történt, miszerint a Na+ -t a többi d-elem kationja kiszorítja a HA mellől [103]. Az antioxidáns hatás vizsgálatát az 5.5 részben leírt, in vitro modellrendszerek segítségével végeztük. A HA degradációját méretkizárásos oszlop-kromatográfia segítségével követtük. A különböző HA asszociátumokkal végzett vizsgálatok során kapott antioxidáns hatást és a szerkezetben végbemenő degradációt, az aktuális ROM és a HA tetraszacharid egységének megfelelő anyagmennyiségek arányában fejeztük ki. Ezt az egyszerűsítést (Na+ kivételével), korábbi EXAFS vizsgálatok eredményei alapján tehettük meg, ahol bebizonyították, hogy egy kétértékű kation (pl. Zn2+, Cu2+) a HA két karboxil csoportot tartalmazó tetraszacharid egységével koordinálódik [169]. Ez alapján a HA funkcionálisan még érdekes legkisebb egysége, a tetraszacharid rész. A Na-HA esetében az összehasonlíthatóság miatt szintén a

64

tetraszacharid egységet vettük figyelembe, természetesen ilyenkor két ekvivalens Na+-nal számoltunk. Vizsgálatainkat az eredmények jobb értékelhetősége érdekében, minden esetben háromszor megismételtük. A három független mérésből származó eredményeket kétmintás t–próba segítségével analizáltuk. Az analízis során a különböző HA asszociátumok és a referencia anyagok hatását, valamint az egyes HA asszociátumok esetén tapasztalt hatásokat hasonlítottuk össze. Az analízis statisztikai jellemzői: *: p≤0,05, szignifikáns különbség; **: p≤0,01 és ***: p≤0,001, magasan szignifikáns különbség.

7.5.1 Hidroxil gyökkel (˙OH) szemben mutatott hatás A 46/a ábrán látható, hogy a HA látszólagos molekulatömegének (Mr) változása alapján tapasztalható degradáció szoros korrelációban van a bevitt ˙OH gyök mennyiségével. Habár az egyes HA asszociátumok degradációjában nem volt számottevő különbség, egyenértékű ˙OH/HA tetraszacharid arány mellett csekély (nem szignifikáns) védőhatás mutatkozott a Cués a Mn-HA esetében. Hasonlóan a ˙OH gyökkel szemben mutatott antioxidáns hatás is párhuzamos lefutású volt az alkalmazott ˙OH/HA tetraszacharid tartományban. Itt is a Cu- és Mn-HA mutattak nagyobb hatást (46/b ábra). Összehasonlítva a HA asszociátumok hatását a referenciaként megadott mannittal megállapítható, hogy a mannit a teljes vizsgált kocentráció tartományban szignifikánsan kisebb antioxidáns hatást fejtett ki, mint a HA asszociátumok. B

A 50

90

45 40

80

35 30 25 20 15

70 Gátlás %

Na-HA Zn-HA Co-HA Cu-HA M n-HA

10 5

Na-HA

**

Zn-HA

60

Co-HA

50

++

40

Cu-HA

++

30

+

Mn-HA

20

++

10

0 0.75

1

1.5

0

3

0.75

˙OH/ HA tetraszacharid ( µ mol/ µ mol)

1

1.5

3

˙OH/ HA tetraszacharid, mannit ( µ mol/ µ mol)

46. ábra A HA asszociátumok ˙OH gyökkel szemben mutatott sajátságai

65

Mannit

7.5.2 Szuperoxid gyökanionnal (˙O2-) szemben mutatott hatás Megvizsgálva a HA asszociátumok ˙O2- gyökanion okozta degradációját, a Co-, Mn- és Cu-HA esetében nem tapasztaltunk degradációt a vizsgált ˙O2-/HA tetraszacharid tartományban (47/a ábra). A Zn-HA degradációja is elmaradt a Na-HA-tól. Zn- és Na-HA esetében a ˙OH gyöknél tapasztaltakkal azonos módon a degradáció ˙O2- gyökanion koncentrációfüggést mutatott. A ˙O2- gyökanionnal szembeni antioxidáns hatás vizsgálata esetében a Na-HA nem mutatott hatást, a Zn- és a Co-HA koncentráció függően gátló hatású. A Mn- és Cu-HA maximális hatást fejtett ki a vizsgált modellrendszerben (47/b ábra). A kapott hatásokat a referencia anyaggal (NDGA) összehasonlítva, a Zn- és Co-HA hatása összemérhető, míg a Mn- és Cu-HA szignifikásan nagyobb hatást fejtett ki. A kationok önálló hatásának kiszűrése érdekében, a fémionok klorid sójával is elvégeztük az antioxidáns vizsgálatot (47/c ábra). Ebben az esetben az előző vizsgálattal azonos módon a Zn2+ és Co2+ koncentráció-hatás összefüggést, míg a Mn2+ és Cu2+ maximális hatást mutatott. Az eredményekből az is kitűnik, hogy bár a Na-HA nem hatott, tehát a HA esetében nem tapasztaltunk antioxidáns hatást a ˙O2- gyökanionnal szemben, a Zn- és Co-HA asszociátumok nagyobb hatást mutattak, mint a Zn2+ és Co2+ önmagukban. Vagyis vizsgálatunk a két ellenion és a HA szinergista kölcsönhatását mutatja.

rel. M % (kDa/kDa)

A

100

Na-HA

80

Zn-HA

60

Co-HA

40

Cu-HA

20

Mn-HA

0 0.42

0.75

1.2

3

˙O2- / HA tetraszacharid (µ mol/µ mol)

47. ábra A HA asszociátumok ˙O2-gyökanionnal szemben mutatott sajátságai (folyt.→)

66

B

C **

Gátlás %

80

Zn-HA Co-HA

*

60

Cu-HA Mn-HA

*

40

NDGA

20 0 0.42

0.75

1.2

**

*

**

Gátlás (%)

*

100

3

˙O2- / HA tetraszacharid, NDGA (µ mol/µ mol)

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

***

Zn2+

*

Co2+ Cu2+ Mn2+

0.36

0.63

1.01

2.54

˙O2 /fém kation ( µ m ol/µ m ol) -

47. ábra A HA asszociátumok ˙O2-gyökanionnal szemben mutatott sajátságai

7.5.3 Az 2,2’-azino-bisz(2-aminopropán)-nal (AAPH) szemben mutatott hatás A lipid peroxidációs modellben, a Mn-HA teljes védelmet élvezett, míg a Na-, Zn-, Co-. és Cu-HA-ok fokozott mértékben degradálódtak a növekvő AAPH mennyiség hatására (48/a ábra). Az is megfigyelhető, hogy a Co- és Na-HA jobban ellenállt az AAPH indukált degradációnak, mint a Zn- és Cu-HA. Ezzel analóg módon, a Na-, Zn- és Cu-HA nem mutattak antioxidáns hatást az AAPH-val szemben, míg a Mn-HA maximális hatást fejtett ki. A Co-HA koncentráció-hatás összefüggést mutatott (48/b ábra). A glutation (GSH), mint referencia anyag hatásával azonos értéket ebben az esetben csak a Mn-HA mutatott. Itt is megvizsgáltuk az ellenionok lehetséges önálló hatását (48/c ábra). Hasonlóan a HA asszociátumokkal végzett vizsgálatokhoz csak a Co2+ és a Mn2+ mutatott antioxidáns hatást az AAPH-val szemben. A szabad sók aktivitása nagyságrendileg megegyezett a nekik megfelelő HA asszociátumokéval.

67

A **

rel. M r % (kDa/kDa)

120

**

*

100

**

**

Na-HA Zn-HA

80

Co-HA

60

Cu-HA

40

Mn-HA

20 0 1.3

2.5

7.5

12.5

25.0

50.0

AAP H/ HA tetraszacharid ( µ mol/ µ mol)

B

C

*

***

***

100

100

90

90

80

80

***

***

70

60

Co-HA

50

Gátlás %

Gátlás %

70

***

*

Mn-HA

40

GSH

30 20

60 Co2+

50

Mn2+

40 30

10

ND

0 1.3

2.5

7.5

12.5

25.0

20

ND

10

50.0

ND

0

AAPH/HA tetraszacharid, GSH (µ mol/ µ mol)

1.3

2.5

7.5

12.5

25.0

50.0

AAPH/ fémkation (µ mol/µ mol)

48. ábra A HA asszociátumok AAPH-val szemben mutatott sajátságai

7.5.4 A peroxinitrittel (ONOO-) szemben mutatott hatás A ONOO- által indukált degradáció vizsgálatában a Co-, Cu- és Mn-HA nagyfokú védettséget élvezett a vizsgált koncentráció tartományban. Kisebb ONOO- koncentrációk mellett a Zn-HA is szignifikánsan nagyobb ellenállást mutatott a Na-HA degradációjához képest (49/a ábra). A degradációs vizsgálatoknak megfelelően az összes HA asszociátum erős antioxidáns hatást mutatott a ONOO- -tel szemben (49/b ábra). A Co-, Cu- és Mn-HA asszociátumok nagymértékben szignifikáns hatást mutattak. A referencia anyagként alkalmazott GSH a Na- és Zn-HA antioxidáns hatásával közel megegyező, míg a Co-, CuMn-hatásával összehasonlítva szignifikánsan kisebb hatást mutatott. A fémionok önálló antioxidáns hatásának vizsgálata során a Co2+ nagyobb, míg a Cu2+ és Mn2+ kisebb hatással bírt. A Co2+ és Cu2+ esetében sikerült koncentráció-optimumot kimutatni (49/c ábra). A Zn2+ 68

nem mutatott antioxidáns hatást, annak ellenére, hogy a Zn-HA asszociátum hatásosabb volt a Na-HA-nál. Az eredmény a Zn2+ és a HA között kialakuló kölcsönhatással magyarázható.

rel. M % (kDa/kDa)

A 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

*

** **

Na-HA

*

Zn-HA

*

Co-HA Cu-HA Mn-HA 1.1

2.1

4.2

8.5

ONOO-/ HA tetraszacharid (µ mol/µ mol)

C

B **

*

Zn-HA

60

*

Co-HA

40

Cu-HA Mn-HA

20

GSH

0 1.1

2.1

4.2

**

**

80 Gátlás %

Gátlás %

Na-HA

80

**

100

**

100

Co2+

60 40

Cu2+ Mn2+

*

20 0

8.5

1.1

ONOO - / HA tetraszacharid, GSH ( µ mol/ µ mol)

2.1

4.2

8.5

O N O O - / f ém k a t io n ( µ m o l/ µ m o l)

