A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések, a TRPV1 és a. gyulladásmodellekben. Elekes Krisztián

A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések, a TRPV1 és a szomatosztatin sst4 receptorok szerepének vizsgálata légúti gyulladásmodellekben Doktori (PhD) értekezés

Elekes Krisztián

Elméleti Orvostudományok – Neurofarmakológiai program Programvezető:

Prof. Szolcsányi János

Témavezető:

Dr. Helyes Zsuzsanna

Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet Pécs 2007 1

TARTALOMJEGYZÉK

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

6

1. BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS

7

1. 1. Előzmények, történeti háttér

7

1.2. A kapszaicin-érzékeny primér szenzoros neuronok és a Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 (TRPV1) kapszaicin receptor

8

1.3. Szenzoros neuropeptidek és a kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések hármas funkciója

11

1.4. A neurogén gyulladás jelentősége a légutakban

14

2. CÉLKITŰZÉSEK

17

3. KÍSÉRLETI MODELLEK, VIZSGÁLATI MÓDSZEREK

19

3.1. KÍSÉRLETI MODELLEK

19

3.1.1. Állatok

19

3.1.2. Endotoxinnal kiváltott akut légúti gyulladás modell

19

3.1.3. Ovalbuminnal kiváltott krónikus légúti gyulladás modell

20

3.1.4. Előkezelések, kezelések

20

3.1.5. Etikai elvek

21

3.2. MÓDSZEREK

22

3.2.1. Légzésfunkciós változások mérése

22

3.2.2. Szövettani vizsgálatok és szemikvantitatív morfológiai értékelés

24

3.2.3. Szenzoros neuropeptidek kvantitatív meghatározása tüdőszövetből és plazmából 26 2

3.2.4. Mieloperoxidáz (MPO) aktivitás mérése a tüdőben

26

3.2.5. Gyulladásos citokinek kvantitatív meghatározása

27

3.2.6. Az sst4 receptor fehérje immunlokalizációja a tüdőben

27

3.2.7. Az sst4 receptor mRNS meghatározása tüdőben

28

3.2.8. Statisztikai értékelés

29

4. EREDMÉNYEK

30

4.1. KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEK ÉS A GYULLADÁSKELTŐ SZENZOROS NEUROPEPTIDEK SZEREPE AKUT LÉGÚTI GYULLADÁSBAN

30

4.1.1. A tüdő SP és CGRP koncentrációjának változása LPS-sel kiváltott gyulladás hatására

30

4.1.2. Endotoxinnal kiváltott légzésfunkciós változások

31

4.1.3. Szövettani vizsgálatok és pontozás

34

4.1.4. Mieloperoxidáz aktivitás változása a tüdőben

36

4.1.5. IL-1β koncentrációjának változása a tüdőben

37

4.1.6. A tüdő szomatosztatin koncentrációjának változása LPS-sel kiváltott gyulladás hatására

38

4.2. A TRPV1 RECEPTOR SZEREPE AKUT LÉGÚTI GYULLADÁSBAN

40

4.2.1. Endotoxinnal kiváltott légúti hiperreaktivitás TRPV1+/+ és TRPV1-/- egerekben

40

4.2.2. Endotoxinnal kiváltott gyulladásos változások a tüdőben TRPV1+/+ és TRPV1-/- egerekben

42

3

4.2.3. MPO aktivitás a tüdőben TRPV1+/+ és TRPV1-/- egerekben

43

4.2.4. Szomatosztatin koncentráció változása a tüdőben és a plazmában TRPV1+/+ és TRPV1-/- egerekben endotoxin hatására

43

4.2.5. A szomatosztatin szerepe az endotoxinnal kiváltott légúti hiperreaktivitásban, gyulladásos szövettani elváltozásokban és a mieloperoxidáz aktivitásban

