A BIOTECHNOLÓGIA MŰSZAKI HÁTTERE Az enzimaktivitás növelése szerves közegben Tárgyszavak: enzimkatalízis; szerves közeg; enzimaktivitás növelése. Nemvizes közegben végzett enzimatikus katalízis specifikussága, szelektivitása, hőstabilitása javítható, amelynek segítségével új bioszintézisek végzésére nyílik lehetőség. Gyakorlati szempontból a szerves közegben végbemenő reakció segítségével elválaszthatók a királis molekulák, ezen az úton enantioszelektív szintézisek, kombinatorikus biokatalízisek végezhetők és lehetővé válik új gyógyszerhatóanyagok kidolgozása. Ugyanakkor ismeretes a nemvizes közegben végbemenő enzimatikus reakciók lényegesen kisebb katalitikus hatásfoka a vizes közegben működő enzimnél. Jó példa erre a szubtilizin Carlsberg (SC) szerin proteáz tetrahidrofurán közegben mért átészterezési aktivitása, amely ötöde a vizes közegben mért aktivitásnak. A szerves oldószerben mért aktivitás növelésének lehetőségével már évek óta foglalkoznak a szakemberek. A kísérletekben többek között erősen hidrofób oldószert, liofilizáláskor fellépő sokkhatást kivédő (lyoprotectant) vegyületeket alkalmaztak, az enzim oldhatóságát különböző felületaktív anyagok adagolásával próbálták javítani, növelték az oldószer víztartalmát. Legjobb eredményt az enzim szervetlen vegyületekkel, sókkal együtt végzett liofilizálásakor kapták. Olyan egyszerű sók alkalmazásával, mint a KCl és NaCH3 COO többszörösére nőtt az enzim aktivitása, de optimális körülmények között még húszezerszeres javulást is sikerült elérni. A sóval aktivált enzim nemvizes közegben mért katalitikus aktivitása több tényezőtől függ. Ezek közé tartozik a liofilizálandó enzimoldat víztartalma, polaritása és pH-ja, de emellett szerepet játszik az aktív rész polaritása, a fagyasztva szárítás időtartama, a liofilizált enzim víztartalma és az aktiváló só kozmotropikussága. (A kozmotróp só és a vízmolekula közötti kötés erősebb, mint a vízmolekulák közötti kötés.) A gyógyszergyártásból jól ismert jelenség, hogy a fehérjetartalmú gyógyszerek hatásossága nagymértékben függ a fehérje tisztításánál és előállításánál alkalmazott eljárástól. A vízmentes közegben végbemenő enzimreakcióknál ugyancsak döntő szerepet játszanak az előállítás körülményei. Az enzimaktivitásban sóadagolás hatására bekövetkezett nem várt mértékű javulás ellenére a nemvizes közegben mért reakciósebesség értéke nagyságrendekkel kisebb a vizes közegben mértnél. A jóval magasabb aktivi-
tást ugyanakkor csak a végtermék igen nagy sókoncentráció-értékei mellett érték el (98 %(m/m)), ami kompromisszum a hatékonyság és a gyakorlati megvalósíthatóság között. A következők a vízmentes hexánban oldott SC szerin proteáz aktivitásának növelésével elért eredményeket ismertetik. Kiemelt figyelmet szenteltek az enzim liofilizálását megelőző fagyasztás körülményeinek, a különböző „lyoprotectant” vegyületeknek (cukrok és polietilénglikol = PEG), az adalékanyagok koncentrációjának, az adalékanyagok és sók kombinációjának, az oldószer és végtermék nedvességtartalmának. A tulajdonképpeni kérdés, hogy az enzimreakció katalitikus aktivitása nem-vizes közegben elérheti-e a vizes közegben mért értéket. Kísérleti rész Enzimminta-előállítás Az enzimet háromszori átkristályosítással és liofilizálással por alakban állították elő. Az enzimet a szerves oldószeres felhasználás előtt vizes pufferoldatának liofilizálásával aktiválták. A különböző adalékokat tartalmazó valamennyi enzimkészítmény pufferkoncentrációja (5,89 mmól vagy 1,0 mg/ml) és enzimkoncentrációja (1,0 mg/ml) ugyanaz volt. Az adalékok koncentrációját úgy választották meg, hogy azok összmennyisége a végtermékben 98 %(m/m) legyen. Az egyes mintákhoz a foszfátpufferban oldott (pH = 7,8) koncentrált enzimoldat (10 mg/ml) 2 ml-ét és az adalékot tartalmazó oldat (pH = 7,8) 18 ml-ét 50 ml-es lombikba mérték össze. A fagyasztás előtt minden enzimoldat pH-ját 7,8-ra állították be, amelyhez néhány csepp 100 mmólos KOHoldatot vagy 100 mmólos HCl-oldatot használtak. A karbonáttartalmú minták pH-ját néhány csepp tömény sósavval állították be. A pH-beállításhoz használt mennyiségek nem befolyásolták sem az oldatok pufferkoncentrációját, sem az ionerősséget, ill. össztérfogatot. A fagyasztás négyféle módon történt. A 20 ml oldatot tartalmazó lombikot folyékony nitrogénbe helyezték: – függőlegesen, keverés nélkül, – 10°-os szögben oldalra döntve, keverés nélkül, – 10°-os szögben oldalra döntve és 1 percig 600 ford/min. sebességgel keverve a függőleges tengely körül, – az oldatot folyékony nitrogénbe finom köddé porlasztották, majd a megszárított port lombikba gyűjtötték. A mintákat addig tartották folyékony nitrogénben, míg a pezsgés meg nem szűnt. A liofilezést –50 °C-on 35 Hgmm nyomáson végezték. A folyékony nitrogénben végzett fagyasztás után a mintákat azonnal a liofilező berendezésbe helyezték és 44 órán át liofilizálták. Közvetlenül a liofilizálás befejezése után meghatározták a minták aktivitását és nedvességtartalmát. A mintákat –
20 °C-on nitrogénatmoszférában CaSO4-os exszikkátorban tárolták, és felhasználás előtt szobahőmérsékletre melegítették fel. A sótartalom és az enzimaktivitás közötti összefüggést különböző koncentrációjú sós enzimoldatokkal vizsgálták, amelyek pH-ja 7,8 volt. Ezeknek az oldatoknak 20 ml-ét az előzőekkel azonos módon liofilizálták. A liofilizált minták végső sókoncentrációja 40, 70 és 98 %(m/m) érték volt. A só nélküli kontroll enzimmintákat (pH 7,8; 5 mg/ml) a fentiekkel azonos módon fagyasztották és liofilizálták. A végtermék foszfátpuffer-koncentrációja 1 %(m/m) volt. Kinetikai mérések A kinetikai méréseket N-acetil-L-fenilalanin-etilészter (APEE) vizes pufferoldatával (0,1 m KCl, pH 7,8) végezték el. Ezzel a szubsztráttal határozták meg a kereskedelemben kapható SC és a saját laboratóriumban előállított, só nélküli SC katalitikus állandóit. A reakciót Mettler DL21 pH-stat műszerrel követték 0,1–10 mmól szubsztrát- és 10 µg/ml enzimkoncentráció értékek mellett. A titráláshoz 0,1 n NaOH-oldatot használtak. A kereskedelmi SC aktívhelytartalma 61±2%-nak, a liofilizált mintáé 50±3%-nak adódott. A különböző adalékot és sót tartalmazó liofilizált SC minták katalitikus állandóit vízmentes hexánban határozták meg. A hexán víztartalma (Karl Fischer szerint) kevesebb mint 0,014%±0,002 %(m/m) víz volt. Az átészterezéshez az APEE 1-propanolos oldatát használták. A hexánban oldott SC (sómentes vagy 98 %(m/m) sótartalmú) minta vizsgálatát úgy végezték el, hogy 10 mg liofilizált enzimkészítményhez 5 ml 1–40 mmól APEE-t, 0,85 mmól 1-propanolt és 1,5 mmól nonadekánt (a gázkromatográfiás vizsgálatnál alkalmazott, reakciót nem adó belső standard) tartalmazó hexánt adtak. A reakció 30 °C-on 250 ford/min. keverési sebesség mellett játszódott le. Sómentes minták esetében az első mintavétel 2–6 órás időközökben történt, a sótartalmú mintáknál 25–90 percenként. A méréseket addig folytatták, míg a görbe lineárissá nem vált. A PEG-gel és cukrokkal aktivált enzimminták esetében a kezdeti kisebb sebességet 60–150 perc között észlelték. A fenti időtartam alatt a görbe lineáris összefüggést mutatott. Ugyanezeket a méréseket elvégezték enzimet nem tartalmazó mintákkal is, amiből a háttérértékeket (vak) kapták meg. Az enzimet nem tartalmazó mintáknál a vizsgálat 6 órás időtartama alatt a konverzió <0,1% volt, ami az enzimtartalmú minták értékeihez viszonyítva elhanyagolható. Azokban a kísérletekben, amelyeknél a szerves oldószerhez vizet adagoltak, az APEE-t először nagy koncentrációban oldották fel az 1propanolban, majd ehhez annyi vizet adtak, hogy a hexán hozzáadása után az oldat végső propanolkoncentrációja elérte a 0,85 mólt, a szubsztrát koncentrációja pedig a 20 mmólt. A kinetikai mérések kivitelezése a következőképpen történt: a lombikba 10 mg enzimkészítményt mértek, ehhez a külön-
böző víztartalmú oldatokból 5 ml-t adtak. A mintavételezés az előbbiek szerint történt, de mivel az enzim a vízmentes közegben gyorsabban dezaktiválódott, a mérésekre 8–20 percenként került sor. Ez alatt a sebesség nem változott. Gázkromatográfiás mérések A reakcióelegy vizsgálatához a homogén szuszpenzióból 500 µl-t vettek ki, ezt 14 000 ford/min. sebességgel 25 s-ig centrifugálták. Az APPE (N-acetilL-fenilalanin-propilészter) átészterezésekor keletkező reakciótermék a felülúszóban gyűlt össze, amelyet gázkromatográfiásan elemeztek. Az eredményt három párhuzamos mérés átlagából számították ki. Az indulási sebességet az átlagértékekhez illeszkedő egyenes segítségével határozták meg. A kinetikai adatokat (νmax)látszólagos és (Km)látszólagos úgy kapták meg, hogy a kezdeti sebességértékeket behelyettesítették