49. ábra A HA asszociátumok ONOO- -el szemben mutatott sajátságai

7.5.5 A HA asszociátumok antioxidáns hatásának értékelése és összefoglalása Vizsgálataink célja, a HA ROM-ok által indukált degradációja és az ezekkel szemben mutatott antioxidáns hatás közötti összefüggés, valamint a különböző ellenionokkal képzett asszociátumok hatásának bemutatása volt. A HA (Na-HA) önálló antioxidáns hatást csak a ˙OH gyökkel és a ONOO- -tel szemben mutatott. A kapott antioxidáns hatást leíró görbe mind a két esetben jól korrelált az egyes ROM által indukált HA degradáció mértékét bemutató görbe lefutásával. A HA asszociátumok antioxidáns, illetve ROM indukált degradációval szemben mutatott a Na-HA-nál fokozottabb hatásának okát két pontban látjuk: (i) a hatás következhet a változó 69

oxidációs állapotú fémionok (Co2+, Cu2+ és Mn2+) redox tulajdonságából. Ennek a hatásnak az érvényesülése figyelhető meg a Cu-, Mn-HA és Cu2+, Mn2+ ˙O2- gyökanionnal szemben, a Co-, Mn-HA és Co2+, Mn2+ AAPH-val szemben, valamint a Co-, Cu-HA és Co2+, Cu2+ ONOO- -el szemben mutatott hatásánál. Látható, hogy ezekben az esetekben nemcsak az antioxidáns hatás fokozódásáról van szó, hanem a Co2+, Cu2+ és Mn2+ megvédték a HA-at az ROM-ok indukált degradációtól is; (ii) a hatás másik lehetséges oka a HA és a fémionok között kialakuló komplex kötődés. Ezt támasztja alá számos, a fémionok és a HA között kialakuló igen szoros kölcsönhatást bemutató vizsgálat [103,169]. Vizsgálatainkban ilyen hatás figyelhető meg az állandó +2-es oxidációs állapottal rendelkező Zn2+ HA-val képzett asszociátuma és a Mn-HA ONOO- -el szemben, továbbá a Co-HA ˙O2- gyökanionnal szemben mutatott szinergista antioxidáns hatása esetében is. Összefoglalva, ˙OH gyök és ONOO- esetében sikerült kimutatnunk, hogy a HA rendelkezik önálló antioxidáns tulajdonsággal, amely feltehetően a szerkezetében végbemenő degradációval hozható kapcsolatba („önfeláldozó antioxidáns sajátság”). Másfelől az egyes HA asszociátumok mind a degradációs, mind az antioxidáns vizsgálatokban előnyösebbnek bizonyultak a HA önálló hatását modellező Na-HA-nál. Így figyelembe véve az egyes fémionok önálló farmakológiai hatását, a HA asszociátumoknak jelentős szerepe lehet olyan fokozott ROM-ok megjelenésével járó betegségek (reumatoid artritisz, krónikus sebek stb.) kezelésében, ahol fontos a HA reológiai tulajdonságának megtartása és a keletkező ROM-ok eliminálása is. A HA antioxidáns hatását bemutató vizsgálatainkat egy közleményben foglaltuk össze: Effect of different metal ions on the oxidative damage and antioxidant capacity of hyaluronic acid (2003) Arch. Biochem. Biophys. 410(1), 76-82. [168*].

70

7.6 Tézisek, összefoglalás Munkám során a biológiai oxidációs folyamatok két nagy területét, a hem fehérjék által katalizált oxidatív folyamatokat, valamint a Richter Gedeon Rt. originális terméke a cinkhyaluronát kapcsán a reaktív oxigént tartalmazó metabolitok (ROM) hatására végbemenő folyamatokat vizsgáltam. Vizsgálataimban az adott biológiai oxidációs folyamatokat kémiai rendszerek segítségével modelleztem, a modellrendszerből származó adatokat az egyes folyamatok mechanizmusának feltérképezésére használtam. Tézisek: 1. Az általam szintetizált mezo-tetrakisz-(2,6-diklórfenil)-vas(III)porfirin (FeTPPCl8), valamint a pentafluorozott vasporfirin (FeTPPF20)/H2O2, meta-klór-perbenzoesav (mCPBA), NaOCl modellrendszert alkalmaztam karbamát inszekticidek (karbofurán (1), karbaril (2), pirimikarb (3)) citokróm P450 által katalizált oxidatív folyamatainak modellezésére.

A

FeTPPF20/H2O2

és

FeTPPF20/m-CPBA

modellrendszerek

bizonyultak a legalkalmasabbnak a vizsgált karbamátok CP450 katalizálta metabolizmusának modellezésére. Pirimikarb esetén sikerült pontosítanom az Ndemetileződésének mechanizmusát is. 2. A kifejlesztett szintetikus metalloporfirin modellrendszert két - a CHINOIN Rt. által kifejlesztett – rovarszelektív citokróm P450 inhibitor (verbutin (22) és perbutin (23)) vizsgálatában is felhasználtam. A kísérletek alapján sikerült rámutatnom a két alkinilbenzil-éter tipusú inhibitor metabolikusan érzékeny pontjára, ami megfelelt a hasonló kémiai szerkezetű alkil-benzil-alkoholok esetében megfigyelt citokróm P450 által katalizált átalakulásoknak. Emellett a kémiai modellben sikerült kimutatnom olyan oxidált termékeket is, amelyek keletkezését csak a táplálkozási lánc lebontási folyamataiért felelős peroxidázok által katalizált oxidatív folyamatokkal lehetet értelmezni. Ílymódon sikerült rámutatni a verbutin (22) és a perbutin (23) lehetséges környezetvédelmi előnyére is. 3. A FeTPPF20/H2O2 modellrendszert egy még napjainkig nem tisztázott működési mechanizmusú, de annál inkább az érdeklődés középpontjánban levő hem fehérje a nitrogén monoxid szintetáz (NOS) vizsgálatában is felhasználtam. Munkám során a kémiai modellrendszer segítségével a NOS természetes szubsztrátjának az argininnek (Arg), az ezzel analóg szerkezeti egységet tartalmazó nikotinamidinnek (NA) és piperidin-karbimidnek (PCI), valamint az Arg-ből a NOS által katalizált folyamat első

71

lépésében keletkező N-hidroxi-argininnek (NHA), az ezzel analóg N-hidroxinikotinamidinnek

(NHNA)

és

piperidin-karbamidoximnak

(PCAO)

oxidatív

átalakulásait vizsgáltam. A vizsgálatok során az Arg és ezzel analóg NA és PCI nem mutatott átalakulást az adott rendszerben. Az NHA-ből és ezzel analóg NHNA-ből és PCAO-ból az in vivo átalakuláshoz hasonlóan nitrogén monoxid, a megfelelő nitril és savamid származékok keletkezetek. A kapott eredmények megfeleltek a korábban Marletta és mtsai által végzett vizsgálatokkal [167], akik az iNOS H2O2 jelenlétében Arg esetében nem tapasztaltak átalakulást, míg NHA-nel végzett vizsgálatuk esetében hasonló termékeloszlás mellett a citrullin és ciano-ornitin keletkezését azonosították. Az eredmények alapján megállapítható, hogy a kifejlesztett kémiai modellrendszer jól felhasználható guanidinszármazékok újszerű biomimetikus oxidációjára, valamint az iNOS kémiai modellezésére. 4. Munkám második felében a hyaluronan (HA) és különböző fémkationokkal (Zn2+, Co2+, Cu2+, Mn2+) képzett asszociátumának ROM-kal való kölcsönhatását vizsgáltam. Vizsgálataimba a klinikai megjelenés alapján és az emberi szervezetben található HA degradációjában fontos szerepet játszó ROM-at - a hidroxil gyököt (˙OH), a szuperoxid gyökaniont (˙O2-), a peroxil gyököt (RO2˙) és a peroxinitritet (ONOO-) vontam be. Hasonlóan előző vizsgálataimhoz ezekben az esetekben is kémiai rendszerekben vizsgáltam a létrejövő folyamatokat. Az egyes ROM esetén igyekeztem olyan kémiai modellrendszert kiválasztani, amely a lehető legjobban modellezi az in vivo biokémiai folyamatokat. Munkám célja a HA önálló antioxidáns hatásának, az antioxidáns hatás és a HA ROM okozta degradáció között párhuzam, valamint az ellenionként jelenlévő fémkationok hatásának bemutatása a degradációs és antioxidáns folyamatokban. A vizsgálatok során a HA önálló antioxidáns hatását csak a ˙OH gyökkel és a peroxinitrittel szemben sikerült kimutatnom. A kapott antioxidáns hatások jól korreláltak a HA egyes ROM által indukált degradációjának mértékével. A Zn-, Co-, Cu- és Mn-HA esetében tapasztalt fokozott antioxidáns hatás és a ROM által indukált degradációval szemben tapasztalt nagyobb ellenállás vizsgálataim alapján két okra vezethető vissza. Egyrészt következik a változó oxidációs állapottal rendelkező fémionok (Co2+, Cu2+ és Mn2+) redox tulajdonságából, másrészt a HA és a fémionok között létrejövő komplex kölcsönhatásból. A kapott eredmények alapján sikerült rámutatnom, hogy a HA rendelkezik önálló antioxidáns hatással, a fémkationokkal képzett HA asszociátum esetén tapasztalt fokozott hatás

72

alapján pedig ezek lehetséges terápiás előnyeire, olyan megbetegedésekben, ahol lényeges a HA reológiai sajátságainak megtartása és a ROM eliminálása.

73

8. Kísérleti rész Kémiai anyagok

Az összes reagenst, valamint a mezo-tetrakisz(pentafluoro) porfirin Fe(III) Cl-ot az Sigma-Aldrich Kft-től rendeltük. A felhasznált oldószerek analitikai tisztaságúak voltak, ezeket a Chemolab Kft és Merck cégtől vásároltuk.

8.1 A biomimetikus oxidációra vonatkozó kísérletek 8.1.1 mezo-Tetrakisz(2,6-diklór-fenil)-porfirin Fe(III)Cl (FeTPPCl8) 2,6-Diklór-benzaldehid (13,5 g, 77,1 mmol) pirrollal (5,35 ml, 77,1 mmol), cink-acetáttal (5,35 g, 23,2 mmol) és 2,6-lutidinnel (116 ml) képzett oldatát egy Soxhlet-extraktorral felszerelt 250 ml-es gömblombikba mértük. Az extraktorban elhelyezett papírhüvelybe szárított Na2SO4-ot raktunk, a reakcióelegyet 5 órán keresztül refluxáltattuk. Ezt követően az elegyet bepároltuk, a kapott maradékot toluolban felvéve egy éjszakán át 0 oC-on tartottuk. A kivált lila kristályokat leszűrve kaptuk meg a ZnTPPCl8-t (14,88 g, 20%, UV-csúcs 420 nm). A porfirin szabad bázist a ZnTPPCl8 (1,86 g, 2 mmol) diklór-metános (250 ml) oldatának trifluor-ecetsavas (19 ml) kezelésével kaptuk meg. A reakcióelegyet 6 órán keresztül kevertettük szobahőmérsékleten, majd vizes NaHCO3-tal és vízzel extraháltuk. A szerves fázishoz 50 ml MeOH-t adtunk és bepároltuk. A kapott terméket MeOH-ból átkristályosítottuk és megkaptuk a megfelelő szabad bázist, H2TPPCl8-t (0,41 g, 24%, UVcsúcsok 418, 512 és 588 nm). Ezt feloldottuk DMF-ban (270 ml) és FeCl2.4H2O-al (2,04 g, 2 mmol) 4 órán át forraltuk, majd a kapott reakcióelegyen 10 órán keresztül levegőt átbuborékoltatva megkaptuk a FeTPPCl8-t. A maradékot felvettük 1M HCl-ban, a kiváló sötétbarna kristályokat leszűrve kaptuk FeTPPCl8-at (0,18 g, 57%, UV-csúcsok 508,580 és 640nm). A termék és az összes intermedier minőségét UV-spektroszkópia segítségével azonosítottuk

irodalmi

adatok

alapján.

Az

spektrofotométer segítségével készültek.