45

4.3. AZ SST4 RECEPTOR EXPRESSZIÓJA A TÜDŐBEN ÉS SZEREPE AKUT LÉGÚTI GYULLADÁSBAN

50

4.3.1. Az sst4 receptor expressziója ép és a gyulladt tüdőben

50

4.3.2. Endotoxinnal kiváltott légúti hiperreaktivitás sst4+/+ és sst4-/- egerekben

51

4.3.3. Endotoxinnal kiváltott gyulladásos változások sst4+/+ és sst4-/- egerek tüdejében

53

4.3.4. Mieloperoxidáz aktivitás a tüdőben sst4+/+ és sst4-/- egerekben

54

4.3.5. Gyulladásos citokinek koncentrációja sst4+/+ és sst4-/- egerek tüdejében

55

4.4. SST4 RECEPTOR AGONISTA VEGYÜLETEK HATÁSA AKUT ÉS KRÓNIKUS LÉGÚTI GYULLADÁSOKBAN

56

4.4.1. J-2156 és TT-232 hatása az endotoxinnal kiváltott gyulladásos légúti hiperreaktivitásra

56

4.4.2. J-2156 és TT-232 hatása ovalbuminnal kiváltott gyulladásos légúti hiperreaktivitásban

57

4.4.3. J-2156 és TT -232 hatása endotoxin-kiváltotta akut légúti gyulladásra

59

4.4.4. J-2156 és TT-232 hatása ovalbuminnal kiváltott krónikus légúti gyulladásra

60

5. MEGBESZÉLÉS, KÖVETKEZTETÉSEK

64

4

A DOLGOZATBAN BEMUTATOTT ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA

73

IRODALOMJEGYZÉK

75

A DISSZERTÁCIÓ ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ PUBLIKÁCIÓK

84

A DISSZERTÁCIÓBAN NEM SZEREPLŐ EREDETI KÖZLEMÉNYEK

85

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

87

MELLÉKLET: A dolgozat alapjául szolgáló eredeti közlemények

5

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

ACE - angiotenzin konvertáló enzim AUC - görbe alatti terület C-SOM - ciklo-szomatosztatin CGRP - kalcitonin gén-rokon peptid DAB - diaminobenzidin IgE – immunglobulin E IL-1β - interleukin-1β Knockout, KO - receptor génhiányos LPS – lipopoliszacharid, endotoxin MPO - mieloperoxidáz NANC - non-adrenerg, non-kolinerg NEP - neutrális endopeptidáz NK1 - neurokinin 1 NK2 - neurokinin 2 NK3 - neurokinin 3 NKA - neurokinin A NKB - neurokinin B OVA – ovalbumin RIA - radioimmunoassay Rl - légúti ellenállás RT-PCR - reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakció RTX - resiniferatoxin SOM - szomatosztatin SOM-14 - szomatosztatin-14 sst - szomatosztatin receptor SP – P-anyag Th2 - T helper-2 sejt TNF-α - Tumor Nekrózis Faktor-α TRPV1- Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 VR1- Vanilloid Receptor 1

6

1. BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS

1. 1.

