Acetil-kolin észteráz Két izoenzim, különböző enzim aktivitással: •vörösvértestben és trombocitákban valódi acetil-kolin észteráz; nagy sebességgel hidrolizálja az acetil-kolint, bizonyos acetil-kolin koncentráció felett szubsztrát gátlás lép fel α2β2 Átviteli szám: 25000 1/sec Acetil-kolin szerepe az idegingerület átvitelben Nyugalmi állapot visszaállítását acetil kolin észteráz végzi
Aktív centrumban reaktív szerin oldallánc donepezil hidroklorid (Aricept )reverzibilis Inhibitor Alzheimer's kór használt
•plazmában pszeudo-kolin észteráz az acetil-kolint til k li t kisebb ki bb aktivitással kti itá l hidrolizálja, hid li álj az acetil-kolin szubsztrát gátlást nem okoz
Valódi egy szubsztrátos enzimek az izomerázok:
liázok
A
B
A
B+C
Hidrolázok : A –B+ H2O
A-OH + BH
Multiszubsztrátos enzimek: O id Oxidoreduktáz d ktá :
O 1 + Red Ox R d1
O 2 + Red Ox R d2
(Kofaktort igénylők: NAD(H), FAD(H), fémion)
AX+B Transzferáz: A + BX (pl. glikozil transzferáz, kináz) XY +ADP + Pi Ligáz X + Y + ATP
Termék gátlás előfordulhat Bi Bi mechanizmus
A
E
P
EA E’ P
B
E’
Q
E’B EQ
Példa: flavoenzimek működése 1. Reduktív félreakció: FMN+ NADH 2. Oxidatív félreakció: NADH
H+ FMNH2 + NAD+ FMN + Pred
FMNH2+ Sox NAD+
S Sox
P d Pred
„A” kötődik először, elreagálva mint termék távozik, majd a „B” szubsztrát kötődik és „Q Q” termékként távozik távozik, visszaalakítja az enzimet a kiindulási aktív állapotba
Szekvenciális: A és B szubsztrát mindkettő bekötődik, mielőtt a P és Q termék eltávozik Random szekvenciális: véletlenszerű a reaktánsok bekötődése és a termékek távozása
Meghatározott g sorrendű szekvenciális: reaktáns kötődés és termék távozás sorrendje j meghatározott
Többszubsztrátos reakció : szekvenciális mechanizmus – meghatározott sorrend
RANDOM SORREND
Irreverzibilis Inaktiváció + E + S
ES
E +P
Enzyme
inaktivátor
+ I
EI
E----I
(Inaktív kovalensen módosított enzim)
•Csoport specifikus reagensek •Affinjelölők •Mechanizmus csapdák
1 Csoport specifikus reagensek 1.Csoport
Ciszteil oldallánc
jódacetamid
Inaktivált enzim
2. Affinjelölők – szubsztrát analógok, amelyek kovalensen módosítják j a katalitikusan aktív oldalláncokat specifikusak az enzim aktív helyén levő oldalláncokra Kimotripszin természetes szubsztrátuma
Tosil-L-fenilalanin klórmetilketon (TPCK) reaktív szubstrát analóg
Specificitást meghatározó csoport aktív zsebbe történő kötődést meghatározó csoport
R ktí csoportt Reaktív
Az aktív helyhez kötődik és reagál az ott lévő hisztidinnel
Acetilkolin észteráz
Szeril oldallánc
Diizopropil-foszfofluoridát DIPF (ideggáz)
Szerin proteázok (pl. kimotripszin, acetilkolin észteráz) gátlószere kovalens módosítás aktív szeril oldalláncon keresztül
Mechanizmus csapda- „suicide inhibition” a legspecifikusabb irreverzibilis inhibítorok inhibítorok, kovalens módosítók, amelyeket az enzim olyan intermedierré alakít amely kovalensen kötődik a reaktív csoporthoz és inaktiválja az enzimet Példák:
1.Monoaminoxidáz (MAO)dezaminálja a neurotranszmittereket az agyban pl. dopamint, szerotonint Az N,N-Dimetilpropargilamin a monoaminoxidáz FAD kofaktorát kovalensen módosítja az első oxidációs lépés után 2. A reaktív ß-laktám gyűrűt tartalmazó penicillin kovalens kötést képez a bakteriális glikopeptid transzpeptidáz katalitikusan aktív szeril oldalláncával Pentaglicin lánc N-term. +D-ala-D-ala C-term
Kereszt kötés + D-ala
Mechanizmus-csapda – 1.
