Amidoblack

HYDRAGEL 7 HR Violet Acide / Acid Violet

Ref. 4102

HYDRAGEL 15 HR Violet Acide / Acid Violet

Ref. 4122

HYDRAGEL 7 HR Amidoschwarz / Amidoblack

Ref. 4105

HYDRAGEL 15 HR Amidoschwarz / Amidoblack

Ref. 4125

2015/06

HYDRAGEL 7 & 15 HR - 2015/06

POUŽITÍ KITU

Soupravy HYDRAGEL 7 HR a HYDRAGEL 15 HR jsou určeny k vícečetné frakcionaci bílkovin z lidského séra a dalších biologických tekutin, jako je moč a mozkomíšní mok elektroforézou na alkalicky pufrovaných (pH 8,8) agarózových gelech. Soupravy se používají se ve spojení s poloautomatizovaným přístrojem HYDRASYS. Přístroj HYDRASYS umožňuje všechny sekvence, dokud není gel připraven pro kvantitativní a kvalitativní analýzu. Elektroforetické separace jsou hodnoceny vizuálně na abnormality záznamu bílkovin a densitometrie může poskytnout semikvantitativní relativní hodnoty. Separované bílkoviny jsou barveny barvicími roztoky kyselé violeti nebo amidočerni a přebytečné barvivo se odstraňuje kyselým roztokem. Pro kvantitativní analýzu poskytuje densitometrické skenování gelů barvených kyselou violetí (pro vzorky séra a moči) nebo amidočerní (pouze pro vzorky séra) kvalitativní stanovení pro každou separovanou zónu. Každý agarózový gel je určen k analýze : - 7-mi vzorků (HYDRAGEL 7 HR kit), - 15-ti vzorků (HYDRAGEL 15 HR kit). Určeno pro diagnostické použití in vitro.

POZNÁMKA : V tomto návodu se název "HYDRASYS" používá pro poloautomatické přístroje HYDRASYS a HYDRASYS 2.

PRINCIP TESTU

Elektroforéza bílkovin je běžnou technikou rutinně používanou klinickými laboratořemi ke skríningu abnormalit bílkovin séra a dalších biologických tekutin. V principu jde o zónovou elektroforézu prováděnou na vhodném podpůrném mediu. Agaróza je univerzální a efektivní podpůrné medium. Většina laboratoří používá tradiční pětizónovou elektroforézu, HR elektroforéza však přináší další diagnostické informace. Na HYDRAGELU 7 HR a 15 HR se bílkoviny séra, moči a likvoru dělí na přibližně 10 frakcí. Každá frakce obsahuje jeden a více sérových proteinů. Složení gelu, podmínky elektroforézy a volba barvičky dovoluje vynikající rozlišení a vysokou senzitivitu zvláště v gama zóně. Dle zákazníkových preferencí je možno gely obarvit amidočerní* nebo kyselou violetí. Obarvené elfogramy lze vyhodnotit vizuálně a doplnit denzitometrií. * V ČR se soupravy s amidočerní nenabízí, nicméně to její použití nevylučuje.

REAGENCIE A MATERIÁL V KITECH HYDRAGEL 7 HR A HYDRAGEL 15 HR VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽKY

Agarózové gely (připraveny k použití) Pufrované stripy (připraveny k použití) Ředící roztok pro amidočern (zásobní roztok) Amidočerň (zásobní roztok) Kyselá violeť (zásobní roztok) Aplikátory (připraveny k použití) Filtrační papíry

KAT. Č. 4102

KAT. Č. 4122

10 gelů 10 bal po 2 ks

10 gelů 10 bal po 2 ks

1 lahv., 75 mL 1 bal. 10 ks (7 zubů) 1 bal. 10 ks

1 lahv., 75 mL 1 bal. 10 ks (15 zubů) 1 bal. 10 ks

KAT. Č. 4105

10 gelů 10 bal po 2 ks 1 lahv. 60 mL 1 lahv. 20 mL

1 bal. 10 ks (7 zubů) 1 bal. 10 ks

PRO OPTIMÁLNÍ VÝSLEDKY : Všechny reagenty ze stejné sady musí být vždy používány společně a podle pokynů v příbalovém letáku. PROSÍME, ČTĚTE PEČLIVĚ PŘÍBALOVÝ LETÁK.

KAT. Č. 4125

10 gelů 10 bal po 2 ks 1 lahv. 60 mL 1 lahv. 20 mL

1 bal. 10 ks (15 zubů) 1 bal. 10 ks

1. AGARÓZOVÉ GELY Příprava

Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok pH 8.8 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.

Použití

Nosné medium pro elektroforézu.

Skladování, stabilita a známky poškození

Skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech – šipkou na přední straně krabice směrem nahoru. Lze skladovat při pokojové teplotě (15 - 30 °C) nebo v chladničce (2 - 8 °C). Zamezit prudkým změnám teploty – neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. Stabilní do doby exspirace vyznačené na krabici či štítcích na obalech gelů. NEMRAZIT! Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). - 191 -

SEBIA NÁVOD - Czech

HYDRAGEL 7 & 15 HR - 2015/06

2. PUFROVANÉ STRIPY Příprava

Pufrované houbovité proužky (stripy) jsou připraveny k použití. Každý obsahuje : tlumicí roztok s pH 8.7 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.

Použití

Slouží jako rezervoár pufru a zajišťují kontakt mezi gelem a elektrodami.

Skladování, stabilita a známky poškození

Skladovat při pokojové teplotě nebo v chladničce. Jsou stabilní nejméně do data exspirace vyznačeného na balení kitu či na štítcích jednotlivých balení. NEMRAZIT! Nepoužívejte stripy z otevřených balení nebo stripy vyschlé!

3. ŘEDÍCÍ ROZTOK PRO AMIDOČERŇ (s kity kat. č. 4105 a 4125) Příprava

Zásobní ředicí roztok barvicího roztoku musí být použit podle pokynů v odstavci "AMIDOČERŇ". Obsahuje kyselý roztok pH ≈ 2.

Použití

Příprava barvícího roztoku s amidočerní.

Skladování, stabilita a známky poškození

Zásobní roztok ředícího roztoku pro amidočerň se skladuje při pokojové teplotě nebo při teplotě 2 - 8 °C. Zásobní roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. NEMRAZIT. Nepřidávat azid sodný.

4. AMIDOČERŇ (s kity kat. č. 4105 a 4125) Příprava

Koncentrát amidočerni je viskózní roztok, který může gelovatět. Citlivost zásobního barvícího roztoku není změněna zvýšením viskozity nebo ztuhnutím. V každém případě je pro dosažení správného rozpuštění barvícího roztoku nutné dodržet následující postup : 1. Přidejte 15 mL ředícího roztoku pro amidočerň do lahvičky s koncentrovanou amidočerní. 2. Pečlivě uzavřete lahvičku. 3. Lahvičku pořádně protřepejte po dobu cca 5 sekund. 4. Přelijte tento roztok do odměrného válce pro přípravu barvicího roztoku. 5. Opakujte tento krok 2 - 3x, až do úplného rozpuštění koncentrované amidočerni. 6. Nalijte zbylý obsah lahvičky s ředícím roztokem pro amidočerň do odměrného válce a doplňte do 300 mL destilovanou nebo deionizovanou vodou 7. Promíchávejte obsah válce po dobu 5 - 10 minut. Barvící roztok je připraven k použití. POZN. : Nesprávná příprava barvícího roztoku povede k nedostatečnému barvení albuminové frakce (nízká procentuální hodnota světlého středu frakce).

Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok o pH ≈ 2 ; amidočerň ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.

Použití

Barvení gelů s rozdělenými bílkovinami po elektroforéze. DŮLEŽITÉ : Barvicí roztok je určen k obarvení pouze 10 gelů. Roztok vyměňte po 10 použitích k barvení.

Skladování, stabilita a známky poškození

Zásobní i pracovní barvicí roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní barvicí roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky rozpouštědla pro barvicí roztok. Pracovní barvicí roztok je stabilní 1 měsíc. Stabilita roztoku může být prodloužena na 3 měsíce, pokud je uchováván v chladničce. Ihned po použití musí být uzavřené nádoby uloženy v chladničce. Neskladujte pracovní barvicí roztok v blízkosti zdrojů tepla.

5. KYSELÁ VIOLEŤ (s kity kat. č. 4102 a 4122) Příprava

Lahvička zásobní kyselé violeti může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 300 mL. Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok pH ≈ 2 ; kyselou violeť ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných.

Použití

K barvení gelů s rozdělenými bílkovinami po elektroforéze. DŮLEŽITÉ : Barvící roztok je určen pro obarvení pouze 10-ti gelů. Vyměňte roztok, po desátém použití.

Skladování, stabilita a známky poškození

Zásobní i pracovní roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo při 2 - 8 °C v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. Pracovní barvící roztok vydrží 6 měsíců.

6. APLIKÁTORY Použití

K nanesení vzorků - připraveny k použití.

Skladování

Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. - 192 -

HYDRAGEL 7 & 15 HR - 2015/06

7. FILTRAČNÍ PAPÍRY Použití

Proužky tenkého filtračního papíru, na jedno použití. Jsou určeny k odsátí přebytečné tekutiny z povrchu gelu před aplikací vzorků.

Skladování

Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce.

POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy.

1. FYZIOLOGICKÝ ROZTOK Příprava

Připravte 0.15 M (0.9 g/dL) roztok NaCl v destilované nebo v deionizované vodě.

Použití

Používá se k ředění vzorků.

Skladování, stabilita a známky poškození

Vydrží asi 3 měsíce v těsně uzavřených láhvích při pokojové teplotě. Při změně vzhledu, tj. výskytu zákalu způsobeného mikrobiální kontaminací, roztok vyřaďte z používání. Pro delší skladování lze použít azid sodný, 0.1 g/dL.

2. ODBARVOVACÍ ROZTOK Příprava

Každá lahvička zásobního Odbarvovacího Roztoku (SEBIA, kat. č. 4540, 10 lahviček po 100 mL) je určena k přípravě 100 litrů pracovního odbarvovacího roztoku. Je výhodné připravovat jen 5 litrů pracovního roztoku, doplněním 5 mL zásobního roztoku do 5 litrů destilovanou nebo deionizovanou vodou, což je objem zásobníku na odbarvovací roztok. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok pH ≈ 2.

Použití

Roztokem se odstraňuje přebytečné množství barvičky a odbarvuje se pozadí agarózové plotny. Dále k vyplachování barvícího prostoru po promývacím kroku. K neutralizaci kyselé reakce odbarvovacího roztoku nalijte do prázdné nádoby na odpady 15 mL 50 % (w/w) komerčně dostupného roztoku NaOH (≈ 19 M NaOH).

Skladování, stabilita a známky poškození

Skladování – při pokojové teplotě nebo v chladničce. Je stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní 1 týden při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Nepřidávejte azid sodný! Nepoužívat při změně vzhledu, vzniku zákalu nebo precipitátu v roztoku. Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μL/dL roztoku ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, KAT. Č. 2059, 1 lahvička, 5 mL). Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku CLEAN PROTECT. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky.

3. PROMÝVACÍ ROZTOK PRO HYDRASYS Příprava

Každá lahvička Promývací roztok pro HYDRASYS (SEBIA, kat. č. 4541, 10 lahviček a 80 mL) se ředí do 5-ti litrů destilovanou nebo deionizovanou vodou. Promývací pracovní roztok po zředění obsahuje : tlumicí roztok pH 8.7 ± 0.5.

Použití

Slouží k čištění modulu HYDRASYSu určeného k barvení. Při denním používání přístroje se doporučuje promývat barvící prostor jednou za týden. Viz příbalový leták.

Skladování, stabilita a známky poškození

Skladujte zásobní i pracovní promývací roztok v uzavřených nádobách při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilní do data exspirace uvedeného na štítcích lahviček s promývacím roztokem. Při známkách změny vzhledu pracovního promývacího roztoku, výskytu zákalu v důsledku mikrobiální kontaminace, roztok vyřaďte z používání.

4. FLUIDIL Příprava

Fluidil (SEBIA, kat. č. 4587, 1 lahv. 5 mL) – připraveno k použití.

Použití

Ředění vzorků s narušenými difusními vlastnostmi přes zuby aplikátoru vzorku (například viskózní nebo zakalené vzorky, jako jsou séra s obsahem kryoglobulinu nebo kryogelu, vzorky s polymerizovaným Ig M,…) nebo s nízkou intenzitou elektroforetického záznamu.

Skladování, stabilita a známky poškození

Skladovat při laboratorní teplotě. Stabilní do doby exspirace vyznačené na štítku. Nesmí obsahovat sraženiny.

POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr ≤ 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µS/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. - 193 -

HYDRAGEL 7 & 15 HR - 2015/06

NUTNÉ VYBAVENÍ

1. HYDRASYS Systém SEBIA : HYDRASYS 2 SCAN kat. č. 1200, HYDRASYS 2 kat. č. 1201, HYDRASYS 2 SCAN FOCUSING kat. č. 1202, HYDRASYS 2 FOCUSING kat. č. 1203, HYDRASYS kat. č. 1210 nebo kat. č. 1211 nebo HYDRASYS FOCUSING kat. č. 1212. 2. Manuální nebo automatizovaný mikropipetor, SEBIA HYDRAPLUS, kat. č. 1216 nebo SEBIA HYDRAPLUS 2, kat. č. 1217 nebo SEBIA ASSIST, kat. č. 1218 jako alternativu k vzorkovým aplikátorům. 3. Vlhká Skladovací Komora kat. č. 1270, dodávaná s HYDRASYS systémem. 4. Souprava Kontejnerů dodávaná s HYDRASYSem. 5. Držák gelů – SEBIA, kat. č. 1278. 6. Pipety – 10 µL a 200 µL. 7. Densitometr / skener pro skenování gelových ploten 82 x 51 mm nebo 82 x 102 mm : Software HYRYS SEBIA, GELSCAN SEBIA, DVSE SEBIA nebo PHORESIS pro plochý skener. Pro postupy činnosti a kalibrace viz pokyny výrobce. 8. Kontrolní materiály.

ANALYZOVANÉ VZORKY

HYDRAGEL 7 a 15 HR je určen pro kvalitativní analýzu sér, močí a likvoru. Proteiny séra se dají kvantifikovat po obarvení kyselou violetí nebo amidočerní. Při sledování stejného paciente analýzami vzorků séra, mozkomíšního moku nebo moči (koncentrované nebo ne) se doporučuje provádět vždy stejný postup HYDRAGEL 7 / 15 HR jedním z příslušným migračních programů 7/15 HR1, 7/15 HR2 nebo 7/15 HR3.

