Alimentární onemocnění
Jaké mikroorganismy nyní sledujeme ? • • • • • • •
Listeria monocytogenes Salmonella Enterobacter sakazakii Escherichia coli Koagulasa-pozitivní stafylokoky Bacillus cereus Enterobacteriacae
Salmonella spp. Salmonely jsou významnými původci alimentárních onemocnění.
Roční incidence salmonelóz se v humánní populaci pohybuje kolem 270 případů na 100 000 obyvatel. Některé serovary vyvolávají onemocnění • výhradně u lidí a vyšších primátů, např. Salmonella Typhi a Salmonella Paratyphi A, B, C • onemocnění lidí i zvířat (druhově specifické serotypy)
19 89 19 90 19 91 19 92 19 93 19 94 19 95 19 96 19 97 19 98 19 99 20 00 20 01 20 02 20 03 20 04 20 05
Salmonelózy v letech 1988-2005 60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Definice salmonelózy • Salmonelóza je bakteriální infekce, která má své pojmenování po rodu bakterií, které ji způsobují. Salmonely patří do čeledi Enterobacteriaceae, fakultativních anaerobů schopných žít v intestinálním traktu. Protože jsou nenáročné, mohou se rozmnožovat také mimo tělo živočichů, především v potravinách živočišného původu. • Salmonely způsobují 3 typy onemocnění: • Břišní tyfus – je nejzávažnějším typem salmonelového onemocnění. Je způsobeno S. typhi a představuje < 2,5% případů onemocnění salmonelózou u lidí. • Paratyfy – způsobované S.paratyphi A, B a C, představuje < 0,5% případů. • Gastroenteritidy – nejběžnější typ salmonelózy známý jako ’Salmonella food poisoning’. Gastroenteritidy způsobují všechny ostatní typy salmonel.
Tyfová varianta • Tyfus a paratyfy jsou onemocnění s cyklicky probíhající celkovou infekcí, dlouho se udržující horečkou. Zdrojem nákazy je člověk, a to buď nemocný nebo bacilonosič. Přenos nákazy se děje přímým nebo nepřímým způsobem stykem se stolicí nebo močí nemocného, dále vodou, mlékem, potravinami apod. Infekce od zvířat byly zjištěny jen u sérotypu S. paratyphi B. • Zdrojem nákaz gastroenteritidou způsobenou salmonelami jsou nejčastěji zvířata, a kontaminované potraviny. Až na výjimky se nešíří od člověka k člověku. Člověk se infikuje salmonelami téměř výlučně orální cestou, a to potravinami, které se nezpracovávají za vyšší teploty. Potraviny mají ústřední postavení v šíření a pomnožování salmonel. Nejčastěji jsou příčinou epidemií kontaminovaná vejce a drůbež, masné a mléčné výrobky. • Salmonelóza se u člověka obvykle projevuje za 6 až 8 hodin po požití kontaminované potraviny. Dostavuje se horečka, nevolnost, vodnaté průjmy, zvracení, bolesti hlavy, někdy i rozsev bakterií do krve a lymfatického systému. Onemocnění trvá podle závažnosti příznaků 5-10 dnů, exkrece bakterií přetrvává až po několik týdnů.
Salmonella Potraviny: 1) Maso, drůbež, mořské ryby a plody 2) Potraviny živočišného původu: Nepasterované vaječné výrobky Pasterované vaječné výrobky
3) Jiné potraviny s přídavky 1 a/nebo 2
Obecná charakteristika rodu Salmonella Rod Salmonella patří do čeledi Enterobacteriaceae. Jedná se o grammnegativní nesporulující tyčinky, až na na někojik málo výjimek pohyblivé pomocí bičíků. Nepohyblivé jsou druhy S. gallinarum a S. pullorum.
Salmonella sp. • Tyčinky jsou 0,5 – 0,8 m široké a přibližně 1 – 3,5 m dlouhé. Jsou schopny růstu v prostředí s kyslíkem i bez kyslíku. Salmonela roste při teplotách 6 – 50 oC, nejlépe však při 37 oC, rychle se vyvíjí i při pokojové teplotě. Dobře přežívá mrazení a chlazení, je však rychle usmrcována teplotou nad 66 oC. Některé sérotypy jsou však značně termorezistentní (S. senftenberg
Kriteria bezpečnosti potravin Maso a masné výrobky Salmonella spp. Negat./25g:
Negat./10g: (c=1)
- mleté maso ke spotřebě za syrova - masné výrobky ke spotřebě za syrova - želatina a kolagen - mleté maso určené k tepelné úpravě - mechanicky oddělované maso - drůbeží výrobky určené k tepelné úpravě
Kriteria bezpečnosti potravin Mléčné výrobky Salmonella spp. Negat./25 g: pasterace)
- sýry ze syrového mléka (< - sušené mléko a syrovátka - mražené výrobky (s výjimkami)
Stafylokokové enterotoxiny Nedetek./25 g - sýry - sušené mléko - sušená syrovátka E. sakazakii Negat./10g - kojenecká výživa (n=30)
Kriteria bezpečnosti potravin Různé potraviny Salmonella spp.
