Állatorvostudományi Egyetem Belgrád - Szerbia
Magyar Állatorvosok Világszervezete
VADDISZNÓK CIRKOVIRUS FERTŐZÖTTSÉGE
BECSKEI Zsolt Beregszász 2015. április 17.-18.
[email protected]
.............. TÖRTÉNELMI ÁTTEKINTÉS............... A vaddisznónak és a vadászatnak a magyar nemzet történelmében nem csak ekonómiai, hanem sorsíró jellege is van
.............. TÖRTÉNELMI ÁTTEKINTÉS...............
................. IRODALMI ÁTTEKINTÉS...............
Megváltozott a vaddisznótartás és gondozás módszere. A vaddisznó etetése általánossá vált. Több mint 30 000 etetõhelyen, heti alkalommal etetnek. A nagyvadas és vegyesvadas területeken, a terület 70%án történik etetés, ez korábban csupán 3% volt. A hazai nagyvadgazdálkodás ezzel intenzívebbé vált.
................. IRODALMI ÁTTEKINTÉS............... SZERBIA 3OO vadászterület 4 nagy nemzeti park – engedélyezett vadászat o.o2-1.38 v.d./ha 35 zárt vadászterület 82.612 ha Nyitott vadászterület 6.844.ooo ha (1.759ooo ha erdő) Vajdaság 2.152.635 ha 18.000 vaddisznó <-> 85.140 vadász
................. IRODALMI ÁTTEKINTÉS............... MAGYARORSZÁG 113 vadaskert 67.ooo ha (93.ooo) Ez csupán 1% az össz vadászterületnek o.o3 - 1.o3 v.d/ha Németország 5.ooo Ausztria 4.ooo
................. IRODALMI ÁTTEKINTÉS............... A vaddisznóállományok környezeti helyzetképe:
2O14
HU 1o5 215 egyed
szabadtéri állományok (83,6%) zárttéri állományok - vadaskert ( 16,4%) ............................................................. TERITÉK 2o13/2o14 vadászaati év 128 365 teriték <-> 61.580 vadász
................. IRODALMI ÁTTEKINTÉS............... HU
Az évi országos teriték 128.365 15% zérttéri vaddisznó 85% szabadtéri vaddiszmó Az évi teriték 19,64% külföldi vadászok teritették
Nyugat EU – forditott az arany
ZÁRTTÉRI VADTARTÁS – VADASKERET 31.ooo ha
................. IRODALMI ÁTTEKINTÉS............... A vaddisznók tartástechnológiája (vaddisznóskertek tipusa)
I. Egységes kert - szaporulatra alapozva - befogasra alapozva - kombinált
................. IRODALMI ÁTTEKINTÉS...............
II. Megosztott kert - váltókert - tárolós kertek - kocatárolós kert - malactárolós kert - kantárolós kert
................. IRODALMI ÁTTEKINTÉS...............
III. Intenziv szaporitasra alapozott kert - különálló szaporitókert - elletőkarámos szaporitókert - kutricás szaporitókert
LAJOSMIZSEI VADDISZNÓKERT
................. IRODALMI ÁTTEKINTÉS...............