Előzmények, történeti háttér

Az 1870-es években Hőgyes Endre volt az első, aki a kapszaicin (N-vanillyl-nonenamide), a paprika csípős anyagának a hatásait vizsgálta és arra a következtetésre jutott, hogy e vegyület elsősorban az érzőidegekre hat. A kapszaicinnel történő szisztematikus kutatásokat 1962-től Szegeden Jancsó Miklós professzor, felesége Gábor Aranka és kutatócsoportunk vezetője, Szolcsányi János indította el. Később Szolcsányi professzor saját, egyre bővülő munkacsoportjával továbbra is a kapszaicin-érzékeny szenzoros neuronok kutatásánál maradt és az elmúlt több, mint 40 évben számos nemzetközi szinten is rendkívül jelentős, áttörő tudományos eredményt mutatott fel, melyek alapján a kapszaicin fontos farmakológiai eszközzé vált a fájdalomérző idegsejtek csoportosításához, élettani és kórélettani funkcióinak pontosabb, részletesebb megismeréséhez. A 70-es évek végén a kapszaicin-érzékeny érzőidegekből felszabaduló peptidek, elsősorban a P-anyag, neurogén gyulladásban kifejtett szerepének felfedezésével új korszak kezdődött a kapszaicin-kutatások történetében. Neurofarmakológiai kutatócsoportunk évtizedek óta a nocicepció és a gyulladás farmakológiájának témakörében folytat kutatásokat, amelyek elsősorban a kapszaicinérzékeny érzőideg végződések szerepének a felderítésére irányulnak. Ezek komplex szabályozó funkciójára az eddigi kísérletek alapján a bőr és az ízületi gyulladásos folyamatok, illetve a gyulladásos és neuropátiás fájdalommechanizmusok számos bizonyítékot szolgáltattak (Szolcsányi és mtsai., 1998a; Szolcsányi és mtsai, 1998b; Szolcsányi, 2004). Amikor 2003-ban bekapcsolódtam a csoport munkájába, akkorra sikerült kialakítani egy, a régiónkban egyedülálló légúti gyulladások és bronchiális válaszkészség mechanizmusainak kutatására alkalmas komplex légzésfunkciós laboratóriumot. Mivel korábbi adatok arra utaltak,

hogy

az

érzőideg

végződéseknek

és

a

belőlük

felszabaduló

szenzoros

7

neuropeptideknek jelentős szerep tulajdonítható a légúti gyulladások kialakulásában, PhD munkám témájául azt a feladatot kaptam, hogy a nemzetközi irodalom alapján kidolgozzam azokat az in vivo egér modelleket, melyek segítségével szisztematikus kísérleteket végezhetünk. Ezzel párhuzamosan másik feladatom az akkoriban vásárolt, éber és altatott állatok légzésfunkciós paramétereinek mérésére alkalmas Buxco teljes test pletizmográf beállítása, a mért adatok feldolgozása és elemzése volt.

1.2

A kapszaicin-érzékeny primér szenzoros neuronok és a Tranziens Receptor

Potenciál Vanilloid 1 (TRPV1) kapszaicin receptor Mivel a kapszaicinről bebizonyosodott, hogy kizárólag az érző idegsejtek kb. felének sejttestjén és végződésein hat, nagyon fontos eszközzé vált ezen idegsejtek vizsgálatához és jellemzéséhez (Szolcsányi és Jancsó-Gábor, 1975). Ezen kapszaicin-érzékeny primér szenzoros neuronok membránjában egy specifikus receptormolekula létezését Szolcsányi professzor már 1975-ben valószínűsítette (Szolcsányi és Jancsó-Gábor, 1975), molekuláris biológiai módszerek csak több mint 20 évvel később tették lehetővé e receptorfehérje klónozását (Caterina és mtsai, 1997). Ennek köszönhetően a 80-as évektől elinduló, az e téma iránti intenzív nemzetközi érdeklődés még rohamosabban fokozódott (Szolcsányi, 2004). A kapszaicin receptort eredetileg más vanilloid struktúrájú vegyületekkel való aktiválhatósága miatt vanilloid receptor 1-nek (VR1) nevezték, de egyéb tranziens receptor potenciál receptorokkal mutatott szerkezeti hasonlóságai miatt a mai neve Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 (TRPV1) receptor (Gunthorpe és mtsai, 2002). A TRPV1 receptor működését tekintve, egy nem szelektív kationcsatorna, aktiválásakor Na2+ és Ca2+ ionok áramlanak a sejtbe, melyet K+ ion kiáramlás és passzív Cl- ion beáramlás követ. Ennek eredményeképpen akciós potenciál generálódik, melynek következménye az érzőműködés és a nocicepció kialakulása. A Ca2+ ionok hatására pedig szenzoros