74

UV-spektrumok

Shimatzu

UV-160

8.1.2 A karbofurán (1) metabolitjainak szintetikus előállítása 8.1.2.1 7-Hidroxi-2,2-dimetil-2,3-dihidro-benzofurán (4) előállítása A karbofuránt (1) (3,31g, 15 mmol) alkoholos kálium-hidroxid (1,01 g, 18 mmol) jelenlétében, a Balba és munkatársai által kifejlesztett eljárás szerint hidrolizáltva kaptuk meg (4)-et (1,85 g, 77%). Forráspont: 70 oC (80 Pa). 1H-NMR δ 1,50 (s, 6H, 2xCH3) 3,05 (s, 2H, CH2) 5,19 (széles s, 1H, OH) 6.73 (s, 3H, Ar); 13C-NMR δ 28,52 (2xCH3) 43,92 (C-3) 88,21 (C-2) 114,83 (C-4),116,91 (C-5), 120,91 (C-6) 127,92 (C-7a), 140,23 (C-7), 146,12 (C-3a). IR νmax: 3567, 1625, 1606, 1479, 1300, 1253 cm-1 (CHCl3). VRK (eluens: benzol-dietil-éter 1:3) Rf = 0,63. HPLC-s retenciós ideje (min): 6,86. Lit. [139]: forráspont: 63-65 oC (0,1 mm) (eluens: hexán-dietil-éter 1:3) Rf = 0,71

8.1.2.2 (2,2-Dimetil-2,3-dihidrobenzofuran-7-il) N-benziloximetil-karbamát (5) A 0,82 g (5 mmol) (4) 25 ml szárított benzollal készített oldatához 0,1 ml trietilamint és 0,82 g (5 mmol) benziloximetil-izocianátot adtunk. A kapott reakcióelegyet 18 órán át refluxáltattuk, majd bepároljuk. A bepárlási maradék dietil-éterből való kristályosításával kaptuk (5)-öt (1,05 g, 66%) színtelen por formában. Olvadáspont: 60-62 oC, 1H-NMR δ 1,49 (s, 6H, 2xCH3) 3,05 (s, 2H, CH2) 4,66 (s, 2H, OCH2) 4,85 (d, 2H, NCH2) 5,97 (t, 1H, NH) 6,77, 7,42 (m, 8H, Ar); 13C-NMR δ 28,13 (2xCH3) 43,07 (C-3) 70,26 (NCH2) 72,02 (BzCH2) 88,34 (C-2) 120,11, 121,61, 122,39, 127,74, 127,95, 128,42, 129,54, 137,82 (C-Ar) 134,50 (C-7a), 150,18 (C-3a) 153,34 (CO). IR νmax : 3443, 1752, 1482, 1231, 1136 cm-1 (CHCl3). Lit. [139]: Olvadáspont: 54-56 oC

8.1.2.3 (2,2-Dimetil-2,3-dihidrobenzofuran-7-il) N-hidroximetil-karbamát (6) A 0,32 g (1 mmol) (5) 20 ml CCl4-dal képzett oldatához hozzáadtunk 1 g (5 mmol) trimetilszilil-jodidot, a reakció elegyet 1 órát kevertettük, majd leszűrtük. Ezt követően a szűrletet felvettük MeOH-ban (4-szeres felesleg) és egy éjszakát kevertettük. Másnap az elegyet bepároltuk és a kapott maradékot felvettük dietil-éterben, majd nátrium-biszulfittal, nátrium-bikarbonáttal, valamint NaCl vizes oldatával extraháltuk. Az így kapott szerves fázist

75

MgSO4 segítségével szárítottuk. A bepárlás után 0,14 g (50%) (6)-ot kaptunk színtelen kristály formájában. Olvadáspont: 133-135 oC. 1H-NMR δ 1,50 (s, 6H, 2xCH3) 3,04 (s, 2H, CH2) 3,41 (s, 1H, OH) 4,35 (d, 2H, NCH2) 5,38 (s, 1H, NH) 6,74-7,37 (m, 3H, Ar); 13C-NMR δ 22,92 (2xCH3), 43,86 (C-3) 73,61 (CH2OH) 89,08 (C-2), 120,91 (C-4), 121,83 (C-5), 121,91 (C-6), 127,92, (C-7a), 130,72 (C-7), 137,95 (C-3a). IR νmax : 3345, 1730, 1225, 1131 cm-1 (KBr). VRK (dietil-éter-hexán 2:1) Rf = 0,54, HPLC retenciós ideje (min) 3,15. Lit. [139]: Olvadáspont: 133-135 oC. 1H-NMR τ 7,82 (s, 1H, OH). IR (körülbelüli értékek, mivel az irodalom csak a spektrumot adta meg) νmax : ~3300, ~1720, ~1240, 1015 cm-1 (KBr). VRK (dietil-éter-hexán 3:1) Rf = 0,21.

8.1.2.4 2,2-Dimetil-7-metilkarbamoiloxi-2,3-dihidrobenzofuran-3-on (7) A karbofuránt (1) (4,4 g, 20 mmol) feloldottuk 20 ml ecetsavban és króm-trioxid (12,16 g, 80 mmol) segítségével 25-30 oC-on 16 órán keresztül folyamatos keverés mellett oxidáltuk, majd a reakcióelegyet felvettük 30 ml vízben és dietil-éterrel extraháltuk. Az elegy bepárlásával kaptuk meg (7)-et (3,00 g, 65%) színtelen kristályok formájában. Olvadáspont: 163-165 oC (etanol). 1H-NMR δ 1,48 (s, 6H, 2xCH3) 2,92 (d, 3H, NCH3) 5,19 (s, 1H, NH) 7,00-7,54 (m, 3H, Ar);

13

C-NMR δ 22,99 (2xCH3) 27,90 (NCH3) 89,08 (C-2) 121,64 (C-4),

121,79 (C-5), 131,03 (C-6), 123,57 (C-7a), 137,26 (C-7), 153,90 (C-3a), 161,12 (CO) 204,33 ((C-3)O). IR νmax: 3358, 1717, 1620, 1500, 1271 cm-1 (KBr). VRK (dietil-éter-benzol 3:1) Rf = 0,27, HPLC-s retenciós ideje (min) 5,51. Lit. [139]: Olvadáspont: 187-188 oC (etanol). 1H-NMR τ 8,54 (s, 6H, 2xCH3), 7,09 (d, 3H, NCH3), 2,74 (m, 3H, Ar). IR (körülbelüli értékek, mivel az irodalom csak a spektrumot adta meg) νmax: ~3500, ~1800, ~1720, ~1550, ~1300 cm-1 (KBr). VRK (dietil-éter-hexán 3:1) Rf = 0,35.

8.1.2.5 3,7-Dihidroxi-2,2-dimetil-2,3-dihidrobenzofurán (8) (7) (0,3 g 1,2 mmol) vízmentes metanollal képzett oldatához 0,094g (2,5 mmol) nátriumborohidridet adtunk. A kiindulási anyag teljes átalakulása után a reakciókeveréket bepároltuk, és a maradékot kromatografálva (Silica gel 60, eluens: dietil-éter/benzol 3:1) kaptuk meg (8)at (0,08 g, 40%) színtelen olaj alakjában. 1H-NMR δ 1,35 (s, 3H, CH3) 1,49 (d, 3H, CH3) 2,11 (d, 1H, COH) 4,76 (d, 1H, CH) 5,75 (s, 1H, ArOH) 6,75, 6,98 (m, 3H, Ar); 13C-NMR δ 76

20,84 (2xCH3) 79,04 (C-2) 90,66 ((C-3)OH) 117,00 (C-4), 117,72 (C-5), 121,59 (C-6), 128,33 (C-7a), 140,91 (C-7), 146,12 (C-3a). VRK (dietil-éter-benzol 3:1) Rf = 0,49, HPLC-s retenciós ideje (min) 3,46. Anal. számít.: C10H12O3; C 67,11%; H 5,66%, Mért: C 66,96%; H 5,51%.

8.1.2.6 (2,2-Dimetil-3-hidroxi-2,2-dimetil-2,3-dihidro-benzofuran-7-il) N-metilkarbamát (9) (7) (0,47 g, 2 mmol) metanollal (10 ml) képzett oldatához nátrium-cianoborohidridet (0,16 g, 2,5 mmol) adtunk. A reakcióelegy hőmérsékletét 3 órán keresztül 45 oC-on tartottuk, eközben a reakcióelegy pH-ját 5M vizes HCl adagolásával 3,1 és 3,4 között tartottuk. Ezután az elegyet felvettük 5 ml vízzel, majd az oldatot dietil-éterrel extraháltuk. Az éteres extraktumot MgSO4-on szárítottuk, majd az elegyet bepároltuk. A maradékot kromatografálva (Silica gel 60, eluens: dietil-éter-benzol 3:1) kaptuk meg (9)-et (0,16g, 35%) színtelen kristály formájában. Olvadáspont:105-108 oC. 1H-NMR δ 1,34 (s, 3H, CH3) 1,48 (s, 3H, CH3) 2,52 (d, 1H, OH) 2,87 (d, 3H, NCH3) 4,71 (d, 1H, CH) 5,08 (s, 1H, NH) 6,83, 7,25 (m, 3H, Ar); 13CNMR δ 20,74 (2xCH3) 26,17 (NCH3) 78,54 (C-2) 90,84 ((C-3)OH) 120,79 (C-4), 123,84 (C5), 124,08 (C-6), 130,87 (C-7a), 135,26 (C-7), 150,90 (C-3a) 154,52 (CO). IR νmax : 3574, 1718, 1295, 1124, 910 cm-1 (CHCl3). VRK (benzol-metanol 5:1) Rf = 0,43, HPLC-s retenciós ideje (min) 3,7. Lit. [139]: Olvadáspont:138-140 oC (H2O). . 1H-NMR τ 8,60 (d, 6H, 2xCH3), 7,61 (s, 1H, OH), 7,13 (d, 3H, NCH3), 5,30 (s, 1H, CH) 2,90 (m, 3H, Ar). IR (körülbelüli értékek, mivel az irodalom csak a spektrumot adta meg) νmax: ~3500, ~1780, ~1300, ~1120, ~920 cm-1 (KBr). VRK (dietil-éter-hexán 3:1) Rf = 0,13.

8.1.2.7 7-Hidroxi-2,2-dimetil-2,3-dihidrobenzofuran-3-on (10) (7)-et (3,52 g, 15 mmol) alkoholos kálium-hidroxid (1,01 g, 18 mmol/40 ml etanol) segítségével 40-45 oC-on 2 órán keresztül hidrolizáltuk. A kapott reakcióelegyet 5M vizes HCl-al megsavanyítottuk, majd dietil-éterrel extraháltuk. A kapott szerves fázist MgSO4-on szárítottuk, majd az oldat bepárlásával kaptuk meg (10)-et (2,55 g, 96%), színtelen kristályos alakban. Olvadáspont: 162-165 oC. 1H-NMR δ 1,49 (s, 6H, 2xCH3) 5,86 (s, 1H, OH) 6,93, 7,36 (m, 3H, Ar);

13

C-NMR δ 23,10 (2xCH3) 89,15 (C-2), 116,20 (C-4), 120,37 (C-7a), 77

122,52 (C-5), 122,83 (C-6), 142,73 (C-7), 159,20 (C-3a) 204,33 ((C-3)O). IR νmax : 3566, 1716, 1621, 1453, 1288, 1257, 1124, 918 cm-1 (CHCl3). VRK (dietil-éter-benzol 3:1) Rf = 0,58, HPLC-s retenciós ideje (min) 4,62. Lit. [139]: Olvadáspont: 159-165 oC (H2O) VRK (dietil-éter-hexán 3:1) Rf = 0,59.

8.1.2.8

(2,2-Dimetil-3-oxo-2,3-dihidrobenzofuran-7-il)

N-benziloximetil-

karbamát (11) A 10 (0,89 g, 5 mmol) 25 ml szárított benzollal készített oldatához 0,1 ml trietil-amint és 0,82 g (5 mmol) benziloximetil-izocianátot adtunk. A kapott oldatot 18 órán keresztül refluxáltattuk, majd bepároljuk. A bepárlási maradék dietil-éterből való kristályosításával kaptuk (11)-et (1,53 g, 90%) színtelen por formában. Olvadáspont: 119-121 oC, 1H-NMR δ 1,48 (s, 6H, 2xCH3) 4,67 (s, 2H, ArCH2) 4,85 (d, 2H, NCH2) 5,99 (s, 1H, NH) 6,02, 7.57 (m, 8H, Ar); 13C-NMR δ 22,99 (2xCH3) 70,50 (NCH2) 72,12 (BzCH2) 89,21(C-2) 121,83, 122,02, 122,39, 127,89, 128,52, 130,79, 137,58 (Ar) 136,93 (C-7a), 150,18 (C-3a) 153,64 ((C-3)O) 203,41((C-3)O). Anal. számít.: C19H19NO5; C 66,84%; H 5,56%; N 4,10%, Mért: C 66,4%; H 5,3%; N 4,1%.