Odběr a skladování vzorků

Pro analýzu se doporučuje používat čerstvé vzorky séra. Odběr musí být v souladu se zavedenými postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. V případě potřeby lze vzorky skladovat při 2 až 8 °C po dobu jednoho týdne. Zmražené vzorky jsou stabilní nejméně jeden měsíc. Rozmrazené vzorky mohou obsahovat slabé aplikační značky vlivem denaturace proteinu nebo lipoproteinu. Mražení sér a vzorků CSF s 0.02 g/dL azidu sodného zvyšuje stabilitu při skladování. Obdobně zvyšuje stabilitu při skladování mražení moči s HEPES 0,1 M (pH 6,75) a s azidem sodným 0,02 g/dL. UPOZORNĚNÍ : Nepoužívejte jako parfém na kůži.

Příprava vzorků

1. Příprava vzorku ke kvalitativní analýze (barvení kyselou violetí) Vzorky jsou pro oba druhy barvení připravovány stejným způsobem.

Sérum

Používejte neředěná séra. Úprava sérových vzorků pomocí Fluidil: Úprava sérových vzorků přípravkem Fluidil se musí provést v následujících případech: - Sérové vzorky s narušenými difusními vlastnostmi přes zuby aplikátoru vzorku, například viskózní nebo zakalené vzorky po skladování při teplotě 2 až 8 °C nebo po zmrazení (zejména vzorky obsahem kryoglobulinu nebo kryogelu). - Sérové vzorky s polymerizovaným Ig M. - Sérové vzorky s elektroforetickým záznamem s nízkou intenzitou. V takových případech přidejte 25 μL přípravku Fluidil na 75 μL séra a odstřeďujte na vortextu po dobu 15 sekund. Dále pokračujte podle standardního postupu.

Likvor nebo dvojice sérum/likvor

Aplikujte vzorky s koncentrací celkové bílkoviny 1.0 g/dL. DŮLEŽITÉ : Dvojice séra a likvoru musí mít stejnou koncentraci celkové bílkoviny.

Moče

K analýze používáme nezahuštěné vzorky močí. Zahušťuje se jen v případě potřeby vyšší senzitivity. Proužky lze detekovat tehdy, dosahuje-li koncentrace bílkoviny na proužek 2 mg/dL a více. - Nezahuštěné moče : Naneste vzorek moči. - Zahuštěné moče : Analyzují se vzorky zahuštěné na koncentraci celkové bílkoviny 0.5 g/dL. DŮLEŽITÉ : Některé moče obsahují zvýšené množství solí, které můžou způsobit deformaci gelu během migrace a následně poškození migračních profilů. Tyto moče je nutno dialyzovat a soli odstranit.

POZNÁMKA : Difúze vzorků moči do špičky aplikátorů může být narušena, pokud je moč (čistá nebo koncentrovaná) zakalená. V tomto případě se doporučuje odstranit částice působící zákal centrifugací (Postupujte podle obvyklých doporučení pro předanalytickou fázi pro analýzu vzorků moči) nebo filtrací (např. stříkačkový filtr 0.45 µm).

2. Příprava séra pro semikvantitativní analýzu (barvení amidočerní nebo kyselou violetí)

Barvení amidočerní

Použijte neředěné vzorky séra.

Barvení kyselou violetí

Použijte vzorky séra předtím 4x zředěné (1 obj./3 obj.) fyziologickým roztokem. Potom pokračujte standardním postupem.

Nepoužívat

Nepoužívejte hemolyzované vzorky séra. Hemolýza zvyšuje zónu alfa-2 a beta. Vzorek plazmy po rozdělení vykazuje proužek fibrinogenu v blízkosti aplikačního bodu. Tento proužek by mohl být považován za monoklonální imunoglobulin. - 194 -

HYDRAGEL 7 & 15 HR - 2015/06

POZNÁMKA : Odběrové zkumavky a centrifugační parametry pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci for zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků…). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, nebo k centrifugaci uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů.

PRACOVNÍ POSTUP

HYDRASYS systém je poloautomatický multiparametrický přístroj. Automatizované kroky zahrnují zpracování agarózových gelů v následujícím pořadí : aplikace vzorku, elektro-foretické dělení, sušení, barvení, odbarvování a konečné osušení. Manuální kroky zahrnují různé manipulace se vzorky a gely a nastavení přístroje. DODRŽUJTE PEČLIVĚ POKYNY UVEDENÉ V MANUÁLU PŘÍSTROJE!

I.

NASTAVENÍ MIGRACE

1. Zapněte HYDRASYS. 2. Umístěte aplikátory – jeden na rovnou plochu čísly jamek nahoru (viz Obr. 1). - Naneste10 mL séra nebo zahuštěné moče do každé jamky. Každý aplikátor musí být naaplikován nejdéle ve dvou minutách, - Vložte aplikátory do vlhké komůrky zoubky nahoru (při vkládání je uchopte za ochranný plastový rámeček), nechejte vzorky difundovat do zoubků po dobu 5 minut po nanesení posledního vzorku. Komůrka se může vložit až na 8 hodin do chladničky a analýza může být tak po tuto dobu odložena. Detaily viz v příbalovém letáku vlhké skladovací komůrky. 3. Otevřete víko migračního modulu a zvedněte migrační rámeček s elektrodami a nosičem aplikátorů nahoru. POzOR : Nikdy nezavírejte víko pokud je migrační rámeček nahoře!

4. Z menu přístroje umístěného v levé části klávesnice zvolte program migrace. - Program "7/15 HR1" : Pro neředěné nebo ředěné sérum, HYDRAGEL 7 HR a HYDRAGEL 15 HR. - Program "7/15 HR2" : Pro ředěné sérum, zahuštěný likvor a zahuštěné moče, HYDRAGEL 7 HR a HYDRAGEL 15 HR. - Program "7/15 HR3" : Pro nezahuštěné moče, HYDRAGEL 7 HR a HYDRAGEL 15 HR. 5. Vyjměte z ochranného obalu pufrované stripy – uchopením za plastikové konce. Děrovanými konci plastikového vyztužení je upevněte na kovové výstupky migračního rámečku nad elektrody. Plastikové vyztužení stripů musí směřovat k nosiči (viz Obr. 2). 6. Vybalte agarózovou plotnu HYDRAGEL. - Plotnu rychle osušte tenkým filtračním papírem tak, že jej po povrchu gelu narolujete, aby přilnul k celé ploše a odsál přebytek tekutiny. Papír ihned odstraňte. POzOR : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu – hrozí dehydratace gelu! - Naneste 120 µL destilované nebo deionizované vody při použití HYDRAGEL 7 HR nebo 200 µL pro HYDRAGEL 15 HR na dolní třetinu rámečku vyznačeného na migrační ploše. - Opřete gelovou plotnu (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku na migrační ploše (viz Obr. 3). - Nyní gel ohněte a pokládejte do kontaktu s kapkou vody tak, aby se voda rozprostřela rovnoměrně pod celým gelem, bez vzduchových bublin. Gel musí být zarovnán s vyznačeným rámečkem (viz Obr. 3). 7. Snižte migrační rámeček dolů. V této pozici se pufrované stripy nedotýkají gelu. NA MIGRAČNÍ RÁMEČEK NETLAČTE DOLŮ SILOU! 8. Aplikátory nyní vyjměte z vlhké skladovací komůrky. Manipulujte s nimi za pomoci ochranného rámečku. - Odlomte ochranný rámeček chránící zuby aplikátoru. - Aplikátor umístěte do nosiče aplikátorů do pozice č. 5. DŮLEŽITÉ : Čísla vyznačená na aplikátoru musí směřovat k operátorovi (viz Obr. 4).