8

neuropeptidek szabadulnak fel az idegvégződésből (Helyes és mtsai, 2003; Szolcsányi, 1996). Tartós aktiváció következményeképpen a hosszan nyitvatartott ioncsatornán keresztül beáramló nagy mennyiségű Ca2+ ion hatására létrejön az ún. kapszaicin-deszenzibilizáció jelensége, mely az érzőideg végződéseket a kémiai ingerekkel szemben érzéketlenné teszi anélkül, hogy elektromos stimulusokkal szemben válaszkészségük megváltozna. Ennek hátterében elsősorban a mitokondriumok duzzadása, proteázok aktiválása és a feszültségfüggő Ca2+ csatornák gátlása áll (Bevan és Szolcsányi, 1990; Oláh és mtsai, 2001). A TRPV1 receptort kapszaicinen kívül forró ingerek és kémiai ingerek széles skálája képes aktiválni. Számos más növényi eredetű vanilloid, például a marokkói kaktuszféléből kivont resiniferatoxin (RTX), a borsban található piperin, és a gyömbérben lévő zingeron is stimulálják a receptort. Ezen túlmenően még többféle endogén fájdalom- és gyulladáskeltő molekula, például endokannabinoidok közé tartozó anandamid, protonok, illetve az arachidonsavból oxidációval keletkező termékek és a magas – 42 oC feletti – hőinger ugyancsak aktivátorai a receptornak (Tominaga és mtsai, 1998) (1. ábra).

H+

Forró hőmérséklet

Passzív Cl- beáramlás

K+

H2O

EC

IC

12(S)HPETE Kapszaicin AEA

Belső áram

Ca2+ Na+

NaCl Feszültségfüggő Proteáz Ca2+-csatorna aktiváció gátlás Mitokondrium Duzzadás

Depolarizációs küszöb

duzzadás

CGRP, SP/NKA, SOM felszabadulás

Transzmitter felszabadulás gátlása

Idegvégződés lízise

Akciós potenciál

1. ábra TRPV1 receptor vázlatos szerkezete és aktivációja 9

A TRPV1 receptor szerepének különféle fiziológiai és patofiziológiai folyamatokban betöltött szerepének vizsgálatában óriási előrelépést jelentett, hogy 2000-ben egy angol és egy amerikai munkacsoport egymástól függetlenül receptor génhiányos (knockout) egereket állított elő (Caterina és mtsai, 2000; Davis és mtsai, 2000). Munkacsoportunk ezen egereken végzett korábbi kísérletei azt mutatták, hogy e receptor különféle gyulladásos mediátorokkal történő aktivációja jelentősen fokozza a krónikus ízületi gyulladásban a duzzadást, a szöveti károsodást és a fájdalmat (Szabó és mtsai, 2005). Ezzel szemben a receptor hiányában szignifikánsan fokozódott a késői típusú hiperszenzitív reakció a bőrben (Bánvölgyi és mtsai, 2004), valamint a mechanikai hiperalgézia polineuropátia modellekben (Bölcskei és mtsai, 2005). Mindezek alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a TRPV1 receptor egy komplex szabályozó molekula, melynek gyulladást/nocicepciót fokozó és gátló szerep is tulajdonítható a kísérleti modelltől, illetve a betegség patomechanizmusától függően. A légutakban a kapszaicin-szenzitív peptiderg afferensek (Watanabe és mtsai, 2005) nem csak érző funkciókat közvetítenek, hanem neuropeptidek - mint például a kalcitonin gén-rokon peptid (CGRP), tachykininek, illetve P-anyag (SP) - kibocsátásával lokális bronchokonstriktor (Szolcsányi és Barthó , 1982) és gyulladáskeltő hatással is rendelkeznek (Lundberg , 1995; Maggi, 1995; Szolcsányi, 1996). Rágcsálókban a kapszaicinnel vagy a resiniferatoxinnal rendszeres,

nagy

adaggal

történő

előkezelés

előidézi

ezen

kapszaicin-szenzitív

kemonociceptív C- és Aδ-rostok végkészülékeinek degenerációját, amelyek Bezold-Jarish és köhögési reflexet okozhatnak (Szállási és Blumberg, 1999; Szolcsányi, 1996). Ezen neurogén mechanizmusnak a gyulladásos reakciókban van szerepe, ahol az irritáns ágenseknek a skálája igen széles, mint például a cigaretta füst, a SO2, az éter, stb. (Barnes, 2001a; Lundberg , 1995; McDonald, 1987).