8.1.2.9 (2,2-dimetil-3-oxo-2,3-dihidrobenzofuran-7-il) N-hidroximetilkarbamát (12) (11) 0,52 g (1,5 mmol) 20 ml CCl4-el képzett oldatához trimetilszilil-jodidot (1,5 g, 7,5 mmol) adtunk, a reakcióelegyet 1 órán keresztül kevertettük, majd leszűrtük. A kapott szűrletet négyszeres feleslegben alkalmazott metanolban vettük fel, majd egy éjszakán át argon atmoszférában kevertettük. Másnap az oldószer bepárlása után a kapott maradékot felvettük dietil-éterben, majd nátrium-biszulfit, nátrium-bikarbonát és NaCl vizes oldataival extraháltuk, a kapott szerves fázist MgSO4 segítségével szárítottuk. Oldatunkat bepárolva kaptuk (12)-t (0,2 g, 60%) színtelen kristály formájában. Olvadáspont: 141-145 oC. 1H-NMR δ 1,48 (s, 6H, 2xCH3) 3,43 (s, 1H, OH) 4,75 (d, 2H, NCH2) 5,98 (s, 1H, NH) 7,02, 7,57 (m, 3H, Ar); 13C-NMR δ 22,95 (2xCH3) 73,91 (CH2OH) 89,17 (C-2) 121,79 (C-4), 121,97 (C-5), 127,98 (C-6), 130,79 (C-7) 120,91 (C-7a), 137,85 (C-3a) 153,85 ((C-3)O) 204,16((C-3)O). IR

78

νmax : 3348, 1752, 1405, 1095 cm-1 (CHCl3). VRK (dietil-éter-benzol 3:1) Rf = 0,47, HPLC-s retenciós ideje (min) 6,85. Lit. [139]: Olvadáspont: 186-188 oC. IR (körülbelüli értékek, mivel az irodalom csak a spektrumot adta meg) νmax: ~3300, 1710, 1730, ~1500, 1015, ~800 cm-1 (KBr). VRK (dietiléter-hexán 3:1) Rf = 0,12.

8.1.2.10 2,2-dimetil-2,3-dihidrobenzofuranil-7-karbamát (13) 3 g 10 %-os H2-al előaktívált Pd/C-hez ¼ óra alatt hozzácsepegtettük az (5) 0,5 g (1,6 mmol) 50 izopropanollal képzett oldatát. Ezt követően H2 atmoszférában 3 órát kevertettük (H2 fogyás 60 cm3). A rekció végén az oldatot szűrtük, bepároltuk. A kapott terméket éter:hexán 2:1-ből átkristályosítottuk. A szűrés után kaptuk meg (0,2 g, 59%) (13)-at színtelen kristály formájában. Olvadáspont: 139-149 oC 1H NMR (CDCl3, 200 MHz) δ 1,50 (s, 6H, 2xCH3) 3,05 (s, 2H, ArCH2) 5,27 (s, 2H, NH2) 6,75-7,02 (m, 3H, Ar).

13

C-NMR δ 28,14 (2C,2xCH3), 43,07

(1C,CH2), 88,37 (1C,Ckvat), 120,13, 122,41, 134,48 (4C,Ar), 129,56, 150,20 (2C, Ar-gy), 154,72 (1C,CO). HPLC Hewlet-Packard 1050. Kolonna : Spherisorb 5 ODS-1, Eluens: Acetonitril:víz 40:60, λ 220 nm,áramlási sebesség: 1 ml/perc, RT(min) 5.703. Elementár analízis; mért értékek:C, 63,8%; H, 6,3%; N, 6,8%. Számított értékek: C11H13NO3: C, 63,76%; H, 6,32%; N, 6,76%. VRK: Adszorbens: Kieselgel 60 F254 5x10 cm-es lemez, eluens: éter:hexán 2:1,reagens: foszformolibdénsav 5 %-os etanolos oldata, felvitt mennyiség: 0,1 µl Rf: 0,20. IR νmax : 3437, 1715, 1687, 1485, 1243 cm-1 (CHCl3).

8.1.2.11 A karbofurán (1) metabolitok analíziséhez felhasznált készülékek A 1H és

13

C-NMR spektrumok Bruker AC-200 NMR készülékkel, CDCl3 oldószerben

készültek. A belső standard tetrametil-szilán volt. Az asszignációkat egyes esetekben HMBC és HMQC mérések segítették.

Az IR-spektrumok Perkin-Elmer 398 spektrométerrel

készültek.

79

8.1.3 A biomimetikus reakciók általános kivitelezése A 0,1 mmol katalizátor keverékét feloldottuk 10 ml oldószerben és az oldathoz hozzáadtunk 0,4 mol oxidálószert. Az így kapott oldatot negyed óráig kevertettük (előoxidáció). Ezt követően raktuk az elegybe a vizsgálandó vegyületet (1,1 mmol), a reakciót szobahőmérsékleten 30 percig folytattuk, majd az oldatot bepároltuk. A kapott maradékot közvetlenül vizsgáltuk HPLC, HPLC-MS segítségével. Ha az oxidálószer m-CPBA volt, oldószerként diklórmetánt, míg NaOCl és H2O2 esetében diklór-metán/metanol 1:1 oldószerelegyet alkalmaztunk.

8.1.4 A biomimetikus oxidáció során kapott termékek elválasztása és azonosítása A karbofurán (1) metabolitok azonosítását RP (fordított-fázisú) HPLC-vel végeztük. Készülék: Hewlett-Packard 1050, Kolonna: Spherisorb 5 ODS-1, Eluens: acetonitril-víz 40:60, a mozgófázis áramlási sebessége 1 ml/min, detektálási hullámhossz: 220 nm. A karbaril (2) és pirimikarb (3) metabolitjait HPLC/MS segítségével azonosítottuk. A HPLC-s rendszer egységei a következők voltak: Symmetry C8 (Waters) 3,9x150 kolonna, Spectraphysics P200 gradiens pumpa, UV100 detektor és 10 ml-es Rheodyne injektor. Az analízisek a következő eluens rendszerben készültek: acetonitril-víz-hangyasav 5:95:0,1 (A), acetonitril-víz-hangyasav 95:5:0,1 (B). Az elválasztáshoz oldószergradienst használtunk, két eluenst egymás után úgy alkalmaztuk, hogy a kezdeti 100% A-ból 20 perc alatt 100% B összetételhez jussunk. Az egyes metabolitokat fotometriásan, 254 nm-en detektáltuk. A mozgófázis áramlási sebessége 1 ml/min volt. A MS mérések VG QUATTRO triplequad tömegspektrométerrel (Micromass, Manchester UK), elektrospray ionizáció segítségével készültek. Az elektrospray forráshőmérséklete 120

o

C, a kúpfeszültség 15 V, az

eluensmegoszlás 1:10 volt. A metabolitok elválasztásához Merck Kieselgel F254 VRK lapokat használtunk. A verbutin (22) és perbutin (23) oxidációjának reakcióelegyét kapillár GC-vel is megvizsgáltuk. Ehhez CHROMPACK CP 9000 készüléket, CP-SIL-8CB állófázissal feltöltött WCOT kolonnát (hossza: 30 m, átmérője: 0,5/0,7 mm, rétegvastagság: 5 µm) használtunk. A Verbutin (22) és Perbutin (23) biomimetikus oxidációja során képződő metabolitokat (24), (25) és (28)-at, belső standard módszerrel, kapillár GC-vel azonosítottuk. Az ismeretlen

80

metabolit komponenseket preparatív VRK-val választottuk el (eluens: hexán-etilacetát 7:3) és 1

H- és 13C-NMR spektroszkópiával azonosítottuk.

Az argininnel és NHA-nel, valamint ezek analógjaival végzett biomimetikus oxidációból származó termékeket is HPLC/MS tecnikával azonosítottuk. Az itt alkalmazott HPLC/MS rendszer megegyezik a karbaril (2) és pirimikarb (3) oxidációs termékeinek azonosítására felhasznált rendszerrel.

8.1.4.1 A pirimikarb (3) biomimetikus oxidációjával nyert két fő metabolit MS és NMR adatai (15): MS (M+1): 225. 1H-NMR δ 2,04 (s, 3H, 5-CH3), 2,34 (s, 3H, 6-CH3), 2,93 (széles d., 3H, NHCH3), 3,04 és 3,12 (s, 3H, CON(CH3)2), 7,37 (széles m., 1H, NH-CH3).

13

C-NMR δ

10,49 (5-CH3), 22,44 (6-CH3), 25,94 (CON(CH3)2), 36,79 (N(CH3)2), 107,10 (5-C), 152,81 (CON(CH3)2), 160,62 (2-C), 168,01 (4-C), 177,97 (6-C). Lit. [170]: 1H-NMR δ 1,99 (s, 3H, 5-CH3), 2,33 (s, 3H, 6-CH3), 3,06 (d, 6H, CON(CH3)2), 3,10 (s, 3H, NHCH3), 4,98 (s, 1H, NH). IR νmax : 3285, 1716 cm-1 (KBr) (18): MS (M+1): 253. 1H-NMR δ 2,12 (s, 3H, 5-CH3), 2,47 (s, 3H, 6-CH3), 3,05 és 3,11 (s, 6H, CON(CH3)2), 3,35 (s, 3H, NH-CH3), 9,75 (s, 1H, CHO).

13

C-NMR δ 10,50 (5-CH3),

22,43 (6-CH3), 36,77 (CON(CH3)2), 115,00 (5-C), 152,80 (CON(CH3)2), 163,84 (NCHO), 164,22 (2-C), 168,87 (4-C), 178,15 (6-C). Lit. [170]: 1H-NMR δ 2,04 (s, 3H, 5-CH3), 2,38 (s, 3H, 6-CH3), 2,97 (d, 6H, CON(CH3)2), 3,24 (s, 3H, NH-CH3), 9,66 (s, 1H, CHO). IR νmax : 1731, 1680 cm-1 (KBr).

8.1.4.2 A Verbutin (22) és Perbutin (23) biomimetikus oxidációjával nyert metabolitok kitermelése és NMR adatai (26): 10 mg, 38%. 1H-NMR: δ 1,37 (d, J=6,5 Hz, 3H, CH3-C), 1,86 (t, J=2,3 Hz, 3H, CH3C≡C), 3,84 (s, 3H, OCH3), 4,04 (dq, J=15,3 és 2,3 Hz, 2H, -OCH2a), 4,13 (dq, J=15,3 és 2,3 Hz, 2H, -OCH2b), 4,73 (dq, J=6,5 és 1,3 Hz, 1H, -OCH), 5,92 (s, 1H, 5-H), 6,77 (d, J=1,3 Hz, 1H, 2-H). 13C-NMR: δ 3,6 (CH3-C≡), 21,7 (CH3-CH), 56,3 (OCH3), 57,1 (OCH2), 70,0 (CH3CH), 74,6 (CH3-C≡), 83,1 (CH2-C≡), 107,1 (C-5), 129,0 (C-2), 150,6 (C-1), 158,7 (C-4), 182,3 (C-3), 187,1 (C-6). Számít.: C 66,66%; H 6,02%, Mért: C 65,43%; H 5,84%.