Negat/25 g:
šťávy
- vaječné výroby (s výjimkami) - potraviny k přímé spotřebě obsahující syrová vejce - vaření korýši a měkkýši - živí dvojskoř. měkkýši a hlavonožci - naklíčená semena rostlin - krájené ovoce a zelenina - nepasterované ovocné a zeleninové
Biochemické vlastnosti • fermentace glukosy za tvorby kyselin a plynů (test s methyl-červení je pozitivní) • utilizace citrátu jako jediného zdroje uhlíku • dekarboxylace lysinu, argininu, ornitinu • tvorba NH3 z močoviny • netvoří indol • nerostou za přítomnosti KCN • nefermentují laktosu • kataláza pozitivní • oxidáza negativní • redukce nitrátů • produkce sirovodíku • Voges Proskauer (tvorba acetyl metyl karbinolu).
• Taxonomie salmonel •
Podle taxonomické studie Le Minora a spol. (1982) má rod Salmonella jen jeden druh a sedm poddruhů (subspecies), které se dají rozlišit podle DNA-DNA hybridizace, biochemických a sérologických charakteristik. Každá ze sedmi subspecií se dělí na sérovary podle složení tělových a bičíkových antigenů.
• • • • • • •
nejčastěji je používáno vymezení sérovarů dle schématu Kauffmann-White čeleď – Enterobacteriaceae rod – Salmonella druh = species – biochemické varianty sérovar = sérotyp – sérologické varianty fagotyp – lyzotyp typizace plasmidových profilů
•
V současné době je známo více než 2200 sérotypů salmonel (podle schématu Kauffmann-White)
•
Antigenní klasifikace salmonel je založena na tělových (somatických) antigenech O a bičíkových (flagelárních) antigenech H. Somatické O-antigeny mají lipopolysacharidový charakter. Velké množství typů těchto antigenů je důsledkem rozdílů ve struktuře specifického sacharidového řetězce, kde se uplatňují různé typy glykosidických vazeb, obě anomerické konfigurace a rozdílná acetylace. Bičíkový H-antigen je bílkovinné povahy a je termolabilní. H-antigeny jsou dvojího typu– antigen první a druhé fáze a liší se primární strukturou bílkovin.
•
•
Taxonomie Jsou většinou pohyblivé, (např. S. Gallinarum je nepohyblivá) • fakultativně intracelulární patogeny • genom salmonel má velikost 4.6-4.8 MB • jeden nebo více plazmidů virulence (SSP) • schopnost tvorby biofilmu.
Současný počet serovarů a členění do druhů a poddruhů Species
subspecies
Počet serotypů
S. enterica
enterica
1454
salamae
489
arizonae
94
diarizonae
324
houtenae
70
indica
12
S. bongori
20
Salmonella enterica subsp. enterica serotyp Typhimurium (Salmonella Typhimurium)
Salmonella - růstové podmínky • pH 4 - 9,5 např. 3,99 v rajských jablíčkách např. 9,5 v oplachové vodě vajíček Při delší expozici kyselinami ATR Acid Tolerance Response Např. potraviny připravené k okamžité konzumaci
Salmonella - růstové podmínky • aw • 0,93 např. v instantní polévce Růst inhibován 3-4% NaCl Sůl je účinější při nižších teplotách Resistentní k suchu
Salmonella - růstové podmínky • • • •
Teplota 2 - 46 oC např. 2 oC (1-2 dny) hovězí a kuřecí maso např. 4 oC (<10 dny) na skořápkách vajíček • 46 oC v krémech, na kuřatech (56 oC mutanty v labotaroři)
Salmonella - růstové podmínky • Není resistentní vůči vyšším teplotám • Pasterace je účinná • Sub-letální zahřívání zvyšuje tepelnou resistenci • Lepší přežívání na suchých potravinách
Salmonella - růstové podmínky • Atmosféra • Fakultativně anaerobní poroste v přítomnosti C02 20-50% na mletém hovězím mase, na vařených krabech • Má větší toleranci k NaCl za anaerobních podmínek
Metoda stanovení salmonel
Salmonela na půdě XLD
Salmonella infekční dávky Potravina
Sérovar
Infekční dávka
Vaječný koňak
S. meleagridis
106-107
S. anatum
105-107
Kozí sýr
S. zanzibar
105-1011
Karmínové barvivo
S. cubana
104
Imitace zmrzliny
S. typhimurium
104
Čokoláda
S. eastbourne
102
Hamburger
S. newport
101- 102
Čedar
S. heidelberg
102
Čokoláda
S. napoli
101- 102
Čedar
S. typhimurium
100- 101
Čokoláda
S. typhimurium
101
Paprikové bramborové lupínky
S. saintpaul S. javiana S. rubislaw
4,5x101
Salmonella pathogenese • Břišní tyfus (střevní horečka) • Inkubace 7-24 dní • Krvavý průjem, horečka, bolest hlavy, bolesti břicha • Léčení : tekutiny (elektrolyty), antibiotika • Agens: enterotoxin a další virulentní faktory • vakciny
Patogeneze Po požití kontaminované potravy pronikají salmonely přes do trávicí trakt do tenkého střeva, kde se množí a při tom jsou uvolňovány toxické látky, které pronikají do lymfatického a krevního oběhu.