Monoaminoxidáz
Penicillin szerkezete
Tiazolidin gyűrű
Reaktív R ktí peptid tid kötés köté a β-laktám gyűrűn Bakteriális glikopeptid transzpeptidáz inhibítor, penicillin gátolja az utolsó lépést a sejtfal szintézisben – a keresztkötések kialakítását a peptodiglikán szálak között
Staphylococcus baktérium sejtfal összetevőjének (peptidoglikán) szerkezete:
glikán
D-Ala-peptidlánc
Penicillin a D-ala-D-ala Egységek szerkezeti analógja
Bakteriális sejtfal Különlegessége, hogy D-ala aminosavakat tartalmaz
pentaglicin
Glikopeptid transzpeptidáz katalizálta reakció mechanizmusa 1.
Acil-enzim köztitermék Transzpeptidáz kovalens acil-enzim Kö tit Köztiterméket ék t képez ké a tterminális i áli D Dala-D-ala peptidde 2.
Az acil-enzim reagál a terminális glicin amino (Nu-)csoportjával
•Penicillin utánozva a D-ala-D-ala szerkezetet a transzpeptidáz aktív centrumába kötődik •A penicillin négy tagú feszített β-laktám gyűrűje nagyon reaktív, az enzim katalitikusan aktív szeril oldalláncával kovalens kötést képez, penicilloil-enzim komplex alakul ki ki, amely tovább nem reagál az enzim inaktiválódik
Az enzimaktivitások mérése A klinikai kémia talán leggyakoribb módszerei közé az enzimaktivitások i kti itá k mérése é é ttartozik. t ik Ezt az indokolja indokolja, hogy a metabolikus folyamatok enzimei normál körülmények között is megtalálhatók a biológiai folyadékokban y ((vér, vizelet, nyál, y bélcsatorna nedvek, tej). j) A kóros, általában a sejtek sérülésével járó folyamatokban a „kiszabadult” ki b d lt” enzimek i k mennyisége i é megnő, ő az aktivitásuk kti itá k fokozódik
Enzimaktivitás mértékegységei: 1961. Nemzetközi Biokémiai Szövetség: unit 1U = 1μmol átalakult szubsztrát 1 min
25 ºC–on standard körülmények között
SI mértékegységrendszer : katal 1 mol átalakult szubsztrát 1 katal= katal 1sec
1nanokatal = 10-9 katal 1U =16 =16.67 67 nanokatal
egységnyi térfogatra vonatkozó enzimaktivitás - volumenaktivitás: U / l; mU/ml; nanokatal/ml
Specifikus aktivitás: Spec akt = Spec.akt. Minta tisztasági fokának jellemzése
U mg protein
=
μmol átalakult szubsztrát min mg protein
Farmakológia gyakorlatban az I50 mérése Azt a gátlóanyag koncentrációt jelöli, amely a maximális gátlás 50%-t okozza Tisztán nem-kompetitív gátlás esetén KI= I50 I50 és KI közötti összefüggés reverzibilis gátlások esetén
Gátlá típus Gátlás tí kompetitív Nem-kompetitív Nem kompetitív unkompetitív vegyes
I50 (KM+[S])KI / KM KI (KM+[S])KI / [S] (KM+[S])KIKI’/(KMKI’+KI [S])
A belső minőség-ellenőrzés leggyakoribb paraméterei Reprodukálhatóság (precizitás, pontosság), azonos minta nagyszámú ismételt lemérése alapján kiszámíthatjuk az átlagot vagy az ahhoz tartozó szórást A specifitás ifitá aztt fejezi f j i ki, ki hogy h az adott d tt módszerrel ód l valóban lób csak az és csakis az a paramétert határozható meg. Az érzékenységet az adott mérendő paraméter azon legkisebb mennyisége jellemzi, amely a mérés során reprodukálhatóan megmérhető. (A megbízhatóság
(torzítás), az összehasonlító mérésekre alkalmas (torzítás) kontroll anyag általunk mintaként történő többszöri lemérését összevethetjük annak a kinyilvánított (deklarált) értékével. Ilyenkor a mért é t és é d deklarált kl ált külö különbsége b é adja dj a ttorzítás ítá té tényleges l ((abszolút) b lút) értékét (pl.: U/L-ben).)