A vaddisznó intenzív tartása
MAGAS ÁLLOMÁNYSŰRŰSÉG
Állategészségügyi gondok
................. IRODALMI ÁTTEKINTÉS............... PCV2-vel kapcsolatban leírt kórképek (PCVAD) házisertésben - választott malacok cirkovirus okozta sorvadása (PMWS) - dermatitisz nefropátia szindróma (PDNS), - sertések légzőszervi tünetegyüttese (PRDC), - magzati miokarditisz és reproduktív rendellenességek - granulómás enterítisz,
(SAMS),
- nekrotikus limfadenítisz, - ekszudative epidermítisz és - congenitális tremor. (West és mtsai.,1999; Ladekjaer és mtsai., 2001; Kim és mtsai., 2004; Chae C., 2005; Cheng és mtsai. 2010)
PCV2
Poxvirus 300 nm Család: Genus:
Circoviridae Circovirus
Legkisebb állati eredetü DNS vírus (virion 17nm)
(Tischer és mtsai., 1982; Studdert, 1993; Harding, 1997; Mankertz és mtsai., 1997; Jiang és mtsai., 2010)
Két tipus:
egyes típusú sertés cirkovírus (PCV1) kettes típusú sertés cirkovírus (PCV2)
(Clark, 1996)
(hármas típusú (PCV1/2a) (Gagnon és mtsai., 2010)
PCV1 - apatogén (Tischer és mtsai., 1986; Allan és mtsai., 1995)
PCV2 – virulens patogén (Meehan és mtsai., 1996; Krakowka és mtsai., 2000)
Két genotípus: PCV2a
PCV2b
(PCV2c)
(Gagnon és mtsai., 2008, 2010)
mutáns PCV2a/PCV2b (Guo és mtsai., 2011)
vaddisznó
házisertés
PCV2 genóm : 1767-1768 nukleotida Fő szekvenciák (ORF1, ORF2, OFR3)
ORF2 gén (Cap gén) PCV2 kapszidn fehérje (Cap antigén) 27.8 kDa struktút protein immunogén (Nawagitgul és mtsai., 2000; Cheung K., 2003; Liu és mtsai., 2006)
Kapszid fehérje 27.8kDa
233-234 a.s.
immunoreaktív domén
A PMWS első leírása egyes országokban 1996
1998 1996 1996
1998 2001
2004
2002 1999
2011 2003 2007 2000 2000 2002
2001 1998
2001 2004
(Chae C., 2004, Csank és mtsai., 2011)
1999
Retrospektív szerológiai eredmények 1996 1998 1996
1998
1986
1996
2002 1999 1999
2002 2002
2001
2004 2001
2001 1998
1993 2004
(Grierson és mtsai., 2004; Staebler és mtsai., 2005)
1989
Retrospektív kórszövettani eredmények 1996 1998
1973
2002 1999
1998
1985
1996
1986
1996
1962 1969
2001
2004 2001
1999
2002 2002
2001 1998
1993 2004
(Jacobsen és mtsai., 2009)
1989
A PMWS diagnózisa a sertésekben akkor megalapozott, ha a következő kritériumok mindegyike teljesül:
- a betegségre jellemző klinikai tünetek és kórbonctani elváltozások kialakultak, - kórszövettanilag a nyirokszövetekben a karakterisztikus elváltozások szintén kialakultak, - a PCV2 (antigén vagy nukleinsav) a limfoid léziókból kimutatható.
.......................CÉLKITŰZÉSEK........................ A kivizsgálások elsődleges célja a PCV2 fertőzés prevalenciájának felmérése a vajdasági vaddisznó állományokban.
Továbbá, a természetes úton PCV2-vel fertőződött vaddisznók immunrendszer károsodásának reszletes leírása.
A kitűzött célok a következő feladatok által lettel végrehajtva: а) a vaddisznók PCV2 fertőzésének prevalenciája;
b) a kórszövettani elváltozások leírása a limfatikus (nyirokcsomók, mandulák, lép, Peyer plakk, illeocökális valvula) és nem limfatikus (tüdő, máj, vesék és szív);
d) a kórszövettani léziók evaluációja;
e) a PCV2 Cap antigén és DNS kimutatása az elváltozott limfatikus és nem limfatikus szervekből;
f) a fertőzött sejtek leírása és immunopozitív szignál erősségének meghatározása ; g) Azon sejtek feltárása melyekben a vírus aktívan szaporodik.
..................ANYAG ÉS MÓDSZER.................
A vaddisznók két magyarországgal határos vadásztelepről származtak.
Részletes kórbonctani leíras mintázás a további
után következett a szövet kivizsgálásokhoz.
A PCV2 fertőzöttség meghatárizása PCR módszerrel történt a tüdőből, nyirokcsomóból és lépből.
