USULAN PROGRAM KREATIVITAS MAHASISWA JUDUL PROGRAM ATHEROX (Atherosclerosis Prevention using LOX-1 Protein Vaccine): PERANCANGAN VAKSIN ATEROSKLEROSIS SECARA IN SILICO BERBASIS PROTEIN LECTIN-LIKE OXIDIZED LDL RECEPTOR 1 (LOX-1) DAN UJI EFEKTIVITAS SECARA IN VIVO
BIDANG KEGIATAN: PKM - PENELITIAN
Diusulkan oleh:
Angi Nurkhairina
115070506111001
Angkatan 2011
Fredo Tamara
0910710077
Angkatan 2009
Oktavia Rahayu A
105070500111029
Angkatan 2010
Ardina Pramesti Putri
105070501111009
Angkatan 2010
Thoha Muhajir Albaar
125070100111063
Angkatan 2012
UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2014
i
PENGESAHAN USULAN PKM-PENELITIAN 1. Judul Kegiatan : ATHEROX (Atherosclerosis Prevention using LOX-1 Protein Vaccine): Perancangan Vaksin Aterosklerosis secara in silico Berbasis Protein Lectin-Like Oxidized LDL Receptor 1 dan Uji Efektivitas secara in vivo. 2. Bidang Kegiatan : PKM-P 3. Ketua Pelaksana Kegiatan a. Nama Lengkap : Angi Nurkhairina b. NIM : 115070506111001 c. Jurusan : Farmasi d. Universitas/Institut/Politeknik : Universitas Brawijaya e. Alamat Rumah dan No Tel./HP : Bend. Siguragura No. 51 A, Malang/087759633111 f. Alamat email :
[email protected] 4. Anggota Pelaksana Kegiatan/Penulis: 4 orang 5. Dosen Pendamping : a. Nama Lengkap dan Gelar : Valentina Yurina, S.Si.,M.Si b. NIDN : 0009028304 c. Alamat Rumah dan No Tel./HP : JL. Simpang Borobudur II/28, Malang 0817218927 6. Biaya Kegiatan Total a. Dikti : Rp 11.200.000 b. Sumber lain : Rp -7. Jangka Waktu Pelaksanaan : 4 bulan
ii
RINGKASAN Aterosklerosis merupakan penyebab utama penyakit kardiovaskuler seperti infark miokard, gagal jantung, dan stroke, yang menjadi permasalahan terbesar yang dihadapi bagi negara maju maupun negara berkembang. Aterosklerosis merupakan penyebab kematian nomor satu di dunia, termasuk Indonesia. Diperkirakan sekitar 17,1 juta orang (29% dari jumlah seluruh kematian di dunia) meninggal karena aterosklerosis, dan diestimasikan pada tahun 2030 hampir sekitar 23,6 juta orang akan meninggal karena aterosklerosis dengan peningkatan jumlah kematian yang paling besar terjadi di Asia Tenggara. Aterosklerosis merupakan suatu respon inflamasi kronik terhadap deposisi lipoprotein pada dinding arteri dimana pada aterosklerosis terjadi upregulasi dari lectin-like oxidized LDL receptor 1 (LOX-1), yang memediasi uptake OxLDL ke dalam intima. LOX-1 diekspresikan secara berlebihan di dalam pembentukan neovaskuler sel endotel. Namun, hingga saat ini terapi aterosklerosis yang ada seperti obat antiinflamasi seperti COX-2 inhibitor dan anti hiperlipidemia seperti statin, hanya bersifat menghambat progresivitas dari plak aterosklerosis, bukan mencegah pembentukannya. Untuk itu diperlukan tindakan preventif lainnya yang lebih efektif, yaitu dengan vaksinasi dimana paradigma vaksinasi saat ini hanya pada penyakit infeksi saja, namun beberapa penelitian terkini menunjukkan bahwa pembentukan antibodi terhadap suatu target tertentu memiliki potensi besar sebagai strategi pencegahan penyakit degeneratif. Berkembangnya pemanfaatan teknologi informatika biologi membuat berkembangnya jenis penelitian in silico, yaitu penelitian menggunakan komputer dan berhubungan dengan istilah biologi secara in vivo maupun in vitro, seperti pada vaksin generasi tiga. Penelitian ini ditujukan untuk menganalisis perancangan vaksin aterosklerosis LOX-1 secara in silico membuktikan pengaruh pemberian kandidat vaksin berbahan dasar protein LOX-1 terhadap peningkatan kadar antibodi anti-LOX-1, penurunan jumlah sel busa, dan penurunan ketebalan dinding pembuluh darah aorta pada model tikus Wistar (Rattus norvegicus) jantan yang diberikan diet aterogenik. Tahapan analisis in silico meliputi pencarian sekuens protein LOX-1, modeling protein, analisis antigenesitas, prediksi epitope, dan analisis potensi autoimunitas. Pada penelitian in vivo, tikus putih Wistar jantan berusia 68 minggu dikelompokkan menjadi 5 kelompok: Kn, Kp yang diberikan diet aterogenik, kelompok perlakuan yang diberikan LOX-1 200 ng/100 µL, LOX-1 200 ng/200 µL (LOX-1: alum = 1:1), dan alum 100 µL dan diberikan diet aterogenik. Injeksi vaksin dilakukan pada minggu ke-0, -2 dan -4. Setelah itu diberikan diet aterogenik selama 4 minggu untuk kelompok Kp dan perlakuan. Pembedahan dilakukan dan diambil pembuluh darah aorta dan darah kemudian dilakukan pembuatan pengukuran kadar antibodi anti-LOX-1 menggunakan ELISA, perhitungan jumlah sel busa dan penentuan ketebalan aorta menggunakan dari hasil slide pewarnaan HE. iii
Hasil pemeriksaan parameter uji kelompok kontrol dan perlakuan dianalisa secara statistik dengan menggunakan program IBM SPSS Statistics 20 dengan tingkat signifikansi 0,05 (p = 0,05) dan taraf kepercayaan 95% (α = 0,05) Langkah-langkah uji hipotesis komparatif dan korelatif adalah uji normalitas data, Uji homogenitas varian, Uji One-way ANOVA, Post hoc test dan Uji korelasi Pearson. Kata kunci: vaksin aterosklerosis; LOX-1; antibodi anti-LOX-1; sel busa; ketebalan aorta
iv
DAFTAR ISI Halaman Sampul .............................................................................................................................. i Halaman Pengesahan ........................................................................................................................ ii Ringkasan ......................................................................................................................................... iii Daftar Isi ........................................................................................................................................... v BAB I. PENDAHULUAN 1. Latar Belakang Masalah .......................................................................................................... 1 2. Rumusan Masalah .................................................................................................................... 2 3. Tujuan Penulisan ...................................................................................................................... 2 4. Luaran yang Diharapkan .......................................................................................................... 3 5. Kegunaan Program .................................................................................................................. 3 BAB II.TINJAUAN PUSTAKA 1. Aterosklerosis .......................................................................................................................... 3 2. Lectin-like Oxidized LDL Receptor 1 (LOX-1) ....................................................................... 4 3. Vaksinasi . ................................................................................................................................. 4 4. Metode in silico ....................................................................................................................... 4 BAB III. METODE PENELITIAN 1. Kerangka Konsep Penelitian .................................................................................................... 5 2. Rancangan Penelitian ............................................................................................................... 6 3. Variabel Penelitian ................................................................................................................... 7 4. Sampel Penelitian .................................................................................................................... 