Invazivní kmeny mohou pronikat do hlubších vrstev sliznice střeva, dostávají se do lymfatického systému, jsou vychytávány fagocyty, ve kterých se dále pomnožují. Po rozpadu buňky se dostávají do krevního oběhu a způsobují septikémii.
Patogeneze Infekční dávka je u zdravého člověka přibližně 105 baktérií.
102 -
Inkubační doba je obvykle udávána 6-36 hodin. Její délka je hlavně ovlivněna infekční dávkou a vnímavosti postiženého jedince. Nejzávažněji probíhá salmonelóza u dětí, starších osob a pacientů se sníženou imunitou. Příznaky onemocnění jsou nevolnost, zvracení, bolesti břicha, teplota kolem 39 °C a průjmy. U malých dětí a osob starých nebo jinak nemocných je nebezpečí dehydratace a následného oběhového selhání.
Salmonella pathogenese • Enterokolitida, střevní katar • Inkubace 8-72 hodin • Nekrvavý průjem, bolesti břicha po dobu 5 dní • Léčení : tekutiny (elektrolyty) • Infekční dávka je nižší u mastných jídel
Výskyt v prostředí Bakterie rodu Salmonella se primárně vyskytují ve střevním traktu zvířat i lidí a vylučovanými fekáliemi kontaminují životní prostředí (voda, půda) a potraviny. Onemocnění doprovázené klinickými příznaky (akutní septické stavy) se projevují hlavně u mláďat, u dospělých zvířat se neprojevuje KP – nosičství. Lidé salmonely vylučují ve faeces jednak v akutním stádiu onemocnění salmonelózou (klinické příznaky onemocnění), dále pak i po proběhlém onemocnění (bez klinických příznaků) a to po dobu až několika měsíců.
Výskyt v potravinách K nejčastěji kontaminovaným potravinám patří: • syrové maso (drůbeží, vepřové) • syrová vejce • potraviny s vysokým podílem ruční práce např. cukrářské a lahůdkářské výrobky.
Odolnost salmonel vůči vnitřním a vnějším faktorům •
optimální teplota se pohybuje kolem 37 °C, minimální teplota růstu je 5 °C, maximální 47 °C,
• hraniční hodnota aw pro množení salmonel je 0.92
• rozmezí hodnot pH, při kterých se salmonely mohou pomnožovat je od 3.8 – 9.5, optimum je při neutrálním pH • koncentrace soli nad 9 % působí baktericidně • salmonely jsou většinou k antimikrobiálním a dezinfekčním látkám citlivé.
Vliv technologií Salmonely běžně nepřežívají sterilační ani pasterační teploty. Všeobecně platí, že efektivita záhřevu potraviny je závislá na koncentraci přítomných bakterií, na dosažené teplotě a délce expozice.
Nízké teploty salmonely neničí, ale zpomalují až zastavují jejich množení. Při teplotě 5 °C se salmonely přestávají množit, při expozici teplotám pod bodem mrazu se salmonely neničí, ale při dlouhodobém skladování při těchto teplotách může docházet k jejich subletálnímu poškození.
Vliv technologií Technologii sprejového sušení (mléko a vaječné směsi) mohou salmonely přežívat a proto je vhodné, když tomuto procesu předchází vhodný způsob tepelného ošetření (např. pasterace) nebo acidifikace. Snížení pH potravin organickými kyselinami má vhodný bakteriostatický až baktericidní účinek (kyseliny octová, askorbová a mléčná). S těmito technologiemi se setkáváme např. při výrobě kysaných mléčných a fermentovaných masných výrobků, kdy společně s ostatními bariérovými mechanismy (osmotický tlak, aktivita vody apod.) účinně zamezují přežívání salmonel i ostatních nesporotvorných baktérií.
Jak provádíme diferenciaci epidemiologicky významných izolátů • fágová typizace • biotypizace (xyl, rha, ino, d-tar) • ATB rezistence • pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) • random amplified polymorphic DNA (RAPD)
2 typy salmonel
Listeria monocytogenes Byla popsána před více než 100 lety, ale až v polovině 80. let byla potvrzena jako původce alimentárního onemocnění člověka. Rod Listeria zahrnuje 6 druhů, L. monocytogenes je jako jediný druh patogenní pro člověka. Za posledních 20 let bylo v Evropě a v USA zaznamenáno několik závažných epidemických onemocnění listeriózou s alimentární cestou přenosu. Závažnost tohoto onemocnění spočívá především ve vysoké smrtnosti postižených osob.
Historický úvod • Murray v roce 1926: – Bacterium monocytogenes – krevní monocyty králíků – Patogen lidí a zvířat
• Pirie v roce 1940: – Listeria monocytogenes – Joseph Lister
• Od roku 1980 – foodborn pathogen
Listeria monocytogenes Scanning EM showing Flagella
Výskyt v prostředí Listerie včetně patogenního druhu L. monocytogenes jsou v prostředí hojně rozšířeny, vyskytují se v půdě, povrchových vodách, na rostlinách a tedy i v zeleném krmivu zvířat včetně nekvalitních siláží, často bývají izolovány ze stolice zdravých lidí, z obsahu střev skotu, ovcí, ptáků, ryb a hlodavců. Ubikvitní výskyt. Vzácněji se u skotu může objevit listeriová mastitída, častěji se však jedná o sekundární kontaminaci mléka nedostatečnou hygienou při dojení.