9. Uzavřete víko migračního modulu. 10. Stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou (levá strana klávesnice) je procedura ihned zahájena. DŮLEŽITÉ : Přesvědčte se, zda není blokován otvor vzduchové ventilace na pravé straně přístroje.

MIGRACE – POPIS AUTOMATICKÝCH ČINNOSTÍ

• Všechny části migračního rámečku jsou sníženy – stripy s pufrem i aplikátory jsou v kontaktu s povrchem gelu – probíhá aplikace vzorků do gelu. • Nosič aplikátorů vzorků se zvedne, části s elektrodami nesoucí stripy s pufrem zůstávají v kontaktu s povrchem gelu. • Pro "7&15 HR1" a "7&15 HR2" migrační programy : Proběhne migrace při konstantním napětí 255 V pro HYDRAGEL 7 HR a HYDRAGEL 15 HR při 20 °C řízených pomocí Peltierova efektu až do 75 Vh (po dobu asi 18-ti minut). • Pro "7&15 HR3" migrační program : proběhne migrace při konstantním napětí 255 V pro HYDRAGEL 7 HR a HYDRAGEL 15 HR při 20 °C řízených pomocí Peltierova efektu až do 40 Vh (po dobu asi 10-ti minut). • Po zvednutí nosiče elektrod se elektrody odpojí. • Teplota migrační plochy stoupá až na 60 °C na dobu 9 minut, po kterou se gel suší. • Migrační plocha je ochlazena na 50 °C a slyšitelné pípnutí signalizuje odjištění víka migračního modulu. Teplota se udržuje na 50 °C až do otevření víka. Po otevření víka teplota klesá na 20 °C (v necelých 5-ti minutách). Po této době může začít nové dělení. POZN. : Víko migračního modulu zůstává uzavřeno během všech migračních kroků.

II. PŘÍPRAVA ZPRACOVÁNÍ GELU 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Otevřete víko. Vyjměte aplikátor a odstraňte jej. Zvedněte oba nosiče, vyjměte pufrované stripy uchopením za plastikové konce a odstraňte je. Vyjměte usušený gel pro další zpracování. Po každém použití otřete podélně elektrody i migrační plochu vlhkým tamponem. Vyjměte držák gelu z barvící komory, otevřete jej, umístěte usušenou gelovou plotnu (gelovou stranou dopředu) do žlábků obou jeho tyček a držák uzavřete. Ujistěte se, že plotna je umístěna správně uvnitř držáku (viz Obr. 5). - 195 -

HYDRAGEL 7 & 15 HR - 2015/06

7. Vložte držák gelu do modulu na zpracování a barvení gelu. DŮLEŽITÉ : Před nastartováním programu pro zpracování a barvení zkontrolujte : - zda kontejner pro barvení obsahuje 300 mL barvícího roztoku, - zda kontejner pro odbarvování obsahuje nejméně 1 litr odbarvovacího roztoku, - zda kontejner na odpad je prázdný (není plný). Pro připojení přívodů reagencií se řiďte pokyny zobrazovanými na obrazovce přístroje (Zvolte klávesu : REAGENT LINES). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte zablokovat nepoužité přívody.

8. Vyberte z menu přístroje program pro barvení "HR ACID VIOLET" nebo "HR AMIDO" a stiskněte "START" (zelená šipka na pravé straně klávesnice). Během barvení, odbarvování a sušení zůstává tento modul zajištěn. Odjištění je signalizováno slyšitelným pípnutím – ventilace je udržovaná až do vynětí držáku s gelem.

III. DOKONČENÍ ZPRACOVÁNÍ GELU

1. Vyjměte držák s gelem, otevřete ho a vyjměte osušený gel. POZNÁMKA : Po obarvení / odbarvení a před densitometrií / skenováním může být gel navíc jednou propláchnut, pokud je to zapotřebí pro další vyjasnění pozadí gelu a odstranění zbytkového barviva, které by se mohlo projevit jako modré skvrny. Omyjte gel pomocí programu "WASH ISOENZ/GEL".

2. Je-li třeba, očistěte zadní plastikovou podpůrnou část gelové plotny vlhkým měkkým hadříkem nebo buničinou. 3. Separace se interpretují z hlediska abnormalit vizuálně. Vizuální pozorování je možné dokončit denzitometrií pro získání semikvantitativních, relativních hodnot pro individuální nebo kombinované frakce bílkovin. Pro kvantitativní analýzu vzorků séra (s barvením kyselou violetí nebo amidočerní) nebo kvantitativní analýzu vzorků moči (s barvením kyselou violetí) proveďte skenování s použitím densitometru / skeneru a zvolte vhodný program skenování. DŮLEŽITÉ : Gely získané migračním programem 7/15 HR3 lze skenovat pouze skenovacím programem HR3 skeneru vybaveného softwarem SEBIA PHORESIS (VS ≥ 8,51).

KONTROLA KVALITY

Doporučuje se zařadit na každou sérii vzorků kontrolní sérum.

VÝSLEDKY

Hodnoty (kvantitativní analýza)

Denzitometrické skenování nabarvených polí elektroforegramů (procentuálních hodnot) jednotlivých proteinových zón.

U 225 sér zdravých dospělých jedinců (mužů i žen) byly nalezeny tyto referenční hodnoty hlavních proteinových zón (průměr ± 2 SD) : FRAKCE Albumin Alfa-1 globuliny Alfa-2 globuliny Beta globuliny Gama globuliny

Doporučuje se, aby každá laboratoř stanovila své vlastní referenční hodnoty.

HYRYS - GELSCAN 56.2 - 69.0 1.2 - 3.2 7.8 - 13.4 7.4 - 13.4 9.8 - 18.6

PHORESIS 57.5 - 67.9 1.0 - 3.8 7.2 - 12.8 7.6 - 13.6 10.3 - 18.3

Interpretace

SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace. Je kvalitativní. Viz LITERATURA.

SÉROVÉ PROTEINY

Interpretace se provádí porovnáváním elektroforeogramů vyšetřovaných klinických vzorků a normálních kontrol. V případě zvýšených, snížených či přidatných frakcí je obvykle nutné potvrdit pozorované změny jinými testy, jako je kvantifikace specifických proteinů, imunoelektroforéza nebo imunofixace. Mezi početnými plasmatickými proteiny existuje přibližně patnáct v množství potřebném pro vznik dostatečné barevné intenzity proužků pozorovaných na gelech HYDRAGEL 7/15 HR. Diagnostická hodnota této metodiky spočívá právě v možnosti průkazu slabých monoklonálních a oligoklonálních proužků.

LIKVOROVÉ PROTEINY

Mozkomíšní mok je biologická tekutina s nízkým obsahem bílkovin – v normálním moku je to jen kolem 30 ± 15 mg/dL. Likvorové bílkoviny většinou pochází ze séra, odkud jsou filtrovány přes hemato-likvorovou bariéru. K analýze na gelech HYDRAGEL 7/15 HR je nutno likvor zahustit na koncentraci 1.0 g/dL. - 196 -

HYDRAGEL 7 & 15 HR - 2015/06

Normální elfogram bílkovin v moku vykazuje následující pořadí zón : • Prealbumin – transthyretin, nejrychlejší frakce ; • Albumin, hlavní frakce, tvořící přes 75% celkových bílkovin ; • Alfa-1, tvořená primárně alfa-1 antitrypsinem ; • Alfa-2, obsahující bílkoviny s vysokou molekulovou hmotností, obyčejně velmi slabá, neboť bílkoviny s vyšší molekulovou hmotností nemohou procházet hemato-likvorovou bariérou ; • Beta frakce, obsahující transferin ; • Beta-2 zóna, obsahující karbohydrát (kyselina sialová) deficientní, "pro likvor specifický" transferin, zvaný rovněž protein Tau ; • Gama frakce, obsahující především Ig G a někdy Ig A a Ig M.

