ÁLLATTENYÉSZTÉS TUDOMÁNYI DOKTORI ISKOLA SZENT ISTVÁN EGYETEM VII. FÓRUM Gödöllő

ÁLLATTENYÉSZTÉS‐TUDOMÁNYI DOKTORI ISKOLA SZENT ISTVÁN EGYETEM

VII. FÓRUM

2013 Gödöllő

Állattenyésztés‐tudományi Doktori Iskola Iskolavezető: Dr. Mézes Miklós, egyetemi tanár, az MTA levelező tagja  Elérhetőségek:   Cím: 

Szent István Egyetem, Mezőgazdaság‐ és Környezettudományi Kar,   Állattudományi Alapok Intézet, Takarmányozástani Tanszék,   2103 Gödöllő, Páter Károly u. 1.  

Telefon: 

28/410735 

Telefax: 

28/410804 

Email: 

[email protected] 

Doktori Iskola titkára: Dr. Urbányi Béla, egyetemi docens, PhD  Elérhetőségek:   Cím: 

Szent István Egyetem, Mezőgazdaság‐ és Környezettudományi Kar,  Környezet‐ és Tájgazdálkodási Intézet, Halgazdálkodási Tanszék  2103 Gödöllő, Páter Károly u. 1.  

Telefon: 

28/522000/ 

Telefax: 

28/410804 

Email: 

[email protected]  

Doktori Iskola adminisztrátora: Dr. Balogh Krisztián, tudományos munkatárs, PhD  Elérhetőségek:   Cím: 

Szent István Egyetem, Mezőgazdaság‐ és Környezettudományi Kar,  Állattudományi Alapok Intézet, Takarmányozástani Tanszék  2103 Gödöllő, Páter Károly u. 1. 

Email: 

[email protected]   

2 

A Doktori Iskola fontosabb témacsoportjai 1. Állatbiotechnológia, génsebészet, genetikai markerek vizsgálata, transzgénikus állatok, klónozás, embrionális sejt és szövettenyészetek Dr. Bősze Zsuzsanna  Dr. Dinnyés András  Dr. Hiripi László 

2. Takarmányozás‐élettan, takarmánytoxikológia, gazdasági állatok élettana Dr. Bárdos László  Dr. Mézes Miklós  

3. Gazdasági állatok szaporodásbiológiája, a szaporítás biotechnikai kérdései Dr. Barna Judit  Dr. Rátky József  

4. Gazdasági állatok produkciógenetikája és etológiája, hús és tejgazdaság Dr. Tőzsér János   Dr. Póti Péter 

5. Halbiológia és halgazdálkodás Dr. Urbányi Béla  

6. Vadbiológia és vadgazdálkodás Dr. Csányi Sándor  Dr. Szemethy László   

3 

Doktori Iskola adatlap Intézmény:  

Szent István Egyetem 

A doktori iskola azonosítója:  

67 

A doktori iskola elnevezése:  

Állattenyésztés‐tudományi Doktori Iskola 

Tudományterületi besorolása:  

Agrártudományok 

Tudományága:  

Állattenyésztési tudományok 

Kutatási területe:  

Az  állattenyésztésen  belóül  a  gazdasági  jelentőségű  állattok  tartási,  takarmányozási,  élettani  és  genetikai  sajátosságainak  vizsgálata,  biotechnológiai‐biotechnikai  módszerek  kifejlesztése és alkalmazása 

A  képzés  az  intézmény  mely  mesterszakjaira  Agrármérnöki  épül:   Állattenyésztő mérnöki  Mezőgazdasági biotechnológus  Ökotoxikológus  Takarmányozási és takarmánybiztonsági mérnöki Létesítésének éve:  

2000 

A képzés kezdetének ideje:  

2000 

MAB minősítés:   Határozat száma:   Határozat kelte:  Érvényessége:  

megfelel  2009/7/XIII/2/  2009.X.02.  2014.XII.31. 

Oktatók száma:  Ebből témavezető:   Törzstagok száma:   Meghívott:  

52  38  10  12 

4 

ELŐSZÓ Az  Állattenyésztés‐tudományi  Doktori  Iskola,  néhány  évi  kényszerű  szünet  után  immár  hetedik Fórumát rendezheti meg a TÁMOP projekt támogatásával.  A  megelőző  hat  fórum  tanulságai  alapján  a  Fórum  szerkezetén  ugyan  nem  kívántunk  változtatni,  de  a  támogatás  előnyeit  kihasználva  a  korábbiaktól  eltérően  egy  olyan  új  elemet  is  beépítettünk, hogy egy nemzetközileg elismert hazai kutató, elsőként Prof. Orbán László, előadásával  kezdjük a programot.   Úgy gondolom, hogy a rendkívül nagy tapasztalattal rendelkező kutatók előadásai, amellett,  hogy  az  adott  tudományterület  legfrissebb  eredményeivel  ismertethetik  meg  a  hallgatóságot,  egyúttal  inspirálók  is  lehetnek  doktoranduszaink  számára  ahhoz,  hogy  egyszer  majd  ők  is  és  ilyen  módon is bemutathassák saját tudományterületük legújabb eredményeit a következő generációnak.  A Fórum hivatalosan megfogalmazott célja idén is az, hogy a kutatásaikat éppen kezdő, vagy  már  jelentősebb  eredményeket  elért  doktoranduszok  bemutathassák  eddig  elért  eredményeiket,  azokról  meghallgathassák  a  Doktori  Iskola  tagjai  és  doktorandusz  társaik  véleményét,  építő  jellegű  kritikáját,  elősegítve  ezzel  további  munkájuk  sikerét.  Emellett  tanácsot,  segítséget  is  kérhetnek  azokon  a  területeken  dolgozó  kollégáiktól,  amelyeken  nem  mozognak  ugyan  saját  területükkel  azonos  mértékben  otthonosan,  de  amelyek  a  biológia  tudományának  komplex  jellege  miatt  segíthetik  saját  eredményeik  minél  korrektebb  értelmezését,  vagy  akár  új  irányokat  is  adhatnak  kutatásaik folytatásához.  A kutatás fő célja ugyan elsődlegesen új ismeretek szerzése, de ezeknek az új ismereteknek ki  kell állnia a hazai és nemzetközi tudományos közösség kritikáját is, mert ezek az ismeretek csak akkor  válhatnak  valóban  az  adott  tudományterület  integráns  részévé,  ha  annak  megfelelőségét  mások  is,  más szemszögből szemlélve, a kutatás szabályainak szigorú betartásával megerősítik.  Bízom  benne,  hogy  a  hagyomány,  azaz  a  Doktori  Iskola  Fórum  sorozat  a  közeljövőben  is  folytatódhat  újabb  és  újabb  doktorandusz  generációk  számára  biztosítva  a  lehetőséget  a  megmérettetésre. 

Gödöllő, 2013. június 19.   

Mézes Miklós  a Doktori Iskola vezetője 

5 

Állattenyésztés‐tudományi Doktori Iskola VII. fóruma Időpont: 2013.06.19. 9.00.  Helyszín: Szent István Egyetem, Környezet és Tájgazdálkodási Intézet előadóterme  A  Fórum  célja,  hogy  a  PhD  hallgatók  bemutathassák  eredményeiket,  előrehaladásukat,  megbeszélhessék  nehézségeiket.  A  rendezvény  során  elhangzó  előadások  a  hallgatók  számára  egy  újabb  lehetőség  munkájuk  elismerésére.  A  Fórum  bevezetéseként  plenáris  előadást  tart  Dr.  Orbán  László  professzor  a  legújabb  halgenetikai  kutatásainak  eredményeiről  (Reproductive  Genomics  Group, Strategic Research Program, Temasek Life Sciences Laboratory, Singapore).  VII. Fórum Bizottsága:        

Dr. Mézes Miklós egyetemi tanár, a Bizottság elnöke  Dr. Bárdos László egyetemi tanár  Dr. Bősze Zsuzsanna tudományos tanácsadó  Dr. Dinnyés András egyetemi tanár  Dr. Szemethy László egyetemi docens  Dr. Tőzsér János egyetemi tanár  Dr. Urányi Béla egyetemi docens 

Plenáris előadás:  Orbán László: Molecular aquaculture: (nutri)genomic studies for improved foodfish production  Előadók és témájuk:   1.

Bernáth Gergely: 

A halsperma minősítési rendszerének gazdasági célú fejlesztése 

2.

Bokor Beáta Judit: 

Hízóbárányok vérmérsékletének és teljesítményének értékelése 

3.

Boltizár Ottó: 

A  hagyományos  planktonszelekció  aktuális  kérdései  és  továbbfejlesztésének lehetőségei 

4.

Bócsai Andrea: 

Rövidtávú  T‐2  toxin  terhelés  hatása  brojlercsirkék  biológiai  antioxidáns védőrendszerének néhány elemére 

5.

Bontovics Babett: 

Az  embrionális  fejlődés  kezdeti  szakaszára  jellemző  markerek  expressziós  mintázatának  vizsgálata  nyúl  embriókban  és  embrionális őssejtekben 

6.

Buza Eszter: 

Hazai réticsík (Misgurnus fossilis) állományok genetikai elemzése  és  szaporodásbiológiai  sajátosságainak  (poliploidizáció  és  aszexuális szaporodás) feltérképezése 

6 

7.

Demény Márton János: 

Holstein‐fríz  tehenek  csülökkeménysége,  a  csülkök  helyeződése  és  keménysége  közötti  összefüggések  vizsgálata 

8.

Hejel Péter: 

Különböző  erdőgazdálkodási  módok  hatása  a  növényevő  nagyvad‐fajok élőhelyére és a vadkár kialakulására 

9.

Kovács Levente: 

Egészséges  és  sánta  holstein‐fríz  tehenek  szívritmusa  és  szívritmus‐varianciája fejés során 

10. Major Péter: 

Transzgenikus  állatmodell  előállítása  és  jellemzése  hosszú  QT  szindróma vizsgálatára 

11. Ősz Ágnes: 

Hazai  vad  és  tenyésztett  sebespisztráng‐állományokgenetikai  hátterének  felmérése  és  egy  genetikai  markerekre  alapozott  tenyésztési rendszer kialakítása 

12. Pelyhe Csilla: 

Hosszú  távú  T‐2  toxin  terhelés  hatása  brojlercsirkék  lipidperoxidációs és glutation redox paramétereire 

13. Prágai Andrea: 

Alpakák kondíció bírálata 

14. Schally Gergely Tibor: 

Az  erdei  szalonka  (Scolopax  rusticola)  vonuló  állományának  vizsgálata Magyarországon 

15. Skoda Gabriella: 

Szuperizmolt  módszerrel 

16. Szentes Katalin: 

A  hormonindukció  hatása  a  barramundi  (Lates  calcarifer)  korai  ivarátfordulására 

17. Váradi Éva: 

Hímivarsejtek  és  korai  ivarszerv‐szövetek  mélyhűtéses  tartósításának  fejlesztése  baromfifajokban  génmegőrzési  célokból 

18. Varga Eszter: 

Transzgén‐mentes  Indukálható  Pluripotens  Őssejt  vonalak  alapítása Egér modellben 

nyúltörzs 

7 

létrehozása 

cink‐finger 

nukleáz 

Plenáris előadás Előadó: Dr. Orbán László 1) 2) 3)

Reproductive  Genomics  Group,  Strategic  Research  Program,  Temasek  Life  Sciences  Laboratory,  Singapore;  Department  of Biological  Sciences,  National  University  of Singapore,  Singapore;  Department  of  Animal  Sciences  and  Animal  Husbandry,  Georgikon  Faculty,  University  of  Pannonia,  Keszthely,  Hungary 

Molecular aquaculture: (nutri)genomic studies for improved foodfish production   We  have  been  working  on  the  improvement  of  traditional  aquaculture  procedures  and  cultured  fish  species  through  the  use  of  molecular  and  genomic  tools  for  over  a  decade.  In  my  presentation, I will describe two aspects of our ongoing project: 1) analysis of the suitability of five  commercial feeds for elite lines of Asian seabass produced by selection assisted by molecular tools;  and 2) understanding the genetic regulation of the sex change of the species through the use of the  zebrafish model.  The  Asian  seabass  (or  barramundi;  Lates  calcarifer)  is  foodfish  species  with  increasing  popularity in Southeast Asia. It is a euryhaline marine teleost that occupies a vast geographic region  that extends from Western Australia through South‐East Asia to Northern India. We have started a  marker‐assisted selection program on Asian seabass in 2004 in collaboration with two partners. We  have  developed  a  set  of  platform  technologies,  including  rapid  sexing,  genotyping  by  multiplexed  microsatellites,  expression  microarrays  and  various  genetic  maps  that  allowed  us  to  improve  the  efficiency of selection. The selected F2s have shown substantially improved growth performance in  farm trials. Commercial farms use a wide variety of commercial feeds for cultruing Asian seabass. We  have performed a nutritional and nutrigenomic trial to compare the performance of our F2 fish fed  five  different  commercial  pelleted  feeds  compared  to  frozen  baitfish.  The  performance  of  the  fish  varied widely among the feeds. In addition to the classical analyses (i.e. phenotyping and histology),  detailed biochemical study of the flesh and transcriptional analysis of the digestive system was also  performed:  the  results  allowed  us  to  make  a  more  informed  choice  for  feeding  the  future  generations of our selected lines.  The  Asian  seabass  is  a  catadromous,  protandrous  hermaphrodite:  it  is  born  in  the  brackish  water of coastal regions, swims up to freshwater to mature as a male, returns to the sea to breed,  and  eventually  changes  sex  into  a  female.  One  of  the  biggest  problems  of  its  aquaculture  is  the  continuously changing sex ratio of the broodstock: the all‐male stock following maturation turns into  a  heavily  female‐biased  population  within  1‐2  years  forcing  the  farmers  to  deal  with  several  generations  in  parallel.  Several  labs,  including  ours,  have  been  studying  the  process  of  gonad  transformation in zebrafish (Danio rerio) males that go through a ‘juvenile ovary’ phase during their  sexual  development.  Through  the  combined  use  of  mutants,  transgenic  reporter  lines,  microarray‐ based  transcriptomics  and  traditional  histology,  it  was  shown  that  at  least  three  major  developmental  pathways  are  involved  in  the  regulation  of  this  process.  In  my  presentation,  I  will  summarize these data and argue that the zebrafish is a potential model to gain information on the  molecular regulation of sex change in teleosts, independently from its direction. 

8 

 

Doktoranduszok előadásai Név: 

Bernáth Gergely 

Kezdés éve: 

2012 

Képzés formája: 

nappali tagozatos 

Témavezető: 

Horváth Ákos 

Intézet, Tanszék: 

Környezet ‐ és Tájgazdálkodási Intézet, Halgazdálkodási Tanszék 

Elérhetőség: 

+36305478167   [email protected] 

A halsperma minősítési rendszerének gazdasági célú fejlesztése A téma aktualitása, jelentősége A  halsperma  mélyhűtési  módszerének  kidolgozása  több  mint  öt  évtizedes  múltra  tekint  vissza. A módszer kidolgozása egy időben kezdődött a gazdasági haszonállatokéval. A halak esetében  az  eljárás  nem  terjedt  el  a  gyakorlati  alkalmazás  terén  ellentétben  pl.  a  szarvasmarha‐  vagy  juhtenyésztéssel.  Ahhoz,  hogy  a  spermamélyhűtés  módszere  elterjedhessen  a  halgazdálkodás  gyakorlatában,  rendszerezni  és  egységesíteni  kell  a  spermaminősítési  eljárásokat.  Minden  fajra  egyedileg alkalmazható protokollra van szükség. Az elmúlt öt évben a halak ivarsejtjeivel foglalkozó  kutatók  három,  egymást  kétévente  követő  nemzetközi  szimpóziumon  fogalmazták  meg  azt  az  általános  igényt,  hogy  a  publikált  módszerek  ismételhetősége  és  gyakorlati  alkalmazása  érdekében  kerüljön  sor  egy  laboratóriumok  közötti  módszertani  egységesítésre.  A  legutóbbi,  Budapesten  és  Gödöllőn  megrendezésre  került  találkozót  (3rd  International  Workshop  on  the  Biology  of  Fish  Gametes,  www.fish‐gametes2011.org)  követően  a  résztvevők  (több,  mint  20  ország  képviselői)  sikeresen pályáztak az Európai Unió COST programjának támogatására. A pályázat témája és fő célja  a  halivarsejtek  kutatásában  használt  módszerek  egységesítése,  standardizálása.  A  pályázat  sikere  is  jelzi a téma időszerűségét és fontosságát.  A halsperma mélyhűtés a genetikai állomány megőrzése és a gyakorlati állattenyésztés során  egyaránt nagyon fontos biotechnológiai eljárás (Cabrita és mtsai., 2010).E tudományterületen egyes  édesvízi  csoportok  esetében  már  jelentős  mennyiségű  eredmény  áll  rendelkezésünkre.  A  pisztrángfélék esetében széles körben kutatott faj a szivárványos pisztráng (Oncorhynchus mykiss), a  sebes  pisztráng  (Salmo  trutta  m.  fario),  a  pataki  szaibling  (Salvelinus  fontinalis)  és  a  tavi  szaibling  (Salvelinus alpinus) (Lahnsteiner és mtsai., 1996; Cabrita és mtsai., 1998; Martinez‐Páramo és mtsai.,  2009). A tokfélék esetében a gazdasági jelentőséggel bíró és veszélyeztetett fajokat egyaránt kutatták  pl.  a  viza  (Huso  huso),  a  kecsege  (Acipenser  ruthenus),  a  lénai  tok  (Acipenser  baeri),  a  fakó  tok  (Scaphirhynchus albus), a közönséges tok (Acipenser sturio), a vágótok (Acipenser güeldenstaedtii) és  a  rövidorrú  tok  (Acipenser  brevirostrum)  (Horváth  és  mtsai.,  2008).  Harcsafélék  közül  az  afrikai  harcsának (Clarias gariepinus) és a harcsának (Silurus glanis), a pontyfélék közül a pontynak (Cyprinus  carpio)  és  a  fehér  busának  (Hypophthalmichthys  molitrix)  szenteltek  eddig  figyelmet  (Horváth  és 

9 

Urbányi, 2000; Alvarez és mtsai., 2008; Maisse és mtsai., 2008; Viveiros és Komen, 2008). A tengeri  fajok esetében a kutatások csak az utóbbi tizenöt évben kezdődtek meg. Nagy figyelmet szenteltek  eddig a rombuszhalnak (Scophthalmus maximus) (Suquet és mtsai., 1998; Chereguini és mtsai., 2003)  és  az  aranydurbincsnak  (Sparus  aurata)  (Fabbroccini  és  mtsai.,  2000;  Cabrita  és  mtsai.,  2005).  Vizsgálták az európai angolna (Anguilla anguilla) és a japán angolna (Anguilla japonica) spermájának  mélyhűtését  is  (Tanaka  és  mtsai.,  2002;  Asturiano  és  mtsai.,  2003).  Széles  körben  kutatták  már  a  csíkos  sügért  (Morone  saxatilis)  (He  és  Woods,  2003),  a  hegyesdurbincsot  (Diplodus  puntazzo)  (Taddei és mtsai., 2001) és az óriás laposhalat (Hippoglossus hippoglossus) (Babiak és mtsai., 2006). A  spermamélyhűtésnek  számos  előnye  lehet  (pl.  az  aszinkron  ivarsejt  termelés  során  mind  a  két  ivar  esetében  a  legjobb  minőségű  mintákat  alkalmazhatjuk,  egyszerűsítheti  a  halgazdasági  termelést,  megoldható  az  ivarsejtek  szállítása  és  kereskedelme,  veszélyeztetett  fajokat  menthetünk  meg,  genetikai  szelekció  és  irányított  tenyésztés  valósítható  meg,  génbankok  hozhatók  létre).  Egyes  halfajok  jól  alkalmazhatóak  orvostudományi  kutatások  során  (pl.  zebradánió  (Danio  rerio)).  A  spermamélyhűtés  segítségével  megoldható  a  transzgénikus  sejtvonalak  hosszú  távú  megőrzése  (Cabrita  és  mtsai.,  2010).  A  frissen  lefejt  sperma  minősége  függhet  az  adott  fajtól,  a  tenyészállománytól,  vagy  akár  az  egy  állattól  származó  mintáktól  is.  A  minőséget  befolyásolhatja  továbbá az ívási időszak is. Általános megfigyelés, hogy a hím egyedek spermájának minősége az ívási  időszak  elejétől  a  végéig  folyamatosan  csökken  (Perez‐Cerezales  és  mtsai.,  2010).  A  fent  említett  okok miatt fontos a minőség biztosítás (a módszerek, eszközök, oldatok standardizációja) fejlesztése.  Ma  már  az  is  ismert,  hogy  minőségtől  függően  a  különböző  minták  eltérő  módon  reagálnak  a  mélyhűtésre.  Fontos  tehát,  hogy  minden  esetben  a  legjobb  minőségű  mintát  válasszuk  ki  vizsgálataink, illetve a gyakorlati felhasználás során egyaránt (Cabrita és mtsai., 2010). A mélyhűtés  során  sérülhet  a  sejt  plazmamembránja,  mitokondriális  állománya  és  genomja  (Watson  és  Morris,  1987; Watson és Fuller, 2001). A sejtet különböző károsító hatások érhetik a mélyhűtés során, mint  pl.  jégkristályok  képződése,  oxidatív  és  ozmotikus  stressz  (Watson  és  Morris,  1987).  A  sperma  funkcionális és életképessége a mélyhűtés során használt eljárásoktól is függ. A spermiumoknak meg  kell  őrizniük  membránjuk  integritását  és  mozgásképességüket,  hogy  a  felolvasztás  után  termékenyíteni  tudják  a  vizes  közegben  úszó  ikraszemeket.  A  spermiumok  mozgékonysága  függ  a  mitokondriumoktól, az ATP produkciótól, a flagellum felépítésétől és működésétől (Cabrita és mtsai.,  2010).  A  motilitás  (mozgékonyság)  vizsgálata  az  egyik  legjelentősebb  spermaminősítési  módszer  (Cosson és mtsai., 2008). Fajtól függően a mozgó sejtek aránya 10‐100 % is lehet (Cabrita és mtsai.,  2010). A  motilitás meghatározása történhet mikroszkóp alatt szabad szemmel vagy alkalmazhatunk  CASA (Computer‐assisted Sperm Analysis) rendszert. A koncentráció mérésével meg tudjuk határozni  a minta sűrűségét, azaz vizsgálni tudjuk a minőséget a spermiumok számának meghatározásával. Az  eljárás során alkalmazhatunk mikroszkópot és vizuális sejtszámlálást, spektrofotométert, és áramlási  citometriát  (Fauvel  és  mtsai.,  2010).  A  sejtek  működését  nagyban  befolyásolhatja  a  sejten  kívüli  és  belüli  környezet  ionösszetétele,  valamint  a  kettő  közötti  iongrádiens  (ozmolalitás).  A  szeminális  plazmában  található  ionok  aktiválják  a  spermiumokat  és  mozgásra  késztetik.  A  külső  közeg  ionösszetételének  változása  növelheti  vagy  csökkentheti  a  spermium  flagellumok  dinamikáját,  működését  (Márián  és  mtsai.,  1993).  Az  ozmolalitást  ozmométerrel  tudjuk  mérni.  A  sperma  minőségének ellenőrzése során nagyon fontos tényező a sejtek életképességének vizsgálata (Cabrita  és mtsai., 2010). A módszer lényege, hogy a membrán integritását kihasználva megállapítjuk az élő és  halott  spermiumok  arányát.  Az  eljárás  során  fluoreszcens  mikroszkóp  alatt  vizsgáljuk  a  kétféle  fluoreszcens  anyaggal  kezelt  sejteket.  Az  élősejtek  kimutatására  használhatjuk  pl.  a  zölden  világító  SYBR 14‐et, a halott sejtek meghatározásához a vörös fluoreszcens fényt kibocsátó propídium‐jodidot 

10 

(Segovia és mtsai., 2000; Grzyb és mtsai., 2003). A SYBR 14 képes az élő sejtek membránján áthatolni  és  a  magban  működő  DNS‐hez  kötődni,  míg  a  propídium‐jodid  behatol  a  sérült  membránnal  rendelkező (azaz halott) spermiumokba és ott festi meg a maganyagot (Segovia és mtsai., 2000). Bár  az  egyes  laboratóriumok  már  számos  spermaminősítési  és  ‐mélyhűtési  módszert  kidolgoztak,  a  legtöbb esetben az eljárásokat minden kutató különféleképpen használja, ezzel eltérő eredményeket  produkálva  (Cabrita  és  mtsai.,  2010).  Szükség  van  standard  spermaminősítési  és  ‐mélyhűtési  protokollok kidolgozására, melyeket követve minden esetben konstans, jó eredményt kaphatunk. Az  egységes  módszertan  hiánya,  a  leközölt  metodikák  gyenge  ismételhetősége  súlyos  akadálya  annak,  hogy  a  sperma  manipulációjával  járó  technikák  (pl.  a  mélyhűtés)  elterjedjenek  a  halgazdálkodás  gyakorlatában.Az ovariális folyadék egyes fajokban nagy mennyiségben, más fajokban korlátozottan  ürül az ívás során. Mivel mindkét ivarnak érdeke a termékenyülés sikerének maximalizálása íváskor,  feltételezhető, hogy az ovariális folyadék fokozza, meghosszabbítja a spermiumok mozgását. Tüskés  pikóban  (Gasterosteus  aculeatus)  végzett  korábbi  vizsgálatok  igazolták,  hogy  az  ovariális  folyadék  önmagában nem aktiválja a halspermát, ugyanakkor vízzel keverve meghosszabbítja annak mozgását  (Eloffson és mtsai., 2006). Az ovariális folyadék spermaaktivációra gyakorolt hatása ugyanakkor igen  kevés fajban ismert. 

Célkitűzések A  kutatás  során  módszertani  fejlesztést  kívánunk  elvégezni  hazai,  gazdasági  jelentőséggel  bíró halfajokon (pontyfélék, sügérfélék, tokfélék, pisztrángfélék és harcsaalakúak). Standard, minden  kutatócsoport  által  használható,  mindenhol  egységesen  működő  spermaminősítési  rendszereket  kívánunk  kidolgozni  a  felsorolt  csoportok  fajaira  egyedileg.  Terveink  között  szerepel  a  spermaminősítés különböző lépéseinek (sperma motilitásának, koncentrációjának, életképességének,  a  szeminális  plazma  ozmolalitásának,  ellenőrzése),  meghatározása,  standardizálása  és  egységes  rendszerbe  foglalása.  Vizsgálni  kívánjuk  továbbá,  hogy  az  egységesített  módszertan  milyen  mértékben  javítja  a  mélyhűtött  sperma  minősítésének  megbízhatóságát  is.  Ezzel  párhuzamosan  egységesíteni kívánjuk az egyes fajokban alkalmazott spermamélyhűtési módszereket is.  Vizsgálni  kívánjuk  az  ovariális  folyadék  sperma  aktiváló  hatását.  Fel  kívánjuk  deríteni  az  aktivációban résztvevő, a folyamatot befolyásoló faktorokat különböző fajokban. 

Módszerek A  módszertani  standardizáció  szerves részét  képezik  majd  a  támogatást  nyert  COST  halózat  keretében  szervezett  tanfolyamok,  módszertani  szimpóziumok  és  workshopok,  amelyek  során  az  elméleti  képzés  mellett  az  egységes  módszertan  kiakakítását  célzó  gyakorlati  foglalkozások  igen  fontos szerepet kapnak. Mivel a SzIE Halgazdálkodási Tanszékének kutatói tevékenyen részt vesznek  a  hálózat  munkájában,  a  módszerek  egységesítését  részben  külföldi  kutatókkal  együtt,  Magyarországon kívül tervezzük megvalósítani.A fejés módszerének alkalmazása során minden halfaj  esetében  külön  kell  tesztelni  a  katéteres  fejés  használatának  hatását  a  sperma  termékenyítő  képességére  nézve.  A  szilikon  katéter  megakadályozza  a  vérrel,  vizelettel  és  bélsárral  történő  kontaminációt.  Tesztelnünk  kell,  hogy  a  különböző  méretű  halfajok  esetében  mekkora  átmérőjű  és  mennyire rugalmas katétert érdemes alkalmazni.  

11 

A  motilitás  vizsgálat  standardizációját  a  CASA  rendszer  segítségével  kívánjuk  elvégezni.  A  rendszer  egy  Sperm  Vision®  nevű  szoftvert  használ,  mely  felismeri  a  mozgó  és  statikus  sejteket  egyaránt.  Minden  halfajra  egyedileg  akarjuk  kidolgozni  a  megfelelő  eljárást.  A  motilitás  vizsgálata  során egyes fajok esetében (a sperma túlzott sűrűsége miatt) ki kell dolgozni a minta hígítási arányát  a megfelelő oldattal, mely nem aktiválja idő előtt a spermiumokat. Minden taxon esetében egyedileg  kell  tesztelnünk,  esetleg  kidolgoznunk  a  legmegfelelőbb  aktiváló  oldatot,  mely  teljes  mértékben  mozgásra készteti a sejteket és maximalizálja az aktiváció időtartamát. Meg kell határoznunk minden  halfaj  esetében,  hogy  a  vizsgálat  során  mekkora  mennyiségű  mintával  a  legoptimálisabb  dolgozni.  Minden  taxon  esetében  ki  kell  dolgozni  a  legmegfelelőbb  oldatot,  mely  megakadályozza  a  spermiumok  kitapadását  a  vizsgálat  során  alkalmazott  Makler‐féle  spermavizsgáló  kamra  aljához.  A  számítógépes  szoftver  használatának  standardizációja  során,  a  fajonként  változó  sejtmérethez  és  sejtkoncentrációhoz kívánjuk meghatározni az optimális beállításokat.  A koncentrációmérést spektrofotometriás méréssel kívánjuk standardizálni. Az abszorbancia  és  a  spermakoncentráció  összefüggését  több  halfajban  felismerték.  A  spermiumok  koncentrációját  különböző  mintákon  és  hígításokban  klasszikus,  sejtszámláló  kamrás  méréssel  kell  meghatározni,  majd  ennek  eredményeit  összevetni  a  spektrofotométerrel  mért  abszorbancia  értékeivel.  A  koncentráció mérése során meg kell határozni minden halfaj esetében a megfelelő hígítási arányt.  Az  életképesség  vizsgálata  során  mikroszkóp  és  számítógép  segítségével  meg  tudjuk  határozni  az  élő  és  halott  sejtek  arányát.  A  munka  során  segítségünkre  van  a  QCapture  szoftver,  mellyel  digitális  felvételeket  készíthetünk  az  adott  mintáról.  Az  általunk  használt  mikroszkóp  fluoreszcens objektívvel rendelkezik. Az életképesség vizsgálata során külön fluoreszcens vegyületet  használunk a halott és élő sejtek elkülönítéséhez. A munka során minden fajra egyénileg tesztelni kell  a floureszcens oldatokat. Standardizálni kell taxononként a vizsgálat módszertanát. A különböző fajok  spermáját  már  korábban  kidolgozott  módszerek  szerint  szeretnénk  mélyhűteni.  A  mélyhűtést  és  felolvasztást követően vizsgálni kívánjuk a fentiek során egységesített módszertan megbízhatóságát  mélyhűtött  spermán  is.  Tehát  a  fent  leírt  módszerek  mindegyikét  alkalmazni  fogjuk  mélyhűtött  spermán  is.A  kifejlesztett  módszerek  megbízhatóságát  később  termékenyítési  kísérletekkel  is  igazoljuk. Ehhez az ikrát, a vizsgált fajokat tenyésztő gazdaságokból szerezzük be, majd laboratóriumi  körülmények  között  termékenyítünk.  A  termékenyítést  az  adott  vizsgálati  paraméter  (hígítás,  életképesség,  stb.)  szerint  végezzük.Ovariális  folyadék  sperma  aktiváló  hatásának  vizsgálatát  több,  nagy  mennyiségű  ovariális  folyadékot  termelő  fajban  szeretnénk  elvégezni,  így  a  különböző  növényevő  fajokban  amur  (Ctenopharyngodon idella),  fehér  busa  (Hypophthalmichthys molitrix),  pettyes  busa  (Hypophthalmichthys nobilis)),  illetve  sügérfélékben.  Az  ovariális  folyadékot  rutin  keltetőházi  szaporítás  során  kívánjuk  begyűjteni.  Az  ovariális  folyadék  egyes  paramétereinek  (ozmolalitás, pH) mérését követően azt a felhasználásig mélyhűtve szándékozunk tárolni. Az ovariális  folyadék  spermiumokat  aktiváló  hatását  hígítatlanul,  illetve  különböző  hígítási  arányok  mellett  kívánjuk vizsgálni. Az aktiváció tényét a már ismertetett CASA eljárással dokumentáljuk.   

12 

Várható eredmények A spermaminősítési eljárások egységesítése gazdasági szempontból fontos halfajokban Ezen belül a következő paraméterek kerülnek közlésre vizsgált fajonként:     

a sperma optimális motilitását biztosító hígító,  a sperma optimális motilitását biztosító hígítási arány,  a spermiumok koncentrációjának pontos mérését lehetővé tevő spektrofotometriás  módszer,  a spermiumok életképességének pontos meghatározását lehetővé tevő fluoreszcens  festési eljárás. 

A  fent  leírt  standardizációs  munkától  azt  várjuk,  hogy  növeli  a  mérések  pontosságát  és  csökkenti a vizsgálati pontatlanságból eredő statisztikai hibát. A kapott eredmények terveink szerint  jelentősen  segítik  a  spermamélyhűtést  követő  túlélést,  ami  végső  soron  a  termékenyülési  eredmények javulásában nyilvánul meg. Ezen kívül az egységesített módszertan lehetővé teszi majd  az  ivarsejtek  manipulációjával  kapcsolatos  eljárások  gyorsabb  bevezetését  a  haltenyésztés  és  nemesítés gyakorlatába. 

Az ovariális folyadék spermiumok aktivációjára gyakorolt hatásának jobb megismerése Ez  elsősorban  biológiai  információt  jelent,  bővülnek  vele  a  halak  szaporodásbiológiájával  kapcsolatos  ismereteink  és  jobban  megismerjük  a  szaporodás  sikerességét  garantáló  biológiai  folyamatokat.  E  mellett  gyakorlati  jelentősége  is  lehet,  hiszen  számos  fajban  a  nagy  mennyiségű  ovariális  folyadék  jelenlétét  károsnak  tartják.  Terveink  szerint  ezt  a  kérdést  is  igyekszünk  majd  tisztázni. 

Irodalomjegyzék Alvarez, B.; Arenal, A.; Fuentes, R.; Pimentel, R.; Abad, Z.; Pimentel, E., (2008): Use of post‐thaw silver  carp (Hypophtalmichthys molitrix) spermatozoa to increase hatchery productions. In: Methods  in  Reproductive  Aquaculture:  Marine  and  Freshwater  Species.  Biology  Series.  E.  Cabrita,  V.  Robles, M. P. Herraez (Eds), CRCPress (Taylor and Francis group), 345–350.  Asturiano,  J.F.,  Pérez,  L.,  Marco‐Jiménez,  F.,  Olivares,  L.,  Vicente,  J.S.,  and  Jover,  M.  (2003):  Media  and  methods  for  the  cryopreservation  of  European  eel  (Anguilla  anguilla)  sperm.  Fish  Physiology and Biochemistry 28: 501–502.  Babiak, I., Ottesen, O., Rudolfsen, G., and Johnsen, S. (2006): Chilled storage of semen from Atlantic  halibut, Hippoglossus hippoglossus : Optimizing the protocol. Theriogenology 66: 2025–2035.  Cabrita,  E.,  Alvarez,  R.,  Anel,  L.,  Rana,  K.J.,  and  Herraez,  M.P.  (1998):  Sublethal  Damage  during  Cryopreservation of Rainbow Trout Sperm. Cryobiology 37: 245–253.  Cabrita,  E.,  Robles,  V.,  Rebordinos,  L.,  Sarasquete,  C.,  and  Herráez,  M.P.  (2005):  Evaluation  of  DNA  damage  in  rainbow  trout  (Oncorhynchus  mykiss)  and  gilthead  sea  bream  (Sparus  aurata)  cryopreserved sperm. Cryobiology 50: 144–153. 

13 

Cabrita,  E.,  Sarasquete,  C.,  Martínez‐Páramo,  S.,  Robles,  V.,  Beirão,  J.,  Pérez‐Cerezales,  S.,  and  Herráez, M.P. (2010): Cryopreservation of fish sperm: applications and perspectives. Journal of  Applied Ichthyology 26: 623–635.  Chereguini,  O.,  García  de  la  Banda,  I.,  Herrera,  M.,  Martinez,  C.,  and  De  la  Hera,  M.  (2003):  Cryopreservation of turbot Scophthalmus maximus (L.) sperm: fertilization and hatching rates.  Aquaculture Research 34: 739–747.  Cosson, J., Groison, A.‐L., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C., and Billard, R. (2008): Studying sperm  motility in marine fish: an overview on the state of the art. Journal of Applied Ichthyology 24:  460–486.  Elofsson, H., Van Look, K. J. W., Sundell, K., Sundh, H. & Borg, B. (2006): Stickleback sperm saved by  salt in ovarian fluid. The Journal of Experimental Biology 209: 4230‐4237.  Fabbrocini,  A.,  Lavadera,  S.L.,  Rispoli,  S.,  and  Sansone,  G.  (2000):  Cryopreservation  of  Seabream  (Sparus aurata) Spermatozoa. Cryobiology 40: 46–53.  Fauvel,  C.,  Suquet,  M.,  and  Cosson,  J.  (2010).  Evaluation  of  fish  sperm  quality:  Journal  of  Applied  Ichthyology 26: 636–643.  Grzyb, K., Rychłowski, M., Biegniewska, A., and Skorkowski, E.F. (2003): Quantitative determination  of creatine kinase release from herring (Clupea harengus) spermatozoa induced by tributyltin.  Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology 134: 207–213.  He,  S.,  and  Woods  III,  L..  (2003):  Effects  of  glycine  and  alanine  on  short‐term  storage  and  cryopreservation of striped bass (Morone saxatilis) spermatozoa. Cryobiology 46: 17–25.  Horváth,  Á.,  and  Urbányi,  B.  (2000):  The  effect  of  cryoprotectants  on  the  motility  and  fertilizing  capacity of cryopreserved African catfish Clarias gariepinus (Burchell 1822) sperm. Aquaculture  Research 31: 317–324.  Horváth,  Á.,  Wayman,  W.R.,  Dean,  J.C.,  Urbányi,  B.,  Tiersch,  T.R.,  Mims,  S.D.,  Johnson,  D.,  and  Jenkins, J.A. (2008): Viability and fertilizing capacity of cryopreserved sperm from three North  American  acipenseriform  species:  a  retrospective  study.  Journal  of  Applied  Ichthyology  24:  443–449.  Lahnsteiner,  F.,  Berger,  B.,  Weismann,  T.,  and  Patzner,  R.  (1996):  The  influence  of  various  cryoprotectants on semen quality of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) before and after  cryopreservation. Journal of Applied Ichthyology 12: 99–106.  Maisse, G.; Ogier de Balny, B.; Labbe, C., (2008): Cryopreservation of testicular sperm from European  catfish  (Silurus  glanis).  In:  Methods  in  Reproductive  Aquaculture:  Marine  and  Freshwater  Species Biology Series. E. Cabrita, V. Robles, M. P. Herraez (Eds), CRCPress (Taylor and Francis  group), pp. 397–401.  Márián, T., Krasznai, Z., Balkay, L., Balázs, M., Emri, M., Bene, L., and Trón, L. (1993): Hypo‐Osmotic  Shock  Induces  an  Osmolality‐Dependent  Permeabilization  and  Structural  Changes  in  the  Membrane of Carp Sperm. J Histochem Cytochem 41: 291–297.  Martínez‐Páramo, S., Pérez‐Cerezales, S., Gómez‐Romano, F., Blanco, G., Sánchez, J.A., and Herráez,  M.P. (2009): Cryobanking as tool for conservation of biodiversity: Effect of brown trout sperm  cryopreservation on the male genetic potential. Theriogenology 71: 594–604.  Pérez‐Cerezales,  S.,  Martínez‐Páramo,  S.,  Beirão,  J.,  and  Herráez,  M.P.  (2010):  Evaluation  of  DNA  damage  as  a  quality  marker  for  rainbow  trout  sperm  cryopreservation  and  use  of  LDL  as  cryoprotectant. Theriogenology 74: 282–289. 

14 

Segovia, M., Jenkins, J.A., Paniagua‐Chavez, C., and Tiersch, T.R. (2000): Flow cytometric evaluation of  antibiotic  effects  on  viability  and  mitochondrial  function  of  refrigerated  spermatozoa  of  nile  tilapia. Theriogenology 53: 1489–1499.  Suquet, M., Dreanno, C., Petton, B., Normant, Y., Omnes, M., and Billard, R. (1998): Long‐term effects  of the cryopreservation of turbot (Psetta maxima) spermatozoa. Aquatic Living Resources 11:  45–48.  Taddei, A.R., Barbato, F., Abelli, L., Canese, S., Moretti, F., Rana, K.J., Fausto, A.M., and Mazzini, M.  (2001): Is Cryopreservation a Homogeneous Process? Ultrastructure and Motility of Untreated,  Prefreezing, and Postthawed Spermatozoa of Diplodus puntazzo (Cetti). Cryobiology 42: 244– 255.  Tanaka,  S.,  Zhang,  H.,  Horie,  N.,  Yamada,  Y.,  Okamura,  A.,  Utoh,  T.,  Mikawa,  N.,  Oka,  H.P.,  and  Kurokura,  H.  (2002):  Long‐term  cryopreservation  of  sperm  of  Japanese  eel.  Journal  of  Fish  Biology 60: 139–146.  Viveiros,  A.  T.  M.;  Komen,  J.,  (2008):  Semen  cryopreservation  of  the  African  catfish,  Clarias  gariepinus. In: Methods in Reproductive Aquaculture: Marine and Freshwater Species. Biology.  Series. (Eds.) Cabrita, V. Robles, M. P. Herraez (Eds), CRCPress (Taylor and Francis group), pp.  403–407.  Watson  P.  and  Morris  G.  (1987):  Cold  shock  injury  in  animal  cells.  Symposia  of  the  Society  for  Experimental Biology 41: 311.  Watson,  P.,  and  Fuller,  B.  (2001):  Principles  of  cryopreservation  of  gametes  and  embryos.  In:  Cryobanking the Genetic Resource. Wildlife conservation for the future. Watson, P  and  Holt, W, (Eds.) Taylor and Francis: London. 23‐46.  

15 

Név: 

Bokor Beáta Judit 

Kezdés éve: 

2011 

Képzés formája: 

részidejű költségtérítéses 

Témavezető: 

Póti Péter 

Intézet, Tanszék: 

Állattenyésztés‐tudományi Intézet 

Elérhetőség: 

+ 36 30 99 87 154  [email protected] 

Hízóbárányok vérmérsékletének és teljesítményének értékelése A téma aktualitása, jelentősége Magyarországon  komoly  múltja  van  a  juhhús  termelésnek  mégis  ezen  hagyományos  állattenyésztési  ágazatunk  hihetetlenül  visszaesett.  Ennek  okai  között  kereshetjük  a  hazai  piac  és  a  külföldi, főként európai piacok felvevőképességének hanyatlását, valamint más kontinenseken kissé  megemelkedett juh létszámot, valamint a fogyasztók keresleti szokásainak megváltozását (minőségi,  mennyiségi, súlybeli stb. különbségek).  A  legfrissebb  tendenciákat  tekintve,  a  juhhús  globális  termelése  közel  14  millió  tonna  volt  2012‐ben, ez az előző évhez képest kismértékű emelkedést mutat (FAO). Ezt a legeltető országokban,  főleg  Ázsiában  a  legelők  minőségi  javulása  okozta,  India,  Törökország,  Pakisztán  és  Irán  területén  növekedett a juh állomány.   2013‐ban további növekedésre számolhatunk ezen területeken, sőt még Afrikában az aszály  sújtotta területeken, ‐ ahol 2012‐ben csökkent az állomány ‐ is növekedés várható ebben az évben,  bár az újabb pestis megtizedelheti az állományt.  A  globális  juhhústermelésből  Európa  és  Észak‐Amerika  csupán  22  %‐kal  veszi  ki  részét,  míg  Ausztrália és Új‐Zéland valamint Ázsia adja a termelés fő részét. A közel‐keleti piacok erős kereslete  hozzájárul  a  juh‐és  kecskehús  kereskedelmének  fellendüléséhez,  míg  az  európai  piac  és  Magyarországon a kereslet messze elmarad ettől.   Az  Európai  Bizottság  rövid  távú  előrejelzése  szerint  az  Unió  juh‐  és  kecskeállományának  folyamatos csökkenése miatt a termelés folyamatos visszaesésével kalkulálhatunk.  Az Európai  Unióban Írország kivételével mindenhol  elmaradt a juhhústermelés 2012‐ben és  várhatóan ez a tendencia marad meg 2013‐ra is.  Az Európai Unió exportja 2013‐ban is bővülhet és elérheti a 22 ezer, illetve a 24 ezer tonnás  mennyiséget. Az EU‐ban a juh‐ és kecskehús fogyasztása az előrejelzések szerint tovább csökkenhet  2013‐ban. 

16 

Az Európai Unióban a kereslet szezonális és a kisebb testű és alacsony faggyúval rendelkező  bárányok  iránt  van.  Mivel  az  Unióba  jelentős  import  érkezik,  valamint  a  tengeren  túlról  érkező  áru  mennyisége is számottevő, ezért a magyar gazdák mind ez uniós mind az importra szoruló országok  (pl. Törökország) felé bővíthetnék exportjukat. 

A vérmérséklet fogalma A vérmérséklet Burrow (1997) megfogalmazása szerint az állatok emberi bánásmódra adott  viselkedési válaszreakciója. A vérmérséklet megállapítása szubjektív módon pontozással, pl. mérleg‐ teszt alkalmazásával, illetve objektív módszerekkel, pl. kezelhetőségi teszt (docility teszt), menekülési  sebesség (flight speed) segítségével történik (Burrow, 1997).   A  vérmérséklet  fontosságát  jól  mutatja,  hogy  több  szerző  is  keresett  kapcsolatot  az  állatok  vérmérséklete  és  egyes  termelési  tulajdonságai  között.  A  nyugodt  vérmérséklet  kedvezően  befolyásolta  a  növekedési  erélyt  (Voisinet  és  mtsai,  1997;  Pajor  és  mtsai,  2008),  a  báránynevelő  képességet  (O’Connor  és  mtsai,  1985;  Pajor  és  mtsai,  2010),  a  hús‐  és  tejminőséget  (Reverter  és  mtsai, 2003, Orbán és mtsai, 2011) egyaránt.  Ezzel  szemben  pl.  a  növekedésben  lévő  bárányok  vérmérséklete  és  a  különböző  vérparaméterek között kevés információ áll rendelkezésre. 

Célkitűzések A  fenti  tényezőket,  a  juhhústermelés  hosszú  időre  visszanyúló  múltját,  valamint  a  magyar  mezőgazdasági  adottságokat  figyelembe  véve,  a  magyar  tenyésztőknek  vannak  kiaknázatlan  lehetőségei  ezen  a  piacon.  A  jövőbeni  sikereiknek  kulcsa  a  minőségi  és  egyben  gazdaságos  juhhústermelésben látom, melynek vizsgálatával foglalkozom, ezen belül most:  1. A vérmérséklet, mint termelést befolyásoló tényező   2. A  hízóbárányok  növekedéssel  kapcsolatos  vérparaméterei  (szénhidrát,  lipid  és  fehérje  anyagcsere metabolitok) 

Módszerek Vizsgálat tárgya A  Törtelen  (Bács‐Kiskun  megye)  található  gazdaságban  beállított  kísérletben  10‐10  német  húsmerinó kosbárányt vizsgálok, mérleg és menekülési teszt alkalmazásával.  Az általam választott fajta a német húsmerinó. Magyarországon a leggyakrabban előforduló  juhfajta  után  a  német  húsmerinó  a  második  leggyakoribb  fajta,  viszont  a  húshasznúak  között  a  leggyakoribb juhfajta.    

17 

Vizsgálat menete A  bárányok  a  választásuk  után  Üzemi  sajátteljesítmény‐vizsgálatban  (ÜSTV)  vesznek  részt  (átlagosan  40  nap).  Az  ÜSTV  alatt  a  bárányok  ivar  szerint  elkülönítve,  bárányhizlaló  teljes  értékű  takarmányt  fogyasztanak,  melynek  a  beltartalmi  értékeinek  meg  kell  felelnie  az  érvényes  Juh  Teljesítményvizsgálati Kódex előírásainak.  A  bárányok  vérmérsékletének  megállapítása  a  mérlegelésekkel  egy  időben  történik.  A  vizsgálatok  során  két  tesztet  használunk.  A  bárányok  választásakor  és  a  hizlalás  végén  a  mérleg  tesztet, valamint a hizlalás végén a menekülési sebesség tesztet alkalmazzuk. A menekülési sebesség  alapján mért adatokból három osztályt állítottunk fel: a nyugodt, az átlagos és az ideges csoportokat. 

Vérmérséklet megállapítására alkalmazott tesztek Mérleg teszt A  mérlegteszt  során  az  állatok  30  másodpercig  tartózkodnak  a  mérlegen  (Trillat  és  mtsai,  2000). Ez alatt a viselkedésüket pontozom 1‐től 5‐ig terjedő skálán, a következők szerint:  1 pont: nyugodt, nem mozog;   2 pont: nyugodt, néhány esetleges mozgás;   3 pont: nyugodt, kicsit több mozgás, de nem rázza a mérleget;  4 pont: hirtelen, epizodikus mozgások, de nem rázza a mérleget;   5 pont: folyamatos, hirtelen mozgások, rázza a mérleget.   Menekülési sebesség teszt A menekülési sebesség tesztet Burrow (1988) ajánlása alapján is elkésztem. Ebben az esetben  a  mérleg  elhagyása  utáni  1,7  m  távolság  megtételéhez  szükséges  időt  határozom  meg  stopper  alkalmazásával. 

Vérvizsgálatok A vérmintákkal a hízóbárányok növekedéssel kapcsolatos vérparaméterek vizsgálata a célom.  Vért  veszek  választáskor  nyugodt  (1‐es  pont)  és  ideges  (5‐ös  pont)  pontozású,  véletlenszerűen  kiválasztott  10‐10  báránytól  választásakor,  és  a  hizlalás  végén.  A  bárányoktól  levett  vért  két  kémcsőbe teszem, az egyikben véralvadás gátlóval (heparin), a másikban nélküle.   Ezt  követően  centrifugálom,  majd  a  szérumot,  ill.  plazmát,  majd  ‐20  0C‐on  tárolom.  A  mintákból  továbbiakban  glükóz,  fruktóz‐amin,  albumin,  karbamid,  triglicerid,  NEFA  és  koleszterol  meghatározásokra kerül sor. 

A vágási és ultrahang vizsgálat Az  ultrahang  méréseket  élő  állapotban  (in  vivo)  tervezem  végezni.  A  faggyú  vastagság  meghatározása ultrahangos méréssel történik a 12‐13 borda között, a bordák ívét követve.   18 

Várható eredmények Várható  eredmények  a  német  húsmerinó  vérmérsékletének  megállapítása  és  egyes  befolyásoló tényezők vizsgálata után a növekedés és hízlalás során a bárányok vérmérsékletének és  anyagcseréjének összefüggéseinek megismerése. 

Összefoglalás Az  Európai  Unió  anyajuh  létszáma  folyamatosan  csökken,  míg  az  import  növekedik.  Magyarországon a juhtenyésztés fő bevételi forrása szinte kizárólag a bárányok eladásából származik.  A bevétel növelésének egyik formája az anyajuhok szaporaságának a növelése.   A  magyar  gazdák  versenyképességének  növelése  érdekében  fontos  az  értékmérő  tulajdonságok  folyamatos  vizsgálata  és  a  minőségi  juhhús  előállítást  megalapozó  egyéb  tényezők  vizsgálata.  Ehhez  elengedhetetlen  az  állatok  viselkedésének  tanulmányozása  is,  mivel  az  állatok  a  külső környezettel (benne az emberrel együtt) állandó kölcsönhatásban vannak, és mind gazdasági,  mind  állatvédelmi  szempontból  egyaránt  rendkívül  fontos,  hogy  az  egyes  állatok  az  adott  technológiát  jól  tűrik,  vagy  sem.  Ezért  nagy  jelentőségű  az  állatok  viselkedésének,  pl.  vérmérsékletének vizsgálata.    A  vérmérséklet  Burrow  (1997)  megfogalmazása  szerint  az  állatok  emberi  bánásmódra  és  tartástechnológiára adott viselkedési válaszreakciója. A vérmérséklet vizsgálatának jelentőségét több  hazai  vizsgálat  is  alátámasztotta,  pl.  Pajor  és  mtsai  (2008)  negatív  összefüggést  találtak  a  bárányok  vérmérséklete  és  az  élősúlya  között,  ahol  a  nyugodt  vérmérsékletű  bárányok  gyorsabban  gyarapodtak a hizlalás alatt, mint az ideges csoportba tartozó társaik.   A  vérmérséklet,  mint  termelést  befolyásoló  tényező  és  a  hízóbárányok  növekedéssel  kapcsolatos  vérparamétereinek  (szénhidrát,  lipid  és  fehérje  anyagcsere  metabolitok)  vizsgálatával  kívánok konzekvenciát levonni a minőségi juhhústermelés érdekében. 

Irodalomjegyzék Burrow, H.M. – Seifert, G.W. – Corbet, N.J. (1988): A new technique for measuring temperament in  cattle. Animal Production Australia, 17. 154‐157.  Burrow, H.M. (1997): Measurement of temperament and their relationship with performance traits  of beef cattle. Animal Breeding Abstracts, 65. 478‐495.  O’Connor, C.E. – Jay, N.P. – Nicol, A.M. – Beatson, P.R. (1985):  Ewe maternal behaviour score and  lamb survival. Proceeding of the New Zealand Society of Animal Production, 45. 159–162.  Orbán, M. – Kovácsné, G.K. – Pajor, F. – Szentléleki, A. – Póti P. – Tőzsér J. – Gulyás L. (2011): Effect of  temperament of Jersey and Holstein Friesian cows on milk production traits and somatic cell  count. Archiv Tierzucht, 54. 594‐599.  Pajor,  F.  –  Szentléleki,  A.  –  Láczó,  E.  –  Tőzsér,  J.  –  Póti,  P.  (2008):  The  effect  of  temperament  on  weight  gain  of  Hungarian  Merino,  German  Merino  and  German  Blackhead  lambs.  Archive  Tierzucht, 51. 247‐254.  Pajor, F. – Murányi, A. – Szentléleki, A. – Tőzsér, J. – Póti, P. (2010): Effect of temperament of ewes  on their maternal ability and their lambs’ postweaning traits in Tsigai breed, Gödöllő, Hungary.  Archiv Tierzucht, 53. 465‐474.. 

19 

Reverter, A. – Johnston, D.J. – Ferguson, D.M. – Perry, D. – Goddard, M.E. – Burrow, H.M. – Oddy,  V.H.  –  Thompson,  J.M.  –  Bindon,  B.M.  (2003):  Genetic  and  phenotypic  characterisation  of  animal, carcass and meat quality traits from temperate and tropically adapted beef breeds. 4.  Correlations  among  animal,  carcass  and  meat  quality  traits.  Australian  Journal  of  Agricultiral  Research, 54. 149‐158.  Trillat,  G.  –  Boissy,  A.  –  Boivin,  X.  –  Monin,  G.  –  Sapa,  J.  –  Mormende,  P.  –  Neindre,  P.L.  (2000):  Relations entre le bien‐entre des bovines et les caracteristiques de la viande (Rapport definitif‐ Juin). INRA, Theix, France, 1‐33. 

20 

Név: 

Boltizár Ottó 

Kezdés éve: 

2011 

Képzés formája: 

nappali tagozatos 

Témavezető: 

Horváth László 

Társ‐témavezető: 

Hegyi Árpád 

Intézet, Tanszék: 

Környezet ‐ és Tájgazdálkodási Intézet, Halgazdálkodási Tanszék 

Elérhetőség: 

0630/519‐4133  Boltizá[email protected] 

A hagyományos planktonszelekció aktuális kérdései és továbbfejlesztésének lehetőségei A téma aktualitása, jelentősége A  Csontoshalak  közé  tartozó,  Közép‐kelet  Európában  a  tavi  haltenyésztésben  domináns  pontyfélék (Cyprinidae) kitűnnek hatalmas szaporaságukkal. A nagy szaporaságra azért van szükség,  mert  a  védtelen,  és  ennek  követeztében  sok  veszteséggel  járó  embrió,  és  lárva  szakasz  alatt  az  utódállományok nagy része elpusztul. A szubsztratofil ikrából kikelő 4‐5 mg nedves testtömegű lárvák  a  tavi  halakra  általában  jellemző  módon,  napokig  helyváltoztatás  nélkül  az  elárasztott  szárazföldi,  vagy vízi növényzet felszínén függeszkednek. Ebben a korban a csaknem teljesen védtelen hallárvákat  az  állóvizek  egyik  leggyakoribb  planktonalkotó,  többségében  ragadozó  kisrákjai  (Copepoda),  és  vízi  rovarok  lárvái  elpusztítják.  A  tavakban  nagy  létszámban  előforduló  ragadozó  kisrákok  a  tavi  pontyfélék természetes ívása során képesek teljes utódállományokat elpusztítani (Szuhanova, 1968,  Tamás  és  Horváth,  1975,  1976).  Hasonló  sorsra  jut  a  védett,  keltetőházakban  előállított  táplálkozó  ivadék is, amikor továbbnevelés céljából tavi környezetbe helyezik ki azokat (Woynárovich és Horváth  1980).  Vegyszeres  planktonszelekciót  az  1970‐es  évek  eleje  óta  végeznek  a  tógazdaságok  ivadék  előnevelő tavaiban. Ennek az agrotechnikai beavatkozásnak a fő célja az, hogy az ivadéknevelő tavak  felárasztása  során,  az  árasztó  vízzel  bekerült  vegyes  planktonállományból  eltávolítsa  azokat  a  ragadozó, illetve táplálékkonkurens inszektákat, amelyek közvetlenül, és közvetve is veszélyeztetik a  legtöbb  halfaj  táplálkozó  ivadékát.  Elsősorban  az  evezőlábú  rákok  alrendjébe  tarozó  ragadozó  Cyclops  fajok,  illetve  az  ágascsápú  rákok  rendjébe  tartozó  nagyobb  testű  fajok  (Daphnia  pulex,  Daphnia  magna)  ideiglenes  eltávolítása  szükséges.  Az  ágascsápú  rákok  kártétele  abban  nyilvánul  meg,  hogy  táplálék  konkurensévé  válnak  a  hallárva  starter  táplálékának,  a  kerekesférgeknek.  Az  elmúlt  évtizedekben  a  haltenyésztők  bevált  módszerként  alkalmazták  a  szerves  foszforsav‐észter  hatóanyagú  rovarirtó  szerekre  alapozott  planktonszelekciót.  A  legáltalánosabb  szer  a  diklórfosz  hatóanyagú Unifosz volt, melyet általában 1‐1,5 ppm töménységben használtak.  Ez  a  bevált  gyakorlat  a  2007‐es  esztendőig  működhetett  legálisan,  mert  ekkor  ugyanis  hatályba  lépett  egy  Európai  Uniós  határozat  (2007/387/EK),  amely  megtiltotta  a  foszforsav‐észter  hatóanyagú  rovarirtó  szerek  többségének  a  mezőgazdasági  célú  felhasználását.  Köztük  az  unifosz  is 

21 

tilalmi  listára  került.  Jelenleg  kizárólag  a  400g/l  illetve  a  200g/l  klórpirifosz‐metil  hatóanyagot  tartalmazó Reldan, illetve Megatox márkanévvel ellátott szerek vannak engedélyezve. 