20 05
+
20 04
20 03
20 02
20 01
20 00
19 99
19 98
19 97
19 96
19 95
počet hlášených případů
Listeriózy
25
20
15
10
5
0
Kriteria bezpečnosti potravin • Potraviny určené k přímé spotřebě pro kojence a potraviny určené k přímé spotřebě pro zvláštní léčebné účely • Nepřítomnost v 25 g EN/ISO 11290-1 • Potraviny určené k přímé spotřebě, které podporují růst L.monocytogenes, jiné než pro kojence a pro zvláštní léčebné účely • 100 KTJ/g EN/ISO 11290-2 produkty uvedené na trh během doby údržnosti
Taxonomie Bakterie rodu Listeria (čeleď Listeriaceae) jsou charakterizovány následovně: Gram pozitivní, krátké nesporulující tyčinky kataláza pozitivní, fakultativně anaerobní. Jsou pohyblivé při teplotě do 25 °C (charakteristický vířivý pohyb), nepohyblivé při teplotách nad 30 °C. Rod Listeria zahrnuje kromě L. monocytogenes i další druhy, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri a
grayi.
Průkaz LM
Půda ALOA
Patogeneze Ne všichni zástupci druhu L. monocytogenes jsou patogenní. Produkce hemolysinu (listeriolysinu O) a fosfolipázy patří mezi významné faktory patogenity. V organizmech nemocných lidí a zvířat se listerie mohou množit i intracelulárně. Cesta přenosu je převážně alimentární, vzácně i kontaktem. Onemocnění postihuje především osoby se sníženou odolností nebo s fyziologickou zátěží (těhotenství). Ze zažívacího traktu pronikají listerie do lymfatického a krevního oběhu. Listerie vykazují vysokou afinitu k mozkové tkáni a gravidní děloze, bakterie pronikají přes placentu, infikují plodovou vodu a dochází k infekci plodu.
Patogeneze Infekční dávka u L.monocytogenes není doposud jednoznačně určena, předpokládá se, že u zdravých jedinců se infekční dávka pohybuje kolem 108 buněk, u rizikových skupin je však výrazně nižší 102–103 buněk. U listeriózy se inkubační doba pohybuje od několika dnů až po několik týdnů v závislosti na infekční dávce, virulenci baktérií a zdravotním stavu pacienta. Spektrum klinických příznaků je u listeriózy široké, onemocnění často probíhá v podobě lehčích chřipkových příznaků (pod obrazem faryngitídy, sinusitídy nebo tonsilitídy), komplikované případy přechází do meningitíd a sepsí, nezřídka končí úmrtím postižené osoby. Toto patogenní agens vyvolává onemocnění především u rizikových skupin obyvatel.
Virulence internalin Listeriolysin, lecitinasa
Aktinová vlákna
Faktory virulence jsou umístěny v lecithinasovém operonu a jejich transkripce ke regulována transkripčním aktivátorem PrfA.
Patogeneze protein
gen
poznámka
PrfA PIPLC LLO ActA IntA
prfA plcA hlyA actA inlA
regulační protein operonu fosfolipáza hemolyzin aktin internalin
Vliv technologií Bakterie rodu Listeria jsou poměrně odolné k vnějšímu prostředí. Nepřežívají sterilační teploty, ale podobně jako další Gram pozitivní baktérie jsou i listerie odolnější k vyšším teplotám než příslušníci čeledi Enterobacteriaceae. Při vysoké předpasterační kontaminaci může část buněk přežít i pasterační proces. Jako bezpečnou lze považovat jen pasteraci probíhající při vyšších teplotách. Chladírenské teploty jsou pro listerie příznivé, přežívají také mrazení.
Nízké pH brzdí růst listerií, ale podobně jako vyšší koncentrace NaCl buňky neničí. Listerie mohou přežívat i proces mléčného kvašení zeleniny.
Odolnost listerií vůči vnitřním a vnějším faktorům Listerie jsou psychrotrofní patogeny s rozmezím teplot, při kterých si zachovávají plně vitální funkce od 0 do 50 °C, přežívají i mrazení (za chladírenských teplot jsou schopny se množit) Při teplotě 20 °C se v potravinách množí od aw 0.93 –0.95 Toleruje hodnoty pH v rozsahu 4.3 – 9.6 s optimem pH 7 Přežívá v potravinách s koncentrací soli do 10%
Bakterie mléčného kvašení a bakteriociny částečně inhibují růst, listerie jsou citlivé k běžným desinfekčním látkám
Christie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP) test • Provedení testu: kultury α-hemolytického Staphylococcus aureus a Rhodococcus equi se načárkují paralelně na misku s krevním agarem. Testované kultury pak se nanášejí v pravém úhlu ke kulturám S. aureus a R. Equi. • Po inkubaci při 35° C po 24-48 h, se na miskách hledá hemolýza. Hemolytická reakce L. monocytogenes a L. seeligeri je zesílená v zonách ovlivněných nárůstem S. aureus. • Ostatni druhy zůstávají nehemolytické. Reakce L. monocytogenes je častěji optimální za 24 h než po 48 h. • Je doporučeno použít kontrolní kmeny Listeria spp. na dalším agaru s ovčí krví. Misky s krevním agarem (beraní erythrocyty) by měly být co nejčerstvější.
