A pre-analitika szerepe a patológiai minták megőrzöttségében
Dr. Lotz Gábor Semmelweis Egyetem, II. sz. Patológiai Intézet
A sebészeti anyagok útja Műtő OPTIMÁLIS HŐMÉRSÉKLET (20-22°C)
IDŐFAKTOR (15 perc – 1óra)
Patológiai osztály
Fixálás (24 óra, 10%-os pufferolt formalin)
Kivágás
Paraffinba ágyazás
Diagnózis felállítása
Formalinban fixált anyagok vizsgálata
Metszeten
HE Speciális festések Immunhisztokémia In situ hibridizáció (FISH, CISH, SISH)
DNS/RNS/fehérje kinyerés után
DNS-alapú technikák RNS-alapú technikák Fehérje-alapú technikák
MILESTONE TissueSAFE High Vacuum Biospecimens Transfer System ™
Anyag és módszer 1. 11 műtéti (nagy)anyag: 1 ép máj metastasis mellőli, 1 focalis nodularis hyperplasia 1 colon adenocarcinoma májáttéte 4 ép vese (világossejtes veserák mellől) 1 ép gyomor (gyomor tumor mellől) 1 pecsétgyűrűsejtes carcinoma 1 leiomyoma uteri 1 liposarcoma
Anyag és módszer 2. Módszer: A mintákat a rezekciótól számított 15 percen belül a.) vákuumfóliáztuk, majd +4°C fokon tároltuk. A 0., 3., 6. és 10. napon a minták egy-egy részletét • beágyazás után HE, PAS, IHC. DNS (QIAmp DNA FFPE Tissue Kit)- és RNS-izolálás (Qiagen RNeasy FFPE Kit ) után 1,2% agaróz gélelektroforézis. • -80°C-ra ‘friss’ mintát tettünk el. DNS (QIAmp DNA FFPE Tissue Kit)- és RNS-izolálás (TRIzol) után 1,2%-os agaróz gélelektroforézis. b.) formalinban tároltuk A 3., 6. és 10. napon a minták egy-egy részletét • beágyazás után HE, PAS, IHC. DNS (QIAmp DNA FFPE Tissue Kit)- és RNS-izolálás (Qiagen RNeasy FFPE Kit ) után 1,2%-os agaróz gélelektroforézis.
Vese beérkezéskor (0. nap)
Vese 6. nap
Vese 3. nap
Vese 10. nap
Vese, 0. nap,
Vese, 3. nap,
HE, 400x
HE, 400x
VÁKUUM-FÓLIÁZOTT, PARAFFINBA ÁGYAZOTT VESE
Vese, 6. nap, HE, 400x
Vese, 10. nap, HE, 400x
Vese, 0. nap, PAS, 400x
Vese, 3. nap, PAS, 400x
VÁKUUMFÓLIÁZOTT, PARAFFINBA ÁGYAZOTT VESE
Vese, 6. nap, PAS, 400x
Vese, 10. nap, PAS, 400x
Vese, 3. nap, CD10, 400x
Vese, 0. nap, CD10, 400x
FÓLIÁZOTT, BEÁGYAZOTT VESE
Vese, 6. nap, CD10, 400x
Vese, 10. nap, CD10, 400x
Vákuum-foliázás hatása a minták RNS- és DNS-koncentrációjára 400 350 300
0. nap
250
3.nap
200
6.nap
150
10.nap
100 50
RNS (ng/µl)
0 Folia
Formalin
50 40 0.nap 30
3.nap 6.nap
20
10.nap 10 0
DNS (ng/ µl)
Fólia
Formalin
A fóliázott mintákból izolált DNS fragmentációja máj Nap:
0.
3.
vese 1 6.
0.
4.
7.
vese 2 10.
0.
3.
6.
vese 3 0.
4.
7.
gyomorák 10.
0.
3.
6.
Fóliázás: −80Co 1000 bp 500 bp
FFP
1000 bp 500 bp
Nap:
0.
3. máj
6.
0.
4. 7. 10. vese 1
0.
3. 6. vese 2
0.
4. 7. 10. vese 3
0. 3. 6. gyomorák
CSAKFFPE: 1000 bp 500 bp
~0,5 µg DNS/minta, 1.2%-os gél Nap:
0.
3. 6. vese 2
0.
4. 7. vese 3
10.
0. 3. 6. gyomorák
Következtetések • A fóliázott sebészeti anyag szállítása és tárolása biztonságosabb. • A formalin-igény csökken a sebészeti osztályokon. • A rutin diagnosztikai eljárások számára a szöveti struktúra jól megőrzött marad. • A molekuláris pathologiai vizsgálatok esetében több napos tárolás után is a műtét utáni állapottal csaknem megegyező minőségű makromolekulák izolálhatóak. • A vákuumfóliázás technika előnyösebb a tumorbankok és a kutatások számára a rutin formalinos fixálással szemben. • Korlátok: anaerob rothasztó baktériumok jelenléte esetén, (pl. vastagbéldaganatoknál) korlátozott lehet ezen eljárás alkalmazhatósága.