7 1. Studi in silico ....................................................................................................................... 7 2. Studi in vivo ......................................................................................................................... 7 5. Tempat Penelitian ..................................................................................................................... 8 6. Definisi Operasional ................................................................................................................ 8 BAB IV. HASIL YANG DICAPAI 1. Kemajuan Pekerjaan ................................................................................................................. 9 1. Analisis In Silico ................................................................................................................. 9 2. Preparasi dan Injeksi Vaksin ............................................................................................... 12 3. Pemberian Diet Aterogenik .................................................................................................. 12 4. Pengukuran Parameter ......................................................................................................... 13 2. Ketercapaian Target Luaran ...................................................................................................... 16 BAB V. RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA 1. Pengukuran Ketebalan Aorta ................................................................................................... 17 2. Analisis Data Variabel Ketebalan Aorta .................................................................................. 17 3. Persiapan Publikasi Artikel Ilmiah dan Paten ........................................................................... 17 DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 17 LAMPIRAN – LAMPIRAN Lampiran 1. Penggunaan Biaya ........................................................................................................ 18 Lampiran 2. Bukti-bukti Pendukung Kegiatan .................................................................................. 21
v
BAB 1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Masalah Aterosklerosis merupakan penyebab utama penyakit kardiovaskuler seperti infark miokard, gagal jantung, dan stroke, yang menjadi permasalahan terbesar bagi negara maju maupun negara berkembang (Tate, 2007). Aterosklerosis merupakan penyebab kematian nomor satu di dunia, termasuk di Indonesia. Diperkirakan sekitar 17,1 juta orang (29% dari jumlah seluruh kematian di dunia) meninggal karena aterosklerosis, dan diestimasikan pada tahun 2030 hampir sekitar 23,6 juta orang akan meninggal karena aterosklerosis dengan peningkatan jumlah kematian yang paling besar terjadi di Asia Tenggara (WHO, 2011). Menurut Depkes Indonesia tahun 2010, Indonesia memiliki angka prevalensi aterosklerosis hampir sebanyak 50%. Bahkan dinyatakan jumlah kematian akibat aterosklerosis justru lebih besar dibandingkan dengan jumlah kematian akibat kanker (Tate, 2007). Aterosklerosis merupakan respon inflamasi kronik terhadap deposisi kolesterol pada dinding pembuluh darah arteri. Oksidasi terhadap kolesterol jenis low density lipoprotein (LDL) memegang peranan penting dalam proses pembentukan plak aterosklerosis. LDL yang telah teroksidasi (Ox-LDL) difagosit oleh makrofag di dalam subendotel pembuluh darah dan menjadi sel busa. Sel busa yang teraktivasi akan menyebabkan sekresi sitokin proinflamasi dan faktor pertumbuhan, serta menginduksi apaptosis sel (Hansson, 2005). Lectin-like oxidized LDL receptor 1 (LOX-1) merupakan satu-satunya scavenger receptor yang terdapat pada sel endotel yang secara aktif berkontribusi terhadap semua tahap dari aterogenesis. LOX-1 memediasi uptake Ox-LDL ke dalam tunika intima sehingga mengarah kepada disfungsi sel endotel yang menyebabkan rangkaian peristiwa di dalam aterogenesis fase awal. Pada aterosklerosis terjadi peningkatan ekspresi LOX-1 yang berlebihan pada endotel (Pirillo et al., 2013). Hingga saat ini, terapi aterosklerosis berupa obat anti inflamasi dan antihiperlipidemia, hanya menghambat progresivitas dari plak aterosklerosis yang ada, bukan mencegah pembentukannya (Curtiss, 2009). Tindakan preventif seperti pola hidup sehat, konsumsi obat anti hiperlipidemia (statin), serta antioksidan dan vitamin, penting dalam pencegahan kejadian aterosklerosis (Brown et al., 2001). Namun, tindakan preventif yang dilakukan sering kali terlambat karena aterosklerosis dapat mulai berkembang pada masa remaja dan semakin progresif tanpa menunjukkan gejala (Caligiuri et al., 2007). Terapi preventif seperti statin pun, hanya dapat menurunkan risiko kurang dari sama dengan 40% (Nisson et al., 2009). Untuk itu, dibutuhkan usaha preventif lainnya untuk meminimalisasi terjadinya penyakit kardiovaskuler dengan mengidentifikasi sistem imun yang berperan pada aterosklerosis. Dari hasil penelitian yang ada membentuk cara berpikir kami untuk menemukan cara pencegahan aterosklerosis terbaru dengan metode vaksinasi. Paradigma vaksinasi saat ini hanya pada penyakit infeksi saja, namun beberapa penelitian terkini 1
menunjukkan bahwa pembentukan antibodi terhadap suatu target tertentu memiliki potensi besar sebagai strategi pencegahan penyakit degeneratif. Seiring berjalannya tahun, muncul penelitian terbaru yang telah mencoba mengembangkan vaksin untuk menginduksi imun protektif terhadap aterosklerosis. Penelitian Calliguri et al (2007), berfokus pada pembentukan antibodi spesifik terhadap phosphorylcholine (PC) pada OxLDL sehingga diharapkan mampu mencegah terbentuknya plak aterosklerosis. Pada tahun 2008, Fredrikson et al. mengembangkan vaksin aterosklerosis dengan target menginduksi autoantibodi apolipoprotein B-100 (apo B-100). Sedangkan di Indonesia sendiri pernah dikembangkan penelitian vaksin aterosklerosis menggunakan bakteri Salmonella thypimurium dengan target yang sama pada penelitian sebelumnya yaitu pembentukan melalui pembentukan antibodi anti-PC (Pratama, 2011). Beberapa penelitian terbaru menyatakan bahwa LOX-1 merupakan target utama untuk terapi aterosklerosis dan penyakit kardiovaskuler, namun hingga saat ini belum ada penelitian yang mengembangkan LOX-1 sebagai bahan vaksin. Berdasarkan data-data yang ada, penulis mencoba untuk mengembangkan vaksin berbasis protein LOX-1 untuk mencegah terjadinya aterosklerosis menggunakan pendekatan in silico yang kemudian diuji efektivitasnya secara in vivo. Berdasarkan data yang ada, kami membuat desain perancangan vaksin aterosklerosis yang kami istilahkan dengan nama “ATHEROX”. 1.2 Perumusan Masalah 1. Bagaimanakah hasil analisis perancangan vaksin aterosklerosis berbasis protein LOX-1
secara in silico? 2. Apakah pemberian ATHEROX mampu meningkatkan kadar antibodi anti-LOX-1,
menurunkan jumlah sel busa, menurunkan ketebalan dinding pembuluh darah aorta pada model tikus (Rattus norvegicus) galur Wistar yang diberikan diet aterogenik? 1.3 Tujuan Program Tujuan Umum : Memperoleh bukti bahwa protein LOX-1 dapat bermanfaat dalam mencegah terjadinya aterosklerosis sehingga dapat dikembangkan sebagai kandidat vaksin aterosklerosis. Tujuan Khusus : 1. Mengetahui hasil analisis perancangan vaksin aterosklerosis LOX-1 secara in silico. 2. Mengetahui pengaruh pemberian ATHEROX terhadap peningkatan kadar antibodi anti-
LOX-1, penurunan jumlah sel busa, dan penurunan ketebalan dinding pembuluh darah aorta pada model tikus (Rattus norvegicus) galur Wistar yang diberikan diet aterogenik.