Provedení CAMP testu • CAMP test. Na krevní agar s propranými ovčími erytrocyty samostatnou čarou naočkujte testovací kultury S. aureus a R. equi, a to navzájem rovnoběžně v opačných polovinách misky. Je zapotřebí inokulovat tenkou čarou a rovnoměrně pomocí kličky vedené kolmo k misce. • Testované kmeny naočkujte podobně, každý samostatnou čarou a navzájem rovnoběžně, ve směru kolmém na očkovací čáry testovacích kultur tak, že se čar očkovaných testovacími kulturami nedotýkají, ale jsou od nich vzdálené asi 1-2 mm. Na jednu misku lze očkovat několik testovaných kmenů (nejčastěji 3 testované kmeny na jednu misku krevního agaru). Současně naočkujte kontrolní kultury L. monocytogenes, L. innocua a L. ivanovii. Takto naočkované misky krevního agaru inkubujte v termostatu s teplotou udržovanou na 37 C po dobu 18-24 hodin.
CAMP test
Výskyt v potravinách K nejčastěji kontaminovaným potravinám patří: • syrové maso a syrové mléko • některé druhy sýrů (např. Olomoucké tvarůžky, sýry s plísní na povrchu nebo sýry zrající pod mazem) • vařené masné výrobky • syrová (mrazená) zelenina
• uzený losos
Rizikové skupiny sýrů Sýry s plísní uvnitř hmoty (Niva, Gorgonzola, Roquefort): pH 4.9, NaCl 4 % Sýry s plísní na povrchu – typ Camembert: pH 4.6-4.8, NaCl 3.5% Sýry zrající pod mazem (Romadur, Ol. tvarůžky): pH 5.2-5.4, NaCl do 5%
Biofilm vznik: 1) jednoduchá vrstva buněk 2) shluk bakterií s extracelulárním slizem (proteiny a polysacharidový adhesin)
• tvorba adhesinu je kodována geny
Jaké mikroorganismy nyní sledujeme ? • • • • • • •
Listeria monocytogenes Salmonella Enterobacter sakazakii Escherichia coli Koagulasa-pozitivní stafylokoky Bacillus cereus Enterobacteriacae
Enterobacter sakazakii Cronobacter sakazakii
Co je Enterobacter sakazakii? • baktérie často zvaná jako « killer bug » („brouk zabiják“) • Codex Alimentarius jej označil jako « známé riziko pro veřejné zdraví » • Definováno jako riziko se “ závažným dopadem na široký okruh spotřebitelů nebo na specifické senzitivní populace ”
Enterobacter sakazakii • Systematické zařazení • Říše:Bakterie Kmen:Proteobakterie Třída:Gamma Proteobakterie Řád:Enterobacteriales Čeleď:Enterobacteriaceae Rod:Cronobacter od r.2007
Enterobacter sakazakii - vlastnosti • Gramnegativní, fakultativně -anaerobní, oxidasa negativní, Katalasa pozitivní, tyčinkovitá bakterie, čeledi Enterobacteriaceae. • Pohyblivé, redukuje nitrát, utilizuje citrát, hydrolyzuje eskulin a arginin, také dekarboxylují L-ornithin. • Kyseliny tvoří z D-glukosy, D-sukrosy, D-raffinosy, Dmelibiosy, D-cellobiosy, D-mannitolu, D-mannosy, Lrhamnosy, L-arabinosy, D-trehalosy, a D-maltosy. Cronobacter má pozitivní reakci na produkci acetoinu (Voges–Proskauer ) a negativní test na methyl červeň
Závažný dopad na specifické senzitivní skupiny populace • Novorozenci a kojenci s ohroženou imunitou (HIV+ matky) • Novorozenci předčasně narození a novorozenci s nízkou porodní hmotností • Zdraví, donošení novorozenci mohou být rovněž ohrožení “řadou závažných a život ohrožujících stavů způsobených E. sakazakii ” • Tyto stavy zahrnují “meningitidy, sepse a nekrotizující enterokolitidy ”
Brány kontaminace • • • •
Čerstvé mléko - transport a skladování Pasterizace a sušení + příprava směsi Plnění do obalů a skladování Příprava nápoje ze sušeného prášku
Kontaminace kojenecké mléčné výživy • Enterobacter sakazakii je jednou z vysoce virulentních baktérií, také Salmonella sp. + Clostridium byly nalezeny ve výrobcích kojenecké mléčné výživy • Sušená kojenecká mléka NEJSOU sterilní výrobky • Mohou být kontaminovány při výrobě patogenními baktériemi rezistentními vůči teplu
“ Závažné onemocnění a neurologické následky ” • “ E. sakazakii zasahuje CNS a
způsobuje cysty nebo abcesy v mozku ” • “ Hlášený výskyt úmrtí dosáhl v některých případech až 50% ” • Kojenci, kteří přežijí mohou mít “závažné opoždění vývoje ” (poškození mozku)
• Americký úřad pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) varoval, že 14% z testovaných sušených kojeneckých mlék bylo kontaminováno E. sakazakii a že: “ Klinici by si měli být vědomi
toho, že sušená kojenecká mléka nejsou sterilní výrobky a mohou obsahovat bakteriální patogeny…” Duben 2002
Výrobci – vlastní výzkum • 2004 – Nestlé Research Centre - E. sak. zjištěn ve vzorcích z prostředí u 8 z 9 potravinářských výroben, 4 z nich byly továrny na výrobu sušených mlék…..
