AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL DAUN MURBEI (Morus alba L.) DENGAN METODE Thiobarbituric Acid (TBA)
WIDIA AYU LESTARI
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Murbei (Morus alba L.) dengan Metode Thiobarbituric Acid (TBA) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Bogor, Januari 2016 Widia Ayu Lestari NIM G84110011
ABSTRAK WIDIA AYU LESTARI. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Murbei (Morus alba L.) dengan Metode Thiobarbituric acid (TBA). Dibimbing oleh HASIM dan ARYANI SISMIN SATYANINGTIJAS. Daun murbei mengandung berbagai senyawa aktif yang berperan sebagai antioksidan. Ekstraksi daun murbei dengan etanol 65% menghasilkan kadar flavonoid dan fenolik tertinggi dibandingkan pelarut lain seperti aseton. Penelitian ini bertujuan menentukan konsentrasi optimum antioksidan ekstrak etanol daun murbei dengan mengukur konsentrasi malondialdehida menggunakan metode TBA, serta membandingkan aktivitas antioksidannya dengan α-tokoferol. Rendemen ekstrak yang diperoleh sebesar 24.52% dan rata-rata kadar air 7.26%. Hasil uji fitokimia positif pada flavonoid, tanin, steroid. Eugenol merupakan senyawa dengan kelimpahan terbesar mencapai 34.32% berdasarkan uji GC-MS. Hasil uji antioksidan menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun murbei pada konsentrasi 125, 200, 500, dan 1000 ppm dapat menghambat pembentukkan MDA masing-masing sebesar 41.21%, 45.33%, 44.20% dan 36.00%. Potensi antioksidan daun murbei terbaik secara in vitro pada konsentrasi 200 ppm. Nilai inhibisi pada konsentrasi 200 ppm lebih rendah dibandingkan inhibisi α-tokoferol yang mencapai 62.06 %. Kata kunci: antioksidan, eugenol, inhibisi, malondialdehida, murbei
ABSTRACT WIDIA AYU LESTARI. Antioxidant Activity of Ethanol Extracts of Mulberry Leaves (Morus alba L.) using TBA Method (thiobarbituric acid). Supervised by HASIM and ARYANI SISMIN SATYANINGTIJAS. Mulberry leaves contain a variety of active compounds that act as antioxidants. Mulberry leaves extraction using ethanol 65% produce the highest level of flavonoids and phenolic compared to other solvents such as acetone. The purpose of this study is to search the optimum concentration antioxidant of ethanol extraction of mulberry leaves to measure the concentration of malondialdehida using TBA method, and compare its antioxidant activity to alpha tocopherol. The yield of extract obtained is 24.52% and average of 7.26% water content. Phytochemical test results showed positive results in flavonoids, tannins, steroids. Eugenol is the most abundant compound detected using GC-MS test, which is 34.32%. The test results showed that the antioxidant extract of mulberry leaves ethanol at a concentration of 125, 200, 500, and 1000 ppm can inhibit the formation of MDA respectively by 41.21%, 45.33%, 44.20% and 36.00%. Best mulberry leaf antioxidant potency in vitro is at the concentration of 200 ppm. Inhibition value at 200 ppm concentration is lower than inhibition value of alpha tokoferol which is 62.06%. Keywords: antioxidants, eugenol, inhibition, malondialdehida, mulberry
AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL DAUN MURBEI (Morus alba L.) DENGAN METODE Thiobarbituric Acid (TBA)
WIDIA AYU LESTARI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
PRAKATA Puji dan syukur penulis ucapkan kepada Allah SWT atas segala nikmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian yang berjudul Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Murbei (Morus alba L.) dengan Metode Thiobarbituric Acid (TBA). Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni 2015 hingga Oktober 2015 di Laboratorium Biokimia Institut Pertanian Bogor. Penulis menyampaikan terima kasih kepada Dr drh Hasim DEA dan Dr drh Aryani Sismin Satyaningtijas MSc atas bimbingan, saran serta waktu selama penelitian serta penulisan skripsi ini. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada orangtua, kakak-kakak, Bidikmisi, keluarga Senior Resident Asrama TPB IPB dan Biokimia angkatan 48 atas doa dan dukungan yang selalu diberikan. Penulis menyadari bahwa tulisan ini masih jauh dari sempurna sehingga sangat terbuka untuk kritik dan saran yang membangun agar tulisan ini menjadi lebih baik. Akhir kata penulis berharap tulisan ini dapat berguna bagi penulis maupun semua pihak demi kemajuan ilmu pengetahuan.
Bogor, Januari 2016 Widia Ayu Lestari
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
viii
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Alat dan Bahan
2
Prosedur Penelitian
2
Analisis Data Statistika
4
HASIL
4
Kadar Air dan Rendemen Ekstrak
4
Senyawa Fitokimia Ekstrak Daun Murbei
5
Penentuan Waktu Inkubasi Asam Linoleat
5
Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Murbei
5
Identifikasi Senyawa Biokatif dengan GC-MS
7
PEMBAHASAN
7
Kadar Air dan Rendemen Ekstrak
7
Senyawa Fitokimia Ekstrak Daun Murbei
9
Penentuan Waktu Inkubasi Asam Linoleat
9
Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Murbei
10
Identifikasi Senyawa Bioaktif dengan GC-MS
12
SIMPULAN DAN SARAN
13
Simpulan
13
Saran
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
17
RIWAYAT HIDUP
25
DAFTAR TABEL 1 Kadar air simplisia dan rendemen ekstrak daun murbei 2 Hasil uji fitokimia ekstrak daun murbei 3 Komposisi senyawa ekstrak etanol daun murbei
4 5 7
DAFTAR GAMBAR 1 Absorbansi asam linoleat pada λ= 234 nm 2 Konsentrasi malondialdehida (MDA) 3 Persen (%) inhibisi ekstrak etanol daun murbei
5 6 6
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Diagram alir penelitian Kadar air simplisia dan rendemen ekstrak daun murbei Kromatogram ekstrak etanol daun murbei Penentuan waktu inkubasi optimum asam linoleat Data penentuan waktu inkubasi optimum asam linoleat Pembuatan kurva standar Kurva standar TMP Pengukuran antioksidan dengan metode TBA Data inhibisi uji antioksidan Hasil analisis fitokimia Analisis statistika aktivitas antioksidan
18 18 19 19 20 20 21 22 23 23 24
PENDAHULUAN Radikal bebas bersifat sangat reaktif dan dapat menyebabkan kerusakan pada makromolekul seperti lipid, protein, karbohidrat dan DNA (Murray 2003). Masalah ini dapat diatasi dengan adanya antioksidan dalam tubuh seperti superoksida dismutase, katalase, dan glutation peroksidase (Winarsi 2007). Jumlah radikal bebas yang berlebihan membuat kebutuhan tubuh akan antioksidan juga meningkat.Antioksidan sintetik seperti butylatedhydroxyanysole (BHA), butylatedhydroxytoluene (BHT), tetra-butyl hydroxy quinon (TBHQ) dan αtokoferol dapat menimbulkan efek samping seperti kanker dan kerusakan hati, sehingga penggunaannya dalam makanan dibatasi sebesar 200 ppm (Hernani dan Rahardjo 2005). Antioksidan alami yang diperoleh dari tumbuhan seperti buah dan sayur diharapkan lebih aman untuk dikonsumsi. Murbei dikenal sebagai tanaman yang kaya manfaat, seperti pemanfaatan daunnya sebagai pakan ulat sutera karena kandungan proteinnya yang mencapai 21.39% (Syahrir et al. 2009). Daun murbei juga dimanfaatkan sebagai obat antidiabetes karena adanya kandungan 1-Deoxynojirimycin (DNJ), yaitu inhibitor kompetitif bagi α-glukosidase (Kwon et al. 2011). Kandungan senyawa aktif daun murbei secara umum meliputi golongan fenolik, flavonoid seperti rutin, kuersetin, asam galat dan asam klorogenik (Katsube et al. 2006). Daun murbei yang diekstrak oleh etanol 65% menghasilkan total fenolik dan flavonoid yang lebih baik dibandingkan aseton pada konsentrasi yang sama. Pengujian aktivitas antioksidan ekstrak etanol 65% daun murbei menggunakan metode 2,2-diphenyl-1picrylhydrazyl (DPPH) juga menghasilkan inhibisi yang lebih baik dari ekstrak aseton 65% (Jeszka et al. 2014b). Jumlah total fenolik dan flavonoid berhubungan dengan aktivitas antioksidan. Semakin tinggi kandungan total fenolik suatu tanaman maka kandungan antioksidannya juga meningkat (Delouee dan Urooj 2007). Penelitian mengenai antioksidan ekstrak etanol 65% daun murbei telah dilakukan menggunakan metode DPPH. Penelitian ini dilakukan berdasarkan permasalahan belum diketahuinya konsentrasi optimum antioksidan ekstrak etanol 65% daun murbei menggunakan metode Thibarbituric acid (TBA). Metode DPPH dan TBA memiliki prinsip yang berbeda. Prinsip metode DPPH berdasarkan kemampuan suatu antioksidan dalam menangkap radikal bebas (DPPH) (Aqil et al. 2006), sedangkan metode TBA menguji kemampuan antioksidan dalam menghambat proses oksidasi senyawa stabil seperti asam lemak atau lipid (peroksidasi lipid) (Kikuzaki dan Nakatani 1993). Kemampuan dalam menghambat peroksidasi lipid penting ditentukan karena tingginya kadar lipid peroksida dalam tubuh dapat menyebabkan penyakit kardiovaskular (Yagi 1994). Penelitian ini bertujuan menentukan konsentrasi optimum antioksidan ekstrak etanol daun murbei dengan mengukur konsentrasi malondialdehida menggunakan metode TBA, serta membandingkan aktivitas antioksidannya dengan α-tokoferol. Penentuan konsentrasi optimum penting dilakukan karena antioksidan yang baik memiliki aktivitas yang tinggi pada konsentrasi rendah. Hasil penelitian ini diharapkan dapat mendukung informasi ilmiah mengenai potensi antioksidan daun murbei, sehingga dapat dijadikan dasar pengembangan daun murbei sebagai produk fitofarmaka.