2
1.4 Luaran yang Diharapkan Luaran yang diharapkan berupa publikasi dan HKI tentang perancangan vaksin aterosklerosis berbasis protein LOX-1 secara in silico dan efektivitasnya secara in vivo. 1.5 Kegunaan Program 1. Sebagai dasar teori untuk menambah wawasan ilmu pengetahuan dan dasar untuk pengembangan penelitian, khususnya potensi target terapi LOX-1 untuk vaksinasi. 2. Dasar teori untuk memberikan informasi kepada kalangan perindustrian vaksin tentang kegunaan LOX-1 sebagai bahan vaksin aterosklerosis. BAB II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Aterosklerosis Aterosklerosis adalah penyakit progresif yang merupakan suatu respon inflamasi kronik terhadap deposisi lipoprotein pada dinding arteri. Adanya plak aterosklerosis pada intima arteri akan menyebabkan dinding arteri menjadi kaku dan mengeras (Hansson, 2005). Patogenesis aterosklerosis, seperti pada Gambar 2.1, diawali oleh oksidasi LDL yang akan berinteraksi dengan LOX-1 pada permukaan sel endotel sehingga menyebabkan disfungsi endotel. Disfungsi endotel memfasilitasi adhesi monosit menuju sel endotel dan migrasi menuju subendotel dimana monosit akan berubah menjadi makrofag. Uptake OxLDL melalui scavenger receptor pada makrofag menyebabkan terjadinya sel busa yang berintegrasi membentuk garis lemak (Tate, 2007). Ikatan terhadap LOX-1 menyebabkan disfungsi endotel, pembentukan leukosit yang bersirkulasi, memicu pembentukan sel busa, migrasi dan proliferasi sel otot polos yang berkontribusi terhadap perkembangan plak aterosklerosis. Selanjutnya, interaksi juga akan berkontribusi ke destabilisasi plak melalui pengaruh apoptosis sel otot polos dan mengeluarkan MMPs (Pirillo et al., 2013).
Gambar 2.1. Perkembangan garis lemak (Tate, 2007). 3
2.2 Lectin-Like Oxidized LDL Receptor 1 (LOX-1) LOX-1 merupakan satu-satunya scavenger reseptor Ox-LDL pada sel endotel pembuluh darah. Reseptor Ox-LDL lainnya terdapat pada makrofag, seperti SR-AI/II, MARCO, CD36, SR-BI, CD68 dan SREC dimana jumlahnya sangatlah kecil dan bahkan tidak ditemukan pada permukaan sel endotel. Struktur LOX-1 pun berbeda dengan SR lainnya dimana LOX-1 diklasifikasikan sebagai C-type lectin-like protein dengan orientasi tipe II dan terdiri dari 4 domain (Gambar 2.2): sitoplasma, transmembran, NECK dan C-type lectin-like domain (CTLD). CTLD diidentifikasi sebagai domain pengenalan dan pengikatan terhadap OxLDL (Tate, 2007).
Gambar 2.2. Domain pada LOX-1 manusia (Tate, 2007). 2.3 Vaksinasi Vaksin dapat menginduksi imunitas melalui stimulasi dari pembentukan antibodi, imunitas seluler, maupun stimulasi keduanya. Perlindungan yang diinduksi oleh kebanyakan vaksin diyakini dimediasi secara primer oleh limfosit B, yang menghasilkan antibodi. Antibodi tersebut dapat menginaktivasi toksin, menetralkan virus dan mencegah penempelan ke reseptor seluler, memfasilitasi fagositosis, berinteraksi oleh komplemen, dan mencegah adhesi bakteri ke permukaan mukosa. Pada vaksin digunakan ajuvan seperti CFA-IFA atau alumunium hidroksida untuk menambah respon imun (Kliegman et al., 2007). 2.4 Metode in silico Istilah “in silico” sering digunakan untuk penelitian menggunakan komputer dan berhubungan dengan istilah biologi secara in vivo maupun in vitro (Ekins et al., 2007). In silico berasal dari kata silicon chips yang ada pada microprocessor komputer. Ilmu yang menunjang penelitian in silico untuk ahli biologi adalah bioinformatika yaitu suatu cabang ilmu yang menggabungkan Teknologi Informasi (TI) dengan bioteknologi. Beberapa komponen yang dibutuhkan untuk desain vaksin in silico adalah database, sequence aligment dan epitope prediction server (Baxevanis & Oullette, 2005; Utama, 2003).
4
BAB III. METODE PENELITIAN 3.1 Kerangka Konsep Penelitian Hiperlipidemia
Protein Lectin-like Oxidized LDL Receptor 1 (LOX-1) + ajuvan alum
Disfungsi endotel
Induksi respons imun humoral
Upregulasi Gen OLR1
Interaksi OxLDL dan LOX-1
IgG anti LOX-1
↑ LOX-1
↑ OxLDL dalam tunika intima
Aktivasi makrofag
↑ sitokin pro-inflamasi
Pembentukan sel busa Keterangan Penebalan dinding pembuluh darah
Variabel yang diukur Variabel yang tidak diukur
Pembentukan plak aterosklerosis
Menginduksi Menghambat
Gambar 3.1 Kerangka Konsep Penelitian Hiperlipidemia merupakan salah satu faktor risiko aterosklerosis dimana jika terjadi peningkatan LDL di plasma maka akan menyebabkan LDL teroksidasi dan menginduksi upregulasi dari LOX-1 yang berfungsi untuk memediasi uptake OxLDL ke tunika intima. Ikatan OxLDL dengan LOX-1 akan memicu terjadinya disfungsi endotel, sehingga semakin banyak OxLDL yang masuk ke intima, infiltrasi makrofag ke intima dan pelepasan sitokin pro-inflamasi. OxLDL akan difagosit makrofag menjadi sel busa yang akan berintegrasi ke dalam pembuluh darah dan menyebabkan penebalan pembuluh darah yang dimediasi oleh migrasi sel otot polos sehingga membentuk plak aterosklerosis. Jika plak ini pecah, maka akan terjadi trombosis yang dapat memicu terjadinya penyakit kardiovaskuler. ATHEROX akan menginduksi antibodi anti-LOX-1 sehingga dapat menghambat uptake OxLDL ke intima.