A genóm 501bp ORF2 fragmentjének kimutatására specifikus oligonukleotid prajmerek voltak alkalmazva: forward PCV2-2A: 5′-CACCTTCGGATATACTGTCAA-3′ i reverse PCV2-2B: 5′-TACATGGTTACACGGATATTGTA-3′
A kórszövettani, az immunohisztokémiai és az in situ hibridizációs kivizsgálásokhoz a következö szervminták szolgálltak alapul: - nyirokcsomók (szubmandibuláris, mediasztinális, mezenteriális és ingvinális szuperficiális); - mandulák, - lép, - payer plakk, - tüdő, - máj, - vesék, - szív.
Szövetfikszálás 10% neutrális formalin, 24-48 óra Szövet proceszuálás: autómatikus szövetprocesszor Szövetbeágyazás: parafin blokk Szüvetmetszés: 5 µm Szövetfestés: hematokszilin - eozin (HE)
A limfatikus szövetkárosodás mértékének meghatározása Kritérium – limfatikus szövet Paraméter
Változatlan (BL)
Enyhe (I)
Közepes (II)
Nagyfokú (III)
Közepes mértékű T és B limfocita depléció
Nagymértékű T és B limfocitás depléció, a follikulusok hiánya
Limfocita depléció
Depléció nélkül
A T és B limfociták enyhe depléciója
Makrofágos infiltrácio
Makrofágos infiltráció hiánya
Makrofágok jelenléte kis számban
Közepes számú makrofág infiltráció
Nagymértékű makrofág infiltráció
Infektív granulóma jelenléte
Granulóma hiánya
Granulóma hiánya
Granulóma hiánya
Granulóma gyakori jelenléte
Gigantikus sejtek jelenléte
Óriássejtek hiánya
Óriássejtek hiánya
Óriássejtek kisszámú jelenléte
Óriássejtek nagyszámú jelenléte
A limfatikus szövet arhitektúrájának változása
A szövet arhitektúrája változatlan
A szövet arhitektúrája változatlan
A szövet arhitektúrája továbbra is megőrzött
A szövet arhitektúra megváltozott, hianyzik a sztróma
(Chiannini és mtsai., 2003)
A szövetek immunohisztokémiai kivizsgálása
(LSAB2)
PCV2 Cap antigén detekció, disztribúció és mennyiség meghatározása
A szövetek in situ hibridizációs kivizsgálása
(ISH CP és ISH RFP) PCV2 DNS detekció, disztribúció, mennyiség meghatározása, vírusreplikáció bizonyítása. (Chiannini és mtsai., 2003)
Negatív kontróla Pozitív kontróla
A pozitív szignál kvantifikációja IHC és ISH ( - , + ,
+ + ,
+ + + )
……. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS ………
8,75%
100,00%
81,67%
70,00%
41,66%
16,17%
86,67%
100,00%
0
68,33%
31,67%
60,00%
Kvalitatív PCR
Magyarország
2o, 5o%
(Cságola mts, 2oo6)
Szlovénia
25,oo%
(Toplak mts, 2oo4)
Szerbia
26,67%
(Becskei mts, 2o1o)
Németország
63,1o%
(Reiner mts, 2o1o)
100,00%
26,67%
Szövettani elváltozások és a PCV2 immunodestruktív hatása
Ln. med., HE
78,33%
13,33%
Tonsila, v.d., HE
Payer plakk, v.d. HE
Ln.mediastinalis, HE
A limfatikus szövetkárosodás mértékének kimutatása házisertés : vaddisznó
Szövet
Házisertás