Intratékální syntéza imunoglobulinů se vyskytuje v souvislosti s různými onemocněními CNS - demyelinizační, zánětlivé a infekční choroby, stejně jako autoimunní reakce. Často se nachází ve spojení s redukovanou heterogenitou imunoglobulinů, jež se manifestuje jako "oligoklonální proužkování" dobře rozlišitelné HYDRAGEL HR elektroforézou. Význačným znakem intratékální syntézy Ig je přítomnost oligoklonálních proužků Ig v likvoru a jejich absence v séru.

Proto je nezbytné : • Analyzovat dvojice vzorků likvor / sérum odebraných od téhož pacienta současně - ve stejnou dobu za předpokladu vyloučení jakékoli manipulace se vzorky, jež by mohla ovlivnit koncentraci imunoglobulinů. • Aplikovat stejná množství proteinů (asi 1 g/dL) s každým z obou vzorků. • Každý abnormální proužek v gama zóně likvoru bez odpovídající frakce v séru, podrobit imunofixaci. Imunochemické potvrzení charakteru imunoglobulinu takového proužku v likvoru je nezbytné, protože v gama zóně se mohou vyskytovat i proužky jiné, než Ig. Např. : frakce Tau, karboanhydráza, post gama nebo CRP. Tyto proužky nemají stejný diagnostický význam jako "pravé" oligoklonální proužky s Ig.

MOČ

Elektroforezou se detekují monoklonální komponenty a jiné močové bílkoviny. Metodika HYDRAGEL 7 nebo 15 HR se používá jako skríningový test pro bílkoviny v moči. Dovoluje detekci monoklonálních komponent (které musí být potvrzeny a identifikovány imunofixací) a detekci proteinů tubulárního, glomerulárního nebo smíšeného původu (který musí být charakterizován vhodnými metodami jako je molekulární síto v SDS elektroforéze, nefelometrie nebo imunofixace odpovídajícími protilátkami.

S použitím densitometru HYRYS 2 a skeneru GELSCAN (od verze PHORESIS ≥ 8.51) je postup HYDRAGEL 7 & 15 HR s kyselou violetí provedený s migračním programem 7/15 HR3 kvantitativní pro analýzu vzorků moči. Je-li pozorován abnormální elektroforetický záznam, proveďte imunofixaci vzorku a pak kvantifikujte monoklonální komponentu, pokud je detekována a charakterizována. Pro kvantitativní určení musí být abnormální frakce integrována ručně s použitím nástroje "quantify peaks" (kvantifikovat píky) a funkce softwaru "peak quantification" (kvantifikace píku).

Konkrétní případ : použití přístroje GELSCAN a softwaru PHORESIS Operátorovi jsou navrhovány dva režimy integrace : integrace "valley to valley" (od údolí k údolí) mezi dvěma píky a integrace "from bottom to top" (od základní linie k vrcholu). Volba režimu integrace je založena na charakteristice elektroforetického záznamu (poloha sledovaného píku ve vztahu k základní linii) a v souladu s obvyklými postupy laboratoře. Pro kvantifikovaný pík jsou výsledky uváděny : - v procentech nebo, - v koncentracích g/dL nebo g/24 hodin (v tomto případě musí být předem v pracovním seznamu uvedena koncentrace bílkovin v moči).

POZNÁMKA : Výsledky získané pro kvantifikaci monoklonálních komponent jsou zcela závislé na hodnotě proteinurie, která byla zadána v softwaru PHORESIS. Jestliže udělá operátor chybu při zadávání hodnoty proteinurie, může tato chyba ovlivnit nahlášené výsledky.

Pro nízkou hladinu monoklonální komponenty lze pozorovat velké nadhodnocení při použití režimu integrace "from bottom to top" (od základní linie k vrcholu). Pro monitorování pacienta musí být režim integrace monoklonálních komponent na elektroforetickém záznamu stejný pro různé analýzy a předchozí analýzy je třeba pečlivě sledovat, aby byly sledované monoklonální komponenty integrovány stejným způsobem. Kromě toho, když je pozorována nová abnormalita záznamu (mimo zónu albuminu), doporučuje se opakovat imunofixační analýzu vzorku.

KONFIRMAČNÍ TESTY

Při nalezení zvýšených, snížených nebo přidatných frakcí je nutno k identifikaci a kvantifikaci specifických proteinů použít konfirmační testy. SEBIA nabízí ve spojení se systémem HYDRASYS např. tyto specializované testy : • Monoklonální proteiny v séru a v moči : HYDRAGEL 1 IF (SEBIA kat. č. 4301 / 4801), HYDRAGEL 2 IF (SEBIA kat. č. 4302 / 4802), HYDRAGEL 4 IF (SEBIA kat. č. 4304 / 4804 a 4308 / 4808) a HYDRAGEL 9 IF (SEBIA kat. č. 4309 / 4809). • Oligoklonální (Ig) proužky v likvoru : HYDRAGEL 3 CSF (SEBIA kat. č. 4350 / 4850) a HYDRAGEL 6 CSF (SEBIA kat. č. 4351 / 4851). • Bence Jonesova bílkovina v moči : HYDRAGEL 1 BENCE JONES (SEBIA kat. č. 4321 / 4821), HYDRAGEL 2 BENCE JONES (SEBIA kat. č. 4322 / 4822), HYDRAGEL 4 BENCE JONES (SEBIA kat. č. 4324 / 4824). • Charakterizace tubulárního a glomerulárního poškození (molekulární síto v SDS pufru) : HYDRAGEL 5 PROTEINURIE (SEBIA kat. č. 4115).

Omezení

Lipoproteiny LDL a HDL jsou komplexní složky s velmi proměnlivou přirozenou elektroforetickou mobilitou mezi beta a alfa-2 pásmem. S cílem zabránit komplikacím při integraci a interpretaci, jsou gely HYDRAGEL vyráběny s konkrétním chemickým složením, které obecně zajišťují umístění HDL v pásmu alfa-2 a LDL v pásmu beta. - 197 -

HYDRAGEL 7 & 15 HR - 2015/06

Migrace je velmi citlivá na následující parametry : - skladování vzorku, - koncentrace lipoproteinů, - ošetření léky (například heparinem), - míru dehydratace gelu (skladování gelu), - odchylky v kvalitě surovin, i malé. Z těchto důvodů je možné pozorovat slabý anodický posun těchto lipoproteinů, které jsou více patrné při rozšíření nebo mírnému rozdělení oblastí alfa-2 a / nebo beta. 1) Procentuální obsah frakcí alfa-2 a beta zůstává zcela nezměněn přes mírné rozdělení v důsledku odchylek elektroforetické mobility. 2) Charakteristický tvar frakce beta-lipoproteinů (s významně zaostřeným a nepravidelným tvarem) by neměl vést k chybné interpretaci, protože se změnil pouze tento aspekt.

U rozmražených vzorků lze pozorovat stopy na místech aplikace, způsobené denaturovanými proteiny. Nepoužívejte hemolyzované vzorky séra a nepoužívejte vzorky plasmy. Díky omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy, je možné, že některé monoklonální komponenty nebudou detekovány touto metodou. Pro kvantitativní stanovení monoklonální komponenty, určené k monitorování pacienta, je nezbytné použít vždy stejnou metodu ke kvantifikaci bílkovin v moči.