5
3.2 Rancangan Penelitian Penelitian ini menggunakan desain eksperimen murni(true experimental design) secara in vivo di laboratorium menggunakan rancangan Randomized Post Test Only Controlled Group Design. Studi in silico vaksin berbasis protein Lectin-like LDL Oxidized Receptor 1 (LOX-1)
Pengumpulan tikus (Rattus norvegicus) galur Wistar
Seleksi sesuai kriteria inklusi dan ekslusi, randomisasi ke dalam 7 kelompok, aklimatisasi 14 hari
Kontrol negatif
Diet normal
Kontrol positif
Diet aterogenik
Perlakuan 1
Perlakuan 2
Perlakuan 3
Perlakuan 4
Perlakuan 5
Vaksinasi LOX-1 1 ng/ 100 µL + Alum 100 µL (Total: 200 µL)
Vaksinasi LOX-1 10 ng/ 100 µL + Alum 100 µL (Total: 200 µL)
Vaksinasi LOX-1 100 ng/ 100 µL + Alum 100 µL (Total: 200 µL)
Vaksinasi LOX-1 1 µg/ 100 µL + Alum 100 µL (Total: 200 µL)
Vaksinasi Alum 100 µL
Diet aterogenik
Diet aterogenik
Diet aterogenik
Diet aterogenik
(Total: 100 µL)
Diet aterogenik
Pembedahan dan pengambilan serum dan aorta tikus setelah 56 hari perlakuan
Pengukuran kadar IgG anti-LOX-1, jumlah sel busa dan ketebalan aorta
Analisa data
Gambar 3.2. Alur Penelitian Kelompok penelitian berjumlah 7 (tujuh) yang dibagi secara acak (Kn, Kp, P1, P2, P3, P4, P5), dengan ketentuan sebagai berikut: a) Kelompok kontrol negatif (Kn): 4 ekor tikus galur Wistar jantan yang diberikan diet normal dan tanpa diinjeksikan vaksin. b) Kelompok kontrol positif (Kp): 4 ekor tikus galur Wistar jantan yang diberikan diet aterogenik dan tanpa diinjeksikan vaksin. 6
Vaksinasi pada Hari ke-0, -21, -35,
c) Kelompok perlakuan (P1): 4 ekor tikus galur Wistar jantan yang diberikan diet aterogenik dan diinjeksikan vaksin yang berisi protein LOX-1 1 ng/100 µL ditambah dengan ajuvan alum 100 µL (Total: 200 µL/injeksi subkutan) d) Kelompok perlakuan (P2): 4 ekor tikus galur Wistar jantan yang diberikan diet aterogenik dan diinjeksikan vaksin yang berisi protein LOX-1 10 ng/100 µL ditambah dengan ajuvan alum 100 µL (Total: 200 µL/injeksi subkutan) e) Kelompok perlakuan (P3): 4 ekor tikus galur Wistar jantan yang diberikan diet standar aterogenik dan diinjeksikan vaksin yang berisi protein LOX-1 100 ng/100 µL ditambah dengan ajuvan alum 100 µL (Total: 200 µL/injeksi subkutan) f) Kelompok perlakuan (P4): 4 ekor tikus galur Wistar jantan yang diberikan diet aterogenik dan diinjeksikan vaksin yang berisi protein LOX-1 1 µg/100 µL ditambah dengan ajuvan alum 100 µL (Total: 200 µL/injeksi subkutan) g) Kelompok perlakuan (P5): 4 ekor tikus galur Wistar jantan yang diberikan diet aterogenik dan diinjeksikan vaksin yang berisi alum 100 µL (Total: 100 µL/injeksi subkutan) Penentuan dosis antigen pada penelitian ini mengacu pada penelitian Pauwels et al pada tahun 1979 di mana dinyatakan bahwa dosis antigen sangat berpengaruh terhadap produksi antibodi sehingga harus dilakukan eksplorasi dosis untuk mengetahui dosis optimum antigen dalam produksi antibodi. 3.3 Variabel Penelitian Variabel bebas dalam penelitian ini adalah protein LOX-1 dosis 1 ng/100 µL, 10 ng/100 µL, 100 ng/100 µL, dan 1 µg/100 µL yang ditambahkan dengan alum 100 µL. Sedangkan variabel tergantung dalam penelitian ini adalah kadar antibodi (IgG) anti-LOX-1, jumlah sel busa dan ketebalan dinding aorta pada kelompok kontrol dan perlakuan. 3.4 Objek dan Sampel Penelitian 3.4.1 Studi in silico Objek yang digunakan dalam penelitian ini adalah sekuens asam amino penyusun protein LOX-1. 3.4.2 Studi in vivo Sampel penelitian adalah model tikus putih (Rattus novergicus) strain Wistar jantan usia 6 – 8 minggu dengan berat 120 – 160 gram dalam kondisi sehat yang ditandai dengan gerakan yang aktif. Dalam penelitian ini, digunakan tujuh kelompok penelitian yang terdiri dari dua kelompok kontrol dan lima kelompok perlakuan. Estimasi jumlah sampel untuk masingmasing kelompok dihitung menggunakan rumus Federer (Federer, 1955): 7
(t-1) (r-1) ≥ 15 (7-1) (r-1) ≥ 15 6r – 6 ≥ 15 6r ≥ 21 r ≥ 3,5 Keterangan : t : jumlah perlakuan r
: jumlah replikasi atau ulangan Dari hasil perhitungan, diperlukan jumlah replikasi atau ulangan paling sedikit adalah
4 kali (pembulatan dari 3,5) untuk masing-masing kelompok, sehingga jumlah total tikus yang dibutuhkan dalam penelitian ini secara keseluruhan adalah sejumlah 28 ekor tikus. 3.5 Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biomedik, Laboratorium Patologi Anatomi, dan Laboratorium Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. 3.6 Definisi Operasional 1. Aterosklerosis merupakan kondisi keradangan kronik terhadap deposisi lipoprotein pada dinding arteri. 2. LOX-1 merupakan scavenger reseptor dari OxLDL yang berada pada sel endotel. LOX-1 hampir tidak ditemukan pada keadaan normal dan mengalami upregulasi pada keadaan aterosklerosis sehingga protein ini digunakan sebagai bahan vaksin untuk menginduksi pembentukan antibodi anti-LOX-1. 3. Diet normal merupakan diet atau pakan biasa tanpa tambahan bahan yang bersifat aterogenik. Diet standar normal yang diberikan mengacu pada penelitian Handayani et al (2011; 2012) yang telah disesuaikan dengan rekomendasi diet oleh American Institute of Nutrition - 93 M (AIN-93 M). 4. Diet aterogenik merupakan diet atau pakan yang diberikan untuk menginduksi pembentukan plak aterosklerosis pada subendotel aorta tikus. Diet aterogenik yang diberikan merupakan diet tinggi lemak AIN-93M (Handayani et al., 2011; Handayani et al., 2012) yang dimodifikasi dengan penambahan bahan bersifat aterogenik yaitu asam kolat 0,3 % dan kolesterol 1% (Shatanovi et al., 2012) serta propil tiourasil 0,2% (Shirai et al., 1984) 5. Alum atau Aluminium hidroksida (Al(OH)3) merupakan ajuvan atau bahan yang ditambahkan ke vaksin untuk meningkatkan respons imun, aktivasi sel T melalui peningkatan akumulasi Antigen Presenting Cell (APC) dan ekspresi kostimulator serta sitokin oleh APC. Alum merupakan ajuvan yang sesuai untuk vaksin aterosklerosis karena 8
mempunyai efek ateroprotektif dan utamanya dapat menginduksi sistem imunitas humoral (Wigren et al., 2009). 6. Kadar antibodi merupakan jumlah antibodi yang terdapat pada serum darah. Kadar antibodi anti-LOX-1 diukur menggunakan enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). 7. Sel busa merupakan sel yang terdapat di dalam plak ateroma. Pengecekan dilakukan dengan pengambilan sampel yang berasal dari pembuluh darah aorta tikus dan dilakukan pembuatan slide histopatologi dan pewarnaan HE. 8. Ketebalan dinding aorta merupakan tebal tunika intima dan media aorta tikus. Pengecekan dilakukan dengan pengecatan HE pada slide parafin potongan melintang aorta. BAB IV. HASIL YANG DICAPAI 4.1 Kemajuan Pekerjaan 4.1.1 Analisis in silico Analisis in silico yang telah dilakukan adalah pencarian database protein LOX-1, pemodelan struktur 3 dimensi, prediksi aksesibilitas permukaan, analisis antigenisitas, prediksi epitop (sel B dan sel T), dan analisis autoimun. Berikut adalah hasil visualisasi dari protein LOX-1 beserta domain penyusun LOX-1:
Gambar 4.1 Visualisasi Domain LOX-1 beserta daerah palmitoilasi
Prediksi regio dengan aksesibilitas permukaan dilakukan berdasarkan skala askesibilitas
permukaan
Emini
menggunakan
server
IEDB
(http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell). Pada Gambar 4.2 menunjukkan adanya prediksi aksesibilitas permukaan dari sekuens peptida yang disajikan pada Tabel 4.1.