Célkitűzések Folyamatban  lévő  vizsgálataink  célja  az  Európai  Unió  által  jelenleg  engedélyezett  hatóanyagok  (főként  természetes  eredetű  készítmények)  tesztelése,  plankton  szelekciós  célokra  történő alkalmasságuk vizsgálata a gazdaságosság kereteit figyelembe véve.  

Módszerek Vizsgált hatóanyagok és készítmények Vizsgálataink során három szóba jöhető készítmény tesztelése lett elvégezve. Az egyik, a már  említett  Reldan  és  Megatox  szerek  hatóanyaga  a  400  g/l  klórpirifosz‐metil,  a  másik  a  kristályos  szerkezetű  ezüst‐nitrát, a  harmadik  pedig az  un. Neem olaj volt.  Utóbbi az Azadirachta Indica nevű  trópusi  fa  leveléből  készült  természetes  kivonat.  Ez  az  ökológiai  gazdálkodásban  is  engedélyezett  készítmény  azért  speciális,  mert  az  inszektákra  kifejtett  hatása  a  szintetikus  rovarirtó  szerekkel  ellentétben,  nem  az  ingerület  átvitel  gátlásán  alapul,  hanem  bizonyos  táplálkozást  befolyásoló  idegközpontokat  bénít.  Ennek  következtében  csökkenhet,  vagy  akár  meg  is  szűnhet  a  veszélyes  Copepoda  rákok  ragadozó  aktivitása.  Ezen  kívül  vizsgálatokat  folytattunk  arra  vonatkozóan,  hogy  a  szernek van e közvetlen toxicitása a Copepodákra, és ha igen, milyen töménységben.   

A tesztkísérletek módszerének ismertetése A  vizsgálataink  elvégzésére  két  részletben  került  sor.  A  laboratóriumi  tesztkísérletek  során  hígítási  sorozatban  került  meghatározásra  a  vizsgált  vegyszerek  Copepodákra  kifejtett  24,  48  és  72  órás  toxicitása.  Az  oldatok  50  ml‐es  tesztedényekben  lettek  elkészítve,  három  ismétlésben.  A  klórpirifosz‐metillel  végzett  kísérlet  során,  a  koncentrációk  0,125  és  2  ppm  közötti  tartományba  estek.  Az  ezüst‐nitrát  esetében  pedig  a  koncentrációk  0,3125  és  2  ppm  közötti  koncentráció  tartományba  estek.  A  Copepodák  kísérleti  mintaszáma  20  db  volt  koncentrációnként.  A  24  és  a  48  órás ellenőrzés során, a lebomlási idő meghatározása céljából az oldatokba új Copepodák kerültek.   A  Neem  olajjal  végzett  kísérlet  során,  a  közvetlen  toxicitás  meghatározására  irányuló  teszt  esetében  a  koncentrációk  1  és  50  ppm  közötti  tartományba  estek.  A  Copepodák  mintaszáma  nem  változott, viszont a kísérlet 72 órás időtartama alatt nem kerültek új Copepodák az oldatba. A Neem  olaj  étvágycsökkentő  hatása,  Copepoda‐ezüstkárász  lárva,  illetve  Copepoda‐Rotatoria  tesztrendszerben, 0,5 és 10 ppm közötti koncentráció tartományban lett vizsgálva, ahol a Copepodák  kísérleti mintaszáma 100 db, a hallárváké pedig 10 db volt.   A  vizsgálatok  második  része  félüzemi  körülmények  között  valósult  meg.  A  klórpirifosz‐metil  hatóanyag  és  az  ezüst‐nitrát  esetében,  a  laboratóriumi  tesztkísérletek  során  leg‐  hatékonyabbnak  bizonyult koncentrációk lettek vizsgálva fóliahengerekben, egy ismétlésben. A Neem olaj esetében 2  m3‐es  ewos  típusú  kádakban,  három  ismétlésben  lettek  elvégezve  a  Rotatoria‐Copepoda  tesztrendszerben folytatott laboratóriumi kísérletek. 

22 

A  fóliahengerek  fő  funkciója  az  volt,  hogy  a  teljes  vízoszlopot  magukban  foglalták  az  üledékkel  együtt,  melynek  következtében  a  bennük  lejátszódó  napszakos  hidrobiológiai  folyamatok  szinte teljesen megegyeztek a hengeren kívüli víztérben lejátszódó folyamatokkal. Mivel a hengerek  alsó peremei legalább 15 cm mélyen bele voltak nyomva az üledékbe, így a bennük lévő oldat csak  minimális  mértékben  léphetett  kölcsönhatásba  a  tó  vizével.  A  hengerekbe  Copepoda  biomassza  került, majd meg lett határozva a 10 liter vízben lévő egyedek száma. Az ellenőrzések során ehhez a  számhoz viszonyítottunk. 

Eredmények A klórpirifosz‐metil és az ezüst‐nitrát toxikus hatása a Copepodákra A  klórpirifosz‐metil  hatóanyaggal  végzett  laboratóriumi  teszt  24‐órás  ellenőrzése  során  megállapítható  volt,  hogy  a  negyed  ppm  koncentrációjú  oldat  több  mint  95  %‐os  mortalitást  eredményezett  a  Copepoda  állományban.  Ugyanennek  a  koncentrációnak  a  48  órás  ellenőrzése  során  a  túlélő  Copepodák  aránya  már  több  mint  90  %  volt.  Ezzel  szemben  a  gyakorlatban  gyakran  használt  1  ppm  töménységű  oldat  esetében  még  a  72‐órás  ellenőrzés  során  is  több,  mint  60  %‐os  mortalitás volt tapasztalható (1. ábra).   A kristályos szerkezetű ezüst‐nitrát esetében, a 0,0625 ppm volt az a legkisebb koncentráció,  amely  24  óra  elteltével  teljes  mortalitást  eredményezett  a  Copepoda  állományban.  A  48  órás  ellenőrzés során a túlélő Copepodák aránya már több mint 75 % volt, a 72 óra elteltével pedig 95 %  (2. ábra).  A  laboratóriumi  tesztek  során,  a  klórpirifosz‐metil  hatóanyag  gyakorlati  alkalmazás  szempontjából hatékonynak bizonyult  negyed ppm  koncentrációjú oldatának félüzemi tesztjében, a  24 órás ellenőrzés során 10 %‐alatti volt a túlélő Copepodák aránya. Ez az érték néhány %‐ban tér el a  laboratóriumi  tesztek  eredményétől.  A  48  órás  ellenőrzés  során  ez  az  arány  88  %  volt,  72‐óra  elteltével pedig 92 %.   Az ezüst‐nitrát 0,0625 ppm koncentrációjú oldatának tesztjében a 24‐órás ellenőrzés során 5  % alatti volt a túlélő Copepodák aránya. A 48 órás ellenőrzéskor ez az érték 89 %, 72 óra elteltével  pedig  94  %  volt,  melyek  kicsivel  magasabb  értékek,  mint  amiket  a  laboratóriumi  tesztek  esetében  kaptunk (3. ábra). 



23 

A Neem olaj Copepodákra gyakorolt közvetlen toxicitása és azok táplálkozását befolyásoló hatása A Neem olaj közvetlen toxicitását vizsgáló laboratóriumi teszt 24 órás ellenőrzésekor, még a  magasabb  koncentrációjú  oldatok  esetében  sem  volt  tapasztalható  jelentős  eltérés  a  kontrollhoz  képest. A 48 órás ellenőrzés során a 45 és az 50 ppm közötti koncentrációjú oldatok esetében volt 90  % feletti mortalitás. 72 óra elteltével már a 40 ppm koncentrációjú oldat is hatékonynak bizonyult. Az  ennél  alacsonyabb  koncentrációk  72‐óra  elteltével  sem  okoztak  jelentős  mortalitást  a  Copepoda  állományban (4. ábra).  A  Neem  olaj  alacsonyabb  koncentrációinak  hatása  a  Copepodák  ragadozó  aktivitására  Copepoda‐ezüstkárász  lárva  tesztrendszerben  lett  vizsgálva.  A  10  ppm  koncentráció  48  és  72  órás  ellenőrzése  esetben  volt  a  legnagyobb  eltérés  a  Copepodát  és  hallárvát  is  tartalmazó  kontroll  csoporthoz képest, de már az 1 ppm koncentráció esetében is észrevehetően több hallárva maradt  életben (5. ábra).  A  Rotatoria‐Copepoda  tesztrendszer  esetében  a  vegyes  kontroll  csoportban  és  a  0,5  ppm  koncentrációjú  csoportban  volt  igen  jelentős  eltérés  a  laboratóriumi,  és  a  félüzemi  tesztek  eredményei között (6. ábra). A laboratóriumi teszt grafikonjain látható, hogy az 1 ppm koncentrációjú  oldat  esetében,  magasabb  volt  a  túlélő  Rotatoriák  aránya,  mint  a  vegyes  kontrol  csoportban.  A  félüzemi teszt során viszont ebben vegyes kontroll csoportban sokkal több Rotatória maradt életben.  Ennek  az  lehetett  az  oka,  hogy  az  ewos‐típusú  kísérleti  medencében  a  zöldalga  biomassza  növekedése lehetővé tette a Rotatoriák folyamatos szaporodását. 

Túlélő Copepodák aránya (%)

100,00 90,00 80,00 70,00 60,00

24 h

50,00

48 h

40,00

72 h

30,00 20,00 10,00 0,00 Kontrol

2 ppm

1 ppm 0,5 ppm 0,25 ppm 0,125 ppm Koncentrációk (ppm)

1. ábra: A klórpirifosz‐metil hatóanyag toxicitása Copepodákra (Cyclops sp.) hígítási sorozatban   (0,125‐2 ppm) (24; 48; 72 h) 

24 

Túlélő Copepodák aránya (%)

100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00

24 h

40,00

48 h

30,00

72 h

20,00 10,00 0,00 Kontrol 2 ppm

1 ppm 0,5 ppm

0,25 0,125 ppm ppm Koncentrációk (ppm)

0,0625 0,03125 ppm ppm

2. ábra: Az ezüst‐nitrát toxicitása Copepodákra (Cyclops sp.) hígítási sorozatban (0,03125‐2 ppm)   (24; 48; 72 h) 

Túlélő Copepodák aránya (%)

100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00

24 h

40,00

48 h 72 h

30,00 20,00 10,00 0,00 Kontrol

Klórpirifosz-metil (0,25 ppm) Koncentrációk (ppm)

Ezüst-nitrát (0,625 ppm)

3. ábra: A klórpirifosz‐metil és az ezüst‐nitrát laboratóriumi tesztekben hatékonynak bizonyult  koncentrációinak Copepodákra (Cyclops sp.) kifejtett toxicitása (24; 48; 72 h) 

25 

100 Túlélő Copepodák aránya (%)

90 80 70 60

24 óra

50

48 óra

40

72 óra

30 20 10 0

Control

1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Koncentrációk (ppm)

Túlélő hallárvák aránya (%)

4. ábra: A Neem olaj közvetlen toxicitása Copepodákra (Cyclops sp.), hígítási sorozatban (1‐50 ppm)   (24; 48; 72 h) 

100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00

24 h

40,00

48 h

30,00

72 h

20,00 10,00 0,00 Kontrol (hallárva)

Kontrol (hallárva és Copepoda)

0.5 ppm

1 ppm

10 ppm

Koncentrációk (ppm) 5. ábra: A Neem olaj hatása a Copepodák (Cyclops sp.) predációjára (hallárva – Copepoda tesztrendszerben  (24; 48; 72 h) 

26 

Túlélő rotatóriák aránya (%)

100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00

laboratóriumi teszt

40,00 30,00

félüzemi teszt

20,00 10,00 0,00 Kontrol Kontrol (Rotatória) (Rotatória és Copepoda)

0.5 ppm

1 ppm

10 ppm

Koncentrációk (ppm)

6. ábra: A Neem olaj hatása a Copepodák (Cyclops sp.) predációjára (Rotatória – Copepoda tesztrendszerben  (72 h) 

Következtetések, javaslatok A  teljes  kísérletsorozat  egyik  legfontosabb  eredménye  annak  bizonyítása,  hogy  a  jelenleg  forgalmazott  400g/l  klórpirifosz‐metil  hatóanyagot  tartalmazó  Reldanból  és  Megatoxból  már  a  negyed  ppm  koncentrációjú  oldat  is  elegendő  a  Copepodák  hatékony  elpusztításához,  melynek  a  toxikus hatása 24 óra elteltével gyakorlatilag megszűnik. Ennek megfelelően, már egy, másfél nappal  a  planktonszelekciót  követően  biztonságosan  elvégezhetjük  a  Cladocera  oltást.  További  előny  a  költségtakarékosság.  A  kristályos  szerkezetű  ezüst‐nitrát  is  viszonylag  olcsó,  és  hatékony  szernek  számít,  viszont  hosszú távon nem lehet kizárni a toxikus ezüst ion felhalmozódását az üledékben.   A  legelegánsabb  megoldásnak  a  Neem  olaj  bizonyulna,  azonban  közvetlenül  csak  magas  koncentrációban toxikus, amelynek alkalmazása túllépné a gazdaságosság kereteit.   Az  alacsonyabb  koncentrációk  táplálkozást  befolyásoló  hatása  pedig  az  eddigi  kísérletek  során nem bizonyult elég hatékonynak. Bízunk benne, hogy a későbbi kísérletek során a ragadozási  aktivitást csökkentő hatást további természetes adalékanyagok hozzáadásával növelni tudjuk.   

27 

Összefoglalás A  planktonszelekció  célja  a  ragadozó,  és  a  táplálék  konkurens  inszekták  ideiglenes  eltávolítása az ivadék előnevelő tavakból. Erre a célra a haltenyésztők az elmúlt évtizedekben szerves  foszforsav észter hatóanyagú rovarirtó szereket használtak 1 – 1,5 ppm töménységben. Egy 2007‐ben  hatályba  lépett  Európai  Uniós  rendelet  (2007/387/EK),  a  klórpirifosz‐metil  hatóanyag  kivételével  megtiltotta  a  foszforsav‐észterek  mezőgazdasági  célú  felhasználását.  Kutatómunkánk  céljaként  egy  olyan planktonszelekciós módszer kidolgozását tűztük ki, amely az engedélyezett, főként természetes  hatóanyagú szerek tesztelésén alapul.  Vizsgálataink során három készítmény tesztelése lett elvégezve. Az egyik a klórpirifosz‐metil  hatóanyagú  Reldan  és  Megatox,  a  másik  a  kristályos  szerkezetű  ezüst‐nitrát,  a  harmadik  pedig  a  Neem  olaj.  A  laboratóriumi  tesztkísérletek  során  hígítási  sorozatban  lett  tesztelve  a  vizsgált  vegyszerek  Copepodákra  (Cyclops  sp.)  kifejtett  toxicitása  (24;  48;  72  h),  valamint  a  Neem  olaj  esetében  Copepoda‐ezüstkárász  lárva,  illetve  Copepoda‐Rotatoria  tesztrendszerben  lett  vizsgálva  a  készítmény,  Copepodák  ragadozó  aktivitására  gyakorolt  hatása.  A  félüzemi  tesztkísérletekben  a  laboratóriumi  tesztek  során,  a  gyakorlati  alkalmazás  szempontjából  hatékonynak  bizonyult  koncentrációkat teszteltük tavi körülmények között fóliahengerekben, illetve 2 m3‐es medencékben.  A klórpirifosz‐metil hatóanyag esetében a 0,25 ppm koncentráció 95 %‐os mortalitást eredményezett  Copepoda állományban, melynek toxikus hatása 24 óra elteltével megszűnt. Az ezüst‐nitrát esetében  a 0,0625 ppm volt a hatékony koncentráció a 24 órás ellenőrzés során. A laboratóriumi és a félüzemi  tesztek mindkét készítmény esetében hasonló eredményt hoztak. A Neem‐olaj esetében, közvetlenül  csak  a  magasabb  (40  ppm  feletti)  koncentrációk  72‐órás  ellenőrzése  során  volt  tapasztalható  jelentősebb mortalitás. Az alacsonyabb koncentrációk táplálkozást befolyásoló hatása pedig az eddigi  tesztek során nem bizonyult elég hatékonynak, így a későbbi kísérleteink során további természetes  adalékanyagok hozzáadásával ezt a hatást kívánjuk fokozni. 

Irodalomjegyzék: Tamás,  G.,  Horvath,  L.  (1975):  Die  chemische  Regulierung  des  Zooplanktonbestandes  von  Brutstreckteichen. Der Fischwirt 25.10: 6‐7 pp.  Tamás G., Horvath L., (1976): Growth of Cyprinids under optimal zooplankton conditions. Bamidgeh  Bull for Fish Culture 28(3): 50‐56.  Szuhanova,  E.  (1968):  Rol  Cyclops  (Acanthocyklops  vernalis  Rich,)  v  vüzsivaniii  licsinok  belogo  tolsztolobik Vopr. Ichtiol. 87. 3: 584‐586.  Woynárovich E. & Horváth L. (1980). The Artificial Propagation of Warm‐Water Finfishes. A manual  for extension. FAO Fisheries Technical Paper. No. 20. Rome, 1‐183.  

28 

Név: 

Bócsai Andrea 

Kezdés éve: 

2010 

Képzés formája: 

nappali tagozatos 

Témavezető: 

Mézes Miklós 

Társ‐témavezető: 

Balogh Krisztián 

Intézet, Tanszék: 

Állattudományi Alapok Intézet, Takarmányozástani Tanszék 

Elérhetőség: 

+3628522000/1796   [email protected] 

Rövidtávú T‐2 toxin terhelés hatása brojlercsirkék biológiai antioxidáns védőrendszerének néhány elemére A téma aktualitása, jelentősége A  kontinentális  éghajlatú  területek,  így  hazánk  is,  kedvező  életteret  biztosít  a  különböző  mikotoxinokat  termelő  Fusarium  penészgombafajok  számára,  melyek  számos  trichotecén  vázas  másodlagos anyagcseretermék szintézisére képesek. A Fusarium sporotrichoides a mérsékelt égövön  igen elterjedt faj, mely talajban és a növényeken egyaránt megtalálható, és ún. A‐típusú trichotecén  vázas  mikotoxinokat  (pl.  T‐2  toxin,  HT‐2  toxin,  T‐2  triol,  T‐2  tetraol,  szcirpentriol  és  diacetoxi‐ szcirpenol) termel (Ueno, 1984).  A  T‐2  toxin  negatív  hatása  egyrészt  a  fehérjeszintézis  gátlásában  nyilvánul  meg,  amelyen  keresztül  befolyásolja  a  sejtek,  elsősorban  a  májsejtek,  mikroszómáinak  monooxigenáz  enzimrendszerének  aktivitását,  valamint  az  immunrendszer  működését  (Kidd  és  mtsai.,  1995),  ez  utóbbi által növelve az állatoknak az egyes betegségekkel szemben mutatott érzékenységét (Niyo és  mtsai., 1988).  Ugyancsak  jelentős,  hogy  a  T‐2  toxin  12,13‐epoxitrichotecén  volta  miatt  a  szabadgyök  képződést  indukálhat,  ezáltal  pedig  fokozhatja  a  különböző  szövetekben  zajló  lipidperoxidációs  folyamatokat (Iwahashi, 1982). 

Célkitűzések Jelen  kísérlet  célja  annak  vizsgálata  volt,  hogy  gyakori  (12  óránként  végzett)  mintavételezéssel  felmérjük,  hogy  a  takarmány  eredetű  mikotoxin  terhelés  (3,09  mg  T‐2  toxin/kg  takarmány)  hogyan  hat  a  brojlerek  glutation‐redox  rendszerére  és  lipidperoxidációs  folyamataira,  valamint egyes máj eredetű enzimeinek aktivitására az expozíció első 48 órájában. 

Anyag és módszer A  kísérletbe  54  Cobb  500‐as  brojler  kakast  állítottunk  a  18.  életnapon,  amelyeket  két  csoportban (n=27) helyeztünk el. A vizsgálat a madarak 21. életnapján kezdődött, melynek során ‐ 12  órás takarmánymegvonást követően ‐ a kontroll csoport kereskedelmi forgalomban kapható brojler 

29 

nevelő teljesértékű takarmánykeveréket fogyasztott a kísérlet teljes időtartama alatt. A T‐2 toxinnal  terhelt csoport Fusarium sporotrichioides NRRL 3299‐es törzs által Fodor és mtsai. (2006) módszere  szerint  termelt  kivont  T‐2  toxinnal  3,09  mg/kg  takarmány  koncentrációban  mesterségesen  szennyezett  takarmányt  fogyasztott,  melynek  etetésére  ugyancsak  12  órás  takarmánymegvonást  követően került sor.  Mintavételekre  a  kísérlet  kezdetekor  (3  állat/csoport,  mint  abszolút  kontroll),  majd  12  óránként  került  sor  valamennyi  kísérleti  csoportból  véletlenszerűen  kiválasztott  6‐6  állatból.  A  madarakból vér‐ (vérplazma és vörösvérsejt 1:9 hemolizátum), majd post mortem máj‐, lép‐ és vese  mintákat vettünk.  A mintavételek a Szent István Egyetem Mezőgazdaság‐ és Környezettudományi Kar Állatetikai  Bizottságának engedélyével történtek.  A  mintákból  meghatároztuk  a  glutation  redox  rendszer  néhány  paraméterét,  így  a  redukált  glutation  (GSH)  koncentrációt  Sedlak  és  Lindsay  (1968)  módszere  szerint,  valamint  a  glutation‐ peroxidáz (GPx) aktivitást Lawrence és Burk (1976) által leírt végpontos direkt assay segítségével. Az  összfehérje  tartalmat  a  vérplazma  és  a  vörösvérsejt  1:9  hemolizátum  minták  esetében  biuret  reakcióval  határoztuk  meg  (Weichselbaum,  1948),  míg  a  többi  vizsgált  szövet  10.000  g  felülúszó  frakciója esetében Lowry és mtsai. (1951) módszerét alkalmaztuk.  A  lipidperoxidációs  folyamatok  metastabil  végtermékeként  létrejövő  malondialdehid  (MDA)  koncentrációját  a  Placer  és  mtsai.  (1966)  által  kidolgozott  és  Matkovics  és  mtsai.  (1988)  által  módosított módszernek megfelelően mértük. Standardként 1,1,3,3‐tetrametoxipropánt használtunk.  A lipidperoxidációs folyamatok kezdeti szakaszában keletkező konjugált diének (CD) és ‐triének (CT)  mennyiségét a májban az AOAC (1984) által elfogadott módszer szerint határoztuk meg.  A  vérplazma  klinikai  biokémiai  paraméterei  közül  az  aszpartát‐aminotranszferáz  (AST)  és  az  alanin‐aminotranszferáz  (ALT)  aktivitását  mértem  reagens  készletek  (Diagnosticum  ZRt.,  Budapest)  segítségével.   Az eredmények statisztikai értékeléséhez (kétmintás t‐próba, átlag és szórás) STATISTICA for  Windows 4.5 programot használtam (StatSoft Inc., 1993).  

Eredmények Vizsgálatunk  során  igyekeztünk  a  T‐2  toxin  hatását  olyan  szövetekben  felmérni,  melyek  a  toxin  szervezeten  belül  zajló  metabolizációjában  (máj),  kiválasztásában  (vese),  vagy  szöveti  akkumulációjában (lép) kitüntetett szerepet töltenek be.  Az  eredmények  alapján  megállapítható,  hogy  a  T‐2  toxinnal  szennyezett  takarmány  fogyasztásának  hatására  a  legtöbb  vizsgált  szerv  esetében  a  biológiai  antioxidáns  védelmi  rendszerben  kitüntetett  fontosságú  glutation  redox  rendszer  mennyisége  és  aktivitása  a  xenobiotikum expozíció kezdetét követően rövid időn megemelkedett, amint azt az 1. ábrán a GSH  koncentráció  szignifikáns  mértékű  emelkedése  is  mutatja  a  vérplazma  esetében  a  mikotoxin  expozíció 24. (p<0,01) és 48. órájában (p<0,05). 

30 

14 GSH (umol/g feh.)

12 10 8 6 4 2 0 0. óra

12. óra

24. óra

36. óra

48. óra

1. ábra: Rövidtávú T‐2 toxin terhelés hatása brojlercsirkék vérplazmájának redukált glutation  koncentrációjára 

GPx (E/g feh.)

Ezen túlmenően, az előzőekben említett ko‐szubsztrát többlet mellett a GPx aktivitásában is  szignifikáns  mértékű  (p<0,001)  emelkedés  volt  megfigyelhető  a  vérplazmában  a  mikotoxin  terhelés  kezdetét követő 24. órában (2. ábra). 

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0. óra

12. óra

24. óra

36. óra

48. óra

2. ábra: Rövidtávú T‐2 toxin terhelés hatása brojlercsirkék vérplazmájának glutation‐peroxidáz aktivitására 

A  glutation  redox  rendszer  fokozott  mennyisége  és  aktivitása  azt  eredményezte,  hogy  a  vizsgálat  ideje  alatt  a  vérplazma  esetében  a  lipidperoxidációs  folyamatok  megfelelő  kontroll  alatt  álltak, melyre a kontroll csoport értékét nem meghaladó, sőt, a 24. és 36. órai mintavétel esetében  attól szignifikáns (p<0,05) mértékben alacsonyabb, malondialdehid koncentráció is utal (3. ábra). 

31 

16

MDA (nmol/ml)

14 12 10 8 6 4 2 0 0. óra

12. óra

24. óra

36. óra

48. óra

3. ábra: Rövidtávú T‐2 toxin terhelés hatása brojlercsirkék vérplazmájának malondialdehid koncentrációjára 

A vérplazmában vizsgált máj eredetű enzimek aktivitásában csak az AST és az ALT esetében  mutatkozott  szignifikáns  (p<0,05)  emelkedés  a  kontroll  csoport  értékeihez  képest  az  expozíció  24.  órájában (1. táblázat), ami a máj károsodását jelzi.  1. táblázat: Rövidtávú T‐2 toxin terhelés hatása brojlercsirkék vérplazmában mért néhány máj eredetű enzim  aktivitására  AST (U/l)    Kontroll  T‐2 toxinnal  terhelt 

0. óra 

12. óra 

24. óra 

36. óra 

48. óra 

201,56±51,61 

254,22±62,27 

183,67±23,77 

154,11±18,69 

145,89±23,33 

 

212,33±43,54 

225,20±29,98 

143,67±46,66 

146,78±29,74 

ALT (U/l)    Kontroll  T‐2 toxinnal  terhelt 

0. óra 

12. óra 

24. óra 

36. óra 

48. óra 

59,77±41,92 

57,99±26,32 

19,31±15,23 

23,83±13,46 

31,53±11,61 

 

73,76±17,25 

115,94±56,22 

32,12±4,44 

27,13±10,42 

A  vörösvérsejt  hemolizátumok  vizsgálata  során  egyik  paraméter  esetében  sem  jelentkezett  statisztikailag is igazolható különbség a mikotoxin terhelés hatására.  A T‐2 toxinnal szennyezett takarmány fogyasztásának hatására legkorábban (már a mikotoxin  expozíció  12.  órájában)  a  májban  statisztikailag  is  igazolható  mértékben  nőtt  a  redukált  glutation  koncentráció (2. táblázat), majd 12 órával később, a mikotoxin expozíció 24 órájában már a vese (3.  táblázat) és a lép (4. táblázat) esetében is szignifikáns (p<0,05) mértékben megemelkedett redukált  glutation koncentrációt mértünk.   

32 

2.  táblázat:  Rövidtávú  T‐2  toxin  terhelés  hatása  brojlercsirkék  máj  homogenizátumának  redukált  glutation  koncentrációjára, glutation‐peroxidáz aktivitására, illetve malondialdehid koncentrációjára  MÁJ HOMOGENIZÁTUM  GSH (umol/g feh.)    Kontroll  T‐2 toxinnal  terhelt 

0. óra 

12. óra 

24. óra 

36. óra 

48. óra 

1,94±0,14 

2,82±0,38 

2,43±0,24 

1,91±0,18 

1,81±0,21 

 

3,48**±0,06 

2,91**±0,23 

2,28*±0,28 

2,02±0,28 

GSHPx (E/g feh.)    Kontroll  T‐2 toxinnal  terhelt 

0. óra 

12. óra 

24. óra 

36. óra 

48. óra 

1,74±0,08 

2,36±0,32 

1,68±0,26 

2,00±0,26 

1,54±0,49 

 

2,74*±0,17 

2,09*±0,18 

2,03±0,18 

1,90±0,22 

MDA (umol/g)    Kontroll  T‐2 toxinnal  terhelt 

0. óra 

12. óra 

24. óra 

36. óra 

48. óra 

7,27±1,22 

6,80±1,79 

6,85±1,33 

4,97±1,12 

4,55±0,86 

 

7,12±1,20 

5,84±0,85 

5,71±1,44 

7,22**±1,11 

A májban a mikotoxin expozíció 12. és 24. órájában, a vesében 12 órával később, a 24. és 36.  órai mintavételkor jelentkezett szignifikáns mértékben magasabb glutation‐peroxidáz aktivitás a T‐2  toxin terhelés hatására (2. és 3. táblázat).  A  lipidperoxidációs  folyamatok  kezdeti  szakaszát  jelző  konjugált  dién  (CD)  és  –trién  (CT)  tartalom  a  májban  a  toxinterhelést  követő  12.  órától  tendenciaszerűen  nőtt  (5.  táblázat),  míg  a  folyamat  végterméke,  a  MDA  tartalom  a  T‐2  toxin  metabolizációjában  és  kiválasztásában  jelentős  szerepet  betöltő  májban  (2.  táblázat)  és  a  vesében  (3.  táblázat)  csak  a  vizsgálat  végén,  a  48.  órai  mintavétel alkalmával emelkedett meg szignifikáns mértékben (p<0,05).   

33 

3. táblázat: Rövidtávú T‐2 toxin terhelés hatása brojlercsirkék vese homogenizátumának redukált glutation  koncentrációjára, glutation‐peroxidáz aktivitására, illetve malondialdehid koncentrációjára  VESE HOMOGENIZÁTUM  GSH (umol/g feh.)    Kontroll  T‐2 toxinnal  terhelt 

0. óra 

12. óra 

24. óra 

36. óra 

48. óra 

1,68±0,17 

1,66±0,19 

1,18±0,06 

1,33±0,10 

1,14±0,11 

 

1,63±0,15 

1,41*±0,18 

1,43±0,26 

1,14±0,20 

GSHPx (E/g feh.)    Kontroll  T‐2 toxinnal  terhelt 

0. óra 

12. óra 

24. óra 

36. óra 

48. óra 

1,49±0,09 

1,44±0,09 

0,86±0,14 

0,97±0,07 

1,15±0,05 

 

1,41±0,08 

1,10*±0,13 

1,12*±0,12 

1,20±0,14 

MDA (umol/g)    Kontroll  T‐2 toxinnal  terhelt 

0. óra 

12. óra 

24. óra 

36. óra 

48. óra 

8,60±2,18 

6,53±0,48 

6,90±1,63 

7,15±1,77 

4,85±0,55 

 

7,08±1,97 

6,22±1,25 

6,38±0,90 

6,89**±0,89 

4.  táblázat:  Rövidtávú  T‐2  toxin  terhelés  hatása  brojlercsirkék  lép  homogenizátumának  redukált  glutation  koncentrációjára  LÉP HOMOGENIZÁTUM  GSH (umol/g feh.)    Kontroll  T‐2 toxinnal  terhelt 

0. óra 

12. óra 

24. óra 

36. óra 

48. óra 

1,40±0,15 

1,47±0,23 

1,39±0,14 

1,44±0,13 

1,76±0,21 

 

1,46±0,15 

1,58*±0,10 

1,51±0,15 

1,58±0,30 

   

34 

5. táblázat: Rövidtávú T‐2 toxin terhelés hatása brojlercsirkék májának konjugált dién és ‐trién tartalmára  Konjugált dién (CD) OD232    Kontroll 

0. óra 

12. óra 

24. óra 

36. óra 

48. óra 

0,67±0,37 

0,55±0,31 

0,17±0,02 

0,38±0,22 

0,47±0,13 

 

0,49±0,10 

0,20±0,07 

0,50±0,17 

0,57±0,13 

T‐2 toxinnal  terhelt 

Konjugált trién (CT) OD268    Kontroll 

0. óra 

12. óra 

24. óra 

36. óra 

48. óra 

0,20±0,06 

0,13±0,05 

0,21±0,03 

0,10±0,03 

0,11±0,02 

 

0,11±0,01 

0,22±0,04 

0,13±0,03 

0,12±0,02 

T‐2 toxinnal  terhelt 

Következtetések A  kapott  eredmények  alapján  levonható  az  a  következtetés,  hogy  a  takarmány  eredetű  T‐2  toxin  terhelés  hatására  rövid  idő  belül  aktiválódik  a  brojlercsirkék  glutation  redox  rendszere,  mind  mennyiségét  (GSH  koncentráció),  mind  pedig  aktivitását  (GPx)  tekintve.  A  folyamat  a  xenobiotikum  transzformáció  központi  szervében,  a  májban  volt  kimutatható  legelőször,  ahol  már  12  órával  a  mikotoxin  terhelést  követően  szignifikáns  mértékben  megemelkedett  GSH  koncentrációt  és  GPx  aktivitás mutatkozott.  A  lipidperoxidációs  folyamatok  kezdeti  szakaszát  jelző  konjugált  dién  és  ‐trién  tartalom  a  májban a toxinterhelést követő 12. órától tendenciaszerűen nőtt, míg a folyamat végterméke, a MDA  tartalom a májban és a vesében csak a vizsgálat végén (12‐36 óra késéssel) emelkedett.  A MDA tartalom a mikotoxint „tároló” szövetekben (máj, vese) a vizsgálat végére megnőtt, a  vérplazmában ugyanakkor a glutation redox rendszer aktivációja következtében csökkent.  Az  eredmények  alapján  feltehető,  hogy  a  T‐2  toxin  lipidperoxidációs  folyamatokat  indukáló  hatása nem ok, hanem okozat, azaz annak oka az antioxidáns rendszer kimerülése. 

Összefoglalás Vizsgálatomban  T‐2  toxinnal  mesterségesen  szennyezett  takarmány  fogyasztásának  brojlercsirkék  glutation  redox  rendszerére,  lipidperoxidációs  folyamataira  és  egyes  klinikai  kémiai  paramétereire gyakorolt rövidtávú hatását vizsgáltam a mikotoxin‐expozíció első 48 órájában.  A kísérletbe 54 Cobb 500‐as brojler kakast állítottak a 18. életnapon. A vizsgálat a madarak  21.  életnapján  kezdődött,  melynek  során  ‐  12  órás  takarmánymegvonást  követően  ‐  a  kontroll  csoport  brojler  nevelő  teljesértékű  takarmánykeveréket,  míg  a  T‐2  toxin  terhelésben  részesült  csoport  mikotoxinnal  mesterségesen  szennyezett  takarmányt  (3,09  mg/kg  T‐2  toxin)  fogyasztott  48  órán keresztül. 

35 

Mintavételekre  a  kísérlet  kezdetekor  (3  állat/csoport),  majd  12  óránként  került  sor  csoportonként  6‐6  állatból.  A  madarakból  vér‐  (vérplazma  és  vörösvérsejt  1:9  hemolizátum),  máj‐,  lép‐  és  vese  mintákat  vettem.  A  mintákból  meghatároztam  redukált  glutation  koncentrációt,  a  glutation‐peroxidáz aktivitást, valamint a malondialdehid koncentrációját. Ezen túlmenően a májban  vizsgáltam  a  lipidperoxidációs  folyamatok  kezdeti  szakaszában  keletkező  konjugált  diének  (CD)  és  ‐ triének (CT) mennyiségét is. A vérplazmából továbbá meghatároztam az aszpartát‐aminotranszferáz  (AST) és az alanin‐aminotranszferáz (ALT) aktivitást is.  Az  eredmények  alapján  megállapítható,  hogy  a  T‐2  toxinnal  szennyezett  takarmány  fogyasztásának  hatására  a  glutation  redox  rendszer  mennyisége  és  aktivitása  a  xenobiotikum  expozíció  kezdetét  követően  rövid  időn  megemelkedett.  Erre  utal  a  GSH  koncentráció  szignifikáns  mértékű emelkedése a vérplazmában (24. és 48. óra), a májban (12., 24. és 36. óra), a vesében (24.  óra),  valamint  a  lépben  (24.  óra).  Ezen  túlmenően,  a  ko‐szubsztrát  (GSH)  többlet  mellett  a  GPx  aktivitásában is szignifikáns mértékű emelkedés volt megfigyelhető az expozíció kezdetét követő 24.  órában a vérplazmában és a lépben, valamint a májban (12. és 24. óra) és a vesében (24. és 36. óra).  A  máj  eredetű  enzimek  (AST  és  ALT)  aktivitása  szignifikáns  emelkedést  mutatott  a  kontroll  csoport  értékeihez képest az expozíció 24. órájában.  A  lipidperoxidációs  folyamatok  kezdeti  szakaszát  jelző  CD  és  CT  tartalom  a  májban  a  toxinterhelést követő 12. órától tendenciaszerűen nőtt, míg a folyamat végterméke, a MDA tartalom   a  májban  és  a  vesében  csak  a  vizsgálat  végén  (12‐36  óra  késéssel)  emelkedett  meg  szignifikáns  mértékben. A glutation redox rendszer fokozott aktivitása és mennyisége azt eredményezte, hogy a  vérplazmában a MDA koncentráció a 24. és 36. órai mintavételkor szignifikáns mértékben elmaradt a  kontroll csoport értékeitől.  Az  eredmények  alapján  feltehető,  hogy  a  T‐2  toxin  lipidperoxidációs  folyamatokat  indukáló  hatása nem ok, hanem okozat, azaz annak oka az antioxidáns rendszer kimerülése. 



36 

Irodalomjegyzék AOAC (1984): Official Methods of Analysis 28054 B. 14th ed., Arlington, USA  Fodor, J., Kametler, L., Kovács, M. (2006): Practical aspects of fumonisin production under laboratory  conditions. Mycotox. Res. 22, 211‐216.  Iwahashi,  M.  (1982):  Mechanism  of  cytotoxic  effect  of  T‐2  toxin  on  a  protozoa.  Proc.  Assoc.  Jpn.  Mycotoxin 4, 23‐30.  Kamalavenkatesh,  P.  (2003):  Individual  and  combined  effects  of  cyclopiazonic  acid  and  T‐2  toxin  in  broiler  chicken.  M.V.Sc.  thesis  submitted  to  Tamilnadu  Veterinary  and  Animal  Sciences  University, Chennai 600 0051, India.  Kidd,  M.T.,  Hagler,  Jr.  W.M.,  Qureshi,  M.A.  (1995):    Trichotecene  mycotoxins  depress  the  mononuclear‐phagocytic  system  of  young  turkeys.  Immunopharmacol.  Immunotoxicol.  17,  385‐398.  Lawrence,  R.,  Burk,  R.  (1978):  Species,  tissue  and  subcellular  distribution  of  non  Se‐dependent  glutathione peroxidase activity. J. Nutr. 108, 211‐215.  Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. (1951): Protein measurement with the Folin  phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265‐275.  Matkovics,  B.,  Szabó,  L.,  Sz.  Varga,  I.  (1988):  Lipidperoxidáció  és  a  redukált  glutation  anyagcsere  enzimek aktivitás meghatározása biológiai mintákban. Lab. Diagn. 15, 248‐250.  Mihara, M., Uchiyama, M., Fukuzawa, K. (1980): Thiobarbituric acid value of fresh homogenate of rat  as  parameter  of  lipid  peroxidation  in  ageing,  CCl4  intoxication  and  vitamin  E  deficiency.  Biochem Med 23, 302‐311.  Niyo,  K.A.,  Richard,  J.L.,  Niyo,  Y.,  Tiffany,  L.H.  (1988):  Effects  of  T‐2  mycotoxin  ingestion  on  phagocytosis  of  Aspergillus  fumogatus  conidia  by  rabbit  alveolar  macrophages  and  on  hematologic, serum biochemical, and pathologic changes in rabbits. Am. J. Vet. Res.  49, 1766‐ 1773.  Placer,  Z.A.,  Cushman,  L.L.,  Johnson,  B.C.  (1966):  Estimation  of  product  of  lipid  peroxidation  (malonyldialdehyde) in biochemical systems. Anal. Biochem. 16, 359‐364.  Sedlak, I., Lindsay, R.H. (1968): Estimation of total, protein‐bound and non‐protein sulfhydryl groups  in tissues with Ellmann’s reagent. Anal. Biochem. 25, 192‐205.  Ueno, Y. (1984): Trichotecenes as environmental toxicants. J. Toxicol. 5, 1‐15.  Weichselbaum, T.E. (1948): An accurate and rapid method for the determination of protein in small  amounts of serum and plasma. Am. J. Clin. Pathol. 16, 40‐43.  WHO/FAO (2000): Safety evaluation of certain mycotoxins in food. WHO Food Aditive Series: 47, FAO  Food and Nutrition Paper No. 74., WHO, Geneva pp. 680. 

37 

Név: 

Bontovics Babett 

Kezdés éve: 

2010 

Képzés formája: 

nappali tagozatos 

Témavezető: 

Gócza Elen 

Társ‐témavezető: 

Bősze Zsuzsanna 

Intézet, Tanszék: 

MBK Állatbiotechnológiai Intézet  Alkalmazott Embriológia és Őssejt Kutató Csoport 

Elérhetőség: 

+36303503360   [email protected] 

Az embrionális fejlődés kezdeti szakaszára jellemző markerek expressziós mintázatának vizsgálata nyúl embriókban és embrionális őssejtekben A téma aktualitása, jelentősége A  szaporodásbiológia  területén  jelenleg  alkalmazott  biotechnológiai  módszerek  lehetőséget  biztosítanak az implantációt megelőző, illetve azt befolyásoló folyamatok tanulmányozására, sejt‐ és  molekuláris  szinten  a  beágyazódást  irányító  szignálok  jobb  megismerésére.  A  gasztruláció  során  az  embrió  pluripotens  sejtjei  mezoderma,  ektoderma  és  endoderma  sejtekké  differenciálódnak,  amelyekből aztán a későbbi embrionális fejlődés során a megszülető magzat szövetei, szervei jönnek  létre. Ennek a bonyolult folyamatnak ma még nem minden lépése ismert. A sejtek differenciálódási  képessége  egyrészt  a  belső  hatások  (fejődés  specifikus  gének  expressziója,  a  genom  metilációs  mintázatának változása) másfelől pedig külső faktorok (a sejtet körülvevő környezet, anyai faktorok)  hatásának befolyása alatt áll.  A  nyúl  potenciálisan  jó  modell  állat  az  emberi  szervezet  betegségeinek,  mint  például  a  hipertrófiás kardiomiopátia, miokardiális infarktus, magas vérnyomás vagy atherosclerosis (Bősze és  mtsai.,  2003).  Nyúl  embrionális  őssejtvonal  létrehozása  nagyon  fontos  lenne,  hogy  célzott  génmódosítást hordozó modellállatot lehessen előállítani (Graves és mtsai., 1996), (Honda és mtsai.,  2008).  Pluripotens (mind három embrionális csíralemez, így az embrionális ektoderma, mezoderma,  endoderma  sejtjeinek  létrehozására  is  képes)  egér  embrionális  őssejt  vonalakat  (mESC)  egér  embrionális  fibroblasztból  létrehozott  tápláló  sejtrétegen  (MEF)  hólyagcsíra  állapotú  embrió  (balsztociszta) embriócsomójából (ICM), magzati borjúsavót (FBS) tartalmazó tenyésztő médiumban  először  1981‐ben  sikerült  létrehozni  (Evans  és  Kaufman,  1981;  Martin,  1981).  Az  első  pluripotens  humán embrionális őssejtek (hESC) létrehozása 1998‐ban valósult meg (Thomson és mtsai., 1998). ES  sejtvonalakat gazdasági haszonállatok embrióiból azonban, mind a mai napig nem sikerült létrehozni.  Feltételezik,  hogy  a  pluripotencia  a  sejtek  alap  állapota,  mégis  a  különböző  fajok  embrióiból  létrehozott ES szerű sejtvonalak eltérő tulajdonságokkal rendelkeznek, eltérő faktorokat igényelnek a  pluripotens állapotuk fenntartásához. 

38 

2006‐ban Takahashi és Yamanaka arról számolt be, hogy négy a pluripotenciát meghatározó  faktor  (Oct4,  Sox2,  Klf4,  cMyc)  túltermeltetésével  egér  fibroblaszt  sejtekben,  egy  új  pluripotens  sejttípust, az úgynevezett indukált pluripotens sejteket (iPS) sikerült létrehozniuk. Ezek az iPS sejtek,  jelenlegi  ismereteink  alapján,  minden  tekintetben  egyenértékűnek  tekinthetők  az  embriók  embriócsomójából származó ES sejtvonalak sejtjeivel (Takahashi és Yamanaka, 2006). Ezt a technikát  hamarosan  sikeresen  alkalmazták  humán  iPS  sejtvonalak  (Takahashi  és  mtsai.,  2007;  Yu  és  mtsai.,  2007) létrehozására, és számos más állatfaj, beleértve a majmot (Liu és mtsai., 2008), (Liao és mtsai.,  2009) esetében is.  Nichols  és  mtsai.,  2009‐ben  azt  vizsgálták,  hogyan  hat  a  2  inhibitoros  tenyésztő  médium  a  fejlődő  egér  embrió  pluripotens  epiblaszt  sejtjeire.  Azt  találták,  hogyha  az  Erk  szignál  rendszert  gátolták  8  sejtes  állapottól,  ez  nem  hátráltatta  az  embrió  fejlődését.  A  2i  médiumban  kifejlődött  blasztocisztákban  nem  jött  létre  a  hipoblaszt  sejtréteg,  és  az  ICM‐et  alkotó  sejtek  száma  sem  lett  kevesebb.  Az  összes  ICM  sejt  Nanog  expressziót  mutatott,  nem  jelent  meg  a  GATA6/GATA4  pozitív  hipoblaszt  sejtek  rétege  (Nichols  és  mtsai.,  2009).  Az  így  fent  tartott  epiblasztból  létrehozott  ES  sejteket felhasználva ivarsejt kiméra állatokat is sikerült létrehozniuk. Ez a megfigyelés azt mutatja,  hogy a hipoblaszt sejtréteg kialakulása az FGF/Erk szignál rendszer hatására indul el, s ha gátoljuk ezt  a jelátviteli útvonalat, az ICM sejtek megtartják pluripotenciájukat. Továbbá ez azt is jelenti, hogy az  epiblaszt  sejtek  osztódásának  fenntartása  nem  igényel  paracrin  jelet  a  hipoblaszt  irányából.  Az  epiblaszt  és  ES  sejtek  azonos  alapállapotban  vannak,  autonóm  képesek  folyamatosan  osztódni,  azonban  Erk  szignál  rendszer  felől  érkező  jel  hatására  a  pluripotens  állapotban  lévő  sejtek  differenciálódni  kezdenek.  A  fent  leírt  szabályozás  azt  igazolja,  hogy  az  ES  sejtek  nem  valamilyen  in vitro  létrehozott  sejttípust  jelentenek,  hanem  eredendően  azonosnak  tekinthetők  az  embrióban  levő epiblaszt sejtjeivel.  Ying és mtsa igazolták, hogy CHIR99021 (Gsk3 inhibitor) és a PD0325901 (mitogen‐activated  protein  kinase  inhibitor)  inhibitorok  hozzáadása  a  tenyésztő  médiumhoz  (2i  inhibitoros  rendszer)  lehetővé teszi új sejtvonalak hatékony alapítását. Az ES sejtek pluripotenciája addig marad meg, amíg  a  differenciálódást  indukáló  Erk  szignál  rendszer  gátolva  van  a  PD0325901  inhibitorral,  vagy  a  LIF/BMP  hozzáadásával  (Ying  és  mtsai.,  2008).  A  Gsk3  gátlása  elősegíti  a  sejtek  önmegújulását,  azáltal,  hogy  a  sejteket  folyamatosan  osztódó  állapotban  tartja,  illetve,  hogy  megakadályozza  az  idegsejt irányú differenciálódásukat.  Ying  és  mtsainak  2010‐ben  sikerült  előállítani  homológ  rekombinációval,  2  inhibitoros  médiumban  tenyésztett  patkány  embrióból  származó  ES  sejteket  felhasználva  olyan  tumor  szupresszor  gén  kiütött  patkányt.  Ezzel  lehetővé  vált  az  egérhez  hasonlóan  génkiütött  patkányt  is  létrehozni,  ami  lehetővé  teszi,  hogy  a  patkányt,  mint  modellállatot  használjanak  az  emberi  betegségek tanulmányozásához (Ying és mtsai., 2010) 



39 

Célkitűzések A  tervezett  munka  során,  az  embriók  korai  embrionális  fejlődését  befolyásoló  gének  expressziós  szintjének  vizsgálatát  tervezzük  (Oct4,  Cdx2,  LIFR,  Nanog,  Zfp42,  őssejt  specifikus  mikroRNS‐ek)  különböző  állatfajok  embrióiban  (egér,  nyúl),  illetve  az  ezekből  származó  embrionális  őssejtekben  és  azok  korai  differenciálódásának  kezdetén.  Vizsgálni  szeretnénk,  hogy  in  vitro  (tenyésztő  médium  összetétele),  illetve  in  vivo  (méh  ürege),  milyen  hatása  van  a  környezet  megváltoztatásának az embriók fejlődésére.  Nyolc‐sejtes  embriókat  (egér,  nyúl)  tenyésztünk  2i  inhibitort  tartalmazó  médiumban  a  hólyagcsíra  állapot  eléréséig.  A  blasztocisztákat  körülvevő  zona  pellucida  eltávolítását  követően  a  trofektoderma  sejteket  “immunosurgery”  segítségével  elimináljuk,  majd  az  így  izolált  ICM  sejteket  tovább tenyésztjük. Azt reméljük, hogy az ICM sejtjei a 2i médiumban tovább osztódnak és további  osztódásuk  során  is  megtartják  pluripotenciájukat.  Az  így  fenntartott  sejtekbe  EGFP  riporter  gént  viszünk  be  transzformációval,  vagy  elektroporációval,  és  tovább  tenyésztjük.  A  sejtek  pluripotenciájának megtartását a pluripotenciát meghatározó faktorok expresszióját real time PCR‐el,  illetve  immunfestéssel  igazoljuk.  Azt  követően,  hogy  igazoltuk,  hogy  ezek  a  sejtek  valóban  pluripotensek  (PS  sejtek),  injektálásos  kimérákat  hozunk  létre  az  EGFP‐t  expresszáló  PS  sejteket  felhasználva. A kiméra embriók fejlődését in vitro, majd beültetésüket követően, in vivo vizsgálnánk. 

Módszerek Embriók tenyésztése Nyúlból  származó  nyolc‐sejtes  embriókat  az  adott  faj  embriójának  megfelelő  tenyésztő  médiumban  (RDH)  tenyésztjük  hólyagcsíra  (blasztociszta)  állapotig,  amit  3  μΜ  CHIR99021  és  1  μΜ  PD0325901  inhibitorokkal  egészítünk  ki  (RDH+CH+PD).  A  trofektoderma  sejteket  immunosurgery  eljárással  távolítjuk  el.  Ezt  követően  az  ICM‐eket  N2B27  médiumban  tartjuk  (Nichols  és  Ying,  2006;  Ying  és  mtsai.,  2008).  Az  izolált  ICM‐eket  diszaggregáltatjuk  tripszinben  (accutase‐ban,  kollagenázban).  Az  így  kapott  egy  sejt  szuszpenziót  aztán  gelatinnal  kezelt  N2B27  +2i,  +/‐  LIF‐et  tartalmazó  médiumba  helyezzük  Néhány  nap  múlva  a  kolóniákat  tovább  passzáljuk  a  tenyésztés  folytatásához. A sejtek egy részéből RNS‐t izolálunk, vagy fixáljuk azokat immunfestéshez.   Néhány passzálás után az a PS sejteket EGFP vektorral transzformáljuk, vagy elektroporáljuk.  Néhány passzázst követően a zöld (EGFP‐t expresszáló kolóniákat) 8‐16 sejtes embriókba injektáljuk,  és in vitro követjük beépülnek‐e tovább fejlődő embriók ICM‐jébe. 

RNS izolálás, kvantitatív RT PCR Az  ES  sejtekből  történő  RNS  preparáláshoz  először  a  sejteket  feltárjuk  TRI  –  reagensben  (SIGMA) való pipettázással. Az így kapott lizátumot fagycsövekbe helyezzük és ‐70°C‐on tároljuk. Az  RNS preparálás első lépéseként 500µl TRI – reagensre számolva 100µl kloroformban szuszpendáljuk  fel  a  felolvasztott  mintákat,  melyeket  10‐15  percig  szobahőmérsékleten  állni  hagyunk.  A  centrifugálást  követően  (12000  rpm;  15  min;  4°C)  az  elegy  három  fázisra  különül.  A  felső,  színtelen  fázis az RNS‐t, a fehér vagy opálos interfázis a DNS‐t és a rózsaszín, alsó fázis a fehérjéket tartalmazza.  A  felső  RNS  tartalmú  fázist  óvatosan  átpipettázzuk  egy  új  Eppendorf  csőbe,  és  250µl  izopropanolt  (REANAL)  adunk  hozzá,  majd  5‐10  percig  szobahőmérsékleten  állni  hagyjuk.  Ezt  követően  40 

lecentrifugáljuk  (12000rpm;  10  min;  4°C).  A  pelletet  ezután  1  ml  75%‐os  etanollal  mossuk.  Újra  lecentrifugáljuk  (7500  rpm;  5  min;  4°C)  szobahőmérsékleten  szárítjuk  5‐10  percig.  A  száradást  követően vízben vesszük fel a mintákat, majd ‐70°C‐on tároljuk felhasználásig.  A qRT‐PCR reakcióját az ajánlott protokollból alkalmazva végezzük TaqMan® Gene Expression  Assays  felhasználásával.  A  használni  kívánt  TaqMan  próbát  felolvasztjuk  ‐20  °C‐ról  majd  2000rpm  fokozaton  hideg  4°C  –os  fugában  5  percig  centrifugáljuk.  A  PCR  mixből,  a  desztillált  vízből  és  a  Taqman  próbából  egy  elegyet  (mixet)  készítünk.  Eppendorf  csövekbe  a  mixből  14‐14µl‐t  mérünk.  Majd  a  14µl‐hez  hozzámérjük  az  1µl  cDNS‐t.  A  mixet  a  cDNS‐el  2000rpm  fokozaton  hideg  4°C  –os  fugában 3 percig centrifugáljuk. Ezután a Real Time készülékkel futtatjuk a mintákat. Pou5f1 (Oct4),  Nanog,  transzkriptumokat  fogjuk  GAPDH  és  HPRT1  belső  kontrolokhoz  viszonyítva  megadni  (Syber  Green  Gene  Expression  Assays,  Applied  Biosystems).  A  futtatásokat  Eppendorf  Mastercycleren  végezzük, az adatok kiértékelését GenEx szoftver segítségével végezzük majd. 

Eredmények Kísérletünkben  a  2,5  napos,  3,5  napos,  4,5  napos  nyúl  embriók  fejlődését  vizsgáltuk  RDH,  illetve 2 inhibitorral kiegészített RDH médiumban.  Vizsgálataink során megállapítottuk, hogy a korai nyúl embriók fejlődését szignifikánsan nem  befolyásolja  a  tenyésztő  médium,  mivel  az  embriók  normálisan  fejlődtek  és  mindkét  médiumban  elérték  a  morula  állapotot,  habár  a  kontroll  médiumban  tenyészett  embriók  gyorsabban  fejlődtek,  mint  a  2  inhibitorral  kiegészített  tenyésztő  médiumban  (1.  ábra).  Ezzel  szemben  az  embriók  fejlődésére jellemző fontos pluripotencia markerek (Oct4, Nanog, Gata4, Gata6, Cdx2) vizsgálatánál  megállapítottuk, hogy a 2i médiumban tenyészett embriók esetében a vizsgált transzkripciós faktorok  expressziós  szintje  szignifikáns  különbséget  mutat  a  normál  RDH  médiumban  tartott  embriókéhoz  képest. A kiegészített médiumban a markerek magasabb (Oct4 négyszeres, Nanog hétszeres, Gata4,  Gata6, illetve Cdx2 kétszeres expressziót mutatnak.  A  2i  inhibitorral  kiegészített  médiumban  fejlődő  embriókból  megpróbáltunk  sejtvonalat  alapítani.  Az  embriócsomók  szépen  letapadtak  a  zselatin  felületére,  de  a  sejtek  lassan  osztódtak,  a  tenyésztés 5‐6. napjára leállt az osztódásuk (2. ábra).  Továbbá  azt  is  vizsgáltuk,  hogy  a  három  inhibitorral  (2i+Y27632)  illetve  négy  inhibitorral  (3i+A83019)  kiegészített  tenyésztő  médium  hogyan  hat  az  embriók  fejlődésére.  A  három,  illetve  a  négy  inhibitoros  médiumban  tartva  az  embriókat  a  fejlődésük  megállt.  Amikor  viszont  csak  egy  inhibitort  (PD032590)  alkalmaztunk  a  tenyésztő  médiumban,  azt  tapasztaltuk,  hogy  az  Oct4  expresszió szintje is lecsökkent, és a Gata6 expresszió is jelen marad. 

41 

RDH

RDH+2i

70 60

IDŐ (óra)

50 40 30 20 10 0 2s

3s

4s

8s

16s

mo

1. ábra: Nyúl embriók fejlődése kontroll (RDH) és két inhibitoros (RDH+CH+PD) médiumban 

ZP B

A MU

E

TB

20x

20x C

D E

E

20x 2i-LIF

10x

2. ábra: Nyúl embrionális őssejtvonal alapítás 

A: 3,5 napos nyúl embrió, B: trofektoderma sejtek (TE), C: embriócsomó (E), D: letapadt  embriócsomó (MU: mucin réteg, TB: trofoblaszt sejtek, E: embrió csomó) 

Összefoglalás Vizsgálataink  során  tehát,  ellentétben  a  korábban  Nichols  és  mtsai  által  találtakkal,  azt  találtuk,  hogy  a  2  inhibitoros  médiumban  tenyészett  4,5  napos  nyúl  embriókban  megmaradt  a  Gata6/Gata4 expresszió, ami normál RDH médiumban tartott expressziós szint kétszerese volt. Más  emlős  állatok  embrió  esetében  is  hasonló  megállapításra  jutottak  más  kutató  csoportok.  Szarvasmarha  és  sertés  esetében  a  2i  inhibitorral  kiegészített  médiumban  tenyésztett  embriók  szintén  mutattak  Gata6  és  Gata4  expressziót  a  Nanog  expresszió  mellett.  Viszont  egy  inhibitort  alkalmazva  (1i)  a  sertés  embriók  Gata4  szintje  lecsökkent  és  a  Nanog  pozitív  sejtek  aránya  megnövekedett (Kujik és mtsai., 2012) ,(Rodriguez és mtsai., 2012). 