Az enzim katalitikus aktivitásának mérése
Az enzim reakciók követése: 1 Folyamatos 1. F l t enzim i kinetikai ki tik i vizsgálat i ál t Azon fizikai paraméter időbeli változásának folyamatos követése követése, amely arányos a szubsztrát vagy termék koncentrációval Pl. NADH függő (enzim)rendszerek esetén a NADH csökkenést vagy növekedést detektálhatjuk spektrofotometriásan : 340nm 340nm–en en a NADH elnyelési maximumán követhetjük •Ha proton szabadul fel az enzim reakció során, akkor követhetjük a pH változást •Oxigén fogyás esetén oxigén oxigén-elektróddal elektróddal mérhetjük a változást
A
Lambert Beer törvény: Lambert-Beer A=εcl A =: log Io/I (Io: a bejövő fény intenzitása; I:átmenő fény intenzitása) ε= molaris extinkciós koefficiens; (M-11cm-11) l = a fény út hossza cm
2
NAD +
15 1,5
NADH + H+
1 0,5 0 250
270
290
310
330
hullámhossz (nm)
350
370
390
NH2 N
Flavin mononukleotid (FMN) Flavin adenin dinukleotid (FAD)
O
H2C O O
O O P O
N
55'
N
CH2 O
N
4'
Foszfát R = Phosphate
OH
HO
P O O
O P O
R
5' O
5'
4'
HO
4'
H
HO
3'
H
HO
2'
H
CH2
CH2
R = Adeninedinukleotid
1'
CH2
Me
Izoalloxazin gyűrű
9 8
10α
1
N
N
2
10 3
Me
7
5
6
N
4α
Riboflavin
4
O
O
NH
Flavin mononukleotid redukciója 460 nm-en követhető
460nm
Absorban nce
0.2
0.1
0.0 400
500
Wavelength [nm]
NADH + FMN
600
2. Nem folyamatos (szakaszos) enzim kinetikai vizsgálat Különböző időpontokban megállított enzimreakcióban határozzuk meg a szubsztrát koncentráció fogyását vagy a termék keletkezését Ha nincsen jól detektálható elnyelése egyik ágensnek sem a reakció során, akkor a reakció leállítása után valamilyen y szubsztrátra ill termékre nézve specip fikus színreakcióval állapítjuk meg a kérdéses koncentrációt
Szakaszos
3. Csatolt enzim rendszerek kinetikai vizsgálat A kérdéses enzim reakcióhoz csatolunk egy gy jjól követhető második enzim reakciót
Pl g glükóz + ATP
hexokináz
glükóz-6-foszfát+ ADP g
glükóz-6-foszfát dehidrogenáz
glükóz-6-foszfát + NADox
6-foszfoglükonát + NADH
NAD+ redukciója jól követhető 340 nm-en
Gyorsreakciók y követése stopped-flow pp spektrofotometriával p A reakciómechanizmus elemi lépéseinek a felderítése
Stacionárius szakasz, sebesség meghatározó lé é h lépés, hagyományosan á kö követhető th tő szakasz k
Előegyensúly, gyors, stacionárius szakasz
Kétfázisú reakció
Kimotripszin katalizálta hidrolízise két fázisú ki tikát követ kinetikát kö t Nitrofenol acetát
O -C C NN H
O CH3–C–O– + H2O
–NO2 Kimotripszin
Peptid kötés
O -C C OO Észter kötés
Acetát
O CH3–C–OH
O HO–
O2 –NO
Nitrofenol f l
ea c ó korai o a fázisában á sába acetát nem e A reakció szabadul fel, ellentétben a korai nitrofenol termeléstől