9
Dari gambar tersebut dapat terlihat bahwa akses permukaan protein terbanyak terdapat pada daerah NECK dan CTLD. Tabel 4.1 Peptida Hasil Prediksi Aksesibilitas Permukaan
Gambar 4.2 Grafik Hasil Prediksi Aksebilitas Permukaan Protein
yang
akan
direkomendasikan
No. 1 2 3 4 5 6
Posisi AA 11-25 75-81 86-102 112-121 164-169 207-212
sebagai
Peptida VKDQPDEKSNGKKAK THQKKKL SARQQAEEASQESENEL KLNEKSKEQM NWEKSQ SRRNPS
kandidat
vaksin
harus mempunyai
antigenisitas tinggi, sehingga sekuens asam amino penyusun protein LOX-1 harus diuji antigenisitasnya untuk mengetahui secara jelas bagian-bagian dari sekuens protein yang memiliki kemampuan tinggi untuk menginduksi respons imun. Analisis antigenisitas protein LOX-1 dilakukan menggunakan
metode
Kolaskar
&
Tongaonkar
melalui
server
IEDB
(http://tools.immuneepitope.org/tools/bcell) seperti pada Gambar 4.3. Tabel 4.2 Peptida Hasil Prediksi Peptida bersifat Antigenik
Gambar 4.3 Grafik Hasil Analisis Antigenisitas
No. 1 2
Posisi AA 8-13 26-69
3 4 5 6 7 8
133-147 152-160 169-183 187-200 223-238 240-267
Peptida IQTVKD GLQFLYSPWWCLAAATLGV LCLGLVVTIMVLGMLSQVSD LLTQ TLKRVANCSAPCPQD GENCYLFSS QEKCLSLDAKLLKIN DLDFIQQAISYSSF LMPHLFRVRGAVSQTY SGTCAYIQRGAVYAENCILA AFSICQKK
Selain mempunyai antigenisitas, protein yang direkomendasikan sebagai kandidat vaksin harus memiliki potensi sebagai epitop, baik terhadap sel B maupun sel T. Hasil prediksi epitop sel B protein LOX-1 menggunakan server EIDB menghasilkan beberapa sekuens epitop yang disajikan pada Gambar 4.4 dan Tabel 4.3. Pada tabel tersebut ditampilkan posisi-posisi dari epitop-epitop yang menggambarkan tingkat pengenalan epitop oleh sel B atau pengikatan dengan antibodi.
10
Tabel 4.3 Sekuens peptida yang prediksi sebagai epitop sel B No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Posisi AA 11-24 72-76 79-82 85-101 114-120 140-149 163-168 170-170 208-223 234-241
Peptida VKDQPDEKSNGKKA ANLTH KKLE ISARQQAEEASQESENE NEKSKEQ CSAPCPQDWI FNWEKS E RRNPSYPWLWEDGSPL VSQTYPSG
Gambar 4.4 Grafik Hasil Prediksi Epitop Sel B Untuk prediksi epitop sel T dari LOX-1, ditentukan bahwa MHC yang berperan adalah MHC kelas II karena antigen LOX-1 berupa antigen ekstraseluler (Abbas et al., 2007). Alel MHC II yang dipilih adalah DRB1*1431 dan DRB3*0303 yang merupakan alel MHC II pada populasi Indonesia (Panigoro et al., 1999). Dari analisis yang dilakukan, didapatkan bahwa LOX-1 mempunyai 518 sekuens peptida yang diprediksi sebagai epitop terhadap sel T. Berikut adalah 20 sekuens petida teratas hasil prediksi epitop sel T yang disajikan dalam Tabel 4.4. Tabel 4.4 20 Sekuens Peptida Teratas Hasil Prediksi Epitop Sel T menggunakan Metode NetMHCIIPan Alel
Posisi
Peptida
Nilai persentil
Afinitas
HLA-DRB1*1431
222-226
PLMPHLFRVRGAVSQ
0.69
Tinggi
HLA-DRB1*1431
223-237
LMPHLFRVRGAVSQT
0.8
Tinggi
HLA-DRB1*1431
221-235
SPLMPHLFRVRGAVS
0.9
Tinggi
HLA-DRB1*1431
224-238
MPHLFRVRGAVSQTY
1.12
Tinggi
HLA-DRB1*1431
225-239
PHLFRVRGAVSQTYP
1.78
Tinggi
HLA-DRB3*0303
177-191
AKLLKINSTADLDFI
1.99
Intermediet
HLA-DRB3*0303
178-192
KLLKINSTADLDFIQ
2.58
Intermediet
HLA-DRB3*0303
176-190
DAKLLKINSTADLDF
3.97
Intermediet
HLA-DRB1*1431
226-240
HLFRVRGAVSQTYPS
4.21
Tinggi
HLA-DRB3*0303
179-193
LLKINSTADLDFIQQ
4.89
Intermediet
HLA-DRB3*0303
248-262
RGAVYAENCILAAFS
5.44
Intermediet
HLA-DRB1*1431
258-272
LAAFSICQKKANLRA
6.28
Tinggi
HLA-DRB3*0303
249-263
GAVYAENCILAAFSI
6.69
Intermediet
HLA-DRB3*0303
213-227
YPWLWEDGSPLMPHL
6.7
Intermediet
HLA-DRB1*1431
257-271
ILAAFSICQKKANLR
6.78
Tinggi
HLA-DRB3*0303
186-200
ADLDFIQQAISYSSF
7.09
Intermediet
HLA-DRB3*0303
188-202
LDFIQQAISYSSFPF
7.23
Intermediet
HLA-DRB3*0303
247-261
QRGAVYAENCILAAF
7.39
Intermediet
259-273 AAFSICQKKANLRAQ HLA-DRB1*1431 Sumber: http://tools.immuneepitope.org/tools/tcell/
7.68
Tinggi
Keterangan: warna _ menunjukkan inti LFRVRGAVS warna _ menunjukkan inti VYAENCILA warna _ menunjukkan inti LWEDGSPLM
warna _ menunjukkan inti LKINSTADL warna _ menunjukkan inti FSICQKKAN warna _ menunjukkan inti FIQQAISYS
11
Analisis potensi autoimunitas dilakukan dengan menggunakan BLASTP dari NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) dengan cara memeriksa kesamaan susunan asam amino dari protein yang kita pilih dan analisa kesamaan susunan asam aminonya menggunakan database semua peptida / protein yang ada. Jika hasil kesamaan di atas 80% artinya terdapat homologi yang tinggi dan antibodi terhadap protein yang dipilih memiliki kemungkinan tinggi untuk bereaksi silang. Dari analisis yang dilakukan, didapatkan bahwa tidak ada sekuens asam amino yang memiliki kesamaan dengan susunan asam amino penyusun protein LOX-1 lebih dari 80%, artinya LOX-1 memiliki potensi sangat kecil untuk dapat menimbulkan suatu kondisi autoimun terhadap protein fisiologis yang tubuh 4.1.2 Preparasi dan Injeksi Vaksin Telah dilakukan injeksi primer pada hari ke-0, dilanjutkan injeksi booster yang dilakukan sebanyak 2 kali yaitu pada hari ke-21 (booster I) dan hari ke-35 (booster II). Dilakukan injeksi jenis vaksin sesuai dengan pembagian kelompok hewan coba. Vaksin disuntikkan sebanyak tiga kali secara subkutan yang terdiri atas satu injeksi primer dan dua injeksi booster. Injeksi primer diberikan pada minggu pertama atau hari ke-0 pemberian diet. Kemudian, injeksi booster pertama diberikan pada minggu ketiga kemudian injeksi booster kedua diberikan pada minggu ketiga mulai dari minggu kedua. Ajuvan yang diberikan pada injeksi vaksin yaitu alumunium hidroksida. 4.1.3 Pemberian Diet Aterogenik Diet aterogenik diberikan pada kelompok tikus kontrol positif (Kp) dan perlakuan (1, 2, 3, 4, 5). Pakan diet aterogenik diberikan selama 8 minggu. Pemberian diet aterogenik setiap hari sebanyak 30 gram bertujuan untuk menginduksi terjadinya aterosklerosis. Penimbangan sisa pakan dilakukan setiap hari dengan menggunakan timbangan digital. Berikut ini grafik perbandingan rerata asupan pakan tikus setiap hari: 18 Rerata asupan pakan (gram/hari)