2
METODE Alat dan Bahan Alat yang digunakan adalah oven, blender, Erlenmeyer, shaker, shimadzu type GC-MS-QP2010, mortar, penangas, pipet Mohr, botol gelap berulir, labu takar, termometer, spektrofotometer Genesys 10 UV (190-1100 nm), sentrifus Hettich Universal (0-6000 rpm) dan tabung sentrifus. Bahan yang digunakan adalah daun murbei yang diperoleh dari Unit Konservasi Budidaya Biofarmaka (UKBB), etanol absolut, kloroform, amoniak, H2SO4, pereaksi Dragendorf, pereaksi Meyer, pereaksi Wagner, FeCl3, eter, NaOH 10%, asam linoleat, bufer fosfat 0.1 M pH 7, α-tokoferol (vitamin E), 1,1,3,3tetrametoksipropana (TMP) 6 M, trichloroacetic acid (TCA), thiobarbituric acid (TBA) dan asam asetat glasial.
Prosedur Penelitian Preparasi Simplisia Daun Murbei (Jeszka et al. 2014a) Daun murbei segar yang diperoleh dari UKBB. Daun yang diambil adalah daun muda pada posisi 1 sampai 8. Daun dipisahkan dari kotoran dan dicuci kemudian dikeringkan selama 1 jam di bawah sinar matahari. Pengeringan dilanjutkan menggunakan oven selama 6 jam pada suhu 60 °C. Daun yang sudah kering diblender agar menjadi serbuk halus berukuran 35 mesh. Analisis Kadar Air (WHO 1998) Analisis kadar air dilakukan dengan mengeringkan cawan porselen menggunakan oven pada suhu 105 ºC selama 30 menit dan diletakkan dalam desikator selama 15 menit kemudian ditimbang. Sebanyak 2 g simplisia daun murbei dimasukkan ke dalam cawan untuk di oven pada suhu 105 ºC selama 3 jam dan didiamkan dalam desikator selama 15 menit, lalu ditimbang. Kadar air dihitung dengan menggunakan rumus : Kadar air = Bobot sampel awal (g)− bobot sampel akhir (g) × 100% Bobot sampel awal (g) Ekstraksi Daun Murbei (Modifikasi metode Jeszka et al. 2014a) Pelarut ekstraksi yang optimal ditentukan berdasarkan percobaan (Jeszka et al. 2014a), yaitu digunakan etanol 65% dengan perbandingan 1:10, diulang sebanyak 3 kali ulangan. Maserasi dilakukan selama 24 jam (6 jam pertama dikocok dengan shaker). Hasil ekstraksi dievaporasi menggunakan rotary evaporator. Analisis Fitokimia Ekstrak Daun Murbei (Harborne 1987) Uji alkaloid menggunakan 0.3 mL ekstrak yang ditambag 1.5 mL kloroform dan 3 tetes amonia sehingga terpisah menjadi dua fraksi yang salah satu fraksinya adalah kloroform. Fraksi kloroform yang terpisah dicampurkan dengan 2 tetes asam sulfat untuk diuji oleh tiga pereaksi yaitu reagen Dregendorf, Meyer dan Wagner. Uji tanin diawali dengan mengencerkan ekstrak dengan perbandingan 1:5 yang kemudian dididihkan selama 5 menit. Pengujian cukup dengan 3 tetes dari
3 sampel oleh 3 tetes FeCl3 1% yang akan menghasilkan warna biru tua atau hijau kehitaman jika positif tanin. Uji flavonoid juga memerlukan pengenceran dengan akuades dengan perbandingan 1:2. Hasil pengenceran digunakan sebanyak 0.3 mL dicampurkan dengan 1.5 mL metanol yang kemudian dipanaskan pada suhu 50 °C selama 5 menit. 5 tetes dari hasil pemanasan tersebut dipindahkan ke plat tetes untuk diuji dengan 5 tetes asam sulfat pekat. Warna merah akan terbentuk jika terdapat flavonoid. Uji saponin cukup dilakukan dengan memanaskan sampel yang telah diencerkan dengan perbandingan 1:10 selama 5 menit. Perlakuan dilanjutkan dengan pengocokan selama 10 menit jika terbentuk buih yang stabil maka ekstrak positif mengandung saponin. Uji steroid dan triterpenoid menggunakan 2 mL ekstrak yang dilarutkan dalam etanol 30% dan dipanaskan kemudian filtrat yang dihasilkan dibiarkan menguap sehingga menyisakan bagian yang diberi penambahan 1 mL eter. Fraksi eter sebanyak 5 tetes diuji dengan 3 tetes asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat. Warna merah atau ungu menunjukkan keberadaan senyawa triterpenoid sedangkan steroid ditandai dengan warna hijau. Penentuan Waktu Inkubasi Asam Linoleat (Esterbauer et al. 1989 dalam Taher 2003) Sebanyak 2 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7, 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%, 1 mL air bebas ion dicampurkan dan ditempatkan pada botol gelap berulir. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 40 °C dan diukur serapannya setiap hari hingga tercapai serapan maksimum dan memberikan pengukuran yang cenderung menurun. Waktu yang Pengukuran intensitas serapan dilakukan dengan cara menambahkan sebanyak 50 µL campuran asam linoleat yang telah diinkubasi ke dalam 6 mL etanol 75%. Selanjutnya campuran tersebut dibaca serapannya pada panjang gelombang 234 nm dengan larutan etanol 75% sebagai blanko. Analisis Potensi Antioksidan dengan Metode TBA (Kikuzaki dan Nakatani 1993) Ekstrak etanol daun murbei dibuat dengan konsentrasi 125, 200, 500, dan 1000 ppm. Kontrol positif menggunakan larutan α-tokoferol 200 ppm yang dilarutkan dalam etanol. Kontrol negatif menggunakan akuades. Ekstrak etanol daun murbei, kontrol positif dan negatif masing-masing diambil sebanyak 1 mL, ditambah dengan 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7.0 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%. Semua larutan dimasukkan ke dalam botol gelap berulir dan diinkubasi pada suhu 40 °C selama waktu inkubasi optimum yang telah ditentukan sebelumnya menggunakan metode diena terkonjugasi. Pengukuran MDA dilakukan dua hari setelah inkubasi dengan menggunakan metode TBA, yaitu dengan mengambil 1 mL dari setiap larutan kemudian ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat glasial 50%. Akuades digunakan sebagai blanko dengan perlakuan yang sama. Campuran diletakkan dalam penangas air 100 °C selama 10 menit. Sentrifugasi dilakukan setelah campuran dingin dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit dan diukur panjang gelombangnya pada 532 nm. Pembuatan kurva standar dilakukan dengan menggunakan larutan TMP dengan konsentrasi 1.5, 3, 6, 9, 12, 15, dan 18 µM, setiap konsentrasi dipipet 1 mL dan
4 ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat glasial 50%. Campuran reaksi diletakkan dalam penangas air 100 °C selama 10 menit. Campuran disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit dan diukur serapannya pada panjang gelombang 532 nm. Blanko yang digunakan adalah akuades dengan perlakuan yang sama (Yagi 1994). Persentase inhibisi ekstrak dapat dihitung dengan rumus : Persen (%) inhibisi = [MDA] kontrol negatif −[MDA] ekstrak × 100% [MDA] kontrol negatif Analisis dan Identifikasi Senyawa Bioaktif dengan GC-MS Ekstrak etanol 65% murbei dianalisis dan diidentifikasi kandungan senyawanya dengan menggunakan alat Shimadzu Type Gas ChromatographyMass Spectroscopy (GC-MS) QP2010. Kondisi GC-MS menggunakan kolom kapiler Rtx-5MS (60 m : 0.25 mmID mengandung 5% difenil 95% dimetilpolisilosan), suhu kolom adalah 50 °C. Gas pembawa yang digunakan adalah helium (He). Aliran kolom sebesar 0.85 mL/menit. Suhu sumber ion sebesar 200 °C dan inlet Press adalah 101.0 kPa.