42 

Nyúl  esetében  tehát  megállapítottuk,  hogy  a  két  inhibitorral  kiegészített  médium  a  legmegfelelőbb az embriók fejlődéséhez és a pluripotencia fenntartásához, azonban ahhoz, hogy ES  sejtvonal  alapítás  során  a  kezelt  ICM  sejtek  osztódó  képesek  maradjanak,  további  faktorok  alkalmazása szüksége, a LIF önmagában nem elég. 

Irodalomjegyzék Bősze  Z,  Hiripi  L,  Carnwath  JW,  Niemann  H  (2003):  The  transgenic  rabbit  as  a  model  for  human  diseases and as a source of biologically active recombinant proteins. Transgenic Res 12: 541‐ 553  Evans,  M.J.,  Kaufman,  M.H.(1981):  Establishment  in  culture  of  pluripotential  cells  from  mouse  embryos. Nature 292. 154‐156.   Honda  A,  Hirose  M,  Ogura  A.  (2009):  Basic  FGF  and  Activin/Nodal  but  not  LIF  signaling  sustain  undifferentiated status of rabbit embryonic stem cells. Exp Cell Res 315.2033–2042.   Honda A., Hirose M., Inoue K., Ogonuki N., Miki H., Shimozawa N., Hatori M., Shimizu N., Murata T.,  Hirose  M.,  Katayama  K.,  Wakisaka  N.,  Miyoshi  H.,  Yokoyama  K.  K.,  Sankai  T.  and  Ogura  A.  (2008):  Stable embryonic  stem  cell lines in rabbits:  potential small animal  models for human  research. Reprod Biomed Online 17. 706‐15.   Kujik  EW,  van  Tol  LTA,  Van  de  Velde  H,  Wubbolts  R,  Welling  M,  Geijsen  N,  Roelen  BAJ  (2012):  The  roles  of  FGF  and  MAP  kinase  signaling  in  the  segregation  of  the  epiblast  and  hypoblast  cell  lineages in bovine and human embryos. Development 139: 871‐882.  Li W, Wei W, Zhu S, Zhu J, Shi Y, Lin T, Hao E, Hayek A, Deng H, Ding S. (2008): Generation of rat and  human  induced  pluripotent  stem  cells  by  combining  genetic  reprogramming  and  chemical  inhibitors. Cell Stem Cell 4. 16–19.   Liao J, Cui C, Chen S, Ren J, Chen J, Gao Y, Li H, Jia N, Cheng L, Xiao H, Xiao L. (2009): Generation of  induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell 4. 11–15  Liu H, Zhu F, Yong J, Zhang P, Hou P, Li H, Jiang W, Cai J, Liu M, Cui K, Qu X, Xiang T, Lu D, Chi X, Gao G,  Ji W, Ding M, Deng H. (2008): Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus  monkey fibroblasts. Cell Stem Cell 3.587–590  Martin, G.R. (1981): Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium  conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78.7634–7638.   Nichols  J,  Jones  K,  Phillips  JM,  Newland  SA,  Roode  M,  Mansfield  W,  Smith  A,  Cooke  A.  (2009):  Validated  germline‐competent  embryonic  stem  cell  lines  from  nonobese  diabetic  mice.  Nat  Med. 15(7).814‐8  Nichols J, Ying QL.(2006): Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum‐ and feeder‐ free culture. Methods Mol Biol. 329.91‐8  Rodriguez A, Allegrucci C, Alberio R (2012): Modulation of Pluripotency in the Porcine Embryo and iPS  Cells. PLoS One 7.  Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S.(2007): Induction of  pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131(5).861‐72.  Takahashi  K,  Yamanaka  S  (2006):  Induction  of  pluripotent  stem  cells  from  mouse  embryonic  and  adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126(4).663‐76.   Thomson  J.  A.,  Itskovitz‐Eldor  J.,  Shapiro  S.  S.,  Waknitz  M.  A.,  Swiergiel  J.  J.,  Marshall  V.  S.  Jones  J.  M.(1998): Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282, 1145‐7.  

43 

Ying  QL,  Wray  J,  Nichols  J,  Batlle‐Morera  L,  Doble  B,  Woodgett  J,  Cohen  P,  Smith  A.(2008):  The  ground state of embryonic stem cell self‐renewal. Nature 453.519–523  Ying  QL,  Yan  Y,  Wu  N.L,  Li  P,Tong  C.(2010):  Production  of  p53  knockout  rats  by  homologous  recombination in embryonic stem cells. Nature. 467(7312). 211–213.   Yu J, Vodyanik MA, Smuga‐Otto K, Antosiewicz‐Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti  V, Stewart R, Slukvin II,  Thomson JA. (2007):Induced pluripotent stem  cell lines derived from  human somatic cells. Science 318.1917–1920. 

Közlésre elfogadott, illetve megjelent válogatott publikációk jegyzéke Angol nyelvű cikk: Maraghechi  P,  Hiripi  L,  Tóth  G,  Bontovics  B,  Bosze  Z,  Gócza  E.  (2013):  Discovery  of  pluripotency  associated  microRNAs  in  rabbit  preimplantation  embryos  and  embryonic  stem‐like  cells.  Reproduction. 145(4):421‐37, IF: 3,09 

Angol nyelvű konferencia kiadvány: Pall, E., Lichner, Zs., Bontovics, B., Gocza, E. (2008): Differentiation of embryonic stem cells: lessons  from  embryonic  development.  Lucrări  ştiinţifice  Zootehnie  şi  Biotehnologii,  41  (1),  absztrakt,  130‐137. ISSN 1221‐5287  Gócza,  E.,  Lichner,  Zs.,  Carstea,  V.B.,  Dobó,  K.,  Bontovics,  B.,  Bősze,  Zs.  (2008):  Examination  of  microRNA  mmu‐miR‐290  expression  level  alteration  in  mouse  embryonic  stem  cells  with  increasing  passages  number.  Transgenic  Research  17/5  pp.1008‐1009,  absztrakt,  poszter,  IF:  2,809  Gócza  E.,  Maraghechi  P.,  Bontovics  B.,  Hiripi  L.,  Hoffmann  O.I.,  Kerekes  A.,  Bosze  Zs.  (2011):  Expression  pattern  of  stem  cell  specific  markers  and  microRNAs  during  rabbit  embryonic  development  and  in  embryonic  stem  cells.  Regenerative  Medicine,  6/Suppl.2.  p205,  World  Conference  on  Regenerative  Medicine,  Leipzig,  Germany,  November  2‐4.,  2011.,  absztrakt,  poszter IF: 3,358  Bontovics B, Slamecka J, Maragechi P, Hiripi L, Makarevich A.V, Chrenek P, Bősze Zs, Gócza E. (2012):  Expression pattern of pluripotency markers in rabbit embryoblast, Bulletin UASVM Veterinary  Medicine 69(1‐2)/2012 ISSN 1843‐5270, absztrakt, előadás 

Angol nyelvű konferencia absztrakt: Gócza E., Bontovics B., Slamecka J., Maraghechi P., Hiripi L., Makarevich A.V., Chrenek P., Bodó Sz.,  Carstea  V.B.,  Kovács  A.,  Bősze  Zs.  (2012):  Current  issues  in  pluripotent  stem  cell  research  (Őssejtkutatás időszerű kérdései)., CEELA‐II 2012.06.02., absztrakt  Gócza, E., Lichner, Zs., Páll, E., Pállinger É., P. Maraghechi, Bontovics, B., Bősze, Zs., (2009): Function  of  miR‐290‐295  micro  RNA  cluster  in  mouse  embryonic  stem  cell  self‐renewal.  ISSCR  7th  Annual Meeting, p121, 757, Barcelona, Spain, July 8‐11, 2009, absztrakt, poszter  Gócza, E., Maraghechi, P., Bontovics, B., Hiripi, L., Makarevich, A.V., Slamecka, J., Chrenek, P., Bősze,  Zs.  (2011):  Pluripotency  markers  in  early  rabbit  development  and  embryonic  stem  cells.  4th  International  Rabbit  Biotechnology  Meeting.  Budapest,  Hungary,  2011.06.30‐07.01.  p35.,  absztrakt  Bontovics, B., Slamecka, J., Maraghechi, P., Hiripi, L., Makarevich, A.V., Chrenek P., Bősze, Zs., Gócza  E.  (2012):  Expression  pattern  of  pluripotency  markers  in  rabbit  epiblast  and  embryonic  stem 

44 

cells. 75th Anniversary of Albert‐Szent Györgyi’s Nobel Prize award. Szeged, Hungary, March,  22‐25. 2012., absztrakt, poszter, P‐M3, p. 237.,  

Magyar konferencia absztrakt: Gócza,  E.,  Lichner,  Zs.,  Páll.  E.,  Bontovics,  B.,  Bősze,  Zs.  (2008):  Embrionális  eredetű  őssejt‐vonalak  szerepe  a  differenciálódás  során  lejátszódó  folyamatok  mechanizmusainak  tanulmányozásában. „RNS Országgyűlés, Visegrád”, pp. 5‐8., 2008.04.03‐04., absztrakt  Gócza  E.,  Lichner  Zs.,  Páll  E.,  Bontovics  B.,  Maraghehechi,  P.,  Bősze  Zs.  (2008):  A  differenciálódás  során  lejátszódó  folyamatok  mechanizmusának  tanulmányozása  egér  embrionális  eredetű  őssejtek felhasználásával. Charles River Laboratories, Partner találkozó, Gödöllő, 2008. 11.12.,  absztrakt  Gócza E., Lichner Zs., Páll E., Bontovics B., Maraghehechi, P., Bősze Zs. (2008): A miR290‐295 őssejt  specifikus  mikro  RNS‐ek,  illetve  őssejt  specifikus  transzkripciós  faktorok  expressziós  mintázatának  vizsgálata  egér  embrionális  őssejt  vonalakban.  MBK  Napok  p8.,  Gödöllő,  2008.11.17‐18., absztrakt  Bontovics B., Lichner Zs., Páll E, Carstea V.B., Maraghechi P., Bősze Zs., Gócza E. (2009): A miR‐290‐ 295 őssejt specifikus mikro RNS‐ek, illetve őssejt specifikus transzkripciós faktorok expressziós  mintázatának  vizsgálata  egér  embrionális  őssejt  vonalakban.  VIII.  Magyar  Genetikai  Kongresszus,  XV.  Sejt‐  és  Fejlődésbiológiai  Napok,  Nyíregyháza,  p135,  PS06,  2009.04.17‐19.,  absztrakt, poszter  Lichner, Zs., Páll. E., Bontovics, B., Pállinger É., P. Maraghechi, Bősze, Zs., Gócza, E.(2009): Az mmu‐ miR‐290‐295  mikro  RNS  klaszter  szerepe  az  egér  embrionális  őssejtek  sejtciklusának  szabályozásában  „Consilium  Silvanus,  Pone  Navata”  Visegrád,  pp.  23‐28.,  2009.06.18‐19.,  absztrakt  Guba P., Bontovics B., Páll E., Markó K., Gócza E., Madarász E. (2011): AK‐c(RGDfC) adhezív peptiddel  bevont  felület  hatása  egér  embrionális  őssejtek  in  vivo,  illetve  in  vitro  differenciálódási  képességére. IX. Magyar Genetikai Kongresszus és XVI. Sejt‐ és Fejlődésbiológiai Napok, P004,  p. 130., Siófok, 2011.03.25‐27., absztrakt, poszter  Maraghechi  P.,  Bontovics  B.,  Hiripi  L.,  Kerekes  A.,  Hoffmann  O.I.,  Bősze  Zs.,  Gócza  E.  (2011):  Az  embrionális fejlődés kezdeti szakaszára jellemző markerek expressziós mintázatának vizsgálata  nyúl  embriókban.  23.  Nyúltenyésztési  Tudományos  Nap,  Kaposvár,  2011.  május  25.  pp.  99‐ 104., ISBN 978‐963‐9821‐30‐9., absztrakt, előadás  Bontovics  B.  (2011):  Az  embrionális  fejlődés  kezdeti  szakaszára  jellemző  markerek  expressziós  mintázatának  változása  MEK  és  Gsk3  inhibitorok  hatására  nyúl  embriókban.  X.minikonferencia”Genetikai  műhelyek  Magyarországon”,  Szeged,  2011  szeptember  9.,  absztrakt, előadás  Major P., Hoffmann O., Bontovics B., Kerekes A., Hiripi L., Gócza E., Bőzse Zs. (2013): A laboratóriumi  nyúl mint betegség modellállat. 25. Nyúltenyésztési Tudományos Nap, Kaposvár, 2013. május  25. pp. 95‐106., ISBN 978‐963‐9821‐30‐9.,  absztrakt  Bontovics  B.,  Slamecka  J,  Maragechi  P,  Hiripi  L,  Makarevich  A.V,  Chrenek  P,  Németh  K,  Bőzse  Zs,  Gócza E. (2013): The effect of early differentiation pathway inhibitors on cell fate decision in  preimplantation rabbit embryos.p 41, ISBN 978‐615‐5270‐02‐4, absztakt 

45 

Név: 

Buza Eszter 

Kezdés éve: 

2010 

Képzés formája: 

nappali tagozatos 

Témavezető: 

Müller Tamás 

Társ‐témavezető: 

Kolics Balázs 

Intézet, Tanszék: 

Környezet ‐ és Tájgazdálkodási Intézet, Halgazdálkodási Tanszék 

Elérhetőség: 

+3628522000/2317   [email protected]  

Hazai réticsík (Misgurnus fossilis) állományok genetikai elemzése és szaporodásbiológiai sajátosságainak (poliploidizáció és aszexuális szaporodás) feltérképezése A téma aktualitása, jelentősége A  réticsík  (Misgurnus  fossilis)  hazánkban  védett,  eszmei  értéke  2000  forint.  Az  IUCN  Vörös  Listáján  szerepel,  állományai  elsősorban  a  vízrendezések  miatt  világviszonylatban  is  csökkenő  tendenciát  mutatnak.  Szerepel  a  Berni  egyezmény  III.  függelékében  és  a  Madár‐  és  élőhelyvédelmi  irányelvek  II.  függelékében  is  (NATURA  2000).  Szaporodásának  egyik  jellegzetessége  az  eltérő  ploiditású  utódok  létrejötte,  melynek  szabályszerűségei  kevéssé  ismertek.  A  réticsík  megőrzése  védetté nyilvánításával önmagában nem oldható meg. Ehhez elsősorban élőhelyeinek védelmére és  rehabilitációjára,  a  meggyengült  populációk  telepítéssekkel  való  megerősítésére,  valamint  a  kipusztult  populációk  újratelepítésére  van  szükség  ‐  utóbbiakhoz  elengedhetetlen  az  anyahalak  indukált szaporítási technológiájának továbbfejlesztése, elősegítve a sikeres ivadéknyerést, valamint  az ivadéknevelés hatékonyságának növelése laboratóriumi körülmények között. Mindezek alapján a  faj szaporodásbiológiájának feltárása természetvédelmi és – remélhetőleg a közeljövőben gazdasági  – jelentőséggel bír.  

Célkitűzések 1. Indukált  szaporítással  az  ivadéknevelés  hatékonyabbá  tétele,  szaporítási  paraméterek  vizsgálata.  A  szaporított  és  felnevelt  réticsík  utódokkal  a  természetes  állományok  megerősítése,  valamint  a  korábbi  illetve  újabb,  a  faj  számára  optimális  élőhelyek  benépesítése.   2. A  faj  szaporodásbiológiai  jellegzetességeinek  feltárása,  kiemelt  tekintettel  az  egyedek  poliploidizációs  képességének  vizsgálatára.  Ennek  során  egyrészt  a  természetes  vizekből  származó  anyahalak  szaporításával  létrehozott  utódok  kromoszómaszámának  meghatározása, másrészt indukált ginogenetikus egyedek létrehozása, hogy megismerhessük  a réticsík lehetséges aszexuális szaporodási képességét és ploiditási jellemzőit. 

46 

3. Ahhoz,  hogy  az  utódok  ginogenetikus  hátterét  igazolni  tudjuk,  a  feltételezett  ginogenetikus  keresztezésekből  származó  utódokban  jelen  lévő  vagy  azokból  hiányzó  apai  örökítőanyag  kimutatása.  Ennek  érdekében  molekuláris  genetikai  eszközökkel  a  kárász  apai  örökítőanyag  jelenlétének  kizárása  az  utódokban.  Távolabbi  terveink  a  ginogenetikus  réticsík  ×  réticsík  F1R1  generációjának  egyedeiben  a  fajazonos  (csík)  apai  genom  jelenlétének  detektálása  mikroszatellit  markerekkel,  illetve  flow  citometriai  vizsgálati  adatokkal  az  anyahalak  ill.  utódaik ploiditási szintjeinek összevetése. 

Módszerek Anyahalállomány létrehozása, felkészítése a szaporításra Teleltetés  után  kiválasztottuk  a  szaporítani  kívánt  réticsíkokat,  amelyeket  ivar  és  populáció  szerint szétválogatva 1 m3‐es kádakba helyezve, a vízhőmérséklet fokozatos növelésével készítettük  fel  a  szaporításra.    Ezzel  egyidőben  a  ginogenetikus  szaporításhoz  széles  kárász  tejeseket  különítettünk  el  egy  másik  medencébe.  2  hét  alatt  7  °C‐ról  ‐  naponta  körülbelül  1 °C‐kal  növelve  ‐  emeltük a halak vizének hőmérsékletét egészen 20 °C eléréséig. 

Szaporítás Az  anyahalakat  hipofizálás  előtt  bódítottuk  1‐2  liter  vízhez  néhány  csepp  szegfűszegolaj  adagolásával,  lemértük  testtömegüket,  mely  alapján  kiszámítottuk  az  egyedi  hormonadagokat  10  mg/ttkg pontyhipofízis koncentráció alkalmazásához viszonyítva. A hipofízist dörzsmozsárban történő  porítást  követően  halfiziológiás  sóoldatban  (0,9  %‐os  NaCl)  oldottuk  fel,  a  megfelelő  adag  teljes  mennyiségét  egyszeri  oltással  a  bódított  egyedek  hasüregébe  –  a  farokalatti  úszó  töve  táján  –  injektáltuk.  Az  oltott  halak  folyamatos  ellenőrzés  mellett  jó  oxigénellátású,  szabályozott  vízhőmérsékletű  medencékbe  kerültek.  Az  ovuláció  24‐36  óra  elteltével  következett  be.  Az  ikraleadásra kész anyákat még az ikraszórás megkezdése előtt szegfűszegolajjal bódítottuk, majd az  ikrákat száraz műanyag edénybe óvatosan lefejtük, a hasi tájékra hosszanti nyomást gyakorolva, az  anyahalat  a  lehető  legjobban  kímélve.  Az  anyák  fejést  követően  azonnal  jó  oxigénellátású  medencékbe  kerültek  vissza.  A  tejes  csík  egyedek  heréjének  kioperálása  mellett  döntöttünk,  mivel  fejéssel  túlságosan  kevés  ivartermék  nyerhető.  Indukált  ginogenezis  kiváltása  céljából  széles  kárászoktól  származó  spermát  használtunk,  a  hímektől  fejt  ‐  a  has  kézzel  történő  nyomására  kipréselődő  ‐  tejet  automata  pipetta  segítségével  gyűjtöttük.  A  lefejt  ikratételek  –  tömegmérést  követően  –  Petri‐csészékbe  lettek  szétadagolva,  a  hímek  tejének  hozzáadásával  finoman  összekevertük,  majd  kevés  állott,  tiszta  víz  hozzácsepegtetésével  aktiváltuk  az  ivartermékeket.  Termékenyítő  oldatot  nem  használtunk,  mivel  az  ikrák  szinte  egyáltalán  nem  ragadtak,  a  Petri‐ csészék vízzel feltöltésével egyidőben a finom kevergetés megakadályozta, hogy a megtermékenyült  ikra leragadjon a Petri‐csésze aljára. Minden egyes termékenyített ikratétel Petri‐csészénként egyedi  azonosító jelölést kapott, nyilvántartva az adott keresztezéshez használt ikrás illetve tejes (csík vagy  kárász)  egyedet.  A  Petri‐csészékben  fejlődő  ikratételekről  fényképeket  készítettünk  az  ikrafejést,  termékenyítést  illetve  a  kelést  követően,  majd  a  petrinkénti  ikraszám  ImageJ  program  segítségével  került  meghatározásra.  Megadtuk  az  anyahalak  testtömegének  és  az  ovulált  ikratömegének  arányából számított pGSI (pszeudo‐gonadoszomatikus index) értékét, a termékenyítést követő 24 óra  elteltével  meghatároztuk  a  termékenyülési  %‐ot,  valamint  az  ivadékok  kikelése  után  a  kelési  %  értékét. 

47 

Keltetés és ivadéknevelés A  Petri‐csészékben  fejlődő  ikrák  vizét  rendszeresen  frissítettük  és  tisztítottuk,  semmilyen  vegyszerrel nem kezeltük, az éretlen vagy elhalt ikraszemeket egyesével, Pasteur‐pipetta segítségével  távolítottuk  el.  A  csészék  kis  vízmélysége  és  viszonylag  nagy  vízfelülete  lehetővé  tette  az  oxigénporlasztás  elhagyását.  A  lárvák  kelése  22‐23  °C‐os  vízhőmérséklet  mellett  a  2‐3.  napon  következett  be.  Gondoskodtunk  a  kelést  követő  azonnali  ikrahéj‐eltávolításról,  valamint  a  kishalak  vizének  rendszeres  tisztításáról  és  frissítéséről,  állandó  hőmérsékletének  fenntartásáról.  A  kiscsíkok  táplálkozásukat a 4. napon kezdték meg, táplálékul frissen keltetett Artemia salina nauplius lárvákat  biztosítottunk  számukra  az  első  hetekben.  Később  a  továbbnevelésre  szánt  csíkokat  apróra  vágott  tubifexszel  etettük.  A  testméret  növekedésével  arányosan  növeltük  a  kishalak  férőhelyét,  a  kezdeti  Petri‐csészékből először bemérőcsónakokba (12x12 cm), majd 10 l‐es haltartó edényekbe helyeztük  át őket. 

Mintavétel Az  anyahalaktól  úszómintát  gyűjtöttünk,  melyeket  etil‐alkoholban  tartósítottunk  DNS  vizsgálatra.  Minden  keresztezésből  kikelt  ivadékoknak  illetve  torz  lárváknak  egy  részét  kromoszómaszám‐meghatározás céljából kromoszóma‐preparáláshoz fixálva rögzítettük, illetve DNS  vizsgálatra etil‐alkoholban tartósítva tároltuk a vizsgálatokig. 

Kromoszómavizsgálatok A kromoszóma‐preparálásához a frissen kelt vagy néhány napos lárvák fixálását a következő  eljárások szerint végeztük:   1. Kolhicin‐kezelés:  0,05%‐os  kolhicin  oldatot  (Sigma–Aldrich,  Hungary,  Ref.  number:  C180)  tartalmazó  Petri‐csészékbe  helyeztük  az  élő  lárvákat,  hogy  leállítsuk  az  osztódás  folyamatát  metafázisban. A kezelés időtartama 3 óra.  2. Hipotonizálás:  A  kolhicinoldatot  leöntöttük  a  lárvákról  és  a  helyére  75  mM  KCL  oldatot  töltöttünk,  amit  fokozatosan  hígítottunk  desztillált  vízzel.  Eközben  a  halak  szikzacskóját  csipesszel‐tűvel  eltávolítottuk.  A  lárvák  a  hipotóniás  oldatban  25  percet  töltöttek,  mialatt  sejteik  megduzzadnak,  sejthártyájuk  felszakad  a  kromatinállomány  körül,  a  kromoszómák  elkülönülnek egymástól, ugyanakkor az egy sejthez tartozó kromoszómák együtt maradnak.  3. Fixálás:  A  hipotóniás  oldatból  a  halakat  metanol  és  99‐100%‐os  ecetsav  (Reanal,  Hungary,  Ref. number: 09215‐1‐01‐47) 3:1 arányú elegyéből készített fixáló oldattal 3/4‐ig megtöltött  és  megjelölt  kémcsövekbe  emeltük  át.  20  perc  elteltével  a  fixáló  oldatot  lepipettáztuk  a  mintákról,  majd  friss  fixálóval  újratöltöttük  a  kémcsöveket.  A  fixálást  ezután  még  kétszer  ismételtük  meg  20  perces  időközönként.  Ezután  a  fixált  lárvák  a  fixálóval  megtöltött  kémcsöveikben hűtve évekig is elállnak.  4. Kromoszómapreparálás: A fixált mintát csipesszel kiemelve mélyített tárgylemezre helyeztük,  kevés  50%‐os  ecetsav  oldatot  rápipettázva  bonctű  segítségével  minél  apróbb  darabokra  szedtük szét. Az így keletkezett sejtszuszpenziós oldatból 2 cseppet feliratozott, előmelegített  tárgylemez egyik végére rápipettáztunk. 20 másodperces száradási időt követően óvatosan, 

48 

szakaszosan felszívtuk pipettával a cseppeket, hogy koncentrikus körökben száradhassanak a  cseppben lévő sejtalkotók a tárgylemezre. Az így felpipettázott maradék cseppekkel ugyanezt  megismételtük háromszor.   5. Festés: A teljesen megszáradt tárgylemezeket 4% Giemsa‐oldattal (Riedel‐de Haën, Germany)  festettük.  15  perces  festési  idő  után  desztillált  vízzel  leöblítettük,  majd  száradni  hagytuk  a  tárgylemezeket.  6. Kromoszómák  fényképezése  és  számlálása:  A  megfelelő  minőségű  tárgylemezekről  digitális  fényképeket készítettünk, melyhez Nikon Eclipse E600 (Nikon, Japan) mikroszkóp 100‐szoros  nagyítású  olajimmerziós  objektívét  használtuk.  A  fényképek  a  mikroszkóp  trinokuláris  tubusához  csatlakoztatott  QImagint  MicroPublisher  3.3  számítógépes  kezelésű  digitális  fényképezőgéppel,  illetve  a  QImaging  QCapture  Pro  5.1  képkezelő  szoftver  használatával  készültek. A sejtosztódás metafázisában terült kromoszómákról készült képek alapján történt  a számlálás ImageJ program segítségével. 

Molekuláris genetikai vizsgálatok A  genomiális  DNS‐t  az  anyahalak  úszódarabkájának  szövetéből,  illetve  lárvák  esetében  a  fél  test  alkotta  szövetekből  izoláltuk  Walbot  és  Warren  (1988)  eljárása  alapján.  SCoT  marker  technika  alkalmazásával  10  SCoT  primert  felhasználva,  Eppendorf  Mastercycler  ep  384  (Eppendorf,  Németország)  PCR  készülék  segítségével  történt  a  polimorf  fragmentumok  felszaporítása,  mely  alapján  elkészítettük  a  szülők  illetve  utódok  genomiális  DNS  ujjlenyomatait.  A  PCR  termékeket  elektroforézissel  1,5%‐os  agaróz  gélen  (Promega)  futtattuk  meg,  majd  ethidium‐bromiddal  megfestettük és UV fényben detektáltuk. Az így kapott gélkép alapján határoztuk meg az anya‐ illetve  apaspecifikus fragmentumokat az utódokban.  Az  utódok  ginogenetikus  hátterének  igazolásához  a  génbanki  adatbázisban  (NCBI)  hozzáférhető  szekvenciákat  alapul  véve  nukleáris  markereket  is  terveztünk,  ezt  követően  az  apai,  anyai és az utód szekvencia polimorfizmusát PCR‐RFLP technikával detektáltuk. 

Eredmények Szaporítási eredmények A  szaporítások  során  mért  és  számított  értékeket  (testtömeg,  fejt  ikratömeg,  pszeudo‐ gonadoszomatikus  index,  termékenyülési  %,  kelési  %)  az  1.  táblázat  szemlélteti.  A  kapott  eredményeink  hasonlóan  alakultak  más  szerzők  szakirodalomban  közölt  adataival  (Adamkova‐ Stibranyiova és mtsai., 1999; Drozd és mtsai., 2009, 2010, 2011; Demény és mtsai, 2009).   

49 

1. táblázat: Réticsík szaporítási adatok összefoglaló eredményei   Csík ikrás  egyedek 

Testtömeg  (g) 

Fejt ikratömeg (g)

PGSI (%)

Termékenyülés  (%) 

Kelés (%)

1 

20.38 

3.71 

18.2 

66.38 

84.1 

2 

13.66 

1.48 

10.8 

51.09 

15.2 

3 

11.07 

1 

9.0 

50.13 

91.8 

4* 

11.57 

0.42 

3.6 

30.34 

14.81 

5 

66.99 

12.59 

18.8 

93.13 

72.8 

6 

61.39 

11.36 

18.5 

93.81 

71.5 

7 

70.45 

3.21 

4.6 

52.94 

51.5 

8 

28.1 

6.228 

22.2 

81.02 

70.4 

9 

25.77 

2.485 

9.6 

53.61 

53.1 

10 

25.30 

1.804 

7.1 

64.19 

51.7 

11 

20.29 

1.164 

5.7 

90.62 

48.8 

12 

19.45 

2.116 

10.9 

92.15 

33.3 

mean±SD 

31.2±21.9 

4.0±4 

11.6±6.3 

68.3±21.4 

54.9±24.8 

* Réticsík × széles kárász szaporításával létrehozott ginogenetikus ikrás egyed réticsík tejes visszakeresztezése során kapott értékek. 

Réticsík × réticsík szaporítási eredmények: A fejt ikra minősége egyedenként igen nagy heterogenitást mutatott, az éretlen ikraszemek  változó  számban  voltak  jelen  még  a  termékenyítés  előtt.  A  termékenyülési  %  szintén  változatosan  alakult egyedektől függően.  Változó eredményeket kaptunk a csík spermiummal termékenyített csík ikrák termékenyülési  (50‐94  %)  és  kelési  (15‐92  %)  értékeinek  tekintetében,  melyek  leginkább  egyedi  különbségekből  adódtak  (több/kevesebb,  jobb/rosszabb  minőségű  ikranyerés  az  egyes  nőstényektől).  Megfigyeltük  továbbá,  hogy  a  kelési  %  sok  esetben  fordított  arányban  állt  a  Petri‐csészénkénti  ikraszámmal  ‐  valószínűleg  jobb  kelési  eredményt  érhetünk  el  az  ikrák  több  Petri‐csészébe  való  szétadagolásával  vagy kezdeti nagyobb tárolóedények alkalmazásával, amennyiben nem a vizsgálatokra, hanem inkább  a továbbnevelésre fektetünk nagyobb hangsúlyt.  A  réticsík  ×  réticsík  keresztezések  között  elvétve  torz  lárvák  előfordulását  is  detektáltuk,  melyek a kelést követő 1‐2 napon belül elpusztultak.  A  továbbnevelt,  szépen  fejlődő  kiscsíkok  kitelepítési  alapot  jelentenek  számukra  optimális  környezeti  feltételek  mellett  eredeti  élőhelyükre,  vagy  bármely  természetvédelmi  területre  történő  kihelyezéshez (2011‐2012: Pusztaszer ‐ 150, Szada‐Veresegyház, Illés‐tavak – 450 kitelepített egyed). 

50 

Réticsík × széles kárász (indukált ginogenetikus) szaporítási eredmények: Első  évben  a  réticsík  ikratételeket  széles  kárásztól  származó  spermiummal  termékenyítve  életképes,  morfológiailag  réticsík  utódokat  nyertünk:  három  lárva  kelt  ki  1210  ikrából,  egy  közülük  elpusztult  két  nappal  a  kelést  követően,  de  két  nőstény  egyedet  sikeresen  felneveltünk  ivarérettségig.  Morfológiáját  tekintve  a  két  hal  nem  tűnt  hibridnek,  amely  a  réticsík  különleges,  a  triploid ezüstkárász (C. gibelio) szaporodási stratégiájához (ginogenezis) hasonló. A következő évben  szintén  sikerült  egy  ginogenetikus,  épnek  látszó  egyedet  létrehozni,  melyet  megpróbáltunk  felnevelni,  de  sajnos  sikertelenül,  mert  3  hetes  korában  elpusztult.  A  pusztulás  technológiai  hiba  folytán, nem fejlődési rendellenesség miatt történt, DNS mintáját viszont sikerült megőrizni.  A  kárász  spermiummal  termékenyített  egyes  ikratételek  termékenyülési  %‐a  sok  esetben  vártnál  magasabb  értéket  mutattak,  azonban  a  kezdetben  termékenynek  látszó  ikrák  a  kelést  megelőző néhány napban tönkrementek. A kikelt kisszámú ivadék a legtöbb esetben torz lett, nagyon  hamar, 1‐4 napos korukig elpusztult.   Ginogenetikus réticsík × réticsík továbbkeresztezési eredmények: Következő  évben  az  egyik  ginogenetikus  úton  létrehozott  és  sikeresen  felnevelt  nőstény  egyed  továbbszaporítása  során  a  hipofizálás  ellenére  kevés,  rossz  minőségű  ikrát  adott.  Az  ikrát  réticsík spermiummal termékenyítve ‐ 30,34 %‐os termékenyülési % mellett ‐ nyolc életképes utódot  kaptunk (F1R1 generáció) – ezek közül négyet kromoszóma‐ illetve DNS vizsgálatra készítettük elő, a  maradék  négy  kishalat  megpróbáltuk  felnevelni,  de  azok  12  napos  korukban  elpusztultak.  A  másik  ginogenetikus ikrástól az első évben nem tudtunk érett ikrát fejni, a következő szaporítási szezonban  viszont  ettől  az  anyahaltól  is  sikerült  életképes  utódokat  nyerni.  Mindkét  indukált  ginogenetikus  szaporításból  származó  anyahal  igen  érzékenynek  bizonyult  a  kezelésekre,  azok  fejést  követően  elpusztultak. 

Kromoszómavizsgálati eredmények Az indukált ginogenetikus úton létrehozott ivadékok 50 %‐ban hexaploidnak (n=2 egyed) és  50  %‐ban  életképes  tetraploidnak  (n=2  egyed)  bizonyultak  a  kromoszómapreparálás  eredményei  szerint (1. és 2. ábra). Fontos kihangsúlyoznunk, hogy a természetből még nem írtak le tetraploidnál  nagyobb kromoszómaszerelvénnyel rendelkező réticsíkot!  

 

 

1. és 2. ábra: 3n=150 kromoszómaszámú (hexaploid) és 2n=100 kromoszómaszámú (tetraploid) réticsík  ivadék kromoszómakészlete. 

51 

A  további  keresztezési  sémák  során  triploid,  aneuploid  és  tetraploid  utódokat  sikerült  detektálnunk a leszámolt kromoszómák alapján (csík × kárász: tetraploid, triploid, aneuploid utódok;  csík  ×  csík:  tetraploid  és  aneuploid  utódok).  Drozd  és  mtsai  (2010)  által  a  természetben  megfigyelt  1:1:4‐es  arányban  előforduló  triploid,  aneuploid,  tetraploid  egyedekhez  képest  csík  ×  csík  esetében  mi 0:1:5 ploiditási arányt kaptunk, de ki kell hangsúlyozni, hogy eddig kevés elemszámmal dolgoztunk  (a kromoszómapreparálás ill. a tárgylemezenkénti kromoszómaszámolás nagyfokú időigénye miatt) –  az adatok pontosabb és további elemszámmal kibővített vizsgálatai jelenleg is folyamatban vannak.  

Molekuláris genetikai eredmények A  réticsík  és  kárász  anyahalak  illetve  utódaik  DNS  mintázatának  összehasonlítása  alapján  (SCoT 12 primerrel) a kárász apai örökítőanyag nem detektálható az utódokban, vagyis a csík utódok  DNS mintázatában nem jelentek meg széles kárász (apa)‐specifikus fragmentumok (3. ábra).    Mindösszesen  négy  nukleáris  markert  szaporítottunk  fel  PCR  segítségével  az  apai  (C.  carassius)  és  az  anyai  (M.  fossilis)  egyedekből,  valamint  az  utódokból  és  kontroll  egyedből  (M.  fossilis),  majd  a  kapott  PCR  terméket  restrikciós  endonukleázokkal  emésztettük.  A  kapott  gél  elektroforézis mintázata alapján elmondható, hogy az alkalmazott PCR‐RFLP módszer egyértelműen  kizárta az apai C. carassius örökítőanyag jelenlétét az utódokban, mivel a nukleáris öröklődésű négy  marker mindegyike csak az anyai allél jelenlétét igazolta. 

 

  3. ábra: Réticsík és kárász anyahalak ill. utódaik DNS mintázata (SCoT 12 primer). 

Összefoglalás A réticsík keltetőházi körülmények között a pontyféléknél alkalmazott módszerhez hasonlóan  eredményesen  szaporítható,  nagyszámú  ivadék  előállítása  és  felnevelése  már  nem  jelent  gondot,  egyetlen  nehézséget  a  tejesektől  fejés  útján  nyerhető  nagyon  kis  mennyiségű  sperma  okoz.  Mesterséges  szaporítása,  ivadéknevelése  és  telepítése  révén  meggyengült  populációinak  megerősítése érdekében így aktívan hozzájárulhatunk a faj védelméhez.  

52 

 A  réticsík  ikráját  széles  kárásztól  származó  spermiummal  termékenyítve  morfológiailag  réticsík  utódokat  nyertünk,  ezek  közül  két  nőstény  egyedet  sikeresen  felneveltünk  ivarérettségig.  Morfológiáját  tekintve  a  két  egyed  nem  tűnt  hibridnek,  amely  a  réticsík  különleges,  a  triploid  ezüstkárász  (C.  gibelio)  ginogenetikus  szaporodási  stratégiájához  hasonló.  Az  alkalmazott  PCR‐RFLP  módszerek  egyértelműen  kizárták  az  apai  C.  carassius  örökítőanyag  jelenlétét  az  utódokban,  így  a  vizsgált  egyedek  ginogenetikus  eredetét  bizonyítani  tudtuk.  Az  egyik  ginogenetikus  nőstény  egyed  továbbszaporítása  során  a  lefejt  ikrát  réticsík  spermiummal  termékenyítve  nyolc  életképes  utódot  kaptunk (F1R1 generáció), ezek közül 4 ivadék kromoszómavizsgálat alapján 50 %‐ban tetraploidnak  (n=2  egyed)  és  50  %‐ban  életképes  hexaploidnak  (n=2  egyed)  bizonyult  ‐  ez  azért  is  jelentős  eredmény,  mivel  természetből  még  nem  írtak  le  tetraploidnál  nagyobb  kromoszómaszerelvénnyel  rendelkező réticsíkot.  Végső  célunk,  hogy  felfedjük  az  anyahalak,  valamint  azok  szaporításával  létrehozott  utódainak ploiditását, illetve esetleges hibridizációs képességét további molekuláris genetikai és flow  citomertiai vizsgálatok bevonásával.  

Irodalomjegyzék Adamkova‐Stibranyiova,  I.,  Adamek,  Z.,  Sutovsky,  I.  (1999):  A  comparative  study  on  the  induced  spawning in female loach (Misgurnus fossilis) by means of single and double pituitary injection  technique. Czech J. Anim. Sci., 44: 403–407.   Demény,  F.,  Zöldi,  L.  G.,  Deli,  Zs.,  Fazekas,  G.,  Urbányi,  B.,  Müller,  T.  (2009):  A  réticsík  (Misgurnus  fossilis)  szaporítása  és  nevelése  a  természetesvízi  állományok  fenntartása  és  megerősítése  érdekében. Pisces Hungarici 3: 107‐113.   Drozd,  B.,  Kouril,  J.,  Blaha,  M.,  Hamackova,  J.  (2009):  Effect  of  temperature  on  early  life  history  in  weatherfish, Misgurnus fossilis (L. 1758). Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems,  392(04): 1‐17.   Drozd,  B.,  Flajshans,  M.,  Ráb,  P.  (2010):  Sympatric  occurrence  of  triploid,  aneuploid  and  tetraploid  weatherfish  Misgurnus  fossilis  (Cypriniformes,  Cobitidae).  Journal  of  Fish  Biology  77:  2163– 2170.  Drozd,  B.  (2011):  Study  of  selected  population  parameters  of  weatherfish  Misgurnus  fossilis  (Cypriniformes,  Cobitidae):  early  life  history  and  status  of  ploidy  in  fish  from  Luznice  River  foodplain area. Ph.D. thesis, Vodňany, p. 16. 

Közlésre elfogadott, illetve megjelent válogatott publikációk jegyzéke Buza E., Demény F., Urbányi B., Kolics B., Müller T. (2012): Investigations on artificial propagation and  reveal  reproduction  features  of  the  weatherfish  (Misgurnus  fossilis)  (preliminary  results).  Praga, Poster section, board 448.  Buza E., Demény F., Horváth Á., Urbányi B., Kolics B., Müller T. (2012): A réticsík (Misgurnus fossilis)  szaporodásbiológiai sajátosságainak vizsgálata. Poszter előadás. XXXVI. Halászati Tudományos  Tanácskozás, Halászati és Öntözési Kutatóintézet, Szarvas.  Buza  E.,  Kolics  B.,  Kovács  B.,  Horváth  Á.,  Demény  F.,  Urbányi  B.,  Müller  T.  (2013):  A  réticsík  (Misgurnus  fossilis)  sajátságos  szaporodásbiológiájának  feltárása  molekuláris  biológiai  és  citológiai  eszközökkel.  Poszter  előadás.  XXXVII.  Halászati  Tudományos  Tanácskozás,  Halászati  és Öntözési Kutatóintézet, Szarvas. 

53 

Buza E., Kolics B., Kovács B., Demény F., Horváth Á., Urbányi B., Sipos S., Müller T. (2013): Artificial  propagation  and  reveal  reproduction  features  of  weatherfish  (Misgurnus  fossilis).  Oral  presentation.  VI.  International  Conference  and  Technical  and  Tedhnological  Exhibition  of  Aquaculture, Fishery and Applied Hydrobiology, Belgrade.  

54 

Név: 

Demény Márton János 

Kezdés éve: 

2011 

Képzés formája: 

nappali tagozatos 

Témavezető: 

Tőzsér János 

Intézet: 

Állattenyésztés‐tudományi Intézet 

Elérhetőség: 

06 (28) 522‐000/1640   [email protected] 

Holstein‐fríz tehenek csülökkeménysége, a csülkök helyeződése és keménysége közötti összefüggések vizsgálata A téma aktualitása, jelentősége A  szarvasmarhák  sántasága  napjainkban  már  állományszintű  megbetegedéssé  vált  hazai,  és  nemzetközi  viszonylatban  is,  különösen  a  tejtermelő,  azon  belül  is  leginkább  a  holstein‐fríz  állományokban. A végtagok többirányú rendeltetésüknek megfelelően bonyolult felépítésűek. Ezért a  végtagbetegségek is rendkívül változatosak. A tünetek két nagy csoportra oszthatók, egyrészt a helyi  tünetekre,  amelyek  nagyjából  hasonlítanak  a  test  egyéb  részein  előforduló  elváltozások  (pl.:  folytonossághiány,  szövetszaporulat)  tüneteihez,  másrészt  a  mozgászavarból  adódó  tünetekre,  amelyeket  összefoglaló  néven  sántaságnak  (claudicatio)  nevezünk  (B.  Kovács,  1962).  A  sántaság  azonban multifaktoriális eredetű megbetegedés, így annak megjelenésében több tényező is szerepet  játszhat.  A sántaság kialakulásának befolyásoló tényezői (Lehoczky, 2010):     

tehén komfort,  genetikai adottságok,  takarmányok tápanyagtartalma  a takarmányozás gyakorlata. 

Magyarországon 2011 első felében a selejtezett állatoknak több mint 24%‐át sántaság miatt  kellett kényszervágni. A mozgászavarok több mint 80%‐át a lábvégek rendellenességei és betegségei  okozzák  (Györkös,  2011).  Hazai  viszonyok  között  a  sántaság  okozta  veszteség  tehenenként  évente  átlagosan 20 ezer Ft‐ra tehető (Györkös és Báder, 2002), amely tetemes összegnek számít. A sántaság  okozta veszteségek a termeléskiesésben, a kezelési költségekben, a kezelések hatására piacképtelen  szermaradványos tej termelésében, és a kényszerselejtezésekben nyilvánulnak meg, melyek pontos  értékét nehéz meghatározni.  Egy holstein‐fríz tehénállományban ma már biztonságosan megoldható lenne a feladat, hogy  tartósan  10%  alatt  tartsuk  a  sántaság  állományszintű  arányát,  mert  jó  és  világosan  követhető  csülökápolási és gyógykezelési technológiák állnak rendelkezésünkre, sőt a kezelések mellett növekvő 

55 

jelentőségűek  a  megelőzésen  alapuló  módszerek,  és  ezeket  ennek  megfelelően  egyre  szélesebb  körben alkalmazzák is a hazai tenyészetekben (Györkös, 2011).  Magyarországon  a  tejelőszarvasmarha‐tenyésztésben  a  nagy  mennyiségű  tejtermelés,  valamint  a  kiváló  küllemi  tulajdonságok  figyelembevételével  a  hosszú  hasznos  élettartam  elérése  a  cél.  A  hasznos  élettartamot  a  szaporodásbiológiai  és  az  egészségi  állapot,  valamint  a  termelési  és  alkati tulajdonságok is – úgymint a láb és a lábvégek alakulása – befolyásolják (Báder, 2001). A láb és  lábvég  tulajdonságainak  javítása  –  gyenge  öröklődhetőségük  ellenére  –  fontos  feladat  állatjóléti  szempontok  miatt  is  (Györkös  és  Kovács,  2005),  melyek  célpárosítások  szakszerű  elvégzésével,  valamint tudatos szelekcióval érhetők el (Dohy, 1999).  A  sántaságot,  a  már  említett  genetikai  fajtagyengeségek  mellett,  jellemzően  két  dolog,  a  tartástechnológia  és  a  takarmányozás  befolyásolja.  Ezek  a  tényezők  ugyan  közvetve  okoznak  betegségeket,  de  a  betegségek  közvetlen  hatnak  a  csülökszarura.  Az  ilyen  típusú  elváltozások  minőségi,  mennyiségi  és  morfológiai  tulajdonságokban  is  tapasztalhatóak.  Az  intenzíven  tejelő  állományok megjelenésével együtt, a mélyalmos tartástechnológia is terjedt. Ez okot adott arra, hogy  a csülökszaru szabályozásának módszerét újragondolják. Míg a legelőn nevelt állatok csülökszaruján  hordozószél kialakítása volt ajánlott, addig az istállózott állatoknál már a padozatra jól felfekvő, biztos  tartást adó hordozó felület (1. ábra) kialakítása vált szükségessé (Lehoczky, 2011). 

1. ábra: Hordozószél kialakítása a csülökszabályozás során. Fotó: Hazai (2011) 

A csülökszaru minőségének tehát elsődleges szerepe van a sántaság, és a lábvégbetegségek  kialakulásában. A csülökkeménység mérésével foglalkozó kutatások száma kevés. Azonban a hazai és  külföldi  irodalmak  arra  mégis  rávilágítanak,  hogy  a  szarvasmarha  láb‐  és  lábvégbetegségeinek  a  sántaság kialakulására gyakorlott hatása, és a sántaság gazdasági és állatjólétet sértő kára, megfelelő  technika és szaktudás nélkül nem orvosolható. 

Célkitűzések Vizsgálataink  célja  az  általunk  kidolgozott  csülökkeménység  mérési  módszer  tesztelése  és  pontosságának  ellenőrzése  mellett  az  volt,  hogy  megállapítsuk  a  szarvasmarha  nyolc  csülkének  talpon  mért  keménységbeli  különbségeit,  és  a  közöttük  található  összefüggéseket  feltárjuk.  A  vizsgálat  szükséges  a  szarvasmarhák  egységes  „in  vivo”  csülökszaru‐keménységmérésének  módszertani kidolgozásához, melynek a vizsgálatok során történő alkalmazásával, a jövőben jelentős  következtetéseket vonhatunk le a sántaság kialakulásának okairól, megelőzésének lehetőségeiről. 

56 

Módszerek Vizsgálatainkat Szegváron, a Puskin Tej Kft. holstein‐fríz tejelő tehenészetében több egymást  követő héten végeztük, egy 450 állatlétszámos holstein‐fríz telepen. A mérések 29 állat mind a négy  lábának  külső  és  belső  csülkén,  a  talpszaru  csúcsi  részén  történtek  (2.  ábra,  5.  pont).  Minden  alkalommal  tízszer  ismételtük  az  adatok  felvételét,  hogy  a  csülökszaru  keménységét  minél  pontosabban meghatározhassuk.  A  talpszaru  keménységének  a  mérését  a  csülökszabályozási  munkálatokba  (3.  ábra)  beleillesztve végeztük, a szabályozási folyamat után, a már megtisztított és „lefaragott” szarun. Ezen  a telepen a szakszerű és rendszeres csülökápolási és szabályozási munkáknak köszönhetően csupán  kétszer találkoztunk talpfekéllyel, illetve kialakulóban lévő talpfekéllyel, mely jó aránynak számít. 

2. ábra: A talpszaru különböző területei (Amstel és mtsai., 2004) 

1 – fehér vonal és a hordozószél körömhegyi része, 2 – fehér vonal és a hordozószél külső talpfelületi  része,  3  –  az  oldalfal  és  a  sarok  illeszkedése,  4  –  a  talpszaru  és  a  sarokvánkos  találkozása,  5  –  a  talpszaru csúcsi része, 6 – sarokvánkos 

3. ábra: Csülökszabályozás Fotó: Hazai (2011) 

Méréseink során műanyag keménységmérőt használtunk (4. ábra), ami a keménységet egy 0‐ 100‐ig  terjedő  skálán  határozza  meg  egy  állandó  (50N)  erővel  terhelt  1,1mm  átmérőjű,  30%‐os 

57 

nyílásszögű  és  0,1mm  csúcsátmérőjű  csonka  kúp  végződésű  behatolótest  benyomódásának  mértékétől függően. Ha a behatolótest nem nyomódik bele az anyagba, az 100‐as értéket jelent az  adott  skálán,  míg  ha  eléri  a  2,5mm‐es  mélységet  (vagyis  a  kúp  teljes  hosszában  benyomódik),  az  0  értéknek felel meg.  A  29  állat  mérése  során  azt  tapasztaltuk,  hogy  vegyesen  voltak  a  csoportban  különböző  végtag  betegségekben  szenvedő,  illetve  teljesen  egészséges  állatok  is.  A  statisztikai  elemzésnél  a  beteg  állatokon  mért  eredményeket  mellőztük,  mivel  a  kóros  elváltozások  csak  néhány  esetben  voltak  tapasztalhatóak,  és  azokban  az  esetekben  is  más  és  más  probléma  volt  észlelhető.  Így  a  betegségek  sokfélesége  és  azok  bonyolult  kapcsolata  a  csülökszaru  keménységével,  ilyen  kis  létszámnál  nem  tette  lehetővé,  hogy  egyértelmű  statisztikai  következtetéseket  tudjunk  levonni  a  betegségek  és  a  csülökszaru  keménység  közötti  összefüggésekkel  kapcsolatban.  Azonban  a  lehetőségekhez  képest  ezeket  feljegyeztük,  és  a  mérésekből  a  gyakorlati  tapasztalatok  alapján  következtetéseket  vontunk  le.  A  29  állatból  10‐nél  tapasztaltunk  valamilyen  kóros  elváltozást  a  lábvégen, ezért a statisztikai elemzésben a 19 egészséges csülkű állat eredményeit értékeltük ki.

4. ábra: SA‐HDD Shore D műanyag keménységmérő műszer. Fotó: Demény (2009) 

Adataink  normál  eloszlását  Shapiro‐Wilk  teszttel  és  Q‐Q  Plot  ábrával  vizsgáltuk.  Meghatároztuk az alapstatisztikai jellemzőket: átlag és szórás érték, minimum és maximum értékek.  Median  teszttel  a  csülkön  belül  az  ismételt  mérések  közötti  kapcsolatot  vizsgáltuk,  illetve  Sperman  korrelációszámítással  a  csülkök  közötti  összefüggéseket  számszerűsítettük.  A  feldolgozáshoz  az  SPSS.18.‐as statisztikai programcsomagot használtuk az első fajú hiba (α) 0,05 volt. 

Eredmények A  vizsgált  állatok  átlagos  életkora  6,7  év,  súlya  pedig  595  kg  volt.  A  19  állat  csülökszaru  keménysége  42,13  és  45,79  Shore‐D  érték  között  alakult  (1.  táblázat),  3,01  és  5,5  közötti  szórás  értékkel. A 19 állaton, 10‐szeres ismétlésekkel mért eredmények átlaga kiegyenlített, illetve szórásuk  nem mutat nagy eltérést. Ez az állatok közel megegyező csülökszaru keménységét bizonyítja, aminek  oka  lehet  az  azonos  fajta,  a  hasonló  termelési  szint,  és  a  megegyező  tartástechnológia  és  takarmányozás.   

58 

1. táblázat: A különböző csülkök keménységének leíró statisztikája  Megnevezés (9)  JEB(1)  JEK(2)  BEB(3)  BEK(4)  JHB(5)  JHK(6)  BHB(7)  BHK(8) 

N (10)  190  190  190  190  190  190  190  190 

Átlag (11) 45,206 45,026 42,128 45,788 44,232 44,304 44,168 43,988

Szórás (12) 3,9084 4,1723 4,9233 4,7618 3,3378 3,0142 5,5064 4,9419

Minimum (13) 33,5 33,7 29,6 34,0 32,4 35,9 29,6 32,7

Maximum (14) 53,5 55,6 53,0 59,0 52,5 52,6 56,8 52,9

A csülkök megnevezése: (1) Jobb elülső belső, (2) Jobb elülső külső, (3) Bal elülső belső, (4) Bal elülső  külső, (5) Jobb hátulsó belső, (6) Jobb hátulsó külső, (7) Bal hátulsó belső, (8) Bal hátulsó külső  A  normalitás  vizsgálatakor  nem  minden  esetben  találtunk  normál  eloszlást  a  Shapiro‐Wilk  teszttel,  de  a  Q‐Q  Plot  ábrákon  azt  tapasztaltuk,  hogy  ezek  a  kiugró  értékek  nagyságrendileg  nem  tértek  el  a  többitől.  Az  eredmények  hasonló  képet  mutattak  a  normál  és  nem  normál  eloszlású  értékeknél,  ahogy  az  5.  ábra  mutatja.  Ezért  az  eredmények  értékeléséhez  nem  parametrikus  próbákat használtunk. 

Expected normal (1)

Observed value (2) 5. ábra: A bal elülső külső csülkön mért eredmények normalitás ábrája 

(1) Expected normal: A normál eloszlás várt eredményei, (2) Observed value: Megfigyelt értékek  Medián teszttel vizsgáltuk, hogy a méréseknél alkalmazott módszertan, a tíz ismételt mérés  esetében megfelelő‐e. A Chi‐négyzet teszt eredményét értékelve láttuk, hogy az alkalmazott eszköz  és módszertan megfelelő, mivel minden esetben – a „magas” empirikus szignifikancia szint miatt – a  Ho hipotézis megtartása volt igazolható vagyis, hogy a 10 mérés medián értékei azonosak egymással  (2. táblázat).  2. táblázat: Az ismételt csülökszaru keménységmérések statisztikai értékelése    N  Medián  Chi‐square  Df  Szignifikancia 

JEB(1) 190 45,500 3,053a 9  0,962

JEK(2)  190  45,150  13,579a  9  0,138 

BEB(3) 190 41,250 8,105a 9 0,524

BEK(4) 190 46,150 3,053a 9 0,962

59 

JHB(5) 190 44,100 2,190b 9 0,988

JHK(6) 190 44,400 3,032b 9 0,963

BHB(7)  190  43,8  3,87  9  0,920 

BHK(8) 190 44,05 3,05 9 0,962

A csülkök megnevezése: (1) Jobb elülső belső, (2) Jobb elülső külső, (3) Bal elülső belső, (4) Bal elülső  külső, (5) Jobb hátulsó belső, (6) Jobb hátulsó külső, (7) Bal hátulsó belső, (8) Bal hátulsó külső  Vizsgálataink  fő  célja  az  volt,  hogy  megállapítsuk,  hogy  mind  a  nyolc  csülökszaru  mérése  szükséges‐e,  vagy  elég  egy  állatnak  egy  lábán  elvégezni  a  keménységvizsgálatot  ahhoz,  hogy  egységesen  megmondhassuk  az  állatot  jellemző  csülökszaru  keménységet.  Ezt  a  kérdést  korreláció  vizsgálattal  válaszoltuk  meg,  ahol  a  lábak,  illetve  a  belső  és  külső  csülökszaru  közötti  korreláció  nagyságát  és  irányát  határoztuk  meg.  A  nem  parametrikus  korreláció  vizsgálatnál  megállapítható,  hogy  a  különböző  csülkök  közötti  összefüggés  igen  laza  (3.  táblázat),  tehát  a  csülökszaru  keménységének  a  vizsgálatát  nem  elegendő  csupán  egy  csülkön  elvégezni,  mert  annak  az  eredményéből nem következtethetünk biztonsággal az állat többi csülökszarujának a keménységére.  Megállapítottuk  továbbá,  hogy  a  csülökszaru  keménységének  és  minőségének  meghatározására a kidolgozott módszertan alkalmas. Mind a használt mérőműszer (SA‐HDD Shore D  műanyag keménységmérő), mind a mérendő felület előkészítése, a mérések helyének megválasztása,  és  az  értékek  felvétele  helyesen  volt  meghatározva,  mivel  a  kapott  értékek  normalitása,  szórása  és  kiegyenlítettsége megfelelő volt.  3. táblázat: A különböző csülkök keménysége közötti korreláció    JEB (1)  JEK (2)  BEB (3)  BEK (4)  JHB (5)  JHK (6)  BHB (7)  BHK (8) 

JEB (1)                 

JEK (2)  0,27               

BEB (3) 0,1 0,04            

BEK (4) 0,28 0,33 0,23

JHB (5) 0,13 0,02 ‐0,15* 0,03

JHK (6) 0,19 0,11 0 0 0,22

BHB (7)  0,11  0,05  0,37  0,38**  0,12  0,01     

BHK (8) 0,17 0,28 0,35 0,14 0,01 0,04 0,31

*P<0,05; **P<0,0001  A csülkök megnevezése: (1) Jobb elülső belső, (2) Jobb elülső külső, (3) Bal elülső belső, (4) Bal elülső  külső, (5) Jobb hátulsó belső, (6) Jobb hátulsó külső, (7) Bal hátulsó belső, (8) Bal hátulsó külső  A  nyolc  csülök  közötti  korrelációs  eredmények  alapján  egyértelmű,  hogy  egy  adott  egyed  csülökszaru keménységének a megállapításához a méréseket az összes csülkön el kell végezni.  A továbbiakban a csülökszaru keménységre ható tényezők vizsgálatára és elemzésére lenne  szükség, a következő szempontok szerint:    

A  nedvességtartalom  csülökszaru  keménységét  befolyásoló  hatásának  pontos  meghatározása  kor, ivar és fajta hatása az állatok csülökszarujának minőségére  a  takarmányozás,  a  tartástechnológia  és  a  szaru  keménysége  közötti  összefüggések  keresése. 

