aÉ=ëíìÇáÉ=î~å=`aQH=`aORH=êÉÖìä~íçáêÉ=qJÅÉääÉå=áå= é~íáØåíÉå=ãÉí=ãìäíáéäÉ=ëÅäÉêçëÉ
páÖêìå=g^`hj^boq éêçãçíçê=W mêçÑK=ÇêK=máÉíÉê=pqfkfppbk
ÅçJéêçãçíçê=W ÇêK=káÉäë=ebiifkdp
báåÇîÉêÜ~åÇÉäáåÖ=îççêÖÉÇê~ÖÉå=íçí=ÜÉí=ÄÉâçãÉå=î~å=ÇÉ=Öê~~Ç= j~ëíÉê=áå=ÇÉ=ÄáçãÉÇáëÅÜÉ=ïÉíÉåëÅÜ~ééÉå=~ÑëíìÇÉÉêêáÅÜíáåÖ= âäáåáëÅÜÉ=Éå=ãçäÉÅìä~áêÉ=ïÉíÉåëÅÜ~ééÉå
Inhoudsopgave Voorwoord ..................................................................................................................................I Lijst met afkortingen ..................................................................................................................II Lijst met figuren ....................................................................................................................... III Lijst met tabellen ...................................................................................................................... IV Samenvatting............................................................................................................................. V 1. Inleiding ................................................................................................................................. 1 1.1 Multiple Sclerose .......................................................................................................................... 1 1.1.1 De huidige hypothese rond de immunopathogenese van MS.............................................. 1 1.1.2 Het verlies van zelftolerantie............................................................................................... 3 1.2 De natuurlijk voorkomende CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatoire T- cellen (Tregs) ......................... 5 1.2.1 Activatie van Tregs en Treg gemedieerde suppressie mechanismen.................................... 5 1.2.2 Fenotypische kenmerken van de Tregs................................................................................. 7 1.2.3 De ontwikkeling van Tregs................................................................................................... 9 1.3 CD4+ CD25+ regulatoire T-cellen in MS-patiënten ................................................................... 10 1.4 Onderzoeksdoel........................................................................................................................... 11
2. Materiaal en methoden ......................................................................................................... 13 2.1 Gezonde controles en MS-patiënten ........................................................................................... 13 2.2 Celkweek technieken .................................................................................................................. 13 2.2.1 Celisolatie ........................................................................................................................... 13 2.2.2 Functionele suppressie assay (CFSE)................................................................................. 14 2.2.3 Kloneren ............................................................................................................................. 16 2.2.4 Flow cytometrie.................................................................................................................. 17 2.3 Moleculair-biologische technieken ............................................................................................. 18 2.3.1 RNA isolatie en cDNA synthese ........................................................................................ 18
2.3.2 TCR BV gebruik bepaling d.m.v de Lightcycler ........................................................ 19
3. Resultaten ............................................................................................................................. 21 3.1 Fenotypische karakterisering van Tregs in MS patiënten en gezonde controles ........................ 21 3.1.1 Fenotypische vergelijking van CD4+ Foxp3+/- en CD4+ CD25-/int/hi T-cellen van HC ........ 21 3.1.2 Fenotypische vergelijking van Tregs van HC, RR-MS patiënten en SP-MS patiënten..... 22 3.2 Suppressie capaciteit van Tregs ten opzichte van myeline antigen T-cel reactiviteit in HC ...... 24 3.2.1 Depletie van CD25+ regulatoire T-cellen uit PBMC en CD4+ T-cellen ............................. 24 3.2.2 Antigen reactiviteit van CD4+T-cellen uit PBMC en CD25 gedepleteerde PBMC van HC….................................................................................................................................. 26 3.2.3 Antigen reactiviteit van opgezuiverde CD4+ T-cellen en CD25 gedepleteerde CD4+ Tcellen in HC… ................................................................................................................... 28 3.2.4 De myeline reactiviteit van naïve en memory responder cellen in HC .............................. 30 3.2.5 Klonering van MBP en TT CFSElow/high T-cellen ............................................................... 30 3.2.6 Onderdrukking van MBP reactieve T-cel klonen door Tregs............................................ 32 3.3 TCR BV gen analyse van T-cellen via real-time PCR (Lightcycler).......................................... 33
4. Discussie............................................................................................................................... 37 Literatuurlijst............................................................................................................................ 45
II
Voorwoord Graag wil ik van de gelegenheid gebruik maken om een aantal mensen te bedanken die mij hebben ondersteund tijdens mijn laatste belangrijke maandjes van de opleiding Biomedische wetenschappen en mij hebben geholpen in het tot stand brengen van dit eindwerk.
Allereerst zou ik mijn begeleider Koen Venken willen bedanken voor het aanleren van belangrijke labo technieken, het bijstaan in het labo en voor zijn begeleiding bij het maken van dit eindwerk. Ook voor het geven van tips en voor het aanreiken van literaire artikels. Mijn copromotor dr. Niels Hellings, promotor Prof. dr. Piet Stinissen en tweede beoordelaar Prof. Dr Jef Raus zou ik willen bedanken voor het nalezen van mijn thesis en voor de colleges omtrent immunologie tijdens de voorbije 4 jaar van mijn opleiding, welke een sterke invloed hebben gehad op de keuze van mijn stageplaats. Voor technische ondersteuning en specifieke vragen omtrent producten en toestellen kon ik naast mijn begeleider ook steeds terecht bij dr. Jerome Hendriks, Igna Rutten, Christel Bocken, Mariëlle Thewissen, Veerle Somers, Kurt Baeten, Kim Pannemans, Cindy Govaert en Klaartje Somers waarvoor bedankt. Anne Bogaers zou ik willen bedanken voor het afnemen van het bloed maar ook de vrijwilligers die het toestonden om bloed te geven. Ik wil ook de afdeling experimentele hematologie van het Virga-Jesse Ziekenhuis in Hasselt bedanken voor het mogen sorteren van cellen via hun Facs Sorting-toestel.
Ook gaat er een woordje van dank naar mijn ouders en mijn vriend voor hun steun en luisterend oor tijdens deze stageperiode.
Als laatste moet ik nog alle mensen bedanken, die op de een of andere manier een bijdrage aan mijn thesis geleverd hebben, en die ik jammer genoeg vergeten te vermelden ben in dit dankwoord.
Sigrun Jackmaert
I
Lijst met afkortingen 7AAD: 7-Amino-Actinomycin D Ab: antilichamen APC: Antigen presenterende cel BSA: bovine serum albumine CD: cluster differentiation code cDNA: complementair deoxyribonucleïnezuur CF(DA)SE: 5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester CTLA-4: Cytotoxisch T-lymfocyt antigen 4 CZS: Centraal zenuwstelsel dNTP: deoxyribonucleotide triphosphate EAE: experimentele auto-immune encephalomyelitis EDTA: Ethyleendiaminetetra-acetaat FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting FCS: foetaal kalf serum FITC: fluoresceïne isothiocyanaat Foxp3: forkhead box p3 GITR: glucocorticoïd-geïnduceerde tumor necrose factor receptor HC: gezonde controle (healthy contol) MBP: Myelin basic protein MHC: Major Histocompatibility Complex MOG: Myelin oligodendrocyte glycoprotein MS: Multiple Slerose PBMC: perifere bloed mononucleaire cellen PBS: phosphate buffered saline PCR: polymerase chain reaction PE: phytoerythrine PERCP: peridine chlorofyl-A proteïne PP-MS: Primair-progressieve MS RR-MS: Relapsing-remitting MS RNA: ribonucleïnezuur SP-MS: Secundaire-progressieve MS TCR: T-cel receptor TCR BV: variabele deel van de ß-keten van de TCR TGF-ß: Transforming Growth Factor beta TNFR: tumor nectrose factor receptor Treg: CD4+ CD25+ regulatoire T-cellen TSST-1: superantigen toxic shock syndrome toxin-1 TT: tetanus toxoid VLA-4: Very Late Antigen-4
II
Lijst met figuren Figuur 1: Huidige hypothese rond de immunopathogenese van MS ……………………………......2 Figuur 2: Mechanismen voor het behoud van perifere zelf-tolerantie………….……………...….…….4 Figuur 3: CD4+ T-cel isolatie d.m.v de Rossettesep techniek…………………….……..…………….14 Figuur 4: Schematische weergave van de PCR reactie……………………………..……………….....20 Figuur 5: De standaardcurve………………………………………………………..………………….20 Figuur 6: Expressie van relevante merkers op Foxp3+ T-cellen en Foxp3- T-cellen van (H)C, RR-MS en SP-MS patiënten………………………………………………………………………....22 Figuur 7: Expressie van relevante merkers op CD25hi T-cellen, CD25int T-cellen en CD25- T-cellen van HC, RR-MS en SP-MS patiënten…………………………………………………….23 Figuur 8: Depletie van CD25+ regulatoire T-cellen uit PBMC en CD4+ T-cellen via RossetteSep…...25 Figuur 9: De antigenreactiviteit van CFSE gelabelde PBMC …………………………………...……26 Figuur 10:De antigen reactiviteit van CD4+ T-cellen uit antigen gestimuleerde PBMC en CD25 gedepleteerde PBMC……………………………..………………………………………27 Figuur 11: De antigen reactiviteit van opgezuiverde CD4+ T-cellen en CD25 gedepleteerde CD4+ Tcellen. ………………………………...…………………………………………………..29 Figuur 12: De antigen reactiviteit van CD4+ T-cellen en CD4+ CD25- T-cellen van 2 HC………...…29 Figuur 13:De antigen respons van naïve (CD45RA+) en memory (CD45RA-) responder cellen.…….30 Figuur 14: Onderdrukkingscapaciteit van Tregs op MBP reactieve T-celklonen…………….……….33 Figuur 15: TCR BV gen expressie profiel van niet- en TSST gestimuleerde PBMC……………..…..35 Figuur 16: TCR BV gen repertoire van Jurkat cellen gemixed met verschillende proporties cDNA PBMC mix………………………………………………………………………………..36
III
Lijst met tabellen Tabel 1: Overzicht van moleculen geassocieerd met Tregs…………………………………………….9 Tabel 2: PCR-programma ter controle van de cDNA synthese………………………………………..18
Tabel 3: Programma voor het meten van het TCR BV gebruik via de Lightcycler………………..….19 Tabel 4: De klonering van MBP en TT reactieve (CFSElow) en niet-reactieve (CFSEhigh) T-cellen…..31
Tabel 5: Overzicht van de BV primers met hun geoptimaliseerde concentraties……………….…….34
IV
Samenvatting Multiple sclerose (MS) is een chronische auto-immune aandoening van het centrale zenuwstelsel waarin autoreactieve T-cellen zich richten tegen componenten van de myelineschede zoals het ‘myelin basic protein’ (MBP) en ‘myelin oligodendrocyte glycoprotein’ (MOG). Deze myeline reactieve T-cellen circuleren in het perifere bloed van ieder persoon als gevolg van een incomplete negatieve selectie procedure in de thymus. De myeline reactieve T-cellen van MS-patiënten vertonen echter een verhoogde geactiveerde status. Een verstoring in de CD4+ CD25+ regulatoire T-cellen van deze patiënten kan mogelijk bijdragen tot een insufficiënte immunoregulatie van deze autoreactieve T-cellen. In dit onderzoek werd d.m.v flow cytometrie een fenotypische karakterisatie uitgevoerd van Tregs van gezonde controles en MS-patiënten om eventuele verschillen in het expressiepatroon van relevante adhesie-, activatie- en differentiatie merkers te detecteren. Er werden geen afwijkingen in de expressie van activatie merkers en differentiatie merkers opgemerkt. Buiten het verschil in de expressie van VLA-4 (CD49hi) in SP-MS patiënten, werden er t.o.v HC geen verdere significante verschillen gedetecteerd in de expressie van relevante adhesie moleculen in Tregs. In dit onderzoek werd ook de suppressieve capaciteit van Tregs t.o.v myeline reactieve T-cellen bestudeerd in HC. Hiervoor werden CD25 (Tregs) gedepleteerde en niet-gedepleteerde PBMC of CD4+ T-cellen gestimuleerd met de antigenen MBP of MOG. Door het CFSE signaal van de responder cellen op te volgen via flow cytometrie werd informatie bekomen omtrent de antigen reactiviteit in de aan- of afwezigheid van Tregs. De Tregs oefenden een onderdrukkende activiteit uit op de myeline reactieve T-cellen in tegenstelling tot de TT gestimuleerde T-cellen waarbij geen Treg activiteit werd aangetoond. Hierna werden verkregen MBP reactieve T-celklonen in cocultuur gebracht met autologe Tregs in verschillende ratio’s waardoor op directe manier informatie bekomen kon worden over het onderdrukkingseffect van Tregs op myeline reactieve T-cellen. In de bekomen data was er een Treg gemedieerd onderdrukkend effect op de reactieve T-cellen waarneembaar bij een lage antigen geïnduceerde proliferatie. Verder werd een semi-quantitatieve PCR geoptimaliseerd om het BV gebruik van Treg populaties te kunnen bepalen. In de toekomst zouden vervolgens metingen betreffende het TCR BV gebruik van Tregs in HC en MSpatiënten uitgevoerd kunnen worden. In conclusie geeft deze studie aan dat Tregs in MSpatiënten fenotypisch verschillen in de expressie van enkele adhesiemoleculen wat kan bijdragen tot de MS-pathologie. Hiernaast blijken Tregs van HC in staat te zijn om in vitro de proliferatie van myeline reactieve T-cellen te onderdrukken.
V
1. Inleiding 1.1 Multiple Sclerose Multiple Sclerose (MS) is een chronische inflammatoire aandoening van het centrale zenuwstelsel (CZS) gekarakteriseerd door een immunologisch gemedieerde demyelinisatie. Het is de meest voorkomende neurologische aandoening bij jonge volwassenen en heeft een prevalentie van 0,05-0.1% onder de westerse bevolking. MS komt twee keer meer voor bij vrouwen dan bij mannen. Symptomen zoals verzwakking, visuele en sensorische stoornissen en spierverlamming zijn vaak aanwezig. Dit is het gevolg van de verminderde zenuwgeleiding tussen de neuronen door de myeline afbraak. Andere klinische kenmerken zijn verlies in autonome en neurocognitieve functies (1). MS kan worden opgedeeld in 3 klinische vormen: de relapsing-remitting MS (RR-MS), de secundair-progressieve (SP-MS) en de primair-progressieve MS (PP-MS). RR-MS is de meest voorkomende vorm (85%-90%) waarbij exacerbaties (relapse) worden afgewisseld met perioden van herstel (remitting). Ongeveer 1/3 van de RR-MS patiënten evolueert na gemiddeld 10 jaar naar de SP-MS vorm waar perioden van herstel uit blijven of sterk verminderd aanwezig zijn. Tien tot 15% van de patiënten heeft de PP-MS vorm waarbij de ziekte vanaf de eerste neurologische aanval een zeer progressief verloop heeft en er geen herstel meer optreedt (1,2). 1.1.1
De huidige hypothese rond de immunopathogenese van MS
Het achterliggende ziekteproces van MS is momenteel nog niet volledig opgehelderd. Toch zijn al vele aspecten van deze ziekte bekend. Zo zijn er aanwijzigingen dat MS een T-cel gemedieerde aandoening is waarin T-cellen gericht tegen componenten van de myelineschede, zoals het myelin basic protein (MBP) en het myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), een belangrijke rol spelen (1). De myeline reactieve CD4+ T-cellen worden initieel buiten het CZS geactiveerd. De exacte oorzaak van deze activatie is niet gekend. De geactiveerde cellen differentiëren tot cellen met een pro-inflammatoire Th1 fenotype en migreren doorheen de bloedhersenbarrière (BHB) (Fig.1). Expressie van adhesiemoleculen op de BHB en vrijzetting van pro-inflammatoire cytokines door de geactiveerde T-cellen ondersteunen deze migratie. In het CZS kan reactivatie plaatsvinden door locale antigen presenterende cellen (APC) zoals microglia of perivasculaire macrofagen. Als gevolg van de cytokine en chemokine productie zullen andere immuuncellen zoals Bcellen, Natural Killer (NK) cellen, macrofagen en CD8+ T-cellen worden aangetrokken. De
1
immuuncellen zorgen er voor beschadiging van het hersenweefsel door de productie van cytokines, antilichamen en radicalen (Fig.1) (1). Pathologisch wordt MS gekenmerkt door sclerotische plaques in de witte stof van het CZS als gevolg van de demyelinisatie. De oligodendrocyten blijven initieel bewaard, waardoor er nog frequent remyelinisatie optreedt. In een later stadium worden ook deze oligodendrocyten beschadigd waardoor myeline herstel uit blijft, wat kan leiden tot axonale schade. Deze schade is waarschijnlijk de belangrijkste oorzaak van de blijvende neurologische defecten in MS (1).
Figuur 1. Huidige hypothese rond de immunopathogenese van MS. TCR: T-cel receptor; APC: antigen presenterende cel; MHC: Major histocompatibility complex; CNS: central nervous system; TNF: tumor necrose factor; IL: interleukine; IFN: interferon (1).
De gevoeligheid voor MS wordt beïnvloed door zowel genetische als omgevingsfactoren. Zo wordt gedacht dat micro-organismen een belangrijke rol spelen in het ziekteproces. Een hypothese is dat micro-organismen zowel via bystander activation alsook via moleculaire mimicry kunnen bijdragen tot de niet-specifieke activatie van autoreactieve T-cellen. Bystander activation wordt gekenmerkt door de verhoogde productie van cytokines en chemokines tijdens infecties door pathogenen. De pro-inflammatoire omgeving leidt ook tot een verhoogde antigenpresentatie door de sterke MHC opregulatie. Anderzijds kunnen infecties leiden tot weefselschade en vervolgens tot het vrijkomen van autoantigenen. Via
2
moleculaire mimicry kunnen virale epitopen die sterk homoloog zijn met myeline antigenen zorgen voor een kruisactivatie van de myeline reactieve T-cellen (1,2).