A Kimotripszin két lépésben katalizálja a fenil acetát hidrolízisét O Nitrofenol acetát CH3–C C–O– O –NO NO2
Acilezés
O CH3–C
HO–
–NO2
Dezacilezés (lassú (l ú lépés) lé é )
O-H O H CH2
+ H2O Nitrofenol
CH3COOH
Reakció kinetikájaa
O CH2
OCH2
Kétfázisú reakció
Idő (sec)
K3: Sebesség meghatározó folyamat – Leglassúbb –stacionárius szakasz (hagyományos módon követhető) K2: Gyors, tranziens szakasz(stopped-flow fotométerrel követhető)
Enzimaktivitást befolyásoló tényezők 1. Szubsztrát koncentráció, enzim koncentráció 2. pH 3. Hőmérséklet 4. Ionerősség 5. Kofaktorok (pl. NADH; fémionok), védőanyagok (merkaptoetanol SHenzimeknél, specifikus ionok jelenléte (glikozidázok esetén Ca2+ stabilizálja az aktív enzimkonformációt) 6. gátlószerek, aktivátorok jelenléte
Aminosavak protonálódása
pH = log10(1/[H+]) = - log10[H+]
Savi disszociációs állandó HA <-----> H+ + A+
−
[ H ][ A ] K= [ HA] pK = - lg p g K = lg g ((1/K))
Hisztidin ionizációs áll állapotai t i
A fehérje protonáltsági fokát az oldalláncok minősége határozza meg
Fehérjében kötött aminosavak protonálódási állandói különbözhetnek a szabad aminosav protonálódási állandóival – meghatározó fehérje környezet
Negatívan töltött P ití Pozitívan töltött
[H+]
-
[OH ]
pI= 5,2
Kd
kcat
ES
E + S
E+P Egyértékű savi disszociációs állandó: Ka
Ka EH+
Kd
EH+S
Nem-kompetitív gátlás mechanizmus analógiája alapján: kcat [S] v = [E]0 (KM + [S]) (1+[I]/ KI)
Behelyesttesítve: [H]+ -t [I] helyébe v [E]0
=
kcat [S] (KM + [S]) (1+[H+]/ Ka) [E]0 v
Ka –t KI helyébe reciprok
[H+] 1 ) + (1+ ) (1+ = Ka kcat Ka kcatt [S] tengely.meredekség metszet KM
[H+]
1
Vegyes gátlásként értelmezve: E + S
Kd
ES
KaE
kcat
E+P
KaES EH+
Kd‘
EH+S
kcat [S] v = [E]0 [S]) (1+[H+]/ KaES) +KM (1+[H+]/ KaE) A pH függés kifejezhető: ES +[H+]K K ES/K E K K M a M a a KMa = pp KaES +[H+]
kcat
app= kcat
KaES
KaES +
ES komplex [H+] Ionizációs állandójától függ
(kcat/KM)KaE kcatapp = K E + [H+] KMapp a
Enzim ionizációs állandójától függ
Acetilkolin észteráz p pH optimuma p 9 felett: aktív centrumban : szerin
Kétértékű sav ionizációja H2E
H2ES
K1
K1
S + HE-
HES-
K2
K2
E2kcat
app =
ES2-
HE- + P
Ks=
kcat K1 [H+] = K1 K2 +K1[H+]+ [H+]2
[EH] [S] [EHS] kcat 1 +[H+]/K1+ K2/ [H+]
Mikor optimális a pH azaz maximális a kcat ha a nevező a legkisebb: 1 +[H+]/K1+ K2/ [H+] =min [H+]opt=√K1K2
R Reakció ó sebess ség
Papain aktivitásának pH függése
His159
Cys25
Papain katalitikusan aktív oldalláncainak ionizációja
Aktív I ktí Inaktív
Inaktív
Inaktív - H+
Aktív
- H+ + H+
+ H+
pKa=8.1
pKa=3.4
tiolát-imidazólium ion pár.