Analisis Data Statistika Pengukuran aktivitas antioksidan sampel dilakukan dengan rancangan percobaan acak lengkap (RAL). Kelompok pertama adalah kontrol negatif (akuades) dengan 3 kali ulangan. Kelompok kedua adalah kontrol positif αtokoferol dengan konsentrasi 200 ppm dan 3 kali ulangan. Kelompok ketiga adalah ekstrak etanol daun murbei dengan konsentrasi 125, 200, 500 dan 1000 ppm dan setiap konsentrasi diulang sebanyak 3 kali.
HASIL Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Simplisia berupa serbuk daun murbei berukuran 35 mesh. Tabel 1 menunjukkan hasil pengukuran kadar air dan rendemen dari simplisia daun murbei. Rata-rata kadar air kurang dari 10%. Ekstraksi simplisia daun murbei menggunakan metode maserasi menggunakan etanol 65%. Hasil ekstraksi berupa pasta berwarna hijau dengan bau menyerupai bau daun murbei segar. Rendemen yang didapatkan sebesar 24.52% dengan standar deviasi 0.095. Tabel 1 Kadar air simplisia dan rendemen ekstrak daun murbei Pengujian Rata-Rata Kadar Air (%) Rendeman Ekstrak (%)
Hasil 7.26 ± 0.765 24.52 ± 0.095
5 Senyawa Fitokimia Ekstrak Daun Murbei Analisis fitokimia dilakukan terhadap ekstrak daun murbei meliputi berbagai uji keberadaan metabolit sekunder seperti alkaloid, tanin, flavonoid, saponin, steroid, dan triterpenoid. Hasil yang tercantum pada Tabel 2 menyatakan bahwa ekstrak etanol daun murbei mengandung flavonoid, tannin, dan steroid. Tabel 2 Hasil uji fitokimia ekstrak daun murbei Uji Alkaloid Flavonoid Tannin Saponin Steroid Triterpenoid Keterangan :
Hasil pengamatan + + + + -
: mengandung senyawa metabolit sekunder : tidak mengandung senyawa metabolit sekunder
Penentuan Waktu Inkubasi Asam Linoleat Nilai absorbansi asam linoleat pada panjang gelombang 234 nm dengan metode diena terkonjugasi ditunjukkan oleh Gambar 1. Nilai absorbansi meningkat dari hari ke-0 sampai hari ke-4. Penurunan nilai absorbansi terjadi pada hari ke-5, namun meningkat di hari ke-6 sebelum menurun kembali di hari ke-7. Waktu inkubasi optimum ditentukan ketika absorbansi mencapai maksimum yaitu dihari ke-4. Pengukuran antioksidan dilakukan dua hari setelah tercapainya absorbansi maksimum yaitu pada hari ke-6. Hal ini berdasarkan asumsi bahwa seluruh diena terkonjugasi telah mengalami dekomposisi membentuk produk akhir peroksidasi lipid yaitu MDA.
Absorbansi (λ=234 nm)
0,08 0,06 0,04 0,02 0 0
1
2
3 4 5 Waktu inkubasi (hari)
6
7
Gambar 1 Absorbansi asam linoleat pada λ= 234 nm Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Murbei Pengukuran aktivitas antioksidan pada berbagai konsentrasi ekstrak dilakukan dengan menggunakan metode TBA. Hasil pengukuran konsentrasi MDA seperti terlihat pada Gambar 2 menunjukkan bahwa kontrol positif memiliki
6
MDA (µM)
konsentrasi MDA terendah. Ekstrak etanol daun murbei pada konsentrasi 125, 200, 500, dan 1000 ppm memiliki nilai MDA yang lebih rendah dari kontrol negatif. Konsentrasi MDA berbanding terbalik dengan nilai inhibisi seperti terlihat pada Gambar 3. Nilai inhibisi menunjukkan % penghambatan pembentukan radikal bebas. Konsentrasi MDA yang semakin kecil menunjukkan kemampuan ekstrak yang lebih baik dalam menghambat peroksidasi lipid. Kontrol positif memiliki nilai inhibisi terbesar mencapai 62.06% dan konsentrasi 1000 ppm memiliki inhibisi terkecil dengan nilai 36.00%. Hal ini berarti penghambatan terbaik berada pada α-tokoferol 200 ppm. Ekstrak etanol daun murbei pada keempat konsentrasi, memiliki penghambatan yang lebih rendah dari α-tokoferol. Ekstrak etanol daun murbei 200 ppm memiliki % inhibisi tertinggi dibandingkan konsentrasi ekstrak etanol lainnya, yaitu sebesar 45.33%. 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
8,11 ± 0,36 c 5,19 ± 0,03 b 4,77 ± 1,45 b 4,53 ± 0,41 b 4,43 ± 0,77 b 3,08 ± 0,16 a
Kontrol Alfa negatif tokoferol (Akuades) 200 ppm
125
200
500
1000
Konsentrasi (ppm)
% Inhibisi
Gambar 2 Konsentrasi Malondialdehida (MDA). Huruf kecil yang berbeda menunjujukkan bahwa secara statistika % inhibisi berbeda nyata pada α=0.05 dan huruf kecil yang sama menunjukkan % inhibisi tidak berbeda nyata pada α=0.05 dengan uji Duncan 70 60 50 40 30 20 10 0
62,06 a 41,21 b
Alfa tokoferol 200 ppm
125
45,33 b
44,19 b
36 b
200
500
1000
Konsentrasi (ppm)
Gambar 3 Persen Inhibisi Ekstrak Etanol Daun Murbei. Huruf kecil yang berbeda menunjukan bahwa secara statistika % inhibisi berbeda nyata pada α = 0.05 dan huruf kecil yang sama menunjukkan % inhibisi tidak berbeda nyata pada α=0.05 dengan uji Duncan
7 Identifikasi Senyawa Biokatif dengan GC-MS Hasil GC-MS menunjukkan bahwa ekstrak etanol 65% daun murbei memiliki 15 senyawa yang terlihat di Tabel 3. Empat senyawa dengan kelimpahan tertinggi adalah eugenol, metil linoleat, asam palmitat dan asam stearat. Tabel 3 Komposisi senyawa ekstrak etanol daun murbei
1 2 3 4 5 6 7 8
Waktu retensi (menit) 2.015 13.850 13.934 14.457 14.544 15.561 17.524 18.400
9
18.550
2.28
10
19.251
6.94
11 12 13 14
19.348 19.567 19.650 20.985