10

1.3.

Szenzoros neuropeptidek és a kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések hármas funkciója

A kapszaicin-érzékeny, TRPV1 receptort expresszáló, érzőideg-végződések különlegessége, hogy a klasszikus érző illetve fájdalomérző (afferens) működésen túl lokális és szisztémás efferens funkciókkal is rendelkeznek a belőlük közvetlenül, reflex nélkül felszabaduló szenzoros neuropeptidek közvetítésével (Szolcsányi és mtsai, 1991). A kalcitonin gén-rokon peptid (CGRP) és a tachykininek, mint a P-anyag (SP), a neurokinin A (NKA) és a neurokinin B (NKB) értágulatot, plazmafehérjék szövetekbe történő kiáramlását (duzzadást) és gyulladásos sejt aktivációt okoznak az innervált területen, amelyet neurogén gyulladásnak nevezünk. A neurogén komponens jelentős szerepet játszik számos gyulladásos kórkép kialakulásában, pl. krónikus ízületi és légúti gyulladás, asztma, a bőr és a gyomor-bél rendszer gyulladásos folyamatai (Maggi, 1995; Szolcsányi J, 1996). Jelenleg egyetlen forgalomban lévő gyógyszercsoport sem tudja megbízhatóan és hatékonyan gátolni a neurogén gyulladást (Helyes és mtsai, 2003). A CGRP a kapszaicin-érzékeny afferensek egy részében a tachykininekkel kolokalizáltan tárolódik és azokkal együtt ürül (Maggi és mtsai, 1995). Biológiai hatásait két receptoron (CGRP1, CGRP2) keresztül fejti ki. (Dakhama és mtsai, 2004) Erős értágító hatású anyag in vitro és in vivo egyaránt (McCormack és mtsai, 1989). Komplex immunmodulátor hatással rendelkezik (Springer és mtsai, 2003), stimulálja a granulocita akkumulációt, a T sejt adhéziót és a gyulladáskeltő citokinek termelődését (Barnes, 2001b). A tachykininek hatásait három tachykinin receptor altípus, a neurokinin 1 (NK1), a neurokinin 2 (NK2) és a neurokinin 3 (NK3) receptor közvetíti. Az NK1 receptort elsősorban a P-anyag, a NK2 receptort az NKA, míg az NK3 receptort az NKB aktiválja (Frossard és Advenier, 1991; Regoli és mtsai, 1994). A neurogén gyulladásban a plazmafehérje kiáramlásért a SP és az NK1 receptor aktiváció a felelős (Advenier és mtsai, 1997), míg az NKA és az NK2 receptorok 11

főképp simaizom kontrakciót vált ki, immun- és gyulladásos sejteket stimulál (De Swert és Joos, 2006). Az NK3 receptorok lokalizációját idegvégződéseken írták le (De Swert és Joos, 2006). Munkacsoportunk egy évtizedes munkájával számos kísérleti bizonyítékot szolgáltatott arra, hogy ugyanezen idegvégződésekből az előzőekben említett gyulladáskeltő neuropeptidek mellett szomatosztatin (SOM) is felszabadul, amely a keringésbe jutva szisztémás gyulladásgátló és antinociceptív hatásokat fejt (Helyes és mtsai, 2004; Szolcsányi és mtsai, 2004; Szolcsányi és mtsai, 1998a; Szolcsányi és mtsai, 1998b; Than és mtsai, 2000). E szomatosztatin által közvetített szisztémás efferens funkciót Szolcsányi professzor a szomatosztatin endokrin és parakrin hatásainak analógiájára „szenzokrin” működésnek nevezte el (Szolcsányi és mtsai, 2004) (2. ábra). - afferens funkció: funkció: érzőműködés, nocicepció nocicepció - lokális efferens funkció: funkció: értágulat, értágulat, neurogén gyulladás - szisztémás efferens funkció: funkció: gyulladásgátló, fájdalomcsillapító hatás