a Michaelis–Menten egyenletbe. A tényleges katalitikus aktivitást (kkat/Km)látszólagos úgy kapták meg, hogy a (νmax/Km)látszólagos értéket az enzim titrálásakor az aktívanyag-tartalomra kapott értékkel normalizálták. A szerves oldószerben oldott enzim aktívanyag-tartalmát Wangikar módszerével határozták meg. A kinetikai paraméterek reprodukálhatóságát két mintán végzett külön-külön mérési adatok alapján ellenőrizték. Víztartalom-meghatározás Az oldószer és a liofilizált enzimkészítmény nedvességtartalmát KarlFischer módszerrel mérték. A liofilizált minta nedvességtartalmát három mérés eredménye alapján számították ki. A szerves oldószerek nedvességtartalmát hasonló módon határozták meg. Eredmények A fagyasztás módjának hatása A liofilizálást megelőző fagyasztási körülmények hatását az 1. táblázat foglalja össze. A sót nem tartalmazó és a KCl-lel aktivált SC katalitikus aktivitása a következő sorrendben nőtt: „straight” (egyenes), „slant” (ferde), „shell” (kéreg) és „spray” (permet). A víztartalom viszont ugyanebben a sorrendben csökkent. A katalitikus aktivitás javulása sokkal inkább a kkat növekedésének volt köszönhető, mintsem a Km csökkenésének. Valójában a Km valamennyi fagyasztási eljárásban közel azonos volt, a KCl-lel aktivált enzim esetében hatoda volt a sómentes minta értékének. Az enzim aktívhelytartalma a sómentes és sóval aktivált enzimben a fagyasztási módszer hatására viszont ellentétes irányú változást mutatott: a „straight” módszertől a „spray” felé haladva a sómentes készítmény aktívhelytartalma csökkent, míg a sótartalmú mintáké nőtt.
1. táblázat A fagyasztás módjának hatása a sómentes és KCl-tartalmú subtilizin Carlsberg (SC) jellemzőire Fagyasztás módjaa
Straight
Slant
Shell
Spray
9,80
8,39
8,10
Sómentes Víztartalom (%(m/m))
11,6
Aktívhelytartalom, %
21,4
kkat
×103
(s-1)
Km (mM) kkat/Km (s-1M-1)
4,73 38,3
20,2 5,22 38,9
18,8 6,66 38,2
16,3 9,99 37,1
0,124
0,134
0,174
0,269
0,974
0,884
0,754
0,714
98 %(m/m) KCl-tartalmú minta Víztartalom (%(m/m)) Aktívhelytartalom, % kkat
×103
(s-1)
Km (mM) kkat/Km (s-1M-1)
29,8 950 6,83 139
34,7 1050 6,66 158
48,9 1230 6,38 193
56,4 1300 6,44 202
aA
fagyasztás részletes leírása a szövegben található. Az értékek három mérés átlagából adódtak, amelyek százalékos eltérése a következő volt: nedvességtartalom: 1,0 – 5,5%; aktívhelytartalom: 6,8 –9,4%; kkat : 5,2 – 10%; Km : 2,3 – 6,3%; kkat/Km : 7,8 – 12%.
A „lyoprotectant” vegyületek és cukrok hatása Négy közismert „lyoprotectant” polihidroxi-vegyület hatását vizsgálták az enzimaktivitásra gyakorolt hatás szempontjából: PEG, szorbit, szacharóz és trehalóz. Az eredményeket a 2. táblázat mutatja be hexánban oldott sómentes és sóval aktivált készítmények esetében. Az alkalmazott koncentrációtartományban legnagyobb aktivitásnövekedést a KCl eredményezett (νmax/Km véve alapul 1920-szoros), ezt követte a PEG (138-szoros), míg a szorbit és a másik két cukorféleségnél lényegesebb kisebb javulást (20-szoros vagy ennél is kisebb) észleltek. A KCl és PEG kombinációjával elért aktivitásnövekedés és a víztartalom a csak egy adalékot tartalmazók értékei közé esett. Érdekességképpen érdemes megemlíteni, hogy ezek az értékek jóval magasabbak voltak a korábbi munkákban más szerzők által között értékeknél. A sótartalom hatása KCl esetében megfigyelték, hogy az aktivitást növelő hatás a koncentráció csökkenésével meredeken zuhan. Ugyanezt tapasztalták a többi adalék
esetében is, beleértve a PEG-et és más sókat is (ez utóbbiakra vonatkozó adatok nincsenek feltüntetve). A 3. táblázatban láthatók a KCl-lel és NaHCO3mal aktivált SC eredményei. Az eredmények jól mutatják, hogy kisebb koncentrációknál a NaHCO3 hatásosabb. Érdemes kiemelni, hogy míg a KCl-lel aktivált SC víztartalma a sókoncentráció növekedésével csökkent, NaHCO3 esetében a sótartalom és víztartalom közötti összefüggés ellenkező irányú. 2. táblázat A „lyoprotectant” vegyületek hatása az SC aktivitására Adaléka
KCl
νmax (µM APPE min-1mg-1 enzim-1)b
175
Km (mM)
7,04
νmax/Km
24,9
Víztartalom (%)
1,02
KCl/PEG
84,9
17,2
4,94
6,48
PEG
56,9
31,8
1,79
12,2
Szorbit
15,8
60,8
0,260
19,5
Szacharóz
8,95
50,2
0,178
15,3
Trehalóz
2,21
40,7
0,054
18,7
Adalék nélküli
0,496
38,2
0,013
13,8
a b
A minta összsótartalma 98 %(m/m) volt. A maximális sebesség értékét mg enzimre normalizálták.