4.84 13.08 8.87 2.68
15
22.074
2.68
Puncak
Kelimpahan (%) 2.94 2.20 34.32 1.32 4.21 1.15 2.75 9.74
Kemungkinan senyawa ethanol eugenol eugenol trans-caryophyllen trans-caryophyllen asam laurat phytol asam palmitat asam nonadecanoat, etil ester metil 11oktadecenoat phytol metil linoleat asam stearat asam hexanedioic asam 1,2 benzenidicarboxylic
PEMBAHASAN Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Daun murbei adalah tanaman herbal yang memiliki berbagai manfaat seperti pakan ulat sutera, antidiabetes dan antioksidan. Saat ini telah banyak diproduksi teh gabungan antara daun murbei dengan daun teh (Camellia cinensis) sebagai minuman kesehatan (Dainy 2009). Banyaknya manfaat daun murbei ini membuka peluang untuk memproduksi daun murbei dalam berbagai sediaan. Kandungan zat aktif daun murbei telah diuji secara fitokimia, yaitu terdiri atas tanin, alkaloid, dan steroid. Penanganan yang buruk terhadap daun murbei akan menurunkan kualitas simplisia sehingga dapat menurunkan pula kandungan senyawa aktif yang terkandung dalam daun murbei. Salah satu parameter yang digunakan dalam penentuan kualitas simplisia adalah kadar air. Kadar air adalah banyaknya air yang terkandung dalam suatu bahan dan dinyatakan dalam persen (%). Kadar air penting untuk ditentukan karena keberadaan air memudahkan pertumbuhan bakteri, kapang dan khamir sehingga dapat mempengaruhi umur simpan simplisia. Kadar air simplisia diperkecil dengan cara pengeringan. Pengeringan membuat simplisia tidak mudah rusak dan dapat disimpan dalam waktu lama karena terhentinya reaksi kimia dalam simplisia.
8 Pengukuran kadar air juga dapat digunakan sebagai faktor koreksi dalam pengukuran rendemen (Ananingsih 2007). Daun murbei yang telah dikeringkan menggunakan oven selama 6 jam pada suhu 60 °C berbentuk kering. Ciri keberhasilan pengeringan pada simplisia daun antara lain bergemerisik, menjadi serpihan bila diremas, tidak berjamur, memiliki bau dan rasa khas menyerupai bahan segarnya (SEAFAST 2012). Pengukuran kadar air terhadap simplisia daun murbei dilakukan sebanyak 3 kali dan menghasilkan rata-rata kadar air sebesar 7.26%. Metode pengeringan yang berbeda dapat menghasilkan kadar air yang berbeda-beda, namun secara umum kurang dari 10%. Kadar air ekstrak yang kurang dari 10% dapat menghindarkan simplisia dari pertumbuhan jamur (Arifin et al. 2006). Suhu 60 °C juga digunakan oleh penelitian (Syahrir et al. 2009) yang menggunakan suhu 60 °C selama 24 jam sehingga menghasilkan kadar air kurang dari 10%. Pengeringan selama 5 jam pada suhu 45 °C dan dibantu pengeringan dengan sinar matahari juga menghasilkan kadar air hingga 7% (Amma 2009). Ekstraksi adalah proses pemisahan campuran beberapa zat menjadi komponen terpisah. Ekstraksi daun murbei dilakukan dengan menggunakan metode maserasi, yaitu dengan cara merendam simplisia dalam pelarut sehingga bahan aktif yang terkandung dalam simplisia dapat terlarut. Pemilihan metode maserasi berdasarkan pada beberapa alasan antara lain maserasi merupakan metode sederhana yang tidak membutuhkan peralatan khusus sehingga dapat dilakukan di semua laboratorium. Hal ini membuat maserasi menjadi metode yang tidak membutuhkan biaya besar. Maserasi tergolong proses ekstraksi dingin, yaitu ekstraksi yang tidak menggunakan pemanasan. Hal ini membuat proses maserasi dapat mempertahankan senyawa-senyawa aktif yang tidak tahan terhadap pemanasan. Penelitian Amma (2009) juga menggunakan proses maserasi dengan pengadukan selama 5 jam dan didiamkan selama 24 jam pada suhu ruang dengan pelarut air dan heksana. Rendemen yang dihasilkan sebesar 16.25%. Nilai ini lebih rendah dibandingkan ekstraksi menggunakan pelarut etanol 65% yang memiliki rata-rata 24.52%. Penggunaan pelarut yang berbeda membuat nilai rendemen yang didapatkan berbeda meskipun berasal dari bahan yang sama. Hal ini disebabkan metabolit sekunder yang terekstrak bergantung dengan jenis pelarut yang digunakan. Kondisi maserasi menggunakan pelarut etanol 65% dan diulang sebanyak 3 kali. Hal ini berdasarkan kondisi optimal untuk ekstraksi daun murbei menurut Jeszka et al. (2014a). Beberapa pelarut telah digunakan dalam berbagai penelitian untuk mengekstraksi senyawa bioaktif dalam daun murbei seperti air, aseton, dan metanol. Pelarut berperan dalam mengekstraksi metabolit sekunder yang terkandung dalam simplisia berdasarkan prinsip like dissoleve like. Metabolit sekunder yang bersifat polar akan terekstrak oleh pelarut polar, sebaliknya senyawa nonpolar akan larut dalam pelarut nonpolar. Pelarut organik seperti aseton dan etanol dapat meningkatkan ekstraksi senyawa bioaktif yang didapatkan sebanyak dua kali lipat (Jeszka et al. 2009). Penelitian Jeszka et al. (2014b) menunjukkan bahwa total flavonoid dan asam fenolik daun murbei lebih tinggi pada ekstrak etanol 65% dibandingkan aseton 65%. Kandungan flavonoid yang tinggi dapat meningkatkan aktivitas antioksidan (Du et al. 2009).
