Adatgyőjtés, mérési alapok, a környezetgazdálkodás fontosabb mőszerei

Tudományos kutatásmódszertani, elemzési és közlési ismeretek modul a g zG d á s lk tn o u im y e rI.ö K

Adatgyőjtés, mérési alapok, a környezetgazdálkodás fontosabb mőszerei É S IÖ c E V K M Z T N R Á L D O Y G A

KÖRNYEZETGAZDÁLKODÁSI MÉRNÖKI MSc 1

Fotometriás eljárások 81. Lecke

2

A mérés elve Ha egy d rétegben az I0 fényintenzitás I-re csökken, a csökkenés mértéke I/ I0 lesz. Ha e mögé másik, hasonló réteget helyezünk el, az abba belépı fény intenzitása megfelel az elsı rétegbıl kilépı I-nek, az intenzitáscsökkenés mértéke pedig azonos lesz az elsı rétegben kialakult csökkenéssel. http://biochem.szote.u-szeged.hu/edu/actual/hu/pdf/gyak-fotometria.pdf

3

Lambert egyenlete

Ahol: • k arányossági tényezı, • d a fényelnyelı réteg vastagsága. • az I/I0 hányadost fényáteresztésnek, transzmittenciának (T) nevezzük. http://biochem.szote.u-szeged.hu/edu/actual/hu/pdf/gyak-fotometria.pdf

4

Transzparencia • Korábban szokás volt a transzmisszió helyett a fényelnyelı rétegen áthaladás utáni fényintenzitást a beesı fényintenzitásának százalékában kifejezni, régebbi fotométerek skáláján még látható ilyen beosztás (transzparencia, t).

http://biochem.szote.u-szeged.hu/edu/actual/hu/pdf/gyak-fotometria.pdf

5

Dekadikus abszorbancia • Az egynél kisebb értékbıl következik, hogy logaritmusa negatív szám lesz. A gyakorlati számításokban transzmisszió helyett általában annak tízes alapú logaritmusát használjuk a negatív elıjel elhagyásával (dekadikus abszorbancia, A). A negatív elıjel elhagyása több technikai könnyítésnél, hiszen megváltozik annak értelme: a magasabb számértékő transzparencia nagyobb fényáteresztést jelent, a magasabb számértékő abszorbancia alacsonyabbat. http://biochem.szote.u-szeged.hu/edu/actual/hu/pdf/gyak-fotometria.pdf

6

A fényelnyelés koncentráció összefüggés • A gyakorlat számára fontos felismerés volt, hogy a fényelnyelés ugyanakkora lesz egy kétszeres, 2d vastagságú fényelnyelı rétegben, és akkor, ha a d rétegvastaság nem változik, de az abban fényt elnyelı anyag koncentrációja kétszer akkora: 2d × c = d × 2c ami általánosítható: nd × c = d × nc.

• n értéke elméletileg bármekkora lehet. A gyakorlatban ez nem igaz, oldatok esetében csak híg oldatokra lehet korlátozás nélkül alkalmazni. http://biochem.szote.u-szeged.hu/edu/actual/hu/pdf/gyak-fotometria.pdf

7

A koncentráció kifejezése • Az abszorbancia (A) alkalmazásával az oldat fényelnyelése egy igen elegáns, jól kezelhetı képlettel írható le (a k arányossági tényezıt egységnyinek véve): A=ε×c×d

• Állandó, d rétegvastagság mellett az ismert fajlagos fényelnyeléső (ε) oldott anyag koncentrációja határozza meg az A értéket. Mivel az ε empirikusan meghatározható, a d ismert (a küvetta rétegvastagsága), az A-t pedig mérjük, a koncentráció: http://biochem.szote.u-szeged.hu/edu/actual/hu/pdf/gyak-fotometria.pdf

8

Az érzékenység fokozása • A fotometriás mérések érzékenysége jelentısen fokozható, ha a vizsgálatot nem fehér fényben végezzük, hanem a fényelnyelés spektrális maximumánál, monokromatikus fényben. • Ilyen esetben lesz az oldatból kilépı fény intenzitása a legalacsonyabb a belépı fény intenzitásához képest, ami egyúttal azt is jelenti, hogy a mérés érzékenysége itt lesz a legnagyobb. • Teljesen homogén fényt elı lehet állítani (lézer, vonalas színképet szolgáltató fényforrások), de ennek az az ára, hogy nem állítható elı bármilyen hullámhosszú fény. Folyamatos színképet szolgáltató fényforrások, pl. izzólámpák fényének egy szőkebb, vagy szélesebb sávja a fotometriás mérésekhez elegendıen homogén hullámhosszú fénynek tekinthetı.