Problémy

Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte technickoservisní středisko vašeho dodavatele. Bezpečnostní datové listy sady reagentů a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA a obaly pro přepravu biologických vzorků a čištění přístrojů jsou k dispozici na DVD s "NÁVODY A BEZPEČNOSTNÍMI DATOVÝMI LISTY".

HODNOTY

Byly použity standardní materiály, příprava vzorků a metody. Všechny elektroforeogramy byly hodnoceny vizuálně.

Kvalitativní analýza

Výsledky na HYDRAGEL 7/15 HR gelech indikují velice dobrou reprodukovatelnost na a mezi gely na všechny testované aspekty a nebyly zde žádné vizuálně pozorovatelné rozdíly mezi jednotlivými opakováními. Jednosto šestnáct (116) různých vzorků (patologických i normálních sér, párů CSF / sérum a močí) bylo analyzováno na HYDRAGEL 7/15 HR gelech a jiných, komerčně dostupných gelových systémech s vysokým rozlišením. Vzorky byly připraveny dle doporučení pro tuto metodu. Podobnosti / rozdíly elektroforeogramů a přítomnost monoklonálních nebo ologoklonálních komponent byly základem pro srovnání. Vizuálně, kvalitativní srovnání těchto dvou testů bylo založeno na srovnání počtu a umístění pozorovatelných proužků. Výsledky mezi těmito dvěma systémy byly ve shodě ve všech 116 případech a s jejich klinickou dg.

Semi-kvantitativní analýza

Pro semi-kvantitativní analýzu výsledky na HYDRAGEL 7/15 HR gelech indikují velice dobrou reprodukovatelnost na a mezi gely na všechny testované aspekty a nebyly zde žádné vizuálně pozorovatelné rozdíly mezi jednotlivými opakováními, průměr, CV byl 4.0 %. HYDRAGEL 7/15 HR metoda s barvením kyselou violetí a amidočerní byla srovnána s jiným, komerčně dostupným gelovým systémem s vysokým rozlišením (tradiční rozdělení s sérových bílkovin s vysokým rozlišením a barvením kyselou violetí). Pro srovnání všech elektroforeogramů byly výsledky skenovány (žlutým filtrem) jako 5-ti zónová elektroforéza. Klincké vzorky séra (n = 56) byly analyzovány oběma technikami a relativní koncentrace pro každou frakci byla srovnána za použití lineární regresní analýza, 0.973 byl střední korelační koeficient pro všechny proteinové frakce s oběma barvícími roztoky. FRAKCE

Koef.

Albumin

0.981

Beta

0.956

Alfa-1 Alfa-2

Gama

Citlivost

0.976 0.982 0.991

HYDRAGEL 15 HR (kys.violeť) Sklon

y-úsek

0.98

-0.14

0.98 0.99 0.91 0.99

Rozsah %

Koef.

1.89

36.7 - 66.1

0.985

0.90

5.8 - 19.8

0.918

-0.11

-0.16

1.5 - 7.5

6.8 - 24.5 8.3 - 40.0

0.982 0.978 0.990

HYDRAGEL 15 HR (amidočerň) Sklon

y-úsek

0.96

0.31

0.96 0.97 0.95 0.94

Rozsah %

2.35

36.1 - 67.4

0.41

5.4 - 20.0

-0.03 1.05

1.3 - 7.1

5.7 - 24.2 7.2 - 37.5

Vzorek patologického séra s monoklonální bílkovinou (identifikován a kvantifikován jinou technikou) byl následně ředěn normálním sérem a takto ředěný vzorek byl elektroforeticky analyzován za použití "HR1" and "HR2" programů. Podobně močový vzorek obsahující albumin a Bence Jonesovu bílkovinu (identifikován a kvantifikován jinou technikou) byl následně ředěn normálním sérem a takto ředěný vzorek byl elektroforeticky analyzován za použití "HR3" programu. Citlivost byla určena z nejvyššího ředění moče se zřetelným monoklonálním gradietem po nabarvení kyselou viletí. Citlivist detekce při použití "HR1" a "HR2" programů byla 10 - 30 mg/dL (pro monoklonální G,K). Citlivist detekce při použití "HR3" programu byla 1.5 - 2.0 mg/dL (pro albumin a Bence Jonesovu bílkovinu). Přibližně stejná barvící citlivost / intenzita byla pozorována při elektroforéze nativního séra a barvení amidočerní vs. elektrophoréza séra ředěného 1/4 následované barvením kyselou violetí. POZN : V závislosti na umístění monoklonální komponenty a polyklonálním pozadí v gama zóně, se může detekční limit lišit.

Linearita

Metoda byla lineární do koncentrace nejméně 5.8 g/dL pro albumin a do 3.9 g/dL pro Ig G pro obě barvící metody. - 198 -

HYDRAGEL 7 & 15 HR - 2015/06

Kvantitativní analýza vzorků moči (migrační program HR3 a skenování provedené densitometry SEBIA HYRYS 2 a GELSCAN)

U postupu HYDRAGEL HR závisí frakcionace bílkovin v moči na každém vzorku a poloha různých frakcí se na elektroforetickém záznamu mění. V tomto případě je ze vzorku identifikován pouze albumin a monoklonální komponenty, ostatní bílkoviny jsou rozděleny do bloků. Pro veškerá densitometrická měření byly použity densitometry SEBIA GELSCAN a HYRYS 2. Následující výsledky, získané skenováním gelů densitometry HYRYS 2 a GELSCAN s použitím postupů HYDRAGEL 7 a 15 HR s kyselou violetí, prováděných na přístroji HYDRASYS, vykazují velmi dobrou reprodukovatelnost mezi vzorky na jednom gelu a mezi skeny pro kvantitativní stanovení bílkovin v moči pomocí HYRYS 2 a GELSCAN.

Reprodukovatelnost mezi vzorky na jednom gelu

Čtyři (4) různé vzorky, sestávající z 1 vzorku (A) bez monoklonální komponenty a 3 vzorků (B, C a D) s monoklonální komponentou (s koncentracemi 16, 43 a 114 mg/dL) byly analyzovány postupem HYDRAGEL 15 HR s kyselou violetí a s použitím migračního programu HR3 na přístroji HYDRASYS s densitometrickým skenováním s použitím densitometrů 1 HYRYS 2 a 2 GELSCAN. Každý vzorek měl analyzovány na reprodukovatelnost všechny stopy každého gelu. V následujících tabulkách jsou uvedeny průměrné hodnoty SO a CV (v %) pro albumin, monoklonální komponentu a různé bloky bílkovin ze 4 vzorků analyzovaných pomoc densitometrů HYRYS 2 a GELSCAN. Vzorek A : HYDRAGEL 15 HR a HYRYS 2 Frakce Albumin Průměr (%) 65,5 SO 1,1 CV (%) 1,7 Vzorek B : HYDRAGEL 15 HR a HYRYS 2

Blok 1 1,5 0,3 19,4

Blok 2 9,7 0,4 4,5

Blok 3 10,5 0,6 6,0

Monoklonální komponenta 9,0 0,7 7,7

Frakce

Albumin

Blok 1

Blok 2

Frakce

Albumin

Blok 1

Blok 2 6,2 0,6 9,1

Monoklonální komponenta 64,0 2,3 3,7

Frakce

Albumin

Blok 1

Blok 2

Blok 3

Průměr (%) 77,4 SO 0,9 CV (%) 1,1 Vzorek C : HYDRAGEL 15 HR a HYRYS 2 Průměr (%) 18,5 SO 0,9 CV (%) 4,9 Vzorek D : HYDRAGEL 15 HR a HYRYS 2 Průměr (%) SO CV (%)