A  mérések  alkalmával,  bár  statisztikailag  nem  voltak  kiértékelhetők  az  adatok,  de  nagy  figyelmet  fordítottunk  a  csülökszarun  észlelhető  kialakuló  vagy  kialakulóban  lévő  betegségek  és  a  keménységi  értékek  közötti  összefüggések  megfigyelésére.  Az  esetek  nagy  többségében  jól  észrevehetően a beteg csülök szaruja puhább volt, már a kialakulóban lévő laminitisz esetén is. Ezért 

60 

a  folytatódó  vizsgálatokban  javasolt  és  szükséges  a  megfelelő  elemszámú  és  jól  beazonosítható  egészséges  és  beteg  csülkön  történő  mérések  elvégzése,  mert  annak  eredményei  a  sántaság  vizsgálatában egy teljesen új módszert hozhat. 

Összefoglalás Hazánkban  is  mint  külföldön,  a  tejelő  szarvasmarha  gazdaságokban  már  állományszintű  megbetegedéssé  vált  a  sántaság,  ami  a  hosszú  hasznos  élettartamot  jelentősen  befolyásolja,  és  a  gazdaságosságot teszi kérdésessé. A sántaságot okozó betegségek időben való felismerése, illetve az  állatok technológiai tűrésének megállapítása érdekében dolgozatunknak a csülökszaru minőségének  meghatározása  volt  a  célja,  aminek  egyik  lehetséges  módszere  a  csülökszaru  keménységének  vizsgálata.  Vizsgálatainkat  Szegváron  végeztük  29  tehénen,  ahol  egyedenként  mind  a  nyolc  csülök  talpszarujának a keménységét mértük, egy SA‐HDD Shore D műanyag keménységmérő műszerrel, a  méréseket tízszer ismételve. Az állatok átlagos csülökszaru keménysége 42,13 és 45,79 Shore‐D érték  között  változott.  A  mért  eredmények  szórása  3,01  és  5,5  között  alakult.  A  normalitás  vizsgálatánál  nem  minden  esetben  találtunk  normál  eloszlást  a  Shapiro‐Wilk  teszttel,  de  a  Q‐Q  Plot  ábrákon  azt  tapasztaltuk,  hogy  a  kiugró  értékek  nagyságrendileg  nem  térnek  el  a  többitől.  A  Chi‐négyzet  teszt  eredményét  értékelve  láttuk,  hogy  az  alkalmazott  eszköz  és  módszertan  megfelelő,  mivel  minden  esetben  –  a  „magas”  empirikus  szignifikancia  szint  miatt  –  a  Ho  hipotézis  megtartása  igazolható,  vagyis  a  10  mérés  medián  értékei  azonosak  egymással.  A  nem  parametrikus  korreláció  vizsgálatnál  megállapítható  volt,  hogy  a  különböző  csülkök  mérési  értékei  között  csak  igen  laza  összefüggések  találhatóak  (például:  bal  elülső  külső:jobb  hátulsó  külső  korrelációja:  0,04),  tehát  a  csülökszaru  keménységének a vizsgálatát nem elegendő csupán egy csülkön elvégezni.  A  gyakorlati  tapasztalatok  alapján  azonban  az  a  megállapítás  tehető,  hogy  a  szarvasmarha  sántaságát okozó gyakori betegségek, mint a laminitisz és a talpfekély, a csülökszaru keménységére  hatással  vannak.  Így  a  módszer  kidolgozásával  akár  lehetővé  válna  a  betegségek  korai  stádiumban  történő azonosítása, aminek komoly gazdasági jelentősége lehetne a gyakorlatban. 

Irodalomjegyzék Amstel, S. R., Shearer, J. K., Palin, F. L. (2004): Moisture content, thickness, and lesinons of sole horn  associated with thin soles in dairy cattle. J. Dairy Sci., 87. 757‐763.  Báder E. (2001): Élettartam, hasznos élettartam. Agro Napló, 5‐6., 45‐46.  B. Kovács A. (1962): Állatorvosi általános sebészet. Mezőgazdasági kiadó, Budapest  Dohy J. (1999): Genetika állattenyésztőknek. Mezőgazda Kiadó, Budapest  Györkös I. (2011): A tavaszi csülökápoló tanfolyam tapasztalatai. Holstein Magazin, Budapest, XIX. 3.  32‐34.  Györkös  I.,  Báder  E.  (2002):  Csülökápolás  és  a  sántaság  megelőzése  szarvasmarha  állományokban.  Szaktudás Kiadó Ház, Budapest  Györkös  I.,  Kovács  K.  (2005):  Állatjóléti  fejlesztés‐  fenntartható  szarvasmarhatartás  és  –tenyésztés.  AWETH, 173‐183.  Lehoczky J. (2010): Lecture, Hoofcare. Budapest, 10. 09. 2010.  Lehoczky. J. (2011): ‐ Szóbeli közlés ‐ 

61 

Közlésre elfogadott, illetve megjelent válogatott publikációk jegyzéke Tőzsér  J.,  Szentléleki  A.,  Demény  M.  (2010):  A  csülökszaru  minőségének  vizsgálati  lehetőségei  a  szarvasmarhafajban. Irodalmi áttekintés. Magyar Állatorvosok Lapja 8. 132. 451‐456.  Demény  M.,  Tóth  G.,  Szentléleki  A.,  Dobra  L.,  Póti  P.,  Tőzsér  J.  (2011):  Holstein‐fríz  tehenek  csülökszarujának  oldalfalán  és  talpán,  in  vivo  mért  keménységi  értékek  összehasonlítása.  Állattenyésztés és Takarmányozás 60. 4. 385‐395.  Demény  M.,  Szentléleki  A.,  Holló  I.,  Holló  G.,  Tőzsér  J.  (2011):  Előzetes  adatok  az  azonos  helyen  tartott  holstein‐fríz  és  magyartarka  fajtájú  szarvasmarhák  csülökszaru  keménységére.  Animal  welfare, etológia és tartástechnológia 7. 2. 94‐103.  Demény  M.,  Tóth  G.,  Szentléleki  A.,  Dobra  L.,  Póti P.,  Tőzsér  J.  (2011):  Holstein‐fríz  tehenek  in  vivo  csülökszaru  keménységének  mérése.  Animal  welfare,  etológia  és  tartástechnológia  7.  2.  104‐ 118.  Demény M., Szentléleki A., Hazai A., Holló I., Holló G., Tőzsér J. (2012): Az azonos körülmények között  tartott  holstein‐fríz  és  magyartarka  fajtájú  szarvasmarhák  csülökszaru  mintáinak  keménysége  szárítás után. Acta Agraria Kaposváriensis 16. 1. 16‐27. 

62 

Név:  

Hejel Péter 

Kezdés éve: 

2012 

Képzés formája: 

részidejű költségtérítéses 

Témavezető: 

Katona Krisztián  

Társ‐témavezető: 

Szemethy László  

Intézet, Tanszék: 

Vadvilág Megőrzési Intézet 

Elérhetőség: 

+36309706005  [email protected] 

Különböző erdőgazdálkodási módok hatása a növényevő nagyvad‐fajok élőhelyére és a vadkár kialakulására A téma aktualitása, jelentősége Az  erdei  vadkárként  ismert,  összetett  problémakör  napjainkban  egyre  élesebb  konfliktusok  forrása  az  erdő‐  és  a  vadgazdálkodók  között.  (Reimoser  and  Gossow,  1996;  Festa‐Bianchet,  2007;  Katona és mtsai., 2007) Hazánkban az erdei vadkár címén kifizetett összeg eléri a 200 millió forintot  (Csányi  és  Lehoczki,  2010).  Az  erdőgazdálkodás  legfőbb  jövedelemforrása  a  fakitermelésből  és  értékesítésből  származó  árbevétel.  Minden,  ami  ezt  negatívan  befolyásolja  az  erdőgazdálkodók  számára problémát jelent. A növényevő nagyvad fajok területhasználatuk során, ami alatt e témában  elsősorban a táplálkozásukat értjük, valóban jelentős károkat okozhatnak, ami jól definiálható lokális  értelemben  (Gill  and  Beardall,  2001).  A  növényevő  nagyvadfajok  hatásának  mértéke  azonban  az  eddigi  kutatási  eredmények  alapján  nem  egyszerűen  a  ‐  nehezen  vagy  egyáltalán  nem  mérhető  ‐  vadlétszám,  sokkal  inkább  az  adott  területen  fennálló  vadsűrűség  és  az  élőhelyi  minőség  kapcsolatának függvénye (Bleier és mtsai, 2010).   Sajnos  úgy  tűnik,  hogy  az  erdőgazdálkodók  túlnyomó  többsége  csupán  egyrészt  a  vadállomány létszámának drasztikus csökkentésében, másrészt erdővédő kerítések építésében látja a  megoldást. (Putman and Moore, 1998; Bartha, 2000) Hazai erdeinkben már kb. 7500 km kerítés van  (Katona és mtsai, 2011). A tapasztalat azt mutatja, hogy ez a két, leggyakrabban alkalmazott módszer  nem  vezet  eredményre.  Ezzel  a  vad  élőhelyének  további  fragmentációját,  felaprózódását  érjük  el;  valójában a nem kerített részeken mi magunk idézzük elő a nagyobb vadsűrűséget, azaz közvetve a  nagyobb mértékű vadkárt.  A vadállomány drasztikus csökkentése vadgazdálkodási szempontból csak addig elfogadható,  amíg  nem  veszélyezteti  az  eredményes  vadgazdálkodást.  A  meggondolatlan  létszámcsökkentés,  a  túlzott‐ és nem kellőképpen alapos válogató szempontok szerint végzett vadászat veszélyeztetheti a  vadállományok biológiai stabilitását is. (Miller and Ozoga, 1997)  A  gazdálkodói  szempontból  károsnak  ítélt  vadhatás  elleni  védekezést  új  alapokra  kell  helyezni,  ugyanis  ha  ma  arról  beszélünk,  hogy  a  vad  helyileg  nagyon  érzékeny  károkat  okoz,  nem  szabad figyelmen kívül hagyni a tényt, hogy az emberi tevékenység miatt jelentősen degradálódott, 

63 

felaprózódott  élőhelyekre  szorult  vissza,  ilyen  feltételek  között  kényszerű  élni.  (Miller  and  Ozoga,  1997)  A helyes döntések meghozatalához minél alaposabban meg kell ismernünk a vad terület‐ és  forráshasználati  szokásait.  Jellemeznünk  kell  az  élőhely  adott  időpontban  tapasztalható  állapotát,  a  vegetáció  változásának  irányát,  annak  megújuló  képességét.  Ezek  ismeretében  hatékony  módszereket dolgozhatunk ki, amelyek középpontjában egy jól átgondolt élőhelyfejlesztés állhat. Az  eddigi eredményeink alapján körvonalazódik, hogy az erdőgazdálkodás néhány elemén is változtatni  szükséges.  A  természetes  erdőállapothoz  mindinkább  közelítő  erdőművelés,  az  ún.  „folyamatos  erdőborítás  melletti  gazdálkodás”  az  eddigi,  ún.  „vágásos  erdőműveléssel”  szembeni  előtérbe  helyezését  sokan  szorgalmazzák.  (Frank  és  mtsai,  2000;  Somogyi  és  mtsai,  2003;  Standovár  és  Gálhidy, 2003; Gamborg and Bo Larsen, 2003; Davis and Kerr, 2011). Ez vadgazdálkodási szempontból  is előnyös volna, ugyanis az erdők természetességének egyik legfontosabb ismérve a magas fokú faji  diverzitás.  (Frank  és  mtsai,  2000;  Somogyi  és  mtsai,  2003),  amely  az  erdei  élőhelyeken  előforduló  minden  fajra  értelmezhető.  Itt  kell  megemlíteni,  hogy  sajnos  a  jelenlegi  erdőművelési  mód  során  tapasztalható drasztikus és csaknem teljes körű cserjeirtás e természetesség ellen hat. A cserjefajok  előfordulásának  hiánya  nagyban  hozzájárul  ahhoz,  hogy  a  vad  az  erőgazdálkodás  szempontjából  célállománynak  tekinthető  faj‐,  fajok  egyedeit  károsítja,  hisz  nem  találja  meg  az  ember  által  elszegényített fajösszetételű vegetációban ezek alternatíváját (Katona és mtsai, 2007, 2009).  Számos  tudományos  eredmény  támasztja  alá,  hogy  a  cserjefajok  jelenléte  jelentős  mértékben  segítik  a  célállomány  egyedeinek  megóvását  (Moser  és  mtsai,,  2006;  Jensen  és  mtsai.,  2012).  Ezzel  egybehangzóan  a  Vadvilág  Megőrzési  Intézet  kutatási  eredményei  azt  mutatják,  hogy  a  hazai  nagyvadfajok  elsődlegesen  a  cserjeszintből  táplálkoznak  és  hogy  a  gímszarvas  előnyben  részesíti  a  cserjében  gazdag  területeket,  ahol  a  táplálékforrás  mellett  biztosított  a  pihenés  is,  hisz  jó  rejteket  talál magának a sűrű növényzetben.  (Mátrai és Kabai, 1989, Mátrai és Szemethy, 2000, Szemethy és  mtsai, 2003; Mátrai és mtsai, 2004).  A cserjeszint táplálékkínálatának vizsgálatakor megállapították,  hogy adott kutatási területeken a vegetációs időszakban az 1500‐3000 kg/ha táplálékot biztosított a  növényevő  nagyvad  számára  (Katona  és  mtsai,  2007).  A  Bükk  hegység  területén  korábban  végzett  hasonló  vizsgálatok  eredménye  azt  mutatja,  hogy  a  cserjében  rendkívül  szegény  területen  minden  elérhető  fásszárú  fajon  válogatás  nélkül  nagymértékű  rágottság  volt  tapasztalható  (Olajos,  2004).  Ugyanakkor a rágottsági arány a kínálattal összefüggésben nem feltétlenül mutat növekedést, amiből  arra lehet következtetni, hogy ha megfelelő mennyiségű táplálék áll rendelkezésre a cserjeszintben a  gímszarvas  számára  és  a  vadsűrűség  ennek  mértékéhez  képest  nem  aránytalanul  magas,  akkor  a  rágottság  egy  stabil  értéken  maradhat.  Mivel  a  növekvő  kínálatból  sem  rág  többet  a  szarvas,  a  táplálékpreferenciái miatt előfordulhat, hogy a főfafajt meg sem rágja, fogyasztása – összességében ‐  abból  jelentősen  lecsökkenhet  (Szemethy  és  mtsai,  2004).  A  rágottság  mértékét  számos  tényező  befolyásolja. Náhlik és munkatársai szerint számottevő rágás a téli időszakban tapasztalható (Náhlik,  1998, Náhlik és mtsai, 2002). Ezzel szemben a SZIE VMI vizsgálatai alapján a téli rágottság általában  kisebb volt a nyáriaknál (Szemethy és mtsai, 2004).   Mindezekből az következik, hogy bár számos nyitott kérdés van még, leszögezhető, hogy az  élőhely‐fejlesztés  egyik  kulcs  eleme  a  hazai  erdőterületek  fásszárú  társulásaira  jellemző  faji  változatosság növelése.  

64 

Célkitűzések A  kutatási  munka  szorosan  kapcsolódik  a  „Sustainable  Conservation  on  Hungarian  Natura  2000 Sites” elnevezésű, SH/4/8 kódszámú Svájci ‐ Magyar Együttműködési Program által támogatott  kutatássorozathoz. E program keretében mindenekelőtt az élőhely‐felmérés módszertani fejlesztését  kell  elvégezni,  majd  a  kijelölt  Natura  2000‐es  erdei  élőhelyek  kezelési  tervét  kell  elkészíteni.  Az  élőhely  leíró  jellemzését  szolgáló  felmérésnek  és  az  azt  követő  kezelési  tervnek  fontos  eleme  a  nagytestű  növényevő  vadfajok  élőhelyi  hatásának  jellemzése  illetve  az  e  szempontot  is  figyelembevevő élőhelyfejlesztés.   Célunk, hogy egy tudományosan megalapozott, megbízható, ugyanakkor a gyakorlat számára  alkalmazható  megközelítést  és  módszert  adjunk,  amely  elsősorban  az  élőhely‐fejlesztésen  keresztül  mérsékli  a  patás  vadfajok  élőhelyre  gyakorolt  kedvezőtlen  hatását,  ugyanakkor  teret  enged  a  vad  pozitív élőhelyi hatásának mind szélesebb körű érvényesülésének.  Az alapvető összefüggések ismeretében meg kell határoznunk egy leíró módszert, amellyel jól  jellemezhetőek  az  egyes  erdős  társulások,  mint  a  növényevő  nagyvad  élőhelyei  (táplálékkínálat,  „erdőtermészetesség”, vegetáció megújuló képessége).   Jelenleg  nem  rendelkezünk  minden  szempontból  megfelelő,  egységes  vadhatás  mérési  eljárással,  ezért  fontos  a  különböző,  eddig  alkalmazott  módszerek  tesztelése,  kalibrálása.  Ehhez  először  a  különböző  eljárások  leírását  összegyűjtjük  hazai  és  nemzetközi  szinten,  majd  elméleti  és  terepi  összehasonlításokat  végzünk.  Ezek  alapján  meghatározzuk  a  növényevő  nagyvad  fajok  élőhelyre  gyakorolt  hatásával  kapcsolatos  főbb  ökológiai  és  gazdasági  kérdések  megválaszolásához  leginkább alkalmas adatgyűjtési és feldolgozási eljárást.   A  fent  leírt  szempontok  alapján  kidolgozott  módszert  javasolhatjuk  majd  a  különböző  ágazatok,  mint  az  erdő‐  és  vadgazdálkodás  vagy  a  természetvédelem  számára  az  üzemtervezési  illetve  a  kezelési  tervek  összeállítási  munkáihoz,  akár  a  jelenleg  széles  körben  alkalmazott,  de  nem  megbízható vadlétszám‐adatok használata helyett is.   Fontosnak érezzük, hogy minél szélesebb körben sikerüljön megismertetni a nagyvad erdőre  gyakorolt  pozitív  ökológiai  szerepét  is  (pl.  válogató  táplálkozás  szabályozó  hatása  a  fajösszetételre,  rágás‐indukált túlkompenzációs növekedés, magterjesztés stb.). Sajnos ez a megközelítés csak ritkán  szerepel  a  témában  folytatott  vitában,  pedig  ellensúlyozhatná  az  egyoldalú,  radikális  vadlétszámcsökkentés mellett érvelő véleményeket.  A  PhD  munka  tudományosan  új  eredményeit  különböző  hazai  és  nemzetközi  fórumokon  publikáljuk. A nemzetközi szinten is publikálható altémák, várhatóan a következők lesznek:   

A növényevő nagyvadak szelektív táplálkozásának leírása különböző módon kezelt és  eltérő táplálékkínálattal rendelkező erdőterületeken.  Élőhely vadszempontú minősítésére és a vadhatás mérésére alkalmazott módszerek  összehasonlító értékelése. 

65 

Módszerek A  témába  illeszkedő  előzetes  vizsgálatként  a  már  régóta  alkalmazott,  a  Vadvilág  Megőrzési  Intézet  munkatársai  által  kifejlesztett  módszerrel  terepi  adatgyűjtést  és  adatértékelést  végeztünk  a  Mátrában  található  bükk  erdőfelújítás  alá  vont  hat  különböző  mintavételi  területen.  Arra  voltunk  kíváncsiak,  hogy  a  különböző  művelési  módok,  ‐  mint  természetes  felújulás  illetve  mesterséges  felújítás ‐, illetve az újulat kora ‐ fiatal 1‐2 éves; középkorú 5‐6 éves és idős 8‐10 éves ‐ függvényében  hogyan  változik  az  adott  területen  a  hajtások  száma  (mint  táplálékkínálat),  illetve  a  vad  által  megrágott hajtások száma. Megállapítottuk, hogy a felújítás jellege és kora befolyásolja a növényevő  nagyvad  fajok  számára  elérhető  táplálékkínálatot  (csemetesűrűség  és  hajtásszám)  és  a  károsítás  mértékét (rágottság).   Jelenleg  a  szakirodalomban  fellelhető  különböző  módszerek  (MTA  ÖBKI  munkatársai  által  kidolgozott és használt módszer (Horváth, 2012); Nagy Istrázsa‐hegyi módszer (Varga, 2013); Vad  Világ  Megőrzési  Intézetben  kidolgozott  módszer  (Katona  és  mtsai.,  2007);stb.)  terepi  összehasonlítása, tesztelése és kalibrálása zajlik. Ebben a munkában szorosan együttműködünk más  tudományterületeket  képviselő  szakemberekkel  is,  akik  saját  módszerük  szerint  végzik  a  terepi  adatgyűjtést botanikai, dendrológiai, zoológiai, stb. szempontból. Az egyes módszerek vizsgálatakor  fontos  szempontok  a  ráfordított  idő  igény,  az  ismételhetőség,  a  gyakorlati  alkalmazhatóság,  stb.  Mivel  a  terepi  adatgyűjtési  munka  alapját  a  mintaterület‐  és  mintavételi  egység  kijelölése  képezi,  reális  cél,  hogy  ebben  olyan  módszert  dolgozzunk  ki,  ami  minden  érintett  szakterület  számára  elfogadható, összehasonlíthatóvá téve ily módon a különböző szempontok szerint gyűjtött adatokat. 

Eredmények Előzetes terepi vizsgálataink eredménye A  Mátrában  végzett  felmérés  adatait  értékelve  statisztikailag  kimutathatóan  több  bükk  csemetét  találtunk  a  természetes  felújítás  alá  vont  területeken,  mint  a  mesterségeseken  (Mann‐ Whitney U‐teszt: p<0,01) (1. ábra). 

Bükk csemetesűrűség (db/ ha+SD)

14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

természetes mesterséges természetes mesterséges természetes mesterséges 1 éves

5 éves

10 éves

1. ábra: Bükk (Fagus sylvatica) Csemete sűrűség 

66 

A  legtöbb  esetben  a  természetes  felújítás  alá  vont  területeken  jelentősen  több  lehetséges  táplálékul szolgáló bükk hajtás volt elérhető, mint a mesterségeseken (kivéve az 5 évesnél nyáron és  télen)  (Mann‐Whitney  U‐teszt:  p<0,05)  (2.  ábra).  Szintén  az  elképzeléseinknek  megfelelően  a  bükk  hajtások elérhetősége a felújítás korával szignifikánsan növekedett (Kruskal‐Wallis‐teszt: p<0,001). 

Elérhető bükk hajtások (1000 db/ ha+SD)

10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

természetes mesterséges természetes mesterséges természetes mesterséges 1 éves

5 éves

10 éves

2. ábra: Bükk (Fagus sylvatica) Hajtáskínálat 

Hajtások aránya a kínálatban

100%

80%

60% Acer spp. Salix caprea Quercus cerris Quercus petraea Populus spp. Pinus spp. Carpinus betulus Rubus spp. Fagus sylvatica

40%

20%

0%

természetes mesterséges természetes mesterséges természetes mesterséges 1 éves

5 éves

10 éves

3. ábra: Hajtáskínálat faji megoszlása 

A  bükk  mellett  elérhető  alternatív  táplálékforrások  aránya  azonban  nem  felelt  meg  alaphipotézisünknek.  A  mesterséges  felújításokban  ugyanis  ezek  részaránya  magasabb  volt,  mint  a  természetes felújításokban (3. ábra).   

67 

A  korábbi  eredményekre  alapozva  saját  vizsgálatainkban  is  kisebb  rágottságot  vártunk  a  fő  fafajon,  azokon  a  természetes  felújítás  alatt  álló  területrészeken,  ahol  várakozásaink  szerint  változatosabb  cserje  vegetáció  lehet.  Bár  a  mesterséges  területrészeken  volt  változatosabb  a  cserjeszint,  és  összességében  nem  mutatott  a  faji  változatosság  szoros  összefüggést  a  főfafaj  rágottságának  mértékével,  ám  a  legmagasabb  rágottsági  értékeket  (>20%)  mégis  csak  azokon  a  területrészeken találtunk, ahol az egyéb fásszárú fajok aránya alacsony volt (<10%) (5. ábra).  60%

Rágott bükk hajtások aránya

50%

40%

30%

20%

10%

0%

természetes mesterséges természetes mesterséges természetes mesterséges 1 éves

5 éves

10 éves

4. ábra: Bükk (Fagus sylvatica) rágott hajtások száma a különböző mintaterületeken  60%

Rágott bükk hajtások aránya

50% frissen rágott bükk hajtás összes rágott bükk hajtás

40%

30%

20%

10%

0% 0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Elérhető bükk hajtások aránya a kínálatban

5. ábra: Kapcsolat az egyéb fásszárúak (mint alternatív táplálékforrás) előfordulási gyakorisága és a  célállomány (bükk) rágottsága között 

68 

Egyéb eredmények Bár még csak a munka legelején járunk, eddigi eredményként számolhatunk be arról is, hogy  elkészítettünk egy Vadjel‐határozó kiadványt, amely a közeljövőben jelenik meg a Vadvilág Megőrzési  Intézet  gondozásában,  továbbá  előkészítés  alatt  van  ennek  folytatásaként  a  Vadhatás‐mérésének  Módszertana című terepi útmutatója is. 

Összefoglalás A  hazai  erdei  életközösségek  jövőbeni  kezelési  terveit  el  kell  készíteni.  Ehhez  támogatást  nyújt  a  „Sustainable  Conservation  on  Hungarian  Natura  2000  Sites”  elnevezésű,  SH/4/8  kódszámú  Svájci  ‐  Magyar  Együttműködési  Program  által  támogatott  kutatássorozat.  A  kezelési  tervben  figyelemmel kell lenni arra, hogy mind nemzetközileg, mind hazánkban egyre fokozódóbb igény van a  természetes  erdőállapothoz  közelítő,  folyamatos  erdőborítás  mellett  végzett  erdőművelésre,  az  ún.  szálaló  vágásra  történő  átállásra.  Számos  más  publikációhoz  hasonlóan  saját  eredményeink  is  arra  engednek  következtetni,  hogy  a  jelenleg  alkalmazott,  ún.  vágásos  erdőműveléskor  viszonylag  nagy  területen  kialakuló,  egykorú  erdőállományok  között  a  kortól  illetve  a  felújítás  módjától  függően  jelentős  különbség  mérhető  a  kínálatban  és  a  rágottságban  is.  Ez  is  alátámasztja,  hogy  az  erdő  szempontjából szerencsésebb volna a természetes erdőképre való törekvés, ahol nincsenek egykorú,  alacsony faji diverzitású területek, hanem az egész területre kiterjedően vegyes korúság a jellemző,  ráadásul magasabb a faji változatosság is. 

Irodalomjegyzék Bartha, P. (2000): Erdőgazdálkodás a XXI. század küszöbén. Erdészeti Lapok, CXXXV. 12:357‐358.  Bleier, N., Hajdú M. és Szemethy, L. (2010): Gondolatok a vadkárról, vadlétszámról, Erdészeti Lapok,  CXLV. 12:416‐417.  Davies, O. and Kerr, G. (2011): The costs and revenues of transformation   tocontinuous  cover  forestry: Modelling silvicultural options with Sitka spruce, The Research Agency of the Forestry  Commission, pp. 1‐63  Csányi,  S.  és  Lehoczki,  R.  (2010):  Ungulates  and  their  management  in  Hungary.  In:  Apollonio  M,  Andersen R, Putman R (eds) European Ungulates and their Management in the 21st Century,  Cambridge University Press, Cambridge, pp. 291‐318  Festa‐Bianchet,  M.  (2007):  Density  dependence  in  deer  populations:  relevance  for  management  in  variable   environments. In: Fulbright, T.E., Hewit D.G.:  Wildlife Science, CRC Press. p. 384  Frank,  T.  (szerk.)  (2000):  Természet  Erdő  Gazdálkodás,  Magyar  Madártani  És  Természetvédelmi  Egyesület és Pro Silva Hungária Egyesület, Eger, p.13‐214   Gamborg,  C.,  and  Bo  Larsen,  J  (2003):  ‘Back  to  nature’  ‐  a  sustainable  future  for  forestry?,  Forest  Ecology and Management 179:559–571  Gill, R.M.A., and Beardall, V. (2001): The impact of deer on woodlands: the effects   of  browsing  and seed    dispersal on vegetation structure and composition. Forestry 74:   200‐ 220  Horváth, F. (2012): Módszertani fejlesztések az erdőrezervátumok hosszú távú faállomány‐szerkezeti  kutatásához. Doktori értekezés. 

69 

Jensen, A. M., Götmark, F. and Löf, M. (2012): Shrubs protect oak seedlings   against  ungulate  browsing in temperate broadleaved forests of   conservation  interest:  A  field  experiment,  Forest Ecology and Management, 266:187–193  Katona, K., Szemethy, L., Hajdu M. és Csépányi P. (2009): A folyamatos erdőborítás és a vadállomány  harmonikus kapcsolata a Pilis‐tető bükköseiben. Erdészeti Lapok, CXLIV (7‐8): 240‐242.  Katona, K., Szemethy L., Nyeste M., Fodor Á., Székely J., Bleier N., Kovács V., Olajos T., Terhes A. és  Demes  T.  (2007):  A  hazai  erdők  cserjeszintjének  szerepe  a  nagyvad‐erdő  kapcsolatok  alakulásában, Természetvédelmi Közlemények 13:119‐126,   Katona,  K.,  Szemethy,  L.,  Csányi  S.  (2011):  Forest  management  practices  and  forest  sensitivity  to  game damage in Hungary. Hungarian Agricultural Research, 20(1): 12‐16.  Mátrai,  K.  és  Kabai,  P.  (1989):  Winter  plant  selection  by  red  and  roe  deer  in  a  forest  habitat  in  Hungary. Acta Theriologica, 34: 227‐234.  Mátrai, K. és Szemethy, L. (2000): A gímszarvas szezonális táplálékának jellegzetességei Magyarország  különböző élőhelyein. Vadbiológia, 7: 1‐9.  Mátrai, K., Szemethy, L., Tóth, P., Katona, K. és Székely, J. (2004): Resource use by red deer in lowland  nonnative forests, Hungary. Journal of Wildlife Management, 68: 879‐888.  Miller,  K.  V.  and  Ozoga,  J.  J.  (1997):  Density  effects  on  deer  sociobiology,  in  McShee,  W.  J.,  Underwood,  B.,  H.  and  Rappole,  J.  H.:  The  science  of  overabundance  ‐  Deer  ecology  and  population management, Smithsonian Books, Washington and London. p. 136‐151.   Moser, B., Schütz, M. and Hindenlang, K. E. (2006): Importance of alternative food   resources  for  browsing  by  roe  deer  on  deciduous  trees:  The  role  of  food  availability  and  species  quality,  Forest Ecology and Management, 226:248–255  Náhlik,  A.  (1998):  Vadkárok  az  erdőgazdaságban  ‐  a  vadrágás  és  vadkár  összefüggései.  Erdészeti  Lapok, CXXXIII/2:49‐50.  Náhlik,  A.,  Borkowski,  J.,  Tóth,  R.  és  Nacsa,  J.  (2002):  A  gímszarvas  téli  táplálékfelvételének  néhány  jellemzője. Vadbiológia, 9: 10‐17.  Olajos,  T.  (2004):  A  gímszarvas  (Cervus  elaphus  hippelaphus)  táplálkozásának  vizsgálata  a  Felsőtárkányi Erdészetnél, Diplomadolgozat, Szent István Egyetem, VMI, Gödöllő, p 39.  Putman,  R.J.,  Moore,  N.P.  (1998):  Impact  of  deer  in  lowland  Britain  on  agriculture,  forestry  and  conservation   habitats. Mammal Review, 28:141–164.  Reimoser, F., Gossow, H. (1996): Impact of ungulates on forest vegetation and its dependence on the   silvicultural system, Forest Ecology and Management 88:107‐119.  Somogyi,  Z.,  Bartha,  D.,  Borovics,  A  és  Csóka,  Gy.  (2003):  Erdő  nélkül?,  in    Nemes  Cs.  (szerk.)  Környezet  és  Társadalom  XXI.  századi  Forgatókönyvek,  L'Harmattan,  Budapest,  2.  változatlan  kiadás, p. 8‐143  Standovár,  T.  and  Gálhidy,  L.  (2003):  Natural  regeneration  of  beech  forests  in  Europe  ‐  Hungary:  Approaches,  problems,  recent  advances  and  recommentadions,  Prepared  by  members  of  Work‐Package  3  in  the  Nat‐Man  Project  (Nature‐based  Management  of  Beech  in  Europe)  funded by the European Community 5th Framework Programme, pp. 1‐9  Szemethy, L., Mátrai, K., Katona, K és Orosz, Sz. (2003): Seasonal home range shift of red deer hinds  Cervus elaphus: are there feeding reasons? Folia Zoologica 52(3): 249‐258.  Szemethy  L.,  Katona  K.,  Székely  J.,  Bleier  N.,  Nyeste  M.,  Kovács  V.,  Olajos  T.  és  Terhes  A.  (2004):  A  cserjeszint  táplálékkínálatának  és  rágottságának  vizsgálata  különböző  erdei  élőhelyeken,  Vadbiológia, 11., Gödöllő 

70 

Varga,  R.  (2013):    Kínálat  és  vadrágás  módszertani  vizsgálata  a  Nagy  Istrázsa‐hegyi  Erdőrezervátumban, Szakdolgozat, SZIE‐MKK VMI, Gödöllő 

Közlésre elfogadott, illetve megjelent válogatott publikációk jegyzéke Hejel, P., Katona, K., Békési, Sz. és Szemethy, L. (2013): Food Supply and Browsing Effect  on Beech  Regeneration  Sites  in  Mátra,  Proceedings  of  SCIENCE  FOR  SUSTAINABILITY  International  Scientific  Conference for PhD Students, University of West Hungary, Győr, March 19‐20, 2013, p.275  Hejel,  P.,  Katona,  K.,  Szemethy,  L.  és  Békési,  Sz.  (2012:  Ungulate  impact  on  different  beech  regeneration  sites,  Proceedings  of    “SCIENCE  FOR  RURAL  AREAS”  XI.  Wellmann  International  Scientific Conference, 10th May, 2012, Hódmezővásárhely   Mindkét  publikáció  nemzetközi  szakmai  konferencián  hangzott  el  és  azok  anyaga  teljes  terjedelemben megjelent a konferenciák hivatalos kiadványában is. 

71 

Név:  

Kovács Levente 

Kezdés éve: 

2010 

Képzés formája:  

nappali tagozatos 

Témavezető: 

Tőzsér János 

Társ‐témavezető: 

Jurkovich Viktor 

Intézet, Tanszék: 

Állattenyésztés‐tudományi Intézet 

Elérhetőség: 

+3630 944 3990   [email protected] 

Egészséges és sánta holstein‐fríz tehenek szívritmusa és szívritmus‐varianciája fejés során A téma aktualitása, jelentősége A  sántaság  fertőző  betegségek  vagy  sérülések  következtében  kialakult  mozgásszervi  betegség,  amely  tejelő  tehenészetekben  a  tőgygyulladás  és  a  szaporodásbiológiai  zavarok  után  a  harmadik  legjelentősebb  veszteségforrás  (Jurkovich  és  mtsai,  2007).  A sánta tehén kevésbé képes a környezethez alkalmazkodni, ugyanis a fájdalom súlyosan korlátozza mozgását, egyéb mozdulatait és aktivitását (O’Callaghan  és  mtsai,  2003). Ezek az állatok kevesebb időt töltenek evéssel,  többet  fekszenek (Chapinal és mtsai, 2009) és hátrébb szorulnak a rangsorban (Galindo és Broom, 2002).  A  krónikus  stressz  következtében  viselkedésük  rendellenessé  válik,  takarmányfogyasztásuk  csökken,  egészségi  állapotuk  és  szaporodásbiológiai  mutatóik  romlanak,  csökken  a  kondíció  és  a  tejtermelés (González és mtsai, 2008).  Háziállatfajokban  egyes  stresszhormonok  és  metabolikus  vérparaméterek  vérbeli  koncentrációjának meghatározása évtizedek óta elfogadott a stressz kimutatására (von Borell, 2001;  Möstl  és  Palme,  2002).  E  módszerekkel  azonban  nem  lehetséges  a  folyamatos  és  hosszú  távú  adatgyűjtés. A vegetatív idegrendszer két ágának aktivitását párhuzamosan meghatározó szívritmus‐ variancia (heart rate variability, HRV) vizsgálatával e nehézség áthidalható (von Borell és mtsai, 2007;  Kovács  és  mtsai,  2012b).  Ennek  is  köszönhetően  az  utóbbi  években  egyre  több  tanulmány  látott  napvilágot  Európában  és  a  tengerentúlon  is,  amelyek  a  HRV  stresszindikátorként  való  alkalmazhatóságát kutatják tejelő teheneken (pl. Hopster és mtsai, 1998; Mohr és mtsai, 2002; Hagen  és mtsai, 2005; Kovács és mtsai, 2012a).  Tejelő  szarvasmarhák  szívműködését  legtöbbször  betegségekkel,  valamint  az  egyedek  viselkedésével  és  technológiával  szembeni  tűrőképességével  összefüggésben  vizsgálták.  Több  vizsgálatban  is  használták  a  HRV  mutatóit  a  technológia  bizonyos  fájdalommal,  ill.  mentális  stressz‐ terheléssel  járó  elemeinek  –  szarvtalanítás,  ivartalanítás,  választás  –  borjak  vegetatív  idegrendszeri  működésére kifejtett hatásainak vizsgálatára (Stewart és mtsai, 2008; Stewart és mtsai, 2010). A fejés  alatti HRV‐mutatók változását ez idáig csak három szerző közölte (Hagen és mtsai, 2005; Neuffer és  mtsai,  2006;  Gygax  és  mtsai,  2008).  Ezekben  a  vizsgálatokban  főként  a  fejési  technológiákat 

72 

hasonlították  össze  (különböző  típusú  robotizált,  ill.  hagyományos,  halszálkás  elrendezésű  fejőállások),  azonban  nem  találtak  köztük  állatjólléti  szempontból  jelentős  különbségeket.  A  fejés  folyamatának különböző szakaszait nem különítették el, csak a fejés alatti, illetve a nyugalmi HR‐ és  HRV‐értékek közötti változást értékelték.   A  krónikus  stressz  vegetatív  idegrendszeri  vonatkozásainak  vizsgálatára  tejelő  teheneken  eddig kevés törekvés irányult (Pomfrett és mtsai, 2004; Konold és mtsai, 2011). Ezek a vizsgálatok a  szivacsos  agyvelőgyulladás  (bovine  spongiform  enchepalopathy,  BSE)  HRV‐re  kifejtett  hatásait  értékelték. Nem vizsgálták azonban a produkciós betegségek következményeként krónikus stressznek  kitett állatok akut stresszorokra adott viselkedési és élettani válaszait sem. 

Célkitűzések Vizsgálataink során igyekeztünk  1. a sánta és egészséges tehenek rövid távú technológiai stresszre (hagyományos fejőházi fejés)  adott HRV‐ben mérhető vegetatív idegrendszeri válaszait összehasonlítani  2. megállapítani,  hogy  e  különbségek  a  fejés  folyamatának  mely  időszakaiban  a  legkifejezettebbek  3. a sánta és egészséges állatok viselkedését (lépésszám) a fejés különböző fázisaiban a HRV‐vel  párhuzamosan összehasonlítani 

Módszerek A vizsgálati állatok és a kutatás helyszíne Vizsgálatainkat  egy  nagyüzemi,  tejtermelő  tehenészetben  végeztük  holstein‐fríz  teheneken,  2012  őszén,  november  és  december  hónapokban,  így  az  emelkedett  környezeti  hőmérséklet  szívműködésre kifejtett esetleges hatásai nem befolyásolhatták az eredményeket.  Az  állatokat  csoportos,  kötetlen,  mélyalmos  rendszerű,  könnyűszerkezetes,  350  férőhelyes,  pihenőboxos  istállókban  tartják.  A  takarmányozás  tömegtakarmányra  épül,  az  állatok  teljes  takarmánykeveréket  kapnak.  A  Boumatic  fejőberendezés  2×24  férőhelyes,  gyors  kiengedővel  és  kehelyleemelő automatával van felszerelve. A fejőállások párhuzamos elrendezésűek.   

73 

A vizsgálati állatokat olyan termelési csoportokból válogattuk, amelyeket időben közel fejtek  egymáshoz (5:30 és 7:00, illetve 17:00 és 18:30 között). A vizsgálati napokon, a 800 fejt tehén közül  kiválasztottunk  7–10  egyedet  (laktációs  tejtermelés:  35±2,5  kg  laktáció  napja:  150±30  életkor:  2–5  év),  amelyek  az  egyes  vizsgálati  napokon  hozzávetőlegesen  fele‐fele  arányban  voltak  sánták  és  egészségesek. Az állatokat mozgásképük alapján különböztettük meg 1–5 pontos skálán az alábbiak  szerint (1. táblázat).  1. táblázat: A sántaság mértékének vizuális meghatározása (Jurkovich és mtsai, 2007)  Pontszám 

Jellemzők 

1: egészséges 

A tehén hátvonala állás és járás közben is egyenes 

2: enyhén sánta 

A tehén hátvonala állás közben egyenes, járás közben enyhén hajlott 

3: közepesen sánta 

A hátvonal állás és járás közben is hajlott, az állat egy vagy több lábával rövidet lép 

4: sánta 

A hátvonal állás és járás közben is hajlott, az egyik (vagy több) lábát kevésbé terheli 

5: súlyosan sánta 

A hátvonal állás és járás közben is hajlott, az egyik (vagy több) láb nagyon fájdalmas,  az állat nem szívesen (esetenként egyáltalán nem) terheli 

A vizsgálatba vont állatokat a fenti pontrendszer alapján két csoportra osztottuk. Az 1‐es és  2‐es  mozgásképű  állatokat  az  egészséges  (n=24),  míg  a  3‐as,  4‐es  és  5‐ös  mozgásképű  állatokat  a  sánta (n=28) kategóriába soroltuk. A sántaság mértékét két alkalommal is meghatároztuk. Először az  állatok  kiválogatásakor,  majd  a  műszerek  rögzítése  után,  az  inszemináló  állásokból  az  istállóba  történő visszaengedéskor is.  

Az adatgyűjtés módszere Az  EKG  RR  távolságainak  rögzítését  Polar  Equine®  (Polar  Electro  Oy,  Finnország)  RS800  CX  műszerekkel  végeztük.  A  Polar  cég  műszereit  tejelő  szarvasmarhákon  végzett  viselkedés‐élettani  kutatásokban  több  szerző  is  használta  (Kovács  és  mtsai,  2012b).  A  készülékek  két  elektródát  tartalmazó hámból, egy jeladóból és egy vevőkészülékből állnak.  Az  állatokat  8:00  és  9:00  óra  között  válogattuk  ki  és  az  istállóból  inszemináló  állásokba  tereltük,  ahol  a  jeladót  és  az  elektródahámot  saját  tervezésű  hevederekkel  rögzítettük  rajtuk.  Az  egyik  elektródát  szívtájékon,  a  másikat  a  jobb  lapocka  fölött  helyeztük  el.  A  megfelelő  vezetőképesség és az elektródák testfelszínhez való tapadása miatt az elektródákat elektróda‐géllel  kentük be a felhelyezés előtt. A HR‐mérő órákat kívülről erősítettük a hevederekhez (1. kép). 

74 

1. kép: A vizsgálati állatok az adatfelvétel megkezdése előtt 

A műszerekhez való hozzászokási időszakot korábbi vizsgálataink és mások (Mohr és mtsai.,  2002; Stewart és mtsai., 2008) ajánlása alapján, 1 órában határoztuk meg. Amikor az összes vizsgálati  állat a nyugodt viselkedés jeleit mutatta, a termelőistállókba engedtük őket (2‐3. kép). 

2‐3. kép: Az állatok testhelyzetét és aktivitási szintjeit az egész nap során rögzítettük 

Az adatfelvételt 10:00 és 11:00 között kezdtük meg és az esti fejés utáni 60. percig folytattuk  (18:30–20:00 óra), ekkor az állatokról az inszemináló állásokban eltávolítottuk a műszereket.   

75 

Szívritmus‐elemzés és viselkedésvizsgálatok A fejés közbeni viselkedést és a fejés különböző szakaszait a HR vevőkészülékekkel szinkronba  hozott digitális videokamerák (Canon Legria HF M36) videofelvételei, illetve vizuális megfigyeléseink  alapján különítettük el az alábbiak szerint (2. táblázat).  2. táblázat: A fejés során értékelt szakaszok  Fejés fázisa 

Meghatározás 

Fejés  előkészítés 

A fejőállás elfoglalása és a fejőkelyhek felhelyezése között eltelt idő 

A fejés 1. perce 

A fejőkelyhek felhelyezése után számított 1 perc 

Fő fejési idő  

A fejőkelyhek felhelyezése utáni 1. perctől és az utolsó fejőkehely levétele előtti 1. perc  között eltelt idő 

A  fejés  utolsó  A fejőkelyhek levétele előtti 1 perces időtartam  perce  Várakozás 

Az utolsó fejőkehely levétele és a fejőállás elhagyása között eltelt idő 

A HR adatok elemzését a Kubios 2.0 HRV szoftverrel végeztük (Niskanen és mtsai, 2004). Az  elemzéshez  korábbi  vizsgálatokban  is  alkalmazott  módszereket  használtunk  (idő‐  és  frekvenciatartományban  való  elemzés,  Poincaré  grafikon,  1.  ábra).  Az  elemzés  során  az  alábbi  paramétereket határoztuk meg (3. táblázat).  3. táblázat: A vizsgálatban számított HRV paraméterek 

1 2

Elemző  módszer 

Paraméter 

Meghatározás 

Idegrendszeri  aktivitás 

Időtartományban 

HR (min‐1) 

A percenkénti szívverések száma 

SNS1 

 

RMSSD (ms)  

Az  egymást  követő  RR  különbségének négyzetgyöke 

Frekvencia‐ tartományban 

HFnorm 

A  magasfrekvenciás  komponens  normalizált  PNS  értéke 

 

LFnorm 

Az  alacsonyfrekvenciás  normalizált értéke 

 

LF/HF arány 

Az  alacsony‐  és  komponensek aránya 

Poincaré  grafikon  

SD1 (ms) 

Az  egymást  követő  RR  távolságok  átlóra  PNS  merőleges szórása (1. ábra) 

 

SD2 (ms) 

Az  egymást  követő  RR  távolságok  átlóval  SNS  párhuzamos szórása (1. ábra) 

 

SD2/SD1 

Az SD2 és az SD1 értékek hányadosa 

szimpatikus idegrendszer (sympathetic nervous system)  paraszimpatikus idegrendszer (parasympathetic nervous system) 

 

76 

távolságok  PNS2 

komponens  SNS 

magasfrekvenciás  Szimpato‐vagális  egyensúly 

Szimpato‐vagális  egyensúly 

A  vizsgálatban  számított  HRV  mutatók  élettani  hátteréről  és  stressz‐vizsgálatokban  való  alkalmazhatóságáról bővebben irodalmi összefoglaló tanulmányokban olvashatnak (Task Force, 1996;  von Borell és mtsai, 2007; Kovács és mtsai, 2012a).  Az állatok lépésszámát (lépés/perc) más szerzőkhöz hasonlóan (Wenzel és mtsai, 2003; Gygax  és  mtsai,  2008)  határoztuk  meg  a  fejés  főbb  fázisai  során  (fejés  előkészítés,  fő  fejési  időszak,  fejés  utáni  várakozás  a  fejőállásban).  Azok  a  lépések  nem  kerültek  feljegyzésre,  amelyek  a  szomszédos  fejőállásban fejt tehén általi lökésekből adódtak.   Az adatok statisztikai kiértékelését az SPSS 18.0 programcsomaggal végeztük. A  csoportok  varianciájának  egyezőségét  Levene’s  teszttel  vizsgáltuk.  Ez  alapján  a  sánta  és  egészséges  állatok  szívműködési  értékeinek  és  a  fejés  folyamatának  különböző  fázisaiban  mutatott  viselkedésének  összehasonlítását paraméterenként külön‐külön Mann‐Whitney teszttel végeztük. 

Eredmények A sánta és egészséges állatok szívműködési paramétereinek és fejés közbeni lépésszámának  összehasonlító statisztikai értékelését a fejési folyamat főbb időszakaiban (fejés előkészítés, fő fejési  időszak, fejés utáni várakozás a fejőállásban) a 4‐6. táblázatok mutatják be.  A  fejés  első  percében  a  HR,  illetve  a  HRV  rövid‐távú  paraméterei  (RMSSD,  SD1)  nagyobbak  voltak sánta tehenek esetében, mint egészségeseknél (P<0,05). A frekvenciatartományban számított  mutatókban  nem  adódott  eltérés  a  két  csoport  között.  A  fejés  utolsó  percében  nem  volt  érdemi  különbség egy szívműködési mutató esetében sem.  A lépésszámok sem a fejés első, sem a fejés utolsó percében nem különböztek statisztikailag  igazolhatóan a két csoport között. 

77 

4. táblázat: A HRV paraméterek és a lépésszám‐értékek (átlag±szórás) a fejés előkészítési szakaszában  Egészségi  állapot 

HR  (min‐1) 

RMSSD  (ms) 

LFnorm 

HFnorm 

LF/HF 

SD1  (ms) 

SD2  (ms) 

SD2/SD1 

lépésszám   (min‐1) 

sánta  (n=24) 

103±9,57 

50,27±38,44 

85,33±15,21 

30,49±16,14 

10,20±7,17 

35,62±29,22 

127,67±89,34 

8,02±4,92 

5,94±4,23 

egészséges  (n=28) 

91,78±11,58 

24,06±12,35 

69,51±25,03 

14,70±12,32 

17,79±12 

17,09±14,62 

94,34±45,76 

5,32±4,67 

5,36±3,45 

U‐érték 

103 

91 

114 

114 

118 

91 

115 

110 

164,5 

P‐érték 

0,026 

0,009 

NS. 

NS. 

NS. 

0,009 

NS. 

0,045 

NS. 

Alkalmazott statisztika: Mann‐Whitney teszt; NS = nem szignifikáns (P>0,05) 

5. táblázat: A HRV paraméterek és a lépésszám‐értékek (átlag ± szórás) a fő fejési időszakban  Egészségi  állapot 

HR  (min‐1) 

RMSSD  (ms) 

LFnorm 

HFnorm 

LF/HF 

SD1  (ms) 

SD2  (ms) 

SD2/SD1 

lépésszám   (min‐1) 

sánta  (n=24) 

99,40±17,18 

42,63±23,49 

76,07±23,49 

23,93±23,49 

11,93±14,35 

30,21±20,86 

119,37±176,15 

5,61±3,85 

11,00±8,96 

egészséges  (n=28) 

86,76±7,19 

9,98±8,53 

88,16±16,13 

11,83±6,13 

18,03±6,13 

7,18±5,67 

34,17±26,72 

6,81±2,45 

5,86±3,67 

U‐érték 

103 

101 

102 

102 

102 

101 

103 

120 

103 

P‐érték 

0,048 

0,040 

0,044 

0,044 

0,044 

0,040 

0,047 

NS. 

0,031 

Alkalmazott statisztika: Mann‐Whitney teszt; NS = nem szignifikáns (P>0,05) 

78 

6. táblázat: A HRV paraméterek és a lépésszám‐értékek (átlag ± szórás) a fejés utáni várakozás során  Egészségi  állapot 

HR  (min‐1) 

RMSSD  (ms) 

LFnorm 

HFnorm 

LF/HF 

SD1  (ms) 

SD2  (ms) 

SD2/SD1 

lépésszám   (min‐1) 

sánta  (n=24) 

94,78±15,32 

45,16±35,63 

66,35±28,41 

33,65±28,41 

14,20±26,32 

32,01±25,22 

110,20±104,21 

5,58±4,32 

1,92±2,86 

egészséges  (n=28) 

85,04±7,44 

19,60±16,82 

78,21±24,52 

21,79±24,52 

9,66±7,70 

13,89±11,92 

55,98±50,54 

5,81±3,37 

1,07±1,02 

U‐érték 

88 

88 

111 

111 

111 

88 

99 

134 

119 

P‐érték 

0,039 

0,039 

NS. 

NS. 

NS. 

0,039 

NS. 

NS. 

NS. 

Alkalmazott statisztika: Mann‐Whitney teszt; NS = nem szignifikáns (P>0,05) 

 

79 

A táblázatok alapján megállapítható, hogy a frekvencia‐tartományban számított paraméterek  (LFnorm,  HFnorm,  LF/HF)  a  fő  fejési  időszakban  mutattak  csak  érdemi  különbséget  a  sánta  és  az  egészséges  tehenek  vegetatív  idegrendszeri  aktivitása  között.  Ennek  oka  lehet,  hogy  a  spektrális  elemzést egyes ajánlások minimum 3 (Task Force, 1996), míg mások minimum 5 (von Borell és mtsai,  2007)  perces  időintervallumok  esetén  tartják  megbízhatónak.  Vizsgálatunkban  a  fejés  előkészítés  hossza 80±47 másodperc, míg a fejőállásban való várakozás145±135 másodperc volt (átlag±szórás).  Az e fázisokban számított spektrális HRV mutatók – korábbi vizsgálatunktól eltérően (Kovács és mtsai,  2012a) nem jelezték pontosan az állatok vegetatív idegrendszeri állapotát. Megoldás lehetett volna,  hogy  csak  a  3  percnél  hosszabb  előkészítési,  illetve  várakozási  idővel  rendelkező  tehenek  adatait  elemezzük,  azonban  ezek  kis  száma  52  vizsgálati  állat  esetén  nem  lett  volna  elégséges  a  teljes  adatelemzéshez.  E  különbségek  azonban  a  fejés  rövidebb  szakaszai  alatt  (előkészítés,  fejés  utáni  várakozás,  fejés  első  perce)  statisztikailag  is  alátámaszthatóak  voltak  az  időtartományban  számított  és  a  Poincaré  paraméterekkel.  A  két  csoport  közötti  legnagyobb  eltérést  a  fő  fejési  időszakban  tapasztaltuk,  ahol  egy  HRV  paramétert  leszámítva  minden  mutató  nagyobb  paraszimpatikus  idegrendszeri aktivitást reprezentált a sánta teheneknél az egészséges állatokhoz viszonyítva.  Eredményeink  magyarázata  a  sánta  teheneket  az  elővárakozóban  ért  korábbi  nagyobb  mértékű  stressz  lehet.  A  vizsgálatunkba  vont  sánta  tehenek  ugyanis  több  időt  töltöttek  az  elővárakozóban,  mint  egészséges  társaik  (22,3±12,5  perc  vs.  9,2±6,4  perc),  amelynek  oka,  hogy  a  felhajtás során rosszabb mozgási képességük miatt a sorban hátrébb szorultak. A hosszabb ideig tartó  zsúfolódás  után  –  a  fejőházban  –  a  szimpato‐paraszimpatikus  egyensúly  helyreállása  során  a  paraszimpatikus tónus kompenzáló aktivitása feltehetően jobban érvényesült a sánta teheneknél. E  feltételezések  igazolására  azonban  az  elővárakozóban  mért  stressz‐szint  csoportonkénti  meghatározása  és  változásának  elemzése  lenne  szükséges  az  elővárakozóba,  illetve  a  fejőházba  történő belépés közötti időszakban. Mindez további tereink között szerepel. 

Összefoglalás Vizsgálatunkban  egészséges  (mozgáskép  pont:  1–2,  n=28)  és  sánta  (mozgáskép  pont:  3–5,  n=24)  tejelő  Holstein‐fríz  tehenek  szívritmusát  (heart  rate,  HR),  szívritmus‐variancia  (heart  rate  variability, HRV) paramétereit és viselkedését (lépésszám‐értékeit) hasonlítottuk össze hagyományos  fejőházi fejés során. A fejés közbeni lépésszám és a HR adatok felvétele az esti fejés során történt. Az  idő‐  (HR,  RMSSD)  és  frekvencia‐tartományban  (LF,  HF,  LF/HF  arány)  számított,  illetve  a  Poincaré  paramétereket  a  fejés  különböző  fázisaiban  számítottuk  ki:  előkészítési  fázis,  a  fejés  első  perce,  fő  fejési időszak, a fejés utolsó perce és a fejőkehely levételétől a fejőállás elhagyásáig eltelt várakozás  időszaka. A sánta tehenek rövid‐távú HRV értékei (HR, RMSSD, SD1, SD2/SD1) – az SD2‐t leszámítva –  nagyobbak  voltak  a  fejés  előkészítő  szakaszában,  mint  az  egészséges  ugyanezen  mutatói  (P=0,026;  P=0,009;  P=0,009;  P=0,045,  sorrendben).  A  fejés  első  percében  a  HR,  az  RMSSD  és  az  SD1  paraméterekben  adódott  hasonló  különbség  (P=0,016;  P=0,042;  P=0,039,  sorrendben).  A  fő  fejés  alatt az SD2/SD1 paramétert leszámítva minden HRV paraméterben (HR, RMSSD, LF, HF, LF/HF, SD1,  SD2) érdemi elérést tapasztaltunk (P=0,048; P=0,040; P=0,044; P=0,044; P=0,044; P=0,040; P=0,047,  sorrendben). A fő fejési időszak során regisztrált lépések száma szintén különbözött az egészséges és  a sánta tehenek között (P=0,031). Nem adódott azonban különbség a fejés utolsó percében sem HRV‐ ben  sem  a  lépésszámokat  tekintve.  A  fejés  utáni  várakozás  szakaszában  a  HR,  az  RMSSD  és  az  SD1 

80

mutatók  nagyobbak  voltak  a  sánta  állatoknál  egészséges  társaikhoz  viszonyítva  (P=0,039;  P=0,039;  P=0,039,  sorrendben).  A  sánta  és  egészséges  tehenek  vegetatív  idegrendszeri  működésében  a  frekvencia‐tartományban számított paraméterekkel (LFnorm, HFnorm, LF/HF) a fő fejési időszakban  tudtuk  csak  kimutatni  különbségeket.  E  különbségek  rövidebb  időtartamok  alatt  (előkészítés,  fejés  utáni várakozás, fejés első perce) kifejezettebbek voltak az időtartományban számított és a Poincaré  paraméterekkel.  A  két  csoport  közötti  legnagyobb  eltérést  a  fő  fejési  időszakban  tapasztaltuk,  ahol  egy  HRV  paramétert  leszámítva  minden  mutató  a  sánta  tehenek  nagyobb  paraszimpatikus  idegrendszeri  aktivitásról  tanúskodott  az  egészséges  állatokhoz  viszonyítva.  Eredményeink  magyarázata a sánta teheneket az elővárakozóban ért korábbi nagyobb mértékű stressz lehet. Ennek  igazolására az adatok további elemzése szükséges. 