81

(27): 14mg, 45%. 1H-NMR δ 1,25 (d, J=6,4 Hz, 3H, CH3-C≡C), 1,76 (t, J=2,0 Hz, 3H, CH3C), 3,24 (s, 3H, OCH3), 3,27 (s, 3H, OCH3), 3,75 (s, 3H, OCH3), 3,96 (dq, J=15,1 és 2,0 Hz, 2H, -OCH2a), 4,03 (dq, J=15,1 és 2,0 Hz, 2H, -OCH2b), 4,58 (qd, J=6,4 és 1,2 Hz, 1H, OCH), 5,54 (s, 1H, 2-H), 6,59 (d, J=1,2 Hz, 1H, 5-H). 13C-NMR: δ 3,4 (CH3-C≡), 22,0 (CH3CH), 51,2, 55,9, 55,9 (OCH3), 56,7 (OCH2), 70,3 (CH3-CH), 74,7 (CH3-C≡), 82,2 (CH2-C≡), 94,3 (C-6), 103,8 (C-2), 133,9 (C-5), 142,6 (C-4), 169,0 (C-1), 185,3 (C-3). Számít.: C 64,27%; H 7,19%, Mért: C 64,02%; H 7,08%. (29): 16 mg, 71%. 1H-NMR δ 1,78 (t, J=2,3 Hz, 3H, CH3-C), 3,34 (s, 3H, OCH3), 4,21 (m, 2H, -OCH2-C≡), 4,29 (dq, J=15,8 and 2,2 Hz, 1H, OCH2a), 4,43 (dq, J=15,8 and 2,2 Hz, 1H, -OCH2b), 5,59 (s, 2H, O-CH2-O), 5,65 (s, 1H, 7-H), 6,94 (t, J=2,2 Hz, 1H, 4-H). 13C-NMR: δ 3,6 (CH3-C≡), 51,4 (OCH3), 58,9 (OCH2-C≡), 66,0 (OCH2), 74,6 (CH3-C≡), 83,1 (CH2-C≡), 97,6 (C-3a), 98,7 (O-CH2-O), 98,8 (C-7), 127,0 (C-4), 140,2 (C-5), 168,6 (C-7a), 186,3 (C-6). Számít. C 62,40%; H 5,64%, Mért: C 62,05%; H 5,38%.

8.2 A hyaluronan asszociátumokkal végzett vizsgálatokra vonatkozó kísérletek A Na-HA-ot a Richter Gedeon Rt. által szabadalmaztatott eljárással kakastaréjból izoláltuk [109]. Az egyes HA asszociátumokat a Na-HA-ból állítottuk elő a következők szerint. Első lépésben elkészítettük a Na-HA tetraszacharid egységre vonatkoztatva 6,3 mMos oldatát, majd ehhez ekvivalens mennyiségű fémion klorid sót adtunk, majd a HA asszociátumot kétszeres t;rfogat] 90 % etanollal kicsaptuk. A kapott csapadékot 80 %-os etanollal sómentesre mostuk. Az összehasonlításhoz szükséges szabad fémionokat tartalmazó oldatokat ennek megfelelően az adott fémion klorid sójából állítottuk elő. Ezek koncentrációja is 6,3 mM-os volt.

8.2.1 A HA asszociátumok reaktív oxigént tartalmazó metabolitok (ROM) hatására végbemenő degradációjának vizsgálata A degradációs vizsgálatoknál minden esetben a HA asszociátumok 6,3 mM-os oldatával dolgoztunk. A különböző ROM-ok előállítását, illetve a HA asszociátumokkal végzett reakció paramétereit az antioxidáns vizsgálatoknál írom le. A ROM-ok hatására a HA asszociátumokban végbemenő degradációt, közvetlenül a reakcióelegyből vett mintából,

82

méretkizárásos kromatográfia segítségével követtük. A vizsgálathoz polimer bázisú TSKgel GMPWXL (7,8mm x 30mm; 13 µm) típusú oszlopot használtunk. A HA asszociátumok látszólagos molekulaméretének megállapításához a kromatográfiás rendszerünket különböző molekulaméretű polietilénoxidok (Mr = 103, 4,6·104, 8,85·105) segítségével kalibráltuk. Degradáció %-os mértéke: [ROM-al degradált HA asszociátum látszólagos moltömege (Mr)] / (kiindulási HA asszociátum Mr-je) X 100.

8.2.2 A HA asszociátumok antioxidáns hatásának vizsgálata 8.2.2.1 ˙OH gyökkel szemben mutatott antioxidáns hatás vizsgálata A reakciót 50 mM-os 3-(N-morfolino)-propánszulfonsav (MOPS) pufferben, pH 6,0-on végeztük. Első lépésben elkészítettük a 2,8 µM 2-dezoxi-D-ribózt és különböző koncentrációban alkalmazott (0,05-2µM) HA asszociátumot tartalmazó oldatokat, majd ezekhez 0,2 µM H2O2-ot és 1,5 µM FeSO4-ot adtunk (Fenton reakció). A reakció végső térfogata 1,4 ml volt. Ezt követően a reakcióelegyet 3 percig 37 0C-on tartottuk (ebben az időintervallumban a ˙OH gyök képződési kinetikája még lineáris). Ezt követően a reakció elegyhez 2 ml 15% triklórecetsavat, 0,25 M HCl-t 0,325 % tiobarbitursavat és 0,06 M NaOHt tartalmazó oldatot adtunk. A kapott reakcióelegyet 15 percig 100 0C-on tartottuk, majd a keletkező vöröses-barna formazán abszorbanciáját 535 nm-en mértük. Gátlás %: 100 – [(HA asszociátum alkalmazásakor kapott abszorbancia) / (HA asszociátum elhagyása mellett kapott abszorbancia) X 100].

8.2.2.2 ˙O2- gyökanionnal szemben mutatott antioxidáns hatás vizsgálata A ˙O2- gyökanionnal szemben mutatott antioxidáns hatást a nitro blue tetrazoliumban (NBT) végbemenő redukció segítségével határoztuk meg. A reakcióelegy 0,015 µM fenazin metoszulfátot, 0,3 µM NADH-t, 0,04 µM NBT-ot és különböző koncentrációjú (0,1-0,7 µM) HA asszociátumot tartalmazott. A reakciót 1M glicin pufferben (pH 7,4) végeztük. Az inkubációt 10 percig szobahőmérsékleten végeztük. A keletkező vöröses oldat abszorbanciáját 560 nm-en mértük. Gátlás %: 100 – [(HA asszociátum alkalmazásakor kapott abszorbancia) / (HA asszociátum elhagyása mellett kapott abszorbancia) X 100].

83

8.2.2.3 AAPH-val szemben mutatott antioxidáns hatás vizsgálata A peroxil gyököt a vízoldható AAPH 37 0C-on történő spontán bomlásának segítségével állítottuk elő, amely az ABTS-t egy-elektronos oxidációs lépésben gyökkationná alakítja. A reakciót 0,1 M glicin pufferben végeztük. A 3 ml össztérfogatú reakcióelegy 300 µl 200 mMos AAPH-t, 90 µl 5 mM-os ABTS-t és különböző térfogatú (1,5-55 µl) 6,3 mM-os HA asszociátumot tartalmazott. A reakcióelegyet 15 percig 37 0C-on tartottuk, majd a keletkezett zöldes oldat abszorbanciáját 414 nm-en mértük. Gátlás %: 100 – [(HA asszociátum alkalmazásakor kapott abszorbancia) / (HA asszociátum elhagyása mellett kapott abszorbancia) · 100].

8.2.2.4 ONOO- -el szemben mutatott antioxidáns hatás vizsgálata A ONOO- -et a 0,5 M NaNO2 és 0,5 M H2O2 sav (1 M HCl) által katalizált reakciójával állítottuk elő. A reakciót jeges hűtés mellett végeztük. Az 1 M-os HCl reakció elegybe való beadását pillanatszerű 1,5 M-os NaOH adagolása követte. A peroxinitrit megjelenését halványsárga szín megjelenése mutatta. A kapott peroxinitritből különböző mennyiségeket ( 2,5-50 µM) mértünk be az 50 µM pirogallol-vöröst és 5,9 µM HA asszociátumot tartalmazó reakció elegybe. A reakciót 25 0C-on 0,1 M glicin pufferben (pH 7) végeztük. A reakció-elegy össztérfogata 3 ml volt. A pirogallol-vörös színének intenzitás változását 542 nm-en mértük. Gátlás %: 100 – [(HA asszociátum elhagyása mellett kapott abszorbancia) / (HA asszociátum alkalmazásakor kapott abszorbancia) · 100].

84

9. Irodalomjegyzék [1] G. P. Georghiou (1990) Overview of insecticide resistance, ACS Symp. Series 421, 18-41. [2] F. J. Oppenoorth (1984) Pestic. Biochem. Physiol. 22, 187-193. [3] R. L. Metcalf (1989) Pestic. Sci. 26, 333-358. [4] A. M. Thayer (1997) Chem. Eng. News 75, 15-19. [5] M. Wadman (1997) Nature 388, 817. [6] H. S. Mason, W. Fawlks and J. J. Peterson (1955) J. Am. Chem. Soc. 77, 2914. [7] (a) O. Hayaishi, M. Katagiri and S. J. Rothberg (1955) J. Am. Chem. Soc. 77, 5450. (b) O. Hayashi: Chapter 1 (1974) Molecular Mechanisms of Oxygen Activation (ed. G. A. Hamilton) pp. 1-28. Academic, New York. [8] Klinberg (1958) Arch. Biochem. Biophys. 75, 376. [9] D. Garfinkel (1958) Arch. Biochem. Biophys. 77, 493. [10] T. Omura and R. Sato (1964) J. Biol. Chem. 239, 2370. [11] R. W. Estabrook, A. G. Hildebrandt, H. Remmer, J. B. Schenkman, O. Rosenthal and D. Y. Cooper (1968) Role of cytochrome P450 in microsomal mixed-function oxidation reaction. In. Hess, B. & Staudinger, H. (eds) pp. 142-177. Springer Verlag, Berlin. [12] D. Garfinkel (1963) Comp. Biochem. Biophys. 8, 367-379. [13] T. L. Poulos, B. C. Finzel and A. J. Howard (1987) J. Mol. Biol. 195, 687-700. [14] (a) K. G. Ravichandran, S. S. Boddupali, C. A. Hasemann, J. Peterson and J. Deisenhofer (1993) Science 262, 731-736. (b) C. A. Hasemann, K. G. Ravichandran, S. S. Boddupali, J. Peterson and J. Deisenhofer (1994) J. Mol. Biol. 236, 1169-1185. (c) J. Cupp-Viskery, H. Li and T. L. Poulos, (1985) Nat. Struct. Biol. 2,144-153. [15] P. A. Williams, J. Cosme, V. Sridhar, E. F. Johnson and D. E. McRee (2000) Mol. Cell 5, 121.

[16] A. Williams, J. Cosme, V. Sridhar, E. F. Johnson and D. E. McRee (2000) J. Inorg. Biochem. 81, 183-190. [17] O. Gotoh (1992) J. Biol. Chem. 267, 83. [18] W. Nebert and D. W. Russel (2002) The Lancet 360, 1155-1162. [19] R. E. White and M. J. Coon (1980) Annu. Rev. Biochem. 49, 315. [20] P. R. Ortiz de Montellano (ed.) (1986) Cytochrome P-450: Structure, Mechanism and Biochemistry, Plenum Press, New York. [21] (a) J. E. Penner-Hahn, T. J. McMurry, M. Renner, L. Latos-Grazynsky, K. S. Eble, I. M.

85

Davis, A. L. Balch, J. T. Groves, J. R. Dawson and K. O. Hodgson (1983) J. Biol. Chem. 258, 12761-12764. (b) J. T. Groves, R. Quinn, T. J. Lang and B. Boso (1984) J. Chem.