INFOSAN – International Food Safety Authorities Network (leden 2005) • Nekojené děti – informace poskytovaná matkám by měla zahrnovat instrukce pro správnou přípravu a upozornění na rizika z nevhodné přípravy a použití výrobku • Doporučená příprava – kojeneckou vodu přivést k bodu varu a nechat ochladit během několika minut na teplotu 70-90 st. C, rozmíchat prášek a směs ochladit na tělesnou teplotu, zkrátit dobu mezi přípravou a konzumací, nepoužité zbytky mléka vyhodit
Thermal Death Time Curves for 2 Enterobacter sakazakii Strains Heated at 58 C
Survivors [Log(CFU/mL)]
9 8
D = 591.9 sec
7 6 5
D = 30.5 sec
4 3 2 0
500
1000
1500
Heating Time (sec)
2000
2500
Porovnání D58°C-Values pro různé Enterobacteriaceae E. sakazakii 607
600
D-value (sec)
500 400 300 200 100 0
E. coli O157:H7 E. sakazaki N&Fpooled K. pneuomoniae Salmonella Hartford E. coli E. aerogenes E. sakazakii 51329
Cronobacter sakazakii Modročerné kolonie na chromogenní půdě bioMerieux
Existuje ISO norma k průkazu C. sakazakii.
•
Escherichia coli • E. coli náleží do čeledi Enterobacteriaceae. • Katalasa-pozitive, oxidasa-negativní, fermentativní, krátká Gram-negativní, nesporulující tyčinka, obvykle s bičíky,které jsou peritrichní. • Často tvoří pouzdra (capsule) nebo microkapsule.
Charakteristika • E. coli je typický mesofilní organismus, roste od 7-10ºC až do 50ºC s optimem okolo 37 ºC. POZOR – pro identifikaci na chromogenních mediích teplota 44 ºC. • Neutrální pH je optimální pro růst, ale roste i při pH 4.4 za jinak optimálních podmínek. • Minimální vodní aktivita pro růst je 0,95.
Escherichia coli • Univerzální obyvatel lidského střeva, rovněž ostatních teplokrevných zvířat – převážně fakultativní anaerob. • Obecně neškodný komensál • Oportunistický patogen působící infekce typu Gramnegativní sepse, infekce močových cest, pneumonie u imunosupresních pacientů a meningitidy u novorozenců • biochemicky je katalase-pozitivní, oxidasa-negativní, fermentativní, krátká gram-negativní nesporulující tyčinka, obvykle s bičíky peritrichního typu.
Escherichia coli
Escherichia coli Enterotoxigenní (ETEC), Enteroinvasivní (EIEC), Enteropatogení (EPEC), Enterohemoragický (EHEC), Enteroaggregativní (EaggEC), Adherentní E. coli (DAEC)
Enterotoxigenní E. coli • ETEC je běžnou příčinou infekčních průjmů (Black, 1993), zvláště v tropech. • Onemocněníl nastává mezi 12 a 36 h po požití infekčního organismu. • ETEC vyvolává vodnaté průjmy spojené s křečemi, zvýšenou teplotou a zvracením. • Onemocnění je samolimitující, trvá 2 až 3 dny. • Je to častý důvod průjmů dětí, může způsobit vážnou dehydrataci. • Průjem vyvolaným ETEC má mnoho společného s cholerou; obě nemoci jsou výsledkem příjmu značně velkého inokula bakterií, které pak kolonizují tenké střevo a tvoří toxiny které vyvolávají sekreci do střevních dutin (lumen).
Enteroinvasivní E. coli • EIEC- klasické symptomy invasivní bacilární dysenterie / jako Shigella - úplavice • EIEC proniká a množí se v epitheliálních buňkách střeva, působí vředovatění a zánět • EIEC kmeny neprodukují Shiga toxin • Invasivnost je daná velkým počtem proteinů vnější membrány, kódovaných velkým plasmidem ( 140 Mda)
Enteropathogenické E. coli • EPEC infekce působí vodnatý průjem doprovázený zvracením a horečkou, v některých případech mohou vznikat dlouhodobé chronické enteritidy. • Nemoc nastupuje 12-36 h po přijjetí bakterií potravou.
• EPEC je tradičně spojován se vzplanutími v porodnicích, jeslích a školkách, ačkoli jsou také běžné případy u dospělých. • U kojenců a batolat je nemoc vážnější než mnoho ostatních průjmových infekcí, může někdy přetrvávat déle než 2 týdny.