Köszönetnyilvánítás A kutatás a TÁMOP 4.2.4.A/1‐11‐1‐2012‐0001 azonosító számú Nemzeti Kiválóság Program –  Hazai  hallgatói,  illetve  kutatói  személyi  támogatást  biztosító  rendszer  kidolgozása  és  működtetése  országos program című kiemelt projekt keretében zajlott. A projekt az Európai Unió támogatásával,  az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósul meg. 

Irodalomjegyzék Borell, von E. (2001): The biology of stress and its application to livestock housing and transportation  assessment. Journal of Animal Science 79:260‐267.  Borell, von E., Langbein, J., Després, G., Hansen, S., Leterrier, C., Marchant‐Forde, J., Marchant‐Forde,  R., Minero, M., Mohr, E., Prunier, A., Valance, D., Veissier, I. (2007): Heart rate variability as a  measure  of  autonomic  regulation  of  cardiac  activity  for  assessing  stress  and  welfare  in  farm  animals: a review. Physiology and Behavior 92:293‐316.  Chapinal,  N.,  Passille,  de  A.M.,  Weary,  D.M.,  Keyserlingk,  von  M.A.G.,  Rushen,  J.  (2009):  Using  gait  score, walking speed, and lying behavior to detect hoof lesions in dairy cows. Journal of Dairy  Science 92:4365‐4374.  Galindo, F., Broom, D.M. (2002): The  effects of lameness on social and individual behavior  of dairy  cows. Journal of Applied Animal Welfare Science 5:193‐201.  Gonzalez,  L.A.,  Tolkamp,  B.J.,  Coffey,  M.P.,  Ferret,  A.,  Kyriazakis,  I.  (2008):  Changes  in  feeding  behavior as possible indicators for the automatic monitoring of health disorders in dairy cows.  Journal of Dairy Science 91:1017‐1028.  Gygax,  L.,  Neuffer,  I.,  Kaufmann,  C.,  Hauser,  R.,  Wechsler,  B.  (2008):  Restlessness  behaviour,  heart  rate and heart‐rate variability of dairy cows milked in two types of automatic milking systems  and auto‐tandem milking parlours. Applied Animal Behaviour Science 109:167‐179.  Hagen,  K.,  Langbein,  J.,  Schmied,  C.,  Lexer,  D.,  Waiblinger,  S.  (2005):  Heart  rate  variability  in  dairy  cows – influences of breed and milking system. Physiology and Behavior 85:195‐204.  Hopster, H., Joop, T., Werf, van der J.T.N., Blokhuis, H.J. (1998): Side preference of dairy cows in the  milking  parlour  and  its  effects  on  behaviour  and  heart  rate  during  milking.  Applied  Animal  Behaviour Science 55:213‐229.  Jurkovich  V.,  Olaszy  K.,  Lehoczky  J.,  Könyves  L.,  Tirián  A.,  Brydl  E.  (2007):  Egyes  lábvégbetegségek  előfordulása tejhasznú tehenészetekben. Magyar Állatorvosok Lapja 129:468‐473.  Konold,  T.,  Bone,  G.E.  (2011):  Heart  rate  variability  analysis  in  sheep  affected  by  transmissible  spongiform encephalopathies. BMC Research Notes 4:539. 

81 

Kovács L., Nagy K., Kira, K., Szenci O., Tőzsér J. (2012a): Tejelő tehenek szívritmus‐változékonysága a  fejés körüli időszakban. Magyar Állatorvosok Lapja 134:653‐661.  Kovács L., Nagy K., Szelényi Z., Szenci O.,  Tőzsér J. (2012b): A szívritmus‐változékonyság elemzésének  biológiai  háttere,  módszertani  kérdései  és  eredményei  szarvasmarha  stresszvizsgálataiban  –  Irodalmi összefoglaló. Magyar Állatorvosok Lapja 134:515‐523.  Mohr, E., Langbein, J., Nürnberg, G. (2002): Heart rate variability: A noninvasive approach to measure  stress in calves and cows. Physiology and Behavior  75:251‐259.  Möstl, E., Palme, R. (2002): Hormones as indicators of stress. Domestic Animal Endocrinology 23:67‐ 74.  Neuffer,  I.  (2006):  Influence  of  automatic  milking  systems  on  behaviour  and  health  of  dairy  cows.  Thesis PhD, University of Hohenheim, Germany.  Niskanen, J.P., Tarvainen, M.P., Ranta‐aho, P.O., Karjalainen, P.A. (2004): Software for advanced HRV  analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine 76:73‐81.  O’Callaghan,  K.A.,  Cripps,  P.J.,  Downham  D.Y.,  Murray,  R.D.  (2003):  Subjective  and  objective  assessment of pain and discomfort due to lameness in dairy cattle. Anim. Welf. 12:605‐610.  Pomfrett, C.J.D., Glover, D.G., Bollen, B.G., Pollard, B.J. (2004): Perturbation of heart rate variability in  cattle fed BSE‐infected material. Veterinary Record 154:687‐691.  Porges,  S.W.  (1995):  Cardiac  vagal  tone:  a  physiological  index  of  stress.  Neuroscience  and  Biobehavioral Reviews 19:225‐233.  Stewart,  M.,  Stafford,  K.J.,  Dowling,  S.K.,  Schaefer,  A.L.,  Webster,  J.R.  (2008):  Eye  temperature  and  heart  rate  variability  of  calves  disbudded  with  or  without  local  anaesthetic.  Physiology  Behavior 93:789‐797.  Stewart, M., Verkerk, G.A., Stafford, K.J., Schaefer, A.L., Webster, J.R. (2010): Noninvasive assessment  of  autonomic  activity  for  evaluation  of  pain  in  calves,  using  surgical  castration  as  a  model.  Journal of Dairy Science 93:3602‐3609.  Task  Force  of  the  European  Society  of  Cardiology  and  the  North  American  Society  of  Pacing  and  Electrophysiology  (1996)  Heart  rate  variability:  Standards  of  measurement,  physiological  interpretation and clinical use. Circulation 93:1043‐1065.  Wenzel,  C.,  Schonreiter‐Fischer,  S.,  Unshelm,  J.  (2003):  Studies  on  step‐kick  behavior  and  stress  of  cows during milking in an automatic milking system. Livestock Production Science 83:237‐246. 

Közlésre elfogadott, illetve megjelent válogatott publikációk jegyzéke Kovács L., Nagy K., Szelényi Z., Szenci O.,  Tőzsér J. (2012): A szívritmus‐változékonyság elemzésének  biológiai  háttere,  módszertani  kérdései  és  eredményei  szarvasmarha  stresszvizsgálataiban  –  Irodalmi összefoglaló. Magyar Állatorvosok Lapja 134:515‐523.  Kovács L., Nagy K., Kira, K., Szenci O.,  Tőzsér J. (2012): Tejelő tehenek szívritmus‐változékonysága a  fejés körüli időszakban. Magyar Állatorvosok Lapja 134:653‐661.  Kovács L., Nagy K., Szenci O., Tőzsér J. (2013): Welfare assessment in dairy cattle by heart rate and  heart rate variability – Literature review and implications for future research. Animal. Közlésre  elfogadva.  Kovács,  L.,  Kézér,  L.,  Tőzsér,  J.  (2013):  Measuring  stress  level  of  dairy  cows  during  milking  using  by  geometric  indices  of  heart  rate  variability.  Scientific  Papers:  Animal  Sciences  and  Biotechnologies, 46. 1. Közlésre elfogadva. 

82 

Kovács L., Kézér L., Jurkovich, V., Nagy, K., Szenci, O., Tőzsér, J. (2013): Heart rate variability of high  producing  cows  in  a  parallel  milking  system.  Animal  Welfare,  Etológia  és  Tartástechnológia.  Közlésre elfogadva.  Kovács  L.,  Kézér  L.,  Tőzsér  J.  (2013):  Tejelő  tehenek  tanult  és  öröklött  viselkedési  formái,  technológiához  való  habituációja  és  érzelmei.  Animal  Welfare,  Etológia  és  Tartástechnológia.  Közlésre elfogadva.  Kovács,  L.,  Nagy  K.,  Szentléleki  A.,  Tőzsér  J.  (2012):  The  methodology  of  heart  rate  variability  measurement in dairy cattle. International Conference of Animal Breeding, Mendel University,  Brno.  Kovács, L., Jurkovich, V., Nagy, K., Szenci O., Tőzsér, J. (2013): Effects of milking procedure on heart  rate  and  heart  rate  variability  in  a  Hungarian  dairy  farm.  International  Conference  of  Animal  Breeding, Mendel University, Brno.  Kovács L., Nagy K., Szelényi Z., Szenci O., Tőzsér J. (2012): A szívritmus fejés körüli változékonysága  egy  intenzív  holstein‐fríz  tehenészetben.  A  Magyar  Buiatrikus  Társaság  XXII.  Nemzetközi  Kongresszusa. Kecskemét, pp. 183‐187.  Kovács L., Szentléki A., Tőzsér J. (2012): A szívritmus‐variancia kutatása szarvasmarhában – irodalmi  áttekintés. 1. közlemény: A szívritmus‐variancia vizsgálatának élettani alapjai és módszertana.  Állattenyésztés és Takarmányozás 61:3‐35.  Kovács L., Szentléki A., Tőzsér J. (2012): A szívritmus‐variancia kutatása szarvasmarhában – irodalmi  áttekintés.  2.  közlemény:  A  szívritmus‐variancia  kutatások  eredményei.  Állattenyésztés  és  Takarmányozás 61:57‐72.  Kovács  L.,  Szentléleki  A.,  Kaufmann,  O.,  Tőzsér  J.  (2010):  A  szívritmus‐variancia  alkalmazhatósága  mint  stresszindikátor  a  szarvasmarha  fajban  –  Irodalmi  áttekintés.  XII.  Magyar  Etológiai  Kongresszus, Veszprém, Poszter szekció.  Kovács  L.,  Nagy  K.,  Tőzsér  J.,  Szenci  O.  (2012):  Akut  fiziológiai  és  technológiai  stressz  vizsgálata  egy  nagyüzemi  holstein‐fríz  tehenészetben  a  szívritmus‐variancia  elemzésével.  Akadémiai  beszámolók,  Klinikumok,  gyógyszertan,  toxikológia  szekció,  Szent  István  Egyetem,  Állatorvos‐ tudományi Doktori Iskola, Budapest. 

83 

Név: 

Major Péter 

Kezdés éve: 

2011 

Képzés formája: 

nappali tagozatos 

Témavezető: 

Bősze Zsuzsanna 

Intézet, Tanszék: 

Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont,  Nyúl Genom Biológiai és Biomodell Csoport 

Elérhetőség: 

+36204836985   [email protected] 

Transzgenikus állatmodell előállítása és jellemzése hosszú QT szindróma vizsgálatára A téma aktualitása, jelentősége Magyarországon a legfőbb elhalálozási okok között szerepel a hirtelen szívhalál, naponta 70,  évente  25  000  fő  hal  meg  benne.  Az  Egyesült  Államokban  annyi  áldozatott  szed  évente,  mint  a  tüdőrák,  mellrák  és  a  HIV/AIDS  együttvéve.  A  betegség  látszólag  egészséges  fiatalokat  is  súlyt,  bármilyen  megelőző  tünet  nélkül,  de  leggyakrabban  olyan  40‐60  év  közötti  embereket  fenyeget,  akiknél a koszorúér elhalás tünetei már egy ideje jelen vannak. A hirtelen szívhalál a szív elektromos  zavara.  Pontosabban  a  hosszú  QT  (LQT)  szindróma  az  okozója,  amely  az  ioncsatornák  csökkent  működésének következménye.   Az idegsejtek felszínén rengeteg ion specifikus ioncsatorna található, amelyek a sejtek külső‐  és belső terét kötik össze, ezáltal biztosítva egy dinamikus egyensúlyi állapotot, amely az eltérő ion  összetételű  terek  között  található.  Ezt  az  egyensúlyi  állapotot  más  szóval  akciós  potenciálnak  (AP)  nevezzük. A szív ritmikus működését a sinuscsomóban kialakuló, és innen a pitvari izomsejteken, az  ingerületvezető  rendszeren,  majd  a  kamrai  munkaizomzaton  tovaterjedő  akciós  potenciálok  hozzák  létre.  Az  akciós  potenciálok  következtében  a  sejten  belüli  (intracelluláris)  kalciumkoncentráció  átmenetileg  megnő,  ami  a  szívizomsejtek  összehúzódását  eredményezi.  A  dinamikus  egyensúlyi  állapotot különböző aktív pumpák generálják, és ezek az AP lezajlása után is szükségesek az eredeti  ionösszetétel  visszaállításához.  Ezek  a  pumpák  közvetlenül  vagy  közvetve  ATP  által  tárolt  energiát  használnak  fel.  A  K+  kiáramlást  a  sejtből  depolarizációnak  hívjuk,  ekkor  az  intracelluláris  térben  csökken  a  pozitív  töltések  száma.  Ennek  következményeként  a  repolarizáció,  amikor  Na+,  Ca+   áramlanak be a sejtbe.   A  szív  AP‐jának  5  fázisát  különböztetünk  meg.  Az  ún.  0  fázist,  azaz  a  gyors  depolarizáció,  rendkívül  gyors  potenciálváltozást  eredményez,  amelynek  során  a  negatív  membránpotenciál  átmenetileg pozitívvá válik. Ezután a szívizom sejttípusok többségében egy gyors repolarizációs fázis  következik (1. fázis), amelyet a szívizomra jellemző hosszú plató (2. fázis) követ. A platófázis után egy  gyorsabb repolarizáció (3. fázis) észlelhető, amelynek lezajlása után a membránpotenciál visszatér az  eredeti negatív értékre. Sinus‐, AV sejteken, ill. Purkinje‐rostokon a repolarizáció befejeződése és az  új (gyors) depolarizáció között spontán, ún. lassú depolarizáció (4. fázis) figyelhető meg, amely – ha a 

84 

küszöbpotenciál‐értéket eléri – tovaterjedő akciós potenciált (azaz újabb 0 fázisú depolarizációt) vált  ki (1. ábra) (Papp és Varró, 2007). 

1. ábra: Az akciós potenciálok szakaszai 

Az  orvostudományban  régóta  használnak  különböző  tesztállatokat  fiziológiai,  anatómiai,  és  betegség  modellezésre.  A  génmódosított  állatok  alkalmazása  újabb  lehetőséget  nyit  a  különböző  betegségek  tanulmányozására  valamint  az  eddig  ismertetlen  molekuláris  háttér  megismerésére.  Az  öröklődő  hosszú  QT  szindróma  okozója  az  ioncsatornák  felépítésében  szerepet  játszó  valamely  fehérjében  bekövetkezett  mutáció.  Mutáns  fehérje  jelenlétében  az  Iks  ioncsatorna  lassítja  a  repolarizációt ennek következtében hosszabbodik az AP időtartama, így az EKG görbe két nevezetes  pontja között (Q és T), amely a kamrai összehúzódást jellemzi, megnövekszik a távolság. Ezt nevezik  hosszú QT szindrómának. Az LQT szindróma modellezésére számos transzgenikus egértörzset hoztak  létre és jellemezték a domináns negativ mutációk következményeként fellépő szívrendellenességeket  is (London és mtsai. 1998, Jeron és mtsai. 2000, Demolombe és mtsai. 2001).   A  bejutatott  konstrukció  aminósav  cserét  okozó  mutációt  a  G52R‐KCNE1‐et  hordozza.  Ezt  a  domináns  negatív  hatású  mutációt  először  kínai  családban  írták  le  (Ma  és  mtsai.  2003).  A  guanin/  adenin  báziscsere  következménye  az  52.  glicinnek  argininre  történő  cseréjét  eredményezi.  Az  52.  pozíciójú  glicin  a  KCNE1  gén  transzmembrán  domenjében  helyezkedik  el  ezért  jelenléte  kritikus,  a  mutáns  G52R‐KCNE1  domináns  negatív  hatású,  in  vitro  tesztelések  Xenopus  petesejtekben  is  megerősítették (2. ábra). 

2. ábra: A G52R mutáció tesztelése in vitro, Xenopus petesejtekben. 

85 

A G52R mutációt PCR mutagenezissel állítottuk elő a humán szív cDNS könyvtából izolált vad  típusú KCNE1 cDNS‐ből kiindulva. Az IKs áramra, hatását a béta csatorna alegységen keresztül fejti ki.  A alegység az egyetlen transzmembránból áll és a minK fehérje alkotja, amit a KCNE1 gén kódol (3.  ábra). 

3.ábra: Az Iks ioncsatorna vázlatos képe. 

Célkitűzések A  kísérletekben  használt  génkonstrukció  elkészítése.  A  4.6  kb  nagyságú  nyúl  β−MHC  (β−myosin heavy chain) szív specifikus promótert három 5’ nem kódoló exonnal, valamint a KCNE1  gén  mutáns  cDNS‐ét  hordozza.  A  mutációt  PCR  mutagenezissel  állítottuk  elő  emberi  szív  cDNS  könyvtár felhasználásá  Majd  transzgenikus  egerek  létre  hozása  előmag  mikroinjektálásos  módszerrel  illetve  lentivírus  transzgenezissel.  Ez  a  lépés  lényeges  a  transzgén  expresszió  szövetspecifícitásának  ellenőrzése  és  az  elsődleges  fiziológiás  vizsgálatok  elvégzése  miatt.  A  lentivírus  transzgenezis  rendkívül  hatékony  módszer  kisméretű  transzgén  konstrukciók  in  vívó  expressziójának  vizsgálatára,  ezzel  a  módszerrel  Bősze  Zs.  munkacsoportja  már  létrehozott  transzgenikus  egérmodellt  (Kvell  és  mtsai. 2010).  

Módszerek A kísérlethez szükséges egérembriókat 8 hetes FVB/N nőstény egerek szuperovuláltatásával  nyertem. A transzgénikus állatok előállításakor a genetikai manipuláció korai (egysejtes) embrionális  korban  történt.  A  mikroinjektálást  Nomarski  differenciál  interferencia  kontraszt  egységgel  és  háromdimenziós  mozgást  biztosító  mikromanipulátor  karokkal  (Narishige,  Japán)  felszerelt  IMT‐2  invert  mikroszkóppal  (Olympus,  Japán)  végeztük.  A  mikroinjektálást  túlélt  embriókat  10  hetes  álvemhes CD1 nőstényekbe ültettem vissza. A mikroinjektált embriókból született utódokból mintát  vettem és a szövetből tisztított DNS‐ben PCR módszerrel vizsgáltam a transzgén jelenlétét, az alábbi  primer  párral  (Promóter  3’vég  forward  pr.:  GCCTCAGCCAGAACCAGTTA,  KCNE1  5’vég    reverz  pr:  GCTTCTTGGAGCGGATGTAG (4.ábra). 

86 

Eredmények A  kísérletekben  használt  génkonstrukció  a  4.6  kb  nagyságú  nyúl  β−MHC  (β−myosin  heavy  chain) szív specifikus promótert három 5’ nem kódoló exonnal, valamint a KCNE1 gén mutáns cDNS‐ ét hordozza. A mutációt PCR mutagenezissel állítottuk elő a humán szív cDNS könyvtárból izolált vad  típusú KCNE1 cDNS‐ből kiindulva. A 224 db előmagba történő mikroinjektálásból 14 utód született és  ezekből  egy  lett  transzgénikus.  Az  előmagba  történő  injektálásból  született  alapítónak  ‐  az  F2  nemzedékben  ‐  27  db  utódjából  11  db  bizonyult  transzgénikusnak.  A  heterozigóta  párkereszteződésből  származó  F3  nemzedékben  (mely  tartalmaz  homozigóta  egyedeket  is)  8  utód  született,  ezekből  3  ellés  után  elpusztult.  A  lentivírusos  G52R  konstrukciót  378  db  embrióba  mikroinjektáltuk, ebből 48 utód született, amelyből egy hordozza a transzgént 

4. ábra: A promóter 3’vég forward és a KCNE1 5’vég reverz primer feltapadási helye és az állataluk detektált  transzgenikus utódok.  

Irodalomjegyzék Demolombe  S,  Lande  G,  Charpentier  F,  van  Roon  MA,  van  den  Hoff  MJ,  Toumaniantz  G,  Baro  I,  Guihard  G,  Le  Berre  N,  Corbier  A,  de  Bakker  J,  Opthof  T,  Wilde  A,  Moorman  AF,Escande  D.,  2001  Transgenic  mice  overexpressing  human  KvLQT1  dominant‐negative  isoform.  Part  I:  Phenotypic characterisation. Cardiovascular research vol.50. Pp. 314‐327  Jeron  A., Mitchell  GF., Zhou  J., Murata  M., London  B., Buckett  P., Wiviott  SD., Koren  G.,  2000.   Inducible polymorphic ventricular tachyarrhythmias in a transgenic mouse model with a long  Q‐T phenotype. Am J Physiol Heart Circ Physiol. vol. 278 no. 6 H1891‐H1898  London  B, Jeron  A, Zhou  J, Buckett  P, Han  X, Mitchell  GF, Koren  G.,  1998.  Long  QT  and  ventricular  arrhythmias in transgenic mice expressing the N terminus and first transmembrane segment of  a voltage‐gated potassium channel., Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 95, pp. 2926–2931  Ma L, Lin C, Teng S, Chai Y, Bähring R, Vardanyan V, Li L, Pongs O, Hui R. 2003. Characterization of a  novel Long QT syndrome mutation G52R‐KCNE1 in a Chinese family. Cardiovasc Res. 2003 Sep  1;59(3):612‐9. 

87 

Kvell  K,  Czömpöly  T,  Hiripi  L,  Balogh  P,  Kóbor  J,  Bodrogi  L,  Pongrácz  JE,  Ritchie  WA,  Bosze  Z.  Characterisation of eGFP‐transgenic BALB/c mouse strain established by lentiviral transgenesis.  Transgenic Res. 2010 Feb;19(1):105‐12  Papp  Gyula  Varró  A.,  2007  A  szívritmuszavarok  keletkezésének  celluláris  elektrofiziológiai  alapjai.  SZOTE Egyetemi jegyzet . pp1‐2. 5‐9. 

88 

Név: 

Ősz Ágnes 

Kezdés éve: 

2012 

Képzés formája: 

nappali tagozat 

Témavezető: 

Horváth Ákos  

Társ‐témavezető: 

Kovács Balázs  

Intézet, Tanszék: 

Környezet‐ és Tájgazdálkodási Intézet, Halgazdálkodási Tanszék   

Elérhetőség: 

+362852200/1611, Mobil: +36209554876  [email protected] 

Hazai vad és tenyésztett sebespisztráng‐állományokgenetikai hátterének felmérése és egy genetikai markerekre alapozott tenyésztési rendszer kialakítása A téma aktualitása, jelentősége A  természetvédelmi  kutatómunkában  a  fajok  megőrzésén  túl  egyre  fontosabb  az  önálló  értéket  képviselő  populációk  megőrzése.  A  doktori  témámban  szereplő  halfaj,  a  főként  horgászhasznosítású vizek telepítésére tenyésztett sebes pisztráng (Salmo trutta m. fario), mely egy  viszonylag közönséges halfaj szerte Európában, ugyanakkor az egyes vízgyűjtőkben az evolúció során  a  fajnak  önálló  genetikai  háttérrel  és  jellemzőkkel  rendelkező  populációi  jöttek  létre  (Presa  és  Guyomard, 1998; Bernatchez, 2001). Ezen faj esetében a kutatások, több európai országban feltárták  az  őshonos  és  a  betelepített  vérvonalak  hibridizációját,  és  a  hibridek  természetes  vizekbe  telepítésével  végrehajtott  genetikai  szennyezés  problémáját  (Snoj  és  mtsai.,  2002;  Jug  és  mtsai.,  2005; Marić és mtsai., 2006; Sušnik és mtsai., 2008; Pustorvh és mtsai., 2011)  Ezek  alapján  elmondható,  hogy  konzerváció‐biológiai  szempontból  a  sebes  pisztráng  esetében  sokkal  fontosabb  az  egyes  populációk  védelme,  mint  az  egész  fajé.  Az  önálló  populációk  jellemzői  a  haltelepítések  következtében  fellépő  hibridizáció  miatt  megszűnnek  (Marić  és  mtsai.,  2010). Ez a folyamat populációgenetikai szempontból introgresszív hibridizációként jellemezhető, ami  a ugyanolyan kedvezőtlen folyamat, mint az ennek az ellentétjeként ismert és sokkal többet tárgyalt  beltenyésztés. 

Genetikai markerek Kutatásunk  során  különböző  genetikai  markereket  alkalmazzunk  a  genetikai  gazdagság,  a  beltenyésztettség és a vérvonalak megállapítására. Genetikai markernek tekintünk általában minden  olyan  tulajdonságot,  amely  alkalmas  egy  fajra,  populációra,  egyedre,  szövetre,  sejtre  vagy  kromoszóma  szakaszra  jellemző  öröklődő  tulajdonság,  vagy  allél  azonosítására,  illetve  nyomon  követésére.  Ez  lehet  fenotípusos  (morfológiai,  viselkedési,  növekedési)  tulajdonság,  bélyeg  vagy  köztes  anyagcseretermék,  az  allél  közvetlen  terméke  (fehérje),  vagy  közvetlenül  a  DNS  bizonyos  szakaszai.  Egy  ideális  marker  esetében  az  alábbi  követelményeknek  célszerű  teljesülnie  (Sunnucks,  2000): 

89 

      

a környezeti hatások jelentősen ne befolyásolják,  az egyedfejlődési fázistól, fiziológiai állapottól legyen független,  egyszerű,  kodomináns  öröklődést  mutasson  (az  egyed  mindkét  allélja,  vagy  annak  hatása legyen azonosítható),  az eredmény könnyen reprodukálható legyen,  legyen polimorf és több alléllal rendelkezzen,  viszonylag gyorsan és olcsó módszerrel legyen kimutatható,  a genomban egyenletes eloszlást mutasson. 

A  markerek  alkalmazása,  elemzése  nemcsak  az  öröklődés  alaposabb  vizsgálatát  teszi  lehetővé,  hanem  közvetlen  gyakorlati  jelentősége  is  van,  elsősorban  a  populációban  zajló  genetikai  folyamatok  feltárásában  (pl.  a  populáción  belüli  rokonsági  kapcsolatok  ellenőrzésében),  de  nélkülözhetetlen  kiválasztott  egyedek  egyértelmű  azonosításához  is,  amely  pusztán  morfológiai  alapokon nem valósítható meg (Çiftci és Okumus, 2002).    A  természetvédelemben  szintén  gyakran  alkalmaznak  genetikai  markereket  a  populációk  szerkezetének  felmérésére,  mivel  a  kezelési,  megőrzési  stratégiához  gyakran  szükséges  annak  ismerete, hogy a populációk genetikailag elszigeteltek‐e egymástól, illetve mekkora az elszigeteltség  mértéke, így a populáció differenciálódás megbízható becslése kulcsfontosságú a természetvédelmi  biológiában (Balloux és Lugon‐Moulin, 2002).  A  DNS  markerek  közül  a  doktori  témában  a  restrikciós  fragment  hossz  polimorfizmust  (restriction  fragment  length  polimorphism  ‐  RFLP),  és  a  korábban  említett  követelményeknek  leginkább  megfelelő  mikroszatelliteket  használjuk  fel  (Hearne  és  mtsai.,  1992;  Bruford  és  mtsai.,  1993; Kashi és mtsai., 1997). 

Restrikciós fragment hossz polimorfizmus (RFLP) A  molekuláris  genetika  egyik  mérföldköve  volt  a  restrikciós  enzimek  felfedezése.  Ezek  az  enzimek  képesek  egy  meghatározott,  általában  4‐8  bázispár  hosszúságú  DNS‐szakasz  felismerésére,  és ott a kettős DNS‐szál elhasítására. Az eltérő hosszúságú szakaszok elektroforézissel elkülöníthetők.  A  restrikciós  enzimek  alkalmazása  révén  a  genetikai  változatosság  új  formája  vált  elemezhetővé:  a  hasítási  helyeken  megnyilvánuló  polimorfizmus.  A  nyolcvanas  évek  elején  ismerték  fel,  hogy  a  hasítással nyert szakaszok genetikai markerként is felhasználhatók (Beuzen és mtsai., 2000; Okumus  és Çiftci, 2003; Liu és Cordes, 2004).   Újabban  polimeráz  láncreakcióval  (Polymerase  Chain  reaction  PCR)  kombinálva  alkalmazzák  az  eljárást  (PCR‐RFLP),  így  a  hasítás  előtt  szekvencia  specifikus  primerekkel  nagyobb  fragmenteket  állítanak  elő,  majd  az  emésztés  után  a  kapott  rövidebb  szakaszokat  elektroforézissel  szétválasztják.  Ezáltal a genom egyes pontjain található polimorfizmus helyek külön‐külön is vizsgálhatóvá váltak. A  módszer minden esetben jól alkalmazható, előnye, hogy nagyon kis mennyiségű DNS is elegendő egy‐ egy vizsgálathoz (Mburu és Hanotte, 2005). 



90 

Mikroszatellitek A  mikroszatellitek  (Short  Tandem  Repeats  ‐  STS)  olyan  DNS‐régiók,  amelyekben  1‐6  bázispárból  álló  rövid  szakaszok  tandem  módon  ismétlődnek  (pl.:  CACACA,  GTCGTCGTC,),  továbbá  két, csak az adott genom egyetlen pontjára jellemző szekvenciarészlet között helyezkednek el (Kashi  és  mtsai.,  1997).  Az  eukarióta  genomban  nagy  számban,  a  kódoló  és  a  nem  kódoló  régióban  is  előfordulnak,  jelentős  változatosságot  mutatnak.  Polimorfizmusuk  az  ismétlődések  eltérő  számából  adódó  eltérő  hosszukból  származik.    A  sejtmagi  genom  mellett  néhány  esetben  (Goldstein  és  Schlöiterer,  1999)  a  mitokondriumban  (Zardoya  és  Meyer,  1998)  is  megtalálhatóak  (Tóth  és  mtsai.,  2000).  Előnyük,  hogy  egy  lókuszon  a  kodomináns  öröklődés  miatt  a  heterozigócia  is  könnyen  detektálható,  továbbá  egy‐egy  fajban  nagy  polimorfizmust  mutatnak.  Esetenként  hátránya,  hogy  a  mikroszatellitek többé‐kevésbé fajspecifikusak, azonban az esetek egy részében használhatók közeli  rokon fajok vizsgálatánál is (Lerceteau‐Köhler és Weiss, 2006; Sekar és mtsai., 2009). 

A sebes pisztráng és genetikai háttere A  sebes  pisztráng  egy  hazánkban  is  őshonos  halfaj.  Az  oxigéndús,  sebes  sodrású,  hideg  vizeket  kedveli.  Eredetileg  csak  Európa  édesvizeiben  élt,  de  a  telepítések  következtében  szinte  már  minden  kontinensen  megtalálható  (Freyhof,  2011).  Hazánkban  minden  hegységünkben  a  halászati  vízterületté nem nyilvánított vizekben önfenntartó, ívó állományai megtalálhatók.  Magyarországon  a  Lillafüredi  pisztrángtelep  az  egyetlen,  amelyik  horgászkezelésű  vizek  halasítása,  illetve  génmegőrzés  céljából  szaporítja  és  neveli  a  sebes  pisztrángot  évente  2‐3  tonna  mennyiségben.  Más  országokban  a  sebes  pisztráng  tenyésztése  a  18.  század  végén  kezdődött,  és  mára iparszerű méreteket öltött.   Európában  ennek  a  fajnak  öt,  mitokondriális  DNS  vizsgálatok  alapján  élesen  elkülöníthető  vérvonala létezik: a legnagyobb elterjedésű az atlanti vérvonal, a mediterrán, az adriai, és a márvány  vérvonalak a Földközi‐tenger partja mentén fordulnak elő, míg Európa keleti részére a dunai vérvonal  jellemző.  A  vérvonalak  vizsgálata,  ma  már  többféle  genetikai  markerekkel  végezhető  elkülönítése  számos kutatás tárgyát képezi Európa szerte, azonban Magyarországon korábban ilyen irányú kutatás  nem  valósult  meg  (Presa  és  Guyomard,  1998;  Aurelle  és  Berrebi,  1998;  Bernatchez,  2001;  Jug  és  mtsai, 2005).  A  fajban  széles  körű  populáció  genetikai  vizsgálatokat  is  végeztek.  Először  kevés,  a  morfológiai  bélyegek  alapján  elkülöníthető,  különböző  területről  származó  egyedeken  tesztelték  a  mikroszatellitek  alkalmazhatóságát  a  sebes  pisztráng  populációk  leírására.  A  mikroszatellit  polimorfizmusokból  azonosították  a  vérvonalakra  jellemző  allélokatt  (Presa  és  Guyomard,  1998,  Aurelle és Berrebi, 1998). Mikroszatelliteket és izoenzimeket használtak genetikai markerként a sebes  pisztráng  és  a  Salmonidae  családba  tartozó  egyéb  fajok  rokoni  kapcsolatainak  feltérképezésében  (Gharbi és mtsai., 2006), illetve az atlanti vérvonalú populációk közti genetikai eltérések vizsgálatára  is  (Dunner  és  mtsai.,  2000).  Szlovéniában  igen  előrehaladott,  az  ott  őshonos  márvány  pisztráng  (Salmo  marmoratus)  és  a  nem  őshonos  pisztrángfélék  hibridizációs  szintjének  felmérése,  melyet  szintén mikroszatellitekkel és PCR‐RFLP‐vel vizsgálnak (Snoj és mtsai., 2000).  Továbbá azonosították 

91 

a  szlovén,  dunai  vérvonalú  sebes  pisztráng  állományokra  jellemző  allélokat,  illetve  feltárták  a  populációk hibridizációs szintjét is (Jug és mtsai, 2005, Bogataj 2010). Mindkét esetben a különböző  vérvonalakra  jellemező  mikroszatelliteket  illetve  PCR‐RFLP  polimorfizmusokat  mutatták  ki.  A  vérvonalak keveredésének fő oka, hogy az európai tenyészállományok létrehozásakor (18‐19. század)  a  tenyésztők  nem  rendelkeztek  a  faj  genetikai  adataival,  így  a  tenyészállományokat  az  egész  kontinensen  főleg  az  atlanti  vonal  egyedeinek  felhasználásával  alakították  ki.  Mivel  a  faj  tenyésztésének  fő  célja  a  horgászhasznosítású  vizek  telepítése,  az  atlanti  vérvonalú  tenyészállományok utódai a horgászvizekbe kikerülve kereszteződtek az ottani őshonos egyedekkel.  Az  így  kialakult  hibridizáció  révén  összekeveredtek  az  eredeti  vérvonalak  genetikai  állománya,  ami  végső  soron  az  adott  környezeti  feltételekhez  alkalmazkodott  genetikai  háttér  „felhígulásához”,  az  egyes populációk sajátosságainak eltűnéséhez vezethet. 

Célkitűzések A hazai sebes pisztráng állomány felmérése, az egyedek genetikai jellemzése és a egy fenntartható dunai vérvonal kialakítása A  tudományos  munka  egy  részében  az  ország  sebes  pisztráng  állományának  genetikai  felmérését  kívánjuk  elvégezni,  a  vizsgálatokat  egyrészt  a  lillafüredi  tenyészállományon,  másrészt  a  hazai  természetes  pisztrángos  vizekből  befogott  egyedeken  kívánjuk  végrehajtani.  Célunk  a  sebes  pisztráng  állományok  atlanti  vérvonallal  történt  hibridizáció  szintjének  megállapítása  különböző  genetikai  markerek  (PCR‐RFLP  és  mikroszatellit)  segítségével.  Végső  célunk  a  genetikailag  tipizált  egyedekből  az  egyetlen  hazai  sebes  pisztráng  tenyésztelepen  (Lillafüreden)  egy  fenntartható  dunai  vérvonal kialakítása.  

Módszerek Mintagyűjtés, egyedek megjelölése és DNS izolálás A  kutatáshoz  a  sebes  pisztráng  esetében  elsőként  a  lillafüredi  tenyészállományból  gyűjtött  szövetminták (elsősorban farokúszó mintákat) genetikai analízisét végeztük el (401 db minta).  A  vizsgálatok  egy  részét  a  Ljubljanai  Egyetem  Biotechnika  Karán  végezték  (Domžale,  Szlovénia),  míg  a  másik  részét  a  Halgazdálkodási  Tanszék  laboratóriumában  dolgoztuk  fel.  A  két  laborból származó eredményeket kontroll minták segítségével megfeleltettük és összesítettük.  Természetes populációkból is gyűjtöttünk mintákat. Ez idáig a Bükkben a Bán‐patakot (25 db  minta), az Aggteleki‐karsztban a Jósva‐patakot (33 db minta), a Börzsönyben a Kemence‐patakot (24  db minta), végül a Visegrádi‐hegységben az Apátkúti‐patakot (50 db minta) mintáztuk meg.   A mintákat az egyedek kifogását követően azok elpusztítása nélkül gyűjtjük be. Az egyedeket  2‐fenoxietanollal  altattuk,  és  1‐2  cm2  –es  farok‐  vagy  farokalatti  úszó  darabot  vágtunk  le,  amit  a  további feldolgozásig tömény etanolban tartósítottunk, majd a laboratóriumba szállítást követően ‐ 20 C°‐on tároltunk. A lillafüredi mintavétel során az egyedeket passzív elektronikus azonosítóval (PIT  tag) láttuk el, melyek a későbbi tenyésztői munkát segítik. 

92 

A  szövetmintákból  a  DNS‐t  az  Omega  Bio‐Tek  által  gyártott  E.Z.N.A  szöveti  DNS  izoláló  kit  segítségével izoláltuk a vonatkozó protokoll betartásával, majd a DNS‐t szintén ‐20C°‐on tároltuk, és  marker vizsgálatokhoz (PCR‐RFLP és/vagy mikroszatellit) használtuk fel. A polimeráz láncreakciókhoz  minden  minta  koncentrációját  50  ng/μl‐re  állítottuk  be,  az  IMPLEN  gyártmányú  nanofotométerrel  mért koncentrációk alapján. 

A sebes pisztráng egyedek vérvonalának megállapítása genetikai markerek segítségével Nyolc  különböző  irodalmi  adatok  alapján  kiválasztott  genetikai  markert  vizsgálunk  a  dunai,  illetve atlanti vérvonal elkülönítésére. Ezek összefoglalása az 1. és 2. táblázatban látható.  1. táblázat: Az alkalmazott PCR‐RFLP markerek  Marker neve 

Elhelyezkedése 

Feltapadási  hőmérséklet 

Emésztőenzim 

Referencia 

CRmt DNS 

mitokondriális  DNS 

45 C° 

Fnu4HI 

Bernatchez & Danzmann,  1993; Susnik és mtsai., 2001;  Snoj és mtsai., 2010 

LDH‐C1 

sejtmagi DNS 

58 C° 

BslI 

McMeel és mtsai., 2001 

SL 

sejtmagi DNS 

50 C° 

MspI 

Ford, 1998 

CRmt DNS: Mitokondriális DNS kontroll régió részlet (anyai öröklődés menet); LDH: Tejsav‐dehidrogenáz enzim  gén részlet; SL: Szomatolaktin gén részlet 

PCR‐RFLP  markerek  (1.  táblázat)  kimutatása  során  a  vizsgálni  kívánt  DNS  szakaszok  felsokszorozását  követően  egy‐egy  restrikciós  endonukleázzal  hasítottuk  a  PCR  terméket.  Az  emésztés  eredményéből  megállapítható,  hogy  az  adott  génszakaszon  mely  vérvonalhoz  tartozó  (atlanti vagy dunai) allélt/allélokat hordoz az egyed.  2. táblázat: Az alkalmazott mikroszatellit markerek  Marker neve 

Elhelyezkedése 

Feltapadási  hőmérséklet 

Fluoreszcens  festék 

Referencia 

BFRO002 (10/2) 

sejtmagi DNS 

57 C° 

NED 

Susnik és mtsai., 1997 

OMM 1064 

sejtmagi DNS 

57 C° 

VIC 

Rexroad és mtsai., 2002 

Ssa 408 uos 

sejtmagi DNS 

57 C° 

PET 

Cairney és mtsai., 2000 

Sso SL 417 

sejtmagi DNS 

57 C° 

FAM 

Slettan és mtsai., 1995 

Sso SL 438 

sejtmagi DNS 

55 C° 

PET 

Slettan és mtsai., 1996 

A  mikorszatellitek  analíziséhez  ún.  farkaztott  (tailed)  primereket  használunk  a  költségek  csökkentése érdekében. Ennél a módszernél a specifikus primerpárok egyik tagjának 5’ végéhez egy  17  bp‐os  (5'‐ATTACCGCGGCTGCTGG‐3')  szekvenciát  (farkat)  csatolunk  és  a  PCR  reakcióban  egy  harmadik  a  farok  szekvenciának  megfelelő  fluoreszcens  festékkel  jelölt  primert  is  alkalmazunk  (Shimizu  és  mtsai.,  2002).  Ennek  segítségével  kapilláris  elektroforézis  során  megállapítható,  hogy  a  PCR  termék  hány  bázispár  hosszú,  melyből  már  eldönthető,  hogy  az  adott  allél,  mely  vérvonalból 

93 

származik.  A  fragmentanalízis  és  PCR‐RFLP  során  kapott  adatok  statisztikai  analízisét  GenoDive  (version 20b22 for Mac OS X ; Patrick G. Meirmans, Hollandia) és GenePop v4.1 szoftverrel végeztük  el.  Az eredmények alapján az lillafüredi egyedeket a különböző markerekhez tartozó azonosító  kóddal  láttuk  el.  Az  egyedek  genetikai  hátterének  feltérképezése  után  az  elektromos  jelölők  segítségével megkezdhetjük egy fenntartható dunai vérvonal kialakítását.  

Eredmények Jelenleg  az  5  különböző  populációból  összesen  533  egyed  genetikai  vizsgálatát  hajtottuk  végre.  A  mitokondriális  DNS  vizsgálatának  eredményei  alapján  a  dunai  haplotípus  a  vad  állományokban  csak  alacsony  mértékben  van  jelen  (<  10  %),  ez  alól  kivételnek  csak  az  Apátkúti  patakból származó állomány mutat, ahol a dunai haplotípus aránya kiemelkedő (34 %). A lillafüredi  tenyészállományban  azonban  a  dunai  haplotípust  mindössze  1  egyed  esetében  mutattuk  ki,  ami  szinte kizárólag atlanti vonalból származó alapító állományt feltételez. A sejtmagi PCR‐RFLP markerek  esetében  a  dunai  allélok  aránya  szintén  10  %  és  40  %  közt  mozog  minden  helyszínen,  ami  a  hazai  természetes pisztrángos vizek intenzív telepítését bizonyítja (3. táblázat). 

3. táblázat: Az atlanti és dunai allélok aránya a három tesztelt PCR‐RFLP lókusz (CRmt DNS, LDH‐C1 és SL)  esetében a vizsgált populációkban  Lókusz 

CRmt DNS 

LDH‐C1 

SL 

 

Populáció 

Dunai 

Atlanti 

Dunai 

Atlanti 

Dunai 

Atlanti 

Lillafüred (401 db) 

0,002 

0,998 

0,370 

0,630 

0,221 

0,779 

Bán (25 db) 

0,080 

0,840 

0,300 

0,660 

0,300 

0,580 

Jósva (33 db) 

0,091 

0,909 

0,106 

0,894 

0,167 

0,803 

Kemence (24 db) 

0,083 

0,917 

0,292 

0,708 

0,417 

0,583 

Apátkút (50 db) 

0,340 

0,660 

0,190 

0,810 

0,180 

0,820 

 

94 

Eddig  az  5  mikroszatellit  lókusz  vizsgálata  során  99  különböző  allélt  találtunk,  a  lókuszok  átlagos  és  effektív  allélszáma  minden  helyszínen  magas.  A  polimorf  információs  tartalom  értékei  alapján a legpolimorfabb markernek az OMM 1064 mikroszatellit lókusz bizonyult (PIC=0,804‐0,933)  az  összes  vizsgált  helyszín  esetében,  míg  a  legkevésbé  változatos  lókusz  minden  helyszínen  a  BFRO002  mikroszatellit  volt  (PIC=0,138‐0,531)  (4.  táblázat).  A  statisztikai  eredmények  alapján  elmondható,  hogy  mindegyik  állományban  általában  magas  a  heterozigozitás  értéke,  és  a  Hardy‐ Weinberg  egyensúly  minden  helyszínen  fennáll  (5.  táblázat).  A  mikroszatellit  vizsgálatok  során  számos  olyan  allélt  találtunk,  melyeket  korábbi  kutatások  nem  írnak  le.    Ezek  valószínűsíthetően  a  Magyarország  sebes  pisztráng  állományára  jellemző  allélok  lehetnek.  Legnagyobb  arányban  a  Bán‐ patakban  találtunk  eddig  ismeretlen  allélokat  a  vizsgált  mikroszatellit  lókuszok  esetében.  Emellett  elmondható,  hogy  a  dunai  vérvonalhoz  tartozó  allélok  legnagyobb  arányban  a  Kemence‐patakban  fordultak elő, azonban szinte minden helyszínen az atlanti allélok, illetve a mindkét vérvonalban leírt,  közös allélok dominálnak (4. táblázat). A 6. táblázatban a populációk közti genetikai távolsága látható  a fixációs index (Fst) alapján, az Apátkúti‐patak és a Kemence‐patak között kapott 0,1‐nél magasabb  érték kiemelkedően magasnak számít ilyen közeli populációk esetében.   

95 

4.  táblázat:  A  dunai  és  atlanti  allélok  aránya  és  genetikai  diverzitás  helyszínenként  és  mikroszatellit  lókuszonként, szignifikáns különbség: p < 0,05.  Hexp – Várt heterozigozitás, Hobs – Tényleges heterozigozitás, Numeff – Effektív allélszám 

 

Allél 

Dunai   Atlanti  Új  

Közös    

Hexp 

Hobs 

p‐érték PIC‐ 

 

 

 

 

Allél‐ 

NumEff 

 

 

 

 

érték  szám 

 

Populáció 

Lókusz 

Lillafüred 

BFRO002 

0,25 

0,65 

0,05 

0,00 

 

0,467 

0,521 

0,005 

0,407  7,00 

1,875 

(401 db) 

OMM 1064 

0,28 

0,54 

0,10 

0,01 

 

0,923 

0,930 

0,407 

0,916  37,00 

12,644 

Ssa 408 uos 

0,18 

0,13 

0,16 

0,46 

 

0,903 

0,951 

0,002 

0,893  17,00 

10,161 

Sso SL 417 

0,04 

0,47 

0,12 

0,29 

 

0,840 

0,762 

0,001 

0,820  11,00 

6,199 

Sso SL 438 

0,17 

0,29 

0,00 

0,02 

 

0,732 

0,747 

0,345 

0,686  9,00 

3,708 

Bán 

BFRO002 

0,28 

0,56 

0,16 

0,00 

 

0,605 

0,680 

0,273 

0,531  4,000 

2,456 

(25 db) 

OMM 1064 

0,20 

0,18 

0,60 

0,02 

 

0,927 

0,920 

0,560 

0,902  16,000  10,965 

Ssa 408 uos 

0,18 

0,02 

0,52 

0,28 

 

0,891 

0,920 

0,464 

0,861  13,000  7,862 

Sso SL 417 

0,00 

0,22 

0,26 

0,44 

 

0,882 

0,957 

0,246 

0,847  9,000 

7,297 

Sso SL 438 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

Jósva 

BFRO002 

0,08 

0,92 

0,00 

0,00 

 

0,145 

0,091 

0,068 

0,138  3,000 

(33 db) 

OMM 1064 

0,21 

0,27 

0,52 

0,00 

 

0,951 

0,939 

0,472 

0,933  22,000  15,783 

Ssa 408 uos 

0,12 

0,14 

0,27 

0,47 

 

0,889 

0,848 

0,297 

0,864  15,000  8,037 

Sso SL 417 

0,00 

0,24 

0,29 

0,44 

 

0,804 

0,781 

0,433 

0,767  9,000 

4,796 

Sso SL 438 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

Kemence 

BFRO002 

0,33 

0,67 

0,00 

0,00 

 

0,454 

0,500 

0,502 

0,346  2,000 

(24 db) 

OMM 1064 

0,29 

0,46 

0,25 

0,00 

 

0,840 

0,792 

0,326 

0,804  12,000  5,620 

Ssa 408 uos 

0,25 

0,04 

0,08 

0,63 

 

0,818 

0,833 

0,570 

0,782  9,000 

5,031 

Sso SL 417 

0,00 

0,06 

0,42 

0,52 

 

0,629 

0,542 

0,224 

0,552  4,000 

2,606 

Sso SL 438 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

Apátkút 

BFRO002 

0,11 

0,89 

0,00 

0,00 

 

0,203 

0,220 

0,570 

0,191  3,000 

(50 db) 

OMM 1064 

0,27 

0,08 

0,57 

0,00 

 

0,893 

0,891 

0,547 

0,872  13,000  8,567 

Ssa 408 uos 

0,13 

0,06 

0,13 

0,64 

 

0,742 

0,750 

0,524 

0,713  9,000 

3,771 

Sso SL 417 

0,00 

0,13 

0,36 

0,47 

 

0,835 

0,812 

0,371 

0,804  8,000 

5,774 

Sso SL 438 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

     

     

     

     

     

96 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

n.a. 

1,167 

1,800 

1,252 

5. táblázat: Genetikai diverzitása az öt tesztelt mikroszatellit lókusz esetében populációnként;   Hexp – Várt heterozigozitás, Hobs – Tényleges heterozigozitás, Numeff – Effektív allélszám 

Populáció 

Mintaszám 

Lókuszok  Hexp  száma 

Hobs 

p‐érték 

Átlagos  allélszám 

NumEff 

Lillafüred 

401 

5 

0,773 

0,781 

0,192 

16,20 

6,917 

Bán 

25 

4 

0,825 

0,869 

0,091 

10,50 

7,145 

Jósva 

33 

4 

0,698 

0,665 

0,104 

12,25 

7,446 

Kemence 

24 

4 

0,686 

0,667 

0,297 

6,75 

3,764 

Apátkút 

50 

4 

0,6686 

0,668 

0,474 

8,25 

4,841 

szignifikáns különbség: p < 0,05 

6. táblázat: Populációk közti genetikai távolság a fixációs index (Fst) alapján  Populáció 

Lillafüred 

Bán 

Jósva 

Kemence 

Apátkút 

Lillafüred 

0 

0,0427 

0,0568 

0,0876 

0,0883 

Bán 

0,0427 

0 

0,0682 

0,0854 

0,0982 

Jósva 

0,0568 

0,0682 

0 

0,1430 

0,0702 

Kemence 

0,0875 

0,0854 

0,1430 

0 

0,1471 

Apátkút 

0,0883 

0,0982 

0,0702 

0,1471 

0 

Összefoglalás Különböző európai állományok vizsgálatát követően a sebes pisztráng (Salmo trutta m. fario  L.  1758)  öt  fő  evolúciós  vonala  különíthető  el  (atlanti,  dunai,  mediterrán,  adriai,  márvány).  A  Magyarország  vizeiben  élő  populációk/állományok  ilyen  irányú  vizsgálata  még  nem  valósult  meg.  Munkánk célja a hazai sebespisztráng‐állományok eredetének és genetikai hátterének feltárása.  A  jelenlegi  vizsgálataink  kiterjednek  az  egyetlen  magyar  sebes  pisztráng  tenyészállományra,  mely  Lillafüreden  található,  illetve  a  Bükk‐hegység,  az  Aggteleki‐karszt,  a  Börzsöny  és  a  Visegrádi‐ hegység  egy‐egy  vízfolyására.  Az  Bükkben  a  Bán‐patakot,  az  Aggteleki‐karsztban  a  Jósva‐patakot,a  Börzsönyben  a  Kemence‐patakot,  végül  a  Visegrádi‐hegységben  az  Apátkúti‐patak  állományát  vizsgáltuk.  Ez  idáig  összesen  533  egyed  genetikai  vizsgálatát  végeztük  el.  Ennek  során  vizsgáltuk  a  dunai  és  az  országba  behozott  atlanti  vonalra  jellemző  allélokat.  A  vonalak  elkülönítéséhez  a  mitokondriális  DNS  kontroll  régióját  és  a  sejtmagi  DNS‐ben  kódolt  tejsav  dehidrogenáz  (LDH),  valamint  a  szomatolaktin  gének  vizsgáltuk  PCR‐RFLP  módszerrel,  továbbá  öt  mikroszatellit  lókusz  (BFRO002, OMM1064, Ssa408, SsoSL417, SsoSL438) genotipizálását végeztük el.   

97 

A  mitokondriális  DNS  vizsgálati  eredményei  szerint  a  vad  állományokban  csak  kis  arányban  származik a (< 10 %) a dunai vérvonalú ikrásoktól, ez alól kivételnek számítanak az Apátkúti patakból  származó  minták,  melyek  esetében  a  dunai  haplotípus  aránya  kiemelkedő  (34  %).  A  lillafüredi  tenyészállomány 401 vizsgált egyedében szinte egységesen az atlanti haplotípus található meg, ami  egy  alapvetően  atlanti  vonalból  származó  alapító  állományt  feltételez.  A  sejtmagi  DNS  markerek  vizsgálata  alapján  az  összes  állomány  erősen  heterogén,  egyértelműen  atlanti  vagy  dunai  vonalhoz  tartozó  egyedek  nem  különíthetők  el.  A  vizsgált  PCR‐RFLP  markerek  esetében  is  megfigyelhető  az  atlanti  allélok  magas  aránya  (60‐70%)  minden  élőhelyen,  ami  a  hazai  „vadnak”  feltételezett  természetes  pisztrángos  vizek  intenzív  telepítését  bizonyítja.  Populáció  genetikai  szempontból  a  mikroszatellit  lókuszok  analízise  alapján  elmondható,  hogy  mindegyik  állomány  heterozigozitása  magas, és eltérés a Hardy‐Weinberg egyensúlytól nem igazolható egyik élőhelyen sem. Számos olyan  allélt  találtunk,  melyeket  az  eddigi  kutatásokban  még  nem  írtak  le,  és  valószínűsíthetően  a  magyarországi sebes pisztráng állományra jellemzőek.  A munka a GOP‐1.1.1‐09/1‐2010‐0141 pályázat és a TÁMOP‐4.2.2.B‐10/1‐2010‐0011 pályázat  támogatásával valósult meg. 

Irodalomjegyzék Aurelle, D., Berrebi, P. (1998): Microsatellite markers and management of brown trout Salmo trutta  fario populations in southwestern France, Genet. Sel. Evol. 30 (Suppl, 1) (1998) S75 ‐ S90.  Balloux, F., Lugon‐Moulin, N. (2002): The estimation of population differentiation with microsatellite  markers, Molecular Ecology 11 (2002) 155–165.  Bernatchez, L., Danzmann, R. G. (1993): Congruence in Control‐Region Sequence and Restriction‐Site  Variation in Mitochondrial DNA of Brook Charr (Salvelinus fontinalis Mitchill). Mol. Biol. Evol.  10(5): 1002‐1014.p.  Bernatchez,  L.  (2001):  The  evolutionary  history  of  brown  trout  (Salmo  trutta  l.)  inferredfrom  phylogeographic,  nested  clade,  and  mismatch  analyses  of  mitochondrial  dna  variation.  Evolution, 55 (2): 351–379.p.  Bogataj,  K.  (2010):  Genetic  analysis  of  native  brown  trout  (Salmo  trutta)  populations  in  Slovenia.  Graduation thesis, Ljubljana, 62 p.  Beuzen, N. D., Stear, M. J., Chang, K. C. (2000): Molecular markers and their use in animal breeding,  The Veterinary Journal 160 (2000) 42–52.  Bruford,  M.  W.;  Wayne  R.  K.  (1993):  Microsatellites  and  their  application  to  population  genetic  studies. Current Opinion in Genetics and Development., 3 (1993) 939‐943. p.  Cairney, M.,Taggart, J. B., Høyheim, B. (2000) Characterization of microsatellite and minisatellite loci  in  Atlantic  salmon  (Salmo  salar  L.)  and  cross‐species  amplification  in  other  salmonids.  Molecular Ecology, 9: 2175‐2178.  Çiftci,  Y.,  Okumus,  I.,  (2002):  Fish  Population  Genetics  and  Applications  of  Molecular  Markers  to  Fisheries  and  Aquaculture:  I‐  Basic  Principles  of  Fish  Population  Genetics  Turkish  Journal  of  Fisheries and Aquatic Sciences 2 (2002) 145‐155  Dunner,  S.,  Royo,  L.,  Canon,  J.  (2000):  Genetic  structure  in  Atlantic  brown  trout  (Salmo  trutta)  populations in the Iberian peninsula: evidence from mitochondrial and nuclear DNA analysis, J.  Anim. Breed. Genet. 117 (2000), 105–120.  Ford, M. J. (1998): Testing models of migration and isolation among populations of Chinook salmon  (Onchorynchus tschawytscha). Evolution 52(2):539‐557.p. 

98 

Freyhof, J. 2011. Salmo trutta. In: IUCN 2011. IUCN Red List of Threatened Species. Version 2011.2.  <www.iucnredlist.org>. Downloaded on 24 May 2012.  Gharbi, K., Gautier, A., Danzmann, R. G., Gharbi, S., Sakamoto, T., Høyheim, B., Taggart, J. B., Cairney,  M.,  Powell,  R.,  Krieg,  F.,  Okamoto,  N.,  Ferguson,  M.  M.,  Holm,  L.  E.,  Guyomard,  R.  (2006):  A  Linkage  Map  for  Brown  Trout  (Salmo  trutta):  Chromosome  Homeologies  and  Comparative  Genome Organization With Other Salmonid Fish, Genetics 172 (2006) 2405–2419.  Goldstein,  D.  B.,  and  C.  Schlöiterer.,  (1999);  Microsatellites:  Evolution  and  Applications.  Oxford  University Press, Oxford. Pp. 352.  Hearne, C. M.; Ghost, S.; Todd, J. A. (1992): Microsatellites for linkage analysis of genetic traits. TIG, 8  (1992) 288‐293. p.  Jug, T., Berrebi, P., Snoj, A. (2005): Distribution of non‐native trout in Slovenia and their introgression  with  native  trout  populations  as  observed  through  microsatellite  DNA  analysis,  Biological  Conservation 123 (2005) 381–388.  Kashi,  Y.;  King,  D.;  Soller,  M.  (1997):  Simple  sequence  repeat  sas  a  source  of  quantitative  genetic  variation. TIG, 13 (2) 74‐78. p.  Lerceteau‐Köhler, E., Weiss, S. (2006): Development of a multiplex PCR microsatellite assay in brown  trout Salmo trutta, and its potential application for the genus. Aquaculture, 258: 641–645.  Liu, Z.J., Cordes, J.F. (2004): DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics,  Aquaculture 238 (2004) 1 –37.  Mburu,  D.,  Hanotte,  O.  (2005):  A  practical  approach  to  microsatellite  genotyping  with  special  reference to livestock population genetics, A manual prepared for the IAEA/ILRI training course  on molecular characterisation of small ruminant genetic resources of Asia, October‐December  2005, ILRI, Nairobi, Kenya  Marić, S., Simonovic, P., Razpet, A. (2010): Genetic characterization of broodstock brown trout from  Bled fish‐farm, Slovenia. Periodicum Biologorum, 112 (2): 145–148.  McMeel, O. M., Hoey, E. M., Ferguson, A. (2001): Partial nucleotide sequences, and routine typing by  polymerase  chain  reaction–restriction  fragment  length  polymorphism,  of  the  brown  trout  (Salmo trutta) lactatedehydrogenase, LDH‐C1*90 and *100 alleles. Molecular Ecology, 10, 29.  Okumus, I., Çiftci, Y. (2003): Fish Population Genetics and Molecular Markers: II‐ Molecular Markers  and  Their  Applications  in  Fisheries  and  Aquaculture,  Turkish  Journal  of  Fisheries  and  Aquatic  Sciences 3 (2003) 51‐79.  Presa,  P.,  Guyomard,  R.  (1998):  Brown  trout  microsatellite  variation:  Preliminary  data  Cahiers  Options Mediterraneennes 34 (1998) 169‐179.  Pustorvh,  G.,  Snoj,  A.,  Sušnik,  S.  (2011):  A  set  of  SNPs  enabling  identification  of  trouts  and  their  hybrids in Salmo genus. Conservation Genet Resour, 3: 147–150.  Rexroad,  C.  E.,  Coleman,  R.  L.,  Hershberger,  W.  K.,  Killefer,  J.  (2002)  Rapid  communication:  Thirty‐ eight polymorphic microsatellite markers for mapping in rainbow trout. J. Anim. Sci. 80:541– 542.  Sekar, M., Suresh, E., Kumar, N.S., Nayak, S.K., Balakrishna, C. (2009): Microsatellite DNA markers, a  fisheries perspective ‐ Part 1: The nature of microsatellites, Aquaculture Asia Magazine, April‐ June 2009, 27‐29 pp.  Shimizu,  M.,  Kosaka,  N.,Shimada,  T.,  Nagahata,  T.,  Iwasaki,  H.,  Nagai,  H.,  Shiba,  T.,  Emi,  M.  (2002):  Universal  Fluorescent  Labeling  (UFL)  Method  for  Automated  Microsatellite  Analysis,  DNA  Research 9 (2002) 173–178. 