Hátsó gyöki ganglion: ganglion: Ganglion nodosum

Stimuláció: (kémiai irritánsok, irritánsok, hő, hő, protonok ok, , stb.) .) proton stb

Idegvégződés LOKÁLIS VÁLASZ

P-anyag, anyag, NEUROPEPTID NKA, NKA, FELSZABADULÁS CGRP

plazma fehérje kiáramlás értágulat

SOM

SZISZTÉMÁS VÁLASZ

AntiAnti-nociceptív hatás Gyulladásgátló hatás

2. ábra. A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések hármas hatása

A SOM 14 és 28 aminosavat tartalmazó ciklikus peptid (Brazeau, 1986) amelyet neuronok, neuroendokrin, gyulladásos és immunsejtek termelnek (Patel, 1999). A szomatosztatin sok 12

helyen megtalálható a szervezetben, a gyomor-bél rendszerben, a pajzsmirigyben, a vesében, a mellékvesében, az ivarszervekben, a gyulladásos sejtekben és a központi idegrendszerben is (Patel és mtsai, 1995; ten Bokum és mtsai, 2000). A SOM jelenlétét az elsődleges érző neuronokban már évtizedekkel ezelőtt leírták (Hökfelt és mtsai, 1976; Reichlin, 1983). A szomatosztatin gátló hatást gyakorol számos hormon (növekedési hormon: GH, inzulin, glukagon, stb.) szekréciójára, a gasztrointesztinális motilitásra és emésztőnedv termelésre, a kognitív funkciókra, és a tumorsejtek proliferációjára (Pintér és mtsai, 2006), melyek öt különböző Gi-proteinhez kötött membrán receptoron (sst) keresztül valósulnak meg (Hoyer és mtsai, 1995; Pintér és mtsai, 2006). E receptorok szintetikus szomatosztatin analóg kötő képességük alapján két csoportra oszthatók: a SRIF1 csoport az sst2, sst3 és sst5 receptorokat tartalmazza, amelyek nagy affinitással képesek kötni az oktapeptid analógokat, míg a SRIF2 csoport az sst1 és sst4 receptorokat foglalja magába, melyekhez ezen analógok csekély affinitást mutatnak (Hoyer és mtsai, 1995; Patel és mtsai, 1993; Pintér és mtsai, 2006). Az irodalmi adatok alapján igazolt, hogy az endokrin hatásokat a SRIF1 család tagjai közvetítik (Raynor és Reisine, 1992), eddigi eredményeink azonban arra utaltak, hogy a SOM gyulladáscsökkentő és antinociceptív hatásai a SRIF2 receptorokon, elsősorban az sst4 receptorokon keresztül valósulnak meg (Helyes és mtsai, 2001; Pintér és mtsai, 2002; Pintér és mtsai, 2006; Szolcsányi és mtsai, 2004). Az sst4 receptorok lokalizációjára és funkciójára vonatkozóan azonban kevés irodalmi adat áll rendelkezésre. A natív szomatosztatin molekula rövid plazma féléletideje (<3 min) és széles hatásspektruma miatt nem lehet potenciális jelölt új típusú gyulladásgátló és fájdalomcsillapító gyógyszerek kifejlesztéséhez, azonban a stabil, elsősorban sst4-szelektív agonisták ígéretesek lehetnek. Ilyen a TT-232, amely egy stabil ciklikus heptapeptid analóg (MTA, Peptid Biokémiai Kutató Csoport, Orvosi Kémia, Semmelweis Egyetem, Budapest). E vegyület, amely az sst4 receptor iránt mutatta a legnagyobb affinitást (Helyes és mtsai, 2006), nem gátolja a növekedési