9 Senyawa Fitokimia Ekstrak Daun Murbei Analisis fitokimia terhadap ekstrak daun murbei menunjukkan hasil seperti terlihat pada Tabel 1 yaitu positif terhadap flavonoid, tanin, dan steroid. Keberadaan tanin ditandai dengan timbulnya warna biru tua atau hitam kehijauan. Flavonoid ditandai dengan adanya warna merah, kuning, dan jingga pada lapisan amil alkohol, sedangkan steroid ditandai dengan warna hijau. Metabolit sekunder yang di sekresikan oleh tumbuhan seperti flavonoid, tanin dan steroid memiliki peran yang beragam. Senyawa bioaktif yang terkandung sebagian besar berperan sebagai antioksidan (Yang et al. 2010). Total antioksidan yang terkandung dalam buah dan sayur hampir 80% berasal dari flavonoid. Golongan flavonoid seperti kuersetin telah terbukti memiliki aktivitas antioksidan penghambatan oksidasi lowdensity lipoprotein (LDL) secara in vitro (Sibuea 2004). Penelitian yang dilakukan oleh Agustina et al. (2014) terhadap daun murbei yang diekstrak menggunakan etanol memperlihatkan adanya kandungan kuersetin dan antosianin yang termasuk jenis flavonoid glikosida, serta beta karoten. Beta karoten memiliki kemampuan penting sebagai antioksidan. Kelompok senyawa yang bertanggung jawab dalam aktivitas antioksidan daun murbei diduga berasal dari golongan flavonoid. Analisis fitokimia terhadap buah murbei menunjukkan adanya kandungan alkaloid (Asano et al. 2001), karoten, dan flavonoid (Hassimotto et al. 2007), serta vitamin, asam linoleat, asam palmitat, asam oleat, gula, dan mineral (Ercisli dan Orhan 2007). Bagian buah murbei (Morus alba L) memiliki 13 jenis flavonol glikosida dan kapasitas penangkapan radikal bebas mencapai 86.79% yang diuji menggunakan metode DPPH (Natic et al. 2015). Penelitian terhadap bagian murbei lain yaitu ranting dan kulit akar yang diekstrak dengan etanol memperlihatkan adanya aktivitas antioksidan dan antitirosin yang lebih tinggi pada bagian ranting dibandingkan akar (Chang et al. 2011). Pengujian kandungan fitokimia pada tanaman yang sama dapat memberikan hasil yang berbeda. Pengujian terhadap bagian yang berbeda dalam tanaman yang sama juga memungkinkan terjadinya perbedaan. Hal ini karena kandungan fitokimia dapat dipengaruhi oleh beberapa hal seperti lingkungan tempat tumbuh termasuk perbedaan varietas dan kondisi geografis tempat tumbuh (Kardono 2003). Metode yang digunakan dalam ekstraksi, reagen-reagen, dan kesensitifan alat juga menjadi penentu metabolit sekunder yang dihasilkan. Penggunaan pelarut yang berbeda dalam proses ekstraksi juga menentukan jenis metabolit sekunder yang terekstrak. Pelarut etanol memiliki dua gugus dengan sifat yang berbeda, gugus alkil bersifat nonpolar, dan gugus hidroksil yang bersifat polar (Salim 2006). Perbedaan ini membuat etanol dapat mengekstrak metabolit sekunder yang memiliki kepolaran yang beragam.
Penentuan Waktu Inkubasi Asam Linoleat Penentuan waktu inkubasi optimal asam linoleat dilakukan sebelum analisis potensi antioksidan, menggunakan metode diena terkonjugasi. Metode ini berdasarkan pada tahapan peroksidasi lipid yang terdiri atas tahap inisiasi, propagasi, dan terminasi. Tahap inisiasi memisahkan sebuah atom hidrogen dari
10 grup metilena (-CH2-) Polyunsatureted fatty acid (PUFA) oleh radikal bebas yang akan menghasilkan suatu radikal karbon. Radikal ini akan distabilkan melalui pengaturan ulang ikatan rangkap sehingga membentuk diena terkonjugasi. Tahap ini dimanfaatkan untuk mengetahui waktu oksidasi optimal asam linoleat, yaitu saat terbentuknya diena terkonjugasi (Cornwell dan Morisaki 1984). Pengukuran dilakukan menggunakan spektrofotometer Uv pada panjang gelombang 234 nm karena kemampuan diena terkonjugasi menyerap pada panjang gelombang tersebut. Nilai absorbansi terus meningkat (Gambar 1), karena pada tahap kedua peroksidasi lipid yaitu propagasi yang menghasilkan radikal karbon lain dan reaksi berlangsung terus menerus (Ekawati 2007). Peningkatan nilai absorbansi dari hari ke-0 hingga hari ke-4 menunjukkan bahwa pembentukan diena terkonjugasi telah mencapai nilai maksimal. Penurunanan nilai absorbansi terjadi pada hari ke-5 namun meningkat dihari ke-6 sebelum menurun kembali dihari ke-7. Hal ini menunjukkan menurunnya jumlah diena terkonjugasi dan mulai terdekomposisi membentuk produk akhir peroksidasi lipid yaitu malondialdehida (MDA). Peningkatan kembali absorbansi di hari ke-6 dapat disebabkan adanya pengaruh suhu dan oksigen yang kurang stabil dalam campuran asam linoleat selama inkubasi. Nilai absorbansi hari ke-6 masih lebih rendah dibandingkan absorbansi di hari ke4 sehingga waktu inkubasi optimum ditetapkan selama empat hari. Analisis potensi antioksidan dapat dilakukan dua atau tiga hari setelah tercapainya pembentukkan diena terkonjugasi maksimum yaitu pada hari ke-6. Hal ini berdasarkan asumsi bahwa setelah dua hari dari masa inkubasi optimum, semua diena terkonjugasi mulai terdekomposisi menjadi MDA (Kikuzaki dan Nakatani 1993). Proses pembentukkan diena terkonjugasi hingga mencapai jumlah maksimum dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti panas, cahaya, pH, oksigen, ion logam dan radikal lipid (Amelia 2006). Faktor-faktor tersebut membuat timbulnya perbedaan waktu tercapainya diena terkonjugasi yang maksimum, sehingga masa inkubasi asam linoleat menjadi berbeda-beda. Penentuan waktu inkubasi asam linoleat dengan metode diena terkonjugasi yang dilakukan oleh Ekawati (2007) menunjukkan bahwa absorbansi optimum tercapai pada hari ke-3, sehingga pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan dua hari setelahnya yaitu pada hari ke5. Hasil berbeda berbeda ditunjukkan oleh Falakh (2008) yaitu menghasilkan inkubasi optimum asam linoleat terjadi pada hari ke-6 sehingga pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan pada hari ke-8.
Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Murbei Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan mengukur kemampuan dalam menangkap radikal bebas atau radical scavenger seperti metode DPPH (Aqil et al. 2006), atau melalui aktivitas penghambatan oksidasi senyawa stabil seperti asam lemak dan lipid dengan metode TBA (Kikuzaki dan Nakatani 1993). Metode TBA dapat menunjukkan kemampuan antioksidan dalam melindungi lipid dari oksidasi (peroksidasi lipid) yang biasa terjadi dalam tubuh terutama di membran sel. Pengukuran aktivitas antioksidan menggunakan TBA berdasarkan pada pengukuran konsentrasi malondialdehida (MDA). MDA sebagai hasil proses peroksidasi lipid bereaksi dengan TBA membentuk kompleks MDATBA berwarna merah muda yang diukur menggunakan spektrofotometer Uv-Vis
