BEZPEČNÉ A KVALITNÉ POTRAVINY

BEZPEČNÉ A KVALITNÉ POTRAVINY

Peter Siekel 1. Zloženie a kvalita 2. Molekulárno-biologické metódy

Chutí nám?

USA sú „najtučnejšou“ krajinou v rozvinutom svete. Jeden z troch dospelých je klinicky obézny a 40 percent detí má oficiálne diagnostikovanú nadváhu.

Sú kvalitné a zdravé?

Všetky?

Zloženie potravín - štruktúra

Kvalita potravín

• • • •

Organoleptické Zdravotné Mikrobiologické Funkčné potraviny

Bezpečnosť potravín • Falšovanie – pravosť potravín, melamín mlieko, konské mäso • Chemická a mikrobiologická kontaminácia • Výskyt prírodných toxických látok • Výskyt alergénov

Využitie molekulárnobiologických metód na hodnotenie kvality a bezpečnosti potravín

Molekulárno-biologické metódy na analýzu potravín Na analýzu potravín sa (už) prakticky nepoužívajú metódy založené na DNA-DNA hybridizácii - DNA-arrays - Fluorescentná in situ hybridizácia (FISH) - suspenzná DNA-DNA hybridizácia (xMAP) Používajú sa:  Polymerázová reťazová reakcia (PCR) Citlivosť 100 - 101 molekúl  Vysokokapacitné paralelné sekvenovanie (Next Generation Sequencing, NGS) Citlivosť a Široký záber!

Využitie molekulárno-biologických DNA metód

 Identifikácia patogénnych mikroorganizmov v potravinách – bezpečnosť potravín

 Typizácia patogénnych mikroorganizmov v potravinách – identifikácia zdroja a ciest kontaminácie v procese ich výroby – bezpečnosť potravín  Analýza zmesných kultúr mikroroganizmov – optimalizácia kvality potravín

* Identifikácia alergénov v potravinách – a identifikácia zdroja a ciest kontaminácie v procese ich výroby– bezpečnosť potravín * Autentifikácia zloženia potravín – rastlinné a živočíšne druhy odhaľovanie falšovania potravín - bezpečnosť a kvalita potravín * Identifikácia GMO v potravinách - ?

Molekulárno – biologické metódy • Založené na identifikácii DNA • Polymerázová reťazová reakcia (PCR) – Konvenčná – V reálnom čase – Citlivosť 100 - 101 molekúl

• Pulzná gélová elektroforéza (PFGE) – Typizácia patogénov

• Denaturačná gradientová GE (DGGE) • Teplotne gradientová GE (TGGE)

DNA

Polymerázová reťazová reakcia

fluorescencia

real-time PCR

konvenčná PCR

Real-time PCR • detekcia, kvantifikácia DNA • monitoruje fluorescenciu emitovanú počas reakcie v závislosti od tvorby amplikónov v každom PCR cykle (v reálnom čase) Výhody: Špecifická, senzitívna, rýchla a reprodukovateľná

Výstup z Real-time PCR (Bio-Rad)

Využitie molekulárnobiologických metód v praxi • Typizácia potravinársky významných mikroorganizmov napr. v

mliečnych výrobkoch – jogurty

• Analýza zmesných kultúr mikroorganizmov vo víne, v bryndzi • Identifikácia a typizácia patogénnych mikroorganizmov v potravinách

Fenotypové metódy identifikácie baktérií mliečneho kysnutia

Identifikácia baktérií mliečneho kysnutia v bryndzi API testy 50CH (bioMérieux, Francúzsko) Izoláty (6): MRS (1, 6, 10, 12) M17 (16, 21) izolát

kmeň

Pravdepod.

1.

Leuconostoc lactis

76,7 %

6.

Lactobacillus rhamnosus

90 %

10.

Lactobacillus buchneri

99,9 %

12.


91,0 %


99,2 %

Lactobacillus curvatus

70,7 %

16.

1.)

6.)

10.)

12.)

Lc. Lactis subsp. cremoris 45, 1% 21.