Studies met tweelingen en families hebben aangetoond dat individuen genetisch vatbaar kunnen zijn voor de ontwikkeling van MS (1,2). Kandidaatsgenen zijn o.a. de T-cel receptor (TCR) genen en genen welke coderen voor cytokine receptoren, adhesie moleculen en immunoglobulines. De sterkste genetische associatie is gevonden met de ‘Major Histocompatibility Complex’ (MHC) II genen HLA-DR en HLA-DQ, wat overeenkomt met de hypothese dat MS een CD4+ T-cel gemedieerde auto-immune aandoening is. Dit gegeven werd reeds achterhaald via het ‘experimentele auto-immune encephalomyelitis (EAE) diermodel waarbij muizen of ratten die worden geïnjecteerd met myeline fragmenten in adjuvant of met myeline reactieve CD4+ T-cellen een auto-immune aandoening ontwikkelen die zeer sterke gelijkenissen vertoont met MS in mensen (1,2). Voornamelijk de HLADRB1*1501, DRB5*0101 en DQB1*0602 polymorfismen zijn geassocieerd met een verhoogd risico op het ontwikkelen van MS (1,2). Ook zijn er beschermende HLA genen zoals het HLA-A201. De kennis over hoe deze HLA genen juist zorgen voor een verhoogd of beschermend effect op MS, blijft echter beknopt. Een hypothese voor de bijdrage van de HLA-DQ en HLA-DR genen is dat deze HLA moleculen enkel een bepaald repertoire van epitopen kunnen binden en dus kunnen presenteren aan T-cellen. Dit kan leiden tot een minder complete negatieve selectie van myeline reactieve T-cellen in de thymus (2). 1.1.2 Het verlies van zelftolerantie Het immuunsysteem is in staat om vreemde van lichaamseigen antigenen te onderscheiden. Zo beschikt het lichaam over beschermingsmechanismen die ervoor zorgen dat autoreactieve T-cellen worden geëlimineerd of onder controle gehouden worden (3). Allereerst zijn er mechanismen die zorgen voor centrale tolerantie. Tijdens de T-cel ontwikkeling in de thymus heeft er in de cortex een positieve selectie plaats welke instaat voor de eigen MHC restrictie. Enkel T-cellen die een binding aangaan met eigen MHC/antigen complexen met intermediaire en hoge affiniteit worden geselecteerd om uit te groeien (4). Vervolgens ondergaat de T-cel in de medullaire zone van de thymus een negatieve selectie waardoor T-cellen die met zeer hoge affiniteit interageren met lichaamseigen antigen, gepresenteerd door MHC, clonale deletie (apoptose) ondergaan. Toch is de negatieve selectie niet volledig o.a. doordat niet alle autoantigenen voorkomen in de thymus of andere epitopen of isovormen van het antigen gepresenteerd worden. Hierdoor zijn autoreactieve T-cellen aanwezig in het perifere bloed
3
van bijna elk persoon (3). Het lichaam vangt dit probleem op via passieve en actieve mechanismen verantwoordelijk voor perifere tolerantie. Onder de passieve mechanismen worden immunologische ignorance, clonale deletie en inductie van anergie verstaan (Fig.2). D.m.v. immunologische ignorance blijven potentiële auto-antigenen gescheiden van het immuunsysteem waardoor geen autoreactiviteit geïnduceerd kan worden. Dit proces heeft plaats in de hersenen, placenta, testikels en de ogen. Antigen presentatie door nietprofessionele APC leidt tot anergie (functionele inactivatie) van autoreactieve T-cellen door het gebrek aan een costimulatoir signaal. Ook zorgen T-helper 1 (Th1) en T-helper 2 (Th2) cytokines voor onderdrukking van autoreactieve CD4+ T-cellen (3,5).
e
Figuur 2. Mechanismen voor het behoud van perifere zelf-tolerantie. (a) auto-antigenen worden d.m.v een fysische barrière (bv de bloedhersenbarrière in de hersenen) gescheiden van autoreactieve T-cellen waardoor er geen immuunrespons kan optreden. (b) Andere antigenen worden functioneel gescheiden van T-cellen door een immunologische barrière. Locale expressie van cytokines zoals interleukin 10 (IL-10) en transforming growth factor β (TGF-β) of de expressie van het apoptotische Fas ligand (FasL) verhinderen de inductie van een immuun respons. (c) apoptose en opruiming van de autoreactieve T-cel (d) functionele inactivatie (anergie) van de T-cel (e) actieve suppressie van de T-cel door een regulatoire T-cel. (5).
Anderzijds zijn er bepaalde regulatoire T-cellen welke zorgen voor een actieve onderdrukking van autoreactieve T-cellen. Zo zijn er de natuurlijk voorkomende ‘natural killer T-cellen’ (NKT) en de ‘CD4+ CD25+ Foxp3+’ regulatoire T- cellen (Fig.2). Andere cellen staan in voor de suppressie van reeds geactiveerde autoreactieve T-cellen, zoals antigen geïnduceerde antiidiotypische T-cellen (3). Bij defecten op het niveau van deze immuunregulerende processen
4
kan verlies in zelftolerantie optreden wat zou kunnen bijdragen tot de ontwikkeling van MS in genetisch vatbare individuen. 1.2 De natuurlijk voorkomende CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatoire T- cellen (Tregs) Van de totale CD4+ T-cel populatie brengt 5-15% de α-keten van de IL-2 receptor (CD25) constitutief tot expressie (6). Deze CD4+ CD25+ T-cellen dragen in vivo actief bij tot de immuno-suppressie van vele fysiologische en pathologische immuun responsen. Ook zorgen ze niet enkel voor het behoud van tolerantie tegenover lichaamseigen antigen maar spelen ze ook een rol in immunologische reacties tegen lichaamsvreemde en onschadelijke antigenen (bv allergenen) (7). In vitro werd aangetoond dat Tregs de activatie en effector functies van verschillende celpopulaties zoals T-cellen, B-cellen en NK-cellen kunnen onderdrukken. Een andere belangrijk kenmerk van deze celpopulatie in vitro is hun anergisch karakter. D.w.z dat na stimulatie van deze cellen via hun TCR de Tregs niet zullen proliferen (8). Een vermindering in aantal of verlies in functie van deze natuurlijke T-cel populatie kan, volgens diermodel studies, leiden tot de ontwikkeling van auto-immune aandoeningen en allergieën (7). 1.2.1
Activatie van Tregs en Treg gemedieerde suppressie mechanismen
Het activatie proces Vooraleer Tregs hun suppressiecapaciteit kunnen uitoefenen, moeten ze geactiveerd worden via hun TCR. Tregs zijn zeer gevoelig voor antigen stimulatie en vertonen reeds suppressiecapaciteit bij een antigen dosis 10-100 x lager dan nodig voor activatie van conventionele CD4+ CD25- T-cellen (8). De activatie van naïve CD4+ CD25+ T-cellen gebeurt in secondaire lymfoïde organen (9). Deze activatie wordt bekomen via interactie tussen de TCR en het antigen gepresenteerd via MHC II-complex op APC. Het costimulatoire signaal van B7-1 (CD80) of B7-2 (CD86) aanwezig op de APC en CD28 op de T-cel is niet nodig voor hun activatie. Dit werd aangetoond in CD28-deficiënte muizen welke een normale suppressieve activiteit vertoonden (10). Het sterk costimulatoire signaal van CD28 verbreekt echter de anergische en suppressieve status van de Treg (8). CD28 speelt eerder een rol in de ontwikkeling van CD4+ CD25+ Foxp3+ T-cellen in de thymus en hun overleving in de periferie aangezien CD28-deficiënte muizen een verlaagd aantal Tregs vertonen (6,11).
Het cytokine interleukine-2 (IL-2) verbreekt net als CD28 het anergische en suppressieve karakter van de Tregs. Dit werd in vitro aangetoond na administratie van IL-2 aan CD4+ 5
CD25+ T-cellen. Na het verwijderen van IL-2 vertoonden de cellen terug hun anergische en suppressieve karakter (8). Het cytotoxisch T-lymfocyt antigen 4 molecule (CTLA-4) kan een rol spelen in het activatieproces. Het interageert net als CD28 met CD80 op APC. CTLA-4 leidt tot een activerend signaal naar de Tregs toe (10). CTLA-4 op Tregs zorgt ook voor de onderdrukking van de T-cel proliferatie. Het veroorzaakt een transductie van een negatief signaal naar geactiveerde T-cellen (12). Hoe de balans tussen CTLA-4 en CD28 signalisatie op Tregs wordt gereguleerd, moet nog verder worden onderzocht. De glucocorticoid-geïnduceerde TNF receptor (GITR) op het celmembraan van CD4+ CD25+ Tregs beïnvloedt de functie van deze cellen. Administratie van het agonistische monoclonale antilichaam tegen deze receptor, tijdens de TCR stimulatie, leidt tot de ontwikkeling van autoimmune aandoeningen in normale muizen, door een gebrek aan CD4+ CD25+ Treg gemedieerde suppressie (13). Dit geeft aan dat signalisatie via GITR, in tegenstelling tot CTLA-4, zorgt voor verminderde suppressiecapaciteit van CD4+ CD25+ Tregs. Administratie van een GITR blokkerend antilichaam, leidt echter niet tot neutralisatie van de Treg capaciteit (13). Er zijn echter recente data die hebben aantoond dat ligatie van GITR op autoreactieve Tcellen, en niet Tregs, verantwoordelijk zouden zijn voor de verminderde suppressie (14). Verder onderzoek is noodzakelijk om de exacte rol van GITR op Tregs te achterhalen. Natuurlijke CD4+ CD25+ Tregs brengen ook leden van de Toll-like receptor (TLR) familie tot expressie zoals TLR2 en TLR4 (15,16). In vitro stimulatie van deze cellen via TLR4 met een hoge concentratie lipopolysaccharide (LPS) stimuleert de celproliferatie, verlengt de overlevingsduur en versterkt de in vitro suppressiecapaciteit. Dit kan ook zonder antigen presentatie door APC gebeuren (16). TLRs verhogen de suppressieve activiteit mogelijk als preventie van locale of systemische immunopathologie (bv septische shock).
Suppressie mechanismen Het suppressie mechanisme van de Tregs is nog niet volledig achterhaald. Wel zijn er verschillende hypothesen. Scheiding van Tregs en responder cellen in een cocultuur experiment via een semi-permeabel membraan toonde aan dat CD4+ CD25+ T-cel suppressie verloopt via een cel-contact afhankelijk mechanisme (17). Andere experimenten wijzen op de rol voor immunosuppressieve cytokines. Zo werd in muizenstudies aangetoond dat administratie van een monoklonaal blokkerend antilichaam gericht tegen de interleukine 10
6
(IL-10) receptor de suppressiecapaciteit van Tregs neutraliseert (18). Dit antilichaam had echter in vitro geen effect op CD4+ CD25+ T-cel gemedieerde suppressie (17). Ook over de rol van Transforming Growth Factor beta (TGF-ß) in het suppressie mechanisme zijn er tegenstrijdigheden. Administratie van anti-TGF-ß antilichamen in muizen, geeft aan dat TGFß nodig is voor een efficiënte suppressie van responder T-cellen (19). CD4+ CD25+ Tregs van TGF-ß1 deficiënte muizen daarentegen waren in staat CD25- T-cellen te onderdrukken in vitro (20). Andere data suggeren dat TGF-ß niet noodzakelijk fungeert als gesecreteerd cytokine maar dat het ook aanwezig is op het celmembraan van geactiveerde CD25+ CD4+ Tregs wat verantwoordelijk zou zijn voor de cel-contact afhankelijke suppressie (21). Tregs zouden eveneens de APC functie kunnen wijzigen waardoor de APC niet meer in staat zijn om effector T-cellen te activeren. Bij dit indirecte suppressie mechanisme wordt het expressie level van CD80 of CD86 op dendritische cellen (DCs) onderdrukt (22). Andere studies konden het effect van Tregs op APC echter niet bevestigen (23). Ook het CTLA-4 molecule op Tregs speelt een mogelijke rol in het onderdrukken van responder cellen door de transductie van een negatief signaal naar geactiveerde T-cellen waardoor de proliferatie en cytokine productie wordt afgeremd (12). Mogelijk vervullen CD4+ CD25+ Tregs hun suppressie via een combinatie van bovenvernoemde mechanismen welk afhankelijk is van de immunologische context zoals de aan- of afwezigheid van pro-inflammatoire cytokines. Een andere hypothese is dat binnen de CD4+ CD25+ T-cel populatie verschillende regulatoire Tcellen vertegenwoordigd zijn met elk hun eigen mechanisme van suppressie.
1.2.2 Fenotypische kenmerken van de Tregs CD25 Het extracellullaire CD25 molecule komt constitutief tot expressie op de Tregs en vormt samen met de ß en γ keten de hoge affiniteitsreceptor voor IL-2 (24). Binding van IL-2 aan deze receptor zorgt voor het behoud van homeostase van CD25+ Tregs in de thymus en periferie (8). Het CD25 molecule wordt momenteel gebruikt als merker voor de isolatie van Tregs. Echter is CD25 geen specifieke merker aangezien deze ook wordt geïnduceerd na activatie van conventionele CD25- T-cellen. Van de humane CD4+ T-cellen brengt gemiddeld 30% CD25 tot expressie. De meerderheid van deze cellen brengt CD25 tot expressie met een intermediaire intensiteit (CD25int) (24). Enkel 1 tot 3% van de CD4+ T-cellen hebben een hoge CD25 intensiteit (CD25high). De CD4+ CD25high T-celpopulatie vertoont de sterkste
7
suppressiecapaciteit maar een gedeelte van de CD4+ CD25int T-cellen die Foxp3 tot expressie brengen, zouden ook suppressiecapaciteit vertonen (25,26). Foxp3 Foxp3 speelt een centrale rol in de ontwikkeling en functionaliteit van Tregs en de expressie is sterk gecorreleerd met CD4+ CD25+ T-cellen (27). Er werd echter ook een lage expressie van Foxp3 op een klein percentage van de humane CD4+ CD25- T-cellen gedetecteerd welke ook suppressie capaciteit bezitten (28). Foxp3 behoort tot de ‘forkhead/winged-helix familie’ van transcriptie factoren en bestaat uit een ‘C-terminal forkhead’ domein, een C2H2 zink vinger en een leucine zipper motief. Deze transcriptie factor richt zich tegen NF-AT/AP-1 plaatsen van promotors van verschillende cytokine genen. Hierdoor wordt o.a. de transcriptie van het cytokine interleukine-2 (IL-2) geïnhibeerd, wat een mogelijke verklaring kan zijn voor het anergische karakter van Tregs (29). Dat Foxp3 belangrijk is voor het suppressieve karakter van de Tregs werd o.a. aangetoond in de Scurfy muis. Deze muis heeft een spontane X-linked recessieve mutatie in het Foxp3 gen. Een 2 basenpaar frameshift insertie zorgt voor verlies van het ‘forkhead domein’ en van het localisatie signaal naar de kern. Dit leidt tot een verlies in de functionaliteit. Hierdoor krijgen de dieren een lymfoproliferatieve aandoening met een vroege dood als gevolg (29). Een mutatie in het humane Foxp3 gen leidt tot het ‘immune dysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome’ (IPEX). Deze aandoening die overeenkomsten vertoont met ‘Scurfy’ in muizen, wordt gekenmerkt door het ontstaan van auto-immune aandoeningen en allergieën op zeer jonge leeftijd (30). In tegenstelling tot muizen kan de TCR activatie van humane CD4+ CD25- T-cellen wel leiden tot een opregulatie van Foxp3 (31). Foxp3 is de meest relevante merker voor de isolatie en karakterisatie van de CD4+ CD25+ regulatoire T-cellen, maar is voor functioneel onderzoek beperkt door zijn intracellullaire ligging. Andere merkers Andere extracellullaire merkers geassocieerd met Tregs zijn GITR (13), CTLA-4 (CD152) (10) en TLR4 (16). Deze merkers spelen een belangrijke rol in het activatie proces van de regulatoire T-cel (zie § 1.2.1). Thans is geen van deze merkers specifiek voor de CD4+ CD25+ FOXP3+ T-cel aangezien deze ook worden opgereguleerd tijdens activatie van de conventionele T-cellen. Momenteel wordt er nog steeds onderzoek uitgevoerd naar de identificatie van moleculen die specifiek zijn voor Tregs of betrokken zijn in het suppressie
8
mechanisme. Een overzicht van enkele recent geïdentificeerde moleculen die een associatie hebben met Tregs worden weergegeven in Tabel 1.
Tabel 1. Overzicht van moleculen geassocieerd met Tregs.
Merker
Beschrijving/functie
Associatie met Tregs
Referentie
CTLA-4
Glycoproteïne
Constitutief aanwezig op Tregs (IC)
(10)
(CD152) GITR
Invloed op activatie/suppressie TNFR(SF18)
Expressie op Tregs
(13)
Invloed op suppressie capaciteit ↓ LAG-3
CD4 gerelateerd MHC-
Expressie op Tregs na activatie
(CD223)
klasseII bindingsmolecule
Rol in suppressie mechanisme
CD44
Hyaluronzuurreceptor/
Sterke upregulatie van CD44act door
Celadhesie en migratie
geactiveerde Tregs
Homingreceptor voor migratie
Expressie op Tregs
(34)
Expressie op Tregs
(35)
CD62L
(32)
(33)
naar lymfeknopen CD27
TNFR(SF7)
Onderscheid geactiveerde T-cellen van Tregs in inflammatoire weefsels CTLA-4: Cytotoxisch T-lymfocyt antigen 4; GITR: glucocorticoid-geïnduceerde TNF receptor; CD: cluster differentiation code; CD44act: actieve vorm van CD44; TNFR: Tumor necrose factor receptor; LAG-3: Lymfocyte activation gene-3; IC: Intracellulair.