13

hormon, ill. a gasztrin szekrécióját, viszont erős anti-proliferatív, gyulladásgátló és antinociceptív hatással rendelkezett több kísérleti modellben (Helyes és mtsai, 2000; Helyes és mtsai, 2001; Helyes és mtsai, 2004; Helyes és mtsai, 2006). Egy új szulfonamido-peptidomimetikum, a J-2156 [(1'S,2S)-4-amino-N-(1'-carbamoyl-2'phenylethyl)-2-(4''-methyl-1''-naphthalenesulfonamino)butanamid] (Juvantia Pharma, Turku, Finnország), a szomatosztatin receptor ligandok kémiailag egy új osztályába tartozik. A J2156 nM nagyságrendű affinitással rendelkezik az emberi sst4 receptor iránt, amely a natív szomatosztatinnál is erősebb affinitást jelent. Ez körülbelül 400-szor nagyobb szelektivitást jelent a többi humán szomatosztatin receptor altípushoz viszonyítva (Engstrom és mtsai, 2005).

1.4.

A neurogén gyulladás jelentősége a légutakban

Számos bizonyíték van arra, hogy a vegetatív idegrendszer mellett a non-adrenerg, nonkolinerg (NANC) - elsősorban szenzoros - rostok effektor működésének változásai is jelentős szerephez jutnak a gyulladásos légúti betegségek pathomechanizmusában. A napjainkban népbetegségnek tekinthető asztma kialakulásában és a hátterében álló gyulladásos folyamatok fenntartásában fontos szerepet játszanak a hörgőket beidegző kapszaicin-érzékeny rostokból felszabaduló gyulladáskeltő neuropeptidek. A CGRP, a SP és az NKA a tüdőben különféle stimulusok (gyulladásos mediátorok, protonok, neurotoxinok, cigarettafüst) hatására exocitózissal szabadulnak fel a tüdő afferens rostjaiból (Lundberg , 1995). Ma már bizonyítékok vannak arra is, hogy tachykininek (elsősorban SP) az immunrendszer sejtjeiben is szintetizálódnak. A két fő metabolizáló enzim az angiotenzin konvertáló enzim (ACE) és a neutrális endopeptidáz (NEP). Mivel az erek endotelében található ACE főként az intravaszkuláris tachykinineket képes bontani, elsősorban a NEP aktivitása határozza meg a légutak tachykinin válaszkészségét. 14

A CGRP és a SP a beidegzett területen vazodilatációval és plazma extravazációval járó neurogén gyulladást okoznak a tüdőben. Az előzőekben vázolt szenzoros-effektor mechanizmus jelentősen hozzájárul a bronchokonstrikcióhoz és a nyálkahártya ödémához, így a fokozott légúti ellenállás kialakulásához (Lundberg , 1995). A SP serkenti továbbá az erek proliferációját, ez a hatás tehető felelőssé az asztmában szenvedők légútaiban tapasztalható megváltozott érstruktúráért. A SP és az NKA a tüdő fibroblasztjait is stimulálja, ezzel hozzájárul az asztmásokban tapasztalt fibrotikus elváltozásokhoz (Barnes, 2001b). A tachykininek az immun- és gyulladásos sejtek működését is serkentik, a P-anyag nem receptor mediált hatással degranulálja a hízósejteket és az eosinophil granulocitákat, valamint serkenti a kemotaxist. A tachykininek fokozzák az alveloáris makrofágokban a gyulladásos citokinek (pl. IL-6) termelését (Barnes, 2001b; Joos és mtsai, 2001). Az NK1 receptorok elsősorban a neurogén gyulladásos reakciókban játszanak szerepet (szekréció fokozódás, vazodilatáció, plazma extravazáció, stb), az NK2 receptorok inkább a bronchokonstrikcióban és a bronchiális hiperreaktivitásban fontosak (Advenier és mtsai, 1997; Joos és mtsai, 2001; Lagente és Advenier, 1998). Akut gyulladásban a fehérvérsejtszám jelentős növekedése tapasztalható neutrofil leukociták infiltrációjával, a gyulladásos citokinek (TNF-α, IL-1β) és egyéb gyulladásos mediátorok mennyiségének

növekedésével,

amelyek

a

szenzoros

idegvégződéseket

aktiválják.