Enterohemorhagické E. coli • Skupina EHEC působí vážné krvavé průjmy (hemorhagická kolitida), hemolytický uremický syndrome (HUS), a thrombotické krvácení do kůže, (thrombocytopenická purpura). • Ačkoli někdy infekce způsobí pouhý průjem bez dalších symptomů. • Nejčastěji nalézaný EHEC kmen má serotyp O157:H7. • EHEC kmeny produkují cytotoxin Verotoxin (označení pochází z jeho schopnosti usmrcovat ledvinové buňky Vero - African Green Monkey.
Zdroje infekce • Zelenina, bramborový salát, suši • Některé typy sýrů • EHEC O157:H7 – špatně tepelně upravené hovězí maso, někdy i mléko
Koagulasa-pozitivní stafylokoky • • • • • • •
taxonomické zařazení: říše Bacteria kmen Firmicutes třída Bacilli řád Bacilliaes čeleď Staphylococcaceae rod Staphylococcus.
Charakteristika organismu • St.aureus je Grampozitivní, kalalasa pozitivní, oxidasa negativní bakterie. Fermentuje glukosu. • Mesofilní bakterie – roste od 7 do 48 oC. • Velmi tepelně odolný organismus, pH 6-7 • Snáší až 20% NaCl • Aw – 0,83 (generační doba 300 min)
Bakterie rodu Staphylococcus jsou charakterizovány jako gram-pozitivní, nepohyblivé koky o velikosti 0,5-1,0 μm, jejichž buňky jsou uspořádané do tvaru charakteristických hroznů Vyskytují se jednotlivě, ve dvojicích nebo v krátkých řetízcích..
Staphylococcus aureus úvod
Byl popsán před více než 140 lety jako původce abscesů a o několik desítek let i jako původce alimentárních intoxikací. V patogenezi infekčních onemocnění lidí a zvířat se uplatňují i jiné druhy, SA má u stafylokokových infekcí a intoxikací dominantní postavení.
Patogenita a virulence SA je způsobena schopností kmenů produkovat biologicky aktivní proteiny: • syndrom toxického šoku • exfoliativní toxiny • enterotoxiny
Stafylokoky tvořící hemolýzu
Výskyt • Staphylococcus aureus je přirozenou součástí mikroflóry lidského těla. Člověk je stafylokoky kolonizován od prvních dnů života. Nejvíce jsou kolonizována kůže na rukou, perinea a sliznice dýchacího a zažívacího ústrojí. Přítomnost S. aureus lze prokázat v horních cestách dýchacích u 20 – 50% populace. Jejich přenašeči mohou být i zdraví jedinci, u kterých není vyvoláno žádné onemocnění. Nosičství stafylokoků organismus nijak nepoškozuje, ale naopak vede k poměrně dobré odolnosti vůči infekci. K onemocnění dochází jen při oslabení imunitního systému. • S. aureus rovněž kolonizuje dýchací trakt hospodářsky významných zvířat. Nejčastěji se jedná o domácí prasata a drůbež. Vyskytuje se také u řady divoce žijících druhů.
identifikace • Medium dle Baird-Parkera • LiCl a telurit působí selektivně, vaječný žloutek a pyruvát působí pozitvně na poškozené buňky. • Typické kolonie jsou černé se zónou hydrolyzovaného žloutkového proteinu. • Průkaz – králičí plasma je srážená koagulasou
Enterotoxiny • Stafylokokové enterotoxiny jsou bazické proteiny rezistentní k proteolytickým enzymům zažívacího traktu. Odolávají účinkům varu po dobu 30 minut. • Svými strukturními a biologickými vlastnostmi náležejí do skupiny stafylokokových a streptokokových pyrogenních toxinů označovaných jako superantigeny, které jsou schopny stimulovat větší množství T-lymfocytů než běžné antigeny. Superantigeny jsou aktivovány ve střevech, kde navodí odezvu, což je příčinou gastroenteritid spojených s dehydratací. • Stafylokokové enterotoxiny jsou jednou z příčin bakteriální virulence, vyvolávají zvracení a mohou také zapříčinit toxický šok.
Typy enterotoxinů • S. aureus produkuje 11 typů enterotoxinů (SE), přičemž doposud bylo identifikováno 20 sérologicky odlišných typů. Jedná se o malé jednořetězcové polypeptidy o velikosti 26 – 30 kDa. • Syntéza je řízena chromozomálními nebo plastidovými geny. Enterotoxiny SEA, SEB, SEC, SED a SEE byly popsány již dříve, zatím co SEG, SEH, SEI a SEJ, jsou nověji popsané enterotoxiny.
Koagulasa • Plazmakoaguláza je určujícím znakem druhu a obecně známkou patogenity. Jednoduchý protein přeměňující fibrinogen na fibrin. Srážení vyvolané koagulázou vede k akumulaci fibrinu okolo bakteriální buňky a ztěžuje tak hostitelským obraným agens zkontaktovat se s ní a zabránit tak fagocytóze. Plazmakoaguláza může přispívat k ohraničení zánětlivé reakce vytvořením fibrinového lemu kolem léze, která se přeměňuje ve stafylokokový absces.