1.2.3 De ontwikkeling van Tregs De CD4+ CD25+ Foxp3+ T-cellen ontwikkeling heeft, zoals voor andere CD4+ T-cellen, plaats in de thymus. De regulatoire T-cellen groeien er uit als een aparte en mature T-cel subpopulatie. Voor de ontwikkeling van deze T-cel populatie is een hoge interactie tussen de TCR en het MHC II vereist. Het MHC molecule, geladen met lichaamseigen antigen, wordt geëxpresseerd door thymische stromale cellen aanwezig in de thymus (36). Sinds thymische CD4+ CD25+ Foxp3+ T-cellen zijn geïdentificeerd tijdens het single positief (SP)-stadium in de thymus, is er een hypothese dat de Treg ontwikkeling gebeurt tijdens de negatieve selectie. Dit werd getest in een studie waarin influenza-virus haemagglutinine (HA) receptor TCR-transgene muizen werden gekruist met transgene muizen welke het antigen tot expressie brachten. Het resultaat was een sterke stijging in het percentage CD25+ Tregs in de thymus en de lymfeknopen (37). Een lage affiniteit voor het peptide ging niet gepaard met de
9
ontwikkeling van CD4+ CD25+ Foxp3+ T-cellen. De conclusie van deze studie was dat CD4+ CD25+ Foxp3+ T-cellen worden geselecteerd via een hoge affiniteits TCR interactie met het target antigen gepresenteerd door stromale cellen (37). Andere studies konden aantonen dat de CD4+ CD25+ Foxp3+ T-cellijn zich reeds ontwikkelt in de thymische cortex (38). Aanvullende studies zijn echter nodig om het exacte ontwikkelingsmechanisme van Tregs in de thymus te achterhalen. CD4+ CD25+ Foxp3+ T-cellen kunnen in vitro ook geïnduceerd worden vanuit CD4+ CD25- T-cellen. Dit gebeurt via antigen presentatie door ‘tolerogene’ dendritische cellen. Het is nog niet geweten of deze Tregs ontstaan vanuit naïve T-cellen of vanuit een CD4+ CD25- Foxp3+ T cel populatie. Verdere studies moeten uitwijzen of deze geïnduceerde Tregs fenotypisch en functioneel gelijkaardig zijn aan de natuurlijke CD4+ CD25+ Tregs (39). Dit kan erop wijzen dat de Foxp3+ Tregs ook kunnen ontwikkelen in de periferie.
Studies met muizen hebben aangetoond dat het TCR BV (variabele deel van de ß-keten van de TCR) gebruik in CD4+ CD25+ Tregs even divers is als in CD4+ CD25- T-cellen (8). Ook humane CD4+ CD25+ Tregs uit perifeer bloed van HC vertoonden een even divers TCR BV repertoire in vergelijking met dat van de CD4+ CD25- tegenhangers. Dit kan erop wijzen dat hetzelfde breed repertoire antigenen, aanwezig tijdens de thymusontwikkeling, instaat voor de ontwikkeling van CD4+ CD25+ T-cellen als van CD4+ CD25- T-cellen (40,41). Het toont eveneens aan dat Tregs geen recent geactiveerde T-cel populatie is dat in contact komt met een beperkt repertoire antigenen. 1.3 CD4+ CD25+ regulatoire T-cellen in MS-patiënten Myeline reactieve T-cellen circuleren aan dezelfde frequentie in het perifere bloed van gezonde individuen als bij MS-patiënten. De myeline reactieve T-cellen in MS-patiënten hebben echter een verhoogde activatie status (42). Een vermindering in het aantal Tregs of verlies van de suppressie functie kan mogelijk bijdragen tot een insufficiënte immunoregulatie in deze patiënten (25). Er werden reeds enkele studies uitgevoerd naar de rol van Tregs in het MS ziekteproces. Er is geen verschil in frequentie merkbaar tussen de CD4+ CD25+ regulatoire T-cellen van HC en MS-patiënten. Dit werd o.a. in vitro aangetoond door analyse van de mean fluorescent intensity van CD25 via ‘fluorescent activated cell sorting’ (FACS). Hierbij werd geen verschil waargenomen in CD4+ CD25high T-cel frequentie tussen RR-MS patiënten, SP-MS patiënten en HC (25,43). Evenals werden er geen fenotypische verschillen tussen de Tregs van de RR-MS patiënten en SP-MS patiënten waargenomen (25).
10
Verder werd de suppressiecapaciteit van de CD25+ regulatoire T-cellen in MS-patiënten vergeleken met deze in HC door deze cellen in verschillende ratio’s in cocultuur te brengen met autologe CD4+ CD25- T-cellen. De cellen werden polyclonaal gestimuleerd d.m.v. antiCD3 Ab. Hieruit kon besloten worden dat CD25+ Tregs van RR-MS patiënten een verminderde suppressieve functionaliteit vertonen (25,43). SP-MS patiënten daarentegen hadden een normale Treg functionaliteit (25). Via in vitro cross-over experimenten werd aangetoond dat de verminderde suppressie te wijten is aan een defect in de CD4+ CD25high Tcellen en niet aan een verworven resistentie van de responder T-cellen (25,43). CD4+ CD25+ T-cellen van RR-MS patiënten hebben een verlaagde Foxp3 mRNA expressie in tegenstelling tot SP-MS patiënten. Deze resultaten geven aan dat een verminderde Treg functionaliteit gerelateerd kan zijn aan de initiële fase in het MS-proces (25,44). Het verminderd Foxp3 niveau heeft enkel betrekking op de CD4+ CD25hi populatie en is niet gerelateerd met de CD4+ CD25int T-cellen van de RR-MS patiënten (25). Verder onderzoek moet achterhalen of de verminderde Foxp3 expressie in RR-MS patiënten wijst op een verminderd aantal Foxp3+ T-cellen of op minder Foxp3 expressie op celniveau. Verdere studies zijn nodig om meer inzicht te krijgen in de verstoorde CD4+ CD25+ Foxp3+ T-cel functie in MS-patiënten. 1.4 Doel van het onderzoek Tijdens deze stage zullen Tregs van MS-patiënten verder onderzocht worden door analyse van hun fenotype en suppressie capaciteit. D.m.v fenotypische karakterisatie wordt er gekeken of het expressie patroon van adhesiemoleculen op Tregs van MS-patiënten verschilt met deze van HC. Dit kan een idee geven over de migratie capaciteit van Tregs in MS-patiënten. In een recent onderzoek werd aangetoond dat Tregs van RR-MS patiënten verminderde suppressie capaciteit vertoonde t.o.v polyclonaal gestimuleerde T-cellen (25). Om te achterhalen of Tregs van MS-patiënten een verminderde suppressie capaciteit vertonen naar MS relevant antigenen zoals MBP en MOG wordt er op een indirecte manier gekeken naar de Treg suppressieve capaciteit t.o.v. myeline reactieve T-cellen. CD4+ T-cellen worden geïsoleerd uit het perifere bloed van zowel HC als MS-patiënten. Deze CD4+ T-cellen worden gescheiden in CD4+CD25+ regulatoire T-cellen en CD4+CD25- T-cellen d.m.v FACS Sorting of via immunomagnetische beads. Voor HC en MS-patiënten wordt er een vergelijking gemaakt tussen de antigen reactiviteit van CD4+ T-cellen (met Tregs) en de Treg gedepleteerde CD4+CD25- T-cellen. Hiervoor worden CFSE gelabelde cellen in kweek gebracht met MBP, MOG of “tetanus toxoid” (TT) (controle antigen) gepulste en bestraalde perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC). De proliferatie van de antigen reactieve T-cellen, uitgedrukt
11
door het percentage CFSELow cellen, wordt gemeten d.m.v. flow cytometrie. Indien het mogelijk is, wordt er op directe manier gekeken naar de suppressieve eigenschappen van de Tregs t.o.v. myeline reactieve T-cellen. Hiervoor worden vanuit de sterk antigen geprolifereerde CFSELow T-cellen, MBP of MOG reactieve T-cellijnen geïsoleerd d.m.v FACS Sorting waaruit vervolgens MBP en MOG reactieve T-celklonen worden aangemaakt. De bekomen T-celklonen worden in cocultuur gebracht met toenemende hoeveelheden Tregs van dezelfde donor. Ook hier wordt er via flow cytometrie (CFSE) gekeken naar de proliferatieve capaciteit van de myeline reactieve T-cel klonen in aan- of afwezigheid van Tregs.
Naast de functionele analyse van Tregs wordt het TCR BV gen gebruik bepaald om eventuele verstoringen in de ontwikkeling van Tregs in de thymus of periferie te detecteren bij MSpatiënten. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van specifieke primers gericht tegen de BV families. De BV PCR reactie wordt allereerst geoptimaliseerd voordat het V gen gebruik van CD4+ CD25+ T-cellen van HC en MS-patiënten vergeleken zal worden. Indien bepaalde BV families overgepresenteerd zijn kan dit wijzen op een verstoord BV gen gebruik. De klonale samenstelling van eventueel overgerepresenteerde BV families wordt onderzocht d.m.v. CDR3 spectratyping.
Dit onderzoek kan bijdragen tot het achterhalen van een eventueel verstoorde Treg functionaliteit in MS, wat op lange termijn kan bijdragen tot nieuwe therapeutische mogelijkheden voor MS-patiënten.
12
2. Materiaal en methoden
2.1 Gezonde controles en MS-patiënten Perifeer bloed en ingevroren PBMC stalen werden bekomen van 7 gezonde controles, 3 RRMS patiënten en 3 SP-MS patiënten. De gezonde controles hadden een gemiddelde leeftijd van 35±18 jaar en bestonden uit 3 mannen en 4 vrouwen. De RR-MS patiënten waren allemaal van het vrouwelijke geslacht en hadden een gemiddelde leeftijd van 39±14 jaar. In de SP-MS groep zaten zowel mannen als vrouwen met een gemiddelde leeftijd van 59±3 jaar. Zowel de RR-MS patiënten als SP-MS patiënten hadden geen behandeling ondergaan. 2.2 Celkweek technieken 2.2.1 Celisolatie Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) werden geïsoleerd via Ficoll dichtheidsgradiënt centrifugatie (Histopaque®-1077, Sigma Aldrich, St. Louis, USA). Hiervoor werd het bloed verdund met RPMI 1640 (Invitrogen, Merelbeke, België) en aangebracht op Ficoll. Na centrifugatie werd de PBMC laag geïsoleerd. De PBMC ondergingen hierna 3 wasstappen met een daling in centrifugatie snelheid om overgebleven rode bloedcellen (RBC) en bloedplaatjes (BP) te verwijderen. Voor CD25+ T-cel depletie werd gebruik gemaakt van antiCD25 Ab gekoppeld aan magnetische beads (EasysepTM human CD25+ selection, Stemcell Technologies, Frankrijk). De PBMC werden hiervoor geresuspendeerd in PBS (Cambrex Bio, Verviers, België) met 1 mM EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) en 2% foetal kalf serum (FCS, Hyclone Europe, Erembodegem, België) aan 1.108 cellen/ml. Er werd 150 µl/ml celsuspensie anti-CD25 antilichamen (AL) en 75 µl/ml SA (Special Application) magnetische nanopartikels toegevoegd met een incubatietijd van respectivelijk 15 en 10 minuten. Doordat CD25+ cellen werden tegengehouden in het magnetische veld van de easysep magneet konden CD25 gedepleteerde PBMC geïsoleerd worden. Voor de CD4+ T-cel isolatie werd, voorafgaand aan de Ficoll scheiding, het bloed gedurende 20 minuten op kamertemperatuur geïncubeerd met Rosette human CD4+ T cell enrichment Cocktail (25 µl/ml bloed) (StemCell Technologies, Frankrijk) op kamertemperatuur. Deze cockail bevat bidirectionele monoklonale antilichamen gericht tegen oppervlakte merkers van ongewenste bloedcellen (CD8, CD16, CD36 en CD56) en tegen glycophorine A op RBC (Fig.3). Het verdunde bloed werd aangebracht op Ficoll en na centrifugatie werden de CD4+ T-cellen geïsoleerd en
13
gewassen. Via FACS-sorting gebruik makend van FACSariaTM (BD, Erembodegem, België) werd uit de CD4+ T-celpopulatie, CD4+ CD25- T-cellen, CD4+ CD25+ T-cellen, CD4+ CD25hi T-cellen, CD4+ CD25- CD45RA+ T-cellen en CD4+ CD25- CD45RA- T-cellen geïsoleerd.
Figuur 3. CD4+ T-cel isolatie d.m.v de Rossettesep techniek. Rosette van een ongewenste cel (B-cel, CD8+ Tcel,..) en RBC gevormd door Rosettesep Tetramere antilichaam complexen (Stemcell Technologies).
Hiervoor werden de CD4+ T-cellen geresuspendeerd in PBS [1 mM EDTA, 2% FCS] aan 5x107 cellen/ml en geïncubeerd met anti-CD4-PERCP, anti-CD25-PE en anti-CD45RA-FITC Ab (BD, Erembodegem, België) gedurende 30 min op 4°C aan een concentratie van 12µl/10.106cellen. De CD4+ T-cellen werden vervolgens geresuspendeerd aan 30.106 cellen/ml in kweekmedium (KM; RPMI 1640, 1% NaPyruvaat, 1% niet-essentiële aminozuren, 10% FCS). De FACS-gesorte cellen werden opgevangen in 4% ‘bovine serum albumine’ (BSA) (US Biological, Zoersel-Halle, België) / PBS gecoate FACStubes, met 20% FCS/RPMI (0,5-1 ml/tube). Ook werd er voor CD25 depletie uit CD4+ T-cellen gebruik gemaakt van het anti-CD25 magnetische beads selectie systeem.
2.2.2 Functionele suppressie assay (CFSE) Carboxy fluoresceïne succinimidyl ester (CFSE) is een molecule opgebouwd uit twee acetaat groepen en een functionele succinimidyl ester groep. In deze vorm is CFSE membraan permeabel en niet fluorescerend. Intracellulair worden de acetaat groepen verwijderd door esterasen waardoor het molecule een niet-permeabele en een fluorescerende eigenschap krijgt. De fluorescerende intensiteit van de CFSE gelabelde cel halveert bij elke celdeling, wat kan worden opgevolgd via flow cytometrie. Zo wordt informatie omtrent de cel proliferatie als respons op antigen stimulatie bekomen (45).
14
PBMC versus CD25 gedepleteerde PBMC PBMC en CD25 gedepleteerde PBMC werden gelabeld met 1µM CFSE (Invitrogen, Merelbeke, België). Hiervoor werden de cellen geresuspendeerd in PBS / 0,1 % BSA aan 20.106 cellen/ml. Hierna werd een gelijk volume 2µM CFSE toegevoegd. Na 7 minuten incubatietijd op 37°C werd de overmaat CFSE weggewassen en werden de cellen geresuspendeerd in KM aan 1,5x106 cellen/ml. De CFSE gelabelde PBMC en CD25 gedepleteerde PBMC werden aangebracht op een 24-well vlakke bodem plaat (Greiner bioone, Wemmel, België). De CD25 gedepleteerde en niet gedepleteerde PBMCs werden in cocultuur gebracht met de myeline antigenen (Ag) MBP (40 µg/ml) en MOG (10 µ/ml, peptiden 1-22, 34-56, 64-86 en 74-96), het controle antigen Tetanus Toxoid (TT) (2,5 LF/ml) en het superantigen toxic shock syndrome toxin-1 (TSST) (0,1 µg/µl). Voor analyse van de antigenreactiviteit van de 2 celpopulaties werd via flow cytometrie (FACSCalibur flow cytometer, BD, Erembodegem, België) na 5 dagen in kweek het percentage CFSElow (Ag) cellen berekend van elke opzet. Er werd voor 5 dagen gekeken naar antigenreactiviteit van de CD4+ T-cellen en de CD8+ T-cellen. Hiervoor werden de cellen gelabeld met anti-CD4-PE of anti-CD8-PE en 7-Amino-Actinomycin D (7AAD) (BD, Erembodegem, België). Voor correctie van de achtergrond proliferatie werden de celpopulaties ook opgezet zonder antigen (ZA). Het percentage CFSElow (ZA) cellen werd afgetrokken van het percentage CFSElow (Ag) cellen wat gedefinieerd wordt als de prolifererende fractie (∆PF). Ook kon de stimulatie index (SI) worden berekend waarbij de ratio van het percentage CFSElow (Ag) en het percentage CFSElow (ZA) berekend wordt. Er was een positieve antigen respons van de cellen wanneer de ∆PF ≥1% of de SI ≥3.