3. táblázat Az adaléktartalom hatása az SC aktivitására Adalék %(m/m)
νmax (µM APPE min-1mg enzim-1)a
Km (mM)
νmax/Km
98% KCl
165
6,85
24,1
98% NaHCO3
121
4,77
25,4
70% KCl 70% NaHCO3
0,97 11,9
12,4
0,078
15,4
0,773
40% KCl
0,513
17,8
0,029
40% NaHCO3
3,31
23,2
0,143
0% só nélkül
0,496
38,2
0,013
a
A maximális sebesség értékét mg enzimre normalizálták.
Víztartalom (%)
0,886 21,3 2,86 18,6 5,33 15,2 9,53
Az adalék kezdeti koncentrációjának hatása A 98 %(m/m) KCl-tartalmú készítménynél a kiindulási oldat sókoncentrációja eltérő lehet, ezért megvizsgálták a különböző kezdeti sókoncentráció és a szerves oldószerben oldott enzim aktivitása közötti összefüggést. Az 1. ábrán láthatók a vizes oldatból készült, 98 %(m/m) sóval aktivált SC kinetikai paraméterei a fagyasztás előtti oldat különböző KCl-koncentrációi mellett. A katalitikus aktivitás 76,4–252 s-1 M-1 között változott, és 1 mól KCl kiindulási koncentráció esetében mérték a maximális kcat/Km értéket.
30
300
● ) 25
▲ ■
/
20
kkat/Km (s--1M –1
Km (mM) kkat (s-1 ) víztartalom (%
250
200
15
150
10
100
5
50
0
0
1
2
3
4
5
0
a KCl kiindulási koncentrációja (mól)
1. ábra A 98 %(m/m) KCl-lel aktivált SC hexánban mért kinetikai paraméterei a KCl kiindulási mólkoncentrációjának függvényében
A készítmény nedvességtartalma 1,01 %(m/m)-ről 0,405 %(m/m)-re csökkent, míg a vizes KCl-oldat koncentrációja 0,33 mólról 4,67 mólra nőtt. Általánosságban elmondható, hogy a katalitikus aktivitásra a kkat változás nagyobb hatással van, mint a Km. Hasonló jelenséget észleltek a NaCH3COO-val és NaHCO3 sókombinációval aktivált SC esetében (adatokat nem közöltek), ugyanakkor a maximum- és minimumértékek közötti különbség nem több mint háromszoros. Legnagyobb aktivitás közepes sókoncentrációnál, 1 mól körül mutatkozott. Kombinációban alkalmazott adalékok hatása A KCl és PEG együttes alkalmazásának hatásáról már bebizonyosodott, hogy a csak KCl, ill. csak PEG-tartalmú mintákra kapott értékek között helyezkedik el (4. táblázat). A további vizsgálatokkal sikerült igazolni, hogy két só együttes alkalmazásával még tovább javítható az aktivitás. A 2. ábrán a NaCH3COO és NaHCO3 különböző kombinációival kapott SC aktivitásértékei láthatók. Minden kombinációban a sók összmennyisége 98 %(m/m) volt. A Km értéke egyenletesen nőtt a csak NaHCO3-t tartalmazó mintától a csak NaCH3COO-t tartalmazó mintáig. A νmax értéket ugyanakkor a 24,1 %(m/m) NaCH3COO és 73,9 %(m/m) NaHCO3 sóösszetételnél mérték, ami az optimális 200 µmól APPE/perc/mg/mmól APEE νmax/Km értéknek felelt meg. Ez az érték a KCl-lel aktivált minta katalitikus aktivitásának nyolcszorosa. 4. táblázat A különböző adalékkombinációk hatása az SC aktivitására νmax (µM APPE min-1mg enzim-1)a
Km (mM)
98% KCl
165
6,85
24,1
98% NaHCO3
121
4,77
25,4
98% NaCH3COO
508
98% KHCO3
667
4,32
66,7/31,3% KCl/NaHCO3
287
6,80
35,6/62,4% KCl/NaCH3COO
386
Adalék %(m/m)
73,9/24,1% NaHCO3/NaCH3COO 57,8/40,2% KHCO3/NaCH3COO a
12,7
11,0
1570
7,86
604
5,90
A maximális sebesség értékét mg enzimre normalizálták.