Lactobacillus paracasei

99,1 %


95,8 %


95,3 %

Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR)

(1) 3000–2800 cm-1 mastné kyseliny v membráne bakteriálnej bunky, (2) 1800- 1500 cm-1 amidové skupiny proteínov a peptidov, (3) 1500-1200 cm-1 zmiešaný región: proteíny a mastné kyseliny, (4) 1200-900 cm-1 polysacharidy v bunkovej stene, (5) 900-500 cm-1 oblasť fingerprintu s obsahom nešpecifických funkčných skupín

FTIR Vyhodnotenie zbierkových kmeňov

GENOTYPOVÉ METÓDY

Mikroorganizmy • Vo víne (kvasinky, baktérie)nekultivačnou metódou

Vo víne Kvasinky

Baktérie

Alkoholové kvasenie Baktérie mliečneho kysnutia (C6H12O6=2C2H5OH+2CO2+teplo) • jablčno-mliečna fermentácia, kys. jablčná = kyselina mliečna+CO2 • Diacetyl (2,3-butandion)-maslové tóny

Vreckaté huby Baktérie octového kysnutia • produkcia kys. octovej, acetaldehyd a iné.

ITS PCR Internal transcribed spacer

• polymorfizmus dĺžky fragmentov (16S rDNA-23S rDNA) pre baktérie

• polymorfizmus dĺžky fragmentov (18S rDNA-26S rDNA) pre kvasinky

Identifikácia baktérii prostredníctvom ITS oblasti Vzorka Veltlín zelený

Bobule

Mušt

Zhoda % Gluconobacter kondonii (99 %) Gluconobacter cerinus (99 %) Klebsiella pneumoniae (81 %) Salmonella enterica (80 %) Klebsiella pneumoniae (81 %) Salmonella enterica (80 %) Enterobacter fergusonii (84%) Salmonella enterica (84%) Enterobacter asburiae (87 %) Salmonella enterica (87 %) Gluconobacter cerinus (98 %) Pseudomonas syringae (99 %) Pseudomonas syringae (99 %) Leuconostoc pseudomesenteroides (99 %) Haemophilus ducreyi (83 %) Erwinia amylovora (89 %) Pantoea stewartii (88 %) Klebsiella oxytoca (93 %) Pantoea sp. (87 %) Clostridium sp. (86 %) Enterococcus silesiacus ( 93%) Exiguobacterium sibiricum (99 %)

Veľkosť amplikónu (bp)

762 bp 595 bp 594 bp 450 bp 434 bp 762 bp 628 bp 452 bp 575 bp 456 bp

452 bp 353 bp 247 bp

Prehľad klonov DNA kvasiniek a vláknitých húb zo vzoriek bubúľ a muštov Vzorka

Názov klonu

Najbližšia zhoda v GenBank, % identity pre amplikón bez primérov

Velkost amplikonu s primermi podľa sekvenácie [bp]

Velkost amplikonu s primermi podľa fluorescenčnej kapilárnej elektroforézy [bp]

VM1CHU

B-4

Uncinula necator (99%)

371

365

VM2CHU

C-6

Saccharomyces cerevicae (100%)

419

413

VGVP

D-2

Candida zemplinina (99%)

278

274

VGVP

D-3

Issatchenkia terricola (99%)

281

276

VM2CHU

F1

Uncultured Candida clone B2-2 (100%) alebo Candida zemplinina EJ1 (99%)

278

274

VM2CHU

F4


278

274

VGP

G29


278

274

VM1CHU

E2


278

274

VM1CHU

E4

Rod Metschnikowia (100%)

254

249

VGCHU

A12

Hanseniaspora uvarum (99%)

399

394

VMCHU

B13

Aureobasidium pullulans (100%)

342

337-338

VM1CHU

B18

Sporobolomyces marcillae (99%)

394

389

VM2CHU

C8

Sporobolomyces marcilae (99%)

394

389

Vysokokapacitné sekvenovanie - Next Generation Sequencing (NGS) - Massively Parallel Sequencing (MPS) - paralelné sekvenovanie veľkého množstva DNA v rovnakom čase => znižovanie nákladov (cena), => nárast dát (potreba spracovať, bioinformatika) Vyhodnotenie výsledkov z NGS: -

CLC genomics workbench 7.5, (spracovanie sekvenčných dát) BLAST (identifikácia čítaní na základe homológie k referenčným 16S rRNA sekvenciám v NCBI) MEGAN 5 (Taxonomická interpretácia výsledkov)

Vysokokapacitné sekvenovanie

• Identifikácia mikrobiálnych spoločenstiev na úrovni štúdie ich: • DNA- Metagenomika- taxonomická analýza • RNA- Metatranskriptomika- funkčná analýza • Proteínov- Metaproteomika - komparatívna analýza