Vaddisznó
Szővetkárosodás mértéke BL
I
II
III
Nyirokcsomók
11,67a
10,00
53,33b
25,00c
Peyer plakk
20,00a
11,67
50,00b
18,33c
Illeocökális valvula
25,00a
18,33
48,33b
8,33
Mandula
18,33a
11,67
51,67b
18,33c
Lép
50,00a
5,00
35,00b
10,00A
Nyirokcsomók
65,00a
21,67
10,00b
3,33c
Peyer plakk
75,00a
16,67
6,67b
1,67c
Illeocökális valvula
78,33a
11,67
8,33b
1,67
Mandula
78,33a
13,33
6,67b
1,67c
Lép
90,00a
6,67
1,67b
1,67A
Legenda: a, b, c = p<0,01;
A = p<0,05
78.33
68.33
100
56.67 45.00
80 60
p<0,01
p<0,01
23.33 p<0,01
40 13.33
8.33
10.00
8.33
3.33
Limfni Ny irok čvorovi
csomó
Pajerove Tonzile Payer Ileocekalna Illeocök. Mandula ploče valvula
plakk
valvula
Slezina Lép
Lép
lj e
ó zn is dd Va
0
Div
s té er is áz H
20
p<0,01
p<0,01
sv
inj
e
p<0,01
Diagram 1. A limfatikus szövet ++ és +++ erősségű limfocitás depléciója (%)
Tüdő,100x, HE
Tüdő, HE
68,33%
78,33%
Máj, HE
51,67%
46,67%
Vese, HE
51,67%
Immunohisztokémiai és in situ hibridizációs kivizsgálás eredményei PCV2 Cap prot
szövettani metszet
PCV2 DNS
Ln.ingvinalis sup., IHC
73,33%
Ln.ingvinalis sup., IHC
5,00%
Tonsila v.d., IHC
Payer plakk, v.d., IHC
Ekszpresszió intenzitás % Szövet
Házi Sertés
-
+
++
+++
Σ pozitiv
Σ pozitiv
Mandulák
30,00a
15,00
36,67b
18,33c
70,00d
ni
Payer plakk
16,67a
10,00
50,00b
23,33c
83,33d
ni
Illeocökális valvula
23,33a
13,33
46,67b
16,67c
76,67d
ni
Lép
25,00a
11,67
48,33b
15,00c
75,00d
100,00e
15,00a
11,67
51,67b
21,67c
85,00d
*100,00e
88,33a
10,00
1,67b
0,00c
11,67d
ni
Payer plakk
86,67a
8,33
3,33b
1,67c
13,33d
ni
Illeocökális valvula
86,67a
8,33
3,33b
1,67c
13,33d
ni
Lép
91,67a
66,67
1,67b
0,00c
8,33d
26,67e
Nyirokcsomók
81,67a
13,33
3,33b
1,67c
18,33d
*26,67e
Nyirokcsomók Mandulák
Vad disznó
PCR
IHC
Legenda: a, b, c, d, e = p<0,01;
* = ingv.sup. ny.cs.;
ni = kivizsgálatlan
73.33
73.33
63.33
63.33
100
55.00 80 p<0,01
60
p<0,01
p<0,01
p<0,01
p<0,01
40 20 0
5.00
5.00
5.00
1.67
1.67
Nyirok Payer Illeocök. Mandula Limfni Pajerove Ileocekalna Tonzile čvorovi ploče valvula csomó plakk valvula
L ép Slezina
V
Há zi se rté s
D ivad lj edi ss vizn nje
ó
p<0,01 Diagram 2. A limfatikus szövet ++ és +++ erősségű PCV2 Cap antigén ekspressziója (%)
Tüdő, IHC
Tüdő, h.s., IHC
75,00%
Ln.mesent., CP ISH
6,67%
Tonzila, v.d., CP ISH
Tüdő, h.s., CP ISH
A PCV2 genóm ekszpressziója (%) CP ISH Tkivo
Házi sertés
Vaddisznó
RFP ISH
PCR
-
+
++
+++
Σ Pozit.
-
+
Σ Pozit.
Tonzile
26,67a
15,00
36,67b
21,67c
73,33d
66,67e
33,33f
ni
Pajerove pl.
15,00a
10,00
50,00b
25,00c
85,00d
60,00e
40,00f
ni
21,67a
13,33
46,67b
18,33c
78,33d
61,67e
38,33f
ni
Slezina
21,67a
13,33
48,33b
16,67c
78,33d
66,67e
33,33f
100,00g
Limfni čv.
