Beads cytokiny v séru detekce buněčných proteinů
75 min • něco o kuličkách • diagnostické aplikace • výzkumné aplikace • jak měříme cytokiny • jak měříme intracelulární proteiny • kam směřujeme?
Proč kuličky? ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) gold standard for clinical use ELISA reader colorimetry (chemiluminiscence) flat surface (96well plate) on well = one antigen x Multiplex ELISA (www.quansysbio.com, www.mesoscale.com) sample volume 25uL time and cost > tissue culture supernatant samples x serum x plasma sensitivity (0,1pg/mL)
Bead Array research flow cytometers or Luminex 100 System fluorescence spherical beads high-throughput multiplex analysis x cross-reactivities, software sample volume 25uL time and cost < tissue culture supernatant samples x serum x plasma sensitivity (0,2pg/mL)
Kuchel et al. ELISA AND MULTIPLEX TECHNOLOGIES FOR CYTOKINE MEASUREMENT IN INFLAMMATION AND AGING RESEARCH, J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2008 August ; 63(8): 879–884. McCoy et al. Multiplex Bead Array Assays: Performance Evaluation and Comparison of Sensitivity to ELISA, Methods. 2006 April ; 38(4): 317–323.
10−3 g
milligram
10−6 g
microgram
10−9 g
nanogram
10−12 g
picogram
10−15 g
femtogram
10−18 g
attogram
10−21 g
zeptogram
10−24 g
yoctogram
Typy cytometrických kuliček FlowCytomix™ www.ebioscience.com eBioscience
Fluorescence parameters and two size discriminators
Yes (up to 20) Compatible with most flow cytometers, including single laser instruments.
Assays for cytokines, chemokines, CRP, coagulation factors, apoptosis and adhesion molecules in blood, serum, and tissue culture supernatant.
H.-Y. Hsu et al. Electrophoresis 2009, 30, 4008–4019
Vazba proteinů na kuličky
http://www.invitrogen.com
- NH2
H.-Y. Hsu et al. Electrophoresis 2009, 30, 4008–4019
http://www.bangslabs.com/
Imunoglobulin vazebné proteiny Species Human
Antibody Class Total IgG IgG 1, IgG2 IgG3 IgG4 IgM IgD IgA IgA1, IgA2 IgE Fab ScFv
Protein A S S W S W NB W W M W W
Protein G Protein A/G Protein L S S S S S S S S S S S S NB W S NB NB S NB W S NB W S NB M S W W S NB W S
W = weak binding, M = medium binding, S = strong binding, NB = no binding
rekombinantní Protein G (65/58kDa) rekombinantní Protein A (56kDa)
Streptococcus
Staphylococcus aureus
rekombinantní Protein A/G (50kDa) rekombinantní Protein L (76kDa)
Peptostreptococcus magnus
(váže kappa lehké řetězce)
http://www.biosyn.com/tew.aspx?qid=230
Otázky k publiku Konjugujete se sami proteiny nebo jiné molekuly na kuličky?
http://clip.lf2.cuni.cz/cs/
Bead-arrays v diagnostice AtheNA Multi-Lyte® Test System
www.zeusscientific.com Infectious T. pallidum IgG ToRCH IgG MMV IgG HSV-1&2 IgG EBV IgG/IgM Borrelia VlsE-1 IgG/pepC10 IgM MMRV IgG
Antigen
Autoimmune
Treponema pallidum Toxoplasma gondii, Rubella, CMV, HSV Measles, Mumps, Varicella-zoster
HSV EBV Borrelia
Antigen
ANA II ANA III Autoimmune Vasculitis TPO/Tg
SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Centromere B, Histone
RF IgM
RF
SSA-52, SSA-60, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Centromere B, Ribosomal P MPO, PR3, GBM Thyroid Peroxidase (TPO), Thyroglobulin (Tg)
Measles, Mumps, Rubella, Varicella-zoster
BioPlex 2200 System
www.bio-rad.com Infectious
Antigen
Autoimmune
Antigen
EBV IgG/IgM
EBV
ANA Screen with MDSS
Syphilis IgG/IgM
Vasculitis
ToRC IgG/IgM
Treponema pallidum Toxoplasma gondii, Rubella, CMV
Anti-CCP (RA)
HSV-1 & HSV-2 IgG
HSV
Antiphospholipid Syndrome, SLE
Cardiolipin, Beta-2 Glycoprotein I
MMRV IgG
Measles, Mumps, Rubella, Varicella-zoster
Celiac Disease
(currently in development)
HIV/Hepatitis
(currently in development)
Lyme Borreliosis
(currently in development)
MPO, PR3, GBM Cyclic Citrullinated Peptide
(Luminex)
Otázky k publiku Používáte Luminex technologii? Používáte bead-array testy v diagnostice?