Podle produkce plazmakoagulázy se stafylokoky rozdělují do dvou velkých skupin: koaguláza pozitivní a koaguláza negativní stafylokoky. Koagulázový test se používá pro rozlišení S. aureus a S. epidermidis, který je koaguláza negativní.
onemocnění • Stafylokokové enterotoxiny mohou vyvolat alimentární onemocnění zvané enterotoxikóza, které patří mezi nejčastější příčiny otravy jídla na světě. • Po požití kontaminované potraviny se dostaví příznaky otravy, jako je slinění, bolest hlavy, odpor k jídlu, křečovité bolení břicha a průjem. Stolice je vodnatá a může obsahovat i hlen. • Inkubační doba je krátká, v rozmezí od 30 minut do 8 hodin. Příznaky většinou odezní po 24 - 48 hodinách. Mezi nejčastěji kontaminované potraviny patří mléko a mléčné výrobky, masné výrobky a drůbež, vejce, krémové zákusky a pekařské výrobky
Patogeneze Toxická dávka 0,1-1 g enterotoxinu je schopna vyvolat onemocnění. Inkubační doba se pohybuje od 1 do 7 hodin.
Nástup klinických příznaků je velmi rychlý a dramatický, bolesti hlavy, zvracení, bolesti břicha, vzácněji průjem. Úzdrava je rychlá, do 2 dní. Předpokládá se, že enterotoxiny stimulují lokální neuroreceptory v trávícím traktu, které prostřednictvím vagu stimulují centrum pro zvracení v mozku.
19 95 19 96 19 97 19 98 19 99 20 00 20 01 20 02 20 03 20 04 20 05 +
počet hlášených případů
Bakteriální intoxikace
1200
1000
800
600
400
200
0
Taxonomie Bakterie S. aureus (čeleď Staphylococcaceae) jsou charakterizovány následovně: • Gram pozitivní koky (hroznovité formace) • kataláza pozitivní • nepohyblivé • aerobní a fakultativně anaerobní, • mohou tvořit zlatožlutý až oranžový pigment • plazmakoagulázový a termonukleázový test pozitivní
Vliv technologií Bakterie SA jsou velmi odolné k vnějšímu prostředí. Dobře přežívají v: • suchém i kyselém prostředí, • snáší vysoký obsah kuchyňské soli, • chladírenské i mrazírenské teploty, • aerobní i anaerobní prostředí.
Nepřežívají sterilační ani pasterační teploty. Toxiny jsou velmi rezistentní!
Bacillus cereus Enterobacteriacae
BACILLUS CEREUS
Scientific classification Kingdom
Bacteria
Phylum
Firmicutes
Class
Bacilli
Order
Bacillales
Family
Bacillaceae
Genus
Bacillus
Species
Cereus
Typické rysy • Gram-pozitivní- mladé buňky,starší mohou být Gramnegativní • Fakultativní aeroby - tvoří endospory (sporotvorné tyčinky): rezistentní k nepříznivým fyzikálním a chemickým podmínkám (teplo, záření,desinfekce,vyschnutí)→ častá příčina kontaminace • Rod obsahuje 80 druhů (species) • Endemická, tyčinka, obývající půdu • Gramovo barvení dává: 1 μm široké, 5-10 μm dloohé, samotné nebo ve dvojicích nebo krátkých řetízcích • Beta hemolytická bakterie působicí onemocnění z potravin: Infekční dávka -– 105 - 107 CFU (KTJ) • Spojení s potravinami: cereálie, mouka, rýže, těstovinová jídla, syndrom čínské restaurace
Růst a jeho kontrola • Teplota: Optimum 30-37 ºC. Některé kmeny až do 55 ºC jiné také i při 4- 5 ºC (mlékárenské výrobky) • pH: minimální pro růst – 4,3 a maximum 9,3. • Atmosféra: Roste nejlépe v přítomnosti kyslíku. Roste také anaerobně, ale s nízkou produkcí toxinu. • Vodní aktivita: Minimální rozmezí pro vegetativní růst je 0,912-0,950.
Konzervační prostředky • Růst je inhibován 0,26% sorbové kys. a pH 5.5 nebo 0,39% alium sorbátu a pH 6.6 • Přídavek 0.2% Ca propionátu zabraňuje klíčení spor B .cereus v chlebu • Nisin je běžně používán k zabránění klíčení spór a jejich dalšímu růstu v tavených sýrech, mléčných desertech, v konzervovaných potravinách, uzeném mase a pekařských výrobcích o vysoké vlhkosti (3.75 μg/g) • Ostatní antimikrobiální látky: benzoát, sorbát, ethylenediaminetetraoctová kys. (EDTA) a polyfosfáty
Onemocnění B. cereus působí dvě různé otravy potravinami syndromes (2-5%): 1. Rychlý nástup emetického syndromu 2. Pomalý nástup diarrhoealního průjmového syndromu
Jak předcházet ? • •
•
Potravina by měla být řádně uvařena Uvařené jídlo by nemělo být rekontaminováno syrovou potravou Uvařené jídlo skladovat při vhodných chladících teplotách .
Emetický syndrom • Inkubace: 1-6 hodin po požití kontaminované potraviny • Symptomy: nausea a zvracení, někdy doprovázené průjmem (důsledek přijetí předem vytvořeného toxinu: emetoxin ETE). Podobné jako u S. aureus. • Velmi běžné v Japonsku