Cisztein proton leadás
A Kimotripszin proteolízissel aktiválódik Kimotripszinogen (inaktív)
245
p-Kimotripszin Ki i i (aktív) ( kí )
tripszin p
p Ki t i i p-Kimotripszin S14-R15 L13
I16
a-Kimotripszin (aktív)
T147-N148 Y146
A149 Diszulfid kötések
Campbell (1 1999) Bioche emistry (3d) p p.179
R15-I16
C
H–N C
N C
CH2
H–O–CH2
Ser 195
H
His 57
O C–O–H
Asp 102
aktív Ser
H C
N C
CH2 His 57
N–H C
H
- O–CH
2
Ser 195
Albe erts et al (200 02) Molecular Biology of the Cell (4e) p..158
=
Asp 102
=
Tölté és re elé az z aktíív cen ntrum mban
O C–O -
H
pH hatása a Kimotripszin Aktivitására
Relatívv Aktivittás 5
6
7
8
9
10
11
pH Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.162
10 9 8 7 Isoelektomos pont, 6 pII
5 4 3
+
+
0
A fehérje eredő töltése
-
Juang RH (2004) BCbassics
pH h hatás sa a ffehérjje ere edő tö öltésé ére
pH
pH 6
H
H–N C
+
C
N–H
H+
H–N
C
C H
=
O C–O -
Asp 102
pH 7
H
C
N C H
H H–N
C
Inaktív + N–H H–O–CH2
C C-H CH CH2
Ser 195
Hi 57 His Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.158
Ad dapted from D Dressler & Po otter (2000) D Discovering E Enzymes, p.16 63
Katalitikus triád: Imidazol gyűrű protonáltsági állapota a pH függvényében
Kimotripszin proteolitikus hasítás hatására elnyeri natív szerkezetét • Asp194 és a protonált Ile16 közötti sóhíd • Kialakul a Katalitikus triád
Proteolitikus hasítás hatására a Kimotripszin βláncában az Ile16 N-Terminálissá N Terminálissá válik Relattív aktivitáss
N-term
L13
pH 5
6
7
8
I16
Y146
9 10 11
NH2– Asp194 és a protonált Ile16 között sóhíd alakul ki –CH CH2COO-
+ NH
pH 9
pKa
Ile 16
pH 10
3– Ile16 Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.165
Az N-terminális Ile16 N és az Asp194 közötti ionos kölcsönhatás stabilizálja j az aktív enzim 3D szerkezetét: kialakul a katalitikus triád His 57
Gly 193
Ser 195 Asp 194
Asp 102
Katalitikus Triád
+NH
3
Ile 16
127 Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.112
Hőmérséklet hatása
Arrhenius összefüggés: gg A Reakciósebesség - hőmérséklet – aktiválási energia k kapcsolata l t :
k = A e-Ea /RT k: Sebességi állandó (arányos a reakció sebességgel)
ln nk
ln k/A = -Ea/ RT
1/T
Hőmérséklet hatása enzim reakció sebességére Arrhenius hőmérsékleti függés tartománya k=Ae e-Ea/RT Ea/RT
denaturáció ln(v) versus 1/T tgα = -Ea /R
Denaturáció sebessége g jóval j nagyobb gy mint az aktiváció sebessége g
Ea = 4 - 20 kcal/mol Ed = 40 -130 kcal/mol
d[E] − = kd [ E ] dt
A hőmérséklet növelése 30 to 40 °C-ra, az enzim aktivitást 1.8-szorosára növeli,, addig g az enzim denaturáció sebességét 41szeresére növeli
Enzim molekulák térszerkezete hőhatására megbomlik (rendezetlen gombolyag) - denaturálódik