http://clip.lf2.cuni.cz/cs/
Bead-arrays ve výzkumu Jednoduché testy - cytokiny, fúzní proteiny, … Multiplexy - cytokiny, proteiny v séru, intracelulární a povrchové buněčné proteiny
MultiScreenHTS Vacuum Manifold
Cytokiny v séru I FlowCytomix Simplex Kit FlowCytomix™ Combination Table
http://www.ebioscience.com/resources/flowcytomix-combination-table.htm
Cytokiny v séru II FlowCytomix
Human Th1/Th2 11plex
Multiplex Kit
Human (Mouse) Th1/Th2/Th9/Th17/Th22 13plex IFN-gamma IL-1beta IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-9
IL-10 IL-12 p70 IL-13 IL-17A IL-22 TNF-alpha
biotin
http://www.ebioscience.com
rozliššen eníí populac populacíí (APC) rozli
streptavidinstreptavidin-PE
kvantifikace (PE)
Cytokiny v séru III
Cytokiny v séru IV
Cytokiny v séru V
Cytokiny v séru VI
Cytokiny v séru VII
Cytokiny v séru VIII
Cytokiny v séru IX O. Beran, FN Na Bulovce
Jak zvýšit senzitivitu?
plazmy a séra neředit plazmy a séra používat čerstvé, max. 1x zamražené plazmy a séra skladovat v -80°C, max měsíce cytometr x detektor pro PE (modrý x žlutý laser) ? použít jiný kit
Cytokiny v séru X CBA Enhanced sensitivity
http://www.bdbiosciences.com
Cytokiny v séru XI
APC--H7 APC
CBA Enhanced sensitivity
APC
normal sensitivity
enhanced sensitivity streptavidinstreptavidin-PE
PE biotin
Analýza: FCAP Array software : Diva, …
http://www.bdbiosciences.com
Otázky k publiku Měříte cytokiny v séru / plazmě? Jakou technologii používáte? Jste spokojeni se senzitivitou? Jak dlouho vydrží cytokiny v zamražené plazmě bez degradace?
http://clip.lf2.cuni.cz/cs/
Buněčné proteiny I
Luminex
http://www.bdbiosciences.com
http://www.ebioscience.com
Buněčné proteiny II
2,5mil buněk 4-5h PML-RARA Dekking et al. Leukemia 2012 Currently in development: TEL-AML1, E2A-PBX1, MLL-AF4, AML1-ETO and CBFB-MYH11 http://www.bdbiosciences.com
Co je možné / nemožné? Myslíte, že je možné detekovat v jednom vzorku více než 1700 proteinů najednou?
Co je možné / nemožné? Myslíte, že je možné kromě exprese proteinu detekovat i jeho velikost?
Size-exclusion Chromatography
FPLC = fast protein liquid chromatography
24 frakcí 670 kDa – 10 kDa
Princip SEC-MAP Size-exclusion Chromatography - Microsphere-based Affinity Proteomics 1 2 3 4 5 6 7
izolace proteinů značení proteinů biotinem rozdělení proteinů na chromatografické koloně imunoprecipitace chromatografických frakcí se SEC-MAP array detekce proteinů pomocí streptavidinu-PE měření na průtokovém cytometru analýza
protein G PROTEIN-BIOTIN
STREPTAVIDIN - PE
Goat anti Mouse Mouse anti Human
Wu, Antibody array analysis with label-based detection and resolution of protein size. Mol Cell Proteomics 2009 Slaastad, Multiplexed immuno-precipitation with 1725 commercially available antibodies to cellular proteins. Proteomics 2011 Stuchly, An automated analysis of highly complex flow cytometry-based proteomic data. Cytometry A 2012
Jak vypadají výsledky? automatická detekce populací kuliček
definice proteinových forem
čárový graf
kvantifikace
Značení proteinů I Biotin
EZ-link NHS PEO4 Biotin
http://www.piercenet.com
Značení proteinů II Fluorochromy
Amine-Reactive Probes Active esters succinimidyl esters (SE), sulfosuccinimidyl esters (SSE) tetrafluorophenyl esters (TFP) sulfodichlorophenol esters (SDP) Isothiocyanates (ITC) Sulfonyl chlorides (SC) př: Alexa Fluor 488® Succinimidyl Esters
Thiol-Reactive Probes Maleimides TS-Link™ Reagents př: Alexa Fluor® 488 C5 Maleimide
http://www.invitrogen.com
Na co dávat pozor? Jak správně vyizolovat protein? slabé x silné detergenty (lokalizace proteinu v buňce) Poly [ADP-ribose] polymerase
Apoptosis regulator BAX
Cytoplasm Organelles Nucleus Membranes
inhibitory proteáz (leupeptin, aprotinin, PMSF,…) a inhibitory fosfatáz (Na3VO4,…) … lze přidat přímo k buňkám před izolací proteinu degradace proteinů v čase !!!
Čas mezi odbě odběrem vzorku a zpracová zpracováním Apoptó Apoptóza po stimulaci Kontaminace granulocyty Opakované Opakované rozmraž rozmražová ování
Na co dávat pozor? kvantita proteinu
Specifita protilátek
snižující se velikost
streptavidinstreptavidin-PE biotin
Vyzkouš Vyzkoušet rů různé zné klony protilá protilátek proti jednomu antigenu Kity … věřit ěřit firmě firmě Imunoprecipituje protilá protilátka nativní nativní nebo denaturovaný protein? 0,2% SDS, 100° 100°C
Otázky k publiku Měříte intracelulární proteiny bead-array technologií? Jakou technologii používáte? Vidíte také degradaci proteinů v čase?
http://clip.lf2.cuni.cz/cs/
Děkuji za pozornost
http://clip.lf2.cuni.cz/cs/