8,8 0,3 2,9

3,6 0,3 7,4

10,0 0,6 5,7

4,7 0,5 11,3 1,9 0,2 8,5

2,7 0,2 7,1

Vzorek A : HYDRAGEL 15 HR a GELSCAN č. 1 / GELSCAN č. 2 Frakce

Průměr (%) SO

CV (%)

Albumin

64,8 / 66,8 1,0 / 1,1

Blok 1

Blok 2

1,4 / 1,3

9,9 / 9,2

0,2 / 0,2

1,5 / 1,6

15,0 / 12,7

Albumin

Blok 1

0,4 / 0,4 3,9 / 4,2

Vzorek B : HYDRAGEL 15 HR a GELSCAN č. 1 / GELSCAN č. 2 Frakce

Průměr (%) SO

CV (%)

76,7 / 79,0 0,9 / 0,6 1,1 / 0,7

Blok 2

3,6 / 3,2

10,3 / 9,3

0,2 / 0,2

0,4 / 0,3

6,5 / 5,0

4,1 / 3,4

Vzorek C : HYDRAGEL 15 HR a GELSCAN č. 1 / GELSCAN č. 2 Frakce

Průměr (%) SO

CV (%)

Albumin

19,1 / 18,6 0,6 / 0,9

Blok 1

0,5 / 0,5

3,2 / 4,7

11,2 / 10,7

Frakce

Albumin

Blok 1

SO

0,4 / 0,4

Průměr (%) CV (%)

9,0 / 8,0 4,7 / 5,0

17,9 / 9,4

0,4 / 0,1

- 199 -

Monoklonální komponenta 9,4 / 8,6 0,6 / 0,4 6,1 / 4,6

Blok 3

2,6 / 2,4

0,3 / 0,2

3,5 / 4,5

Blok 2

6,3 / 5,9

1,8 / 1,6

0,4 / 0,5

6,2 / 5,7 0,4 / 0,3

Vzorek D : HYDRAGEL 15 HR a GELSCAN č. 1 / GELSCAN č. 2

Blok 3

10,5 / 10,1

Monoklonální komponenta 63,1 / 64,4

Blok 2

4,5 / 4,5

1,0 0,1 10,3

13,7 / 3,4

1,0 / 1,3 1,6 / 2,0 1,4 / 1,0 0,2 / 0,2

15,9 / 15,2

Blok 4 12,8 0,5 3,8 / / / / Blok 4 6,5 1,2 18,5

Monoklonální komponenta 85,6 0,5 0,6 Blok 4

13,3 / 12,6 0,6 / 0,6 4,5 / 4,6 / / / / Blok 4

7,2 / 6,9 1,1 / 0,6

15,8 / 8,7

Monoklonální komponenta 85,3 / 86,9 0,8 / 0,7 1,0 / 0,8

HYDRAGEL 7 & 15 HR - 2015/06

Reprodukovatelnost mezi jednotlivými skeny po přenastavení gelu na denzitometru

Osmnáct (18) různých vzorků, sestávajících z 1 vzorku (A) bez monoklonální komponenty, 2 vzorků (B a C) s monoklonální komponentou (s koncentracemi 16 a 43 mg/dL)a 15 různých vzorků moči byly analyzovány postupem HYDRAGEL 15 HR s kyselou violetí a s použitím migračního programu HR3 na přístroji HYDRASYS s 5 po sobě následujícími densitometrickými skenováními s použitím densitometrů 15 HYRYS 2 a GELSCAN. Každý vzorek A, B a C měl analyzovány na reprodukovatelnost všechny stopy každého gelu. 15 vzorků moči bylo analyzováno na stejném gelu a pro každý vzorek byla provedena 1 analýza. V následujících tabulkách jsou uvedeny limitní průměrné hodnoty (v %), SO a CV (v %) pro albumin, monoklonální komponentu a různé bloky bílkovin z 18 vzorků analyzovaných na denzitometrech HYRYS 2 a GELSCAN. Vzorek A : HYDRAGEL 15 HR a HYRYS 2 Frakce Albumin Průměr (%) 64,3 - 67,0 SO 0,0 - 0,7 CV (%) 0,1 - 1,0 Vzorek B : HYDRAGEL 15 HR a HYRYS 2

Blok 1 1,3 - 2,3 0,0 - 0,2 0,0 - 15,2

Blok 2 9,1 - 10,4 0,0 - 0,3 0,4 - 2,9

3,3 - 3,7 0,0 - 0,2 1,4 - 7,5

9,6 - 10,6 0,1 - 0,8 0,8 - 7,5

Průměr (%) 18,1 - 20,3 4,3 - 5,8 SO 0,2 - 0,9 0,1 - 0,5 CV (%) 1,2 - 4,3 1,7 - 9,8 15 různých vzorků moči : HYDRAGEL 15 HR a HYRYS 2 Frakce Albumin Průměr (%) 2,3 - 82,0 SO 0,0 - 1,1 CV (%) 0,1 - 4,7

6,0 - 7,0 0,1 - 0,5 1,4 - 7,0

Monoklonální komponenta 60,7 - 64,7 0,2 - 1,7 0,4 - 2,7

5,3 - 8,2 0,2 - 0,8 2,7 - 12,0

Blok 1 1,2 - 1,9 0,0 - 0,2 0,0 - 12,9

Blok 2 9,3 - 10,6 0,0 - 0,1 0,1 - 1,3

Blok 3 10,2 - 11,3 0,0 - 0,2 0,0 - 1,5

Blok 4 12,4 - 14,1 0,1 - 0,5 0,5 - 4,1

Blok 1

Blok 2

Frakce

Albumin

Frakce

Albumin

Průměr (%) 76,1 - 78,6 SO 0,1 - 0,3 CV (%) 0,1 - 0,4 Vzorek C : HYDRAGEL 15 HR a HYRYS 2

Vzorek A : HYDRAGEL 15 HR a GELSCAN Frakce Albumin Průměr (%) 63,0 - 66,1 SO 0,0 - 0,5 CV (%) 0,1 - 0,8 Vzorek B : HYDRAGEL 15 HR a GELSCAN Frakce

Albumin

Frakce

Albumin

Průměr (%) 76,1 - 78,5 SO 0,1 - 0,4 CV (%) 0,1 - 0,6 Vzorek C : HYDRAGEL 15 HR a GELSCAN

Blok 1

Blok 2

Blok 1

Blok 2

Blok 3 9,6 - 11,3 0,1 - 0,5 0,6 - 4,1

Monoklonální komponenta 8,0 - 10,4 0,0 - 0,9 0,5 - 8,5

Ostatní bílkoviny 0,4 - 93,9 0,0 - 1,4 0,0 - 19,3

3,1 - 3,8 0,0 - 0,2 0,0 - 5,0

9,5 - 10,9 0,0 - 0,2 0,0 - 2,0

Blok 1

Blok 2

Průměr (%) 18,2 - 20,5 3,3 - 5,7 SO 0,0 - 0,3 0,0 - 0,2 CV (%) 0,2 - 1,9 0,9 - 4,5 15 různých vzorků moči : HYDRAGEL 15 HR a GELSCAN Frakce Albumin Průměr (%) 2,5 - 82,7 SO 0,0 - 0,4 CV (%) 0,0 - 3,9