νmax/Km
40,1 154
Víztartalom (%)
0,886 22,3 2,76 20,0
42,3
6,88
35,1
5,33
200 81,2
17,3 11,7
508
720
761
890
1326
1482
1571
1366 599
12.68
9.79
9.54
8.69
8.26
8.03
7.86
7.58
5.22
119 4.08
2. ábra A NaCH3COO/NaHCO3 sókombinációt tartalmazó SC hexánban mért kinetikai paraméterei a különböző sótartalmú kombinációk függvényében (a minta összes sótartalma 98 %(m/m)). A törtvonal előtti érték a NaCH3COO koncentrációjára vonatkozik, νmax – fehér oszlop, Km – szürke oszlop, νmax/Km – fekete oszlop. Az értékek három, a szövegben leírt módon előállított minta átlagából származnak. A hiba egyszeres standard deviációt jelöl A 4. táblázatban további olyan sókombinációk szerepelnek, amelyekkel az egyetlen sóval kapott enzimaktivitás-érték többszörösét lehetett elérni. A sókombinációkra a 2. ábrához hasonló összefüggés készíthető, a 4. táblázat az optimális νmax/Km értékeket foglalja össze. Itt is elmondható, hogy az enzimaktivitás ugrásszerű emelkedése sokkal inkább a νmax jelentős növekedésének a következménye, mint a Km számottevő csökkenésének. A NaHCO3/NaCH3COO sókombinációval aktivált enzimkészítmény aktívhelytartalma Wangikar módszere szerint 42±8% volt. Az ebből számított (normalizált) kkat/Km érték 1180/s M volt, ami a csak NaCH3COO-al aktivált SC aktivitásának mintegy ötszöröse. A 2. ábrán szereplő minták nedvességtartalma a 3. ábrán látható. A nedvességtartalom a csak NaHCO3-ot tartalmazó készítmény 22,3±1,2% értékéről egyenletesen csökkent a csak NaCH3COO-t tartalmazó készítmény 2,76±0,3% értékére. Hasonló tendenciát tapasztaltak a sóval, a PEG+sóval és a só–só kombinációval aktivált készítmények esetében is. Általánosságban elmondható, hogy a kétkomponensű adalékot tartalmazó száraz enzimkészítmény víztartalma lineárisan változott az egyes adalékok %-ával és víztartalmával. Ez még abban az esetben is fennállt, amikor az egyik adalék maga az enzim volt.
25
víztartalom, (%(m/m))
20
15
10
5
0 0
20
40
60
80
100
NaCH3COO-tartalom, (%(m/m))
3. ábra A 2. ábrán szereplő minták nedvességtartama
A szerves oldószerhez adagolt víz hatása A 4. ábrán látható a 73,9 %(m/m) NaHCO3 és 24,1 %(m/m) NaCH3COO sókombinációval aktivált SC indulási aktivitása 20 mmól APEE-t és 0,85 mól 1-propanolt tartalmazó hexánban. Az indulási víztartalom részben a száraz hexán saját víztartalmából (0,014±0,002 %(m/m)) részben a katalizátor saját víztartalmából (17,3±0,7 %(m/m)) adódott. A 0,85 mól 1-propanolt tartalmazó hexán telítésekor a víztartalom 0,48 %(m/m) volt. Ezen víztartalom felett az átlátszó, homogén folyadékfázis két fázisra vált szét. A kezdeti reakciósebesség 0,05 %(m/m) víztartalomtól kezdődően lineárisan emelkedett, az SC aktivitása pedig a száraz hexánban mért aktivitás kétszeresére nőtt. A propanolkoncentráció további emelésével egészen 1,5 mólig és 0,8 %(m/m)
víz adagolásakor az SC aktivitása tovább nőtt. Ebben az esetben a következő kinetikai állandókat mérték: νmax =1910 µmól APPE/mg enzim/perc, Km = 5,42 mmól, vmax/Km = 352 µmól APPE/mg enzim/perc/mmól APEE, ami a kezeletlen enzim aktivitásának több mint 27 000-szerese.
indulási reakciósebesség (µM APPE/mg enzim/min)
1600
1400
1200
1000
800
600 0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
víztartalom, (%(m/m))
4. ábra 24,1 %(m/m) NaCH3COO/73,9 %(m/m) NaHCO3 sókombinációt tartalmazó SC aktivitásnövekedése a hexánhoz adagolt víz mennyiségének függvényében. Az értékek két mérés átlagából származnak. A hiba egyszeres standard deviációt jelöl
Értékelés A fehérje- és gyógyszer-előállításban a liofilizálásnak fontos szerepe van. A fagyasztás és szárítás kapcsán a fehérjét érő stressz hatására irreverzibilis változás következik be, ami sok esetben denaturálodáshoz, aggregációhoz és az aktivitás elvesztéséhez vezethet. A fagyasztás során fellépő kedvezőtlen