Soc., Chem. Commun. 1984, 1455-1456. (c) B. Boso, G. Lang, T. J. McMurry and J. T. Groves (1983) J. Chem. Phys. 79, 1122-1126. (d) J. E. Penner-Hahn, S. Eble, T. J. McMurry, M. Renner, A. L. Balch, J. T. Groves, J. R. Dawson and K. O. Hodgson (1986) J. Am. Chem. Soc. 108, 7819-7825. [22] Y. Watanabe, J. T. Groves (1992) Molecular mechanism of oxygen activation by cytochrome P450: The Enzymes 3rd ed., Vol. XX, pp. 406-453, Academic Press, New York. [23] J. T. Groves, S. Krishnan, G. E. Avaria and T. E. Nemo (1980) Adv. Chem. Ser. 191, 277-289. [24] (a) J. T. Groves, G. A. McClusky, R. E. White and M. J. Coon (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 81, 154-160. (b) R. E. White, J. P. Miller, L. V. Favreau and A. Bhattacharya (1986) J. Am. Chem. Soc. 108, 6024-6031. [25] M. Murray, K. Hetnarski and C. F. Wilkinson (1985) Xenobiotica 15, 369-379. [26] P. R. Ortiz de Montellano, B. L. K. Mangold, C. Wheeler, K. L. Kunze and N. O. Reich (1983) J. Biol. Chem. 258, 4202-4207. [27] P. R. Ortiz de Montellano and E. A. Komives (1985) J. Biol. Chem. 260, 3330-3336. [28] D. Covey Aromatase inhibitors: specific inhibitors of oestrogen biosynthesis. In: M. Berg & M. Plempel (eds) Sterol biosynthesis inhibitors. pp. 534-571. Ellis Horwood, Cambridge. [29] D. M. Jerina, J. W. Daly (1974) Science 185, 573-582. [30] J. A. Hinson, S. D. Nelson, J. R. Gillette (1979) Mol. Pharmacol. 15, 419-427. [31] T. Ohe, T. Mashino, M. Hirobe (1994) Arch. Biochem. Biophys. 310, 402-409. [32] C. A. Mulin and J. G. Scott (eds) Molecular mechanism of insecticide resistance. (1992) ACS Symp. Series No. 505, Am. Chem . Soc., Washington DC. [33] E. Hodgson, R. L. Rose, D. K. S Goh, G. C. Rock and R. M. Roe (1993) Biochem. Soc. Trans. 21, 1060-1065. [34] M. E. Elderfrawi, R. Miskus and V. Sutcher (1960) J. Econ. Entomol. 53, 231-234. [35] K. A. Hassal (1990) The biochemistry and use of pesticides. pp. 124, VCH, Weinheim. [36] P. F. Dowd, C. C. Gagne and T. C. Sparks (1987) Pestic. Biochem. Physiol. 28, 9-16; and E. Hodgson & R. L. Rose (1991) In: E. Arinc, J. B. Schenkman, E. Hodgson (eds) Molecular aspect of monooxygenases and bioactivation of toxic compounds. Plenum Press, London. 86

[37] F. T. Bonner and G. Stedman: The Chemistry of Nitric Oxide and Redox-related Species (1996) Methods in Nitric Oxide Research (eds. M. Feelisch and J. S. Stamler) pp.3-19. John Wiley & Sons, New York. [38] M. B. Hansen, L. S. Dresner and R. B. Wait (1998) Physiol. Res. 47, 307. [39] N. Agnihotri, J. C. Lopez-Garcia, R. D. Hawskins and O. Arancio (1998) Histol. Histopathol. 13, 1155. [40] G. C. Brown (1999) Biochim. Biophys. Acta: Bioenerget. 1411, 351. [41] J. E. Albina and J. S. Reichner (1998) Cancer Metastasis Rev. 17, 39. [42] N. S. Shah and T. R. Billar (1998) Environ. Health Perspect. 106, 1139. [43] F. Cosentino, and T. F. Luscher (1998) J. Cardiovasc. Pharmacol. 32, s54. [44] C. K. M. Hammerman (1998) Clin. Perinatol. 25, 757. [45] B. Hemmers and B. Mayer (1998) Nitric Oxide Protocols (ed. M. A. Titheradge) p. 1. Humana, Totowa, NJ. [46] (a) H. G. Korth, R. Sustmann, C. Thater, A. R. Butler and K. Ingold (1994) J. Biol. Chem. 269, 17776. (b) J. M. Hevel and M. A. Marletta: Vol. 338 (1993) Advances in Experimental Medicine and Biology (eds. J. E. Ayling, M. G. Nair and C. M. Baugh) p. 285., Plenum Press, New York. [47] C. J. Parli, N. Wang and R. E. McMahon (1971) J. Biol. Chem. 246, 6953. [48] (a) A. M. Leone, R. M. Palmer, R. G. Knowles, P. L. Francis, D. S. Ashton and S. Moncada (1991) J. Biol. Chem. 266, 23790. (b) N. Y. Kwon, C. F.Nathan, C. Gilker, O. W. Griffith, D. E. Matthews and D. J. Stuehr (1990) J. Biol. Chem. 265, 13442. [49] (a) N. Bec, A. C. F. Gorren, C. Voelker, B. Mayer and R. Lange (1998) J. Biol. Chem. 273, 13502. (b) P. Klatt, K. Schmidt and B. Mayer (1993) J. Biol. Chem. 268, 14781.

[50] M. Akhtar, P. LeeRobichaud, M. E. Akhtar and J. N. Wright (1997) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 61, 127. [51] (a) J. T. Groves, T. E. Nemo and R. S. Myers (1979) 101, 1032. (b) D. Mansuy, J. F. Bartoli and M. Momenteau (1982) Tetrahedron Lett. 23, 2781. (c) J. T. Groves and T. E. Nemo (1983) J. Am. Chem. Soc. 105, 6243-6248. (d) J. F. Bartoli, P. Battion and D. Mansuy (1991) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 440. [52] (a) C. Crestini, R. Saladino, P. Tagliatesta and T. Boschi (1999) Bioorg. Med. Chem. 7, 1897-1905. (b) F. Cui, T. Wijeskera and D. Dolphin (1993) 30, 15-26. (c) M. Shimada, T. Habe, T. Higuchi, T. Okanoto and B. Panijpan (1977) Holzforschung 41, 277-285. (c) M. Shimada, T. Habe, T. Umezawa and T. Higuchi (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 122, 1247-1252. 87

[53] C. Y. Wang, M. H. Douglas and J. T. Groves (1999) J. Am. Chem. Soc. 121, 1209412103. [54*] Gy. M. Keserű, Gy. T. Balogh and T. Karancsi (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 1775-1777. [55] (a) S. Defrance and B. Meunier (1992) New J. Chem. 16, 1015-1016. (b) P. J. F. Gauuan, M. P. Trova, L. Gregor-Boros, S. B. Bocckino, J. D. Crapo and B. J. Day (2003) Bioorg. Med. Chem. (article in press) (c) D. Ricard, M. L’Her, P. Richard and B. Boitrel (2001) Chem. Eur. J. 7(15), 3291-3297 [56] (a) G. M. Ramos Tombo and D. Bellus (1991) Angew. Chem. 30, 1193. (b) J. T. Groves and P. Viski (1990) J. Org. Chem. 55, 3628. (c) J. T. Groves and P. Viski (1989) J. Am. Chem. Soc. (1989) 111, 8537. (d) J. T. Groves and R. S. Myers (1983) J. Am. Chem. Soc. 105, 5791. (e) R. M. Hanson (1991) Chem. Rev. 91, 437. [57] (a) K. Suda, T. Umehara and F. Hino (1990) Chem. Pharm. Bull. 38, 839. (b) K. Suda, M. Sashima, M. Izutsu and F. Hino (1994) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 949. [58] (a) S. Tangestaninejad and V. Mirkhani (1999) J. Chem Research (S), 370-371. (b) T. Takanami, R. Hirabe, M. Ueno, F. Hino and K. Suda (1966) Chem. Lett. 1031. [59] (a) H. Firouzabadi, A. R. Sardarian, Z. Khayat, B. Karami and S. Tangestaninejad (1997) Synth. Commun. 27, 2709. (b) H. Firouzabadi, Z. Khayat, A. R. Sardarian and S. Tangestaninejad (1996) Iran J. Chem. Chem. Eng. 15, 54. [60] B. Meunier: General Overview on Oxidations Catalyzed by Metalloporphyrins (1994) Metalloporphyrins Catlyzed Oxidations (eds. F. Montanari and L. Casella) pp. 1-4. Kluwer Academic Publishers. Nederlands. [61] (a) R. W. Wanger, P. A. Brown, T. E. Johnson and J. S. Lindsey (1991) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1463-1466. (b) R. P. Bonar-Law and J. K. M. Sanders (1991) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 574-577. (c) C. H. Lee and C. K. Lee (1992) Bull. Korean Chem. Soc. 13, 352-354. [62] (a) J. Among, J. E. Baldwin, R. L. Dyer and M. Peters (1975) J. Am. Chem. Soc. 97, 226-227. (b) W. F. K. Schnatter, Ö. Almarsson and T. C. Bruice (1991) Tetrahedron 47, 8687-8700. (c) H. Y. Zhang, A. Blaskó, J. Q. Yu and T. C. Bruice (1992) J. Am. Chem. Soc. 114, 6621-6630. [63] (a) J. P. Collman, R. R. Gagne, T. R. Halbert, J. C. Marchon, C. A. Reed (1973) J. Am. Chem. Soc. 95, 7868. (b) B. Morgan and D. Dolphin (1987) Structure and Bonding 64, 115. (c) L. Weber, I. Imiolczyk, G. Haufe, D. Remorek and H. Hennig (1992) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 301. 88

[64] (a) G. L. Labat and B. Meunier (1989) New J. Chem. 13, 801. (b) G. L. Labat and B. Meunier (1989) J. Org. Chem. 54, 5008. (c) Y. Sato, M. Satouchi, M. Mifume, T. Tai, J. Odo, Y. Tanaka, M. Chikuma and H. Tanaka (1987) Bull. Chem. Soc. Jpn. 60, 2227. [65] (a) S. Jeon and T. C. Bruice (1992) Inorg. Chem. 31, 4843. (b) N. Herron (1988) 19, 25. (c) M. Nakamura, T. Tatsumi and H. Tominaga (1990) Bull. Chem. Soc. Jpn. 63, 3334. [66] (a) S. Fukuzumi, S. Mochizuki and T. Tanaka (1987/88) Isr. J. Chem. 28, 29. (b) T. Tatsumi, M. Nakamura and H. Tominaga (1989) Chem. Lett. 419. (c) P. R. Cooke and J. R. Lindsay Smith (1992) Tetrahedron Lett. 33, 2737. [67] B. Meunier: Oxidations Catalyzed by supported metalloporphyrins (1994) Metalloporphyrins Catlyzed Oxidations; (eds. F. Montanari and L. Casella) pp. 25-28. Kluwer Academic Publishers. Nederlands. [68*] Gy. M. Keserű,Gy. T. Balogh,I. Czudor,T. Karancsi, A. Fehéra and B. Bertók (1999) J. Agric. Food. Chem. 47(1-2), 762-769. [69*] Gy. M. Keserű, Gy. T. Balogh, S. Bokotey, G. Árvai and B. Bertók (1999) Tetrahedron 55, 4457-4466.