CD4+ T-cellen versus CD4+ CD25- (CD45RA+/-) T-cellen De CD4+ T-cellen, CD4+ CD25- T-cellen, CD4+ CD25- CD45RA+ T-cellen en CD4+ CD25CD45RA- T-cellen werden met CFSE gelabeld zoals hierboven beschreven. Na de labeling werden de cellen geresuspendeerd aan 6x105 cellen/ml. PBMC (feeders) werden voor 3 uur gepulst met MBP (100 µg/ml), MOG (30 µg/ml, peptiden AZ 1-22, 34-56, 64-86 en 74-96) en TT (20 LF/ ml) of enkel in KM. De PBMC fracties werden hierna voor 30 min bestraald (6620 RAD) waarna ze werden geresuspendeerd aan 750.000 c/ml. De responder cellen (6x105) werden aangebracht op een 24-well vlakke bodem plaat en in kweek gebracht met de MBP, MOG of TT gepulste en bestraalde PBMC (7,5x105). Ook werd een conditie met de ongepulste fractie opgezet (ZA). Na 7 dagen werd via flow cytometrie gekeken naar de
15
antigen reactiviteit van de CD4+ T-cellen (% CFSElow) door labeling met anti-CD4-PE en 7AAD. Correctie voor de achtergrond proliferatie en berekening van de positieve antigen respons werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven. 2.2.3 Kloneren Na 10 dagen in kweek werden CFSElow en CFSEhigh CD4+ T-cellijnen geïsoleerd d.m.v FACS-sorting (FACSariaTM, BD) en rechtstreeks uitverdeeld in een 96-well ronde bodem plaat (NUNC, Neerijse, België) aan 1 cel/well, 5 cellen/well of 10 cellen/well. Aan de cellen werden
allogene,
bestraalde
PBMC
(1x105)
toegevoegd
samen
met
4
ug/ml
phytohemagglutinine (PHA, Sigma Aldrich, St. Louis, USA) en 5 U/ml IL-2 (Roche Diagnostics, Brussel, België). Drie maal per week werd het medium ververst met 5 U/ml IL-2 in KM. Indien nodig werden de cellen gerestimuleerd met antigen gepulste, bestraalde PBMC (1x105) en IL-2 (5 U/ml). Sterk uitgegroeide T-celklonen werden gesplitst en verder opgekweekt. Indien de CFSElow en CFSEhigh T-celklonen voldoende aangerijkt waren, werden deze gescreend op hun antigen reactiviteit d.m.v een split well assay. Hierbij werden de cellen van één well uitverdeeld over vier nieuwe welletjes. Aan twee welletjes werden antigen gepulste en bestraalde PBMC toegevoegd en aan de andere twee, ongepulste en bestraalde PBMC. Twee dagen na het opzetten van de screening werd [3H] thymidine (1 µCi) toegevoegd (Amersham, Buckinghamshire, UK). Na 16 uur werden de cellen geharvest met een automatische cell harvester (Perkin-elmer, Zaventem, België). Het geïncorporeerde [3H]thymidine werd gemeten door een ‘ß plaat scintillatie teller’ (Perkin-Elmer, Zaventem, België). Voor iedere kloon werd de stimulatie index (SI) berekend als het gemiddelde van de counts van antigen gestimuleerde cellen over het gemiddelde van de counts van niet-antigen gestimuleerde cellen. Klonen die een SI ≥ 3 vertoonden werden gedefinieerd als antigen reactief en werden verder opgekweekt.
MBP-reactieve T-cellen in cocultuur met Tregs CFSE gelabelde MBP-reactieve T-cel klonen (2x104 cellen/well) werden in duplo op een 96well ronde bodem plaat in cocultuur gebracht met autologe CD4+ CD25hi regulatoire T-cellen aan verschillende ratio’s (1:0; 1:0,5; 1:1) en gestimuleerd door MBP (100 µg/ml) gepulste en bestraalde autologe PBMC (2x106 cellen/ml) of d.m.v anti-CD3 Ab (2 µg/ml) en bestraalde, autologe PBMC (2x106 cellen/ml). Ook werden CFSE gelabelde CD4+ CD25- T-cellen (2x104 cellen/well) aan dezelfde ratio’s in kweek gebracht met CD4+ CD25hi regulatoire T-cellen en
16
gestimuleerd door toevoeging van anti-CD3 Ab (2 µg/ml) in de aanwezigheid van bestraalde, autologe PBMC (2x106 cellen/ml). In elke opzet werd een conditie zonder stimulus meegenomen. Na 5 dagen in kweek werd via flow cytometrie gekeken naar de antigen reactiviteit van de MBP-reactieve T-cel klonen (% CFSElow) door labeling met anti-CD4PERCP en anti-CD25-PE. 2.2.4 Flow cytometrie Cel oppervlakte kleuring De cellen (100.000-300.000) werden aangebracht op een 96-well plaat met V-bodem (Greiner Bio-One, Wemmel, België). Na het wassen van de cellen met FACS-buffer (1x PBS, 2% FCS, 0,1 % Na-azide) werden deze geïncubeerd voor 30 minuten op 4°C met PE, PERCP of FITC geconjugeerde Ab gericht tegen de extracellulaire merkers CD4, CD25, CD62L, CD45RO (BD, Erembodegem, België), CD24, CD27, CD44, CD49d, CD103, CD45RB, CD11a (Immunotools, Friesoythe, Duitsland), GITR (R&D Systems, Minneapolis) en CTLA4 (Immunotech, Marseille, Frankrijk) (6µl AL/well). De cellen werden hierna gewassen en geanalyseerd op een FACSCalibur flowcytometer (BD) gebruik makend van Cellquest software (BD).
Intracellulaire Foxp3 kleuring Na de oppervlakte kleuring werd de intracellulaire FOXP3 kleuring uitgevoerd door gebruik te maken van een ‘FOXP3 staining kit’ (eBiosciences, San Diego, USA). Allereerst werden de cellen gefixeerd met een Fixatie/Permeabilisatie oplossing gedurende 30 minuten op 4°C. Vervolgens werden de cellen gewassen met permeabilisatie buffer en geresuspendeerd in 2% normaal rat serum/permeabilisatie buffer om aspecifieke Ab bindingsplaatsen te blokkeren. Na 15 minuten op 4°C werden de cellen geïncubeerd met 10 µl FOXP3 AL/well gedurende 30 minuten. Na het wegwassen van de niet gebonden antilichamen werden de cellen geresupendeerd in FACS-buffer en geanalyseerd op de FACSCalibur flow cytometer (BD) gebruik makend van Cellquest software (BD).
17
2.3 Moleculair-biologische technieken 2.3.1 RNA isolatie en cDNA synthese Voor RNA isolatie uit celpellets werd gebruik gemaakt van de High pure RNA isolation kit (Roche Diagnostics, Brussel, België). Cellen werden gelyseerd d.m.v een lysisbuffer en het cellysaat werd aangebracht op een high pure filter tube. Het genomisch DNA werd verwijderd d.m.v DNAse. Na 2 wasstappen werd het RNA geëlueerd van de filter door toevoeging van elutiebuffer gevolgd door een centrifugatie stap. De omzetting van het RNA naar cDNA gebeurde d.m.v de Reverse Transcriptase System kit (Promega Corporation, Madison). Aan het RNA staal werd 5 mM MgCl2, 10 mM reverse transcriptase buffer, 10 mM dNTP, 40 mM rRNAse inhibitor, 40 mM AMV reverse transcriptase en 20 mM oligo dT primers toegevoegd. De stalen werden vervolgens gedurende 60 minuten geïncubeerd op 42°C waardoor de oligo dT primers bonden aan de polyA staart van het mRNA en het AMV reverse transcriptase de polymerisatie van het cDNA katalyseerde met het mRNA als template. Vervolgens werden de stalen gedurende 10 minuten op 95°C geplaatst voor denaturatie en erna op ijs om renaturatie te voorkomen, respectievelijk voor 5 en 10 minuten. Fenol/chloroform extractie werd uitgevoerd om het cDNA te scheiden van de reagentia van de cDNA synthese mix, waarna het cDNA terecht kwam in de H2O fase. Het cDNA werd overnacht geprecipiteerd in de aanwezigheid van 3M NaAcetaat en 100% ethanol. Na het wassen met 70% ethanol werd het cDNA opgelost in geautoclaveerd milliQ en werd de kwaliteit van het gesynthetiseerde materiaal gecontroleerd door een PCR reactie met primers gericht tegen het huishoud gen glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) of het constante deel van de ß-keten van de TCR (Tabel 2).
Tabel 2. PCR-programma ter controle van de cDNA synthese. # cycli
Activiteit
Temperatuur
Tijd
1
Denaturatie
95°C
5 min
35
Denaturatie
94°C
20 sec
Annealing
55°C
20 sec
Elongatie
72°C
40 sec
1
Finale elongatie
72°C
6 min
1
Koeling
4°C
∞
18
2.3.2 TCR BV gebruik bepaling d.m.v de Lightcycler Het TCR BV gen gebruik werd gemeten van PBMC en CD4+ CD25+ T-cellen door real-time PCR m.b.v specifieke primers gericht tegen de verschillende BV families.
Om het TCR BV gen gebruik te bepalen in een cDNA staal werd aan het staal 4 mM MgCl2 (geoptimaliseerd), forward en reverse BV primers of de BC primer [ sequenties verkregen van Dr. Wei Sun, Houston Texas. 1 pmol/ml, 0,5 pmol/ml of 0,25 pmol/ml (geoptimaliseerd)], geautoclaveerd MilliQ, 10x verdund SYBR Green (+ dNTP mix en reactiebuffer) en ‘FastStart’ DNA polymerase toegevoegd (Lightcycler® Faststart DNA Master SYBR Green I kit, Roche, Vilvoorde, België). Het Taq polymerase werd beschermd door een eiwit wat ervoor zorgde dat het polymerase geen activiteit vertoonde tot aan de prenaturatie stap, waar het eiwit van het polymerase denatureerde. De stalen werden vervolgens onderworpen aan een geoptimaliseerd PCR-programma (Tabel 3). Bij elke run werd als negatieve controle ook een reactie met de BC primers meegenomen zonder cDNA. Op het einde van de PCR amplificatie werd het PCR product uitgesmolten door de temperatuur gradueel te verhogen en het SYBR Green signaal te meten. De resulterende smeltcurve gaf een idee over de specificiteit van het PCR product. Sommige stalen werden eveneens gecontroleerd d.m.v een 2% agarose gel electroforese waarbij het PCR fragment op basis van de grootte (aantal bp) gescheiden werd. Tabel 3. Programma voor het meten van het TCR BV gebruik via de Lightcycler. Doel
# cycli
Activiteit
Temperatuur
Tijd
Pre-Denaturatie
1
Denaturatie
95°C
10 min
Amplificatie
45
Denaturatie
95°C
10 sec
Annealing
61°C*
3 sec*
elongatie
72°C
10 sec
40°C
30 sec
Koeling
1
* geoptimaliseerd tijdens deze stage
BV gen PCR amplificatie kon in real-time gevisualiseerd worden d.m.v het SYBR Green signaal (Fig. 4). Dit fluorescerend molecule intercalleert tussen het dubbelstrengige DNA. Het aantal cycli dat nodig was om amplificatie van het cDNA staal te visualiseren werd aangegeven door een crossingpoint. Het crossingpoint voor iedere PCR reactie met de baseline werd berekend via de Lightcycler software volgens de maximale 2e afgeleide
19
methode. De expressie van de TCR BV genen was omgekeerd evenredig met het crossingpoint van de respectievelijke PCR amplificatie. Om aan de crossingpoints een concentratie te kunnen koppelen werd na elke run de standaardcurve geïmporteerd (Fig 5). Deze standaardcurve werd aangemaakt door van vier verdunningen (1, 1/10, 1/100, 1/1000) van een PBMC cDNA mix (PBMC uit 5 HC) de BC expressie (in duplo) te meten.
Baseline
Figuur 4. Schematische weergave van de PCR-reactie. Op de X-as is het aantal cycli in de amplificatie fase en op de Y-as het fluorescent signaal van het DNA intercallerende SYBR Green weergegeven. Iedere curve stelt een aparte BV expressie voor (24 in totaal).
Hiervoor werd eerst de concentratie van het onverdunde cDNA mix staal gemeten via spectofotometrie (Pharmacia Biotech, Brussel, België). Tijdens elke Lightcycler run werd de 1/100 verdunning meegenomen om te kunnen corrigeren voor kleine afwijkingen tussen elke Lightcycler run.
1/10 1 1/1000 1/100
Figuur 5. De standaardcurve gemaakt d.m.v 4 verdunningen (1, 1/10, 1/100, 1/1000) van een cDNA mix.
Uiteindelijk werden de gemeten BV concentraties relatief ten opzichte van elkaar uitgezet waardoor een benadering van het BV gen gebruik verkregen werd (zie onderstaande formule). % BVx = BVx / ∑ BV1,2...n 20
3. Resultaten 3.1 Fenotypische karakterisering van Tregs in MS patiënten en gezonde controles Voor de fenotypische analyse van Tregs van MS-patiënten en HC werd de expressie van verschillende relevante activatie-, adhesie- en differentiatie merkers op Foxp3+ CD4+ en CD25high CD4+ T-cellen onderzocht via flow cytometrie. Eerst werd het expressiepatroon van Foxp3+ en CD25high T-cellen vergeleken met hun respectievelijke tegenhangers Foxp3- en CD25int/- T-cellen. Vervolgens werd het fenotype van deze cellen vergeleken tussen MSpatiënten en gezonde controles. 3.1.1 Fenotypische vergelijking van CD4+ Foxp3+/- en CD4+ CD25-/int/hi T-cellen van HC PBMC geïsoleerd uit gezonde controles werden gelabeld met antilichamen gericht tegen relevante membraan gebonden activatie-, adhesie- en differentiatie merkers en het intracellulaire Foxp3. Een overzicht van de resultaten is weergegeven in figuur 6 en 7. De meerderheid van de Foxp3+ CD4+ T-cellen vertoonden een geactiveerd (CD25, 87±10%) en geheugen (CD45RO, 83±11%) fenotype. Een klein gedeelte van de cellen (27±21%) bracht CD45RA, kenmerkend voor een naïef fenotype, tot expressie. In vergelijking met conventionele FOXP3- CD4+ T-cellen bracht een significant hoger aantal (p<0,05) van de Foxp3+ CD4+ T-cellen, GITR (data niet weergegeven) en intracellulair CTLA-4 tot expressie waartegen een kleiner percentage van de FOXP3+ CD4+ T-cellen positief was voor VLA-4 (CD49d). De Foxp3 expressie was het sterkst gecorreleerd met de CD25high CD4+ T-cellen (80±7% Foxp3+). Een klein gedeelte van de CD25int CD4+ T-cellen (9±4%) bracht eveneens Foxp3 tot expressie. De meerderheid van de CD25- CD4+ T-cellen daarentegen was FOXP3-. De CD25high CD4+ T-cellen vertoonden een expressieprofiel dat vergelijkbaar was met de Foxp3+ CD4+ T-cellen. In vergelijking met de CD25int en CD25- CD4+ T-cellen, vertoonden ze een hogere expressie van CD45RO en GITR (p<0,05) (Fig.7).
De meeste T-cellen
(regulatoire en conventionele) brachten CD62L, CD27 en CD44 tot expressie hoewel een groter percentage van CD62L- en CD27- cellen werd teruggevonden in de CD25int CD4+ T-cel populatie t.o.v de CD25hi en CD25- CD4+ T-cellen (p<0,05). Het expressie niveau (bepaald a.h.v het gemiddelde fluorescentie signaal) van CD44 was lager op CD4+ CD25high en CD4+ Foxp3+ T-cellen t.o.v respectievelijk de CD4+ CD25int/- en CD4+ Foxp3- T-cellen (data niet weergegeven). De frequentie CD103+ T-cellen was hoger in Tregs (FOXP3+ en CD25high CD4+ T cellen) dan in de conventionele T-cellen (Fig.7). VLA-4+ cellen werden voornamelijk
21
teruggevonden in de CD25int en CD25- T-celpopulatie waarbij een hoger percentage CD4+ CD25int T-cellen CD49dhi tot expressie bracht (p<0,05) (Fig.6 en 7).
3.1.2 Fenotypische vergelijking van Tregs van HC, RR-MS patiënten en SP-MS patiënten In de experimentele data werden er geen significante verschillen gedetecteerd tussen HC en MS-patiënten betreffende het aantal CD4+ Foxp3+ T-cellen en CD4+ CD25hi T-cellen dat de differentiatie merkers CD45RO, CD45RA, CD27 tot expressie bracht (Fig.6 en 7). Eveneens waren er geen significante verschillen in de expressie van adhesie moleculen (CD44, CD49d, CD103, CD62L) op CD4+ Foxp3+ T-cellen en CD4+ CD25hi T-cellen van HC en MSpatiënten. Echter brachten, in vergelijking met het aantal CD4+ CD25hi T-cellen van HC (85±8%), minder CD4+ CD25hi T-cellen van RR-MS (75±33%) en SP-MS patiënten (60%) CD62L tot expressie (Fig.7). +
Foxp3 T-cellen
100 80 60 40 20 0
HC
CD 49 d
D2 7 C
C
iC TL A 4 CD 45 R O CD 45 RA
RR-MS SP-MS
D2 5
Expressie (%)
A
-
Foxp3 T-cellen Expressie (%)
B 100
#
80
HC
60 40 20
RR-MS SP-MS
** CD 49 d
CD 27
iC TL A4 CD 45 RO CD 45 RA
CD 25
0
Figuur 6. Expressie van relevante merkers op Foxp3+ T-cellen en Foxp3- T-cellen van HC, RR-MS en SPMS patiënten. PBMC van 3 HC, 3 RR-MS en 3 SP-MS patiënten werden geanalyseerd voor de expressie van relevante activatie-, adhesie- en differentiatie merkers in combinatie met het intracellulaire Foxp3 d.m.v flow cytometrie. De gate voor de analyse werd geplaatst op de lymfocyten door gebruik te maken van de forward en side scatter eigenschappen. Een tweede gate werd geplaatst op de CD4+ populatie. In A wordt het percentage Foxp3+ T-cellen dat de merkers tot expressie brengt weergegeven en in B het percentage Foxp3- T-cellen. (* p<0,05 vergeleken met HC, # p<0,05 vergeleken met RR-MS)
22
CD25
high
T-cellen
100 80 60 40 20 0
HC RR-MS
*
SP-MS
Fo xp 3 G I C TR D 45 C RO D 45 RA CD 2 CD 7 62 L CD C 44 D 49 d C hi D4 9 CD d 10 3
Expressie (%)
A
CD25
100 80 60 40 20 0
int
T-cellen
*
HC RR-MS SP-MS
*
Fo xp 3 G I C TR D4 5 C RO D4 5R A CD 2 CD 7 62 L CD C 44 D4 9d CD hi 49 CD d 10 3
Expressie (%)
B
C
-
Expressie (%)
CD25 T-cellen **
100 80
*
60 40
*
20
HC RR-MS SP-MS
Fo xp 3 G C ITR D 45 C RO D 45 R A C D 2 C 7 D 62 L C D C 44 D 49 d hi C D 49 C d D 10 3
0
Figuur 7. Expressie van relevante merkers op CD25hi T-cellen, CD25int T-cellen en CD25-T-cellen van HC, RR-MS en SP-MS patiënten. PBMC van 3 HC, 3 RR-MS en 3 SP-MS patiënten werden geanalyseerd voor de expressie van de weergegeven activatie-, adhesie- en differentiatie merkers d.m.v flow cytometrie. De gate voor de analyse van de cellen werd geplaatst op de lymfocyten door gebruik te maken van de forward en side scatter eigenschappen. Een tweede gate werd geplaatst op de CD4+ populatie. De derde gate was afhankelijk van het CD25 signaal (zie Fig.8). Resultaten werden uitgezet als het percentage van de CD25hi (A), CD25int (B) en CD25- (C) CD4+ T-cellen dat de merker tot expressie bracht. (CD49d: de frequentie van positief CD49d signaal, CD49d hi: frequentie van hoog CD49d signaal) (* p<0,05 vergeleken met HC)
23
Het verlaagde CD62L expressieprofiel was ook aanwezig op de conventionele T-cellen en CD4+ CD25int T-cellen van de RR-MS patiënten en SP-MS-patiënten. De CD4+ CD25hi Tcellen en CD4+ CD25- T-cellen van SP-MS patiënten vertoonden meer VLA-4+ (CD49hi) Tcellen in vergelijking met HC (p<0,05). Deze observatie werd niet teruggevonden voor de CD25int T-cellen. Zowel de RR-MS patiënten als SP-MS patiënten hadden een verlaagd aantal CD4+ CD25- CD49d+ T-cellen (p<0,05). In RR-MS patiënten waren er significant minder CD4+ CD25int CD49+ T-cellen aanwezig dan in de HC (p<0,05). Voor de activatie merkers (CD25, CTLA-4) waren er geen significante verschillen in expressie op CD4+ Foxp3+ Tcellen van HC en MS-patiënten. Het percentage Foxp3- T-cellen in de MS patiënten dat de activatie merker CTLA-4 tot expressie bracht, was significant hoger dan in de HC (p<0,05). De SP-MS patiënten hadden meer CD4+ CD25- CD45RO+ T-cellen (56±20%) vergeleken met HC (25±14%) (p<0,05). In de RR-MS patiënten waren er minder Foxp3- T-cellen die VLA4+ (CD49) (40±19%) waren vergeleken met de Foxp3- T-cellen (79±3%) van de SP-MS patiënten (p<0,05) (Fig.6 en 7). De experimentele bevindingen tonen dus aan dat Tregs in HC over een geactiveerd/geheugen fenotype beschikken. Er is echter ook een kleine populatie van naïve (CD45RA+) Foxp3+ CD4+ regulatoire T-cellen aanwezig in het perifere bloed van HC. In zowel RR-MS patiënten als SP-MS patiënten werd er geen verschil in de frequentie van cellen die de differentiatie merkers, activatie merkers en adhesie merkers tot expressie brachten op Tregs waargenomen, met uitzondering van VLA-4 (CD49dhi) in SP-MS patiënten.