11 pada panjang gelombang 532 nm. Alasan penggunaan metode TBA untuk menguji aktivitas antioksidan karena TBA bersifat sensitif terhadap peroksida lipid. Metode TBA merupakan metode yang sering digunakan dalam mengukur peroksidasi lipid pada membran sel. Reaksi yang terjadi antara MDA dengan TBA juga menghasilkan produk yang sama dengan reaksi lipid peroksida dan TBA (Yagi 1994). Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan pada hari ke-6, yaitu dua hari setelah inkubasi optimum pada hari ke-4. Hal ini berdasarkan asumsi bahwa diena terkonjugasi yang terbentuk optimum pada hari ke-4 mulai terdekomposisi menjadi MDA (Kikuzaki dan Nakatani 1993). Kurva standar menggunakan 1,1,3,3tetrametoksipropana (TMP). Hasil pengukuran kurva standar menghasilkan regrasi linier yang digunakan dalam pengukuran konsentrasi MDA. Inkubasi asam linoleat yang ditambah akuades sebagai kontrol negatif menghasilkan rata-rata selisih MDA 8.11 µM (Gambar 2). Nilai MDA yang dihasilkan pada kontrol negatif merupakan yang tertinggi. Hal ini disebabkan ketiadaan senyawa antioksidan yang berperan dalam menghambat pembentukan MDA. Ketiadaan senyawa antioksidan baik ekstrak etanol daun murbei maupun α-tokoferol membuat oksidasi terjadi terus menerus terhadap asam linoleat hingga terbentuk jumlah MDA yang tinggi. Proses oksidasi asam linoleat akan dihambat oleh α-tokoferol sebagai kontrol positif dan senyawa antioksidan yang diperkirakan terkandung dalam ekstrak etanol daun murbei. Αlfa tokoferol atau vitamin E dengan konsentrasi 200 ppm digunakan sebagai kontrol positif menghasilkan konsentrasi MDA yang lebih kecil yaitu 3.08 µM dengan inhibisi sebesar 62.06%. Penggunaan α-tokoferol 200 ppm berdasarkan pada batas konsentrasi maksimum yang dapat digunakan dalam pembuatan makanan (Hernani dan Rahardjo 2005). Αlfa tokoferol banyak digunakan dalam berbagai penelitian sebagai pembanding kinerja antioksidan. Hal ini karena peran α-tokoferol telah terbukti sebagai pelindung senyawa lain dan sifatnya yang mudah teroksidasi. Salah satu peran α-tokoferol dalam tubuh antara lain sebagai antioksidan pada membran lipid dengan mencegah terjadinya oksidasi Poly unsaturated fatty acid (PUFA). Penggunaan α-tokoferol sebagai antioksidan dapat menghasilkan inhibisi yang berbeda-beda. Perbedaan ini dapat disebabkan beberapa faktor, antara lain kemurnian dan kualitas α-tokoferol serta metode yang digunakan. Terdapat beberapa metode yang digunakan untuk menentukan waktu inkubasi seperti metode diena terkonjugasi dan tiosianat, keduanya dapat menghasilkan waktu inkubasi yang berbeda. Perbedaan waktu inkubasi ini mengakibatkan perbedaan oksidasi asam linoleat sehingga antioksidan yang digunakan juga menghasilkan reaksi dan inhibisi yang berbeda. Penambahan ekstrak etanol daun murbei dengan konsentrasi 125, 200, 500 dan 1000 ppm menghasilkan konsentrasi MDA dan inhibisi yang beragam. Konsentrasi MDA terendah berada pada ekstrak 200 ppm dengan inhibisi tertinggi mencapai 45.33%. Konsentrasi MDA tertinggi dengan inhibisi terendah justru berada pada ekstrak 1000 ppm. Hal ini dapat disebabkan konsentrasi yang terlalu besar sehingga ekstrak yang seharusnya berperan sebagai antioksidan berubah menjadi prooksidan (Gordon 1990). Konsentrasi MDA ekstrak etanol daun murbei secara keseluruhan lebih tinggi dibandingkan α-tokoferol. Ekstrak etanol 200 ppm memiliki inhibisi yang lebih rendah dibandingkan α-tokoferol pada konsentrasi yang sama, sehingga ekstrak etanol daun murbei tidak lebih baik dari α-tokoferol
12 dalam menghambat oksidasi lipid. Hal ini karena α-tokoferol digunakan dalam bentuk senyawa murni, sedangkan daun murbei berupa ekstrak kasar , selain itu banyak faktor seperti suhu dan oksigen dalam pembentukan MDA yang harus dikendalikan dengan baik (Fitri et al. 2014). Aktivitas antioksidan ekstrak etanol daun murbei dianalis menggunakan uji statistika RAL. Hasil uji statistika menunjukkan tidak ada perbedaan daya hambat yang nyata antar konsentrasi ekstrak etanol daun murbei pada (α= 0.05) tetapi, kontrol positif dan ekstrak etanol daun murbei pada keempat konsentrasi ekstrak menunjukkan adanya perbedaan pada (α= 0.05). Kontrol negatif menunjukkan perbedaan yang nyata pada (α= 0.05) dengan α-tokoferol dan ekstrak etanol daun murbei.
Identifikasi Senyawa Bioaktif dengan GC-MS Potensi antioksidan yang dihasilkan oleh daun murbei berkaitan dengan kandungan fitokimia yang dimilikinya. Kandungan fitokimia yang diuji secara kualitatif menunjukkan keberadaan senyawa flavonoid, tanin dan steroid. Identifikasi menggunakan GC-MS dilakukan untuk mengetahui senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak etanol 65% daun murbei, terutama yang berperan sebagai antioksidan. GC-MS bekerja dengan menggabungkan prinsip kerja Gas Chromatography (GC) dan Mass Spectroscopy (MS). Kromatografi gas berperan dalam memisahkan senyawa-senyawa yang terdapat dalam campuran ekstrak etanol daun murbei. Spektrofotometer akan mendeteksi jenis senyawa yang telah berhasil dipisahkan. Senyawa yang teridentifikasi dalam ekstrak etanol daun murbei tercantum dalam Tabel 3 menunjukkan terdapat 15 jenis senyawa dengan waktu retensi dan kelimpahan berbeda. Kandungan asam lemak dalam ekstrak etanol daun murbei antara lain asam palmitat, etil ester, metil ester, asam stearat dan asam heksadekanoat, berperan dalam menghambat pertumbuhan mikroba (Asghar 2011). Senyawa lain yang terkandung dalam ekstrak murbei adalah trans-caryopphyllene. Senyawa ini termasuk dalam golongan sesquiterpen, yaitu senyawa triterpenoid yang dibangun oleh 3 isoprena. Senyawa trans caryophyllene dan beberapa asam lemak yang terkandung dalam ektrak etanol daun murbei memiliki peran sebagai antifungi (Warsinah 2011). Senyawa dengan kelimpahan tertinggi mencapai 34.32 % adalah eugenol. Eugenol merupakan komponen utama dari minyak cengkeh (Syxygium aromaticum). Kandungan eugenol dalam minyak cengkeh mencapai 70- 96% (Towaha 2012). Kim et al. (2000) menyebutkan bahwa eugenol juga terdapat dalam daun murbei (Morus alba) bersama senyawa lain seperti rutin, morasetin, kuersetin, benzaldehida, dan skopoletin. Struktur eugenol terdiri atas beberapa gugus fungsional seperti alil, metoksi dan fenol. Gugus fenol dapat berperan sebagai antioksidan karena kemampuannya menyumbangkan atom hidrogen untuk menstabilkan radikal bebas (Aini et al. 2007). Penghambatan pembentukan MDA oleh ekstrak etanol 65% pada berbagai konsentrasi diduga karena keberadaan senyawa eugenol sebagai antioksidan. Pengujian antioksidan dengan metode β- karoten juga menunjukkan bahwa eugenol memiliki sifat antioksidan karena dapat menghambat pembentukan peroksida dari
13 asam oleat. Eugenol memiliki beberapa derivat seperti isoeugenol dan vanili. Aktivitas antioksidan isoeugenol lebih tinggi dibandingkan eugenol, sedangkan vanili memiliki aktivitas yang lebih rendah dari eugenol (Aini et al. 2007). Manfaat lain dari eugenol meliputi antimikroba, antioksidan analgesik, antifungal dan lainlain. Penggunaan eugenol sebagai obat kumur dapat menghambat pertumbuhan bakteri streptococcus mutans dan streptococcus viridians yang menjadi penyebab utama plak gigi (Nurdjannah 2004). Gabungan eugenol dan isolat katekin gambir (Uncaria gambier) dari fase etil asetat memiliki aktivitas penghambatan terhadap sel kanker serviks (Zakiah 2011).
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Uji statistika (α= 0.05) menunjukkan bahwa konsentrasi MDA pada kontrol negatif berbeda nyata dengan ekstrak etanol daun murbei. Uji statistika terhadap kontrol positif dan ekstrak etanol daun murbei pada keempat konsentrasi berbeda nyata. Keempat konsentrasi ekstrak etanol daun murbei tidak berbeda nyata pada (α= 0.05). Konsentrasi optimum antioksidan ekstrak etanol daun murbei adalah 200 ppm. Αlfa tokoferol bekerja lebih baik dibandingkan ekstrak etanol daun murbei pada konsentrasi yang sama. Kandungan fitokimia daun murbei meliputi flavonoid, tannin, dan steroid. Identifikasi dengan GC-MS menunjukkan bahwa terdapat senyawa dominan yaitu eugenol, metil linoleat, asam palmitat, asam stearat. Saran Penelitian lebih lanjut dapat dilakukan dengan menguji potensi antioksidan senyawa murni dari ekstrak etanol 65% daun murbei, seperti eugenol. Senyawa aktif lain yang dihasilkan ekstrak etanol 65% daun murbei memiliki potensi antibakteri, sehingga penelitian berikutnya dapat dilakukan untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak etanol 65% daun murbei.