16 14 12 10 8 6 4 2
15
8.25
7.75
8.25
7.5
8.5
7
Kn
Kp
P1
P2
P3
P4
P5
0
Gambar 4.5 Perbandingan Rerata Asupan Pakan per hari antar Masing-Masing Kelompok Penelitian 12
Dari grafik diatas terlihat bahwa rerata asupan pakan terendah terdapat pada kelompok P5 yaitu 7,00 gram/hari, sedangkan rerata asupan pakan tertinggi terdapat pada kelompok Kn yaitu 15,00 gram/hari. Dari uji normalitas, didapatkan bahwa hasil sebaran ketujuh kelompok data asupan pakan tikus adalah tidak normal (p < 0,05) sehingga tidak dapat dilanjutkan dengan uji One-way ANOVA. Untuk itu, digunakan uji alternatif dari One-way ANOVA yaitu uji non parametrik Kruskal-Wallis. Dari hasil uji Kruskal-Wallis, didapatkan nilai p sebesar 0,017 (p < 0,05) yang artinya bahwa terdapat pengaruh perbedaan kelompok penelitian terhadap asupan pakan tikus yang berbeda secara bermakna, paling tidak diantara dua kelompok penelitian. Setelah itu dilakukan uji Mann-Whitney untuk mengetahui hubungan antar kelompok penelitian, dan didapatkan bahwa asupan pada Kn berbeda secara signifikan dengan Kp dan P1, 2, 3, 4, dan 5. Sebelum
diberi
perlakuan,
tikus
diadaptasikan
(aklimatisasi)
pada
kondisi
laboratorium selama dua minggu dengan pemberian diet normal dan minuman yang diberikan secara ad libitum. Setelah dua minggu, dilakukan pemberian diet normal dan diet aterogenik selama 8 minggu. Pengontrolan berat badan dilakukan dengan penimbangan berat badan setiap satu minggu sekali. Kenaikan berat badan tikus ditentukan dengan menghitung selisih berat badan akhir dengan berat badan awal sebelum penelitian dilakukan. Grafik perbandingan rerata kenaikan berat badan tikus pada masing - masing kelompok penelitian
Rerata kenaikan berat badan (gram)
disajikan pada Gambar 4.6 berikut: 35 30 25 20 15 10 5 28.25
14.25
19.75
23.25
13.5
23.25
19.25
Kn
Kp
P1
P2
P3
P4
P5
0
Gambar 4.6 Perbandingan Rerata Kenaikan Berat Badan antar Masing-Masing Kelompok Penelitian Dari grafik diatas terlihat bahwa rerata kenaikan berat badan tertendah terdapat pada kelompok P3 yaitu 13,5 ± 2,08 gram, sedangkan rerata asupan pakan tertinggi terdapat pada kelompok Kn yaitu 28,25 ± 20,53 gram. Dari uji normalitas, didapatkan bahwa hasil sebaran 13
ketujuh kelompok data kenaikan berat badan tikus adalah normal (p > 0,05), sehingga selanjutnya dilakukan uji varians sebelum dilakukan uji parametrik One-way ANOVA. Dari hasil uji varians kenaikan berat badan tikus didapatkan nilai p sebesar 0,005 (p < 0,05), artinya hasil sebaran ketujuh kelompok data kenaikan berat badan tikus adalah tidak homogen, sehingga tidak dapat dilanjutkan dengan uji One-way ANOVA. Untuk itu, digunakan uji alternatif dari One-way ANOVA yaitu uji non parametrik Kruskal-Wallis. Dari uji Kruskal-Wallis didapatkan asupan pakan tikus dan didapatkan nilai p sebesar 0,610 (p > 0,05) yang artinya bahwa tidak terdapat pengaruh perbedaan kelompok penelitian terhadap kenaikan berat badan tikus yang berbeda secara bermakna. 4.1.5 Pengukuran Parameter 4.1.5.1 Pengukuan Kadar Antibodi Pada akhir penelitian, dilakukan pengambilan spesimen darah dari jantung hewan coba dan darah disentrifugasi untuk mendapatkan serum yang akan diukur kadar IgG anti-LOX-1 didalamnya. Namun sebelum dilakukan perhitungan kadar IgG anti-LOX-1, maka dilakukan pembuatan kurva baku atau kurva standar (konsentrasi vs OD) sehingga didapatkan persamaan regresi, yaitu y = 0,007x + 0,106 dengan nilai R2 = 0,996. Nilai R2 menunjukkan tingkat keeratan antar variabel yaitu konsentrasi dan OD di mana nilai R2 yang baik adalah mendekati satu (R2≈1). Grafik kurva baku disajikan pada Gambar 4.7. Kurva Baku Konsentrasi vs Optical Density 1.4 y = 0.007x + 0.106 R² = 0.996
Optical Density
1.2
1.244
1 0.8
0.736
0.6 0.4165
0.4
0.2555 0.1655 0.1315 0.091
0.2 0 0
50
100 Konsentrasi (pg/ml)
150
200
Gambar 4.7 Kurva Baku. Selanjutnya dilakukan perhitungan kadar IgG anti-LOX-1 (x) dengan memasukkan nilai OD (y) ke dalam persamaan y = 0,007x + 0,106. Grafik rerata kadar antibodi IgG antiLOX-1 serum pada masing-masing kelompok yang diberikan diet normal dan atau diet aterogenik dengan atau tanpa pemberian vaksinasi disajikan dalam Gambar 4.8. 14
Rerata Kadar IgG anti-LOX1 (pg/ml)
100 80 60 40 20 0
66.14
67.64
68.79
69.18
71.25
75.39
80.71
Kn
Kp
P1
P2
P3
P4
P5
Gambar 4.8 Perbandingan Rerata Kadar IgG anti-LOX-1 antar Masing-Masing Kelompok Penelitian Dari grafik diatas terlihat bahwa rerata kadar IgG anti-LOX-1 terendah terdapat pada kelompok Kn yaitu 66,14 ± 4,58 pg/ml, sedangkan rerata kadar IgG anti-LOX-1 terdapat pada kelompok P5 yaitu 80,71 ± 5,36 pg/ml. Sebelum dilakukan uji One-way ANOVA maka perlu dilakukan uji normalitas dan uji varians. Dari uji yang dilakukan, didapatkan hasil sebaran ketujuh kelompok data adalah normal (p > 0,05) dan varians data sama dengan nilai p = 0,505 (p > 0,05), maka uji One-way ANOVA dapat dilakukan. Dari uji One-way ANOVA didapatkan nilai p = 0,010 (p < 0,05), artinya terdapat pengaruh perbedaan kelompok penelitian terhadap kadar IgG anti-LOX-1
yang berbeda secara bermakna,paling tidak
diantara dua kelompok penelitian 4.1.3.2 Perhitungan Sel Busa Dilakukan pembuatan preparat dengan pewarnaan Hematosilin-Eosin untuk meihat jumlah sel busa dan selanjutnya pengamatan slide dilakukan menggunakan mikroskop cahaya dengan perbasaran 1000x. Sel busa terlihat dengan timbulnya pendesakan ruang pada subintima dan tunika media aorta. Perhitungan dilakukan pada sepuluh lapangan pandang yang berbeda kemudian diambil rerata jumlahnya. Berikut ini tabel dan grafik rerata jumlah sel busa aorta pada masing-masing kelompok perlakuan: Nama Kelompok Kontrol Negatif Kontrol Positif Perlakuan 1 Perlakuan 2 Perlakuan 3 Perlakuan 4 Perlakuan 5
Jumlah Sel Busa (Rerata±SD) 0,7750±0,968 7,1500±0,126 3,250±0,723 2,725±0,556 2.725±0.873 2.250±0,370 3.233±0,416
Tabel 4.1 Rerata Jumlah Sel Busa
15
Grafik 4.9 Rerata Jumlah Foam Cell Busa (p<0,005)
