Tartalomjegyzék
Abszorpciós spektroszkópia (Nyitrai Miklós; 2011 február 1.)
A fény; Elektromágneses hullám kölcsönhatása anyaggal; Az abszorpció definíciója; Az abszorpció mérése;
Dolgozat: május 3. 18:00-20:00.
Alkalmazások;
Egész éves anyag.
Speciális problémák, esetek.
Korábbi dolgozatok nem számítanak bele. Felmentés 80% felett.
Emlékeztető
Emlékeztető
Elektromágneses hullámok terjedése növekvő energia távoli vörös
vörös
760nm
narancs 647nm
sárga
586nm
535nm
zöld
kék 492nm
ibolya 422nm
UV 390nm
Hogyan függ össze a frekvencia, hullámhossz és energia? A fény transzverzális elektromágneses hullám.
Spektroszkópia energia (eV)*
Fényelnyelés híg oldatokban
hullámhossz (nm) frekvencia (Hz)
- transzmittancia - abszorpció
hullámhossz tart.
sp.-i módszer *1eV = 1,602 x 10-19 J = 3,83 x 10-20 cal
1
Transzmittancia I
I0 fényforrás
Abszorpció detektor
anyag T = I / I0 Általában százalékban (%) adjuk meg
I0
Minta (homogén)
intenzitás
Exponenciális függvény!!!
Megj.: hasonló a radioaktív bomlás egyenletéhez!
I = I0 exp (-kx) vagy I = I0 e-kx
N = N0 exp (-λt)
vagy
N = N0 e-λt
I távolság
minta
Az abszorpció definíciója Ez is exponenciális!
intenzitás
I0
A cél: - legyen könnyen érthető - legyen jól mérhető - legyen additív
I
Megj.: a transzmittancia (T=I/I0) nem additív: ha az egyik komponens átenged 30%-ot, a másik 60%-ot, akkor a kettő együtt NEM -10%-ot fog átengedni!
ln(távolság)
2
A távolságfüggés más formában
I0
Miért ε(λ) és nemcsak ε?
I távolság
abszorpció
intenzitás
minta
λ (nm)
I = I0 10-ε(λ) c x Miért ε(λ) és nemcsak ε?
Paraméterek definíciója!
Az abszorpció definíciója
Mi áll a megfigyelések hátterében? A Born-Oppenheimer közelítés:
I
I0
Az ε értéke λ függő!
Mag mozgás vs. elektron mozgás.
anyag
OD = A = - log (I / I0) = ε (λ) c x Röv.: „optical density”
I = I0 10-ε(λ) c x
Az energia felbontása Eösszes = Eelektron + Evibrációs + Erotációs Az egyes energia típusok megváltozása független. A megváltozás írható mint:
Az energia felbontása Az energia típusok nagyságrendje: ΔEelektron ~ 1,000 * ΔEvibrációs ~ 1,000,000 * ΔErotációs
ΔEösszes = ΔEelektron + ΔEvibrációs + ΔErotációs
3
Emergia séma: sávos spektrum
Fotometriai mérések megvalósítása
fotometriai = abszorpciós spektroszkópiai
Hogyan mérjük az abszorpciót?
Spektrofotométer Spektro
Egy fotométer egyszerű sémája.
fényforrás
monokromátor
minta
detektor
•
Fő komponensek: 1. Fényforrás • •
2. 3.
4. 5.
UV fényforrás (~180-350nm): Deutérium lámpa Látható fény forrása (~350-800nm): Wolfram-izzó
Monokromátor: egyedi hullámhosszak kiválasztása. Mintatartó: a minta és a referencia behelyezése a fényforrás és a detektor közé (küvetta: kisméretű, fényáteresztő mintatároló egység) fotodetektor: PMT, dióda… Egyebek: lencsék, szűrők, rések.
Prizma
Hogyan működik a prizma?
4
A törésmutató hullámhosszfüggése n
A törésmutató hullámhosszfüggése Monokromatikus fény
Fehér fény piros sárga lila
λ
λ
Egy és két-utas fotométerek
Miért használunk referencia mintát?
A fehérjék abszorpciója
A fehérjék abszorpciója
A fehérjék abszorpciójának értelmezése
5
Miért jó az additivitás? (példa)
Alkalmazás: fehérjekoncentráció meghatározása A mért abszorbció: A
abszorpció
Szükség van egy ‘referencia’ számra (kalibráció): extinkciós koefficiens: ε fluoreszcens próba
fehérje
ε szokásos egységei:
M-1cm-1, vagy (mg/ml)-1cm-1
Ha A = 0.55 and ε = 1.1 (mg/ml)-1cm-1 λ (nm)
c = (A/ ε) in mg/ml; c = 0.5 mg/ml
Példa egy másik alkalmazásra: elektroforézis eredmények kiértékelése
A fotométer linearitása; “stray light effect” Megfigyelés:
1.0
Várható tendencia 0.8
Meredekség: ε Mérési eredmények
S
Abszorpció
0.6 0.4 0.2 0.0 0
5 10 15 [mDia3-FH2] (μM)
20
De miért nem mér lineárisan?
Koncentráció
A probléma forrása: elvileg sem tökéletesek a monokromátorok!
Második, harmadik… felharmónikusok! 2λ; 3λ…
Optikai rács
A monokromátor működésének alapelve.
6
Tegyük fel, hogy az anyag csak a kiválasztott hullámhosszon nyel el!
‘Nagy’ abszorbció mellett:
‘Kicsi’ abszorbció mellett: I
I0
I
I0
99% λválaszt. 99% λválaszt anyag
és 1% λfelh.
anyag
89% λválaszt.
és
és
1% λfelh..
1% λválaszt. és 1% λfelh.
1% λfelh.
A hatás!
Az átmenő fény összetétele
Várható tendencia
I / I0 = 90 / 100 = 0.9 valódi érték = 89 / 99 ~ 0.9
Meredekség: ε
A mért és a valódi közel azonos! Nagy abszorbció:
Abszorpció
Kicsi abszorbció:
I / I0 = 2 / 100 = 0.02 valódi érték = 1 / 99 ~ 0.01 Az eltérés nagy!
Koncentráció
A lényeg - az abszorpció jelensége, értelmezése;
Köszönöm a figyelmet!
- az abszorpció definíciója; - az abszorpció mérése; - az abszorpció alkalmazásai.
7
A probléma
Derivatív spektroszkópia
pl. nagy fényszórás a mintában
Mikor és mire jó? - optikailag sűrű minták
A látszólagos vagy mért abszorpció abszorbció
- nagyon szóró minták - igen kicsi abszorbció változások Hasznos módszer a biokémiában, gyógyszerkutatásban….stb.
A valódi abszorpció λ (nm)
A spektrum deriváltja!
A spektrum (első) deriváltja!
Emlékeztető!
Mért spektrum
abszorbció
ΔA / Δλ,
és Δλ nagyon kicsi, nullához tart:
dA / dλ
Δλ ΔA
d (abszorbció) / d λ
Deriválás:
Valódi spektrum λ (nm)
A módszer előnyei - az abszorpciós csúcsokat könnyebb azonosítani - alkalmas továbbra is koncentráció meghatározásra
λ (nm)
A lényeg - az abszorbció definíciója - az abszorbció mérése - az abszorbció alkalmazásai
8