hatásokat több tényező idézi elő. Ezek közé tartozik az oldat bekoncentrálódása, a hűtés sebessége, a hőmérséklet és a felmelegítési idő. Mindez ugyanakkor kapcsolatban áll a keletkező jégkristály méretével, a felület morfológiájával és a száraz készítmény szerkezetével. Általános elv, hogy lassú hűtés hatására nagyméretű jégkristályok képződnek, aminek következtében az amorf üveges fázis bekoncentrálódik és olyan környezet alakul ki, amely lényegesen eltér az enzim vizes oldatában uralkodó körülményektől. A fagyasztás során nagy pH-változás következik be, ami a még meg nem fagyott fázisban levő anyagok kicsapódásához vagy fázisátalakuláshoz vezethet. A száraz fehérjekészítmény ismételt vizes feloldásától eltérően a szerves oldószerben való feloldáskor a liofilizálás alatt elszenvedett szerkezeti változás vagy aktivitáscsökkenés megmarad. Ebből következik, hogy a sómentes és sóval aktivált szerves oldószerben oldott szerin proteáz SC enzim aktivitását a fagyasztás módja és körülményei nagymértékben befolyásolják. A szublimációra rendelkezésre álló felület növekedésével a végtermék nedvességtartalma csökken. A só nélküli és a sótartalmú készítmény végső nedvességtartalma a só higroszkópos tulajdonságától is függ. Például a KCllel aktivált SC enzimkészítmény nedvességtartalma egy nagyságrenddel kisebb volt a sómentes készítményénél, amiben szerepe volt az enzimnél kevésbé higroszkópos KCl finomabb diszperziójának is. Mindkét készítmény katalitikus aktivitása a fagyasztási sebesség emelésével arányosan nőtt. Nagy fagyasztási sebesség esetén a sótartalmú enzimkészítmények aktív helyeinek százalékos aránya is magas. A só az enzim körül védő mátrixot képez, ezáltal védőhatást fejt ki az enzim aktivitására. A gyakorlati szakemberek előtt ismeretes, hogy a liofilizált gyógyszerek és enzimek stabilitása és hatásossága különböző töltőanyagok, így pl. PEG vagy cukrok hatására megmarad, sőt egyes esetekben még tovább növelhető. A jelenség magyarázata a polihidroxi-vegyületek stabilizáló hatásában keresendő. Valószínűleg szerepet játszanak a fagyasztva szárítás alatt bekövetkező üvegszerű amorf szerkezet kialakulásában, részben pedig az enzimmel képezett hidrogénhidak létrehozásában vesznek részt. Ezek a hidak a fehérjéhez kötött víz hidrogénhídjait helyettesítik, mivel az enzim a fagyasztva szárítás alatt vizet veszít. A négy különböző „lyoprotectant” vegyülettel végzett kísérletben csak a PEG-gel értek el jelentős aktivitásnövekedést, ami a sómentes készítmény νmax/Km értékének 137-szerese volt. Ugyanakkor ez az érték a KCl-lel mért katalitikus aktivitásnak tizennegyed része, amiből arra lehet következtetni, hogy szerves oldószerben a sóval aktivált enzimnél a „lyoprotectant” hatás mellett egyéb tényezők is szerepet játszanak. Tény, hogy a só hatására bekövetkező többezerszeres katalitikus aktivitásnövekedés csak igen magas sókoncentrációknál, >90 %(m/m), jelentkezik. Ez a nagyüzemi termelésben hátrányt jelent. Több kísérletben beigazolódott, hogyha a sókoncentráció 98%-ról 90%-ra csökken, a katalitikus aktivitás jelentősen romlik. Termelékenységjavulást hozó enzimkoncentráció növeléséből
származó előny az enzim speicifikus aktivitása szempontjából kompromiszszum. A 3. táblázatban feltüntetett adatokból látható, hogy ez a nem kívánt jelenség körültekintően megválasztott adalékkal kiküszöbölhető. A NaHCO3mal aktivált készítmény alacsonyabb sókoncentrációja esetén ugyanolyan aktivitást értek el, mint KCl-lel. Például a 70 %(m/m) NaHCO3-mal kapott enzimaktivitás a KCl-lel kapott érték tízszerese. Hasonló eredményt született a kozmotróp NaCH3COO-val, ill. a NaCH3COO és NaHCO3 kombinációjával is. Az 1. ábrából jól látható, hogy a hexánban oldott enzim aktivitása a kiindulási oldat KCl-koncentrációjától függ annak ellenére, hogy a végtermék sókoncentrációja minden esetben 98 %(m/m) volt. Alacsony sókoncentrációknál egészen 1 mól KCl értékig nő a katalitikus aktivitás, a sókoncentráció további növelésével csökken. A katalitikus aktivitás értéktartománya nem széles, kb. háromszoros és még a legalacsonyabb aktivitás is közel 500-szorosa a sómentes enzim aktivitásának. A jelenség egyik lehetséges magyarázata, hogy a KCl viszonylag nagy kezdeti moláris koncentrációjának hatására erőteljes dehidratáció megy végbe, ezen kívül a készítmény végső nedvességtartalma csekély. Az eredményekből az a következtetés vonható le, hogy a szerves oldószerben oldott enzimek sóval végzett aktiválásakor az eredmény döntően a végtermék nedvességtartalmától és az alkalmazott sókoncentrációtól függ. A nagy sókoncentráció meghatározó szerepet játszik a liofilizáláskor kialakuló por szerkezetében azáltal, hogy megakadályozza jégkristály képződését és az oldat bekoncentrálódását, továbbá kedvezően befolyásolja a végtermék általános morfológiáját. Már korábban beigazolódott, hogy az enzimek sóval végzett aktiválásában meglepően jó