FISH: A pre-analitikai hibák következményei • A Her2-pozitív emlőrákok mellett a célzott terápiás lehetőségek egyre bővülő köre kezelhetővé képes tenni olyan, korábban reménytelen daganatos megbetegedéseket is, mint a tüdőrák vagy a melanoma egyes fajtái. • Fennáll annak lehetősége, hogy egy beteg azért nem részesülhet célzott kezelésben, mert szövetmintájának rossz minőségű feldolgozása miatt nem lehet azon diagnosztikus értékű molekuláris patológiai vizsgálatot végezni. • Következmények???
FISH: A pre-analitikai hibák következményei A sokszor nagyon nehezen értékelhető esetek... • elégtelenül fixált • túlfixált • eozinnal festett • fixálatlanul tárolt/szállított és utólagosan fixált
Elégtelenül fixált szövet MET / CEN 7
Elégtelenül fixált szövet ALK break apart
Túlfixált szövet Her2 / CEN 17
Elégtelenül fixált szövetek standard feltárással
Elégtelenül fixált szövetek Elégtelenül fixált szövetek standard feltárással módosított feltárással
Túlfixált szövetek standard feltárással
Túlfixált Túlfixáltszövetek szövetekmódosított standard feltárással feltárással
Az eozinos felületfestés hatása • Az eozin savas vegyhatású festék, így a nukleinsavak degradálódását okozhatja (savas hidrolízissel bomlanak). • Másrészt az eozin zavarja a fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) kiértékelését, mert ha nem is károsodott olyan mértékben a célszekvencia, ami a hibridizációt meghiúsítaná, de az eozin rendkívül erős fluoreszcenciája a szöveti autofluoreszcenciát olyan mértékben felerősíti, hogy az a specifikus fluoreszcens jeleket elfedheti. • Fontos tudni, hogy az eozin utólagos savas elszíntelenítése az autofluoreszcenciát nem csökkenti, de a fehérjéket, nukleinsavakat tovább károsítja. • Felületfestési célra Giemsa vagy metilénkék használata javasolt, de bármely más olyan festék alkalmazható, ami nem növeli jelentősen a háttér-fluoreszcenciát és megőrzi a makromolekulákat (próbafestés!).
Eozin-festett szövet EGFR / CEN 7
fixálatlanul szállított és utólagosan fixált szövet Her2 / CEN 17
FISH: A pre-analitikai hibák következményei A teljesen reménytelen esetek... • nem-pufferolt formalinnal (túl)fixált • nagyon túlfixált • savval dekalcinált • fixálatlanul tárolt/szállított és utólagosan fixált
Túlfixálás, nem-pufferolt formalinnal
A neutrális pufferolt formalin jelentősége • A hagyományosan használt, csapvízzel hígított formalin nem felel meg a mai felhasználási követelményeknek. • Állás során a formalinban hangyasav képződik a formaldehid oxidációja miatt továbbá, továbbá a szövetekből kioldott fehérjékben a bázikus aminocsoportok fixálás közbeni lekötődése miatt túlsúlyra jutnak a savas csoportok. • Savas közegben a fehérjék szerkezete irreverzibilisen megváltozhat (így pl. az epitópok is) és a nukleinsavak savas hidrolízissel bomlanak! • Csak a stabil neutrális pH-t biztosító, úgynevezett neutrális pufferolt formalin (NPF) alkalmas a megfelelő szöveti fixálásra. Ennek jelentőségét jól szemlélteti, hogy ugyanazon szövetminta NPFban fixált részletéből kb. 50-szer több β-aktin DNS molekula nyerhető ki, mint a nem-pufferolt formalinban fixáltból!
Erős túlfixálás (agresszív feltárás után)
Savas dekalcinálás
fixálatlanul szállított és utólagosan fixált
Következtetés
• A pre-analitikai tevékenységek korszerű kivitelezése, a megfelelő mintaelőkészítés elengedhetetlen előfeltétel nemcsak a szövettani, de a molekuláris patológiai vizsgálatok eredményességéhez is.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Prof. Dr. Tímár József Dr. Kiss András Dr. Korompay Anna Dr. Törzsök Péter Dr. Somorácz Áron Dr. Lendvai Gábor Dr. Szász Marcell Sklánitzné Samodai Erika Pekár Zoltánné Tordainé Szabó Hédi