3.2 Suppressie capaciteit van Tregs ten opzichte van myeline antigen T-cel reactiviteit in HC 3.2.1 Depletie van CD25+ regulatoire T-cellen uit PBMC en CD4+ T-cellen Door middel van een CD25 magnetisch selectie systeem werden CD25+ T-cellen enerzijds uit PBMC en anderzijds uit opgezuiverde CD4+ T-cellen verwijderd. De zuiverheid werd gecontroleerd via flow cytometrische analyse van de CD4 en CD25 expressie (Fig.8). Eveneens werd er een controle gedaan van de CD25 depletie van CD4+ T-cellen geïsoleerd uit het perifere bloed van één HC. De CD4+ T-cel populatie vertoonde een zuiverheid van 94,48%. Vóór de CD25 depletie bestond de totale CD4+ T-cel populatie voor 19,7% uit CD25int cellen en voor 1,82% uit CD25hi cellen (Fig.8C). Na depletie waren de percentages gereduceerd tot respectievelijk 2,4% en 0,07% (Fig.8D).
24
A.
B. PBMC
CD25 gedepleteerde PBMC
CD25 total
CD25 total 2,08%
0,06%
CD25 hi
CD25 int
C.
CD25 hi
22,17%
CD25 int
D.
CD4+ T-cellen
CD25 total
8,12%
CD25 gedepleteerde CD4+ T-cellen
CD25 total 1,82%
CD25 hi
0,07%
CD25 hi
19,70%
CD25 int
2,40%
CD25 int
Figuur 8. Depletie van CD25+ regulatoire T-cellen uit PBMC en CD4+ T-cellen via RossetteSep. PBMC en CD25 gedepleteerde PBMC (CD25- PBMC) werden net als geïsoleerde CD4+ T-cellen en CD25 gedepleteerde CD4+ T-cellen gelabeld met anti-CD4-FITC en anti-CD25-PE Ab, en vervolgens geanalyseerd d.m.v flow cytometrie. De cellen in de CD4+ lymfocyte gate werden getest op de aanwezigheid van CD25+ cellen. Er werd een onderscheid gemaakt tussen een hoog (CD25hi) en intermediar (CD25int) signaal. De cellen buiten “CD25 total” waren CD25 negatief. In A wordt de expressie van CD25 in de CD4+ T-cellen uit de PBMC fractie weergegeven en in B deze in de CD25 gedepleteerde PBMC fractie. In C wordt de expressie van CD25 van de geïsoleerde CD4+ T-cellen weergegeven en in D deze van de CD25 gedepleteerde CD4+ T-cellen.
Deze data tonen aan dat er een hogere zuiverheid in de CD25 depletie bekomen wordt uit geïsoleerde CD4+ T-cellen (97,53% CD4+ CD25- T-cellen) in vergelijking met de depletie uit PBMC (91,82% PBMC CD25- T-cellen), met voornamelijk een verbetering in de reductie van het aantal CD4+ CD25int T-cellen.
25
3.2.2 Antigen reactiviteit van CD4+T-cellen uit PBMC en CD25 gedepleteerde PBMC van HC Om informatie te verkrijgen over de myeline reactiviteit van responder cellen na Treg depletie werden CFSE gelabelde PBMC en CD25 gedepleteerde PBMC (CD25- PBMC) gestimuleerd met de antigenen MBP en MOG. Daarnaast werden de 2 celpopulaties ook gestimuleerd met de controle antigenen TT en TSST. Aan de hand van het CFSE signaal kon de T-cel reactiviteit t.o.v de stimuli berekend worden. Na deling vertoonden de CFSE gelabelde cellen immers een lager CFSE signaal (CFSElow) dan de niet gedeelde fractie (CFSEhigh). In figuur 9 wordt een representatief voorbeeld weergegeven van de CFSE proliferatie analyse.
A
B
KM
0,80%
D
7,28%
46,91%
C
MBP
40,65%
E
TT
13,58%
MOG
0,58%
47,37%
TSST
60,22%
8,21%
35,40%
Figuur 9. De antigenreactiviteit van CFSE gelabelde PBMC. De antigen gestimuleerde PBMC werden gelabeld met anti-CD4-PE en 7-AAD en geanalyseerd via flow cytometrie. Na selectie op levende (7-AAD-) lymfocyten via gates (niet weergegeven), werd het CD4 signaal van de cellen uitgezet t.o.v het CFSE signaal voor de verschillende antigen condities (A-E). (A: KM zonder antigen (ZA), B: MBP, C: MOG, D: TT, E: superantigen TSST)
Via PE gelabelde Ab gericht tegen CD4 en CD8 kon het aantal CFSElow CD4+ en CD8+ Tcellen berekend worden respectievelijk t.o.v het totale percentage CD4+ en CD8+ T-cellen.
26
Vervolgens werd een kinetiek van de antigen respons opgesteld door dagelijks de CFSE fluorescentie te meten vanaf dag 5 t.e.m dag 9 van de celkweek.
Op dag 5 van de celkweek was een klein percentage delende cellen (4,5% in de totale PBMC fractie en 0,8% in de CD25- PBMC fractie) detecteerbaar in de condities zonder stimulus. De achtergrond proliferatie steeg gedurende de volgende dagen respectievelijk tot aan 33,8% en 13,2% (data niet weergegeven). Vanaf dag 6 was er een duidelijke MBP respons van de CD4+ T-cellen merkbaar. Gedurende de volgende dagen steeg de proliferende CD4+ T-cel fractie uit de niet gedepleteerde PBMC en bereikte een plateau waarde op dag 9 (Fig.10A).
CD4+ T-cellen uit PBMC A
B
MBP
MOG
100
80
80
60
60
PBMC
40
40
CD25-PBMC
20
20
∆PF
100
0
0 dag 5
dag 6
dag 7
dag 8
dag 5
dag 9
∆PF
dag 7
dag 8
dag 9
Tijd (dagen)
Tijd (dagen)
C
dag 6
D
TT
100
100
80
80
60
TSST
60
40
40
20
20
0 dag 5
dag 6
dag 7
Tijd (dagen)
dag 8
dag 9
0 dag 5
dag 6
dag 7
dag 8
dag 9
Tijd (dagen)
Figuur 10. De antigen reactiviteit van CD4+ T-cellen uit antigen gestimuleerde PBMC en CD25 gedepleteerde PBMC. CFSE gelabelde PBMC en CD25 gedepleteerde PBMC (1,5x106 cellen/well) werden gestimuleerd met de antigenen MBP (A), MOG (B), TT (C) en TSST (D). Na 5 dagen in kweek werd de antigen reactiviteit van de CD4+ T-cellen gedurende 5 dagen opgevolgd. De cellen werden gelabeld met anti-CD4-PE en 7AAD en het CFSE signaal van de levende (7AAD-) en CD4+ T-cellen werd gemeten via flow cytometrische analyse. De prolifererende fractie (∆PF) werd berekend door het percentage CFSElow (KM) cellen af te trekken van het percentage CFSElow (Ag) cellen voor de verschillende condities.
Op dag 9 werd er een significante (∆PF=14,8%) MOG geïnduceerde proliferatie gedetecteerd voor de CD4+ T-cellen uit niet gedepleteerde PBMC maar deze bleef echter significant lager dan de MBP respons (Fig.10B). Zoals weergegeven in figuur 10A was er een hogere MBP reactiviteit van de CD4+ T-cellen uit de CD25 gedepleteerde PBMC in vergelijking met deze
27
uit de totale PBMC fractie. De TT gestimuleerde cellen vertoonden een sterke antigen reactiviteit voor zowel de CD4+ T-cellen uit de CD25 gedepleteerde als niet-gedepleteerde PBMC, met voor beiden de hoogste proliferatie (∆PF= 70%) op dag 8. De TSST gestimuleerde CD4+ T-cellen uit de CD25 gedepleteerde en niet gedepleteerde PBMC vertoonden reeds zeer vroeg (dag 5) een hoge proliferatie respons. Een maximale proliferatie (∆PF= 80%) werd gemeten op dag 6 waarna de ∆PF daalde op dag 8 en 9 wegens een stijgende achtergrond proliferatie (Fig.10D). De reactiviteit van de CD8+ T-cellen uit de PBMC en PBMC CD25- t.o.v de MBP en MOG stimulatie was significant lager dan in de CD4+ T-cellen (data niet weergegeven). Wel was er sterke proliferatie in de condities met de controle antigenen TT en TSST (data niet weergegeven).
3.2.3 Antigen reactiviteit van opgezuiverde CD4+ T-cellen en CD25 gedepleteerde CD4+ Tcellen in HC Eveneens werd de kinetiek bepaald van CD4+ T-cellen en CD25 gedepleteerde CD4+ Tcellen. Hiervoor werden enerzijds CFSE gelabelde CD4+ T-cellen (met Tregs) en anderzijds CD4+ CD25- T-cellen (zonder Tregs) in kweek gebracht met MBP, MOG of TT gepulste PBMC. Na 7 dagen in kweek werd de CFSE deling van de responder cellen bepaald d.m.v flow cytometrische analyse gedurende 4 dagen. In tegenstelling tot het MOG antigen was er een hoge respons na MBP stimulatie in de CD25 gedepleteerde PBMC welke vanaf dag 9 even sterk was in de CD25- CD4+ T-cellen als de niet gedepleteerde CD4+ T-cellen (Fig.11A en B). De TT gestimuleerde cellen vertoonden in beide celpopulaties een sterke antigen reactiviteit. (Fig.11C).
Voorafgaande resultaten hebben aangetoond dat een maximale antigen reactiviteit van de CD4+ en CD25- CD4+ T-cellen geobserveerd werd op dag 10 van de celkweek betreffende de antigenen MBP en TT (persoonlijke commentaar K.Venken). De antigen reactiviteit van CD4+ T-cellen van 2 HC, geanalyseerd tijdens deze stage, werd dan ook vergeleken op dag 10 (Fig.12). Voor de eerste donor (Fig.12A) was er op dag 10 een even sterke MBP respons van de CD4+ T-cellen als van de CD4+ CD25- T-cellen. MOG-geïnduceerde proliferatie was niet tot weinig detecteerbaar.
28
Opgezuiverde CD4+ T-cellen MBP
MOG
B
100
100
80
80
∆PF
∆PF
A
60 40
60 40 20
20
0
0 d7
d8
d9
d7
d10
d8
d9
d10
Tijd (in dagen)
Tijd (in dagen)
C
TT 100
∆PF
80
CD4+ T-cellen
60 40
CD4+ CD25- Tcellen
20 0 d7
d8
d9
d10
Tijd (in dagen) Figuur 11. De antigen reactiviteit van opgezuiverde CD4+ T-cellen en CD25 gedepleteerde CD4+ T-cellen. CFSE gelabelde CD4+ T-cellen en CD25 gedepleteerde CD4+ T-cellen (6x105 cellen/well) werden in cocultuur gebracht met MBP (A), MOG (B) en TT (C) gepulste en bestraalde PBMC (7,5x105 cellen/well). Na 7 dagen in kweek werd de antigen reactiviteit van de CD4+ T-cellen gedurende 5 dagen opgevolgd . De cellen werden gelabeld met anti-CD4-PE en 7AAD en het CFSE signaal van levende cellen (7AAD-) en CD4+ T-cellen werd gemeten via flow cytometrische analyses. De prolifererende fractie (∆PF) werd berekend zoals eerder beschreven (fig.10) voor de verschillende condities.
In figuur 12B was de MBP en MOG geïnduceerde proliferatie hoger voor de Treg (CD25-) gedepleteerde CD4+ T-cellen dan voor de niet gedepleteerde CD4+ T-cellen. In beide donors vertoonden zowel de CD25 gedepleteerde als totale CD4+ T-celpopulatie een sterke reactiviteit t.o.v het controle antigen TT. 100
A
B
80 ∆PF (%)
∆PF (%)
80
100
60 40 20
60 40 20
0
0 MBP
MOG
TT
CD4+ T-cellen
MBP
MOG
TT
CD4+ CD25- T-cellen
Figuur 12. De antigen reactiviteit van CD4+ T-cellen en CD4+ CD25- T-cellen van 2 HC. Na 10 dagen in kweek werd de antigen reactiviteit van de MBP, MOG en TT gestimuleerde CD4+ T-cellen en CD4+ CD25- Tcellen (6x105 cellen/well) gemeten. De CD4+ T-cellen en CD25 gedepleteerde CD4+ T-cellen werden gelabeld met anti-CD4-PE en 7AAD en geanalyseerd via flow cytometrische analyse. De proliferatie fractie (∆PF) werd berekend voor de verschillende condities. In A de reactiviteit uit figuur 12 en in B de reactiviteit van een 2e HC.
29
3.2.4 De myeline reactiviteit van naïve en memory responder cellen in HC Om een onderscheid te maken tussen primaire of secundaire (geheugen) antigen responsen werden de CD25- responder cellen van één HC d.m.v FACS-Sorting gescheiden in CD45RA+ (naïve) en CD45RA- (geheugen) cellen. De MBP, MOG en TT respons werd d.m.v een CFSE assay voor deze 2 subpopulaties en de totale CD4+ T-celpopulatie gemeten.
50
∆PF (%)
40 30 20 10 0 MBP
MOG
TT
CD4+ T-cellen CD4+ CD25- CD45RA+ T-cellen CD4+ CD25- CD45RA- T-cellen
Figuur 13. De antigen respons van naïve (CD45RA+) en memory (CD45RA-) responder cellen. CFSE gelabelde CD4+ T-cellen, CD4+ CD25- CD45RA+ T-cellen en CD4+ CD25- CD45RA- T-cellen (6x105 cellen/well), geïsoleerd uit één HC, werden in kweek gebracht met MBP, MOG en TT gepulste en bestraalde PBMC (7,5x105 cellen/well). Na 10 dagen in kweek werden de cellen gelabeld met anti-CD4-PE en 7AAD en werd het CFSE signaal van de levende (7AAD-) CD4+ T-cellen via flow cytometrie gemeten. De reactiviteit wordt weergegeven in ∆PF (%).
In onze experimentele data was er op dag 10 een lage tot geen respons van de naïve en geheugen T-cellen na MOG en MBP stimulatie. De CD4+ T-cellen vertoonden ook geen significante MOG respons (0,5%) maar wel een significante MBP respons (12,3%). Het aantal delende cellen na TT stimulatie was hoger in de geheugen (CD45RA-) cellen in vergelijking met de naïve (CD45RA+) T-cellen (Fig. 13). Deze verhoudingen van de antigen respons tussen de 3 celpopulaties bleef hetzelfde op dag 12 van de kweek (data niet weergegeven).