4.2 Ketercapaian Target Luaran No. 1. 2.
3.
4. 5.
6. 7.
8.
9.
10. 11.
12. Total
Keterangan Mengurus ethical clearance penelitian Perijinan laboratorium Laboratorium di FKUB (FAAL, PA, Biomedik dan Fisiologi) Laboratorium di RSUD dr. Soetomo Surabaya Persiapan Alat dan Bahan Alat dan bahan pembuatan pakan diet Alat dan bahan preparasi vaksin Alat dan bahan injeksi vaksin Preparasi dan injeksi vaksin Diet aterogenik Resep diet Prosedur pembuatan Pembedahan Pembuatan preparat Pengambilan jaringan aorta Pewarnaan HE Pengecekan kadar antibodi Optimasi spesimen darah ELISA Perhitungan sel busa Identifikasi sel busa Penentuan jumlah lapang pandang Pengukuran ketebalan aorta Analisis data dan pembahasan Asupan pakan dan kenaikan berat badan Hasil pemeriksaan kadar antibodi Hasil pengukuran sel busa dan ketebalan aorta Penyusunan laporan akhir
Target Proporsi 2% 3% 2%
Ketercapaian 2% 3% 2%
1% 8% 4% 2% 2% 9% 28% 18% 10% 6% 6% 3% 3% 8% 3% 5% 8% 5% 3% 5% 13% 5% 4% 4% 4% 100%
1% 8% 4% 2% 2% 9% 28% 18% 10% 6% 6% 3% 3% 8% 3% 5% 8% 5% 3% 2% 12% 5% 4% 3% 0% 92% 16
30% 20% 10% 0%
Target Proporsi
Ketercapaian
Perkembangan Penelitian Total Penelitian Kegiatan terlaksana Kegiatan terlaksana
Total Penelitian 85%
90%
95% 100%
92%
BAB V. RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA 5.1 Pengukuran Ketebalan Aorta Pengukuran ketebalan aorta dilakukan menggunakan preparat aorta yang telah diberi pewarnaan hematoksilin-eosin. Pengamatan slide dilakukan menggunakan mikroskop perbesasan 1000x. Penampang aorta diukur dengan mikrometer pada sepuluh titik yang berbeda pada potongan melintang lumen aorta dan kemudian diambil rerata hasilnya. 5.2 Analisis Data dan Pembahasan Teknik pengolahan dan analisis data dilakukan dengan menggunakan SPSS Statistics 20 dengan tingkat signifikansi atau nilai probabilitas 0,05 (p=0,05) dan taraf kepercayaan 95% (α=0,05). 5.3 Persiapan Publikasi Artikel Ilimiah dan Paten DAFTAR PUSTAKA Baxevanis and Oullette. 2005. Comprehensive computational assessment of ADME properties using mapping techniques. Curr Drug Disc Tech 2: 99–113. Brown, B.G., Zhao, X.Q., Chait, A., Fisher, L.D., Cheung, M.C., Morse, J.S., ….. and Albers, J.J. 2001. Simvastatin and Niacin, Antioxidant Vitamins, or The Combination For ThE Prevention of Coronary Disease. New England Journal of Medicine, Vol. 345 No. 22. Caligiuri, G., Khallou-Laschet, J., Vandaele, M., Gaston, A., Delignat, S., Mandet, C. 2007. Phosphorylcholine-Targeting Immunization Reduces Atherosclerosis. Journal of the American College of Cardiology, 50(6): 540-546 Christina, S. 2010. Efek Ekstrak Kacang Tunggak (Vigna unguiculata) terhadap Kadar Superoksid Dismutase (SOD) Serum Tikus Putih (Rattus novergicus) Strain Wistar yang telah Diovariektomi. Malang: Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Curtiss, L.K. 2009. Reversing Atherosclerosis. New Eng. J. of Med., No. 360:11. 17
Dahlan, SM. 2004. Seri Statistik: Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan; Uji Hipotesis dengan Menggunakan SPSS Program 12 Jam. Jakarta: Arkans. Hal. 4-26; 90-101 Ekins, S., Mestres, J., and Testa, B. 2007. In Silico Pharmacology for Drug Discovery: Methods for Virtual Ligand Screening And Profiling. British Journal of Pharmacology, Vol. 152: 9–20 Freeman,M.W. 1997. Scavenger Receptors in Atherosclerosis. Curr. Opin. Hematol. Vol. 4: 41–47 Handayani D., Barbara J. Meyer, Chen,….. and Xu-Feng Huang. 2012. The Comparison of the Effect of Oat and Shiitake Mushroom Powder to Prevent Body Weight Gain in Rats Fed High Fat Diet. Food and Nutrition Sciences, 2012, 3, 1009-1019. Hansson, G. K. 2005. Inflammation, Atherosclerosis, and Corornary Artery Disease. New England Journal of Medicine, No. 352:1685-95 Kliegman, R.M., Behrman, R.E., Jenson, H.B., Stanton, B.F. 2007. Nelson Textbook of Pediatric (18th Edition). New York: Saunders. Lateef SS, Gupta S, Jayathilaka LP, Krishnanchettiar S, Huang JS, Lee BS. 2007. An Improved Protocol for Coupling Synthetic Peptides to Carrier Proteins for Antibody Production Using DMF to Solubilize Peptides". J Biomol Tech, Vol. 18 (3): 173–176 Movahedi, A., and Hampson D.J. 2008. New Ways to Identify Novel bacterial antigens for vaccine development. Veterinary Microbiology, Vol. 131: 1–13. Nisson, Kitahara, M., Kanaki., Ishii, I., and Saito, Y. 2009. Atherosclerosis Induced by Chronic Inhibition of The Synthesis f Nitric Oxide in Moderately Hypercholesterolaemic Rabbits is Suppressed by Pitavastatin. Br J Pharmacol, Vol. 159(7): 1418–1428. Pirillo A., Norata G. D., Catapano A. L. 2013. LOX-1, OxLDL, and Atherosclerosis: Mediators of Infallamtion. Hindawi Publishing Corporation, Vol. 2013: 152786. Rastini, E.K., Widodo, M.A., dan Rohman, M.S. 2010. Pengaruh Pemberian Ekstrak Buah Mengkudu terhadap Aktivasi NF-κβ dan Ekspresi Protein (TNF-α, ICAM-1) pada Kultur Sel Endotel dipapar Ox-LDL. J.Exp. Life Sci, Vol. 1 No. 1. Universitas Brawijaya. Rohman, M.S., Rastini, E.K., Dwi Sarbini, D., W.A. Titi., Widodo, dan Sargowo, D. 2006. Penghambatan Aktifasi Nf-κB oleh Cape, Komponen Aktif Madu Lebah pada Huvec’s yang Dipapar LDL Teroksidasi. Jurnal Kedokteran Brawijaya, Vol. XXII, No.1. Scarselli, M., Giuliani, M.M., Adu-Bobie, J., Pizza, M., Rappuoli, R., 2005. The Impact of Genomics on Vaccine Design. Trends Biotechnol. 