[70] (a) T. G. Traylor, T. Nakano, B. E. Dunlap, P. S. Traylor and D. Dolphin (1986) 108, 2782. (b) J. T. Groves and W. J. Kruper (1979) J. Am. Chem. Soc. 101, 7613. (c) K. Srinivasa, P. Michaud and J. K. Kochi (1986) J. Am. Chem. Soc. 108, 2309. [71] (a) J. R. Lindsay Smith and D. N. Mortimer (1985) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 410. (b) B. R. Cook, T. J. Reinert and K. S. Suslick (1986) J. Am. Chem. Soc. 108, 7281. (c) P. E. Ellis and J. E. Lyons (1989) ) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1187. [72] (a) B. R. James, S. R. Mikkelsen, T. W. Leung, G. H. Williams and R. Wong (1984) Inorg. Chim. Acta 85, 209. (b) J. T. Groves and K. H. Ahn (1987) Inorg. Chem. 26, 3831. (c) J. T. Groves and R. Quinn (1984) Inorg. Chem. 23, 3844-3846. [73] N. Rajapakse, B. R. James and D. Dolphin (1990) Stud. Surface Sci. Catal. 55, 109. [74] N. Rajapakse (1990) Ph. D. Dissertation, University of British Columbia, Vancouver. [75] (a) T. Higuchi, H. Ohtake and M. Hirobe (1991) Tetrahedron Lett. 32, 7435. (b) J. S. Huang, C. M. Che, Z. Y. Li and C. W. Poon (1992) Inorg. Chem. 31, 1313. [76] N. Rajapakse, B. R. James and D. Dolphin (1989) Catal. Lett. 2, 219. [77] (a) B. R. James (1986) Fundamental Research in Homogeneous Catalysis (ed.) A. E. Shilov) Vol. 1, p. 309. Gordon & Breach, New York. (b) J. T. Groves (1992) Proc. 8th Intern. Symposium on Homog. Catal., Amsterdam, Lecture K-6. (c) J. C. Marchon and R. Ramasseul (1988) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 298. [78] (a) M. Ke, C. Sishta, B. R. James, D. Dolphin and J. W. Sparapany (1991) Inorg. Chem. 89

30, 4766. (b) H. Ohtake, T. Higuchi and M. Hirobe (1992) J. Am. Chem. Soc. 114,

10660. [79] T. Mlodnicka and B. R. James: Oxidation Catalyzed by Ruthenium; (1994) Metalloporphyrins Catalyzed Oxidations (eds. F. Montanari and L. Casella) pp. 25-28. Kluwer Academic Publishers. Nederlands. [80] (a) B. Meunier (1992) New J. Chem. 16, 203. (b) B. R. Cook, T. J. Reinert and K. Suslick (1986) J. Am. Chem. Soc. 108, 7581. (c)* M. Nappa and C. A. Tolman (1985) Inorg. Chem. 24, 4711. [81] A. Robert and B. Meunier (1988) New J. Chem. 12, 885. [82] (a) P. A. Loach and M. Calvin (1963) Biochemistry 2, 361. (b) Y. Adam, J. Bernadou and B. Menuier (1992) New J. Chem. 16, 525-528. (c) J. Bernadou and B. Menuier (1998) Chem. Commun. 2167-2173. [83] P. Rothemund and A. R. Menotti (1941) J. Am. Chem. Soc. 63, 267-270. [84] A. D. Adler, F. R. Longo, J. D. Finarelli, J. Goldmacher, J. Assour and L. Korsakoff (1967) J. Org. Chem. 32, 476. [85] J. S. Lindsey, I. C. Schreiman, H. C. Hsu, P. C. Kearney and A. M. Margeuerettaz (1987) J. Org. Chem. 52, 827-836. [86] (a) K. Yamaguchi, K. Watanabe and I. Morishima (1992) inorg. Chem. 31, 156-157. (b) T. Higuchi, S. Uzu and M. Hirobe (1990) J. Am. Chem. Soc. 112, 7051-7053. (c) T. Higuchi, K. Shimada, N. Maruyama and M. Hirobe (1993) J. Am. Chem. Soc. 115, 7551-7552. (d) S. I. Adachi, S. Nagano, K. Ishimori, Y. Watanabe, I. Morishima, T. Egawa, T. Kitagawa and R. Makino (1993) Biochemistry 32, 241-252. (e) J. H. Dawson, R. H. Holm, J. R. Trudell, G. Brath, R. E. Linder, E. Bunnenberg, C. Djerassi and S. C. Tang (1976) J. Am. Chem. Soc. 98, 3707-3709. [87] Gy. M. Keserű, I. Kolossváry and B. Bertók (1997) J. Am. Chem. Soc. 119, 5127. [88] (a) I. Tabushi and N. Koga (1979) Tetrahedron Lett. 19, 3681. (b) E. Guilmet and B. Meunier (1980) Tetrahedron Lett. 21, 4449. [89] (a) J. Haber, L. Matachowski, K. Pamin and J. Poltowicz (2000) J. Mol. Catal. A: Chemical 162, 105-109. (b) A. Thellend, P. Battioni, W. Sanderson and D. Mansuy (1997) Synthesis 1387. (c) A. Thellend, P. Battioni, D. Mansuy (1994) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1035. (d) M. J. Nappa and C. A. Tolman (1985) Inorg. Chem. 24, 4711-4719. (e) W. Nam, M. H. Lim, S. Y. Oh, J. H. Lee, H. J. Lee, S. K. Woo, C. Kim and W. Shin (2000) Angew. Chem. Int. Ed. 39(20), 3646-3649. [90] (a) M. J. Beck, E. Gopinath and T. C. Bruice (1993) J. Am. Chem. Soc. 115, 21-29. (b) 90

H. Patzelt and W. D. Woggon (1992) Helv. Chim. Acta 75, 523-530. [91] (a) J. E. Lyons, P. E. Ellis and H. K. Myers (1995) J. Catal. 155, 59. (b) L. J. Boucher (1973) Ann. N. York. Acad. 408. [92] (a) J. T. Groves, Z. Gross and M. K. Stern (1994) Inorg. Chem. 33, 5065-5072. (b) C. M. Dicken, F. L. Lu, M. W. Nee and T. C. Bruice (1985) J. Am. Chem. Soc. 107, 57765789. (c) B. De Poorter, M. Ricci and B. Meunier (1985) Tetrahedron Lett. 26, 44594462. (d) B. De Poorter, M. Ricci and B. Meunier (1985) J. Mol. Catal. 31, 221-224. (e) P. Battioni, J. P. Renaud, J. F. Bartoli and D. Mansuy (1986) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 341-343. [93] (a) I. Tabushi (1988) Coord. Chem. Rev. 86, 1-42. (b) P. Battioni, J. F. Bartoli, P. Leduc, M. Fontecave and D, Mansuy (1987) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 791-792. (c) D. Mansuy (1993) Coord. Chem. Rev. 125, 129-141. [94] J. T. Groves and R. Quinn (1985) J. Am. Chem. Soc. 107, 5790-5792. [95] (a) D. H. Chin, A. L. Balch and G. N. LaMar (1980) J. Am. Chem. Soc. 102, 4344-4350. (b) A. L. Balch, Y. W. Chan, R. J. Chen, G. N. LaMar, L. Latos-Grazynsky and M. W. Renner (1985) J. Am. Chem. Soc. 106, 7779-7785. (c) A. L. Balch L. Latos-Grazynsky and M. W. Renner (1985) J. Am. Chem. Soc. 107, 2983-2985. [96] (a) J. T. Groves and Y. Z. Han: Models and Mechanism of Cytochrome P450 Action (1995) Cytochrome P450: Structure, Mechanism and Biochemistry (ed. P. R. Ortiz de Montellano) p. 11. Plenum Press, New York. (b) T. J. McMurry and J. T. Groves: Metalloporphyrin models for cytochrome P450 (1986) Cytochrome P450: Structure, Mechanism and Biochemistry (ed. P. R. Ortiz de Montellano) pp. 1-28. Plenum Press, New York. [97] (a) J. T. Groves and D. V. Subramanian (1984) J. Am. Chem. Soc. 106, 2177. (b) K. M. Fish, G. E. Avaria and J. T. Groves: Rearrangement of alkyl hydroperoxides mediated by cytochrome P-450. Evidence for the oxygen rebound mechanism (1988) Microsomes and Drug Oxidations (eds. J. O. Miners, D. J. Birkett, R. Drew, B. K. May and M. E. McManus) pp. 176-183. Taylor & Francis, London. (c) A. D. N. Vaz and M. J. Coon (1994) Biochemistry 33, 6442-6449. [98] (a) E. Baciocchi and A. Lapi (1999) Tetrahedron Lett. 40, 5425-5428. (b) E. Baciocchi, O. Lanzalunga, A. Lapi and L. Manduchi (1998) J. Am. Chem. Soc. 120, 5783-5787. (c) Y. Goto, Y. Watanabe, S. Fukuzumi, J. P. Jones and J. P. Dinnocenzo (1998) J. Am. Chem. Soc. 120, 10762-10763. 91

[99] J. E. Scott: Secondary Structure in Hyaluronan Solutions: Chemical and Biological implication (1989) The Biology of Hyaluronan Ciba Foundation Symposium 143 (ed. T. C. Laurent) pp. 6-20. John & Wiley, Chichester, UK. [100] (a) C. L. Hew and D. S. C. Yang (1992) Eur. J. Biochem. 203, 33-42. (b) Q. Liu and J. W. Brady (1996) J. Am. Chem. Soc 118, 12276-12286. (c) H. G. Lee and M. K. Cowman (1994) Anal. Biochem. 219, 278-287. (d) H. Min and M. K. Cowman (1986) Anal. Biochem. 155, 275-285. [101] H. Bother and O. Wik (1987) Acta Octolaryngol. 442, 25-30. [102] H. B. Wik and O. Wik: Rheology of Hyaluronan (1998) The Chemistry, Biology and Medical Applications of Hyaluronan and its Derivetives (ed. T. C. Laurent) pp. 25-32. Portland Press, London. [103] K. Burger, J. Illés, B. Gyurcsik, M. Gazdag, E. Forrai, I. Dékány and K. Mihályfi (2001) Carbohydrate Res. 332, 197-207. [104] M. Tamaki, Y. Chikako, O. Satoshi (1998) J. Appl. Polymer Sci. 67(13), 2199-2206. [105] U. B. G. Laurent and J. R. E. Fraser (1983) Exp. Eye Res. 36, 493-504. [106] (a) R. K. Reed, K. Lilja and T. C. Laurent (1988) Acta Physiol. Scand. 134, 405-411. (b) A. Tengblad, U. B. G. Laurent and K. Lilja (1986) Biochem. J. 236, 521-525. [107] K. Meyer and J. W. Palmer (1934) J. Biol. Chem. 107, 629-634. [108] K. Meyer (1947) Physiol. Rev. 27, 335-359. [109] K. Burger, G. Takácsi-Nagy, J. Illés and B. Stefkó(20 Feb. 1990)EP. No. 413016 B1. [110] (a) H. Shuji, N. Masanori, S. Mitsuru, Y. Shinya, H. Susumu (1999) J. Biosci. Bioeng. 88(1), 68-71. (b) R. Berkholz, D. Rohlig, R. Guthke (2001). Enzyme and Microbial

Technol. 27(10), 784-788. (c) D. C. Ellwood, C. G. T. Evans, G. M. Dunn, N. McInnes, R. G. Yeo, K. J. Smith (1992) PCT Int. Appl. WO 9208799 A1 29 [111] (a) N. Rydell and E. A. Balázs (1971) Clin. Orthoped. 80, 25-32. (b) J. G. Peyron and E. A. Balázs (1974) Pathol. Biol. 22, 731-736. [112] E. A. Balázs: The viscoelstic intracellular matrix and control of the cell function by hyaluronan (1998) The chemistry, Biology and Medical Applications of Hyaluronan and its Derivatives (ed. T. C. Laurent) pp. 185-205. Portland Press, London. [113] (a) M. Mörgelin, D. Heinegard, J. Engel and M. Paulsson (1994) Biphys Chem. 50, 113-128. (b) M. Mörgelin, M. Paulsson, A. Malström and D. Heinegard (1989) J. Biol. Chem. 264, 12080-12090. (c) U. Specks, U. Mayer, R. Nischt, T. Spissinger, K. Mann, R. Timpl, J. Engel and M. L. Chu (1992) EMBO J. 11, 4281-4290. [114] (a) B. F.Haynes, M. J. Telen, L. P. Hale and S. M. Denning (1989) Immunol. Today 10, 92