99 

Slettan,  A.,  Olsaker,  I.,  Lie,  Ø.  (1995)  Atlantic  salmon,  Salmo  salar,  microsatellites  at  the  SSOSL25,  SSOSL85, SSOSL311, SSOSL417 loci. Anim. Genet. 26:281‐282.  Slettan  A,  Olsaker  I  and  Lie  Ø(1996)  Polymorphic  Atlantic  salmon,  Salmo  salar  L.,  microsatellites  at  the SSOSL438. SSOSL439 and SSOSL444 loci. Anim Genet 27: 57‐58.  Snoj, A., Jug, T., Melkic, E., Susnik, S., Pohar, J., Dovc, P. (2000): Mitochondrial and microsatellite DNA  analysis of marble trout in Slovenia, Quaderni ETP 29 (2000) 5–11.  Snoj A, Marčeta B, Sušnik S, Melkič E, Meglič V, Dovč P (2002) The taxonomic status of the ‘sea trout’  from  the  north  Adriatic  Sea,  as  revealed  by  mitochondrial  and  nuclear  DNA  analysis.  J  Biogeography 29:1179–1185  Snoj, A., Glamuzina, B., Razpet, A., Zablocki, J., Bogut, I., Lerceteau‐Köhler, E., Pojskić, N., Sušnik, S.  (2010): Resolving taxonomic uncertainties using molecular systematics: Salmo dentex and the  Balkan trout community. Hydrobiologia 651:199–212.  Sušnik, S., Snoj, A., Pohar, J., Dovč, P. (1997) The microsatellite marker (BFRO 002) characteristic for  different geogarphically remote brown trout , Salmo trutta L., popuations. Animal Genetics 28:  372.  Sušnik,  S.,  Snoj,  A.  Dovč,  P.  (2001)  Evolutionary  distinctness  of  grayling  (Thymallus  thymallus)  inhabiting  the  Adriatic  river  system,  as  based  on  mtDNA  variation.  Biological  Journal  of  the  Linnean Society 74: 375–385.  Sušnik, S., Sivka, U., Snoj, A. (2008): A set of nuclear DNA markers diagnostic for marble trout, Salmo  marmoratus. Aquaculture, 285, 260‐263.  Sunnucks, P. (2000): Efficient genetic markers for population biology. TREE, 15 (2000) 199‐203. p.  Tóth  G.,  Gáspári  Z.,  Jurka,  J.  (2000):  Microsatellites  in  Different  Eukaryotic  Genomes:  Survey  and  Analysis, Genome Research 10 (2000) 967‐981.  Vandeputte, M., Rossignol, M. N., Pincent, C. (2011): From theory to practice: Empirical evaluation of  the assignment power of marker sets for pedigree analysis in fish breeding, Aquaculture 314  (2011) 80–86.  Zardoya,  R.,  and  A.  Meyer.  (1998):  Cloning  and  characterization  of  a  microsatellite  in  the  mitochondrial control region of the African side‐necked turtle, Pclomedusa subrufa. Gene 216  (1998) 149‐153. 

100 

Név:  

Pelyhe Csilla 

Kezdés éve: 

2012 

Képzés formája: 

nappali tagozatos 

Témavezető: 

Mézes Miklós 

Társ‐témavezető: 

Kovács Balázs 

Intézet, Tanszék: 

Állattudományi Alapok Intézet, Takarmányozástani tanszék 

Elérhetőség: 

+36309163229   [email protected] 

Hosszú távú T‐2 toxin terhelés hatása brojlercsirkék lipidperoxidációs és glutation redox paramétereire A téma aktualitása, jelentősége A  gabonafélék  a  monogasztrikus  gazdasági  állataink  legfőbb,  kérődző  állatainknak  pedig  fontos takarmány alapanyagai.  A  mikotoxinok  fonalas  gombák  másodlagos  metabolizmus  termékei,  amelyek  a  takarmányokat, ezen belül különösen a gabonaféléket, szennyezve gazdasági állatoknál dózisfüggően  termeléskiesést,  illetve  toxikus  válaszreakciót  váltanak  ki  (Diaz,  2005).  Jellemzően  hőstabil  vegyületek,  a  hagyományos  takarmány‐feldolgozás  során  alkalmazott  kezeléseknek  ellenállnak  (Szigeti, 1997).  A  Fusarium  penészek  általában  hűvös  és  párás  környezetben  (Wood,  1992),  a  jelenlévő  oxigén mennyiségétől, illetve a gabonában jelenlévő szubsztrátoktól (pl. keményítő) függően (Kovács,  2010), számos, eltérő kémiai struktúrával rendelkező mikotoxint termelnek. Hazánkban gyakoriságuk  és  gazdasági  károkozásuk  alapján  két  trichotecénvázas  mikotoxin,  a  deoxinivalenol  (DON)  és  a  T‐2  toxin  a  legjelentősebbek.  A  T‐2  toxint  már  1968‐ban  leírták  (Bamburg  és  mtsai,  1968),  s  az  egyik  leginkább toxikusnak ítélt trichotecénvázas mikotoxin. A T‐2 toxin, valamint annak részben a tárolás  során, illetve az állati szervezetben képződő metabolitja, a HT‐2 toxin, valamint a DON az eukarióta  sejtekben  gátolják  a  fehérje‐  és  a  DNS  szintézisét  (Holladay,  1995).  Ezek  a  mikotoxinok  sertés  és  baromfi faj esetén különösen nagy veszteséget okozhatnak, mivel csökkentik a takarmányfelvételt és  a  fehérjeszintézist,  így  mind  a  hús‐,  mind  pedig  a  tojástermelési  paramétereket  rontják  (Zomborszkyné, 2002). Korábban megállapítást nyert, hogy a sejtekben zajló biokémiai változásokkal  összefüggésben  a  trichotecénvázas  mikotoxinok  hosszú  távú  hatására  fokozódik  az  állati  szervezetben a lipidperoxidációs folyamatok intenzitása, amely kihat a biológiai antioxidáns rendszer  működésére is (Mézes és mtsai, 1998; Surai és mtsai, 2002).  Kiemelendő,  hogy  az  Európai  Unió  országaiban  a  T‐2  toxin  határértéke  a  takarmány  alapanyagokban  és  takarmányokban  kötelező  érvénnyel  nincs  meghatározva,  sőt  arra  vonatkozóan  még  ajánlati  szintek  sem  állnak  rendelkezésre.  Eriksen  és  Pettersson  (2004)  0,5 mg  T‐2  toxin/kg  takarmány  koncentrációt  állapított  meg  ajánlási  szintként.  2003‐ban  a  Magyar  Tudományos 

101 

Akadémia  Állatorvos‐tudományi  Bizottsága  tett  javaslatot,  melyben  depresszív  határértékként  0,3  mg/kg,  míg  toxikus  határértékként  0,6  mg/kg  T‐2  toxin  koncentrációt  javasolt  határértékként  a  takarmánykeverékekben (MTA Állatorvos‐tudományi Bizottsága, 2003).  A  biológiai  rendszerekben  az  evolúció  során  egy  hatékonyan  működő  enzimatikus  és  nem  enzimatikus antioxidáns védőrendszer alakult ki, annak érdekében, hogy megvédje a sejtalkotókat a  (per)oxidációs  károsodásoktól  (Chow,  1988;  Davies,  1995).  Az  oxigén  szabad  gyökök  által  kiváltott  oxidációra  főként  a  többszörösen  telítetlen  zsírsavak  hajlamosak,  azonban  a  peroxidáció  során  képződő  oxigén  szabadgyökök  kisebb‐nagyobb  mértékben  károsíthatják  a  zsírsavak  környezetében  jelenlévő  többi  biomolekulát;  így  a  fehérjéket,  a  nukleinsavakat  és  a  szénhidrátokat  is.  A  folyamat  elsősorban a membránokat érinti, mind a sejt, mind a sejtorganellumok esetén, amelyek ennek révén  elvesztik  fluiditásukat,  integritásukat,  és  megnő  permeabilitásuk  (Gutteridge  és  Halliwell,  1990),  amely  végeredményben  a  sejt  pusztulásához,  líziséhez  vezethet  (Mézes  és  Matkovics,  1986).  Az  oxigén  szabad  gyökök  által  elindított  láncreakció  lezárása  ún.  gyökfogó  antioxidáns  molekulák  (pl.  redukált glutation (GSH) vagy E‐vitamin) segítségével, valamint enzimatikus úton egyaránt történhet  (Chow, 1988; Davies, 1995).  A hagyományos kvantitatív paraméterek mellett régóta alkalmaznak biokémiai végpontokat a  mikotoxinok  által  fokozott  oxidatív  stressz  és  lipidperoxidációs  folyamatok  vizsgálata  során.  A  xenobiotikum  transzformációban  a  biológiai  antioxidáns  védőrendszer  egyik  lényeges  komponenseként  a  glutation  szintézisében  és  metabolizmusában  szerepet  játszó  enzimek,  illetve  azok  katalitikus  aktivitása  is  jelentős.  Az  antioxidáns  enzimek,  illetve  az  antioxidáns  molekulák  vizsgálata lehetőséget kínál a szervezet antioxidáns állapotának jellemzésére, s így az oxidatív stressz  biomarkereként alkalmazhatók. A lipidperoxidációs folyamatok kezdeti szakaszát a konjugált dién és ‐ trién tartalom meghatározásával detektálhatjuk (Pegg, 2001), míg a folyamat vége a lipidperoxidációs  folyamatok  vizsgálata  során  széles  körben  alkalmazott  végpont,  a  malondialdehid,  mint  a  folyamat  egyik  metastabil  végterméke,  mennyiségének  mérésével  jellemezhető  (Janero,  1990;  Draper  és  mtsai, 1993). 

Célkitűzések A fentiek alapján, célom volt megállapítani, hogy eltérő mértékű szubletális per os T‐2 toxin  terhelés milyen mértékű hatást gyakorol a lipidperoxidációs és antioxidáns védőrendszer változásaira  brojlercsirkékben, hosszú távú expozíció esetén. 

Módszerek A takarmányba kevert T‐2 toxinnal végzett toxinterheléses vizsgálataimhoz Cobb 540 hibrid  brojlercsirkéket használtuk. Két különböző mikotoxin szennyezési szintet (1,5 és 3,4 mg T‐2 toxin/kg  takarmány)  alkalmazva  két  kísérletet  állítottam  be,  egyenként  30  madárral.  A  T‐2  toxinnal  mesterségesen  szennyezett  takarmány  (brojler  nevelő  teljesértékű  keveréktakarmány)  etetését  14  napos madarakkal kezdtük és a mikotoxin expozíció 4 héten keresztül, azaz 42 napos korig, zajlott.  A  T‐2  toxin  előállítása  nagy  mikotoxin  termelő  kapacitással  rendelkező  penészgomba  törzs  felhasználásával  (Fusarium  sporotrichoides  NRRL  3229  [Agricultural  Research  Service  Culture  Collection,  National  Centre  for  Agricultural  Utilization  Research,  Peoria,  IL],  történt  a  Kaposvári  Egyetem Állattudományi Kar Élettani és Állathigiéniai Tanszékén. A kezelt csoportok által fogyasztott 

102 

takarmányok  T‐2  toxin  tartalmát  immunaffinitás  oszlopon  történő  előtisztítást  követően  HPLC  módszerrel mértük.  Az  állatok  testtömeg‐gyarapodását  a  hetente  végzett  egyedi  mérlegelések  adataiból  számítottuk ki.   A biokémiai vizsgálatokhoz szükséges mintavételek a toxinterhelés 0. (abszolút kontroll), 14.  és  28.  napján  történtek,  melyek  során  véletlenszerűen  kiválasztott  6‐6  állat  került  exterminálásra,  melyekből vér, majd post mortem májmintát vettem. A mintákat a biokémiai vizsgálatok elvégzéséig ‐ 20  C‐on  tároltam.  A  vér‐  (plazma  és  vörösvérsejt  1:9  hemolizátum)  és  májminták  esetén  mértem  a  redukált  glutation  (GSH)  koncentrációt,  a  glutation‐peroxidáz  (GPx)  aktivitást,  a  fehérje‐  és  malondialdehid (MDA) koncentrációt, valamint konjugált dién és ‐trién tartalmat.  A redukált glutation koncentrációt Sedlak és Lindsay (1968) módszere alapján mértem 5,5’‐ ditio‐bisz‐2‐nitrobenzoesav  reagenssel.  A  glutation‐peroxidáz  aktivitást  Matkovics  és  mtsai  (1988)  módszerével határoztam meg, végpontos direkt assay‐vel, redukált glutation és kumol‐hidroperoxid  ko‐szubsztrátok jelenlétében. A fehérjekoncentráció meghatározása a vérplazma és vvs. hemolizátum  esetében  biuret  módszer  segítségével  (Weichselbaum,  1948),  míg  a  máj  homogenizátum  10.000  g  szupernatans  frakciójában  Folin‐fenol  módszerrel  történt,  szarvasmarha  szérum  albumin  standard  felhasználásával  (Lowry  és  mtsai,  1952).  A  konjugált  dién  és  –trién  tartalom  meghatározása  a  májminták lipid tartalmának 2,2,4‐trimetilpentánban való kivonását követően 232 nm‐en, illetve 268  nm‐en  mutatott  abszorpció  alapján  történt  (AOAC,  1984).  A  malondialdehid  tartalom  meghatározását  Placer  és  mtsai  (1964)  módszere  alapján  végeztem  savanyú  közegben,  magas  hőmérsékleten  2‐tiobarbitursavval  való  komplex  képzés  alapján,  standardként  1,1,3,3  tetraetoxi‐ propánt alkalmazva.   A  kapott  eredmények  statisztikai  értékelését  STATISTICA  for  Windows  4.5  programmal  (StatSoft  Inc.,  1993)  végeztem.  A  normalitás  vizsgálatot,  majd  a  kiugró  értékek  kizárását  követően  varianciaanalízis  (ANOVA)  során  a  Fisher‐féle  legkisebb  szignifikáns  különbség  (LSD)  tesztet  alkalmaztam a szignifikáns (p<0,05) különbségek megállapítására. 

Eredmények Mindkét mikotoxin dózissal végzett kísérlet során a brojlercsirkék testtömeg‐gyarapodásának  tekintetében annak szignifikáns mértékű csökkenését figyeltem meg a T‐2 toxin terhelés hatására a  kontroll  csoporthoz  képest  (1.  és  2.  táblázat).  A  két  csoport  testtömegének  összehasonlítása  során  minden  héten  szignifikáns  különbséget  állapítottam  meg  (1.  ábra),  mindkét  kísérletben.  A  kapott  eredmények  alátámasztják  a  szakirodalomban  leírtakat,  miszerint  a  T‐2  toxin  terhelés  baromfi  faj  esetén  nagy  gazdasági  veszteséget  okozhat,  mivel  csökkenti  a  takarmányfelvételt  és  a  fehérjeszintézist,  így  romlik  a  takarmányértékesítés,  tömeggyarapodás,  és  végül  a  hústermelés  (Zomborszkyné, 2002).   

103 

1. táblázat: A testtömeg‐gyarapodás alakulása (g) az 1,5 mg T‐2 toxin/kg tak. kísérletben   

2‐3. hét 

3‐4. hét 

4‐5. hét 

5‐6. hét 

Kontroll 

348,00±57,47 a 

462,67±78,69 a 

492,50±84,64 a 

598,75±47,04 a 

T‐2 

218,67±43,40 b 

330±100,46 b 

341,25±126,88 b 

365,00±128,17 b 

2. táblázat: A testtömeg‐gyarapodás alakulása (g) a 3,4 mg T‐2 toxin/kg tak. kísérletben 

a,b

 

2‐3. hét 

3‐4. hét 

4‐5. hét 

5‐6. hét 

Kontroll 

329,64±56,89 a 

440,00±68,39 a 

658,13±163,81 a 

308,13±119,73 a 

T‐2 

229,62±40,44 b 

292,31±51,50 b 

325,00±43,78 b 

260,71±35,87 a 

Azonos oszlopban eltérő jelzések szignifikáns különbséget jelentenek P0,01 szinten

2500

Testtömeg alakulása a   1,5mg/tak.kg T‐2 toxin hatására

2000

2500 2000

*

1500

Testtömeg alakulása a   3,4mg/tak.kg T‐2 toxin hatására

**

1500

*** ***

***

1000

1000

***

*** **

500

500

0

0

K T‐2 K T‐2 K T‐2 K T‐2 K T‐2

K T‐2 K T‐2 K T‐2 K T‐2 K T‐2

2. HÉT 3. HÉT 4. HÉT 5. HÉT 6. HÉT

2. HÉT 3. HÉT 4. HÉT 5. HÉT 6. HÉT

1. ábra: Az állatok testtömeg alakulása a kísérletek során (* ‐ p<0,05; ** ‐ p<0,01; *** ‐ p<0,001) 

A  post  mortem  nyert  szervek  tömegét  vizsgálva  megállapítható  volt,  hogy  a  kontroll  csoporthoz  képest  a  T‐2  toxinnal  szennyezett  takarmányt  fogyasztó  madarak  mindkét  T‐2  toxin  szennyezettségi  szint  mellett  szignifikáns  mértékben  kisebb  szerv  tömeggel  rendelkeztek.  Ugyanakkor a relatív (100 g élőtömegre vonatkoztatott) szervtömegeket vizsgálva mindkét T‐2 toxin  szennyezettségi  szint  mellett  csak  a  lép  esetében  tapasztaltam  a  kontroll  madarakhoz  viszonyítva  szignifikáns  mértékben  kisebb  relatív  tömeget,  a  relatív  májtömegekben  viszont  nem  volt  statisztikailag is igazolható a különbség.   Az  alacsonyabb  T‐2  toxin  koncentrációval  (1,5  mg/kg  takarmány)  lefolytatott  kísérletben  a  vörösvérsejt hemolizátum esetében a fehérje tartalmat tekintve a második mintavétel során találtam  szignifikáns  különbséget  (K:  56,09±9,88g/l,  T:  48,25±3,12g/l).  A  többi  mintavételi  időpontban  és  szövetek  esetében  nem  találtam  statisztikailag  igazolható  eltérést  ezen  végpont  vizsgálata  során.  A  magasabb  (3,4  mg/kg  takarmány)  T‐2  toxin  koncentráció  hatásainak  vizsgálata  során  a  T‐2  toxin  jól 

104 

ismert  fehérjeszintézist  gátló  hatása  ellenére  csupán  a  máj  esetében  tapasztaltam  szignifikáns  csökkenést a fehérje tartalomban a 2. mintavétel esetében, a kontrollhoz viszonyítva.  Egyik  részről  a  szervezetben  a  szabad  gyökök  által  elindított  láncreakciók  lezárása  ún.  gyökfogó  antioxidáns  molekulák  segítségével  történhet,  melyek  egyike  a  redukált  glutation  (GSH),  ami  egyben  az  enzimatikus  antioxidáns  rendszerben  is  fontos  szerepet  lát  el,  mivel  több  enzim,  így  például a glutation‐peroxidáz enzimcsalád esetében is ún. ko‐szubsztrátként szerepel.  A két kísérlet során a redukált glutation tartalom alakulása a májban a 2. ábrán látható. Az  alacsonyabb  dózisú  (1,5  mg/kg  takarmány)  T‐2  toxin  terhelés  hatására  a  toxinexpozíció  2.  hetében  már  szignifikáns  eltérést  találtam  a  máj  GSH  tartalmában  (K:  2,17±0,23  µmol/g  feh.,  T:  2,90±0,42  µmol/g feh.), emellett a vérplazma vizsgálata során is emelkedést tapasztaltam. A máj esetében ez a  szignifikáns  mértékű  eltérés  a  4.  héten  is  kimutatható  volt  (K:  1,55±0,47  µmol/g  feh.,  T:  2,40±0,55  µmol/g  feh.).  A  többi  vizsgált  szövet  és  mintavételi  időpont  alkalmával  azonban  nem  mutatkozott  statisztikailag is igazolható eltérés. Nagyobb dózisú (3,4 mg/kg takarmány) T‐2 toxin terhelés esetén  is szingifikáns mértékben nagyobb GSH tartalmat mértem a toxinexpozíció 4. hetében (K: 2,37±0,30  µmol/g feh., T: 3,27±0,72 µmol/g feh.), míg a vörösvérsejt hemolizátum vagy a vérplazma esetében  nem volt szignifikáns különbség.  

4,50

A GSH tartalom alakulása a  májban 1,5mg/tak.kg T‐2 toxin  hatására

A GSH tartalom alakulása a  májban  3,4mg/tak.kg T‐2 toxin  hatására 4,50 4,00

4,00 3,50

*

3,50

***

3,00

3,00

*

2,50

2,50

2,00

2,00

1,50

1,50

1,00

1,00

0,50

0,50

0,00

0,00 K

T‐2 4. HÉT

K

K

T‐2

T‐2 4. HÉT

6. HÉT

K

T‐2 6. HÉT

2. ábra: A redukált glutation (GSH) tartalom alakulása a májban eltérő mértékű T‐2 toxin terhelés hatására   (* ‐ p<0,05; ** ‐ p<0,01; *** ‐ p<0,001) 

A két kísérlet során a glutation‐peroxidáz aktivitás alakulása a májban a 3. ábrán látható. Az  alacsonyabb  dózisú  (1,5  mg/kg  takarmány)  T‐2  toxin  terhelés  hatására  a  máj  homogenizátum  GPx  aktivitása  szignifikáns  mértékben  nagyobb  volt  mindkét  mintavétel  esetében  (1.  mintavétel:  K:  1.98±0,10 E/g feh., T: 2.72±0,14 E/g feh.; 2. mintavétel: K: 1.97±0,17 E/g feh., T: 2.44±0,23 E/g feh.),  míg a többi minta esetében nem találtam szignifikáns eltérést a kontrollhoz viszonyítva. A nagyobb  dózisú  (3,4  mg/kg  takarmány)  T‐2  toxin  terhelés  hatására  a  máj  homogenizátum  GPx  aktivitásában  csupán a mikotoxin expozíció 4. hetében mutatkozott szignifikáns mértékű emelkedés (K: 1,87±0,19  E/g  feh.,  T:  2,47±0,73  E/g  feh.),  míg  a  vérplazma  és  a  vörösvérsejt  hemolizátum  esetében  nem  találtam szignifikáns különbséget. 

105 

A GPx aktivitás alakulása a  májban  1,5mg/tak.kg T‐2 toxin  hatására

A GPx aktivitás alakulása a  májban  3,4mg/tak.kg T‐2 toxin  hatására

3,50

3,50 *

3,00

3,00

* *

2,50

2,50

2,00

2,00

1,50

1,50

1,00

1,00

0,50

0,50 0,00

0,00 K

T‐2 4. HÉT

K

K

T‐2

T‐2 4. HÉT

6. HÉT

K

T‐2 6. HÉT

3. ábra: A glutation‐peroxidáz (GPx) aktivitás alakulása a kísérletekben (* ‐ p<0,05; ** ‐ p<0,01; *** ‐ p<0,001)  

A  máj  paramétereinek  összefoglaló  értékeléseként  megállapítható,  hogy  mindkét  T‐2  toxin  terhelési  szint  esetében  több  vizsgált  végpont  esetében  is  szignifikáns  eltérést  találtam  a  kontroll  csoporttal összehasonlítva. A GSH tartalom és a GPx aktivitás a nagyobb T‐2 toxin terhelés hatására a  kísérlet  28  napján  történt  mintavétel  alkalmával  magasabb,  a  májhomogenizátum  10.000  g  szupernatans  frakció  fehérje  tartalma  ugyanakkor  alacsonyabb  volt.  Az  alacsonyabb  T‐2  toxin  dózis  hatására viszont mindkét mintavételkor kimutatható volt a növekedés a GSH tartalomban és a GPX  aktivitásban, a fehérje tartalom tekintetében ugyanakkor szignifikáns eltérés nem volt kimutatható. A  szervezetben  zajló  xenobiotikum  transzformáció  központi  szerve  a  máj,  így  az  emelkedett  GSH  tartalom  és  GPx  aktivitás  az  antioxidáns  rendszer  fokozott  aktivitását  jelzi.  A  magasabb  toxin  expozíció  esetében  azonban  az  antioxidáns  rendszer  aktiválódása  időben  később  jelentkezett,  ami  feltevésem szerint azzal magyarázható, hogy a szervezetre, ezen belül a májra a 3,4 mg T‐2 toxin/kg  takarmány  koncentráció  olyan  jelentős  mértékű  hatást  gyakorolt,  hogy  a  terhelés  első  szakaszában  nem  aktiváció,  hanem  gátlás  következett  be  a  glutation  redox  rendszer  működésében.  A  válaszreakció  pedig  csak  a  folyamatos  terhelés  hatására  feltételezhetően  bekövetkező  fokozott  T‐2  toxin metabolizmus aktivációját követően alakult ki.  A konjugált dién és ‐trién képződés a májban a lipidperoxidáció korai szakaszának markere.  Ezen végpontok vizsgálata során a T‐2 toxin terhelés hatására egyik vizsgálat során sem mutatkozott  statisztikailag is igazolható különbség. A statisztikailag nem igazolható eltérés azt támasztja alá, hogy  a  lipidperoxidáció  első  szakasza  már  valószínűleg  az  első  mintavételt  (toxinterhelés  14.  napja)  megelőzően lezajlott.  Az  alacsonyabb  dózisú  T‐2  toxin  terhelés  hatására  a  minták  malondialdehid  tartalmában  egyik mintavétel alkalmával sem tapasztaltam szignifikáns mértékű különbséget. A nagyobb dózisú T‐ 2 toxin terhelés hatására pedig a malondialdehid koncentrációja a vörösvérsejt hemolizátumban, az  irodalmi adatoktól eltérően, a mikotoxin terhelés hatására nem nőtt, hanem szignifikáns mértékben  alacsonyabb  volt  az  első  mintavételkor  (K:  7,49±0,92  nmol/ml,  T:  6,36±0,80  nmol/ml).  A  második  mintavételkor pedig nem volt kimutatható szignifikáns különbség. Ez a jelenség azzal magyarázható, 

106 

hogy  a  szervezeten  belül  a  vörösvérsejtek  jelentős  és  folyamatos  oxidatív  stressznek  vannak  kitéve  még  fiziológiás  körülmények  között  is,  így  nagyobb  aktivitású  antioxidáns  védelmük  alakult  ki  az  evolúció során. Az MDA szint mérsékelt, bár szignifikáns, csökkenése az antioxidáns védelmi rendszer  aktiválódásával  magyarázható,  mivel  a  mikotoxin  terhelés  hatására  valószínűleg  gyorsan  és  hatékonyan  aktivált  antioxidáns  rendszer  nagyobb  mértékben  gátolta  a  szabad  gyökök  által  előidézett  lipidperoxidációs  folyamatok  intenzitását,  mint  a  kontroll  csoportban.  A  későbbiekben  ugyanakkor  a  vörösvérsejtekben  az  antioxidáns  rendszer  tovább  már  nem  aktiválható,  így  az  MDA  szintje  a  kontroll  értékre  nőtt.  Emellett  viszont  a  vérplazma  esetében  az  első  mintavételkor  szignifikánsan  nagyobb  malondialdehid  tartalmat  mértem  (K:  4,48±0,91  nmol/ml,  T:  8,52±3,55  nmol/ml),  ami  a  második  mintavétel  esetén  viszont  statisztikailag  már  nem  volt  igazolható.  Ezen  eredmények  a  4.  ábrán  láthatók.  Ennek  a  változásnak  a  hátterében  az  állhat,  hogy  a  vérplazma  részben  tükrözi  a  májba  zajló  folyamatokat,  azaz  amennyiben  a  májban  hatékonyan  aktiválódott  a  glutation  redox  rendszer,  úgy  a  szisztémás  keringésbe,  így  a  vérplazmába,  is  csak  kisebb  mennyiségben jutottak ki a májból az oxidatív folyamatok végtermékei, így a malondialdehid.  

MDA tartalom aktivitás  alakulása  1,5mg/tak.kg T‐2  toxin hatására vérplazmában 

MDA tartalom aktivitás alakulása   1,5mg/tak.kg T‐2 toxin hatására  vvs hemolizátumban 14

14 12

12

*

10

10

8

8

6

6

4

4

2

2

0

0 K

T‐2 4. HÉT

K

T‐2

*

K

6. HÉT

T‐2 4. hét

K

T‐2 6. hét

4. ábra: A vérplazma és a vörösvérsejt hemolizátum malondialdehid (MDA) tartalmának jellemzése az  alacsonyabb T‐2 toxin kitettség esetén (* ‐ p<0,05; ** ‐ p<0,01; *** ‐ p<0,001) 

Összefoglalás Kísérleteim során, két különböző T‐2 toxin terhelés (1,5 illetve 3,4 mg/kg takarmány) hatását  vizsgáltam  brojlercsirkék  lipidperoxidációs  és  glutation  redox  paramétereire  2,  illetve  4  hetes  mikotoxin‐expozíciót követően. Kísérleteim eredményei alapján elmondható, hogy a T‐2 toxin 1,5 és  3,4 mg T‐2 toxin/kg takarmány koncentrációban statisztikailag igazolható mértékben csökkentette a  brojlercsirkék  testtömeg‐gyarapodását  és  emellett  a  vizsgált  lipid‐peroxidációs  és  glutation  redox  paraméterek  esetén  is  több  ponton  is  találta  szignifikáns  eltérést  a  kezelt  és  kontroll  csoportok  között. Ezek közül kiemelendő, hogy a GSH tartalom és a GPx aktivitás mindkét terhelési szint mellett  szignifikáns mértékben emelkedett, ami a szervezet antioxidáns rendszerének aktiválódását jelzi a T‐ 2 toxin terhelés hatására. 

107 

A  jövőben  terveim  szerint  vizsgálni  tervezzük  alacsonyabb  dózisú  T‐2  toxin  hatásait,  illetve  szeretném feltárni a T‐2 toxin által kiváltott oxigén szabadgyök képződési és antioxidáns folyamatok  kezdeti  lépéseit,  illetve,  megállapítani,  hogy  a  T‐2  toxin  közvetlenül  vagy  közvetett  módon,  a  szervezetre  gyakorolt  egyéb  hatásokon  keresztül  indukálja  e  az  antioxidáns  védőrendszert,  illetve  a  lipidperoxidációs folyamatokat.  A  kutatásokat  a  TÁMOP‐4.2.1.B‐11/2/KMR‐2011‐0003  „Az  oktatás  és  kutatás  színvonalának  emelése a Szent István Egyetemen” valamint az OTKA PD 104823 pályázatok támogatásával végeztük. 

Irodalomjegyzék AOAC (1984): Official Methods of Analysis (28.054) 14th edition. Arlington, VA, USA  Bamburg,  J.  R.  –  Riggs,  N.  V.  –  Strong,  F.  M.  (1968):  The  structure  of  toxins  from  two  strains  of  Fusarium Trincitum. Tetrahedron Lett. 24, 3329‐3326.  Chow,  C.K.  (Ed.),  (1988):  Cellular  Antioxidant  Defense  Mechanisms,  vol.  I  and  II.  CRC  Press,  Boca  Raton, FL.  Davies, K.J.A., (1995): Oxidative stress, the paradox of aerobic life. In: Rice‐Evans, C. ‐ Halliwell, B. ‐  Land,  G.G.  (Eds.),  Free  Radical  and  Oxidative  Stress:  Environment,  Drugs  and  Food  Additives.  London, Portland Press, pp. 1–31.  Diaz, D. E. (ed.) (2005): The Mycotoxin Blue Book. Nottingham University Press, Nottingham  Draper, H.H. ‐ Squires, E.J. ‐ Mahmooch, H. ‐ Wu, J. ‐ Agarwal, S. ‐ Handley, M., (1993): A comparative  evaluation  of  thiobarbituric  acid  methods  for  the  determination  of  malondialdehyde  in  biological materials. Free Radicals Biol. Med. 15, 353–363.  Eriksen, G.S. – Pettersson H. (2004): Toxicological evaluation of trichothecenes in animal feed. Animal  Feed Science and Technology 114. 205–239  Gutteridge,  J.  M.  ‐  Halliwell,  B.  (1990):  The  measurement  and  mechanism  of  lipid  peroxidation  in  biological systems. Trends. Biochem. Sci. 15. 4. 129‐135.  Holladay, S.  D. ‐ Smith, B. J. ‐ Luster,  M. I. (1995):  B‐lymphocyte precursor cells represent sensitive  targets of T2 mycotoxin exposure. Toxicol. Appl. Pharmacol. 131. 309‐315.  Janero, D.R., (1990): Malondialdehyde and thiobarbituric acid‐reactivity as diagnostic indices of lipid  peroxidation and peroxidative tissue injury. Free Radicals Biol. Med. 9. 515–540.  Kovács, M. (szerk:) (2010): Aktualitások a mikotoxin kutatásban. Agroinform Kiadó, Budapest, 156. p.  Lowry, O. H. ‐ Rosenbrough, N. J. ‐ Farr, A. L. ‐ Randall, R. J. (1951): Protein measurement with the  Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193. 265‐275.  Matkovics,  B.  ‐  Szabó,  L.  ‐  Sz.Varga,  I.  (1988):  Lipidperoxidáció  és  redukált  glutation  anyagcsere  enzimek aktivitás meghatározása biológiai mintákban. Lab. Diagn. 15. 248‐250.  Mézes,  M.  –  Matkovics,  B.  (1986):  A  lipidperoxidáció  molekuláris  mechanimzusa  és  mennyiségi  mérése. In: Csaba Gy. (ed.): A Biológia Aktuális Problémái Medicina, Budapest Vol. 34, pp. 61‐ 105  Mézes, M. ‐ Barta, M. ‐ Nagy, G. (1998): Comparative investigation on the effect of T‐2 mycotoxin on  lipid peroxidation and antioxidant status in different poultry species. Res. Vet. Sci. 66: 19–23.  MTA  Állatorvos‐tudományi  Bizottsága  (2003):  Mikotoxin  határértékek  takarmány‐keverékekben.  Állatteny. Takarm. 52, 393‐396.  Pegg,  R.  B.,  (2001):  Measurement  of  Primary  Lipid  Oxidation  Products.  Current  Protocols  inFood  Analytical Chemistry D2.1.1‐D2.1.15. 

108 

Placer,  Z.  A.  ‐  Cushman,  L.  L.  ‐  Johnson,  B.  C.  (1966):  Estimation  of  product  of  lipid  peroxidation  (malonyl dialdehyde) in biochemical systems Anal. Biochem 16.359‐364.  Sedlak,  J.  ‐  Lindsay,  R.  H.  C.  (1968):  Estimation  of  total,  protein  bound  and  non‐protein  sulf‐hyryl  groups in tissue with Ellmann's reagent. Anal. Biochem. 25.192‐205.  Statsoft Inc., (1993): Statistica for Windows, Release 4.5. Statsoft Inc.  Surai,  P.F.  ‐  Dvorska,J.E.  ‐  Sparks,N.H.C.  ‐  Jaques,  K.A.  (2002):  Impact  of  mycotoxins  on  the  body’s  antioxidant defence. In: Lyons T.P., K..A Jaques eds: Nutritional biotechnology in the feed and  food industries. Nottigham University Press, Nottingham, pp. 131‐142.  Szigeti,  G.  (1997):  Az  állategészségügyi  jelentőségű  gombák  (Az  állatorvosi  mikológia  alapjai).  Europharma, Budapest, 96.  Weichselbaum, T. E. (1948): An accurate and rapid method for the determination of protein in small  amounts of serum and plasma Am. J. Clin. Pathol. 16. 40‐43.  Wood, G. E. (1992): Mycotoxins in foods and feeds in the United States.J. Anim. Sci. 70.3941–3949.  Zomborszkyné, K.M. (2002): A penészgombák toxinjainak állategészségügyi vonatkozásai. Agro Napló  6. 73‐77. 

Közlésre elfogadott, illetve megjelent válogatott publikációk jegyzéke Pelyhe Cs., Balogh K., Zándoki E., Bakti G., Mézes M. (2013): Eltérő dózisú T‐2 toxin terhelés hatása  brojlercsirkék  bizonyos  szöveteinek  lipidperoxidációs  és  glutation  redox  paramétereire.  XIX.  Ifjúsági Tudományos Fórum, Állattudományi szekció, ISBN 978‐963‐9639‐51‐5 

109 

Név:  

Prágai Andrea 

Kezdés éve: 

2012 

Képzés formája: 

nappali tagozatos 

Témavezető: 

Kovács Alfréd 

Intézet, Tanszék: 

Állattenyésztés‐tudományi Intézet 

Elérhetőség: 

+36304774556  [email protected] 

Alpakák kondíció bírálata A téma aktualitása, jelentősége A  guanakó,  a  vikunya,  a  láma  és  az  alpaka  a  Tevefélék  családjába  tartozik.  Azon  belül  az  Újvilági  tevefélékhez  (Brehm,  1992).  Külső  megjelenésükre  jellemző,  hogy  fejük  kicsi,  orrlyukai  résszerűek,  nyakuk  hosszú,  felső  ajkuk  osztott.  Lábaikon  két  patás  ujj  található,  ahol  a  két  utolsó  ujjperc  talppárnái  érintik  a  talajt  (Clutton‐Brock,  2002).  Bromage  (2011)  írja,  hogy  napjainkban  elfogadott, hogy az alpaka az alacsonyabb, félénkebb vikunyától származik.   Elsősorban  a  gyapjúja  miatt  tenyésztik  ezeket  az  állatokat.  Az  alpakák  gyapjúja  rugalmas,  könnyen festhető, puha, hipoallergén, mivel nem található benne lanolin, kevésbé zsíros, mint a juh  gyapjú. Továbbá nem szúr, így kényelmes viselet (Internet I).   Két  különböző  típusú  alpakát  különböztethetünk  meg,  a  surit  és  a  huacayat.  Az  elsődleges  különbség, ami megkülönbözteti a két típust a suri‐t és a huacayat, a gyapjú fenotípusa.   Mint  más  gazdasági  állatok  esetében  az  alpakáknál  is  fontos  az  ideális  súly  elérése,  megtartása.  A  túlsúlyos  állatok  érzékenyebbek  a  hőstresszre,  nagyobb  eséllyel  lesznek  terméketlenek,  nehezen ellenek, kevesebb lesz a tejük és nő az újszülöttek halandósága.  A  sovány  alpakák  esetében  sokszor  a  csikók  kis  súllyal  születnek,  a  kancák  könnyen  elvetélnek, vagy kevés tejet adnak (Australian Alpaca Association). 

Célkitűzések Magyarországon egyre több tenyésztő van, az ő alpakáinak kondícióját szeretném felmérni.  Hazánkban  korábban  még  nem  történt  erre  irányuló  vizsgálat.  Az  eredmények  alapján  képet  kaphatok  a  hazánkban  tartott  állatokról.  Így  megtudhatom  a  jelenlegi  takarmányozás,  tartás  megfelelő‐e. Ha nem, javaslatot teszek az állatok állapotának javítására. A takarmány mennyiségének  és/vagy minőségének módosításával. 

110 

Módszerek Előzetesen  felmértem  Magyarországon  hol  találhatóak  alpaka  tenyésztők,  személyesen  megnéztem az állományokat. 

A bírálat Sokszor  a  nagy  mennyiségű  gyapjú  vagy  az  előrehaladott  vemhesség  miatt  nem  látható  milyen az alpakák kondíciója valójában. Ezért érdemesebb nyírás után elvégezni a bírálatot (Bowman,  2006).  A  kondíció  bírálat  során  1‐től  5‐ig  tart  a  pontozási  rendszer.  Ebben  az  esetben  az  1  pont  a  nagyon  gyenge  kondíciót,  az  5  pont  pedig  az  elhízott  alpakákat  jelöli.  Az  ideális  pontszám  2,5‐3,5  körül  van  (Australian  Alpaca  Association).  Az  alábbi  táblázatban  olvasható,  pontosan  mely  életszakaszban mennyi az ideális pontszám (1. táblázat). 

1.  táblázat  Ideális  pontszámok  az  alpakák  kondíció  bírálata  során  (Australian  Alpaca Association)  Életszakasz 

Bírálati pontszám 

Herélt/hobbi állat 

2,5‐3,5 

Ivarérett, nem vemhes kanca 

2,5‐3,5 

Ivarérett kanca 

2,5‐3,5 

Vemhes kanca 

3‐3,5 

Csődör 

2,5‐3,5 

Fiatal állat (<15 hónap) 

3‐3,5 

Van Shaun egy további kategóriát is meghatároz, a laktációban lévő állatok számára a 2,5‐3,0  a megfelelő kondíció pont (Internet II).   

111 

A vizsgálat menete Fontos szabály hogy ne a medencei rész után vizsgáljuk az állatot, mivel az sokszor még akkor  is csontos tapintású, ha a vizsgálati alany elhízott (1. ábra).  A  kondíció  bírálatnak  megfigyeléssel  és  tapintással  kell  történnie.  A  területen  található  izomtömeg tapintás útján határozható meg, az ujjak és a hüvelykujj segítségével.  Az egyik legáltalánosabban vizsgált rész a bordák mögött, és a medence előtti terület. Ezzel a  zsír  jelenlétét  értékelhetjük  a  csontos  részek  között  –  a  csigolyáktól  felfelé,  oldalirányban  a  gerincoszlopnál. 

1. ábra Az ideális bírálati pontok (forrás: Bowmann, 2006) 

A  másik  vizsgálandó  rész  a  horpasz.  Sovány  alpakák  esetében  a  test  fal  beesett,  rátapad  a  rövid  bordákra.  A  kövér  állatok  testfala  kivetül,  a  rövid  bordákat  nehezen  lehet  azonosítani.  Továbbá meg kell nézni a kövérség mértékét a mellkasnál és a lágyéki résznél. 

2. ábra Különböző kondícióban lévő alpakák csigolyái (a középső az optimális)  (forrás: Australian Alpaca Association) 

Optimális  esetben  a  bordákat,  és  a  csontos  részeket  csak  kis  mértékben  fedi  zsírréteg  (2.  ábra).  A  borda  és  a  gerincnyúlványok  enyhe  nyomásra  kitapinthatóak.  Izomtömeg  hiány  nem  figyelhető meg.  Az  állatokat  elölről  is  meg  kell  figyelni.  Ha  a  szegycsont  kiemelkedő  V  alakú,  az  alultápláltságra utal. Kövér, ha a csontos rész nem látható ezen a részen. Átlagos kondícióban a V alak  kissé kitöltött.  Hátulsó profilnál fordított V alak figyelhető meg a comboknál, ha az alpaka vékony. Súlyosan  elhízott esetben a lágyéktájék dülledt a zsírtól. Megfelelő súly esetén mérsékelt zsír látható az ágyék  tájékán (Internet II).  

112 

Eredmények Az eredmények a közeljövőben várhatóak. 

Összefoglalás Az  alpakák  optimális  kondíciójának  megtartása  fontos,  mivel  egészségügyi  problémákhoz  vezethet.   Az  újszülött  kis  súllyal  jöhet  világra,  a  kancák  könnyen  elvetélhetnek,  vagy  kevés  tejet  adhatnak,  ha  az  alpaka  alultáplált.  A  túlsúlyos  állatok,  nagyobb  eséllyel  lesznek  terméketlenek,  nehezen  ellenek,  kevesebb  lesz  a  tejük  és  nő  az  újszülöttek  halandósága,  érzékenyebbek  a  hőstresszre.  Ezért érdemes az alpakák küllemi bírálatát elvégezni, hogy kiküszöbölhessük az ebből adódó  problémákat. 

Irodalomjegyzék Australian  Alpaca  Association:  http://flowerdalealpacas.net/download/alpaca.body_condition.pdf   2013.03.25.  Bowman J. (2006): Body scoring llamas and alpacas, The Camelid Quarterly  Brehm (1992): Az állatok világa‐Emlősök, Kassák Kiadó, Budapest, 216‐241 p.  Bromage G. (2011): Llamas and alpacas, A guide to management, The Crowood Express  Clutton‐Brock J. (2002): Határozó kézikönyvek‐Emlősök, Dürer Nyomda Kft 330.331 p.  Internet I. http://alpaca.com/alpacafiber.cfm 2013.03.25.  Internet II. http://vbs.psu.edu/extension/focus‐areas/small‐ruminant/BCS‐Fact‐Sheet‐VSE‐09‐02.pdf   

113 

Név:  

Schally Gergely Tibor 

Kezdés éve: 

2010 

Képzés formája: 

nappali tagozat 

Témavezető: 

Szemethy László 

Intézet, Tanszék: 

Vadvilág Megőrzési Intézet 

Elérhetőség: 

+362852200/1863   [email protected] 

Az erdei szalonka (Scolopax rusticola) vonuló állományának vizsgálata Magyarországon A téma aktualitása, jelentősége Az  erdei  szalonka  Magyarországon  és  Európa  számos  országában  népszerű  vadászható  faj.  Ésszerű,  tartamos  hasznosításához  elengedhetetlen  a  vonuló‐  és  költő  állomány  nagyságának,  összetételének, valamint a vadászat állományra gyakorolt hatásának lehető legpontosabb ismerete.  Az  Európai  Unió  Madárvédelmi  Irányelvében  (79/409  EGK)  foglaltaknak  és  az  ehhez  kapcsolódó vadászati tájékoztató dokumentumnak megfelelően a faj egyedeinek befogása, a tartása  vagy  más  ésszerű  használata  csak  szigorúan  ellenőrzött  körülmények  között,  szelektív  alapon,  a  madarak kis számára engedélyezhető. Az Európai Unió Erdei Szalonka Gazdálkodási Tervében felhívja  továbbá  a  figyelmet  a  tudományos  kutatások  jelentőségére,  és  rámutat  arra,  hogy  fontosságuk  ellenére  azok  értékelhető  minőségben  jelenleg  csak  néhány  tagállamában  folynak  (European  Woodcock Management Plan).  Magyarország ‐ földrajzi helyzetéből és területi sajátosságaiból adódóan – a faj főbb ismert  telelő‐  és  költőhelyei  között  található,  és  feltehetően  több  irányból  is  érkező  vonulási  útvonalak  keresztezik  itt  egymást  (Fluck  2009).  A  magyarországi  viszonyokról  annak  ellenére  keveset  tudunk,  hogy  szalonka  megfigyelések  viszonylag  nagy  múltra  tekintenek  vissza.  Napjainkig  alapvetően  populációbiológiai  adatokat  gyűjtöttek,  a  populáció  nagyságára  vonatkozó  ismeretek  azonban  meglehetősen hiányosak.  Az  ismeretanyag  bővítése,  az  ország  területén  átvonuló  állomány  felmérése,  ezáltal  elfogadható  hasznosítás  tervezése  céljából  2009‐ben  Erdei  szalonka  monitoring  program  indult  a  Földművelésügyi  Minisztérium  és  a  vadászati  érdekképviseletek  (Országos  Magyar  Vadászkamara,  Országos  Magyar  Vadászati  Védegylet)  kezdeményezésére.  Az  adatgyűjtés  módszereit  ‐  nemzetközileg  is  elfogadott  módszerek  alapján  (Bibby  és  mtsai.,  1997,  Ferrand  és  mtsai.,  2008,  Machado és mtsai., 2008) ‐ a Szent István Egyetem Vadvilág Megőrzési Intézete dolgozta ki, valamint  vállalta az adatok feldolgozását és értékelését is. Az egész ország területét lefedő, önkéntes alapon  működő monitoring‐hálózat nagy számú résztvevő közreműködésével, sikeresen elindult. A program  folytatása  a  kitűzött  célok  elérése  érdekében  elengedhetetlen  fontosságú,  eredményei  egy  nemzetközi megfigyelési hálózatba is jól illeszthetők. 

114 

A program során gyűjtött megfigyelési adatok értékelésétől várt eredmények:     

A szalonkavonulás biológiai hátterének és működésének pontosabb ismerete  Nemzetközileg  is  elfogadott,  széles  körben  alkalmazható  állománybecslési  módszer  kidolgozása  A  megbízható  biológiai  eredmények  alapján  a  vonuló  állományt  nem  veszélyeztető  mértékű hasznosítás tervezése  Az  erdei  szalonka  vadászatának  az  Európai  Unió  Madárvédelmi  Irányelvében  foglaltaknak megfelelő jogi szabályozása  Az  erdei  szalonka  tavaszi  vadászatának,  mint  nagy  múltra  visszatekintő  hagyománynak, rekreációs értéknek megőrzése 

A kutatás irodalmi háttere Az erdei szalonka populációk megfigyeléseken alapuló vizsgálatai hazánkban és Európa több  országában is legalább évszázados múltra tekintenek vissza. Annak ellenére, hogy régre visszanyúló  irodalmi  forrásokkal  rendelkezünk  a  fajról,  számos  kérdésre  (például  a  populáció  méretére,  a  populáció trendjére) a mai napig nem tudunk egyértelmű választ adni.  A  BirdLife  International  internetes  adatbázisában  (BirdLife  International  2009)  a  következő  információk találhatók meg a fajról:    

A becsült teljes populációméret: 10.000.000 – 26.000.000 egyed  Elterjedési terület becsült nagysága: 15.100.000 km2  A populáció‐trend az elterjedési területen egységesen nincs megállapítva 

Az  IUCN  Vörös  Listáján  (a  BirdLife  International  ‐  az  IUCN  madarak  vörös  listájáért  felelős  hatósága – által értékelve) a „Legkevésbé Aggasztó Állományhelyzet” (Least Concern).  Az erdei szalonka elterjedése és európai állományainak helyzete az 1970‐es évek közepe óta  stabilnak  tekinthető  (Hagemeijer  és  Blair  1997).  A  legnagyobb  visszaesést  az  Egyesült  Királyságban  találták, ez vélhetően a faj számára fontos gyepterületek nagyságának csökkenésével, és az élőhelyek  minőségi  romlásával  hozható  összefüggésbe.  További  csökkenéseket  figyeltek  meg  Litvániában,  Ukrajnában,  és  Németországban,  az  Oroszországban  költő  populáció  méretében  észlelt  hullámzás  pedig  szintén  figyelmet  érdemel.  Ugyanakkor  Dániában,  Hollandiában,  Írországban,  és  Spanyolországban a költőterületek és az állománynagyság növekedéséről számoltak be (Hagemeijer  és Blair 1997).  Az  Európai  Unió  számára  a  2006‐2009  közötti  időszakra  erdei  szalonka  gazdálkodási  terv  készült,  melynek  alapját  egy  korábbi  tanulmány  képezte  (Ferrand  és  Gossmann  2001).  Hosszú  távú  (10 éves) célja az erdei szalonka Európai Unión belüli kedvező megőrzési státuszának kialakítása, míg  rövidtávon  három  fő  célt  nevez  meg:  A  faj  költő‐  és  telelőterületeinek,  élőhelyeinek  fejlesztése;  a  tartamos  hasznosítását  szolgáló  vadászati  gyakorlat  bevezetése/alakítása;  kutatási‐  és  monitoring  programok fejlesztése.  A gazdálkodási tervben leírtak alapján az egész elterjedési területén kérdéses a faj státusza,  számos  helyen  az  állományok  nagysága  csökkenő  trendet  mutat.  Nagyon  fontos  a  populáció 

115 

állapotának  pontos  meghatározása.  A  hosszú  távú  célok  elérésének  kulcsa  pedig  mindenképpen  a  nemzetközi szintű együttműködési programok kialakítása.  Magyarországon,  országos  szinten  az  elmúlt  évtizedekben  a  terítékadatok  kerültek  egységesen  rögzítésre,  az  Országos  Vadgazdálkodási  Adattár  éves  kiadványaiban  megtalálható  országos  összesített  adatok  nyújtanak  tájékoztatást  a  Magyarországon  elejtett  erdei  szalonkák  számáról.  Az  elejtések  száma  1997‐2007  között  5156  db  és  9538  db  között  változott.  Jelentős  hullámzás  figyelhető  meg  az  egyes  évek  eredményei  között,  eloszlásuk  nem  egyenletes.  Ezután  kvótarendszer  került  bevezetésre,  később  pedig  törölték  a  tavaszi  vadászati  idényt.  Az  adatok  természetesen  csak  a  teríték  változásait  mutatják,  ezekből  a  vonuló  állomány  nagyságára  kevésbé,  legfeljebb az abban az évek során bekövetkező változások irányára lehet következtetni.  Az erdei szalonka a magyar vadászati kultúrában fontos szerepet töltött be, ezt számos írásos  emlék  bizonyítja,  és  a  vadászati  idényének  eltörlését  követő  reakciók  ezt  nagyban  meg  is  erősítik.  Lesvadászata  évszázados  hagyományokra  tekint  vissza,  ám  nem  ez  volt  az  egyetlen  vadászati  mód,  amivel  az  idők  során  hasznosították.  Hajtásban  való  vadászata,  az  úgynevezett  „klopfolás”  szintén  nagy  népszerűségnek  örvendett  Magyarországon.  Ezt  azonban  1934‐ben  a  48.500/1934.  számú  rendelettel  megtiltották.  A  rendeletet  követő  viták  már  akkoriban  felvetették  egy  olyan,  országos  szintű,  egységes  statisztika  összeállításának  igényét,  mely  az  egyes  „magánstatisztikai”  adatok  összevonását,  szintetizálását  hivatott  szolgálni  (Dr.  P.  K.  1935).  További  érdekesség  a  fent  említett  rendelettel kapcsolatban, hogy azt 1937‐ben rövid időre fel is függesztették (Darányi 1937).  Az erdei szalonka a hazai vadászirodalomban is kiemelt helyet foglal el. Bár a róla szóló írásos  emlékek  döntő  hányada  a  vadászatával  kapcsolatos  élményekről,  tapasztalatokról  szól,  az  elmúlt  évszázadban  keletkeztek  olyan  művek  is,  melyek  a  faj  biológiájával,  életmódjával,  szaporodásával,  vonulásával  kapcsolatos  kérdések  tárgyalását  tűzték  ki  célul  (Lakatos  1904,  Schenk  1923,  Szabolcs  1974).  Az  éves  terítékek  (mennyiségi  adatok)  mellett  az  1990‐es  évekig  kevés  információval  rendelkeztünk vonuló erdei szalonka populációnk testméreteiről, ivari‐ és korviszonyairól (Faragó és  László  2005).  E  hiány  pótlása  céljából  kezdetben  Sopron  környékén,  később  országszerte,  teríték  monitoring  keretei  között  az  elejtett  madarak  testméreteinek  gyűjtésébe  kezdtek,  meghatározták  azok  ivarát  és  korát.  Az  ivar  meghatározását  boncolással,  a  kor  meghatározását  a  tollazat  alapján  végezték.  Az  elejtett  szalonkák  ivari  összetételéből  a  megfigyelések  során  észlelt  madarak  ivari  összetételére lehet következtetni. Ez azért fontos, mert az észlelt madarak ivararánya eltérhet a valós  viszonyoktól.  Franciaországban  például  –  ahol  a  magyar  gyakorlattól  eltérő  vadászati  mód  van  érvényben ‐ az elmúlt évek terítékében a hím nemű példányok aránya folyamatosan kisebb volt, mint  a  tojóké  (Boidot  2009).  Ezzel  szemben  a  magyarországi  eredmények  ennek  éppen  ellenkezőjét  mutatják. Ha tehát a megfigyelések során – viselkedésükből adódóan – itt csak bizonyos százalékát  észleljük  a  tojóknak,  akkor  ezt  a  számot  az  irodalmi  adatok  alapján  korrigálhatjuk  az  állomány  nagyságának  becslése  során.  Az  elejtett  szalonkák  korösszetétele  az  állomány  természetes  mortalitásának  becsléséhez  elengedhetetlen  információ.  A  terítékvizsgálat  folytatása  céljából  a  Nyugat Magyarországi Egyetem Vadgazdálkodási és Gerinces Állattani Intézete 2010‐ben csatlakozott  az erdei szalonka monitoring programhoz. 

116 

Célkitűzések Hallgatóként  a  program  kezdete  óta  részt  veszek  az  adatok  gyűjtésében,  archiválásában  és  feldolgozásában. Kutatási munkám keretében vizsgálataim az erdei szalonka Magyarországon vonuló  állományára irányulnak a következő célkitűzések szerint. 

Módszertani célok:   

A monitoring rendszer adatainak gyűjtése, archiválása és feldolgozása.  Az adatokat térinformatikai módszerekkel értékelő rendszer fejlesztése  A monitoring program adatgyűjtési és –feldolgozási módszereinek további fejlesztése  az  adatközlés  hatékonyságának  és  az  eredmények  megbízhatóságának  növelése  érdekében. 

Biológiai célok:   

Vonulásdinamikai modellek kidolgozása/alkalmazhatóságának tesztelése  A vonulást befolyásoló biotikus és abiotikus tényezők és hatásaik meghatározása  A vonuló állomány nagyságának becslése 

Gazdálkodási célok:   

A faj magyarországi hasznosításának tervezése  Az  Európai  Unió  Madárvédelmi  Irányelvében  (79/409  EGK)  foglaltaknak  megfelelő  derogációs jelentések szakmai hátterének kidolgozása  A monitoring és az eredmények integrálása a nemzetközi kutatási programokba. 