eredménnyel alkalmazhatók az erősen kozmotróp sók, így pl. a NaCH3COO (Jones Dole B koefficiens = 0,250). Bár PEG-gel együtt alkalmazva nem hozott jelentős javulást, ennek ellenére nem zárható ki az egyes sók kombinációjával elérhető javulás. Erre vonatkozóan két sóval (NaCH3COO és NaHCO3) végeztek kísérletet. Ennek során nem változtatva az ionerősséget a végtermék adalékanyag-koncentrációját változatlanul 98 %(m/m)-re állították be. A 2. ábrán jól látható, hogy a két só kombinációjával a katalitikus aktivitás jelentősen nőtt ahhoz képest, amikor csak egy sót használtak. Az optimumot 24,1 %(m/m) NaCH3COO és 73,9 %(m/m) NaHCO3 értéknél érték el. A szinergetikus hatás annak köszönhető, hogy mindegyik komponens megőrizte korábbi saját előnyös tulajdonságát, az acetát nagyfokú kozmotropikusságát, a karbonát pedig nagy pufferkapacitását az optimális pH tartományban. A NaHCO3 liofilizációs tulajdonsága a NaCH3COO-énál kedvezőbb, ugyanis a karbonát üvegesedési hőmérséklete –52 °C, az acetáté –64 °C. Ezen kívül pH = 7,8 értéken a NaHCO3 disszociációjakor kis mennyiségű igen erősen kozmotróp CO23- anion képződik (B koefficiens = 0,301), ami elősegíti az enzim stabilizálását oldatban, majd pedig fagyasztás során. Az erősen kozmotróp sók igen jó liofilizációs tulajdonsággal és nagy
pufferkapacitással rendelkeznek, alkalmazásukkal csökkenthető az enzim környezetének megbomlása, és jobb minőségű végtermék állítható elő. Más sókombinációkkal folytatott kísérletek is hasonló eredményt hoztak, ezek a 4. táblázatban szerepelnek. A két só egymáshoz viszonyított arányát a NaHCO3 és NaCH3COO sókkal folytatott kísérlettel azonos módon változtatták, és az enzimkészítmény aktivitását is ugyanazzal a módszerrel határozták meg. A 4. táblázatban az egyes kombinációk legnagyobb aktivitást adó összetételei láthatók. A KHCO3 és NaCH3COO kombinációja nem adott jobb eredményt, mint a NaHCO3 és NaCH3COO kombináció. Már a korábbi kísérletek is arra utaltak, hogy a KHCO3 az NaHCO3-hoz képest nem növeli a SC enzimaktivitását annak ellenére, hogy általános megfigyelés szerint a káliumsók a nátriumsóknál hatékonyabb aktiválószerek. A KCH3COO üvegesedési hőmérséklete igen alacsony (–76 °C), ami a liofilizáláskor alkalmazott hőmérsékletnél lényegesen alacsonyabb, ennek következtében a 98 %(m/m) KCH3COO-ot tartalmazó SC a liofilizálás során megolvad. A mintákon szabad szemmel is jól kivehető kis „zsebek”, lyukak keletkeznek, ami feltehetően a KCH3COO helyi megolvadása (fázisátalakulás) következtében képződik és megváltoztatja a száraz por eredeti szerkezetét. Ugyanakkor a KHCO3/NaCH3COO sókombinációval aktivált készítmény νmax/Km értéke (81,2 µmól APPE/perc/mg mmól APEE) még mindig háromszorosa volt a csak KCl-lel aktiváltnak, ami az aktivitás egészét tekintve 6200-szoros értéknek felel meg. Az 1., 2. és a 3. táblázatban szereplő KCl-tartalmú enzimkészítmények víztartalmának alakulását követve megállapítható, hogy a katalitikus aktivitás a víztartalom csökkenésével arányosan nő. A jelenség lehetséges magyarázata, hogy a feleslegben levő víz az enzimhez gyengén kötődik, amelyből a szerves oldószer ki tudja szorítani. Ennek következtében megbomlik az enzim konformációs stabilitása és aktivitása. A víztartalom csökkenésével a visszamaradó víz és enzim közötti kötés egyre erősebbé válik, amelyből a szerves oldószer már nem tudja kiszorítani. A szárított enzimpor robusztus szerkezetű és igen nagy aktivitású. A karbonáttartalmú készítményeknél a fentivel ellentétes összefüggést észleltek, vagyis a nedvességtartalom növekedésével nőtt az aktivitás. A 3. táblázat adatai szerint az NaHCO3-mal aktivált enzimkészítmény víztartalma nagyobb volt, mint a sómentes készítményé. Az NaCH3COO és NaHCO3 sókeverékkel aktivált SC aktivitása (2. ábra) és víztartalma (3. ábra) alakulásából kiderült, hogy az enzimaktivitásban nem a víztartalom játssza a kulcsszerepet. A két sóval végzett kísérletből látható, hogy az NaCH3COO-tartalom növekedésével arányosan csökkent a végtermék víztartalma, míg a csak ezzel a sóval aktivált készítmény aktivitása és sókoncentrációja között nem állt fenn lineáris összefüggés. Egy másik sókombináció, a KCl és NaHCO3 alkalmazásakor a víztartalom és a sókoncentráció között éppen ellentétes kapcsolat állt fenn, és a 98 %(m/m) sótartalmú minta közel azonos νmax/Km értékéből