423-428. (b) B. F. Haynes, L. P. Hale, K. L. Patton, M. E. Martin and R. M. McCallum (1991) Arthritis Rheum. 34, 1434-1443. (c) C. Underhill (1992) J. Cell Sci. 103, 293298. [115] (a) S. Gupta, R. B. Batchung and K. Datta (1991) Eur. J. Cell. Biol. 56, 58-67. (b) P. Prehm (1995) Ann. Rheum. Dis. 54, 408-412. (c) Z. Hrkal, K. Kuzelova, U. MullerEberhard and R. Stern (1996) FEBS Lett. 383, 72-74. (d) D. Kohda, C. J. Morton, A. A. Parkar, H. Hatanaka, F. M. Inagaki, L. D. Cambell and A. J. Day (1996) Cell 86, 767775. [116] J. Y. Lee and A. P. Spicer (2000) Curr. Opin. Cell Biol. 12, 581-586. [117] (a) M. S. Insler, (1985) Ann. Ophthalmol. 106-108. (b) J. R. Toczolowski (1987) Ophthalmol.Surg. 18(3), 214-216. (c) A. S. Holmberg and B. T. Philipson (1984) Ophthalmology 91, 53-59. [118] (a) K. Sakurai et al. (1997) Jpn. J. Pharmacol. 74, 117-120. (b) A. Ialenti and M. Di Rosa (1994) Agents Actions 43, 44-47. (c) P. Venge et al. (1996) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153, 312-316. (d) C. Zeng et al. (1998) Int. J. Cancer 77, 396-401. (e) M. Dougados (2000) Arthritis Rheum. 30, 19-25. [119] (a) L. Paimela et al. (1991) Arthritis Rheum. 34(7), 815-821. (b) T. C. Laurent, U. B. R. Laurent and J. R. Fraser (1996) Ann. Med. 28, 241-253. (c) M. Tischler et al. (1998) Ann. Rheum. Dis. 57, 506-508. (d) J. G. McHutchinson et al. (2000) J. Gastroenterol. Hepatol. 15, 945-951. [120] (a) R. A. Miller and B. E. Britigan (1995) J. Invest. Med. 43, 39-49. (b) M. Li et al. (1997) Arch. Biochem. Biophys. 341, 245-250. (c) M. Jahn, J. W. Baynes and G. Spiteller (1999) Carbohydr. Res. 321, 228-234. (d) S. F. Wong et al. (1981) J. Inorg. Biochem. 14, 127-134. [121] (a) C. von Sonntag et al. (1976) Naturforsch 45c, 1031. (b) H. Zegota and C. von Sonntag (1977) Z. Naturforsch. 32b, 1060. (c) M. N. Schuchmann and C. von Sonntag (1978) Int. J. Radiat. Biol. 34, 397. [122] (a) W. H. Betts and L. G. Cleland (1982) Arthrit.Rheum. 25(12), 1469-1476. (b) V. Deguine, M. Menasche, L. Fraisse, P. Ferrari, Y. Pouliquen and L. Robert (1997) Clin. Chim. Acta 262, 147-152. (c) H. Uchiyama, Y. Dobashi, K. Ohkouchi and K. Nagasawa (1990) J. Biol. Chem. 265(14), 7753-7759. [123] P. A. Frey: Vitamins, Coenzymes and Metal Cofactors (1993) Biochemistry (ed. G. L. Zubay) pp. 278-302. W. C. Brown Publishers, dubuque, Iowa. [124] (a) S. A. Linehan, D. W. Holden (2003) Immunol. Lett. 85(2), 183-92. (b) G. Karupiah, 93

N. H. Hunt, N. J. King, G. Chaudhri (2000) Rev. Immunogenet. 2(3), 387-415. (c) A. Vazquez-Torres, J. Jones-Carson, P. Mastroeni, H. Ischiropoulos, F. C. Fang (2000) J. Exp. Med. 192(2), 227-36. [125] (a) H. Weixiong, A. Aneman, U. Nilsson, O. Lundgren (1994) Acta Physiol. Scand. 150(3), 241-50. (b) E. Roche, D. Romero-Alvira (1994) Med. Hypotheses 142(2), 105-

9. (c) P. A. Riley (1994) Int. J. Radiat. Biol. 65(1), 27-33. [126] (a) A. Boveris and E. Cadenas: Production of Superoxide Radicals and Hydrogen Peroxide in Mitochondria (1982) Superoxide Dismutase (ed. L. W. Oberley), CRC Press, Boca Raton, Fl. (b) H. J. Forman and A. Boveris: Superoxide Radical and Hydrogen Peroxide in Mitochondria (1982) Free Radicals in Biology (ed. V. W. A. Pryor) pp. 65-90. Academic Press, New York. (c) W. W. Parson: Electron Transport and Oxidative Phosphorylation (1993) Biochemistry (ed. G. L. Zubay) pp. 379-413. W. C. Brown Publishers, dubuque, Iowa. [127] A. Naqui, B. Chance and E. Cadenas (1986) Ann. Rev. Biochem. 55, 137. [128] H. J. Forman and M. J. Thomas (1986) Ann. Rev. Physiol. 48, 669. [129] (a) B. Chance, H. Sies and A. Boveris (1979) Physiol. Rev. 59, 527-605. (b) I. Fridovich (1995) Ann. Rev. Biochem. 64, 97-112. [130] (a) S. Johnson (2000) Med. Hypoth. 55, 242-244. (b) C. R. Wade, P. G. Jackson, J. Highton and A. M. van Rij (1987) Clin. Chim. Acta 164(3), 245-250. [131] (a) G. Perry et al. (2002) Free Rad. Biol. Med. 33(11), 1475,1479. (b) C. Cecchi, C. Fiorillo, S. Sorbi, S. Latorraca, B. Nacmias, S. Bagnoli, P. Nassi and G. Liguri (2002) Free Rad. Biol. Med. 33(10), 1372-1379. [132] (a) A. Cross, P. T. Manning, R. M. Keeling, R. E. Schmidt and T. P. Misko (1998) J. Neuroimmunol. 88(1-2), 45-56. (b) K. J. Sith and H. Lassmann (2002) The Lancet Neurology 1(4), 232-241. [133] (a) E. A. Offord, J.-C. Gautier, O. Avanti, C. Scaletta, F. Runge, K. Kramer and L. A. Applegate (2002) Free Rad. Biol. Med. 32(12),1293-1303. (b) A.-L. Bulteau, M. Moreau, C. Nizard and B. Friguet (2002) Free Rad. Biol. Med. 32(11), 1157-1170. [134] (a) M. Nikishimi, N. A. Rao and K. Yaki (1972) Biochem. Biophys. Res. Commun. 46, 849. [135] B. Taldolini and L. Cabrini (1990) Mol. Cell. Biochem. 94, 97-104. [136] (a) B. Halliwell, J. M. Gutteridge: Free Radical in Biology and Medicine, 3th. Ed. (1999) Oxford University Press, New York. (b) G. Bartosz et al. (1998) Biochem. Mol. Biol. Int. 46(3), 519-528. 94

[137] (a) G. G. A. Balavoine and Y. V. Geletii (1999) Nitric Oxide 3, 40-54. (b) V. B. Bhat and K. M. Madyastha (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 285, 262-266. [138] R, J. Kuhr, H. W. Dorough (1976) Carbamate Insecticides: Chemsitry, Biochemistry and Toxicology. Chapter 6 CRC Press, Cleveland, USA. [139] R. C. Metcalf, K. Borck, S. A. El-Aziz Munoz, C. C. Casillo, (1968) J. Agric. Food Chem. 16, 300-311. [140] (a) H. W. Dorough and J. E. Casida (1964) J. Agric. Food Chem. 12, 294-304. (b) J. B. Knaak, M. J. Tallant, W. J. Bartley and L. J. Sullivan (1965) J. Agric. Food Chem. 13,537-543.

[141] The Pesticide Manual (1997) 11th Edition, British Crop Protection Council, Farnham, UK. [142] M. H. Balba, M. S. Singer, M. Slade and J. E. Cassida, J. E. (1968) J. Agric. Food Chem. 16, 821-825. [143] M. E. Jung and M. A. Lyster (1977) J. Org. Chem. 42, 3761-3763. [144] R. C. Metcalf, K. Borck, S. A. El-Aziz Munoz and C. C. Casillo (1968) J. Agric. Food Chem. 16, 300-311. [145] (a) R. A. Johnstone, P. G. Nunes, M. M. Pereira and M. A. R. Gonsalves (1996) Heterocycles 43, 1423-1437. (b) M. S. Chorghade, D. A. Dezaro, D. R. Hill, E. C. Lee, R. J. Pariza, J. V. Andersen, K. T. Hansen and D. H. Dolphin (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4, 2867-2870. [146] P. A. MacFaul, I. W. Arends, K. U. Ingold, D. M. Wayner (1997) J. C. S. Perkin Trans. 2, 135-144.

[147] M. S. Chorghade, D. A. Dezaro, D. R. Hill, E. C. Lee, R. J. Pariza, J. V. Andersen, K. T. Hansen and D. H. Dolphin (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4, 2867-2870. [148] I. Artaud, K. Ben-Aziza and Mansuy (1993) J. Org. Chem. 58, 3373-3380. [149] H. J. Benezet, F. Matsumura F. (1974) J. Agric. Food Chem. 22(3), 427-30. [150] D. J. Brown (1994) The Pyrimidines. The Chemistry of Heterocyclic Compounds. Vol. 52, Wiley Interscience, New York, USA, pp. 542-545. [151] I. Székely, L. Pap, B. Bertók (1997) B. Proc. Brighton Crop. Prot. Conf. – Pests. Dis. 1996, Vol. 2 473-480. CA 126, 86068. [152] E. Baciocchi, S. Belvedere and M. Bietti (1998) Tetrahedron Lett. 39, 4711-4714. [153] I. Artaud, K. Ben-Aziza, C. Chopard and D. J. Mansuy (1991) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 31-33. [154] P. J. Kersten, M. Tien, B. Kalyanaraman and T. K. Kirk (1985) J. Biol. Chem. 260, 95

2609. [155] I. Artaud, K. Ben-Aziza and D. Mansuy (1993) J. Org. Chem. 58, 3373-3380. [156] P. Anzenbacher, T. Niwa, L. M. Tolbert, S. Sirimanne and F. P. Guengerich (1996) Biochemistry 35, 2512. [157] T. L. Poulos, B. C. Finzel and A. J. Howard (1987) J. Mol. Biol. 195, 697-700. [158] T. L. Poulos, S. L. Edwards, H. Wariishi and and M. H. Gold (1993) J. Biol. Chem. 268, 4429-4440.

[159] P. R. Ortiz de Montellano (1992) Ann. rev. Pharmacol. Toxicol. 32, 89-107. [160] P. F. Hollenberg, P. F. (1992) FASEB J. 6, 686-694. [161] A. R. Dahl and E. Hodgson (1979) Chem. Biol. Interact. 27, 163-175. [162] S. J. Rasmussen, N. Chung, A. Khindaria, T. A. Grover and S. D. Aust (1995) Arch. Biochem. Biophys. 320, 243-249. [163] D. K. Joshi, and M.H. Gold (1996) Eur. J. Biochem. 237, 45-57. [164] U. Tuor, H. Wariishi, H. E. Schoemaker and M. H. Gold (1992) Biochemistry 31, 49864995. [165] J. Trojanowski, M. Wojtas-Wasilewska and B. Junosza-Wolska (1970) Acta Microbiol. Pol. Ser. B. 19, 13-22. [166] (a) V. Andronik, J. L. Boucher, M. Delaforge, Y. Henry and D. Mansuy (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 185, 452. (b) J. P. Renaud, J. L. Boucher, S. Vadon, M. Delaforge and D. Mansuy (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 192, 53. [167] M. J. Clague, J. S. Wishnok and M. A. Marletta (1997) Biochemistry 36, 14465-14473. [168*] Gy. T. Balogh, J. Illés, Zs. Székely, E. Forrai and A. Gere (2003) Arch. Biochem. Biophys. 410(1), 76-82. [169] L. Nagy, S. Yamashita, T. Yamaguchi, P. Sipos, H. Wakita and M. Nomura (1998) J. Inorg. Biochem. 72, 49-55. [170] F. M. Pirisi, P. Cabras, V. L. Garau, M. Melis and E. Secchi (1996) J. Agric. Food. Chem. 44, 2417-2422.

96

Mellékletek a dolgozatban felhasznált saját közlemények

97