Módszerek Az adatgyűjtés a program kezdete óta az egész ország területén zajlik, jelenleg 4 év tavaszi és  őszi megfigyelési adatai állnak rendelkezésre (1. táblázat).  1. táblázat: Az erdei szalonka monitoring során gyűjtött adatlapok és a megfigyelési pontok száma évenként  és évszakonként   

 

2009 2010  2011  2012 

Tavasz  Megfigyelési pontok 856  922  Adatlapok  Ősz 

944 

7140 9112  10066 10319

Megfigyelési pontok 755  846  Adatlapok 

922 

906 

893 

7758 10368 10093 9913 



117 

A monitoring program tavaszi és őszi időszaka során gyűjtött adatok Az erdei szalonka megfigyelése rejtőzködő életmódja miatt nehéz, a hatékony adatgyűjtésre  ezért egy, a többi madárfajétól eltérő módszerrel van csak lehetőség. A módszer a „húzó” szalonkák  számlálásán alapul (Ferrand 1993). A húzás egyfajta figyelemfelkeltő viselkedés, mely a szaporodási  időszakban  a  hím  egyedekre  jellemző.  A  madarak  hajnalban  illetve  napnyugtakor,  az  erdők  lombkoronaszintjéhez közel repülnek, és korrogó és/vagy pisszegő hangot hallatnak, tojókat keresve  ezáltal. A megfigyelés során a húzó szalonkák számát kell rögzíteni, mely bár pontos, teljes számlálást  nem tesz lehetővé, bizonyítottan jellemzi a szalonkák sűrűségét adott területen (Hoodless és mtsai.,  2008,  Mulhauser  2010).  Az  őszi  megfigyelések  alkalmával  természetesen  nincs  lehetőség  kereső  hímek  számlálására,  azonban  hasonló  körülmények  között,  a  nappali  zárt,  erdős  pihenőhelyek  és  éjszakai nyíltabb táplálkozóhelyek között váltó madarak számlálhatók.  Az  önkéntes  résztvevők  által  évente  2*12  héten  át  hetente  egyszer  elvégzett  szinkronszámlálás  adatai:  a  „húzáson”  megfigyelt  (látott  és  hallott)  egyedek  száma;  az  egyes  megfigyelési pontok térbeli elhelyezkedése; a belátható területek becsült nagysága; a megfigyelések  időtartama;  a  megfigyelési  pontok  növényzeti  jellemzői;  a  megfigyelésekre  vonatkozó  időjárási  adatok.  Az  elektronikus  adatgyűjtés  során  a  megyei  koordinátorok  minden  héten  az  adott  heti  megfigyelések  adatait  juttatták  el  a  VMI  internetes  szerverére,  egy  általunk  létrehozott  webes  adatfeltöltő‐rendszer  segítségével.  A  kitöltött  elektronikus  adatlapok  gyűjtését,  rendszerezését  és  archiválását tavasszal és ősszel hetente végeztem el. A letöltött elektronikus adatlapokat  Microsoft  Office Excel 2003 programmal készítettem elő a további feldolgozásokhoz.  Az  elektronikus  adatlapokon  megadott  földrajzi  koordináták  leválogatását,  rendszerezését,  ellenőrzését,  és  adatbázisban  való  rögzítését  minden  héten  az  adott  heti  összesített  adatlapokból  végeztem  (ESRI  Arcview  3.1,  Google  Earth  4.2,  Ozi  Explorer  3.95.4q  szoftverek  segítségével).  A  megfigyelési  pontokat  térképi  ábrázolásuk  során  több  szempont  figyelembe  vételével  ellenőriztem:  megvizsgáltam, hogy az adott megfigyelési pont valóban az adatlapon megjelölt település közelében,  valóban  a  kódszámában  szereplő  vadgazdálkodási  egység  határvonalain  belül,  és  a  megfigyelés  elvégzésére valóban alkalmas területen (pl. nem folyó‐, állóvíz, település‐belterület) található.  A  megfigyelő  nevével  és  vadászjegyének  számával  ellátott,  valamint  az  illetékes  megyei  koordinátor  aláírásával  ellenjegyzett  papír  alapú  adatlapok  nemcsak  a  ténylegesen  végzett  megfigyelések hiteles bizonyítékai, hanem az elektronikus úton beérkezett adatok ellenőrzésében is  elengedhetetlen fontosságúak. A papír adatlapokat beérkezésük  után összevetettük az elektronikus  adatlapokkal az eltérések javítása és az adatbázis véglegesítése céljából.  Kimutatásokat  készítettem  minden  időszakban  a  résztvevő  vadgazdálkodási  egységek,  megfigyelési  pontok,  és  beérkezett  adatlapok  számáról.  A  vonulás  dinamikájának  bemutatásához  minden  megfigyelési  időpontra  kiszámítottam  az  észlelések  leíró  statisztikáit  valamint  a  pozitív  pontok  (olyan  megfigyelési  pontok,  ahonnan  legalább  egy  észlelést  jelentettek)  arányát.  Összevetésükkel  az  egyes  éven  belüli,  és  évek  közötti  esetleges  eltérésekről,  a  vonuló  állományban  bekövetkező  változásokról  is  képet  formálhatunk.  A  statisztikai  értékelést  az  R  (v2.15.0)  és  a  GraphPad  Instat  (v3.05)  szoftverekkel  készítettem.  A  térképen  ábrázolható  pontok  megfigyelési 

118 

adatait  feldolgozva  vonulási  területeket  becsültem  minden  megfigyelési  időpontra  „Kernel  Density  Estimation” módszerrel (Brunsdon 1995). Kiválasztottam azokat a megfigyelési pontokat, ahonnan az  adott héten pozitív válasz érkezett az észlelésre vonatkozóan (tehát legalább egy szalonkát láttak), és  ezek  alapján  készítettem  el  a  vonulási  területek  becsült  kontúrvonalait.  A  kontúrvonalak  azokat  a  területeket  határolják,  amelyeken  belül  –  a  megfigyelési  pontok  számából  és  elhelyezkedéséből  számítva – 90%, ill. 60 %‐os a valószínűsége, hogy olyan pont található, ahonnan szintén pozitív válasz  érkezhetett  volna.  Másképp  fogalmazva  a  csökkenő  százalékok  csökkenő  területeket,  ám  sűrűsödő  észleléseket  határolnak  körül.  A  legkisebb  területen  koncentrálódik  leginkább  a  vonuló állomány.  A  térinformatikai  módszereink  bővítésével  lehetőségem  nyílt  a  becslés  pontosítására,  így  a  feldolgozásokat már az egyes pontokon történt észlelések számának figyelembe vételével (súlyozás)  tudtam elvégezni (Hawth’s Analysis Tools v3.27). 

Eredmények Az  országos  kiterjedésű  monitoring  rendszer  működtetése,  az  adatok  archiválása  és  feldolgozása  tanulmányaim  során  megszakítás  nélkül,  hiánytalanul  megtörtént.  A  program  kezdeti  szakaszának  tapasztalatai  és  a  megfigyelők  visszajelzései  alapján  a  papír  alapú  és  elektronikus  adatlapokat  is  fejlesztettük,  áttekinthetőbbé  tettük.  A  tudományos‐  és  szakirodalmi  források  feldolgozásával  megismertük  és  összehasonlítottuk  a  fontosabb  európai  szalonka  monitoring  hálózatokat (Schally és Szemethy 2011).  Az észlelések számának és a pozitív pontok arányának alakulása minden tavasszal egycsúcsú  görbével  jellemezhető  (1.  ábra).  Ősszel  a  pozitív  pontok  arányának,  azaz  területi  lefedettségének  alakulása  szintén  egycsúcsú  (2.  ábra),  az  észlelt  szalonkák  számának  alakulása  ezzel  szemben  évenként nagy eltéréseket mutat.  A  tavaszi  csúcsokban  észlelt  szalonkák  számában  az  egyes  évek  között  eltérést  találtunk  (Schally és mtsai., 2012), az észlelések középértéke 1‐3 db között alakult az elmúlt négy év során. Az  észlelt  madarak  számában  valamint  a  pozitív  pontok  arányában  is  a  2012  tavaszi  adatok  jóval  elmaradtak a korábbi években tapasztaltakhoz képest.  A  becsült  vonulási  területek  mérete  a  pozitív  pontok  arányához  hasonlóan  alakult,  egyértelmű  irányt  vagy  térbeli  eltolódást  azonban  az  általunk  használt  módszerrel  nem  tudtunk  kimutatni.  Az  észleléseket  befolyásoló  tényezők  és  hatásaik  meghatározása,  az  állománybecslési  modellek kidolgozása és publikálása jelenleg folyamatban van. 

119 

100% 2009 2010 2011 2012

pozitív visszajelzések aránya

90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% NA

NA

02-28

03-07

03-14

03-21

03-28

04-04

04-11

04-18

04-25

05-02

02-13

02-20

02-27

03-06

03-13

03-20

03-27

04-03

04-10

04-17

04-24

05-01

02-12

02-19

02-26

03-05

03-12

03-19

03-26

04-02

04-09

04-16

04-23

04-30

02-11

02-18

02-25

03-03

03-10

03-17

03-24

03-31

04-07

04-14

04-21

04-28

Megfigyelési időpont

1. ábra: pozitív visszajelzések aránya tavasszal 2009‐2012 között 

pozitív visszajelzések aránya

100% 90%

2009

80%

2010

70%

2011

60%

2012

50% 40% 30% 20% 10% 0% 09-15

09-22

09-29

10-06

10-13

10-20

10-27

11-03

11-10

11-17

11-24

12-01

NA

NA

09-14

09-21

09-28

10-05

10-12

10-19

10-26

11-02

11-09

11-16

11-23

11-30

12-07

12-14

09-20

09-27

10-04

10-11

10-18

10-25

11-01

11-08

11-15

11-22

11-29

12-06

NA

NA

09-18

09-25

10-02

10-09

10-16

10-23

10-30

11-06

11-13

11-20

11-27

12-04

NA

NA

Megfigyelési időpont

2. ábra: pozitív visszajelzések aránya ősszel 2009‐2012 között 

120 

A megfigyelések mellett a vonuló állomány kor‐ és ivari összetételének vizsgálata és nyomon  követése  céljából  a  programban  részt  vevők  szigorúan  ellenőrzött  feltételek  mellett  kis  számú  elejtésre kaptak lehetőséget. Az elejtési kvótákat évente felülvizsgálva, a megfigyelési adatok alapján  határoztuk meg. A mintagyűjtés célú elejtéseket az Európai Unió felé derogációs jelentés formájában  jelenteni  kell.  A  2010.  és  2011.  évről  szóló  jelentést  a  Vidékfejlesztési  Minisztérium  készítette,  szakmai hátterét a monitoring adatainak felhasználásával készítettük el.  Az erdei szalonka vonuló állományának vizsgálatát az Országos Vadgazdálkodási Adattárral, a  Nyugat‐Magyarországi  Egyetem  Erdőmérnöki  kar  Vadgazdálkodási  és  Gerinces  Állattani  Intézetével,  az  Országos  Magyar  Vadászkamarával,  és  a  Magyar  Szalonka  Klubbal  közreműködve  végezzük.  A  kutatás  eredményeit  folyamatosan  publikáljuk,  előadásokkal  ismertetjük.  A  monitoring  program  résztvevői  számára  a  tavaszi  megfigyelések  kezdete  előtt  megyei  tájékoztatókat  tartunk  évente,  lehetőség  szerint  minden  megyében.  Doktori  tanulmányaim  megkezdése  óta  tagja  vagyok  a  Wetlands  International  Szalonka  és  Sárszalonka  Specialista  Csoportjának  (WSSG),  mely  egyedülálló  lehetőséget biztosít a nemzetközi információcserére. A csoport „7th Woodcock és Snipe Workshop”  című nemzetközi rendezvényt szervezett Szentpéterváron, ahol előadóként részt vehettem. 

Összefoglalás Az  ismeretanyag  bővítése,  a  Magyarország  területén  átvonuló  állomány  felmérése,  ezáltal  elfogadható  hasznosítás  tervezése  céljából  2009‐ben  Erdei  szalonka  monitoring  program  indult  a  Földművelésügyi  Minisztérium  és  a  vadászati  érdekképviseletek  kezdeményezésére.  A  program  kezdete  óta  részt  veszek  a  mintegy  900  önkéntes  résztvevő  által  évente  2*12  héten  át  hetente  egyszer  elvégzett  szinkronszámlálás  adatainak  gyűjtésében,  archiválásában  és  feldolgozásában.  Az  országos  kiterjedésű  monitoring  rendszer  működtetése,  az  adatok  archiválása  és  feldolgozása  tanulmányaim  során  megszakítás  nélkül,  hiánytalanul  megtörtént.  Az  észlelések  számának  és  a  pozitív  pontok  arányának  alakulása  minden  tavasszal  egycsúcsú  görbével  jellemezhető.  Ősszel  a  pozitív  pontok  arányának,  azaz  területi  lefedettségének  alakulása  szintén  egycsúcsú,  az  észlelt  szalonkák számának alakulása ezzel szemben évenként nagy eltéréseket mutat. A tavaszi csúcsokban  észlelt szalonkák számában az egyes évek között eltérést találtunk, az észlelések középértéke 1‐3 db  között  alakult  az  elmúlt  négy  év  során.  A  becsült  vonulási  területek  mérete  a  pozitív  pontok  arányához hasonlóan alakult, egyértelmű irányt vagy térbeli eltolódást azonban az általunk használt  módszerrel nem tudtunk kimutatni. Az észleléseket meghatározó abiotikus tényezők meghatározása,  az állománybecslési modellek kidolgozása jelenleg folyamatban van. 

Irodalomjegyzék Bibby C. J., Burgess N. D., Hill D. A. (1997): Bird Census Techniques. Academic Press Limited, London.  257p.  BirdLife  International  (2009)  Species  factsheet:  Scolopax  rusticola.  Downloaded  from  http://www.birdlife.org on 12/4/2010  Boidot  J‐P.  (2009):  Evaluation  of  the  2008/09  Woodcock  hunting  season  in  France.  WI/IUCN‐WSSG  Newsletter no 35: 38‐39.  Brunsdon C.  (1995):  Estimating  probability surfaces for geographical point data: an adaptive kernel  algorithm. Computers & Geosciences 21(7): 877‐894.  Dr. P. K. (1935): A szalonkakérdés. Nimród vadászújság 1935. március 20: 105‐107. 

121 

Darányi K. (1937): A m. kir. Földmívelésügyi Miniszter 23.618/19377. I. B. 2. számú rendelete az erdei  szalonka tavaszi hajtóvadászatára vonatkozó tilalom felfüggesztése tárgyában. Erdészeti Lapok  1937. március.  Faragó  S.,  László  R.  (2005):  Az  erdei  szalonka  (Scolopax  rusticola)  teríték  monitoring  eredményei  2002‐ben Magyarországon. Magyar Vízivad Közlemények 12: 247‐261.  Ferrand Y. 1993. A census method for roding Eurasian Woodcocks in France. Biological Report 16: 19‐ 25.  Ferrand  Y.,  Gossmann  F.  (2001):  Elements  for  a  Woodcock  (Scolopax  rusticola)  management  plan.  Game and Wildlife Science 18(1): 115‐139.  Ferrand Y., Gossmann F., Bastat C., Guénézan M. (2008): Monitoring of the wintering and breeding  Woodcock populations in France. Revista Catalana d’Ornitologia 24: 44‐52.  Fluck  D.  (2009):  Nouvelles  de  l’étranger.  La  Mordorée  ‐  Organe  Officiel  du  Club  National  des  Becassiers. 249. 48p.  Hagemeijer E. J. M., Blair M. J. (1997): The EBCC Atlas of European Breeding Birds: Their Distribution  and Abundance. T&AD Poyser, London. 903p.  Hoodless, A.N., Inglis, J.G., Doucet, J‐P. Aebischer, N.J. 2008. Vocal individuality in the roding calls of  Woodcock Scolopax rusticola and their use to validate a survey method. Ibis 150: 80‐89.  Lakatos K. (1904): Az erdei szalonka és vadászata. (Vadászati monográfia). Budapest‐Szeged. 165p.  Machado A. L., Ferrand Y., Gossmann F., Silveira A. M., Gonçalves D. (2008): Application of a roding  survey  method  to  the  sedentary  Eurasian  Woodcock  Scolopx  rusticola  population  in  Pico  Island, Azores. European Journal of Wildlife Research 54: 205‐214.  Mulhauser,  B.  2010.  Individual  recognition  and  monitoring  of  male  Eurasian  woodcocks  Scolopax  rusticola by characteristics of their roding calls. Ornithologische Beobachter 107: 39‐50.  Schally  G.,  Szemethy,  L.  (2011):  Comparison  of  Eurasian  Woodcock  (Scolopax  rusticola)  monitoring  methods. Agrár‐ és vidékfejlesztési szemle, 6(1): 45‐50.  Schally  G.,  Szemethy  L.,  Bleier  N.  (2012):  Woodcock  report  from  Hungary  ‐  Spring  2012.  WI/IUCN‐ WSSG Newsletter, 38, 6‐9.  Schenk J. (1923): Az erdei szalonka vonulása Európában. Aquila 24.  Szabolcs J. (1974): Az erdei szalonka. Második, javított kiadás. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest. 120p. 

Közlésre elfogadott, illetve megjelent válogatott publikációk jegyzéke Bleier N., Fáczányi Zs., Schally G. (2010): Eurasian Woodcock (Scolopax rusticola) monitoring in Buda  Mountain (Hungary). WI/IUCN‐WSSG Newsletter, 36: 14‐17.  Bleier N., Fáczányi Zs., Schally G. (2012): Eurasian woodcock (Scolopax rusticola) monitoring in Buda  Mountain (Hungary). WI/IUCN‐WSSG Newsletter, 38, 9‐12.  Fluck D., Schally G. (2010): FANBPO konferencia Gödöllőn. Nimród vadászújság, 98, 11.  Schally  G.,  Szemethy  L.  (2010):  Monitoring  of  the  wading  woodcock  population  in  Hungary.  F.A.N.B.P.O. (Fédération des Associations Nationales des Bécassiers du Paléarctique Occidental  ‐A  Nyugati  Palearktikus  Régió  Nemzeti  Szalonkázó  Szervezeteinek  Szövetsége)  2010.  évi  éves  teljes ülés, Gödöllő, Magyarország.  Schally  G.,  Bleier  N.,  Szemethy  L.  (2010):  Country‐wide  monitoring  of  the  migrating  Eurasian  Woodcock (Scolopax rusticola) populations in Hungary. WI/IUCN‐WSSG Newsletter, 36: 17‐20.  Schally  G.  (2011):  National  roding  censuses  of  migrating  Eurasian  woodcock  (Scolopax  rusticola)  populations in Hungary in spring 2009/2010. 7th Woodcock & Snipe Workshop. Szentpétervár,  Oroszország 2011 

122 

Schally  G.,  Fluck  D.  (2011):  The  1st  Meeting  of  the  Hungarian  Woodcock  ringers  (Karád,  2011).  WI/IUCN‐WSSG Newsletter, 37: 9‐10.  Schally G., Szemethy, L. (2011a): Comparison of Eurasian Woodcock (Scolopax rusticola) monitoring  methods. Agrár‐ és vidékfejlesztési szemle, 6(1): 45‐50.  Schally  G.,  Szemethy  L.  (2011b):  Woodcock  report  from  Hungary  –  Spring  2011.  WI/IUCN‐WSSG  Newsletter, 37: 6‐9.  Schally G., Szemethy L. (2011c): Az erdei szalonka tavaszi állományfelmérésének tapasztalatai 2011‐ ben. Vadász Hírmondó. Vadászok és vadgazdálkodók Észak‐Magyarországi Területi Szövetsége  és az Országos Magyar Vadászkamara B.‐A.‐Z. Megyei Területi Szervezete lapja, 21, 10.  Schally G., Szemethy L. (2012): Woodcock monitoring in Hungary 2009‐2012. F.A.N.B.P.O. (Fédération  des Associations Nationales des Bécassiers du Paléarctique Occidental ‐A Nyugati Palearktikus  Régió  Nemzeti  Szalonkázó  Szervezeteinek  Szövetsége)  2012.  évi  éves  teljes  ülés,  Limoges,  Franciaország.  Schally  G.,  Bleier  N.,  Szemethy  L.  (2012):  Monitoring  the  migration  of  the  Eurasian  Woodcock  in  Hungary. Hungarian Agricultural Research, 21(1): 13‐17.  Schally  G.,  Szemethy  L.,  Bleier  N.  (2012):  Woodcock  report  from  Hungary  ‐  Spring  2012.  WI/IUCN‐ WSSG Newsletter, 38, 6‐9.  Schally G., Fluck D. (2012): F.A.N.B.P.O. konferencia Limoges‐ban. Nimród vadászújság 100:(10) p. 17.  Szemethy L., Schally G., Bleier N., Lehoczki R., Kovács G. (2010a): Az erdei szalonka monitoring 2009.  évi  tavaszi  időszakának  értékelése.  In:  Pechtol  János  (szerk.)  Vadászévkönyv  2010.  Budapest:  Dénes Natúr Műhely Kiadó ‐ Országos Magyar Vadászkamara, pp. 88‐94.  Szemethy L., Schally G., Bleier N., Lehoczki R., Kovács G. (2010b): Az erdeiszalonka‐monitoring 2009‐ ben.  In:  Csányi  S.,  Heltai  M.  (szerk.):  Vadbiológiai  olvasókönyv.  Budapest:  Mezőgazda  Kiadó,  pp. 65‐70. (ISBN:978‐963‐286‐592‐8)  Szemethy  L.,  Schally  G.,  Bleier  N.,  Lehoczki  R.  (2010):  Beszámoló  az  erdeiszalonka‐monitoring  első  évének eredményeiről. In: Nagy E., Bíró Gabriella (szerk.): A vadgazdálkodás időszerű kérdései  10.  Budapest:  Dénes  Natúr  Műhely  Kiadó  ‐  Országos  Magyar  Vadászkamara,  pp.  21‐27.  (ISBN:978 963 9783 21 8)  Szemethy L., Bleier N., Schally G. (2011): Folytatódik az erdei szalonka monitoring. In: Pechtol János  (szerk.)  Vadászévkönyv  2011.  Budapest:  Dénes  Natúr  Műhely  Kiadó  ‐  Országos  Magyar  Vadászkamara, pp. 122‐126.   

123 

Név:  

Skoda Gabriella 

Kezdés éve: 

2011 

Képzés formája: 

nappali tagozatos 

Témavezető: 

Hiripi László 

Intézet, Tanszék: 

Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóintézet,   Állatbiotechnológiai Intézet, Kérődző Genom Biológia Csoport 

Elérhetőség: 

+3628526253  [email protected] 

Szuperizmolt nyúltörzs létrehozása cink‐finger nukleáz módszerrel A téma aktualitása, jelentősége A házinyúl célzott genetikai módosítása mai ismereteink szerint nem széleskörűen megoldott.  Mivel  a  nyúl  nagyon  fontos  bizonyos  humán  betegségek  modellezésében,  emiatt  célzott  genetikai  módosítására  nagy  igény  lenne.  Ezt  lehetővé  tévő  egyik  alternatíva  az  ún.  cink‐finger  nukleáz  (ZFN)  technológia alkalmazása, melyet munkám megkezdéséig senki nem publikált nyúlban.  A  házinyulat  Magyarországon  elsősorban  hústermelésre  hasznosítják.  Jól  jellemzett  húsnyúlfajták ismertek, azonban olyan házinyulat nem ismerünk mely szuperizmolt fenotípust mutat.  Háziállataink között viszont több ilyen fajta létezik, melyekből funkcionális és nagy élvezeti értékkel  bíró  húskészítmény  hozható  létre.  Szuperizmolt  nyúlvonal  kialakítása  és  jellemzése  tenyésztői  és  fogyasztói oldalról is nagy igényt mutathat. Emellett a szuperizmolt fenotípusú miosztatin génkiütött  nyúlvonal  izmoltságra  ható  faktorok  vizsgálatára  is  alkalmas  lehet,  így  orvostudományi  és  gyógyszerészeti szempontból is hasznosítható lenne.  A  transzgénikus  nyulak  sok  szempontból  előnyösebb  modellállatok  mint  a  patkány,  vagy  az  egér.  Jobban  vizsgálhatók  bennük  az  érszűkület,  a  lipoprotein  metabolizmus  és  keringési  rendszer  betegségei,  mint  egyéb  emlős  modellekben,  mivel  az  emberi  fiziológiás  és  patológiás  állapotokat  jobban képesek tükrözni (Bősze és mtsai., 2003).  A  cink‐finger  nukleáz  egy  szintetikus  fehérje,  amelyet  egy  cink‐finger  DNS‐kötő  domén  és  a  FokI restrikciós endonukleáz hasító doménje alkot. A ZFN‐okat specifikus helyeken történő duplaszálú  DNS törések előidézésére használják, ezáltal elősegítik a hely‐specifikus homológ rekombinációt és a  lókuszok  célzott  manipulációját  különböző  sejttípusokban  (Cathomen  és  mtsai.,  2008).  Néhány  esetben (5‐10%) a DNS javítás nem tökéletes, így bázispárok deléciója vagy inzerciója jön létre, ami  így frame shift mutációkat generál, ezáltal megakadályozhatja a kívánt fehérje termelését (Durai és  mtsai.,  2005).  A  FokI  endonukleáz  dimer  fehérjeként  működik,  ennek  következtében,  egy  pár  ZFN  szükséges  egy  duplaszálú  DNS  töréséhez.  A  dimerizáció  szükséges  volta  miatt  két  különböző  ZFN  célhelyhez  való  kötődését  kell  biztosítani.  Az  egyes  ZFN‐ok  12‐18  bázispárból  álló  célszekvenciákat  ismernek fel, amelyeket 4‐7 bázispár választ el egymástól. Ez szükséges ahhoz, hogy a katalitikusan 

124 

aktív  FokI  endonukleáz  képes  legyen  a  hasításra.  Ez  a  struktúra  biztosítja  a  rendszer  magas  specificitását (Bitinaite és mtsai., 1998).  A  ZFN  alapú  génkiütéses  technika  nagyon  hatékony  nemcsak  különböző  sejtvonalakon,  de  gerinces embriókban is, így patkányban, zebradánióban, sertésben (Geurts és mtsai., 2009, Foley és  mtsai., 2009). 2011 júniusában jelent meg az első és eddig egyetlen cikk, melyben nyúlon használták  a  ZFN‐t  IgM  gén  kiütésére  (Flisikowska  és  mtsa.,  2011).  A  ZFN  génkiütéses  technikát  egysejtes  megtermékenyített  embriókon  végzik.  A  ZFN‐t,  mRNS,  fehérje  vagy  DNS  formában  injektálják  előmagba,  citoplazmába,  vagy  a  petébe  (zebradánió),  ahol  a  célszekvencián  duplaszálú  törést  generálnak.  A  duplaszál  törése  elősegíti  a  nem  homológ  végek  kapcsolódását  és  kihasználva  a  DNS  javítás  nem  tökéletes  voltát,  létrejön  a  mutáció.  Az  injektálást  követően  az  embriókat  álvemhes  anyákba  ültetik  és  a  megszületendő  utódokat  a  célgén  mutációira  szűrik,  majd  a  mutáns  alapító  egyedeket azonosítják. 

Célkitűzések Munkánk  során  az  előzőleg  említett  transzgénikus  módszert  kíséreltük  meg  alkalmazni  laboratóriumi  nyulakban  szuperizmolt  vonal  létrehozása  céljából.  Első  megközelítésben  egy  markergén segítségével próbáltuk ki a technológiát. Ez a markergén a zöld fluoreszcens (GFP) gén. Az  MBK  Kérődző  Genom  Biológia  Csoportjának  laboratóriumában  rendelkezésre  állnak  olyan  transzgénikus  nyulak,  melyek  minden  sejtjükben  termelik  a  GFP  markergént.  Első  évben  az  erre  a  génre  tervezett  ZFN  felhasználásával  próbáltuk  kiütni  a  fluoreszcens  fehérjét.  Ennek  hatására  azt  vártuk,  hogy  az  elrontott  GFP  gén  miatt  a  nyulak  UV  fényben  nem  fluoreszkálnak,  és  a  GFP  szekvenciájában deléciós mutációkat tudunk majd kimutatni.  Terveink között szerepelt, hogy a második évben a létrehozott transzgénikus alapító egyedek  molekuláris  jellemzését  végeznénk  el,  továbbá  a  technika  optimalizálását  házinyúlban  (koncentrációk, körülmények, pufferek stb.)  A  harmadik  év  célkitűzéseként  a  nyúl  miosztatin  gén  első  kódoló  exonját  elrontó  ZFN  megtervezése szerepelt. Ami könnyen megoldható, hiszen a nyúl miosztatin gén szekvenálása 2010‐ ben megtörtént Du és munkatársai által (Genbank GU938461, NM_001109821). Következő lépésként  a miosztatin hiányos nyulak létrehozását tűztük ki célul, majd a vonal alapítást. Ezen eredményeinket  terveztük nyilvánosságra hozni a harmadik év végén. Ezt követnék a húsminőségi vizsgálatok, de ez  már nem a PhD tématerv része. 

Módszerek Molekuláris módszerek A GFP génre irányuló ZFN tervezése már megtörtént közreműködő laboratórium által, ezért  ennek beszerzése gyors és könnyen megoldható volt.   A  plazmidot  kompetens  sejtekben  szaporítottuk  fel,  majd  Qiagen  Plasmid  Maxi  Kit  segítségével  tisztítottuk  ki.  Ezt  követően  a  plazmidot  restrikciós  emésztésnek  vetettük  alá,  majd  gélből  izoláltuk,  és  tisztítottuk  a  megfelelő  DNS  fragmentet.  Az  így  kapott  lineáris  DNS‐ről  in  vitro 

125 

transzkriptumot  hoztunk  létre  mMESSAGE  mMACHINE®  T7  Kit  használatával.  A  létrejött  mRNS‐t  injektáltuk később az egysejtes nyúl embriók előmagjába és/vagy citoplazmájába.   Egy  másik  megközelítésben  csak  a  lineáris  plazmid  DNS  mikroinjektálása  történt  a  zigóták  egyik előmagjába.  Az  utódok  megszületése  után  szövetmintát  vettünk  az  egyhetes  állatok  füléből,  majd  ebből  tisztítottunk  ki  DNS‐t  fenol‐kloroformos  kicsapással.  Az  így  kapott  mintákból  PCR  segítségével  válogattuk  ki  a  GFP‐t  tartalmazó  DNS‐eket,  amiket  gélelektroforézissel  (1%  agaróz  gélen)  tettünk  láthatóvá  és  értékelhetővé.  A  felsokszorozott  GFP  szekvencia  részleteket  megszekvenáltuk  és  a  szekvencia  adatokat  Chromas,  MEGA4  és  Staden  programokkal  elemeztük.  A  szekvenálás  mellett  eredményeinket visszaigazoltuk fluorescens módon jelölt PCR termékek fragment analízisével.   A  plazmid  működőképességének  ellenőrzése  érdekében  kipróbáltuk  GFP‐t  expresszáló  egér  fibroblaszt  sejtvonalon  a  rendszert.  Ehhez  megfelelő  típusú  egér  fibroblaszt  sejtvonalat  kellett  létrehozni,  fenntartani,  melynek  sejtjeibe  később  a  lineáris  plazmid  DNS‐t  jutattuk  be  elektroporációval. A hatékonyságot fluoreszcensmikroszkóp segítségével állapítottuk meg. 

Kísérleti állatokhoz kapcsolódó módszerek Új‐Zélandi Fehér nyúl fajtával dolgoztunk, melyekből PMSG és HCG hormonok használatával  történő  szuperovuláltatás  után  embriókat  nyertünk  ki  a  petevezető  átmosásával.  A  kimosott  egysejtes  embriókat  embrióolaj  alatt  lévő  M2  oldatban  termosztátba  helyeztük  a  mikroinjektálás  megkezdéséig.  A  zigótákat  a  cink‐finger  nukleázt  tartalmazó  mRNS  ill.  DNS  oldattal  injektáltuk  3D  manipulátorokkal  felszerelt  mikroszkóp  segítségével.  A  beavatkozást  túlélt  embriókat  endoszkópos  módszerrel  visszaültettük  álvemhes  nőstény  nyulak  petevezetőibe,  és  vártuk  az  utódok  megszületését. 

Eredmények A  cink‐finger  nukleáz  mikroinjektálása  során  fontos  feladat  a  megfelelő  minőségű  és  koncentrációjú  biológiailag  aktív  in  vitro  transzkriptum  létrehozása.  Kísérleteink  során  sikerült  létrehozni  a  mesterséges  CAP  védőfehérjével  ellátott  in  vitro  transzkriptumot,  mely  az  injektálás  körülményei között sem degradálódik. Az 1. táblázat tartalmazza az injektálás eredményeit.   17  db  recipiens  nősténybe  ültettünk  vissza  a  mikromanipulált  embriókat,  melyekből  9  nőstény szült. A megszülető utódok száma összesen 28 volt. Ebből 18 állat tartalmazta a GFP gént. A  beültetés hatékonysága megfelel a nemzetközi gyakorlatnak (kb 50%). A megszületett utódok száma  azonban  kissé  elmarad  a  laboratóriumunkban  várt  értéktől.  Ennek  lehet  oka  az,  hogy  a  cink‐finger  nukleázok  nem  megfelelő  koncentrációban  lehetnek  enyhén  toxikusak.  Ezt  a  problémát  úgy  próbáltuk  kiküszöbölni,  hogy  a  kísérletek  utolsó  harmadában  csökkentettük  az  injektált  mRNS  koncentrációját.   

126 

1. Táblázat  Beültetett  embriók száma 

Recipiens  nőtények száma 

Ellett nőstények  száma 

Megszülető  utódok száma 

GFP‐t tartalmazó  utódok száma 

331 db 

17db 

9 db 

28 db 

18 db 

  A  zöld  egyedekből  nyert  GFP  szekvenciáját  határoztunk  meg,  és  itt  kerestük  a  lehetséges  mutációkat. Az ZFN rendszer irodalomban talált nagy hatékonysága ellenére eddig egyetlen utódban  sem találtunk mutációt az utódok GFP génjében.   A  kísérlet  folyamán  többször  is  újra  tisztítottuk  a  ZFN  plazmidot,  illetve  mRNS‐t,  hogy  megbizonyosodjunk arról, hogy nem a bevitt nukleinsavban van a hiba.  Már  számos  publikáció  jelent  meg  a  ZFN  hatékonyságáról  egerekben,  ezért  kipróbáltuk  a  plazmidunkat  GFP‐t  tartalmazó  egér  embriókon  is.  Melynek  eredményeit  a  következő  táblázat  mutatja.  2. Táblázat  Beültetett  embriók száma 

Recipiens  nőtények száma 

Ellett nőstények  száma 

Megszülető  utódok száma 

GFP‐t tartalmazó  utódok száma 

132 db 

6 db 

3 db 

12 db 

3 db 

  A  megszülető  egér  utódok  között  sem  találtunk  GFP  mutációt  hordozó  egyedeket.  Miután  sem  nyulakban,  sem  egerekben  nem  kaptunk  pozitív  eredményt,  a  cink‐finger  nukleáz  plazmid  működőképességét  ellenőriztük  GFP‐t  tartalmazó  egér  fibroblaszt  sejtvonalon.  Az  elektroporációval  bejuttatott lineáris DNS a kísérletünkben nem fejtett ki hatást a sejtekben, a kontrollhoz viszonyítva  minden sejt ugyanolyan mértékben expresszálta a GFP‐t.  Mivel a tesztelt három rendszer egyikében sem sikerült igazolni a cink‐finger nukleáz hatását,  valamint  laboratóriumunkban  párhuzamos  kísérletben  más  cink‐finger  nukleáz  hatékony  módon  működött  rágcsáló  rendszerben,  ezért  feltételezzük,  hogy  a  megrendelt  nukleázt  hordozó  plazmid  tartalmaz olyan hibát, mely miatt nem elég specifikus a konstrukció.  Miután munkánk során nem kaptunk kielégítő eredményt, és emellett lehetőségünk nyílt rá,  ezért a jövőben a TALEN (Transcription activator‐like effector nucleases) rendszer kipróbálása mellett  döntöttünk (Gaj és mtsai., 2013). A TALEN működése hasonló az általunk kipróbált módszeréhez. A  TALEN  egy  FokI  restrikciós  endonukleázból  és  egy  dimerekből  álló  DNS‐kötő  doménből  álló  fúziós  fehérjemolekula, mely célzott kettős DNS hasítást tesz lehetővé. Az eddig megjelent publikációkban  dicsérik a TALEN hatékonyságát egérben és patkányban egyaránt, emellett kevesebb off target hatást  tulajdonítanak neki (Mussolino és mtsai., 2011).  A nyúl genomban a miosztatin gén 3 kódoló exonból és 2 intronból áll. Mivel nincs a génben  5' nem kódoló exon, ezért érdemesnek találtuk az első kódoló szakasz első felére tervezni  a TALEN  konstrukciót,  amit  meg  is  tettünk  az  Applied  Biosystem  segítségével.  Az  első  exon  372  bp  hosszú, 

127 

tehát  elég  nagy  ahhoz,  hogy  több  konstrukciót  is  tudjunk  rá  tervezni.  Ez  azért  fontos,  hogy  kiküszöböljük a nem megfelelő specificitás lehetőségét.  Tehát a nemsokára elkezdődő kísérleteinkhez már rendelkezünk 2 féle megtervezett TALEN  rendszerrel. 

Összefoglalás Munkám  első  évében  megpróbáltunk  létrehozni  GFP  knockout  nyúltörzset  cink‐finger  technológia  segítségével,  melynek  során  elsajátítottam  a  szükséges  technikák  alkalmazását,  mind  a  molekuláris,  mind  az  állatokhoz  kapcsolódó  módszerek  lépéseit  sikerült  megtanulnom  és  alkalmaznom. Az embriók mikromanipulációját és recipiens anyába való visszaültetését egér és nyúl  rendszerben gyakoroltam. A két faj zigótájának mikroinjektálása nem különbözik sokban, viszont az  egérbe és nyúlba való embrió beültetés már jelentős különbségeket hordoz.  Egereken  történő  munkám  során  bekapcsolódtam  egy  másik,  a  csoportban  futó  porjektbe  (Regulomix  projekt),  melynek  keretein  belül  transzgénikus  egérvonalakat  hoztunk  létre  sikeresen.  Ebben a kísérletben szarvasmarha szabályozó SNP‐ket vizsgáltunk egérmodellben.  PhD  témámhoz  kapcsolódó  kísérleteinket  mostantól  a  TALEN  rendszer  alkalmazásával  folytatjuk,  amelytől  azt  várjuk,  hogy  hatékonyan  fog  működni  nyúlban.  Ebből  már  a  konstrukciók  megtervezése meg is történt. 

Irodalomjegyzék Bitinaite  J.,  Wah  D.A.,  Aggarwal  A.K.,  Schildkraut  I.  (1998):  FokI  dimerization  is  required  for  DNA  cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 95(18):10570‐10575.   Bősze  Zs.,  Hiripi  L.,  Carnwath  J.W.,  Niemann  H.  (2003):  The  transgenic  rabbit  as  model  for  human  diseases and as a source of biologically active recombinant proteins. Transgenic Res. 12(5):541‐ 53.  Cathomen  T.,  Joung  J.K.  (2008):  Zinc‐finger  nucleases:  the  next  generation  emerges.  Mol  Ther.  16(7):1200‐7.    Du  R.,  Du  J.,  Qin  J.,  Cui  L.C.  (2010):  Isolation,  Cloning  and  Sequence  Analysis  of  the  Myostatin  Promoter in Rabbit. Genbank GU938461, NM_001109821   Durai  S.,  Mani  M.,  Kandavelou  K.,  Wu  J.,  Porteus  M.H.,  Chandrasegaran  S.  (2005):  Zinc  finger  nucleases:  custom‐designed  molecular  scissors  for  genome  engineering  of  plant  and  mammalian cells. Nucleic Acids Res. 33(18):5978‐5990.   Flisikowska T., Thorey I.S.,  S., Ros F., Lifke V., Zeitler B., Rottmann O., Vincent A., Zhang L., Jenkins S.,  Niersbach H., Kind A.J., Gregory P.D., Schnieke A.E., Platzer J. (2011): Efficient Immunoglobulin  Gene  Disruption  and  Targeted  Replacement  in  Rabbit  Using  Zinc  Finger  Nucleases.  Plos  ONE  6(6): 1‐10  Foley  J.E.,  Yeh  J.R.,  Maeder  M.L.,  Reyon  D.,  Sander  J.D.,  Peterson  R.T.,  Joung  J.K.  (2009):  Rapid  mutation  of  endogenous  zebrafish  genes  using  zinc  finger  nucleases  made  by  Oligomerized  Pool ENgineering (OPEN). PLoS One. 4(2):e4348.   Gaj  T.,  Gersbach  C.A.,  Barbas  C.F.  (2013):  ZFN,  TALEN,  and  CRISPR/Cas‐based  methods  for  genome  engineering. Trends in Biotechnology In press. Online available.  Geurts  A.M.,  Cost  G.J.,  Freyvert  Y.,  Zeitler  B.,  Miller  J.C.,  Choi  V.M.,  Jenkins  S.S.,  Wood  A.,  Cui  X.,  Meng X., Vincent A., Lam S., Michalkiewicz M., Schilling R., Foeckler J., Kalloway S., Weiler H.,  Ménoret  S.,  Anegon  I.,  Davis  G.D.,  Zhang  L.,  Rebar  E.J.,  Gregory  P.D.,  Urnov  F.D.,  Jacob  H.J., 

128 

Buelow  R.  (2009):  Knockout  rats  via  embryo  microinjection  of  zinc‐finger  nucleases.  Science.  325(5939):433.  Mussolino  C.,  Morbitzer  R.,  Lütge  F.,  Dannemann  N.,  Lahaye  T.,  Cathomen  T.  (2011):  A  novel  TALE  nuclease  scaffold  enables  high  genome  editing  activity  in  combination  with  low  toxicity.  Nucleic Acids Research, 39(2): 9283–9293.   

129 

Név: 

Szentes Katalin 

Kezdés éve: 

2010 

Képzés formája: 

nappali tagozatos 

Témavezető: 

Szabó Tamás 

Társ‐témavezető: 

Horváth Ákos 

Intézet, Tanszék: 

Környezet‐ és Tájgazdálkodási Intézet, Halgazdálkodási Tanszék 

Elérhetőség: 

+362852200/2317  [email protected]  

A hormonindukció hatása a barramundi (Lates calcarifer) korai ivarátfordulására A téma aktualitása, jelentősége A barramundi (Lates calcarifer) Délkelet‐Ázsia egyik fontos tenyésztett halfaja, versenyképes  termelést lehetővé teszi az energiatakarékos és környezetbarát technológiák alkalmazása az intenzív  rendszerekben.  Különleges  húsminőségének  köszönhetően  keresett  faj  az  európai  piacokon  is.  A  magyarországi  halgazdálkodás  diverzifikációját  célozta  meg  az  a  projekt,  amelynek  a  SzIE  Halgazdálkodási  Tanszéke  is  aktív  résztvevője.  A  projekt  a  Magyarországon  még  ismeretlen,  de  Európában  jelentős  piaccal  rendelkező  barramundi  tenyésztését  indítja  el.  A  halfaj  édesvízben  is  nevelhető,  így  komoly  kitörési  pontot  jelenthet  a  hazai  haltermelés  számára.  A  faj  nevelésére  a  Jászkiséri Halas Kft. termálvízre alapozott intenzív haltartó rendszerében kerül sor.  A  barramundi  tenyészállományok  kialakításánál  több  probléma  is  jelentkezik,  különösen  édesvízi  rendszerekben.  A  halak  ivaréréséhez  nem  feltétlenül  kell  tengervíz,  ugyanakkor  az  ivarsejtjeik  aktivációjához,  illetve  az  ikra  inkubációjához  viszont  igen.  Mivel  a  tenyészállomány  egyedei  folyamatosan  alakulnak  át  ikrássá,  gondoskodni  kell  a  tejes  egyedek  folyamatos  utánpótlásáról.  A  faj  tejesei  igen  kis  mennyiségű  spermát  termelnek,  ami  eddigi  tapasztalataink  alapján hormonkezelés útján sem növelhető. Nem tudjuk, hogy az édesvízben nevelt, majd átfordult  egyedek  petefészke  milyen  érettségi  stádiumig  jut  el  és  indukálható‐e  folyamatosan  édesvízben  tartott egyedek ovulációja. Ugyanakkor egy saját tenyészállomány felnevelése mindenképpen előnyt  és biztonságot jelentene, hiszen – valószínűleg pont a tenyészállatok tartásának nehézségei miatt –  az európai barramundi nevelő telepek külső beszállítóktól (a Távol‐Keletről illetve Izraelből) szerzik be  a nevelésre szánt ivadékot, így erősen importfüggők. 

Célkitűzések Kutatómunkánk  során  az  Ázsia  délkeleti  részén  jelentős  mennyiségben  tenyésztett  halfaj  előállításának eddig a világon kellően nem tisztázott részletét kívántuk feltárni.  A  mesterséges  környezetben  történő  nevelés  céljai  túlmutatnak  az  áruhal  és  a  telepítő‐,  illetve  népesítőanyag  előállításon,  a  szaporításra  alkalmas  anyaállomány  felnevelése  további,  gazdasági  és  tudományos  szempontból  is  meghatározó  lehetőségeket  rejt  magában.  A  fenti  célok 

130 

ezért indokolják a felnevelt állomány szaporodásbiológiai vizsgálatát is, ezáltal téve gazdaságosabbá  és biztonságosabbá a szóban forgó faj fenntartható termelését.  Vizsgálatunk  során  a  halak  spermiációját  szerettük  volna  indukálni  sorozatos  hormonkezeléssel. 

Módszerek Az  előnevelt  barramundi  ivadékokat  Izraelből  szállítják  Magyarországra,  a  Madan‐Ma’agan  Micheal  Fish  Breeding  Center‐ből,  az  ivadék  szállítás  egész  évben  folyamatosan  biztosított.  Az  ivadékok  testtömege  0,2‐1  gramm  közötti  érték,  átlagosan  0,5  gramm.  Az  ivadékok  rövid  akklimatizációs  idő  után  kerülnek  be  a  jászkiséri  telep  zárt  recirkulációs  rendszerébe.  A  nevelés  kezdetén a telepítési sűrűség 5 kg ivadék/1000 liter víz, 4 köbméteres utónevelő körmedencékben.  20  grammos  testtömeg  elérésekor  az  állományt  áthelyezik  az  áruhal  nevelő  medencékbe,  melyben  80 kg hal/1000 liter víz a telepítési sűrűség, és a medence mérete 54 köbméter. Az állományt teljes  értékű haltakarmánnyal etetik, az Aller Aqua cég tápjaival. A testtömegre vetítve az ivadékok 4‐10%,  az  áruhalak  100  grammos  testtömegig  2%,  felette  1%,  a  kívánt  testméret  elérése  után  0,5%  takarmányt kapnak. Az alkalmazott fényprogram minden haltartó épületben 12 órás. A nevelés ideje  alatt a víz hőmérsékletét folyamatosan 27 °C‐on tartják (+/‐1°C eltéréssel).  A sorozatos hormonkezelés hatásait vizsgáló kísérletünkben a 21 hónapos életkorú egyedek  közül  véletlenszerűen  választottunk  ki  30  halat,  melyeket  két  csoportra  osztottunk  (15  egyed/csoport),  és  az  egyedeket  a  csoportok  szerint  jelöltük  (BH:  hipofizált‐,  BK:  kontroll  csoport),  valamint  megmértük  a  testparamétereiket.  Az  egyedeket  mindkét  kísérlet  esetében  hátizomba  injektált  elektronikus  jeladóval  (PIT,  passive  integtared  transponder  tag),  jelöltük  meg  leolvasó  készülékkel  azonosítottuk  a  halakat.  A  hipofízis  injekcióval  kezelt  csoport  oltásait  altatásban  végeztük,  melyhez  2‐fenoxietanolt  használtunk.  Az  oltás  során  5mg/testtömegkilogramm  ponty  hipofízist  sóoldatban  (SalsolA,  Teva)  oldva  injektáltunk  a  halak  hasüregébe.  A  kontroll  csoport  egyedeinek  hasüregébe  sóoldatot  injektáltunk.  Az  oltásokat  a  kísérlet  során  hetente  ismételtük.  A  kezelt, illetve kontroll csoport halaiból 2 havonta 5‐5 egyedet feláldoztunk és szövettani vizsgálatokat  végeztük el az ivarszerveiken.   A  halak  testhosszát,  testtömegét  megmértük,  az  ivarszerveiket  pedig  8%‐os  pufferolt  formalinban  rögzítettük.  Metszeteket  készítettünk  az  ivarszervek  fej  felőli,  középső  és  farok  felőli  részéből  a  lehetséges  heterogenitás  felderítésére.  Az  ivarszerveket  víztelenítettük,  majd  paraffinba  ágyazva szánkás mikrotómmal 4‐7 μm vastag metszeteket készítettünk, amelyeket hematoxilin/eozin  festékkel  festettünk  meg.  A  metszeteket  Nikon  Eclipse  E600  mikroszkóppal  vizsgáltuk  és  QImaging  MicroPublisher  3.3  digitális  fényképezőgéppel  fényképeztük  le.  A  mikroszkópos  vizsgálatokat  követően  a  Guiguen  és  mtsai  (1994)  által  közölt  kategóriákba  soroltuk  az  ivarszerveket  éretsségi  állapotuk szerint.  Összesen  négyszer  vettünk  mintát  a  halaktól,  a  kísérlet  beállításakor  21  hónapos  korukban,  majd 23, 25 és 27 hónapos korukban (a 9., 18. és 27. oltást követően). 

131 

Eredmények Vizsgálatunk  a  jászkiséri  haltartó  telepen  2011.  október  24‐én  kezdődött,  az  utolsó  mintavétel  2012.  május  3‐án  történt.  A  halak  egészségi  állapotára  nem  volt  káros  hatása  a  kezeléseknek (egyedi jelölés, hetente esedékes altatás, injektálás), egyetlen egyed sem pusztult el a  kísérlet  időtartama  alatt.  Az  állomány  testtömege  és  testhossza  a  kísérlet  végéig  növekedett.  A  kísérlet  beállításakor  az  állomány  ivarérett  tejesekből  állt,  a  szövettani  metszeteken  a  herecsatornácskák többségében érett spermiumokat találtunk, a halak heréjéből nyert spermiumok  mesterséges tengervíz hatására aktiválódtak.   Az  első  mintavétel  során,  két  hónappal  a  kísérleti  beállítás  után  már  találtunk  ivarváltáson  átesett  egyedeket.  A  kontroll  csoport  minden  egyede  ivart  váltott,  a  hipofízis  injekcióval  kezelt  csoport 5 egyedéből 4‐nél tapasztaltuk ezt, és csupán 1 egyed maradt tejes. A szövettani metszetek  vizsgálatakor  megállapítottuk,  hogy  az  átalakuló  ivarszerv  státuszától  függetlenül  homogén,  a  dorzális,  centrális,  ventrális  részeken  azonos  sejtállapotokat  figyeltünk  meg.  Az  eltérő  fejlődési  stádiumú  sejtek  egymástól  elkülönülve,  körkörös  sávokba  rendeződve  találhatók.  Az  átalakuló  ivarszervben a herére és a petefészekre jellemző sejttípusokat nem választja el egymástól membrán,  a működő herében megfigyelhetők ovocita‐szerű sejtek, de ezek nem alakítanak ki ovariális szövetet.  A  protoplazmás  fejlődési  szakaszban  lévő  ovociták  az  ivarszerv  ventrális  oldalán  találhatók  egyenként,  vagy  kisebb  csoportokban.  Átmérőjük  átlaga  20  és  50  µm  közötti  érték.  Az  ivarszerv  metszetek mikroszkópos vizsgálata során hermafrodita ivarszervet nem találtunk.   A  következő  mintavételre  a  kísérlet  negyedik  hónapjában  került  sor,  ekkor  a  halak  25  hónaposak  voltak.  A  kontroll  és  a  hipofizált  csoporton  kívül  mintát  vettünk  5,  az  árutermelő  állományból  származó  hal  ivarszervéből  is  összehasonlításképp.  Azt  tapasztaltuk,  hogy  a  kontroll  csoport  továbbra  is  kizárólag  ivarátforduláson  átesett,  ikrás  egyedekből  állt.  Az  ovociták  sejtmagjában egy sejtmagvacska található, a citoplazma erősen bazofil, a follikuláris tok egyrétegű. A  hipofizált  csoport  2  tejes  és  3  ikrás  egyedből  állt.  Az  árutermelő  állományban  kizárólag  tejes  egyedeket találtunk.  A kísérlet hatodik hónapjában szintén a két kísérleti csoportból és az árutermelő medencéből  vettünk mintát, ekkor a halak 27 hónaposak voltak. Ekkorra a kontroll csoport és hipofizált csoport  mind  a  tíz  egyede  átesett  az  ivarátforduláson,  kizárólag  petefészkeket  láttunk  az  ivarszervek  szövettani  metszetének  mikroszkópos  vizsgálatakor.  Ezzel  szemben  az  árutermelő  medencében  továbbra is kizárólag tejes egyedeket találtunk.   

132 

1. táblázat: Az ivari érés megoszlása az ázsiai tengeri sügér (Lates calcarifer) vizsgált korcsoportjaiban.  Életkor 

Árutermelő  medencéből kivett  (db) 

Kontroll (db) 

Hipofizált (db) 

♂ 

♀ 

♂ 

♀ 

21 hónapos 

5 

0 

5 

0 

23 hónapos 

0 

5 

1 

4 

25 hónapos 

0 

5 

2 

3 

5 

0 

27 hónapos 

0 

5 

0 

5 

5 

0 

 

♂ 

♀     

Összefoglalás Vizsgálataink eredményei alapján megállapíthatjuk, hogy a hipofízis injektálás elősegítette az  édesvizi  recirkulációs  rendszerben  tartott  barramundi  spermatogenezisét,  mivel  előrehaladottabb  érési  stádiumokat  figyeltünk  meg  a  kezelt  halak  ivarszervének  külalakját  és  szövettani  metszetét  vizsgálva,  mint  az  árutermelő  állományból  vizsgálatra  kivett  tejes  egyedek  esetében.  Emellett  a  hipofízissel  kezelt  csoport  egyedei  később  alakultak  át  ikrásokká,  mint  a  kontroll  halak.  A  kontroll  csoport minden egyedében a kísérlet beállítása utáni második hónapra végbe ment az ivarátfordulás,  ez  alapján  érdemes  lenne  további  vizsgálatokat  folytatni  az  állománysűrűség  szaporodásbiológiai  állapotra gyakorolt hatásával kapcsolatban, mivel ez volt az egyetlen olyan tényező, amelyben nem  egyeztek a kísérleti medence és az árutermelő medence paraméterei.  A  vizsgált  ivarszervek  alapján  megerősítettük  más  szerzők  azon  megfigyelését,  miszerint  az  ivarérés mesterséges tartáskörülmények között gyorsabban végbe megy a halakban, mint ahogy azt a  természetes  vizekben  megfigyelték  Davis  (1982)  és  Toledo  és  mtsai  (1991).  Emellett  kijelenthetjük,  hogy az ivarváltás édesvízi mesterséges tartásban is bekövetkezik. 

Irodalomjegyzék Davis, T. L. O., 1982: Maturity and sexuality in barramundi, Lates calcarifer (Bloch), in the Northern‐ Territory and Southeastern Guf Carpentaria. Aust. J. Mar. Freshw. Res. 33, 529–545.  Guiguen, Y.; Cauty, C.; Fostier, A.; Fuchs, J.; Jalabert, B., 1994: Reproductive cycle and sex inversion of  the  seabass,  Lates  calcarifer,  reared  in  sea  cages  in  French  Polynesia:  histological  and  morphometric description. Environ. Biol. Fishes 39, 231–247.  Toledo, J. D.; Marte, C. L.; Castillo, A. R., 1991: Spontaneous maturation and spawning of sea bass –  Lates calcarifer – in floating net cages. J. Appl. Ichthyol. 7, 217–222. 

Köszönetnyilvánítás Az  elvégzett  munkát  a  TECH_09‐A3‐2009‐0235,  a  TÁMOP  4.2.2.B‐10/1‐2010‐0011,  illetve  a  TÁMOP‐4.2.1.B‐11/2/KMR‐2011‐0003 projektek támogatásával valósítottuk meg. 

133 

Közlésre elfogadott, illetve megjelent válogatott publikációk jegyzéke Szentes, K., Mészáros, E., Szabó, T., Csorbai, B., Borbély, Gy., Gergely Bernáth, Urbányi, B., Horváth,  Á.  (2011):  Gonad  development  and  gametogenesis  in  the  asian  sea  bass  (Lates  calcarifer)  grown in an intensive aquaculture system. (poster) 3rd International Workshop on the Biology  of Fish Gametes: Budapest, Abstract book p. 108‐109.  Szentes K., Mészáros E., Szabó T., Csorbai B., Borbély Gy., Bernáth G., Kása E., Urbányi B., Horváth Á.  (2012) Zárt, édesvízi rendszerben nevelt barramundi (Lates calcarifer) ivarérésének vizsgálata.  XXXVI. Halászati Tudományos Tanácskozás Szarvas, Kivonat 20.p.  Szentes, K., Mészáros, E., Szabó, T., Csorbai, B., Borbély, Gy., Gergely Bernáth, Urbányi, B., Horváth,  Á. (2012): Histological assesment of gonadal development of asian sea bass (Lates calcarifer)  reared  in  an  intensive  system  (poster)  AQUA  2012,  Prague,  Czech  Republic  Abstract  book  p.1079.  Horváth, Á., Szentes, K., Szabó, T., Csorbai, B., Borbély, Gy., Bernáth, G. and Urbányi, B. (2012.): Early  sex  inversion  of  the  asian  sea  bass  reared  in  a  freshwater  intensive  system.  (poster)  10th  International Congress on the Biology of Fish Madison, Wisconsin, USA Abstract book p. 58.  Szentes  K.,  Szabó  T.,  Csorbai  B.,  Borbély  G.,  Bernáth  G.,  Kása  E.,  Urbányi  B.,  Tóth  G.,  Horváth  Á.  (2012.):  Hormone  induction  and  early  sex  inversion  of  the  asian  sea  bass,  Lates  calcarifer,  reared  in  a  freshwater  intensive  system  (presenation)  Domestication  in  Finfish  Aquaculture  Olsztyn, Poland  Szentes, K., Mészáros, E., Szabó, T., Csorbai, B., Borbély, G., Bernáth, G., Urbányi, B. and Horváth, Á.  (2012), Gonad development and gametogenesis in the Asian sea bass (Lates calcarifer) grown  in  an  intensive  aquaculture  system.  Journal  of  Applied  Ichthyology,  28: 883–885.  doi: 10.1111/jai.12064  Szentes,  K.,  Szabó,  T.,  Csorbai,  B.,  Borbély,  Gy.,  Gergely  Bernáth,  Kása,  E.,  Urbányi,  B.,  Tóth,  G.,  Horváth,  Á.  (2013.):  Effects  of  hormonal  induction  on  gonad  development  of  freshwater‐ reared  asian  sea  bass,  Lates  calcarifer  (presenation)  Aquaculture  2013  "Strike  a  Chord  for  Sustainable Aquaculture" Nashville, Tennessee, USA Abstract book p. 1075.   