Metagenomika • Dva prístupy (podľa cieľovej DNA): - 1. Sekvenovanie amplikónov kódujúcich 16S rRNA (16S rDNA) - 2. Sekvenovanie fragmentov celkovej DNA (Shotgun sequencing) • -

16S rRNA (výhody): Prítomná vo všetkých baktériách, veľká cca 1500 bp (v bioinformatike postačujúca), rovnaká v rámci toho istého taxónu, sekvenčne a funkčne nemenná (len evolučne determinované)

Analýza výsledkov sekvenovania • Predspracovanie surových údajov (trimming): - „Odstrihávanie“ nekvalitných 5´ a 3´ koncov, vylúčenie nejednoznačných báz a báz s nízkym kvalitatívnym skóre, ignorovanie krátkych/ dlhých čítaní (tj. osekvenovaných fragmentov). • Identifikácia čítaní: - Priradenie čítaní k referenčným sekvenciám 16S rRNA v databázach (NCBI, Greengenes) na základe ich homológie

Bryndza

B1

B2

GENOTYPOVÉ METÓDY

Taxnomická interpretácia výsledkov z NGS

B3

B2

Patogénne baktérie v potravinách Mliečne a mäsové potravinové výrobky • Staphylococcus aureus • Escherichia coli

• Listeria monocytogenes • Salmonella enterica

Typizácia patogénnych baktérií • Typizácia kmeňov izolovaných z potravín vs. z klinických vzoriek, epidemiológia

• Typizácia kmeňov izolovaných z potravinárskych výrobkov vs. z výrobných prevádzok, hygiena a sanitácia

Typizácia patogénnych baktérií • VNTR (variable number tandem repeats)

• MLST (multilocus sequence typing) housekeeping gény

• PFGE (pulsed field gel electrophoresis)

Poddruhová typizácia Staphyloccocus aureus Multi-locus variable number of tandem repeats analysis (MLVA)

- Multiplexná PCR – gény sdr, clfA, cflB, ssp, spa - Stanovenie molekulovej hmotnosti fragmentov

Detekcia alergénnych zložiek v potravinách • Povinnosť označovania • Directive 2003/89/EC of the European Parliament and of the Council of 10 November 2003 amending Directive 2000/13/EC as regards indication of the ingredients present in foodstuffs • Výnos Ministerstva pôdohospodárstva SR a Ministerstva zdravotníctva SR z 28. apríla 2004 č. 1187/2004 – 100, ktorým sa vydáva hlava Potravinového kódexu SR upravujúca označovanie potravín

Alergény v potravinách Autentifikácia potravín (napr. sója v mäsových výrobkoch)

Práca bola podporená z projektov: APVV: • „Charakterizácia bakteriálnych spoločenstiev slovenských vín pomocou molekulárno-biologických metód (Baktvin)“ APVV-0344-12 • „Rozšírenie vedeckých poznatkov o kvalite a bezpečnosti Slovenskej bryndze modernými mikrobiologickými, molekulárno-biologickými a chromatografickými metódami" (BryndzaPro) (APVV0590-10). • APVV-0498-12 "Štúdium genómovej variability Listeria monocytogenes so zameraním na kmene schopné prežívať v potravinárskych prevádzkach" ASFEU: • „Efektívne metódy kontroly pre bezpečné potraviny“, ITMS 26240220089 • „Centrum excelentnosti pre kontaminujúce látky a mikroorganizmy v potravinách“, ITMS projektu 26240120042 • „Využitie vedeckých poznatkov pre kvalitné a zdravé potraviny“, ITMS projektu 26240220090 Rezortných projektov: • 08W0301 „Rozvoj progresívnych metód a postupov pre zabezpečenie procesu kontinuálneho zvyšovania kvality a bezpečnosti vo výrobe a kontrole potravín" • 08W0301 "Autentifikácia produktov a charakterizácia krížovej kontaminácie rastlinných alergénov„ RP EÚ: • FP7-KBBE-2010-4/265877 "Protection of consumers by microbial risk mitigation through combating segregation of expertise" (PROMISE)

Ďakujem za pozornosť.

BEZPEČNÉ A KVALITNÉ POTRAVINY

Recommend Documents