9

Az érzékenység fokozása • Ha például az alábbi ábrán látható elnyelési spektrumú p-nitrofenolátot (az alkálikus foszfatáz reakció indikátora) a teljes hullámhossztartománynak megfelelı, fehér fényben fotometráljuk, kb. 0,01 abszorbancia egység fényelnyelést mérhetünk. • Ha ugyanezt a mérést a maximális fényelnyelésnek megfelelı, 398-402 nm-es sávban végezzük, a mért abszorbancia ennek kb. az ötvenszerese lesz, vagyis ennyivel lesz nagyobb a mérés érzékenysége. http://biochem.szote.u-szeged.hu/edu/actual/hu/pdf/gyak-fotometria.pdf

10

Abszorbancia növelése

A p-nitrofenolát fényelnyelése a hullámhossz függvényében (A-abszorbancia) http://biochem.szote.u-szeged.hu/edu/actual/hu/pdf/gyak-fotometria.pdf

11

Mérési tartományok • A fotométerek hullámhossztartománya 190 és 850 nm, vagy 320 és 800 nm között van (a látható fény hullámhossza: 400-800 nm), vagyis a különbség az, hogy a mőszer alkalmas-e rövidhullámú ultraibolyában történı mérésre. • Gyártási költségben igen nagy különbségrıl van szó, ugyanis a közönséges üveg 360 nm alatt, az emelt kvarctartalmú üveg 320 nm alatt nem fényáteresztı, az optikai elemeket optikai kvarcból kell készíteni, ehhez társul a drágább fényforrás és detektor költsége is. • Másfelıl, rövidhullámú ultraibolyába esik a nukleinsavak és nukleotidok (260 nm körül), az aromás aminosavak (280 nm körül) fényelnyelése, így kutatási célokra az ilyen fotométer nélkülözhetetlen. http://biochem.szote.u-szeged.hu/edu/actual/hu/pdf/gyak-fotometria.pdf

12

A fotométer fı elemei


13

A fotométer fényforrásainak tulajdonságai


14

Szőrık Színszőrınek ma szinte kizárólag több, vékony fémréteg üvegfelületre gızölésévei készített interferenciaszőrıket használunk. Az interferenciaszőrı elve az, hogy két, vékonyan fémmel (pl. ezüst, neodimium) gızölt sík üvegfelület közé vékony, fényáteresztı dielektrikum (pl. MgF2) réteget visznek fel.


15

Küvetták •

A régi fotométerekhez igen sokféle úthosszú küvetta tartozott, jellemzıen 5tıl 50 mm-ig. A nagy úthosszú küvetták jelentısége abban volt, hogy a széles sávú üveg- vagy festékszőrık nem tették lehetıvé, hogy kevéssé színes oldatokat megfelelı pontossággal fotometráljunk, így legegyszerőbb a rétegvastagság emelése volt. Napjainkra a spektrofotométerekhez szinte kizárólag az 1 cm szabad úthosszú küvetták használatosak. A küvetták anyagi minısége és a mérési tartomány


16

Fényérzékelık Ma a fotométerekben alapjában már csak kétféle fényérzékelıt használunk. Az olcsóbb fotométerekbe – félvezetı érzékelıt építenek, az igényes spektrofotométerekbe és automatákba – fényelektron-sokszorozót,

• a korábban használt alacsony érzékenységő, rossz linearitású detektorok (szelén fényelem, fotocella) ma már nem használatosak. • A detektor nagy érzékenysége nem öncél. A nagy érzékenységő detektor spektrofotométerekben rendkívül szők sávú (0,1-0,5 nm) mérést tesz lehetıvé, HPLC mérıfejekben és automatákban pedig igen vékony mérı fénynyaláb használatát, vagyis igen apró küvetta alkalmazását. • Még lényegesebb szempont, hogy a mérések egy részében a vak minta fényelnyelése igen magas (pl. brómkrezolzölddel végzett albumin meghatározás mérése 590 nm körül), és ehhez képest kell néha igen kis abszorbanciaértékeket pontosan meghatározni. http://biochem.szote.u-szeged.hu/edu/actual/hu/pdf/gyak-fotometria.pdf

17

A mai kémiai automatákba épített fotométerek fı részei


18

Kérdések a leckéhez • A mérés elve • A koncentráció kifejezése • Az érzékenység fokozása

19

KÖSZÖNÖM FIGYELMÜKET!

20

Adatgyőjtés, mérési alapok, a környezetgazdálkodás fontosabb mőszerei

Recommend Documents