134 

Név: 

Váradi Éva 

Kezdés éve: 

2011 

Képzés formája: 

nappali tagozatos 

Témavezető: 

Barna Judit 

Intézet, Tanszék: 

KÁTKI, Genetikai és Szaporodásbiológiai Kutatócsoport 

Elérhetőség: 

+36204326861  [email protected]   

Hímivarsejtek és korai ivarszerv‐szövetek mélyhűtéses tartósításának fejlesztése baromfifajokban génmegőrzési célokból A téma aktualitása, jelentősége Napjainkban  a  régi  őshonos  állatfajok  és  fajták  genetikai  változatosságának  megőrzése  kiemelt figyelmet követel világszerte. A génmegőrzés és a biodiverzitás fontosságának hangsúlyozása  genom‐ és adatbankok létrehozását és fejlődését vonta maga után (Boa‐Amponsem és mtsai., 2004).  Mivel az in vivo génbankok számos kockázatot hordoznak, ezért nélkülözhetetlen in vitro génbankok  kialakítása  is.  Jelenleg  a  világon  csak  négy  olyan  nemzeti  génbank  működik,  ahol  az  őshonos  baromfifajták  genetikai  anyagát  megőrzik.  A  Francia  Nemzeti  Génbank  mellett  még  Hollandiában,  Észak‐Amerikában és Spanyolországban tárolnak mélyhűtött mintákat (Blackburn, 2006; Woelders és  mtsai., 2006, Santiago‐Moreno és mtsai., 2011).  Az  in  vitro  génmegőrzés  legalkalmasabb  módja  madarak  esetében  az  ondó  mélyhűtéses  tartósítása  (Gee,  1995;  Reedy  és  mtsai,  1995)  azonban  a  spermiumok  mélyhűtésével  csak  a  hím  genomot (ZZ) tudjuk megőrizni ezért szükséges új, alternatív módszerek kidolgozása a teljes genom  fenntartása érdekében. Mivel a nőivart is be kell vonni a génmegőrzési programokba ezért feltétlen  szükséges a petesejtek megőrzésének kidolgozása, melyre a korai petefészek szövetek tartósítása és  transzplantációja megoldást nyújthat. 

Célkitűzések A  kutatómunka  célja  az  egyes  baromfifajokra  (jelen  esetben  ‐  gyöngytyúk)  kidolgozott  ondómélyhűtési  eljárások  metodikai  fejlesztése  a  ritka,  értékes  gének  hosszú  távú  megőrzésének  elősegítése céljából.   Az alábbi ondómélyhűtési vizsgálatok elvégzését tervezzük:  



gyöngytyúk  spermiumok  lassú  illetve  gyors  programozott,  nitrogéngőzben  valamint  vitrifikációs  mélyhűtési  eljárással  történő  tartósításának  fejlesztését,  a  faj  számára  ideális protokoll(ok) kidolgozását  a  legeredményesebb  ondómélyhűtési  protokollok  hatékonyságának  ellenőrzését  in vivo technikák (mesterséges termékenyítés) alkalmazásával 

135 

Kutatásaink  kiterjednek  a  korai  ivarszerv‐szövetek  mélyhűtéses  tartósítására,  valamint  transzplantációjára, mely elősegíti a nőivar bevonását a génmegőrzési programokba.  Kutatásaink során tervezzük:   

első  lépésként  korai  ivarszerv  szövetek  (házityúk)  transzplantációjának  technikai  kidolgozását   a kidolgozott módszer eredményességének ellenőrzését szövettani vizsgálatokkal 

Módszerek Ondómélyhűtési vizsgálatok gyöngytyúk fajon Kísérleti állatok és ondóminősítés A  spermafagyasztási  kísérletekhez  30,  egy  éves  gyöngytyúk  kakast  helyeztünk  el  egyedi  ketrecekben,  az  állatok  hagyományos  kakastápot  fogyasztottak,  önitatókból  ittak  ad  libitum.  A  megvilágítás,  természetes  fény  mellett,  mesterséges  kiegészítéssel  történt,  napi  16  óra  időtartamban.  A  spermadonor  állatok  kiválogatását  a  kezelhetőség,  illetve  az  ondóvételre  való  reagáló  képesség,  majd  az  egyedi  ondóbírálati  adatok  alapján  végeztük.  Az  ondóvétel  Burrows  és  Quinn  (1937)  dorso‐abdominális  masszázs‐technikájával  történt  heti  2  alkalommal,  2  hónapon  keresztül. Az ondó minősítésére minden esetben két alkalommal került sor: a mélyhűtés előtt (friss  minta), ill. a felengedés után (fagyasztott/felengedett minta). A mennyiség megállapítását követően  mikroszkópban  meghatároztuk  a  motilis  sejtek  arányát  egy  0‐5‐ig  terjedő  szubjektív  pontozásos  skálán.  A  spermiumkoncentráció  ellenőrzését  spektrofotométerrel  (Accucell  IMV,  France)  végeztük,  valamint vizsgáltuk a morfológiai rendellenességeket és az élő/holt sejtarányt eozin‐anilin kék vitális  festés segítségével.   Ondómélyhűtési módszerek Vizsgálatunkban első lépésben négyféle hűtési protokollt hasonlítottunk össze: lassú és gyors  programozott  mélyhűtést,  nitrogén  gőzben  történő  hűtést  és  egy  pellet  formában  történő  vitrifikációs eljárást (1. táblázat). Az eltérő hűtési ráták mellett a különböző krioprotektánsok hatását  is vizsgáltuk: 10% etilén‐glikol (EG), 6% dimetil‐formamid (DMF) és 6% dimetil‐acetamid (DMA).    

136 

1. táblázat: Ondómélyhűtési módszerek kísérleti leírása  Protokoll  Tároló típusa  Hígító  Hígítási arány  Equilibrációs idő  Hűtési ráta 

Krioprotektáns 

Ondómélyhűtési protokollok Lassú  Gyors N2 gőz ampulla Lake 1:3 25 perc  5perc 5perc 3°C‐on  5°C‐on  5°C‐on  ‐1°C/perc  ‐15°C/perc 4cm‐re a folyékony  ‐30°C‐ig  ‐30°C‐ig  N2 fölé helyezve  (120°C 3 percig)  ‐30°C/perc  ‐30°C/perc  ‐60°C‐ig  ‐60°C‐ig  10%  EG 

6%  DMF 

10%  EG 

6%  DMF 

10%  EG 

6%  DMF 

Pellet    Tselutin 1:1  2 perc  2°‐on  közvetlenül folyékony N2‐be  cseppentve  6%  DMA 

Mesterséges termékenyítés A második lépésben a legeredményesebb mélyhűtési protokollok hatékonyságát mesterséges  termékenyítéssel  teszteltük.  3x10  gyöngytyúk  tojót  egyedi  ketrecekben  helyeztünk  el  a  gyöngyös  kakasokéval  megegyező  tartástechnológia  mellett.  Tíz  gyöngytyúkot  friss,  hígított  spermával,  tízet  10%  EG‐t  tartalmazó  lassú  eljárásból  származó  fagyasztott‐felolvasztott  mintával,  tízet  pedig  a  vitrifikációs  eljárással  mélyhűtött‐felolvasztott  spermával  termékenyítettünk.  A  mesterséges  termékenyítést  hetente  3  alkalommal  végeztük,  3  héten  keresztül,  alkalmanként  250‐300  millió  spermium bejuttatásával.  A  keltetőbe  hetente  berakott  tojások  (összesen  300)  termékenységét  lámpázással  ellenőriztük az inkubáció 10. napján. A kilámpázott tojások vizsgálata során meghatároztuk a valódi  terméketlen,  a  korai,  (a  petevezetőben),  és  a  későbbi,  (inkubáció  alatt  történő)  embrióelhalások,  valamint  a  normális  fejlődésű  embriók  arányát.  A  petevezetőben  történt  elhalásokat  a  csírakorong  speciális festési eljárásával állapítottuk meg (Liptói és mtsai., 2004).  Statisztikai analízis Az  adatok  statisztikai  feldolgozásához  Mann‐Whitney  és  Kruskal‐Wallis  tesztet  használtunk  (Statistica, Version 7.0, StatSoft Hungary Kft, Budapest, Hungary). 



137 

Korai ivarszerv‐szövetek transzplantációja Előkísérletként  a  napos  csibék  ivarszerveinek  átültetési  lehetőségét  vizsgálatuk,  fagyasztási  eljárás  nélkül.  A  petefészek  és  here  átültetés  módszerét  Song  és  Silversides  (2006,  2007a,b)  által  leírtak  alapján  végeztük  kisebb  módosításokkal  a  kikelés  napján,  amikor  még  az  immunrendszer  kevéssé reagál erre a beavatkozásra csirkék esetében.   Kísérleti állatok Első  lépésben  autosex  Tetra  SL  naposcsibékkel  dolgoztunk,  melynek  kakasai  napos  korban  fehérek,  tojói  barnásak,  így  egyszerű a  műtétekhez  a  megfelelő ivar  kiválasztása.  A  szervek  kilökődésének  megakadályozására  először  szteroid  oldat  (dexametazon  0,01  ml/állat),  később  Mycophenolate  kipróbálása  történt.  A  továbbiakban  autosex  Tetra  SL  naposcsibékbe  kendermagos  színű  Harco  naposcsibék  ivarszerveinek  átültetését  végeztük,  mivel  az  ezekből  származó  utódok  (fekete naposcsibe) fenotípusosan könnyen azonosíthatók (2. táblázat).   Az állatok elhelyezése: A  naposcsibéket  5  hetes  korig  csibenevelő blokkban  helyezzük  el,  zeolit  alomra,  melyben  a  hőmérséklet  és  a  megvilágítás  szabályozható.  A  madarak  5  hetes  koruk  után  egyedi  ketrecekbe  kerültek. Ad libitum takarmányozás során 16 hetes korukig indítótápot, 16‐18 hétig tojó előkészítő,  18 hetes koruk után tojótápot kaptak. A megvilágítást fokozatosan 15 órára emeltük.  Busulfan kezelés: A  Busulfan  (1,4‐butanediol  dimethanesulfonate)  alkalmazása  a  recipiens  embriókon  a  saját  ivarszerv  fejlődését  gátolja,  megkönnyítve  ezzel  a  donor  ivarszerv  megtapadását  és  fejlődését.  A  vízszintes helyzetben keltetett tojásokat 24 órás inkubáció után a tompa végükön injektáltuk, a szikbe  szezám  olaj,  dimetil‐formamid  (DMF)  és  Busulfan  oldat  keverékét  juttatva.  Mivel  ez  a  keverék  a  fecskendőben gyorsan frakcionálódik, ultrahang sonár alkalmazásával lehetséges volt az olajcseppek  kisebbítése, így a keverék alkotórészei egyenletesebben oszlanak el. További 24 órás forgatás nélküli  inkubálás során az olaj a hatóanyagot felemelte az embrióhoz, ahol Busulfan ki tudta fejteni hatását.  2. táblázat: Az elvégzett műtétek adatai  Elhullás (db) 

Operált  állatok   (db)  17 

Donor  TETRA SL 

Recipiens  TETRA SL 

11 

TETRA SL 

TETRA SL 

10 

TETRA SL 

TETRA SL 

34 

Kendermagos  színű Harco 

TETRA SL 

Kezelés  nincs  Busulfan antibiotikum,  szteroid  Busulfan,  Mycophenolate  antibiotikum  Busulfan,  Mycophenolate  antibiotikum 

138 

műtét után   közvetlenül  0 

mycophenolate   kezelés miatt  0 

4 

0 

1 

3 

1 

7 

Ovárium és a herék eltávolítása a kiirtott napos állatokból A  donor  ivarszerveket  a  naposcsibe  dekapitációja  után  távolítottuk  el.  Az  eltávolított  ivarszerveket  beültetésig  (10‐40perc)  steril  DMEM  oldatot  tartalmazó  Petri‐csészében  szobahőmérsékleten tároltuk.   A recipiens naposcsibék altatása intramusculárisan adott 0,5 mg‐os ketamin (Ketaset, Ayerst  Veterinary Laboratories, Guelph, ON, Canada) és 0,1 mg xylazine (Rompun, Bayer Inc., Toronto, ON,  Canada)  injekcióval  valamint  Isofluran  (Florane,  Abbott  Laboratories  Ltd.,  Queenborough)  inhalációval történt.   Az  ivarszervek  eltávolítása  a  recipiens  állatokból:  a  hasi  oldal  műtéti  felületéről  70%‐os  alkoholos  lemosás  után  a  pihéket  eltávolítottuk.  Az  így  előkészített  műtéti  felületen  2‐3  cm  bemetszést végeztünk harántirányban és kb. 1 cm‐es bemetszést az utolsó bordáig, amivel feltártuk  az  abdominális  üreg  bal  oldalát.  A  hashártyát  óvatosan  eltávolítottuk  a  zúzógyomorról  és  a  sziktömlőnyél  elkötése  (sebészeti  levarrása)  után  a  szikzacskót  teljes  egészében  eltávolítottuk.  A  zúzógyomor és a belek óvatos eltolása után a petefészek láthatóvá válik. Napos korban az ovarium a  hasüreg  bal  felső szélén  a  vesék  fölött  található,  amelyet  a  bal  vese,  a  vastagbél  bélfodra,  és  a  nagyobb abdominális légzsák határol. A nagyobbik abdominális légzsák elemelése után a petefészek  teljes  egészében  eltávolításra  került  egy  csipesz  segítségével,  végül  steril  vattával  megtisztítottuk  a  műtét  helyét.  A  herék  eltávolításának  módszere  megegyezik  a  petefészeknél  leírtakkal.  A  műtétet  nehezíti, hogy napos korban a herék a hasi artériával párhuzamosan helyezkednek el.  Transzplantáció A  donor  ovarium  darabot  a  recipiens  csibe  eltávolított  eredeti  petefészkének  helyére  helyeztük.  A  nagyobb  abdominális  légzsákot  megnyitottuk  és  ezzel  fedtük  be  a  transzplantált  szövetet rögzítés céljából. A hasi vágást sebészeti varrattal zártuk. Ezt követően preventív im. 5 mg  antibiotikumot  (Excenel,  Pharmacia  Animal  Health,  Orangeville,  ON,  Canada)  adtunk.  A  donor  heredarabot  a  hasüreg  felső részén  található  bélfodor  alá  helyeztük.  A  műtétet  követő  kezelés  az  ovariumnál  leírtakkal  megegyezett.  A  műtét  utáni  lábadozás  alatt  Traumeel  (Heel  Gmbh,  Germany)  cseppeket  adagoltunk  a  vérzés  csillapítása,  fájdalomcsillapítás,  a  gyulladáscsökkentés,  valamint  a  műtéti szövődmények elkerülése céljából.  Mycophenolate mofetil (CellCept) immunszupresszáns Az  átültetett  szervek  kilökődésének  gátlására  napi  100  mg/kg  mycophenolate  mofetilt  (CellCept,  Roche,  Anglia)  használtunk  immunszupresszánsként.  Ismert,  hogy  a  T  és  B  sejtek  proliferációját gátolja a készítmény, így megkönnyíti az idegen szövetek beépülését (Morris és mtsai.,  1990).  Megfigyeléseink  szerint  azonban  néhány  állatnál  bélrendszeri  problémákat  okozott  a  készítmény.  Ennek  kiküszöbölésére  a  továbbiakban  az  első  két  élethéten  Lactiferm  L‐50  WS  (Enterococcus faeceum M74 50x109 CFU) probiotikumot kevertünk a takarmányba (0,5g/kg).    

139 

Eredmények Ondómélyhűtési vizsgálatok A 10% EG‐t alkalmazó lassú eljárás esetében nagyobb volt az összes élő sejt aránya a pellet  módszerhez  képest  (41  vs  31%),  ez  a  technika  azonban  szignifikánsan  (p≤  0,05)  több  rendellenes  sejtet  adott  (23  vs  10%),  így  a  legnagyobb  élő,  ép  morfológiájú  spermium  arányt  (21%)  a  pellet  módszernél találtuk (1. ábra).  

élő, normális morfológiájú sejtek

rendellenes sejtek

elhalt sejtek

1. ábra: A fagyasztást/felengedést követő változások a spermiumok minőségében  

A  spermiumok  a  lassú,  10%  EG‐t  tartalmazó,  programozott  és  a  vitrifikációs  módszer  esetében  produkálták  a  legmagasabb  túlélést  az  élő  normális  morfológiájú  sejtekre  vonatkoztatva  (23,5 és 28,6%). Utóbbival szignifikánsan jobb (p< 0.05) túlélési arányt értünk el. A másik két hűtési  módszerrel nem találtunk megfelelő sejt‐túlélést (2. ábra). 

2. ábra: Az élő, normális morfológiájú sejtek túlélési aránya a friss sperma kiindulási értékeihez viszonyítva 

140 

A két eredményesebb mélyhűtési protokollból származó mintákkal, valamint friss spermával  3  gyöngytyúk‐csoportban  végeztük  a  termékenyítéseket.    A  háromhetes  termékenyítési  időszak  végére  a  friss  spermával  91,7,  a  lassú  mélyhűtéses  protokollal  29,1,  míg  a  pelletes  mélyhűtéssel  63,6%‐os termékenységet értünk el. A tojások termékenysége a termékenyítések számával növekvő,  míg  az  korai  embrióelhalások  tekintetében  csökkenő  tendenciát  mutatott  minden  csoportban  (3.  ábra). 

3. ábra: A termékenység és az embrióelhalások alakulása a három csoportban a mesterséges  termékenyítések után 

Korai ivarszerv‐szövetek transzplantációja A  műtéteket,  és  a  diagnosztikai  boncolásokat  jegyzőkönyvben  rögzítettük,  fotókkal  dokumentáltuk.  A  boncoláskor  kivett  ivarszerveken  szövettani  vizsgálatot  végeztünk.  A  8  illetve  16  hetes korban történő boncolási eredményeket láthatjuk a lenti képeken (1‐10. kép).  A  nyolchetes  tojó  boncolása  során  megállapítottuk,  hogy  a  beültetett  petefészekdarabok  megtapadtak (nyilakkal jelölve az 1. képen) és a szövettani vizsgálat mindhárom esetben funkcionáló  petefészket igazolt (1‐3.kép). 

 

1. kép: 8 hetes tojó boncolása 

2. kép: Funkcionáló petefészek szövettani képe 

141 

3. kép: Beültetett petefészekdarabok  

A nyolchetes kakas boncolásakor megtaláltuk a megtapadt beültetett herét (zöld nyíl) az állat  saját heréi (fekete nyilak) közelében, mely a szövettani vizsgálat szerint működőképes (4‐6. kép). 

 

4. kép: 8 hetes kakas boncolása 

5. kép: Működőképes here szövettani képe 

6. kép: A saját herék és a beültetett here. 

 

142 

A  16  hetes  tojó  boncolása  is  a  beültetett  petefészekdarabok  (zöld  nyilak)  megtapadását  igazolta az eredeti petefészek (fekete nyíl) működése mellett (7‐8. kép). 

 

7. kép: 16 hetes tojó boncolása 

8. kép: Saját illetve beültetett petefészkek 

A 16 hetes kakas boncolási eredménye is igazolta a beültetett here megtapadását (zöld nyíl)  az állat saját ivarszerve (fekete nyíl) mellett (9‐10. kép). 

 

9. kép: 16 hetes kakas boncolása 

10. kép: Saját illetve beültetett herék.  

A  72  beavatkozásból  31  esetben  találtunk  megtapadt  ivarszervet  a  beültetést  követően.  A  TETRA  SL‐TETRA  SL  párosítás  eredményesebbnek  bizonyult,  mely  során  az  operációt  túlélő  állatok  77%‐ában találtunk megtapadt, beültetett ivarszervet (3. táblázat).   

143 

3. táblázat: Ivarszerv‐átültetések eredményei  Donor/  Recipiens 

Operált állatok  (db) 

TETRA SL/  TETRA SL  Harco/  TETRA SL  Ősszesen 

A beavatkozás következtében  elhullott (db) 

Sikeres ivarszerv‐ transzplantáció (db) 

Sikertelen ivarszerv‐ transzplantáció (db) 

38 

8 

24 (63%) 

6 

34 

8 

7 (21%) 

19 

72

16

31 (43%)

25 

Összefoglalás Ondómélyhűtési vizsgálatok



In vitro vizsgálataink azt igazolták, hogy lassú hűtési sebesség esetén a 6% DMF‐t tartalmazó  ondóhígítónak nincs megfelelő védőhatása a gyöngytyúk spermiumokra, míg a 10% EG viszonylag jó  túlélést  biztosított.  A  gyors  és  a  nitrogén  gőzös  eljárást  nem  találtuk  megfelelőnek  gyöngytyúk  spermiumok  mélyhűtésére.  A  módszerek  közül  a  vitrifikációs  eljárás  (pellet  módszer)  bizonyult  a  legígéretesebbnek  mind  a  sejttúlélést,  mint  a  termékenyítőképességet  illetően.  A  pellet  módszer  segítségével  gyöngytyúkban  a  szakirodalomban  megadott  egyetlen  spermamélyhűtési  adatnál  (Seigneurin és Blesbois, 2005) jóval nagyobb termékenységet (20 vs. 64%) sikerült elérnünk.  

Korai ivarszerv‐szövetek transzplantációja Vizsgálatainkat  során  mindkét  ivarban  voltak  sikeres  ivarszerv‐átültetések,  a  transzplantált  szervek  egy  része  megtapadt,  működni  kezdett,  amelyet  a  szövettani  vizsgálatok  is  igazolnak.  Az  irodalomból vett módszereket továbbfejlesztve alkalmassá tettük egyszerű laborkörülmények közötti  felhasználáshoz. Kidolgoztuk az állatok műtét utáni ellátásának, gyógyszerelésének és felnevelésének  technológiáját.  Előkísérletünk  eredményeit  felhasználva  a  továbbiakban  lehetővé  válik  a  donor  állatok  ivarszervének  eltávolítása  a  mélyhűtéshez  valamint  a  fagyasztva  tárolt  és  felolvasztott  ivarszervek beültetése a recipiens madarakba. 

Irodalomjegyzék Blackburn  H.D.  (2006):  The  national  animal  germplasm  program:  challenges  and  opportunities  for  poultry genetic resources. Poultry Science 85: 210‐215.  Boa‐Amponsem  K.,  Scherf  B.  és  Hoffmann  I.  (2004):  Utilisation  and  conservation  of  poultry  genetic  resources: FAO Initiatives. World Poultry Congress, June 8‐12, Istanbul, CD Proceedings.  Burrows  W.H.  és  Quinn  J.P.  (1937):  The  collection  of  spermatozoa  of  domestic  fowl  and  turkey.  Poultry Science 16: 19‐24.  Gee  G.F.  (1995): Artificial insemination and cryopreservation of semen from nondomestic birds. In:  Proceedings  First  Symposium  on  the  Artificial  Insemination  in  Poultry.  Ed.  Bakst,  M.R.  and  Wishart G.J. 262‐280.  Liptói K., Varga Á., Hidas A., Barna J. (2004): Detection of the rate of true fertility in duck breeds by  the combination of two in vitro methods. Acta Veterinaria Hungarica 52: 227‐233.  Morris  R.E.,  Hoyt  E.G.,  Murphy  M.P.,  Eugui  E.M.,  Allison  A.C.  (1990):  Mycophenolic  acid  morpholinoethylester  (RS‐61443)  is  a  new  immunosuprestant  that  prevents  and  halts  heart 

144 

allograft  rejection  by  selective  inhibition  of  T‐  and  B‐cell  purine  synthesis.  Transplantation  Proceedings 22: 1659‐1662.  Reedy,  S.E.,  Leibo  S.P.,  Clark  M.E.  and  Etches  R.J.  (1995):  Beyond  Semen  Freezing.  In:  Proc.  First  Symposium on the Artificial Insemination in Poultry. Ed.Bakst, M.R. and Wishart G.J. 229‐250.  Santiago‐Moreno  J.,  Castaño  C.,  Toledano‐Díaz  A.,  Coloma  M.A.,  López‐Sebastián  A.  et  al.  (2011):  Semen cryopreservation for the creation of a Spanish poultry breeds cryobank: Optimalization  of freezing rate and equilibration time. Poultry Science 90: 2047‐2053.  Seigneurin F. és Blesbois E. (2005): The first method of cryopreservation of guinea fowl semen. Proc.  of the French Poultry Research Days. 2005. Brittary, France. 23.  Song Y. és Silversides F.G. (2006): The technique of orthotopic ovarian transplantation in the chicken.  Poultry Science 85: 1104‐1106.  Song  Y.  és  Silversides  F.G.  (2007a):  Heterotopic  transplantation  of  the  testes  in  newly  hatched  chickens  and  subsequent  production  of  offspring  via  intramagnal  insemination.  Biology  of  Reproduction 76: 598‐603.  Song  Y.  és  Silversides,  F.G.  (2007b):  Offspring  produced  from  orthotopic  transplantation  of  chicken  ovaries. Poultry Science 86: 107‐111.  Woelders  H.,  Zuidberg  C.A,  Hiemstra  S.J.  (2006):  Animal  genetic  resources  conservation  in  The  Netherlands and Europe: poultry perspective. Poultry Science 85: 216‐222. 

Közlésre elfogadott, illetve megjelent válogatott publikációk jegyzéke Váradi  É.,Végi  B.,  Liptói  K.,  Barna  J.  (2012):  Ondómélyhűtési  vizsgálatok  gyöngytyúk  fajon.  Magyar  Állatorvosok Lapja 134: 469‐474.  Váradi É., Végi B., Liptói K., Barna J. (2012): Comparison of two cryopreservation protocols of guinea  fowl  sperm.  Proc.  XXIV.  World’s  Poultry  Congress.  Salvador,  Brazil.  5‐9  August  2012.  World’s  Poultry Science Journal 68: 458.  Liptoi  K.,  Horvath  G.,  Gal  J.,  Varadi  E.,  Barna  J.  (2012):  Preliminary  results  of  the  application  of  gonadal tissue transfer in the poultry gene conservation. Proc. XXIV. World’s Poultry Congress.  Salvador, Brazil. 5‐9 August 2012.World’s Poultry Science Journal 68: 289‐292.   Liptoi  K.,  Horvath  G.,  Gal  J.,  Varadi  E.,  Barna  J.  (2012):  Preliminary  results  of  the  application  of  gonadal  tissue  transfer  in  various  chicken  breeds  in  the  poultry  gene  conservation.  Animal  Reproduction Science Submitted.  Váradi  É.,  Végi  B.,  Liptói  K.,  Thieu  N.L.P.,  Barna  J.  (2012):  Comparative  cryopreservation  of  guinea  fowl  spermatozoa:  a  slow  programmable  and  pellet  method.  7th  Vietnamese–Hungarian  International Conference on Agricultural Research for Development (ARD). Can Tho, 26‐30 Aug  2012.  Váradi  É.,  Végi  B.,  Thieu  N.L.P.,  Barna  J.  (2012):  Cryoconservation  methods  of  guinea  fowl  spermatozoa.  7th  Vietnamese–Hungarian  International  Conference  on  Agricultural  Research  for Development (ARD). Can Tho, 26‐30 Aug 2012.  Váradi É., Végi B., Liptói K., Lévai T., Barna J. (2012): Ondómélyhűtési vizsgálatok gyöngytyúk fajon.  XXXIV. Óvári Tudományos Nap, Mosonmagyaróvár, 2012. október 5.  Váradi  É.,  Végi  B.,  Liptói  K.,  Barna  J.  (2013):  Methods  for  Cryopreservation  of  Guinea  Fowl  Sperm.  Plos One April 2013 Vol. 8 Issue 4 e62759.   

145 

Név: 

Varga Eszter 

Kezdés éve: 

2011 

Képzés formája: 

nappali tagozatos 

Témavezető: 

Dinnyés András 

Intézet, Tanszék: 

Állattudományi Alapok Intézet, Molekuláris Állatbiotechnológiai  Laboratórium 

Elérhetőség: 

+36 20 513 1648  [email protected]  

Transzgén‐mentes Indukálható Pluripotens Őssejt vonalak alapítása Egér modellben A téma aktualitása, jelentősége Felnőtt  testi  sejtek  visszaprogramozásával  Indukálható  Pluripotens  Őssejt  (IPS)  vonalak  hozhatóak  létre.  Az  IPS  technológia  használata  fontos  lehet  páciens  specifikus  vonalak  létrehozásában,  gyógyszer  tesztekhez,  illetve  betegségek  modellezésében,  betegség  specifikus  vonalak  alapításán  keresztül.  Az  első  IPS  vonalat  Takahashi  és  Yamanaka  hozta  létre  2006‐ban  oly  módon, hogy a pluripotenciáért felelős faktorok bizonyos kombinációját (Oct3/4, Sox2, klf4 és c‐Myc)  a  sejtekbe  juttattva  próbálták  indukálni  a  pluripotenciát.  A  különböző  géneket  retro‐vírus  transzdukcióval jutatták be egér embrionális‐ és felnőtt‐ fibroblaszt sejtekbe.   Azóta  számos  kutatócsoport  alapított  emlős  IPS  vonalakat  az  említett  négy  faktor  alkalmazásával,  melyeket  különböző  génbeviteli  eljárásokkal  juttattak  a  sejtekbe.  A  széles  körben  elterjedt  IPS  generálási  eljárás  retro‐  vagy  lenti‐vírus  transzdukcióval  történik,  ahol  a  transzgén  random  integrálódik  a  genomba,  amely  inzerciós  mutagenezishez  vezethet.  Igaz  a  legtöbb  alkalmazott  rendszerben  a  transzgén  expressziója  idővel  elcsendesül,  vagy  blokkolható  (Wernig  és  mtsai.,  2008;  Sommer  és  mtsai.,  2009),  azonban  amíg  a  transzgén  jelen  van  a  genomban  a  re‐ aktiválódás  veszélye  fenn  állhat,  ami  tumor  formálódáshoz  vezethet  (Bock  és  mtsai.,  2011;  Hochedlinger és mtsai., 2005; Markoulaki és mtsai., 2009).  Az  IPS  vonalak  későbbi  lehetséges  humán  klinikai  alkalmazásához  a  generálási  rendszer  továbbfejlesztésére annak biztonságossá tételére volna szükség. Ennek egyik elengedhetetlen eleme  a transzgén‐mentes rendszer kidolgozása.  E probléma lehetséges megoldásaként egyes kutatócsoportok olyan IPS vonalakat alapítottak  ahol  a  stabilan  integrálodó  transzgén  kivágható  volt.  Ilyen  rendszerek  például  a  transzpozon‐ transzpozáz  (Woltjen  és  mtsai.,  2009),  vagy  lenti‐vírus‐  génbeviteli  eljárások  (Sommer  és  mtsai.,  2010; Soldner és mtsai., 2009; Somers és mtsai., 2010; Chang és mtsai., 2009). Habár e rendszerek  igen  magas  hatékonysággal  működnek,  azonban  a  kivágás  megvalósítása  problematikus  lehet.  Néhány  munkacsoport  nem  integrálodó  visszaprogramozási  módszerek  alkalmazásával  ért  el  sikereket,  ahol  a  pluripotenciáért  felelős  transzgént  RNS  (Warren  és  mtsai.,  2010,  Fusaki  és  mtsai.,  2009),  minicircle  DNS  (Jia  és  mtsai.,  2010),  episzómális  vektor  (Yu  és  mtsai.,  2009),  protein  (Kim  és 

146 

mtsai., 2009, Zhou és mtsai., 2009) vagy Adenovírus (Okita és mtsai., 2008; Stadtfeld és mtsai., 2008)  formájában  jutatták  be.  Ezen  rendszerek  ígéretesek  lehetnek  humán  terápiás  alkalmazásokban,  azonban  egyelőre  igen  alacsony  hatékonysággal  működnek,  így  a  jelenleg  kutatási  célokra  alapított  vonalak  túlnyomó  többsége  továbbra  is  integrálodó  génbeviteli  eljárásokkal  történik.  Azonban  a  transzgén jelenléte az IPS vonalakban még az in vitro kísérleteket is negatív módon befolyásolhatja,  például  a  differenciációs  képességükben  (Sommer  és  mtsai.,  2010),  ezért  azok  eltávolíthatósága  mindenképpen indokolt.  

Célkitűzések Az  alábbi  tanulmányban  egy  hatékony  IPS  generálási  rendszert  hoztunk  létre,  amelyben  hibrid genetikai hátterű C57BL/6JxDBA/2J (F1) embrionális fibroblaszt (MEF) sejteket programoztunk  vissza  lenti‐vírus  génbevitelt  alkalmazva.  Az  inzerciós  mutagenezis  által  okozott  kockázat  minimalizálása  érdekében  a  visszaprogramozásért  felelős  4  faktort  expresszáló  policisztrónikus  kazettát úgy  terveztük  meg, hogy az kivágható legyen a genomból a Cre/Lox rendszer segítségével.  Egy  pluripotens  sejtvonal  jellemzése  során  köztudottan  a  legfontosabb  pluripotencia  marker  azok  csíravonal transzmissziója a következő generációba. Korábbi publikációkban ugyan hasonló kivágható  IPS generálási rendszereket alkalmazva sikeresen hoztak transzgén‐mentesített IPS vonalakat (Chang  és  mtsai.,  2009,  Sommer  és  mtsai.,  2010),  azonban  azok  csíravonal  kompetenciája  nem  volt  bemutatva,  amely  igazolása  úgy  gondoljuk  elengedhetetlen  volna.  Célunk  az  volt,  hogy  egy  olyan  transzgén‐mentes IPS generálási rendszert hozzunk létre, ahol az alapított vonalak pluripotensek és  ivarsejt kimérák létrehozására képesek. További célunk pedig az volt, hogy az alapított vonalainkon a  transzgén  jelenlétének/hiányának  hatását  vizsgáljuk  azok  in  vitro  differenciációs  képességén  keresztül.  Távlati  célunk  pedig  egy  olyan  megbízható  transzgén‐mentes  visszaprogramozási  rendszer  beállítása  laborunkban,  amely  sémájára  humán  vonalak  is  alapíthatóak  lesznek.  Egy  megfelelően  működő  IPS  generálási  rendszer  birtokában  pedig  akár  nehezen  visszaprogramozható  kiinduló  sejtpopulációból is (például vér) illetve betegségséget hordozó páciensekből is pluripotens vonalakat  tudnánk alapítani alapkutatásokhoz illetve gyógyszertesztekhez. 

Módszerek Sejttenyésztés A  C57BL/6JxDBA/2J  hibrid  genetikai  hátterű  egér  embrionális  fibroblaszt  sejtek  in  vitro  tenyésztése  fibroblaszt  tenyésztő  médiumban  történt.  Az  ESC  és  IPS  sejtek  tenyésztése  pedig  Mytomicin‐el  kezelt  fibroblaszt  sejt  rétegen  vagy  0,1%‐os  zselatinon  LIF‐et  (Leukémia  Inhibitor  Faktor)  tartalmazó  tenyésztő  médiumban,  normál  ESC  tenyésztési  protokollt  követve  történt  (Nagy  és mtsai., 1993).  

Lenti‐virus plazmid előállítása A  MEF  sejtek  visszaprogramozásához  egy  kivágható  lenti‐vírus  vektort  állítottunk  össze  (1.  ábra),  amely  egy  EF1α  promótert  egy  IRES  (Internal  ribosome  entry  site)  és  egy  EGFP  szekvenciát  tartalmaz.  Az  EF1α  promóter  és  az  IRES  közé  helyeztük  a  pluripotencia  géneket  (OSKM).  Egy  LoxP  szekvenciát  illesztettünk  a  konstrukció  3’  LTR  régiójába,  amely  a  genomba  való  integrálódáskor  az 

147 

5’LTR  régióba  másolódik,  így  lehetővé  téve  az  egész  kazetta  eltávolíthatóságát  a  Cre  rekombináz  expressziójával.  

1. ábra 

Vírus előállítás és transzdukció A  visszaprogramozó  kazettát  hordozó  vírust  HEK293T  sejtekben  termeltettük  a  megfelelő  lenti‐vírus  pakoló  szekvenciák  illetve  az  expressziós  vektorunk  együttes  transzfekcióját  követően.  A  vírust tartalmazó felülúszót a MEF sejtekhez adtuk (0. nap). A hozzáadott vírus mennyiség 2 és 5 MOI  (Multiplicity  of  Infection)  közé  esett.  Két  nappal  a  vírusfertőzést  követően  a  sejteket  tripszines  kezelés  után  10  cm‐es  tenyésztőedényekbe  tenyésztettük  az  ESC‐szerű  kolóniák  megjelenéséig.  Az  EGFP  pozitív  kolóniákat  fluoreszcens  mikroszkóp  alatt  izoláltuk  és  növesztettük  további  vizsgálatokhoz és az EGFP expressziós szintjének flow cytometriás méréséhez.  

A Cre Plazmid elektroporációja, a transzgén mentesített klónok felismerése 40 µg Cre‐expresszáló plazmidot, pTriEx‐HTNC (Addgene) vittünk be 2x106 sejtet tartalmazó  sejtszuszpenzióba  a  Gene  Pulser®  II  Elektroporációs  rendszer  alkalmazásával.  A  sejteket  alacsony  sejtszámban  tenyésztettük  tovább  10  cm‐es  tenyésztő  edényekben,  hogy  a  transzgén‐mentes  kolóniák  izolációja  megvalósulhasson.  Fluoreszcens  mikroszkóp  alatt  EGFP  negatív  kolóniákat  szedtünk fel, majd flow cytometriás mérésekben igazoltuk azok tényleges EGFP negatívitását.  

A transzgén jelenlétének/hiányának igazolása Polymerase Chain Reakcióval (PCR) A transzgén meglétét illetve a kivágás után annak eltűnését igazoló analízisként genomi PCR‐t  végeztünk el az EGFP szekvenciára specifikus primer pár használatával. 

RT‐PCR Az  RT‐PCR‐hez  a  sejtekből  izoláló  kit  segítségével  RNS‐t  készítettünk  és  a  cDNS‐sé  történő  átírását  pedig  reverz  transzkripcióval  végeztük.  Az  kapott  cDNS‐en  a  pluripotenciáért  felelős  gének  expresszióját vizsgáltuk. A felhasznált primerek listáját, amelyek az exogén és endogén pluripotencia  faktorokat  együttesen  ismerik  fel  az  1.  táblázat  tartalmazza,  míg  csak  az  endogén  faktorok  detektálásra Woltjen és társa (2009) primer szekvenciáit alkalmaztuk.   

148 

1. táblázat  c-Myc

TCCTGTACCTCGTCCGATTC

GGTTTGCCTCTTCTCCACAG

Oct3/4

GAGGAGTCCCAGGACATGAA

AGATGGTGGTCTGGCTGAAC

Sox-2

ACCAGCTCGCAGACCTACAT

GTGGGAGGAAGAGGTAACCA

Klf4

GTGCCCCAAGATTAAGCAAG

CGGGACTCAGTGTAGGGGTA

Pluripotenciát igazoló festések Ezekkel  a  módszerekkel  az  adott  sejtek  pluripotens  jellegét  ellenőriztük  és  igazoltuk.  A  sejteket  4%‐os  paraformaldehides  fixálás  után,  alkalikus  foszfatáz‐al  festettük.  Valamint  immun  hisztokémiai  festéseket  végeztünk,  a  pluripotenciában  fontos  szerepet  játszó  markerekre:  Oct‐3/4,  SSEA‐1, Nanog. 

In vitro kardiális és neurális irányú differenciáció Az IPS vonalak pluripotenciáját, in vitro differenciálódási képességükön keresztül is teszteltük.  Vizsgálván azt, hogy találunk e eltérést, a transzgént még tartalmazó és annak kivágott leszármazott  vonalai között. Kardiális differenciáció esetén a függőcseppes technikával, míg neurális differenciáció  esetén  szuszpenzióban  képeztük  az  embrionális  testeket  (EB)  LIF‐et  nem  tartalmazó  ESC  tenyésztő  médium felhasználásával. Kardiális differenciációhoz a kapott embrionális testeket zselatinnal fedett  tenyésztőedényekbe helyeztük a differenciáció 2. napján és a 14. és 21. napon a ritmikusan dobogó  kardiomiociták számát feljegyeztük, majd azokat fixálás után kardiális markerekre festettük (Troponin  T,  Desmin).  Neurális  differenciáció  esetén  az  embrionális  testeket  a  differenciáció  8.  napján  tripszinnel  emésztettük  és  a  sejtszuszpenziót  laminin‐al  fedett  tenyésztő  edényekbe  helyezzük.  A  feltételezett  korai  és  érett  neuronokat  neurális  markerek  (Nestin,  III  ‐tubulin)  segítségével  tettük  láthatóvá  a  differenciáció  10.  és  14.  napján  a  fixált  sejtekben.  A  Nestin  expressziós  szintjének  változását flow cytometriás mérésekben is vizsgáltuk. 

Kimérák létrehozása, ivarsejt kimérizmus tesztelése A  transzgén‐mentesített  sejtvonalakat  in  vivo  differenciációs  képességükben  is  teszteltük  kiméra előállítási kísérletekben. A sejteket CD1 genetikai hátterű, blasztociszta stádiumú embriókba  mikroinjektáltuk,  majd  az  embriókat  álvemhes  nőstények  méhébe  ültettük  és  a  kiméra  utódok  születését  vizsgáltuk.  A  született  kimérákat  CD1  egerekkel  párosítottuk  ellenőrizve  így  hogy  a  sejtvonalak képesek a csíravonal transzmissziójára.  

Eredmények IPS vonalak generálása lenti‐vírus transzdukcióval Az  IPS  vonalak  generálása  a  kísérleti  elrendezés  alapján  (2.  ábra)  zajlott  az  általunk  létrehozott lenti‐vírus vektorral. 14‐16 nappal a vírus‐transzdukciót követően nagyszámú ESC‐jellegű  kolónia  jelent  meg,  melyeket  manuálisan  felszedtünk.  Morfológiai  kritériumok  alapján  6  klónt  választottunk  ki  azok  további  felszaporítására  és  EGFP  expressziós  szintjének  flow  cytometriás  mérésére.  A  kiválasztott  klónok  EGFP  expressziója  71.02  %  és  97.86%  között  oszlott  meg.  A  legalacsonyabb expressziós szintet mutató klónt (a továbbiakban: iPS‐Bef) választottuk ki a transzgén  kivágásának megkísérlése céljából. 

149 

A visszaprogramozó transzgén kivágása a Cre/Lox rendszer alkalmazásával A  Cre  plazmid  transzfekcióját  követően  az  iPS‐Bef  szülői  vonalba,  nagyszámú  EGFP  negatív  kolóniát  figyeltünk  meg  fluoreszcens  mikroszkóppal  vizsgálva  azokat.  A  feltételezetten  transzgén‐ mentes  kolóniákat  egyenként  felszedtük,  majd  az  EGFP  expressziós  szintjüket  mértük  flow  cytometiával. 15 vizsgált szubklónból 13 EGFP negatívitást mutatott a Cre rekombinációját követően  (2A.  ábra).  Morfológia  és  növekedési  potenciál  alapján  két  EGFP  negatív  szubklónt  választottunk  ki  azok részletes karakterizációjához (továbbiakban: iPS‐Af.4 és iPS‐Af.15). Az említett két szubklónban  a transzgén kivágásának igazolását PCR reakcióval is megerősítettük (2B. ábra). 

2. ábra 

Az IPS vonalak jellemzése Az IPS vonalak kivágás előtt és után  morfológiájukban nagyon hasonlóak voltak normál ESC  vonalakhoz (3A. ábra). Nem találtunk különbséget a vizsgált IPS és kontrol F1 ESC vonalak növekedési  potenciáljában sem. Az általunk generált vonalak mind pluripotensek voltak,  expresszálták a fontos  pluripotencia markereket, amelyet immun hisztokémiai festésekkel, alkalikus foszfatáz (AP) festéssel  (3A. ábra) és RT‐PCR‐el támasztottunk alá (3B. ábra). 

150 

3. ábra 

Az IPS vonalak in vitro kardiális differenciációs képessége Az  IPS‐ek  pluripotenciájának  további  jellemzéseként,  illetve  annak  vizsgálatához,  hogy  a  transzgén  jelenlétének/hiányának  van  e  hatása,  a  vonalakat  in  vitro  kardiális  differenciációs  kísérletekben teszteltük. Mindkét transzgén‐mentesített vonal (iPS‐Af.4 és iPS‐Af.15) és a transzgént  még tartalmazó szülői vonal is (iPS‐Bef) képes volt EB‐kat formálni, hasonló hatékonysággal, mint a  kontrol F1 ESC vonal (4A. ábra). 

4. ábra 

 

151 

A  kontrol  vonalból  létrejött  EB‐k  túlnyomó  többsége  a  differenciáció  7‐8.  napjától  kezdett  dobogni,  míg  a  kivágott  vonalakban  ehhez  képest  2‐3  napos  késést  tapasztaltunk.  A  transzgént  tartalmazó  szülői  vonalból  formálódott  EB‐k  nagy  része  nem  volt  képes  letapadni,  és  a  csekély  számban letapadók is csak a differenciáció 16‐17. napján kezdtek el dobogni. Megállapítottuk, hogy a  dobogó  kardiomiociták  száma  növekedett  a  transzgén  eltávolításának  hatására,  azonban  ez  a  szám  még mindig alacsonyabb volt, mint amit a kontrol ESC vonalban tapasztaltunk (2. táblázat).  2. táblázat 

Dobogó kardiomiocita

F1 ESC

iPS-Bef

iPS-Af.4

iPS-Af.15

20/22 (91±10%)

9/23 (39,13 ±10%)

16/24 (66,67 ±10%)

13/24 (54,17 ±10%)

Immun  hisztokémia  festődésükben  tipikus  kardiális  markerekre  (Desmin,  TroponinT  ),  mind  az iPS‐Bef, iPS‐Af.4 és iPS‐Af.15 vonalak hasonló festődést mutattak, mint a kontrol vonal (4B.ábra).  

Az IPS vonalak in vitro neurális differenciációs képessége A  vonalainkat  in  vitro  neurális  irányú  differenciációs  képességükben  is  teszteltük.  A  differenciáció  10.  12.  és  14.  napján  a  sejteket  fixáltuk  és  különböző  ektodermális  markerekre  festettük:  Nestin  és  β‐III  Tubulin  (5A.  ábra).  A  szülői  iPS‐Bef  vonalban  nem  láttunk  β‐III  Tubulin  festődést. Ehhez képest a transzgén kivágását követően a vonalak képesek voltak érett neuronokat  fejleszteni,  amit  a  β‐III  Tubulin  pozitív  festések  igazoltak.  Azonban  a  két  vizsgált  szubklón  festődésében jelentős különbséget észleltünk mind a β‐III Tubulin (5A. ábra) mind pedig a Nestin (5A.  ábra) esetében. E különbséget flow cytometriás mérésekkel kvantifikáltuk, ahol a Nestin expressziós  szintbeli  változását  vizsgáltuk  (5B.  ábra).  Ahogy  azt  vártuk  a  Nestin  szintje  a  10.  napon  volt  a  legmagasabb,  és  fokozatos  csökkenést  mutatott  a  14.‐ik  napig  az  összes  vizsgált  vonalban.  A  transzgén eltávolításával az iPS‐Af.15 szubklón magasabb Nestin pozitivitást mutatott, mint a szülői  iPS‐Bef vonal, azonban az iPS‐Af.4 esetében nem sikerült növelni ezt az értéket.  

5. ábra 



152 

Kiméra előállítás és csíravonal transzmisszió Ahogy  azt  bemutattuk  a  transzgén  jelenléte  negatív  hatással  van  az  in  vitro  differenciációs  képességre,  és  annak  eltávolításával  jelentős  javulást  érünk  el  mind  kardiális  mind  pedig  neurális  iranyú  differenciációban.  Így  arra  voltunk  kíváncsiak,  hogy  a  kivágott  vonalak  képesek  e  in  vivo  is  differenciálódni, kiméra előállítási tesztekben. Az élve született kimérák aránya 39.1% (9/23) volt az  iPS‐Af.4‐ben  és  36.4%  (8/22)  az  iPS‐Af.15‐ben.  A  kimérák  CD1  egerekkel  pároztatva  csiravonal  kompetenciát  mutattak  mindkét  transzgén  mentes  vonal  esetében,  amelyet  a  fekete  szőrű  utodók  létrejötte igazolt (6. ábra). 

6. ábra 

Összefoglalás A  bemutatott  munkában  sikeresen  alapítottunk  IPS  vonalakat  C57BL/6xDBA/2J  genetikai  hátterű  egértörzsből,  egy  általunk  létrehozott  rendszerrel.  A  kivágható  pluripotencia  vektorunkat  alkalmazva  transzgén‐mentesített  IPS  vonalakat  hoztunk  létre,  amiken  a  transzgén  hatását  tudtuk  tanulmányozni  azok  pluripotens  állapotára,  illetve  differenciációs  képességére.  Sikerült  bizonyítanunk,  hogy  a  transzgén  jelenléte  negatívan  hat  a  differenciációs  teljesítményre,  mivel  a  kivágással  jelentősen  hatékonyabbá  vált  az.  Igazolva  így  azt,  hogy  a  transzgén‐mentes  vonalak  alkalmazása nem csak akkor indokolt, ha klinikai alkalmazás a cél, hanem az in vitro kísérletekben is  jelentős szerepe lehet.   Azt  is  megfigyeltük,  hogy  a  két  kivágott  szubklón  eltérő  módon  viselkedett  az  in  vitro  differenciációs  kísérletekben.  Az  iPS‐Af.4  vonal  relatíve  magas  számú  dobogó  kardiomiocitát  adott.  Ezzel  ellentétben  az  iPS‐Af.15  a  neurális  differenciációban  szerepelt  hatékonyabban.  Habár  nagyszámú  tanulmányban  a  létrehozott  IPS  vonalak  eredményesek  voltak  in  vitro  differenciációs  kísérletekben,  illetve  in  vivo  is  sikeresen  differenciálódtak  teratóma  tesztekben,  azonban  a  legtöbb  esetben  a  csíravonal  öröklődése  a  következő  nemzedékbe  nem  következett  be.  Még  nem  teljesen  tisztázott,  hogy  egy  sejtvonal  pluripotens  állapota  milyen  vizsgálatok  elvégzésével  jelenthető  ki  egyértelműen,  azonban  úgy  gondoljuk,  hogy  a  legfontosabb  paraméter  egy  újonnan  alapított  IPS  esetében  mindenképpen  annak  képessége  a  csíravonal  transzmisszióra.  Kiméra  előállítási  kísérletekben  mindkét  transzgén‐mentes  szubklónunk  igen  jól  szerepelt.  A  kapott  kimérák  ivarsejt  kimérák voltak, amely lenti‐vírus által létrehozott IPS vonalaknál ez idáig még  nem volt bemutatva.  Habár  az  in  vitro  differenciációs  kísérletekben  a  két  szubklónunk  eltérő  módon  szerepelt,  azonban  in vivo differenciációs potenciáljuk igen hasonló volt. Ezen eredmények pedig tovább erősítik annak a 

153 

ténynek  a  fontosságát,  hogy  az  in  vitro  differenciációs  pluripotencia  jellemzések  mellett  az  in  vivo  differenciációs kiméra tesztek megléte is elengedhetetlen.   Összefoglalva  tehát,  ebben  a  tanulmányban  hazánkban  először  sikerült  olyan  transzgén– mentes  lenti‐vírus  által  létrehozott  IPS  előállítási  rendszert  beállítanunk,  ahol  az  új  sejtvonalak  csíravonal kompatibilisek voltak. Ezen rendszer alkalmazása ígéretes lehet humán transzgén mentes  IPS vonalak előállításában, alapkutatási illetve gyógyszertesztelési célok eléréséhez. 

Irodalomjegyzék Bock, C., Kiskinis, E., Verstappen, G., Gu, H., Boulting, G., Smith, Z.D., Ziller, M., Croft, G.F., Amoroso,  M.W., Oakley, D.H., Gnirke, A., Eggan, K., Meissner, A., 2011. Reference maps of human ES and  iPS cell variation enable highthroughput characterization of pluripotent cell lines. Cell. 144(3),  439‐452.  Chang,  C.W.,  Lai,  Y.S.,  Pawlik,  K.M.,  Liu,  K.,  Sun,  C.W.,  Li,  C.,  Schoeb,  T.R.,  Townes,  T.M.,  2009,  Polycistronic  Lentiviral  Vector  for  ‘‘Hit  and  Run’’  Reprogramming  of  Adult  Skin  Fibroblasts  to  Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells. 27, 1042–1049.  Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M., 2009. Efficient induction of transgene‐free  human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not  integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85(8):348‐62.  Hochedlinger,  K.,  Yamada,  Y.,  Beard,  C.,  Jaenisch,  R.,  2005.  Ectopic  expression  of  Oct‐4  blocks  progenitor‐cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121, 465– 477.  Jia,  F.,  Wilson,  K.D.,  Sun,  N.,  Gupta,  D.M.,  Huang,  M.,  Li,  Z.,  Panetta,  N.J.,  Chen,  Z.Y.,  Robbins,  R.C.,  Kay, M.A., Longaker, M.T., Wu, J.C., 2010. A Nonviral Minicircle Vector for Deriving Human iPS  Cells. Nat Methods. 7(3), 197–199.  Kim, D., Kim, C.H., Moon, J.I., Chung, Y.G., Chang, M.Y., Han, B.S., Ko, S., Yang, E., Cha, K.Y., Lanza, R.,  Kim,  K.S.,  2009.  Generation  of  Human  Induced  Pluripotent  Stem  Cells  by  Direct  Delivery  of  Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4(6),  472–476.  Markoulaki,  S.,  Hanna,  J.,  Beard,  C.,  Carey,  B.W.,  Cheng,  A.W.,  Lengner,  C.J.,  Dausman,  J.A.,  Fu,  D.,  Gao, Q., Wu, S., Cassady, J.P., Jaenisch, R., 2009. Transgenic mice with defined combinations of  drug‐inducible reprogramming factors. Nat Biotech. 27, 169 –171.  Nagy,  A.,  Rossant,  J.,  Nagy,  R.,  Abramarow‐Newerly,  W.,  Rode  J.C.,  1993.  Derivation  of  complementely culture‐derived mice from early‐passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad  Sci U S A.90(18):8424‐8428.  Okita,  K.,  Nakagawa,  M.,  Hyenjong,  H.,  Ichisaka,  T.,  Yamanaka,  S.,  2008.  Generation  of  Mouse  Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors. Science. 322(5903), 949‐953.  Soldner, F., Hockemeyer, D., Beard, C., Gao, Q., Bell, G.W., Cook, E.G., Hargus, G., Blak, A., Cooper, O.,  Mitalipova,  M.,  Isacson,  O.,  Jaenisch,  R.,  2009.  Parkinson’s  Disease  Patient‐Derived  Induced  Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors. Cell. 136(5), 964–977.  Somers,  A.,  Jean,  J.C.,  Sommer,  C.A.,  Omari  A.,  Ford,  C.C.,  Mills,  J.A.,  Ying,  L.,.  Sommer,  A.G.,  Jean,  J.M.,  Smith,  B.W.,  Lafyatis,  R.,  Demierre,  M.F.,  Weiss,  D.J.,  French,  D.L.,  Gaude,  P.,  Murphy,  G.J., Mostoslavsky, G., Kotton, D.N., 2010. Generation of Transgene‐Free Lung Disease‐Specific  Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral ‐ Stem Cell Cassette.  Stem Cells. 28, 1728–1740. 

154 

Sommer,  C.A.,  Stadtfeld,  M.,  Murphy,  G.J.,  Hochedlinger,  K.,  Kotton,  D.N.,  Mostoslavsky,  G.,  2009.  Induced  Pluripotent  Stem  Cell  Generation  Using  a  Single  Lentiviral  Stem  Cell  Cassette.  Stem  Cells. 27(3), 543‐549.   Sommer, C.A., Sommer, A.G., Longmire, T.A., Christodoulou, C., Thomas, D.D., Gostissa, M., Alt, F.W.,  Murphy,  G.J.,  Kotton,  D.N.,  Mostoslavsky,  G.,  2010.  Excision  of  Reprogramming  Transgenes  Improves  the  Differentiation  Potential  of  iPS  Cells  Generated  with  a  Single  Excisable  Vector.  Stem Cells. 28, 64–74.  Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K., 2008. Induced pluripotent stem cells  generated without viral integration. Science. 322, 945–949.  Takahashi,  K.,  and  Yamanaka,  S.,  2006.  Induction  of  Pluripotent  Stem  Cells  from  Mouse  Embryonic  and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663–676.   Warren,  L.,  Manos,  P.D.,  Ahfeldt,  T.,  Loh,  Y.H.,  Li,  H.,  Lau,  F.,  Ebina,  W.,  Mandal,  P.K.,  Smith,  Z.D.,  Meissner, A., Daley, G.Q., Brack, A.S., Collins, J.J., Cowan, C., Schlaeger, T.M., Rossi, D.J., 2010.  Highly  Efficient  Reprogramming  to  Pluripotency  and  Directed  Differentiation  of  Human  Cells  with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 1–13.   Wernig, M., Lengner, C.J., Hanna, J., Lodato, M.A., Steine, E., Foreman, R., Staerk, J., Markoulaki, S.,  Jaenisch, R. A., 2008. A drug‐inducible transgenic system for direct reprogramming of multiple  somatic cell types. Nature Biotechnology. 26, nr. 8   Woltjen, K., Michael, I.P., Mohseni, P., Desai, R., Mileikovsky, M., Hämäläinen, R., Cowling, R., Wang,  W.,  Liu,  P.,  Gertsenstein,  M.,  Kaji,  K.,  Sung,  H.K.,  Nagy,  A.,  2009.  Piggybac  transposition  reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. Vol.458  Yu, J., Hu, K., Smuga‐Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I.I., Thomson, J.A., 2009. Human Induced  Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324(5928), 797–801.  Zhou, H., Wu, S., Joo, J.Y., Zhu, S., Han, D.W., Lin, T., Trauger, S., Bien, G., Yao, S., Zhu, Y., Siuzdak, G.,  Schöler,  H.R.,  Duan,  L.,  Ding,  S.,  2009.  Generation  of  Induced  Pluripotent  Stem  Cells  Using  Recombinant Proteins. Cell Stem Cell. 4(5), 381‐384. 

Közlésre elfogadott, illetve megjelent válogatott publikációk jegyzéke Muenthaisong, S., Ujhelly, O., Polgar, Z., Varga, E., Ivics, Z., Pirity, M.K., Dinnyes A., 2012. Generation  of  mouse  induced  pluripotent  stem  cells  from  different  genetic  backgrounds  using  Sleeping  beauty  transposon  mediated  genetransfer.  Experimenttal  Cell  Reseracher  31  8  (2012)  2482– 2489.  Richard,  P.D.,  Varga,  E.,  Freund,  C.,  Kosmidis,  G.,  Gkatzis,  K.,  Jong,  D.,  Szuhai.  K.,  Dinnyes,  A.,  Mummery  C.L.,  2013.  Generation  of  Induced  Pluripotent  Stem  Cells  from  Human  Foetal  Fibroblasts  Using  the  Sleeping  Beauty  transposon  Gene  Delivery  System.  Differentiation  –  Submitted  Nemes, C., Varga, E., Polgar, Z., Klincumhom, N., Pirity, M.K., Dinnyes, A., 2013. Generation of mouse  induced  pluripotent  stem  cells  by  protein  transduction.  Journal  of  Tissue  Engineering‐  Submitted 

155