3.2.5 Klonering van MBP en TT CFSElow/high T-cellen MBP en TT reactieve (proliferende) CD4+ CD25- T-cellen van een HC (zie 3.2.3) werden op dag 8 van de kweek gekloneerd. Hiervoor werden levende (7AAD-) MBP en TT reactieve 30
CFSElow CD4+ T-cellen gesorteerd aan 1, 5 en 10 cellen/well in een 96 well plaat in de aanwezigheid van 100 000 bestraalde PBMC/well, PHA (4 µg/µl) en IL-2 (5 U/ml). Eveneens werden ook niet MBP en TT reactieve T cellen (CFSEhigh) gesorteerd ter controle van de experimentele set-up. Sterk uitgegroeide T cel klonen (na visuele inspectie) werden gescreend voor hun antigen reactiviteit d.m.v een split well assay. De resultaten zijn samengevat in Tabel 4. Tabel 4. De klonering van MBP en TT reactieve (CFSElow) en niet reactieve (CFSEhigh) T-cellen Antigen
MBP
CFSE
Kloneringsdensiteit
Aantal groeiende
Aantal antigen reactieve T-
signaal
(cellen/well)
T-cel klonen (a)
cel klonen (b)
10
20/60 (33,3%)
0/12 (0%)
5
16/60 (26%)
0/16 (0%)
1
3/60 (5%)
0/3 (0%)
10
49/60 (81,6%)
0/12 (0%)
5
26/60 (43,3%)
0/26 (0%)
1
7/60 (11,6%)
0/7 (0%)
10
2/17 (11,7%)
0/2 (0%)
5
8/60 (13,3%)
3/8 (37,5%)
1
1/60 (1,6%)
1/1 (100%)
10
/
/
5
24/60 (40%)
0/24 (0%)
1
2/60 (3,3%)
0/2 (0%)
CFSE
low
CFSEhigh
TT
CFSE
low
CFSEhigh
CFSE gelabelde CD4+ CD25- T-cellen werden gestimuleerd met MBP of TT gepulste PBMC. Na 8 dagen kweek werden de CFSEhigh en CFSElow 7AAD- CD4+ T- cellen gesorteerd aan 1, 5 en 10 cellen/well in een 96 well plaat. Sterk groeiende T-cel klonen werden getest op hun antigen reactiviteit d.m.v een split well assay. De stimulatie index (SI) van iedere uitgegroeide kloon werd berekend als het gemiddelde van het aantal antigen gestimuleerde cellen over het gemiddelde aantal niet-antigen gestimuleerde cellen. ( a = aantal groeiende T-celklonen t.o.v het aantal opgezette wells, b=aantal antigen reactieve T-cel klonen (SI≥3) t.o.v het aantal gescreende T-cel klonen, / = conditie niet opgezet wegens tekort aan cellen)
Er werd per conditie nagegaan hoeveel van de uitgegroeide T-cel klonen er antigen reactief waren door het berekenen van de stimulatie index (SI) voor iedere kloon. Het aantal groeiende T-cel klonen (per conditie) was hoger bij hogere kloneringsdensiteit (Tabel 4). De resultaten van de screening gaven aan dat zowel de MBP als TT CFSEhigh T-celklonen geen myeline reactiviteit vertoonden (SI<3). Van de gescreende MBP CFSElow T-cel klonen werden er eveneens geen positieve SI gemeten. Er moet hierbij echter wel vermeld worden dat voor de meeste T-cel klonen er een hoge achtergrond proliferatie werd waargenomen (data niet weergegeven). Wel werd er een positieve antigen respons gedetecteerd voor de TT reactieve 31
CFSElow T-cel klonen (37,5% en 100% van de cellen uitgeplaat aan respectievelijk 5 en 1 cel/well hadden een SI ≥3).
Deze data tonen dus enerzijds aan dat de hoeveelheid uitgegroeide T-cel klonen per conditie positief gecorreleerd is aan de kloneringsdensiteit. Anderzijds is de antigen reactiviteit omgekeerd evenredig met het aantal gesorteerde T-cellen/well (kloneringsdensiteit).
3.2.6 Onderdrukking van MBP reactieve T-cel klonen door Tregs Vervolgens werd er op een directe manier gekeken naar de suppressieve eigenschappen van Tregs t.o.v myeline reactieve T-cellen. Hiervoor werden 2 MBP reactieve CFSE gelabelde Tcelklonen van een HC (verkregen uit het T-cel vaccinatie labo) in cocultuur gebracht met autologe FACS gesorte CD4+ CD25high T-cellen (Tregs) aan verschillende ratio’s (Fig.14). Als TCR stimulus werden MBP gepulste en bestraalde PBMC of anti-CD3 Ab samen met bestraalde PBMC toegevoegd. Ter controle van de Treg suppressie capaciteit werden CD4+ CD25- T-cellen aan dezelfde ratio’s in kweek gebracht met Tregs en gestimuleerd door toevoeging van anti-CD3 Ab en bestraalde PBMC. De proliferatie capaciteit van de MBP reactieve T-cel klonen en autologe CD4+ CD25- T-cellen in de aan- of afwezigheid van Tregs werd gemeten via een CFSE assay.
Zoals weergegeven in figuur 14A veroorzaakten de Tregs een dosis afhankelijke suppressie van de proliferatie respons van de MBP gestimuleerde MBP reactieve T-cel kloon 4. Voor kloon 7A werd er onder dezelfde omstandigheden geen sterke daling in de proliferatie capaciteit waargenomen. Vanaf de ratio 1:0,5 was er geen verandering meer in de suppressieve activiteit. De Tregs vertoonden een sterke suppressie activiteit t.o.v de anti-CD3 gestimuleerde CD4+ CD25- T-cel populatie. Er was een lage Treg gemedieerde onderdrukking van de proliferatie van kloon 4. De proliferatie van kloon 7A werd onderdrukt door de Tregs maar vanaf ratio 1:0,5 werd er een maximale onderdrukking gedecteerd (Fig.14B). Wanneer gekeken werd naar de absolute proliferatie (% CFSElow) van de klonen na stimulatie zagen we dat kloon 7A een sterke celdeling vertoonde na stimulatie met MBP welke duidelijk minder was na anti-CD3 stimulatie. Kloon 4 vertoonde het omgekeerde patroon (Fig.14C).
32
B
A
anti-CD3 Ab
100 Kloon 7A 50
Kloon 4
0 1:0
1:0.5
1:1
proliferatie (%)
proliferatie (%)
MBP
100
CD4+CD25Kloon 7A
50
Ratio responder - Treg
Kloon 4 0 1:0
1:0.5
1:1
Ratio responder - Treg
C % gedeelde cellen
100 80 60
MBP
40
aCD3
20 0
Kloon 7A
Kloon 4
Figuur 14. Onderdrukkingscapaciteit van Tregs op MBP reactieve T-celklonen. Twee CFSE gelabelde MBP reactieve T-cel klonen (2x104 cellen/well) werden in kweek gebracht met een stijgende hoeveelheid autologe CD4+ CD25high T-cellen (Tregs) en gestimuleerd d.m.v MBP gepulste en bestraalde, autologe PBMC (2x106 cellen/ml) (A) of anti-CD3 Ab in de aanwezigheid van bestraalde autologe PBMC (B). Ook werden antiCD3 gestimuleerde CD4+ CD25- T-cellen in verschillende ratio’s in cocultuur gebracht met Tregs. Na 5 dagen in kweek werd via flow cytometrie gekeken naar de antigen reactiviteit van de MBP-reactieve T-cel klonen (% CFSElow) door labeling met anti-CD4-PERCP en anti-CD25-PE Ab. In A en B werd de relatieve proliferatie van de klonen of CD25- CD4+ T-cellen uitgezet voor de verschillende Treg ratio’s. Figuur C is de weergave van de absolute proliferatie (% CFSElow CD4+ T-cellen) van de 2 klonen na stimulatie met MBP en anti-CD3 Ab.
Deze resultaten geven aan dat geïsoleerde Tregs enkel in staat zijn om MBP reactieve Tcellen te onderdrukken bij een lage stimulus reactiviteit. Bij een te hoge aantal Tregs in de cocultuur werd er een plateau waarde bereikt in de suppressieve activiteit van de Tregs. 3.3 TCR BV gen analyse van T-cellen via real-time PCR (Lightcycler) Een derde doel in deze studie was om het TCR BV gebruik te meten en te vergelijken in Tregs van HC en MS-patiënten. Vooraleer het TCR BV gen gebruik kon worden bepaald in CD4+ CD25+ T-cellen van HC en MS-patiënten, moesten de PCR condities worden geoptimaliseerd. De optimale MgCl2 concentratie, annealingstemperatuur en primer concentraties voor de real-time PCR werden hiervoor bepaald. Voor de optimale MgCl2 concentratie werd de BV expressie van 2 BV families en de BC bepaald van een PBMC staal van een HC bij een MgCl2 eindconcentratie van 1, 2, 3, 4 en 5 mM. De optimale amplificatie
33
resultaten werden verkregen bij een MgCl2 eindconcentratie van 4 mM (data niet weergegeven). Om de optimale annealingstemperatuur te bepalen werd deze gevarieërd voor dezelfde BV primers tijdens de PCR reacties respectievelijk van 58°C tot 63°C. Bij 62°C en 63°C werd er een verlaagd of geen PCR product gedetecteerd. De optimale temperatuur voor onze toepassing werd vastgelegd op 61°C (data niet weergegeven). Naast de optimalisatie van bovenstaande parameters werd de vorming van primer dimeren ook verlaagd door de concentraties van de verschillende primers te variëren. Een overzicht van de geoptimaliseerde primer concentraties is weergegeven in Tabel 5.
Tabel 5. Overzicht van de BV primers met hun geoptimaliseerde concentraties (pmol/µl).
BV familie (46)
VB familie (47)
[Forward primer] pmol/µl
[Reverse primer] pmol/µl
2 3 4 5 6 7 10 11 12 14 15 19 20 24 27 28 29 30
22 9 7 5 13 6 12 21 8 16 24 17 2 15 14 3 4 20
1 1 1 1 0,5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0,5 1 1 1
1 1 1 1 0,25 1 0,5 0,5 0,5 0,5 1 1 1 1 0,25 0,5 1 1
In deze thesis werd gebruik gemaakt van een nieuwe nomenclatuur voor de BV subfamilies volgens Rowen et al (46). Voor de volledigheid werd ook de oude VB nomenclatuur weergegeven volgens Wei et al (47).
Om de specificiteit en gevoeligheid van de geoptimaliseerde PCR reactie te testen werd het TCR BV gebruik gemeten in niet-gestimuleerde PBMC en in TSST gestimuleerde PBMC van een gezonde controle (Fig.15). Hiervoor werden PBMC gestimuleerd met TSST gedurende 6 dagen waarna de cellen gepelleteerd werden. De BV expressie werd gemeten van het
34
gesynthetiseerde cDNA van de cellen, via de Lightcycler BV analyse. De expressie van de BV genen werd relatief t.o.v de totale BV expressie uitgezet (zie materiaal en methode). De BV gen expressie in niet-gestimuleerde PBMC vertoonde een breed BV gen gebruik vergeleken met deze van de TSST gestimuleerde PBMC. In de TSST gestimuleerde PBMC was er een BV20 (VB 2) expressie van 53% t.o.v de totale BV gen expressie zichtbaar. De relatieve BV5 en BV7 expressie was respectievelijk 28% en 7%. De relatieve expressie van de andere BVs was kleiner dan 3% (Fig.15).
% BV gen expressie
60 50 40 30 20 10
B V 2 B V 3 B V 4 B V 5 B V 6 B V B 7 V 1 B 0 V 1 B 1 V 1 B 2 V 1 B 4 V 1 B 5 V 1 B 9 V 2 B 0 V 2 B 4 V 2 B 7 V 2 B 8 V 2 B 9 V 30
0
Niet gestimuleerde PBMC
TSST gestimuleerde PBMC
Figuur 15. TCR BV gen expressie profiel van niet- en TSST gestimuleerde PBMC. De PBMC werden in kweek gebracht in de aan- of afwezigheid van het superantigen TSST. Na 6 dagen in kweek werd het RNA van de cellen geïsoleerd waaruit cDNA werd gesynthetiseerd. De BV gen expressie in de cDNA stalen werd via de Lightcycler geanalyseerd. De expressie van elk individueel TCR BV gen wordt gepresenteerd als een percentage van de totale BV gen expressie.
Vervolgens werd het TCR BV gen repertoire van een artificieel mengsel bestaande uit een PBMC mix (cDNA van 6 HC) en een Jurkat T-cel kloon bepaald. Deze Jurkat cellen zijn geïmmortaliseerde T-cellen die BV12 tot expressie brengen. De PBMC werd gemengd met de Jurkat T-cellen aan de ratio’s 1:1 en 1:4 en het TCR BV gen profiel van deze artificiële celpopulatie werd vergeleken met deze van de Jurkat cellen en PBMC mix alleen (Fig.16).
De relatieve expressie BV12 was positief gecorreleerd met de hoeveelheid Jurkat cellen in de gemengde populatie. Het TCR BV12 cDNA vertegenwoordigde 54% van de totale TCR cDNA pool in het 100% Jurkat staal, 42% in de 1:4 mengsel van de PBMC /Jurkat cellen, 23% in de 1:1 mix van de PBMC / Jurkat cellen en 17% van de PBMC mix alleen (Fig.16).
35
% BV gen expressie
60 50 40 30 20 10
75% Jurkat-PBMC
30
29
BV
27
BV
25
BV
24
BV
20
BV
19
BV
15
BV
14
50% Jurkat-PBMC
BV
BV
12
11
BV
10
BV
7
100% PBMC
BV
5
4
3
6
BV
BV
BV
BV
BV
BV
2
0
100% Jurkat
Figuur 16. TCR BV gen repertoire van Jurkat cellen gemengd met verschillende proporties cDNA PBMC mix. Analyse van het TCR BV repertoire van een 100% PBMC mix (50 ng/µl), 75% en 50% Jurkat-PBMC mix (50 ng/µl) en een 100% Jurkat (50 ng/µl) via de Lightcycler. De expressie van elk individueel TCR BV gen wordt gepresenteerd als een percentage van de totale BV gen expressie.
Uit deze resultaten kon geconcludeerd worden dat de geoptimaliseerde BV real-time PCR analyse een gevoelige en specifieke techniek is om overgerepresentateerde BV subfamilies te detecteren in een T-cel populatie.
36
4. Discussie Zowel diermodellen voor auto-immuniteit als in vitro studies hebben experimentele bewijzen geleverd voor het bestaan van een natuurlijk voorkomende populatie CD4+ CD25+ Foxp3+ Tcellen (Tregs). Deze T-cellen zijn belangrijk voor het behoud van zelf-tolerantie door de onderdrukking van de activatie en proliferatie van autoreactieve T-cellen aanwezig in de periferie. Myeline reactieve T-cellen circuleren aan dezelfde frequentie in het perifere bloed van gezonde personen en MS-patiënten. Er is echter een verhoogde frequentie van geactiveerde myeline reactieve T-cellen in RR-MS-patiënten aanwezig. Een verstoring in de Tregs van deze patiënten, zoals recent aangetoond (25), kan mogelijk bijdragen tot een insufficiënte immunoregulatie van deze autoreactieve T-cellen. In deze studie werd op zoek gegaan naar fenotypische en functionele verschillen tussen Tregs van HC en MS-patiënten.
Onze resultaten tonen aan dat Tregs van HC, RR-MS patiënten en SP-MS patiënten fenotypisch op elkaar gelijken betreffende de expressie van relevant activatie-, differentiatieen adhesie moleculen. Er was echter een significant hoger aantal CD4+ CD25hi CD49hi Tcellen aanwezig in SP-MS patiënten vergeleken met het aantal in HC. Wat de suppressie capaciteit van Tregs t.o.v. myeline reactieve T-cellen in HC betreft, waren Tregs enkel in staat om MBP reactieve T-cellen te onderdrukken bij een lage stimulus reactiviteit. Om metingen omtrent het TCR BV gen gebruik te kunnen uitvoeren in Tregs van HC en MS-patiënten, werd in deze thesis een real-time PCR reactie voor het meten van expressie van BV genen geoptimaliseerd.