DAFTAR PUSTAKA Agustina L, Mustabi J, Jamilah. 2014. Zat bioaktif dan daya hambat antibakteri daun murbei [catatan penelitian]. Makassar (ID): Universitas Hassanudin. Aini N, Purwono B, Tahir I. 2007. Structure-antioxidant activities relationship analysis of isoeugenol, eugenol, vanilin and their derivates. Indo. J. Chem. 7(1):611-66. Amelia G. 2006. Potensi rumput mutiara (Hedyotis corymbosa (L.) Lam.) sebagai antioksidan alami [Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Amma NR. 2009. Efek hipoglikemik ekstrak daun murbei (Morus multicaulis) terhadap kadar glukosa darah tikus DM [Disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
14 Ananingsih K. 2007. Food Processing and Engineering. Semarang (ID):Teknologi Pengolahan Pangan, Unika Soegijapranata. Aqil F, Ahmad I, Mehmood Z. 2006. Antioxidant and free radical scavenging properties of twelve traditionally used Indian medicinal plants. Turk J Biol. 30:177-183. Arifin H, Anggraini N, Handayani D, Rasyid R. 2006. Standarisasi ekstrak etanol daun Eugenia cumini Merr. Jurnal Sains Teknologi Farmasi. 11(2). Asano N, Yamashita T, Yasuda, K, Ikeda K, Kizu H, Kameda Y. 2001. Polyhydroxylated alkaloids isolated from mulberry trees (Morus alba L.) and silkworms (Bombyx mori L.). J Agric Food Chem. 49:4208–4213. doi/abs/10.1021/jf010567e. Asghar S, Rehman MI, Choudahry, Rahman. 2011. Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis of petroleum ether extract (oil) and bioassays of crude extract of Iris germanica. I J Of Genetics and Molecular Biology. 3(7): 95-100. Chang LW, Juang LJ, Wang BS, Wang MY, Tai HM, Hung WJ, Chen YJ, Huang MH. 2011. Antioxidant and antityrosinase activity of mulberry (Morus alba L.) twigs and root bark. Food Chem Toxic. 49:785-790. doi:10.1016/j.fct.2010.11.045. Cornwell DG, Morisaki N. 1984. Free Radicals in Biology. Lousiana: Academic Pr. Dainy NC. 2009. Teh camellia-murbei sebagai minuman kesehatan [Disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Delouee SA, Urooj A. 2007. Antioxidant properties various solvent extract of mulberry (Morus indica L.) leaves. Food Chemistry. 102:1233-1240. doi:10.1016/j.foodchem.2006.07.013. Du Q, Zheng J, Xu Y. 2008. Composition of anthocyanins in mulberry and their antioxidant activity. Journal of Food Composition and Analysis. 21:390–395. doi:10.1016/j.jfca.2008.02.007. Ekawati RA. 2007. Potensi antioksidasi daun salam (Eugenia polyantha Wight.) pada lingkungan agrobiofisik yang berbeda [Skripsi]. Bogor (ID). Institut Pertanian Bogor. Ercisli S, Orhan E. 2007. Chemical composition of white (Morus alba), red (Morus rubra) and black (Morus nigra) mulberry fruits. Food Chemistry. 103:1380– 1384. doi:10.1016/j.foodchem.2006.10.054. Falakh S. 2008. Aktivitas antioksidasi ekstrak jamur kuping hitam (Auricularia polytricha) [Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Fitri HA, Santoso B, Suhendi A. 2014. Aktivitas penangkapan radikal bebas ekstrak etanol daun ubi ungu (Ipomoea batatas L.) dengan pengeringan oven menggunakan metode DPPH, FTC, dan TBA [catatan penelitian]. Surakarta (ID): Universitas Muhammadiyah Surakarta. Gordon MH. 1990. Food Antioxidant. New York (US): Elseviere Applied Science. Harborne JP. 1987. Metode Fitokimia. Padmawinata K, Soediro I, penerjamah; Niksolihin S, editor. Bandung (ID):ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Methode. Hassimotto NMA, Genovese MI, Lajolo FM. 2007. Identification and characterisation of anthocyanins from wild mulberry (Morus nigra L.) growing in Brazil. Food Science and Technology International.13:17–25.
15 Hernani, Rahardjo M. 2005. Tanaman Berkhasiat Antioksidan. Jakarta (ID): Penebar Swadaya. Jeszka M. Kobus J, Flaczyk E. 2009. Evaluation of antioxidant activity of Morus alba leaf extracts. Bromatologiai Chemia Toksykologiczna. XLII:2791–2796. Jeszka M, Flaczyk E, Gorecka D, Kobus J, Kosmider A. 2014a. Optimization the extraction process of phenolic compounds and antiradical activity of white mulberry leaves by response surface methodology. Food Science Technology Quality.91:15-29. Jeszka M, Flaczyk E, Jeszka J, Krejpcio Z, Krol E, Buchowski MS. 2014b. Mulberry leaf extract intake reduces hyperglycaemia in streptozotocin (STZ)induced diabetic rats fed high-fat diet. Journal of Functional Foods. 8(C):917. doi:10.1016/j.jff.2014.02.018. Kardono LBS. 2003. Kajian kandungan kimia mahkota dewa (Phaleria marcocarpa). Di dalam: Prosiding Pameran Produk Obat Tradisional dan Seminar Sehari Mahkota Dewa; Jakarta, Indonesia. Jakarta (ID): Pusat Penelitian dan Pengembangan Farmasi dan Obat Tradisional. Katsube T, Imawaka N, Kawano Y, Yamazaki Y, Shiwaku K, Yamane Y. 2006. Antioxidant flavonol glycosides in mulberry (Morus alba L.) leaves isolated based on LDL antioxidant activity. Food Chemistry. 97:25-31. Kikuzaki H, Nakatani N. 1993. Antioxidant effect of some ginger constituents. Journal of Food Science. 58(6):1407-1410. doi: 10.1016/j.foodchem.2005.03.019. Kim SY, Gao JJ, Kang HK. 2000. Two flavonoids from the leaves of Morus alba induce differentiation of the human promyeloctic leukimia (HL-60) cell line. Biol Pharm Bull. 23(4):451-455. Kwon HJ, Chung JY, Kim JY, Kwon O. 2011. Comparison of 1-deoxynojirimycin and aqueous mulberry leaf extract with emphasis on postprandial hypoglycemic effects: in vivo and in vitro studies. J Agric Food Chem. 59:3014-3019. Natic MM, Dabic DC, Papetti A, Aksic MM, Ognjanov V, Ljubojevic M, Tesic ZL. 2015. Analysis and characterisation of phytochemicals in mulberry (Morus alba L.) fruits grown in Vojvodina, North Serbia. Food Chemistry. 171:128136. doi: 10.1016/j.foodchem.2014.08.101. Nurdjannah N. 2004. Diversifikasi penggunaan cengkeh. Perspektif. 3(2):61-70. Salim. 2006. Penentuan daya inhibisi ekstrak air dan etanol daging buah mahkota dewa (Phaleria marcocarpa (Scheeff.)Boerl.) terhadap aktivitas enzim tirosin kinase secara in vitro [Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. [SEAFAST] Southeast Asian Food and Agricultural Science and Technology Center. 2012. Cara Produksi Simplisia yang Baik. Bogor (ID): SEAFAST Center. Sibuea P. 2004. Kuersetin senjata pemusnah radikal bebas. Kompas. Rubrik Humaniora. Syahrir S, Wiryawan KG, Parrakasi A, Winugroho Ramdania W. 2009. Daya hambat hidrolisis karbohidrat oleh ekstrak daun murbei. Agripet. 9(2):1-9. Taher A. 2003. Peran fitoestrogen kedelai sebagai antioksidan dalam penanggulan aterosklerosis [Tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Towaha J. 2012. Manfaat eugenol cengkeh pada berbagai industri di Indonesia. Perspektif. 11(2):91-101.