ugyancsak az a következtetés vonható le, hogy a szerves oldószerben oldott enzim aktivitása döntő mértékben nem a készítmény víztartalmától függ. A (0,85 mól 1-propanolt tartalmazó) hexánhoz adott kis mennyiségű víz jelentős mértékben növelte a 73,9 %(m/m) NaHCO3 és 24,1 %(m/m) NaCH3COO-tartalmú enzimkészítmény aktivitását (4. ábra). A szerves oldószer víztartalmának növelésekor nő az enzim mikrokörnyezetének polaritása, ami a szilárd fázisú enzimre adszorbeálódott vízben oldott só hatásának tudható be. Az erősen hidrofób tulajdonságú hexán esetében jobb eredmény érhető el a sótartalmú enzimkészítmény szilárd fázisának részleges szolubilizálásával. Mivel az aktivitás a nedvességtartalommal arányosan nő, továbbá a víztartalom a hexán 1-propanol-tartalmától függ, az NaHCO3/NaCH3COO sókombinációval aktivált SC aktivitását 1,5 mól propanolt és 0,8 %(m/m) vizet tartalmazó hexánban határozták meg. A νmax/Km értéke 352 µmól APPE/mg enzim/perc/mmól APEE-nek adódott, ami a száraz hexánban mért érték több mint 1,8-szorosa. 50% aktívhelytartalommal számolva az enzim katalitikus aktivitása nedves oldószerben 1650 s-1 M-1 . A kereskedelemben kapható SC készítmény APEE vizes pufferoldatában mért katalitikus konstansaira a következő értékek adódtak: kkat = 28±1 s-1, Km = 1,4±0,2 mmól, és kkat/Km = 20 000±3000 s-1 M-1. Az SC aktivitását hexánban úgy határozták meg, hogy feloldás után fagyasztva szárították. Ugyanakkor figyelembe véve, hogy az enzim aktivitása a fagyasztás körülményeitől döntő mértékben függ, 1 %(m/m) foszfátpufferban is megmérték a SC liofilizált készítmény katalitikus aktivitását: kkat = 45±2 s-1, Km = 2,6±0,3 mmól, vagyis az általános katalitikus aktivitás csökkent, számszerűen 17 000±3000 s-1 M-1. Ezt az értéket összehasonlítva a NaHCO3 /NaCH3 COO sókombinációval aktivált SC nedves hexánban mért katalitikus aktivitásával kiderül, hogy a hexánban mért aktivitás a vizes oldaténak kb. 10%-a. A szerves oldószerben oldott, fagyasztva szárított SC aktivitását befolyásoló tényezőket egy átgondolt és sok szempont alapján összeállított kísérletsorozatban vizsgálták. Többek között sorra vették a fagyasztás módját, különböző „lyoprotectant” vegyületek és sók, az adalékok kezdeti és végső koncentrációjának, különböző kozmotróp és pufferkapacitású sókombinációk, valamint a szerves oldószerhez adagolt víz hatását. A felsorolt tényezők hatásának körültekintő vizsgálata és részleges optimálása után megállapították, hogy a hexánban oldott SC aktivitása jelentősen növelhető egyrészt nagy hűtési sebességgel és felületnöveléssel, másrészt kozmotróp és pufferkapacitású sókombinációk megfelelő kiindulási mólkoncentrációival és kis mennyiségű vizet tartalmazó szerves oldószerrel. Optimális körülmények között a hexánban mért enzimaktivitás a sómentes minta huszonhétezerszeresére nőtt. Az így kapott érték ugyanannak a szubsztrátnak vizes pufferoldatban mért katalitikus aktivitásának nagyságrendjébe esett. Az 5. ábra a különböző kombinációkkal elért katalitikus aktivitás emelkedését mutatja be. A legjobb értéket a
26,4
33,2
42,2
46
5
6
7
8
9
4,94
1,79
10
1
0,01
0,001
1
0,013
0,1
0,005
νmax/Km [µM APPE min-1 (mg enzim)-1]
100
24,9
200
1000
352
szinte vízmentes hexánban oldott enzim adta. A kísérletek alapján arra lehet következtetni, hogy az aktivitás további növelése is lehetséges, pl. érzékenyebb vizsgálatokkal, kombinatorikus optimalizálással és/vagy faktoriális tervezéssel.
2
3
4
10
11
minta száma
5. ábra A különböző adalékok hatása a hexánban oldott SC aktivitására (νmax/Km) átészterezésekor 1 – a sómentes liofilizált enzim korábban közölt kinetikai aktivitása 2 – a sómentes liofilizált enzim jelen kísérletben mért kinetikai aktivitása 3 – PEG (molekulatömeg 2000) 4 – 49% KCl/49% PEG 5 – KCl 6 – 49% NaHCO3/49% PEG 7 – NaHCO3 8 – 31,3%NaHCO3/66,7% KCl 9 – NaCH3COO 10 – 24,1%NaCH3COO/73,9% NaHCO3 11 – 24,1%NaCH3COO/73,9% NaHCO3 (0,8% víztartalmú hexánban) (Haidekker Borbála) Ru, M. T.; Wu, K. C. stb.: Towards more active biocatalysts in organic media: increasing the activity of salt-activated enzymes. = Biotechnology and Bioengineering, 75. k. 2. sz. 2001. okt. 20. p. 187–196.
Ke, T.; Klibanov, A. M.: Markedly enhancing enzymatic enantioselectivity in organic solvents by forming substrate salts. = Journal of the American Chemical Society, 121. k. 1999. p. 3334–3340.