Een eerst doel in dit onderzoek was het expressiepatroon van relevante activatie-, adhesie- en differentiatie merkers op Tregs van HC te vergelijken met de expressie op MS-patiënten d.m.v flow cytometrie. Eerst werd de frequentie van merkers op Tregs en conventionele Tcellen vergeleken in HC. Omdat Foxp3 de meest relevante merker is voor de isolatie en karakterisatie van Tregs werd de expressie op CD4+ Foxp3+ T-cellen bestudeerd (27). Hiernaast werd ook gekeken naar de expressie van CD4+ CD25hi T-cellen aangezien de meerderheid van deze cellen Foxp3 tot expressie brengen met een hoge intensiteit en een sterke suppressieve activiteit vertonen (25). Zoals in de literatuur wordt aangegeven beschikten de Tregs over een sterk geactiveerd/geheugen karakter (CD25, CD45RO, CTLA4, GITR) in vergelijking met conventionele T-cellen in HC (24). Uit de experimentele data
37
was ook af te leiden dat er in de periferie van HC en MS-patiënten een naïve Treg populatie (CD45RA+ Foxp3+ CD4+ T-cellen) aanwezig is. Deze bevinding is in overeenstemming met de recente studie van Valmori et al waarin CD4+ Foxp3+ CD45RA+ CD4RO- T-cellen werden geïdentificeerd, genaamd natuurlijke naïve Tregs, in humaan perifeer bloed. Deze populatie werd omschreven als een naïve precursor van de natuurlijk voorkomende Tregs die reeds in contact gekomen zijn met antigen (48). Door te kijken naar de expressie van relevante adhesie moleculen op CD4+ Foxp3+ T-cellen en CD4+ CD25hi T-cellen Tregs kon meer informatie omtrent het migratiepatroon van deze cellen bekomen worden. Er kon inzicht verkregen worden in het feit of deze regulatoire Tcellen enkel recirculeren in de lymfeknopen om er naïve T-cellen te onderdrukken of dat deze cellen eveneens in staat zijn om te migreren naar inflammatoire plaatsen om er geactiveerde T-cellen te onderdrukken. Het integrine αEß7 (CD103), dat instaat voor de migratie naar inflammatoire gebieden (49), kwam in HC meer tot expressie op Tregs vergeleken met nietregulatoire T-cellen. Er was geen verschil in de expressie van de hyaluronzuur receptor (CD44), betrokken in celadhesie en migratie, tussen de regulatoire en conventionele T-cellen (33). Dit gold ook voor de homingreceptor CD62L welke tot expressie wordt gebracht op naïve T-cellen voor recirculatie van het bloed naar de lymfeknopen (34). Het percentage Tregs dat het adhesie molecule VLA-4 (CD49d) tot expressie bracht, was significant lager dan voor conventionele T-cellen. Aangezien VLA-4 belangrijk is voor de migratie naar het CZS, kan dit mogelijk een invloed hebben op de migratiecapaciteit naar de plaats van ontsteking (50). In overeenstemming met andere studies vertoonden de Tregs uit MSpatiënten geen significante verschillen in de frequentie van differentiatie (CD45RO, CD45RA, CD27) en activatie merkers (CD25, iCTLA4, GITR) vergeleken met HC (25,51). De RR-MS patiënten en SP-MS patiënten hadden t.o.v HC echter significant meer CD4+ Foxp3- iCTLA4+ T-cellen wat mogelijk wijst op een hoger aantal geactiveerde T-cellen in deze patiënten als gevolg van een aanwezige inflammatie. Er was een verlaagde expressie van L-selectine op de T-cellen in SP-MS patiënten. Dit gegeven moet echter met enige voorzichtheid worden geïnterpreteerd aangezien deze data afkomstig zijn van 1 SP-MS patiënt. Er werd een verhoogde expressie van CD49dhi op CD4+ CD25hi T-cellen en CD4+ CD25- T-cellen van RR-MS patiënten en SP-MS patïenten gedetecteerd. In een studie werd aangetoond dat deze merker, betrokken in migratie van T-cellen naar het CZS, verhoogd tot expressie komt op het T-cel oppervlakte tijdens MS opflakkeringen (relapsen) (52). In een klinische studie werd recent aangetoond dat toediening van een monoklonaal antilichaam 38
gericht tegen CD49d, (Natalizumab), aan MS-patiënten leidt tot een reductie in het aantal inflammatoire lesies in de hersenen bij deze patiënten (53). Nadelig aan deze behandeling is dat er ook een vermindering in de migratie van CD4+ Foxp3+ CD49hi T-cellen (Tregs) naar de hersenen zal optreden waardoor autoreactieve T-cellen er minder onderdrukt kunnen worden. In overeenkomst met Hänninen et al werd er geen significante verhoging gedetecteerd in de expressie van de hyaluronzuur receptor (CD44) op T-cellen, afkomstig van MS-patiënten in de remitting fase, tijdens deze fase (52). In ons opzet kon, wegens technische redenen, de expressie van de merkers CD103, GITR, CD62L en CD44 op CD4+ Foxp3+ en CD4+ Foxp3T-cellen niet betrouwbaar bepaald worden van verschillende MS-stalen. Er werd dan ook geopteerd om deze data (van de MS-patiënten en HC) weg te laten in de figuur (°6). Een belangrijke opmerking hierbij is dat voor de stalen van een aantal MS-patiënten de fenotypische analyse werd uitgevoerd op PBMC stalen die gedurende een korte tijd ingevroren waren in vloeibare stikstof (N2). De analyses van de HC daarentegen werden allemaal uitgevoerd op vers geïsoleerde PBMC. Dit verschil kan mogelijk een effect hebben op de expressie van de geanalyseerde merkers. Om de bekomen gegevens te bevestigen zijn bijkomende analyse experimenten van Tregs in HC en MS-patiënten noodzakelijk.
Het tweede luik van deze studie had als doel de Treg suppressieve capaciteit t.o.v. myeline reactieve T-cellen te bestuderen in HC en MS-patiënten. Hiervoor werd, d.m.v een CFSE assay, de kinetiek van de myeline reactiviteit van CD4+ T-cellen en CD8+ T-cellen uit PBMC voor en na CD25 (Treg) depletie bestudeerd in HC. Deze myeline reactiviteit werd vergeleken met deze van geïsoleerde CD4+ T-cellen en CD4+ CD25- T-cellen (Treg gedepleteerd) in HC. Voorafgaand werd de CD25+ T-cel (Treg) depletie gecontroleerd door de expressie van CD25 op de CD4+ T-cellen (uit de PBMC en opgezuiverde CD4+ T-cellen) te meten via flow cytometrie. Er werd een onderscheid gemaakt tussen CD25int T-cellen en CD25high T-cellen. Omdat de CD25high T-cellen, welke 1-3% uitmaken van de CD4+ T-cellen, de sterkste suppressie capaciteit vertonen werd voornamelijk gekeken naar de depletie van deze cellen (25). Onze resultaten gaven aan dat zowel in de PBMC als CD4+ T-cellen er een zuivere depletie van de CD4+CD25hi T-cellen bekomen werd. De CD4+ (CD25-) T-cellen vertoonden in vergelijking met de PBMC (CD25-) echter een meer optimale depletie van de CD4+ CD25int T-cellen. Dit is mogelijk te verklaren doordat B-cellen, NK-cellen en geactiveerde CD8+ T-cellen die CD25 ook tot expressie brengen, aanwezig zijn in de PBMC fractie en hierdoor kunnen interageren met de CD25 depletie uit de CD4+ T-cellen.
39
In vergelijking met 3H-thymidine is labeling met CFSE een significant gevoeligere methode om celproliferatie te detecteren waarbij het fenotype van de proliferende cellen achterhaald kan worden en rekening gehouden kan worden met dode cellen via 7AAD+ kleuring. Deze techniek laat in tegenstelling tot 3H- thymidine incorporatie, waar enkel de proliferatie van de cellen aan het einde van de celkweek gemeten kan worden, ook toe om het totale aantal gedeelde cellen (gedurende de volledige celkweek) op te volgen (54). Een belangrijk verschil tussen het opzet met de PBMC en aangerijkte CD4+ T-cellen is dat antigen gepulste en bestraalde PBMC vereist zijn voor antigen presentatie in het opzet met aangerijkte CD4+ Tcellen, in tegenstelling tot de opzet met PBMC en CD25 gedepleteerde PBMC. Het opzet met de aangerijkte CD4+ T-cellen en de CD4+ CD25- T-cellen geeft echter een accurater beeld van de antigen reactiviteit van de CD4+ responder cellen, doordat de aanwezige bestraalde PBMC geen delingscapaciteit meer hebben (en waarschijnlijk minder cytokines vrijzetten) waardoor er geen interferentie is met de proliferatie van de responder cellen. De CD8+ T-cellen uit de PBMC voor en na Treg depletie vertoonden geen tot weinig myeline respons. Dit kan verklaard worden door het feit dat CD8+ T-cellen antigen krijgen gepresenteerd via MHC I moleculen. Deze antigenen worden via de intracellulaire cytolytische pathway geprocessed in tegenstelling tot de CD4+ T-cellen welke antigen gepresenteerd krijgen via de endocytotische pathway (2). In het opzet met de opgezuiverde CD4+ T-cellen was er geen MOGgeïnduceerde CD4+ T-cel proliferatie merkbaar. De afwezige MOG respons kan het gevolg zijn van een (donor afhankelijk) lager aantal MOG-reactieve T-cellen in de CD4+ Tcelpopulatie daar eerdere studies hebben aangetoond dat de frequentie van MOG reactieve Tcellen tussen verschillende HC sterk kan variëren (55). In de tweede donor was de MBP en MOG reactiviteit in de totale CD4+ T-celpopulatie lager dan de proliferatie van de CD4+ CD25- T-cellen, wat er indirect op wijst dat de Tregs in de CD4+ T-celpopulatie deze myeline responsen onderdrukten. In de eerste donor werd er geen MOG reactiviteit van de CD4+ CD25- T-cellen gedetecteerd en was de MBP geïnduceerde proliferatie in beide celpopulaties even sterk. Dit kan erop wijzen dat naast de CD25+ Tregs er nog andere regulatoire mechanismen in het lichaam belangrijk zijn voor de onderdrukking van myeline reactieve Tcellen (3). Ondanks de Treg gemedieerde suppressie van de myeline reactiviteit in de tweede donor werd er met betrekking op het controle antigen TT geen Treg activiteit aangetoond. Dit kan verklaard worden doordat TT een lichaamsvreemd antigen is waartegen een sterke immunologische geheugen respons gericht is (via vaccinatie). De Tregs zijn waarschijnlijk niet in staat om deze sterke respons te onderdrukken (56). Wegens technische problemen en tijdsgebrek werd er enkel een vergelijking gemaakt tussen de antigen reactiviteit van CD4+ T40
cellen uit PBMC en opgezuiverde CD4+ T-cellen in de aan- en afwezigheid van Tregs in HC. Toekomstige studies moeten uitwijzen of Tregs van MS-patiënten een verminderd onderdrukkend effect vertonen t.o.v myeline reactieve cellen. Binnen de CD25- T-celpopulatie werd er gekeken naar de naïve en geheugen myeline respons. Hiervoor werd de myeline reactiviteit van CD4+ T-cellen, CD4+ CD25- CD45RA+ (naïve) Tcellen en CD4+ CD25- CD45RA- (geheugen) T-cellen bestudeerd in HC d.m.v dezelfde assay. In tegenstelling tot onze verwachtingen was er een lage respons van de naïve responder cellen in de MBP en MOG condities, evenals was de MBP geïnduceerde proliferatie hoger in de CD4+ T-cellen in vergelijking met de CD4+ CD25- (CD45RA+ en CD45RA- T-cellen). Een mogelijke verklaring voor dit resultaat is het verschil in intensiteit van het CFSE signaal tussen de 3 celpopulaties dat gedetecteerd werd om een nog ongekende reden (data niet weergegeven). Een te hoge CFSE labeling kan immers een toxisch effect hebben op de gelabelde cellen (45). Een alternatieve verklaring is het feit dat de CD4+ T-cellen werden geïsoleerd met Rossettesep tot een zuiverheid van 90%. Deze CD4+ T-cellen werden niet verder opgezuiverd d.m.v FACS-sorting in tegenstelling tot de CD4+ CD25- CD45RA+ Tcellen en CD4+ CD25- CD45RO+ T-cellen (± 99% zuiver) waardoor de experimentele condities niet volledig gelijk waren voor de 3 celpopulaties. De lage respons van de CD4+ CD25- CD45RA+/- T-cellen kan het gevolg zijn van het FACS-Sorting waarbij deze cellen, die tijdens het sorten onder hoge druk komen te staan, tijd nodig hebben om te herstellen. Voor toekomstige experimenten is het beter om de CD4+ T-cellen ook verder op te zuiveren via FACS-Sorting (57). Opvallend in onze bevindingen was dat de CD4+ CD25- CD45RA- Tcellen naast een sterk verwachte TT geïnduceerde proliferatie ook deelde na MBP stimulatie. De exacte rol van de myeline reactieve T-cellen is nog niet volledig opgehelderd in de MSpathologie aangezien deze cellen naast pro-inflammatoire effecten ook een beschermend effect kunnen uitoefenen door secretie van neurokines (58,59). Of er een selectieve suppressie is van deze myeline reactieve T-cellen zal verder onderzocht moeten worden. Mogelijk is deze afhankelijk van de immunologische context zoals de aan- of afwezigheid van pro- en anti-inflammatoire cytokines. Omdat de verkregen resultaten afkomstig zijn van één HC is verder onderzoek op HC en MS patiënten vereist om informatie omtrent de myeline reactiviteit van de naïve responder T-cellen en memory responder T-cellen te verkrijgen. Om MBP en TT-reactieve T-cel klonen te verkrijgen, werden levende (7AAD-) MBP en TT reactieve CFSElow CD4+ T-cellen gesorteerd aan 1, 5 en 10 cellen/well in een 96 well plaat in 41
de aanwezigheid van PBMC, PHA en IL-2. Eveneens werden niet MBP en TT reactieve T cellen (CFSEhigh) gesorteerd. Sterk uitgegroeide T cel klonen werden gescreend voor hun antigen reactiviteit d.m.v een split well assay. Uit de resultaten van het kloneringsexperiment kon geconcludeerd worden dat de kloneringsfrequentie positief gerelateerd was aan de kloneringsdensiteit (aantal cellen uitgesorteerd per well). Dit is te verklaren doordat de kans dat er een cel doorgroeit in de condities met 10 en 5 cellen/well groter is dan deze in de conditie met 1 cel/well. De T-celklonen uit de MBP reactieve CFSElow T-cellen waren tegen onze verwachtingen in niet MBP reactief. Opvallend in de screening van deze T-celklonen was de hoge achtergrondproliferatie, wat het gevolg kan zijn van een niet optimale afname van het supernatans, met daarin IL-2, vóór het opzetten van de screening. Een gedeelte van de TT reactieve CFSElow T-celklonen waren wel antigen (TT) reactief. De reactiviteit was omgekeerd evenredig met de kloneringsdensiteit. Dit was gedeeltelijk tegen de verwachtingen in aangezien de CFSElow gesorteerde T-cellen reeds antigen reactiviteit zouden moeten vertonen (60). De screening van de MBP CFSElow T-celklonen zal zeker herhaald moeten worden maar wegens tijdsgebrek was dit niet meer mogelijk voor deze studie.
Door MBP reactieve T-celklonen in cocultuur te brengen met Tregs aan verschillende ratio’s kon na stimulatie de suppressieve eigenschap van Tregs t.o.v myeline reactieve T-cellen op een directe manier geëvalueerd worden. De bekomen data toonden aan dat Tregs in staat zijn om MBP reactieve T-cellen gedeeltelijk te onderdrukken. Wanneer MBP gepulste en bestraalde PBMC werden toegevoegd als stimulus werd er een onderdrukking van maximaal 8% in kloon 7A waargenomen. Zonder de aanwezigheid van Tregs vertoonde deze kloon een absolute proliferatie van 89% welke 50% hoger was dan kloon 4. Mogelijk was de proliferatie van kloon 7A te hoog om suppressieve activiteit van Tregs te kunnen waarnemen bij een 1:1 ratio. Wegens praktische redenen (beperkt aantal CD25hi T-cellen na sorting) konden er geen hogere Treg/responder ratio’s toegevoegd worden in de cocultuur. De klonen werden in dezelfde ratio’s in kweek gebracht met Tregs en polyclonaal gestimuleerd met anti-CD3 Ab en bestraalde PBMC waardoor de Tregs zeker gestimuleerd werden aangezien activatie via hun TCR vereist is om hun suppressiecapaciteit te kunnen uitoefenen. Onder deze conditities was eveneens de Tregs suppressie capaciteit omgekeerd evenredig met de proliferatie capaciteit
van
de
MBP
reactieve
T-cel
klonen.
Ter
controle
van
de
Treg
onderdrukkingscapaciteit werden ook CD4+ CD25- T-cellen in cocultuur gebracht met Tregs aan verschillende ratio’s en gestimuleerd d.m.v anti-CD3 Ab. Zoals eerder aangetoond in de studie van Venken et al waren de Tregs in staat om polyclonaal gestimuleerde CD4+ CD25- T42
cellen dosis afhankelijk te onderdrukken na activatie met anti-CD3 Ab (25). Er was een sterkere Treg gemedieerde suppressie van de CD4+ CD25- T-cellen vergeleken met de antiCD3 gestimuleerde MBP reactieve T-celklonen wat mogelijk te verklaren is door het naïve karakter van de CD4+ CD25- T-cellen. De MBP reactieve T-celklonen waren reeds gedurende lange tijd geactiveerd en in kweek gebracht waardoor deze cellen een gedifferentieerd fenotype vertoonden. In toekomstig onderzoek zou dit experiment toegepast moeten worden op klonen van verschillende HC om een beter idee te krijgen over de suppressie capaciteit van Tregs t.o.v. myeline reactieve T-cellen. Dit experiment zou in de toekomst ook uitgevoerd kunnen worden op bloedstalen van MS-patiënten om te achterhalen of afwijkingen in Tregs van deze patiënten leiden tot een verminderde suppressie van myeline reactieve T-cellen.
In het laatste onderzoeksdoel werd op zoek te gaan naar eventuele afwijkingen in het TCR BV gen gebruik in Tregs van MS-patiënten, vergeleken met deze in HC. De afwijkingen zouden kunnen wijzen op een verstoring in de ontwikkeling van de Tregs of zouden het gevolg kunnen zijn van clonale expansies van antigen specifieke Tregs als gevolg van de pathologie (40). Vooraleer de TCR BV expressie in stalen kon worden gemeten d.m.v real-
time PCR (Lightcycler), werden de PCR condities geoptimaliseerd (annealingstemperatuur, MgCl2 concentratie, primerconcentratie). Om de specificiteit van de geoptimaliseerde PCR reactie te testen werd het TCR BV gebruik gemeten in niet-gestimuleerde PBMC en in TSST gestimuleerde PBMC van een gezonde controle. Zoals verwacht, vertoonden de PBMC (van HC) een breed TCR BV repertoire (61). Na TSST stimulatie was er zoals verwacht een aanrijking van de relatieve BV20 en BV5 expressie zichtbaar (62). TSST is een superantigen dat leidt tot expansie van T-cellen op een BV afhankelijke wijze. Daarnaast kon er ook een BV12 opregulatie gedetecteerd worden in het 100% Jurkat staal. De bijdrage van BV12 was, in overeenstemming met een eerder uitgevoerde studie, gecorreleerd met een dalende hoeveelheid Jurkat cellen in de PBMC mix (63). Dit wees erop dat de PCR TCR BV analyse gevoelig genoeg was om overgerepresentateerde BV genen te detecteren. Reeds andere technieken werden beschreven in de literatuur om informatie te bekomen van het TCR BV gen gebruik in een T-celpopulatie. Onze techniek heeft echter een aantal voordelen t.o.v deze beschreven technieken. Zo kan er d.m.v de PCR-ELISA techniek geen kwantificatie van de TCR gen expressie gebeuren. In vergelijking met de PCR-ELISA techniek heeft de real-time PCR (LC) ook als voordeel dat er geen post-PCR technieken moeten worden uitgevoerd en het minder tijdsrovend is aangezien data bekomen worden binnen enkele uren (in tegenstelling tot 2 dagen voor de PCR-ELISA) (62,63). Informatie omtrent het TCR BV gen 43
gebruik kan ook bekomen worden d.m.v FACS kleuring. Hierbij wordt het TCR BV gebruik bestudeerd op eiwit niveau door gebruik te maken van monoklonale antilichamen gericht tegen verschillende BV families. Doordat antilichamen gericht tegen andere oppervlakte merkers kunnen worden meegenomen in het opzet kan er via gates geselecteerd worden op het te onderzoeken celtype en op levende cellen. Aangezien er slechts van een beperkt aantal BV subfamilies Ab commercieel beschikbaar zijn, kan slechts 60% van de TCR BV families via deze techniek gedetecteerd worden (40). Door tijdsgebrek konden er geen BV analyses uitgevoerd worden op Tregs van HC en MS-patiënten. Recente gegevens wijzen erop dat CD4+ CD25+ Foxp3+ T-cellen van HC een zeer divers TCR BV gebruik vertonen (41). Over het TCR BV gebruik van Tregs in MS-patiënten zijn er echter nog geen resultaten gepubliceerd. Studies naar het TCR BV gen van Tregs geïsoleerd uit patiënten met Sjögren’s syndrome, vertoonden een polyclonaal niet gerestricteerd BV repertoire. Hierbij moet wel opgemerkt worden dat de Tregs van deze patiënten een normale suppressie capaciteit vertoonden (64). Dit gegeven maakt het interessant om het BV repertoire van Tregs uit RRMS patiënten te bestuderen aangezien deze een verstoorde suppressie capaciteit vertonen.