13,33a
16,67
51,67*b
23,33c
86,67d
53,33e
46,67f
Tonzile
88,33a
10,00
1,67b
0,00c
11,67d
98,33e
1,67f
ni
Pajerove pl.
85,00a
8,33
5,00b
1,67c
15,00d
96,67e
3,33f
ni
85,00a
8,33
5,00b
1,67c
15,00d
96,67e
3,33f
ni
Slezina
91,67a
5,00
3,33b
0,00c
8,33d
98,33e
1,67f
26,67g
Limfni čv.
80,00a
13,33
5,00b
1,67c
20,00d
93,33e
6,67f
*26,67g
Ileocek.valv.
Ileocek.valv.
Legenda: istim slovima a, b, c, d, e = p<0,01; * = ingv. sup.l.čvor; ni = nije ispitano
*100,00 g
75.00
75.00
65.00
100
58,33
65.00
80 p<0,01
60
p<0,01
p<0,01
p<0,01
p<0,01
s té er is áz H
40 20
6,67
6,67
6,67
1,67
3,33
Limfni Nyirok čvorovi
Csomó
Pajerove Payer Ileocekalna Illeocök. ploče valvula
plakk
valvula
Tonzile Mandula
Slezina L ép
lj e s
ó zn is dd Va
0
Div
vin
je
p<0,01
Diagram 3. A limfatikus szövet ++ és +++ erősségű CP ISH szignálja (%)
100.00 78.33
75.00
73.33
100 80
50.00
60 40
26.67
25.00
20
s rté se zi Há
18.75
Domaće svinje
PCR
kHistopatološki órszövettan
IHC
p<0,01
CP ISH
ó zn is dd Va
0
Divlje svinje
Diagram 4. PMWS diagnózis a PCV2-vel fertőzött sertéseknél. % Küloböző diagnosztikai módszerek komparatív eredményei. (II és III intenzitású kórszövettani elváltozások, ++ és +++ intenzitású ICH és CP ISH szig.)
PCV2-vel fertőzött malacok bakteriális fertőzései
PCV2 + 1 fajta baktérium PCV2 + 2 fajta baktérium PCV2 + 3 fajta baktérium PCV2 + 4 fajta baktérium PCV2 + 5 fajta baktérium
15% 46.25% 32.50% 5% 1.25%
...................KÖVETKEZTETÉS................... +
A PCR analízis eredményei megerősítették a PCV2 fertőzést minden kivizsgált sertéstelepen, valamint mindkét vaddisznó állományban (100,00% h.s., 26,67%v.d., p<0.01)
+
A kórbonctani, kórszövettani, immunihisztokémiai és in situ hibridizaciós eredmények arra utalnak, hogy a kivizsgált házisertések 75,00% PMWS-ben szenved, míg a vaddisznóknál a kórkép a kivizsgált egyedek 6,67%-ban lett alátámasztva.
+
Patognomikus kórbonctani elválozás nem található a PMWS-ben szenvedő egyedeknél.
+
A leggyakoribb kórszövettani lelet a limfatikus szövetben jelenlevő közepes és intenzív mértékű limfocita depléció.
+
A limfocita depléció a fő oka az immunoszupresszív állapotnak.
+
Nagy mennyiségű PCV2 Cap antigén és DNS van jelen a limfatikus szövetek sejtjeiben, elsősorban a makrofágokban, dendritikus sejtekben, APC sejtekben, alveoláris makrofágokban.
+
+
A PCV2 Cap antigén és DNS jelenléte bizonyított a mandulákban, lépben, Payer plakkokban, nyirokcsomókban, illeocökális valvulákban, tüdőben, májban, vesékben és szívben. Lebnagyobb mennyiségben viszont a limfatikus szövetekben található
A PCV2 tropizmusa bebizonyosult a limfociták, makrofágok, alveoláris epitel, bronhiális epitel,vesetubulus epitel, epecsatorna epitel sejtjei iránt, valamint a hepatociták és enterociták iránt is.
Csapatmunka :)