16 Warsinah, Kusumawati E, Sunarto. 2011. Identifikasi senyawa antifungi dari kulit batang kecapi (Sandoricum koetjape) dan aktivitasnya terhadap Candida albicans. Majalah Obat Tradisional. 16(3):165-173. [WHO] World Health Organization. 1998. Quality Control Method for Medicinal Plant Material. Geneva:World Health Organization. Winarsi H. 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Yogyakarta (ID): Kanisius. Yagi K. 1994. Free Radical in Diagnostic Medicine. Newyork (US):Plenum Press. Yang X, Yang L, Zheng H. 2010. Hypolipidemic and antioxidant effects of mulberry (Morus alba L.) fruit in hyperlipidaemia rats. Food Chem Toxic. 48:2374–2379. doi:10.1016/j.fct.2010.05.074. Zakiah K. 2011. Uji efek antiproliferatif campuran senyawa eugenol dan isolat katekin gambir (Uncaria gambier, Roxb) dari fase etil asetat terhadap kultur sel kanker serviks (HeLa cell line) [Skripsi]. Jakarta (ID): Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah.
17
LAMPIRAN
18 Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Preparasi simplisia daun murbei
Analisis kadar air
Uji alkaloid
Ekstraksi daun murbei
Uji tanin Analisis fitokimia ekstrak daun murbei
Uji flavonoid Uji saponin
Analisis dan identifikasi dengan GC-MC
Steroid dan triterpenoid
Penentuan waktu inkubasi asam linoleat dengan metode diena terkonjugasi
Analisis potensi antioksidan dengan metode TBA
Lampiran 2 Kadar air simplisia dan rendemen ekstrak daun murbei Contoh Perhitungan: Massa simplisia : 190 g Massa ekstrak : 43.2060 Kadar air : 7.258 % % rendemen = =
bobot ekstrak Bobot simplisia tanpa air 43.2060
x 100%
x 100% = 24.52%
176.210
Bobot simplisia tanpa air = bobot simplisia - (kadar air x bobot simplisia)
19 Lampiran 3 Kromatogram ekstrak etanol daun murbei
Lampiran 4 Penentuan waktu inkubasi optimum asam linoleat 2 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7, 1 mL air bebas ion, 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%
Inkubasi pada 400C, masukan ke dalam botol berulir
50 µL campuran asam linoleat yang telah diinkubasi, 6 mL etanol 75%
Etanol 75% sebagai blanko
Ukur pada 234 nm
Pengukuran dilakukan setiap hari hingga mencapai serapan maksimum
20 Lampiran 5 Data penentuan waktu inkubasi optimum asam linoleat Hari ke0 1 2 3 4 5 6 7
Absorbansi rata-rata 0.003 ± 0.0005 0.003 ± 0.000 0.006 ± 0.002 0.047 ± 0.010 0.068 ± 0.020 0.040 ± 0.008 0.056 ± 0.006 0.043 ± 0.002
Lampiran 6 Pembuatan kurva standar Larutan TMP 1.5, 3.0, 6.0, 9.0, 12, 15, 18 µM
Setiap konsentrasi diambil 1 mL
Ditambahkan 2 mL TCA 20%, 2 mL TBA 1% dalam asam asetat 50%
Diinkubasi di penangas pada 100 °C, selama 10 menit
Setelah dingin, sentrifus pada 3000 rpm, 15 menit
Dibaca serapan pada panjang gelombang 532 nm
Akuades sebagai blanko dengan perlakuan sama
21 Lampiran 7 Kurva standar TMP 0,7
y = 0,0339x - 0,0149 R² = 0,9968
0,6
Absorbansi
0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 -0,1 0
5
10 Konsentrasi TMP
15
20
22 Lampiran 8 Pengukuran antioksidan dengan metode TBA
1 mL air bebas ion, 2 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7, 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%,
Ekstrak murbei
etanol
daun
Setiap konsentrasi diambil 1 mL 2 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7, 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%,
Botol gelap berulir, diinkubasi pada suhu 40 °C selama waktu inkubasi optimum.
Diambil 1 mL larutan, 2 mL TCA 20%, 2 mL TBA 1% dalam asam asetat 50%.
Diikubasi di penangas air 100 °C, 10 menit
Sentrifus 3000 rpm, 15 menit
Ukur serapan pada 532 nm
Akuades sebagai blanko
1 mL αtokoferol, 2 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7, 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%,
23 Lampiran 9 Data inhibisi uji antioksidan No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Perlakuan (ppm) K.negatif I K.negatif II K.negatif III K.positif I K.positif II K.positif III 125 I 125 II 125 III 200 I 200 II 200 III 500 I 500 II 500 III 1000 I 1000 II 1000III
Rata-Rata [MDA]
Inhibisi (%)
8.11 ± 0.358
-
3.08 ± 0.163
62.06
4.77 ± 1.448
41.21
4.43 ± 0.775
45.33
4.53 ± 0.409
44.19
5.19 ± 0.029
36.00
Lampiran 10 Hasil analisis fitokimia
Uji Alkaloid
Uji Saponin
Uji Tanin
Uji Flavonoid
Uji Steroid/Triterpenoid
24 Lampiran 12 Analisis statistika aktivitas antioksidan ANOVA Source
Type III Sum of Squares
Df
Mean Square
F
Sig.
Corrected Model
42.029a
5
8.406
16.689 16.689
.000
Intercept
453.386
1
42.029 6.044 501.460 48.073
5 12 18 17
900.163 16.689
.000
Perlakuan Error Total Corrected Total
453.386 8.406 .504
.000
DUNCAN Perlakuan
N
Subset 1
Kontrol positif
2
3.07800 3
Ekstrak 200 ppm
3
4.43500
Ekstrak 500 ppm
3
4.52667
Ekstrak 125 ppm
3
4.76933
Ekstrak 1000 ppm
3
5.19167
Kontrol negatif
3
Sig.
3
8.11200
1.000
.249
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means. The error term is Mean Square(Error) = ,504.
1.000
25
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 26 Juni 1993 dari ayah Agus Waluyo dan ibu Sukaesih. Penulis merupakan anak ke lima dari lima bersaudara. Penulis lulus Sekolah Menengah Atas (SMA) Negeri I Leuwiliang tahun 2011 dan pada tahun yang sama lulus seleksi penerimaan mahasiswa baru melalui jalur undangan, serta menjadi penerima beasiswa Bidikmisi dari Dikti. Penulis diterima di mayor Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum Biokimia Hewan. Penulis pernah melakukan Praktek Lapangan (PL) di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), tepatnya di Pusat Penelitian Biologi, Laboratorium Fitokimia, Cibinong selama periode Juli 2014 hingga September 2014 dengan judul Isolasi Metabolit Sekunder Antibakteri dari Jamur Endofit C1BP1 (PDB) yang diperoleh dari Kayu Manis (Cinnamomum burmanii). Kepanitiaan yang diikuti penulis selama perkuliahan antara lain anggota divisi Koodinator Lapangan Open House IPB 2012 dan Panitia Masa Perkenalan Kampus Mahasiswa Baru (MPKMB) angkatan 49. Penulis terdaftar sebagai Senior Resident Asrama Putri TPB IPB pada periode 2012-2013, 2013-2014 dan 2014-2015. Selama menjadi Senior Resident, penulis pernah menjadi Pembina Klub Cinta Lingkungan untuk periode 2012-2013 dan 2013-2014, Pembina Korea Dormitory Club periode 2013-2014, dan Pembina Dormitory Music Club