In conclusie geeft deze studie aan dat Tregs en conventionele T-cellen in MS-patiënten afwijkingen vertonen in de expressie van adhesiemoleculen wat kan bijdragen tot de MSpathologie. Tregs in HC blijken in staat blijken te zijn om in vitro de proliferatie van myeline reactieve T-cellen te onderdrukken. Echter is analyse van deze regulatoire T-cellen in MSpatiënten, met betrekking op de suppressie capaciteit, t.o.v myeline reactieve T-cellen, zeker vereist. Dit zou kunnen leiden tot nieuwe inzichten omtrent de behandeling van MS. De TCR BV PCR kon worden geoptimaliseerd waardoor in de toekomst BV gen analyses kunnen worden uitgevoerd op Tregs van HC en MS-patiënten.
44
Literatuurlijst (1) Hellings N, Raus J, Stinissen P. Insights into the immunopathogenesis of Multiple Sclerosis. Immunologic Research 2002; 25/ p.1: 27-51. (2) Sospedra M, Martin R. Immunology of Multiple Sclerosis. Annu.Rev.Immunol.2005; 23: p.683-747. (3) Jiang H, Chess L. An integrated view of suppressor T cell subsets in immunoregulation. The Journal of Clinical investigation 2004; 114: p.1198-1208. (4) Takahama Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature reviews immunology 2006; 6: p.127-35. (5) Harber M, Sundstedt A, Wraith D. The role of cytokines in immunological tolerance: potential for therapy. Expert reviews in molecular medicine 2000; p.1-20. (6) Tang Q, Henriksen J, Boden K, Tooley J, Ye J. Cutting Edge: CD28 controls peripheral homeostasis of CD4+CD25+ regulatory T cells. The journal of Immunology 2003; 171: p. 3348-52. (7) Sakaguchi S. Naturally arising Foxp3-expressing CD25+ CD4+ regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self. Nature Immunology 2005; 6: p. 345-52. (8) Takahashi T, Kuniyasu Y, Toda M, Sakaguchi N. Immunologic self-tolerance maintained by CD25+ CD4+ naturally anergic and suppressive T cells: induction of autoimmune disease by breaking their anergic/suppressive state. International Immunology 1998; 10: p.1969-80. (9) Iellem A, Mariani M, Lang R, Recalde H, Panina-Bordignon P, et al. 2001. Unique chemotactic response profile and specific expression of chemokine receptors CCR4 and CCR8 by CD4+ CD25+ regulatory T cells. J. Exp. Med. 194: p.847-53. (10)
Takahashi T, Tagami T, Yamazaki S, Uede T, Shimizu J, et al. 2000. Immunologic self tolerance maintained by CD25+ CD4+ regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic lymphocyte-associated antigen 4. J. Exp. Med. 192: p.303-10.
(11)
Salomon B, Lenschow DJ, Rhee L, Ashourian N, Singh B, et al. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+ CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity 2000; 12: p.431-40.
(12) Salomon B, Bluestone JA. Complexities of CD28/B7: CTLA-4 costimulatory pathways in autoimmunity and transplantation. Annu. Rev. Immunol. 2001; 19: p.225-52. (13) Shimizu J, et al. Stimulation of CD25+ CD4+ regulatory T cells through GITR breaks immunological selftolerance. Nat. Immunol 2002; 3: p.135-42. (14) Stephens GL, McHugh RS, Whitters MJ, et al. Engagement of glucocorticoid-induced TNFR familyrelated receptor on effector T cells by its ligand mediates resistance to suppression by CD4+ CD25+ T cells. J Immunol 2004; 173: p.5008-20. (15)
Haiying L, Komai-Koma M, Xu D, Liew Y. Toll-like receptor 2 signaling modulates the functions of CD4+ CD25+ regulatory T cells. PNAS 2006; 103: p.7048-53.
(16)
Caramalho I, Lopes-Carvalho T, Ostler D, Zelenay S, Haury M, Demengeot J. Regulatory T cells selectively express toll-like receptors and are activated by lipopolysaccharide. J. Exp. Med. 2003; 197: p.403-11.
(17)
Thornton AM, Shevach EM. CD4+ CD25+ immunoregulatory T cells suppress polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production. J. Exp. Med. 1998; 188: p.287-96.
45
(18)
Asseman C, Mauze S, Leach MW, Coffman RL, Powrie F. An essential role for interleukin 10 in the function of regulatory T cells that inhibit intestinal inflammation. J. Exp. Med. 1999; 190: p.995-1004.
(19)
Powrie F, Carlino J, Leach MW, Mauze S, Coffman RL. A critical role for transforming growth factorbeta but not interleukin 4 in the suppression of T helper type 1-mediated colitis by CD45RBlow CD4+ T cells. J. Exp. Med. 1996; 183: p.2669-74.
(20)
Piccirillo CA, Letterio JJ, Thornton AM, et al. CD4+ CD25+ regulatory T cells can mediate suppressor function in the absence of transforming growth factor ß1 production and responsiveness. J. Exp. Med. 2002; p.196: p.237-46.
(21)
Nakamura K, Kitani A, Strober W. Cell contact-dependent immuno-suppression by CD4+ CD25+ regulatory T cells is mediated by cell surface-bound transforming growth factor beta. J. Exp. Med. 2001; 194: p.629-44.
(22)
Cederbom L, Hall H, Ivars F. CD4+ CD25+ regulatory T cells downregulate co-stimulatory molecules on antigen-presenting cells. Eur. J. Immunol. 2000; 30; p.1538-43.
(23)
Thornton A, Shevach E. Suppressor effector function of CD4+ CD25+ immunoregulatory T cells is antigen nonspecific. J. Immunol. 2000; 164: p.182-190.
(24)
Wing K, Ekmark A, Karlsson H, Rudin A, Suri-Payer E. Characterization of human CD25+ CD4+ T cells in thymus, cord and adult blood. Immunology 2002; 106: p.190-9.
(25) Venken K, et al. Secondary progressive in contrast to relapsing-remitting multiple sclerosis patients show a normal CD4+ CD25+ regulatory T cell function and FOXP3 expression. Journal of Neuroscience Research 2006; p.1-50. (26)
Tsaknaridis L, Spencer L, Culbertson N, et al. Functional assay for human CD4+ CD25+ Treg cells reveals an age-dependent loss of suppressive activity. Journal of neuroscience research 2003; 74: p.296-308.
(27)
Roncador G, Brown J, Maestre L, Hue S, Martinez-Torrecuadrada L, et al. Analysis of Foxp3 protein expression in human CD4+ CD25+ regulatory T cells at the single-cell level. European Journal of Immunology 2005; 35: p.1681-91.
(28)
Zelenay S, Lopes-Carvalho T, Caramalho I, Moraes-Fontes M et al. Foxp3+ CD25– CD4+ T cells constitute a reservoir of committed regulatory cells that regain CD25 expression upon homeostatic expansion. PNAS 2005; 102: p.4091-96.
(29)
Schubert A, Jeffery E, Zhang Y, et al. Scurfin (FOXP3) acts as a repressor of transcription and regulates T cell activation. J. Biol. Chem 2001; 276; p.37672-79.
(30)
Gambineri E, Torgerson TR, Ochs HD. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy and Xlinked inheritance (IPEX), a syndrome of systemic autoimmunity caused by mutations of FOXP3, a critical regulator of T-cell homeostasis. Curr. Opin Rheumatol 2003; 15: p.430-5.
(31)
Walker M, Kasprowicz D, Gersuk V, Benard A et al. Induction of FoxP3 and acquisition of T regulatory activity by stimulated human CD4+CD25- T cells. J. Clin Invest. 2003; 112: p.1437-43.
(32)
Huang C, et al. Role of LAG-3 in regulatory T-cells. Immunity 2004; 21(4): p.503-13.
(33)
Firan M, Dhillon S, Estess P, Siegelman H. Suppressor activity and potency among regulatory T cells is discriminated by functionally active CD44. Blood 2006; 107: p.619-27.
(34) Ermann J, Hoffman P, Edinger M, Dutt S, et al. Only the CD62L+ subpopulation of CD4+ CD25+ regulatory T cells protects from lethal acute GVHD. Blood 2005; 105: p.2220-26. (35) Ruprecht R, Gattorno M, Ferlito F, Gregorio A, et al. Coexpression of CD25 and CD27 identifies FOXP3+ regulatory T cells in inflamed synovia. JEM 2005; 201 (11): p.1793-1803.
46
(36)
Itoh M, Takahashi T, Sakaguchi N, Kuniyasu Y, Shimizu J, et al. Thymus and autoimmunity: production of CD25+ CD4+ naturally anergic and suppressive T cells as a key function of the thymus in maintaining immunologic self-tolerance. J. Immunol. 1999; 162: p.5317-26.
(37) Jordan MS, Boesteanu A, Reed AJ, et al. Thymic selection of CD4+ CD25+ regulatory T cells induced by an agonist self-peptide. Nat Immunol. 2001; 2: p.301-6. (38)
Bensinger SJ, Bandeira A, Jordan MS, Caton AJ, Laufer TM. Major histocompatibility complex class IIpositive cortical epithelium mediates the selection of CD4+ CD25+ immunoregulatory T cells. Exp. Med. 2001; 194: p.427-38.
(39)
Sato K, Yamashita N, Baba M, Matsuyama T. Modified myeloid dendritic cells act as regulatory dendritic cells to induce anergic and regulatory T cells. Blood 2003; 101: p.3581-89.
(40) Fujishima M, Hirokawa M, Fujishima N, Sawada K. TCRαß repertoire diversity of human naturally occurring CD4+ CD25+ regulatory T cells. Immunology Letters 2005; 99: p.193-197. (41)
Kasow A, Chen X, Knowles J, Wichlan D, Handgretinger R, Riberdy M. Human CD4+ CD25+ regulatory T cells share equally complex and comparable repertoires with CD4+ CD25- counterparts. J Immunol. 2004; 172: p.6123-28.
(42)
Zhang J, Markovic-Plese S, et al. Increased frequency of interleukin 2-responsive T cells specific for myelin basic protein and proteolipid protein in peripheral blood and cerebrospinal fluid in patients with multiple sclerosis. J Exp Med 1994; 179: p.973-84.
(43)
Viglietta V, Baecher-Allan C, Weiner L, Hafler A. Loss of functional suppression by CD4+ CD25+ regulatory T cells in patients with multiple sclerosis. J. Exp. Med 2004; 199 (7): p.971-9.
(44)
Huan J, Culbertson N, Spencer L, et al. Decreased FOXP3 levels in multiple sclerosis patients. J. Neurosci Res. 2005; 81 (1): p.45-52.
(45)
Lyons B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. Journal of Immunological Methods 2000; 243: p.147-54.
(46)
Rowen L, Koop B, Hood L. The complete 685-Kilobase DNA Sequence of the Humanß T cell receptor locus. Science 1996; 272: p.1755-1762.
(47)
Wei S, Charmley P, Robinson M, Concannon P. The extent of the human germline T-cell receptor V beta gene segment repertoire. Immunogenetics 1994; 40: p.27-36.
(48)
Valmori D, Merlo A, Souleimanian E et al. A peripheral circulating compartment of natural naïve CD4+ Tregs. The Journal of Clinical Investigation 2005; 115: p.1953-62.
(49)
Huehn J, Siegmund K, Lehmann J et al. Developmental stage, phenotype and migration distinguish naive and effector/ memory-like CD4 regulatory T cells. J. Exp Med 2004; 199: p.303-313.
(50)
Valjkoczy P, Laschinger M, Engelhardt B. Alpha 4-integrin-VCAM-1 binding mediates G proteinindependent capture of encephalitogenic T cell blasts to CNS white matter microvessels. J. Clin. Invest. 2001; 108: p.557-65.
(51) Putheti P, Pettersson A, Soderstrom M et al. Circulating CD4+ CD25+ T regulatory cells are not altered in multiple sclerosis and unaffected by disease modulating drugs. Journal of clinical immunology 2004; 24: p.155-61. (52)
Soilu-Hänninen M, Laaksonen M, Hänninen A. Hyaluronate receptor (CD44) and integrin α4 (CD49d) are up-regulated on T cells during MS relapses. Journal of Neuroimmmunology 2005; 166: p. 189-92.
(53)
Miller DH, Khan O, Sheremata W et al. A controlled trial of natalizumab for relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med. 2003; 348: p.15-23.
47
(54)
Mannering S, Morris J, Jensen K et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigenspecific human T cells. Journal of Immunological methods 2003; 283: p.173-83.
(55)
Hellings N, Barée M, Verhoefen C et al. T-cel reactivity to multiple myelin antigens in multiple sclerose patients and healty controls. Journal of neuroscience research 2001; 63: p.290-302.
(56)
Bacher-Allan C, Viglietta V, Hafler DA. Inhibition of human CD4+ CD25high regulatory T-cel function. J. Immunol. 2002; 169 (11): p.6210-7.
(57) Wing K, Lindgren S, Kollberg G et al. CD4 T cell activation by myelin oligodendrocyte glycoprotein is suppressed by adult but not cord blood CD25+ T cells. Eur. J. Immunol. 2003; 33: p.579-87. (58)
Schwartz M. Protective autoimmunity as a T-cell response to central nervous system trauma: prospects for therapeutic vaccines. Prog Neurobiol 2001; 65: p.489-96.
(59)
Vanderlocht J, Hellings N, Hendriks J, Stinissen P et al. Leukemia inhibitory factor is produced by myelin-reactive T cells from multiple sclerosis patients and protects against tumor necrosis factor-ainduced oligodendrocyte apoptosis. Journal of neuroscience research 2006; 83: p.763-74.
(60)
Mannering S, Dromey J, Morris J. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological methods 2005; 298: p.83-92.
(61)
Sun W, Popat U, Hutton G, Zang Q et al. Characteristics of T-cell receptor repertoire and myelin-reactive T cells reconstituted from autologous haematopoietic stem-cell grafts in multiple sclerosis. Brain 2004; 127: p. 996-1008.
(62)
Lang R, Pfeffer K, Wagner H, Heeg K. A rapid method for semiquantitative analysis of the human Vßrepertoire using TaqmanR PCR. Journal of immunological methods 1997; 203: p.181-92.
(63)
Vanderborght A, Stinissen P, Raus J, Van der Aa A, Geusens P, Vandevyver C. Identification of overrepresented T-cell receptor genes in blood and tissue biopsies by PCR-ELISA. Journal of immunological methods 1999; 223: p.47-61.
(64) Gottenberg J, Lavie F, Abbed K et al. CD4 CD25high regulatory T cells are not impaired in patiënts with primary Sjögren’s syndrome. Journal of Autoimmunity 2005; 24: p.235-42.
48
Auteursrechterlijke overeenkomst Opdat de Universiteit Hasselt uw eindverhandeling wereldwijd kan reproduceren, vertalen en distribueren is uw akkoord voor deze overeenkomst noodzakelijk. Gelieve de tijd te nemen om deze overeenkomst door te nemen en uw akkoord te verlenen.
Ik/wij verlenen het wereldwijde auteursrecht voor de ingediende eindverhandeling: De studie van CD4+ CD25+ regulatoire T-cellen in patiënten met multiple sclerose Richting: Master in de biomedische wetenschappen Jaar: 2006 in alle mogelijke mediaformaten, - bestaande en in de toekomst te ontwikkelen - , aan de Universiteit Hasselt. Deze toekenning van het auteursrecht aan de Universiteit Hasselt houdt in dat ik/wij als auteur de eindverhandeling, - in zijn geheel of gedeeltelijk -, vrij kan reproduceren, (her)publiceren of distribueren zonder de toelating te moeten verkrijgen van de Universiteit Hasselt. U bevestigt dat de eindverhandeling uw origineel werk is, en dat u het recht heeft om de rechten te verlenen die in deze overeenkomst worden beschreven. U verklaart tevens dat de eindverhandeling, naar uw weten, het auteursrecht van anderen niet overtreedt. U verklaart tevens dat u voor het materiaal in de eindverhandeling dat beschermd wordt door het auteursrecht, de nodige toelatingen hebt verkregen zodat u deze ook aan de Universiteit Hasselt kan overdragen en dat dit duidelijk in de tekst en inhoud van de eindverhandeling werd genotificeerd. Universiteit Hasselt zal u als auteur(s) van de eindverhandeling identificeren en zal geen wijzigingen aanbrengen aan de eindverhandeling, uitgezonderd deze toegelaten door deze licentie
Ik ga akkoord,
Sigrun JACKMAERT Datum:
Lsarev_autr