5,6 - 6,9 0,1 - 0,3 1,3 - 5,1

Monoklonální komponenta 8,3 - 10,0 0,1 - 0,4 0,8 - 3,8 Monoklonální komponenta 60,8 - 65,6 0,0 - 0,8 0,1 - 1,3

Ostatní bílkoviny 0,5 - 93,6 0,0 - 0,7 0,0 - 10,6

Přesnost – srovnávací studie

Blok 4 12,2 – 13,6 0,1 - 0,5 0,7 - 4,4 / / / /

Blok 4

/ / / / Blok 4

5,8 - 7,7 0,1 - 1,0 1,5 - 12,4

Analýza 91 různých vzorků moči s celkovými koncentracemi bílkovin v rozsahu od 0,10 do 19,00 g/L elektroforézou na agarózovém gelu s použitím postupů HYDRAGEL 7 & 15 HR s kyselou violetí na přístroji HYDRASYS (migrační program HR3) a densitometrické skenování na přístrojích HYRYS 2 a GELSCAN prokázaly dobrou shodu mezi těmito dvěma kvantifikačními systémy pro bílkoviny v moči. V následující tabulce je uvedena korelace parametrů, vypočítaných pro albumin a další bílkoviny ze směsných údajů mezi oběma systémy (y = HYDRAGEL 7 & 15 HR na GELSCAN). - 200 -

HYDRAGEL 7 & 15 HR - 2015/06 Frakce

Albumin Ostatní bílkoviny

Linearita

Korelační koeficient 0,998 0,999

Úsek y 0,075 -0,135

Sklon 0,995 1,014

Rozsah % hodnot pro HYDRAGEL 7 & 15 HR (GELSCAN) 3,9 - 87,4 2,8 - 96,7

Vzorek postupně ředěný fyziologickým roztokem vykazoval perfektní linearitu postupu HYDRAGEL 15 HR s kyselou violetí pro kvantitativní stanovení v celém rozsahu sledované optické hustoty od 0,08 do 3,39 na přístroji HYRYS 2 a od 0,08 do 3,68 na přístroji GELSCAN,

Citlivost

Citlivost postupu HYDRAGEL 15 HR s kyselou violetí s kvalitativním určením byla určena postupným ředěním monoklonální komponenty ve fyziologickém roztoku při počáteční koncentraci 95 mg/dL. Minimální limit detekce monoklonálního pásu byla okolo 1.5 mg/dL. POZNÁMKA : Kvantifikační limit se může lišit v závislosti na umístění monoklonální složky a polyklonálního pozadí v zónách gama a beta.

ELEKTROFOREOGRAM

- 201 -

HYDRAGEL 7 & 15 HR - 2015/06

(1) (2) (3) (4)

(5)

(6) (7) (8) (9)

(10) (11)

(12) (13)

(14)

(15) (16) (17)

BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY

Cameron JS. 1987. The nephrotic syndrome. Am J Kidney Dis, 10 : 157-171. Chopin N. 1991. Étude de la protéinurie. Inf Tech Biol, 1 : 23-28. Cohen R, François B, Sabot JF, Bernard P, Picq JP, Adeleine P. 1985. Étude comparative de l’immunoélectrophorèse urinaire et de quatre index de sélectivité glomérulaire au cours des glomérulopathies chroniques. Path Biol, 33 : 23-26. Davenport RD, Keren DF. 1988. Oligoclonal bands in cerebrospinal fluids, significance of corresponding bands in serum for diagnosis of multiple sclerosis. Clin Chem, 34 : 764-765. Joachim GR, Cameron JS, Chwartz M, Belker EL. 1964. Selectivity of protein excretion in patients with the nephrotic syndrome. J Clin Invest, 43, 2332-2346. Keren DF, “High resolution electrophoresis and immunofixation techniques and interpretation”, Butterworth-Heinemann, Woburn, MA, USA, 1994, 397 pp. Laurell DB. 1972. Comparison and variation of the gel electrophoresis fractions of plasma cerebrospinal fluid and urine. Scand J Clin Lab Investigation, 29 : 71-82. Le Carrer D. 1990. Protéinuries : Mise au point sur leur exploration biologique en 1990. L’Eurobiologiste, 190 : 395-405. Le Carrer D, Chopin N. 1994. Profil protéique urinaire : Proposition d’un protocole d’exploration biologique des protéinuries. Revue française des laboratoires, 269 : 29-37. Le Carrer D, Nicolas A, Ducasse L. 1992. L’analyse des protéinuries au laboratoire de biologie en 1992. Revue française des laboratoires, 225 : 41-47. Linstedt G, Lindberg PA. 1974. Loss of tubular proteinuria pattern during urine concentration with a commercial membrane filter cell. Clin Chem Acta, 56 : 125-126. Olsson JE, Link M. 1973. Immunoglobulin abnormalities in multiple sclerosis. 1973. Arch Neurol, 28 : 392-399. Papadopoulos NM, Costello R, Kay AD, Cuttler NR, Papoport SL. 1984. Combined immunochemical and electrophoretic determination of protein in paired serum and cerebrospinal fluid samples. Clin Chem, 30 : 1814-1816. Pearson SD, Wu JT. Sensitive, specific detection of oligoclonal banding in cerebrospinal fluid by agarose gel electrophoresis. 1989. Clin Chem, 35 : 1997. Philipon C. 1989. Protéines urinaires : Intérêt clinique et interprétation. Technique et Biologie, 6 : 239-249. Waller KV, Ward KM, Mahan JD, Wismatt DK. 1989. Current concepts in proteinuria. Clin Chem, 35 : 755-765. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact-Internat, 1986 ; Sept : 93-97.

- 292 -

HYDRAGEL 7 & 15 HR - 2015/06

SCHÉMAS / FIGURES Figure 1

Figure 2

9 10 78 56 34 12

11

12

13

15 14

Figure 3

Figure 4

12

123

456

789

10 11

12 13

14 15

Figure 5

HYDRASYS

sebia

HYDR 16

AGEL

17

18

15/30 27 28 (E) 26 EIN 25 24 PROT 23

19

20

21

29

30

22

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10

11

12

13

14

15

sebia

HYDR 16

AGEL

17

18

15/30 27 28 (E) 26 EIN 25 24 PROT 23

19

20

21

29

30

22

1

2

3

7 AGEL HYDR

4

5

6

7

8

9 10

11

12

13

PROT

EIN

(E)

1

2

3

4

6

sebia 5

7

- 293 -

15

(E) EIN PROT

1

7 AGEL HYDR

14

2

3

5

sebia 4

6

7

34

5 6 sebia 78 9 10 11

12

HYDRAGEL 7 & 15 HR - 2015/06

SCHÉMAS / FIGURES HYDRASYS 2 sebia

28 15/30 26 27 (E) 25 EIN 24 PROT 22 23 AGEL 20 21 HYDR 18 19 16

29

30

17

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10

11

12

13

14

15

sebia

28 /30 27 26 ) 15 25 (E IN 24 OTE 23 22 PR 21 EL AG 19 20 DR HY 17 18

29

30

16

1

HY

DR

EL AG

7 PR

OT

2

3

7 AGEL

(E) EIN PROT

1

2

3

4

5

6

7

sebia

- 294 -

6

7

8

(E) EIN

1

HYDR

5

4

2

3

4

5

6

sebia

7

9

10

11

12

13

14

15