23, 84–91. Steinbrecher, U.P., 1999. Receptors for OxLDL. Biochim. Biophys. Acta 1436: 279-298 Tate S. 2007. OxLDL receptor, LOX-1, on the endothelial cell – The receptor structure and functions of LOX-1 in atherogenesis. J.Biol.Macromol,, 7(2): 12-20. WHO. 2011. Cardiovascular Diseases (CVDs), (Online), (http://www.who.int/mediacentre/ factsheets/fs317/en/index.html) Maria Wigren, Daniel Bengtsson,… and Jan Nilsson. 2009. Atheroprotective Effects of Alum Are Associated With Capture of Oxidized LDL Antigens. Circ Res., Vol.104:62-70. LAMPIRAN 1. Penggunaan Biaya Periode Bulan Januari 2014
Tanggal
Uraian Kegiatan
Debet (Rp)
Kredit (Rp)
31-1-2014
Urunan Anggota
500.000.00
31-1-2014 31-1-2014
Print proposal Fotocopi proposal
15.000,00 10.000,00
31-1-2014
Jilid terusan proposal
20.000,00 18
Periode Bulan Februari 2014 Tanggal Uraian Kegiatan Saldo Periode 31 Januari 2014 17-2-2014 Print form etik dan proposal 17-2-2014 Fotocopi etik dan proposal Periode Bulan Maret 2014 Tanggal Uraian Kegiatan Saldo Periode 28 Februari 2014 06-3-2014 Dana Bantuan Rektorat
Debet (Rp)
Kredit (Rp)
455.000,00 17.000,00 10.000,00 Debet (Rp)
Kredit (Rp)
428.000,00 2.500.000,00
06-3-2014 06-3-2014 06-3-2014 06-3-2014 06-3-2014
Urunan Anggota kelompok Pembelian kayu Pembelian kawat Pembelian paku
7.500.000,00
Pembelian Tepung
16.000,00
06-3-2014
Pembelian CMC
40.000,00
06-3-2014
Pembelian Sukrosa
28.000,00
06-3-2014
Pembelian Pewarna Makanan
10.000,00
07-3-2014
Pembelian Kasein
07-3-2014
Pembelian Minyak Kedalai
40.000,00
07-3-2014
Pembelian Gelatin
50.000,00
08-3-2014
Pembelian Sekam
20.000,00
09-3-2014
Pembelian buku folio
30.000,00
10-3-2014
Pembelian Handscoen
50.000,00
11-3-2014
Pembelian Vitamin
15.000,00
12-3-2014
Pembelian Tikus
560.000,00
13-3-2014
Pembelian Botol minum tikus
106.000,00
17-3-2014
Pembayararan Aluminium Hidroksida
18-3-2014
Pembelian Kasein
500.000,00
19-3-2014
Pembelian Gelatin
50.000,00
25-3-2014
Pembayaran Protein LOX-1
27-3-2014
Pembelian Spuit 1ml
20.000,00
28-3-2014
Pembelian Corvet
28.000,00
28-3-2014
Pembelian Kolesterol
100.000,00
28-3-2014
Pembelian Asam kolat
500.000,00
28-3-2014
Pembelian PTU
23.000,00
29-3-2014
Pembelian Minyak kelapa
50.000,00
12.000,00 10.000,00 10.000,00
500.000,00
1.000.000,00
3.145.000,00
19
29-3-2014
Pembelian Tepung
Periode Bulan April 2014 Tanggal Uraian Kegiatan Saldo Periode 31 Maret 2014 01-4-2014 Pembelian Kolesterol 02-4-2014 Pembelian Botol Minum Tikus
48.000,00 Debet (Rp)
Kredit (Rp)
3.467.000,00 300.000,00 20.000,00
04-4-2014
Pembelian Asam Kolat
07-4-2014
Pembelian Tepung
12.000,00
08-4-2014
Pembelian Corvet
28.000,00
14-4-2014
Pembelian Vitamin
15.000,00
16-4-2014
Pembelian Tepung
12.000,00
16-4-2014
Pembelian Sukrosa
35.000,00
16-4-2014
Pembelian Kolesterol
100.000,00
21-4-2014
Pembelian Kasein
500.000,00
22-4-2014
Pembelian Sekam
12.000,00
23-4-2014
Pembelian Gelatin
50.000,00
24-4-2014
Pembelian Handscoen
50.000,00
Periode Bulan Mei 2014 1044 Tanggal Uraian Kegiatan Saldo Periode 30 April 2014 01-5-2014 Urunan Anggota kelompok 10-5-2014 Pembelian sekam
500.000,00
Debet (Rp)
Kredit (Rp)
1.833.000,00 690.000,00 8.000,00
15-5-2014
Pembelian spuit 3 ml
22-5-2014
Pengisian Bensin
22-5-2014
Vacotainer
30.000,00
22-5-2014
Botol organ
25.000,00
22-5-2014
Eter
30.000,00
22-5-2014
Formalin
23.000,00
22-5-2014
Alkohol
15.000,00
22-5-2014
Kapas
5.000,00
29-5-2014
Pengukuran kadar antibodi
1.000,00
30-5-2014
Pengukuran foam cell
800.000
Periode Bulan Juni 2014 Tanggal Uraian Kegiatan Saldo Periode 30 April 2014 Urunan Anggota Kelompok
7.000,00 100.000,00
Debet (Rp)
Kredit (Rp)
480.000,00 100.000,00 20
Rekapitulasi Penggunaan Biaya Bulan Januari Februari Maret April Mei
Debet Rp500.000,00 Rp455.000,00 Rp10.428.000, 00 Rp3.467.000,00 Rp2.523.000,00
Kredit Rp45.000,00 Rp27.000,00 Rp6.961.000,00 Rp1.637.000,00 Rp2.043.000,00
Saldo Rp455.000,00 Rp428.000,00 Rp3.467.000,00 Rp1.830.000,00 Rp480.000,00
2. Bukti-bukti Pendukung Kegiatan
Penggantian sekam
Pemberian pakan
Pengisian air minum
Pencucian botol minum
Pemberian air minum Pengerusan vitamin
Pengadukan bahan adonan Penggerusan PTU
Pembuatan korvet cair di atas penangas
21
Pencampuran bahan menggunakan mixer
Pakan diet normal
Penggerusan PTU
Pakan diet aterogenik
Penyimpanan adonan di freezer Penimbangan BB tikus
Injeksi vaksin
Preparasi vaksin di LAF
Homogenisasi vaksin menggunakan vortex
Penempatan tikus di kandang
22