Szövettanilag diffúz alveoláris károsodás látható, jelentős mértékű interstíciális fibrózissal, résnyire szűkült légterekkel, exsudatummal. Az alveoláris szeptumok fala megvastagszik a gyulladásos sejtek beáramlásának hatására (Zsiray, 2003). Az asthma bronchialét allergiás (extrinsic) és nem allergiás (intrinsic) csoportokra oszthatjuk. Az allergiás asztmánál antigén hatására, lymphocyták közvetítésével a hízósejtek felszínéhez allergén specifikus IgE antitestek kötődnek, majd egy Th2 típusú mechanizmust elindítva a szervezet túlérzékennyé válik. Ismételt allergén bejutásakor aktiválódnak a már szenzibilizált

15

hízósejtek, degranulációval felszabadulnak a bennük lévő mediátorok (pl. hisztamin) melyek elindítják a gyulladásos folyamatokat. A gyulladásos reakcióban eozinofil és neutrofil granulociták is részt vesznek, melyek oxidatív károsodást okoznak a légutak epithel rétegében. A leváló sejttörmelék, a képződött váladékkal együtt elzárhatja a hörgők lumenét, amit súlyosbít a nyálkahártyák ödémája és a bronchusgörcs is. A nem allergiás (intrinsic) asztmában az epithelsejtek között és mögött található szenzoros irritáns receptorok (C rostok) izgatása történik nem specifikus ingerekkel. Ez az inger eljut a vagusközpontba, ahol átkapcsolódik, majd a vagus efferens ágon a paraszimpatikus ganglionok

közvetítésével

a

paraszimpatikus

posztganglionális

idegvégződésekből

acetilkolint szabadít fel. Ez okozza a bronchokonstrikciót, a kapilláris-permeabilitás növekedését és a hízósejt-degranulációt, mely az allergiás asztmához hasonló tüneteket eredményez. A gyulladásos mediátorok hatására az érzőideg-végződések tovább aktiválódnak és a következményes neurogén gyulladás fokozza a folyamat súlyosságát (Nagy, 2003). A krónikus obstruktív légúti betegségben a bronchialis obstrukció szövetkárosító gázok és részecskék inhalációjának hatására kialakuló, kóros gyulladásos reakció következménye. Jellemző, hogy a bronchusok és bronchiolusok falában megszaporodnak a neutrofil granulociták, az aktivált makrofágok, valamint a limfociták, tipikus krónikus gyulladásra jellemző kép alakul ki. A csillószőrök károsodnak, majd fokozatosan elpusztulnak. A kehelysejtek túltengése, a submucosában lévő nyákmirigyek hiperpláziája figyelhető meg. A légúti váladék megszaporodik és sűrűvé, tapadóssá válik. A kilégzési áramlás korlátozottságát a kislégutak gyulladásos szűkülete és a tüdőszövet destrukciója okozza. A széteső neutrofil granulocitákból és a makrofágokból szabad gyökök, proteolitikus enzimek szabadulnak föl. Ez az alveolusfal pusztulását, a légzőfelszín beszűkülését, a tüdőszövet rugalmasságának csökkenését okozza, amely emfizéma kialakulásához vezet (Böszörményi és mtsai, 2000).

16

2.

CÉLKITŰZÉSEK

A fentiekben vázolt előzmények alapján PhD munkám célja a kapszaicin-érzékeny érzőidegvégződések és a belőlük felszabaduló szenzoros neuropeptidek légúti gyulladásban betöltött szerepének vizsgálata volt funkcionális, morfológiai és biokémiai módszerekkel.

2.1. Mivel az irodalomban a kapszaicin-érzékeny afferensek légúti gyulladásban betöltött szerepére vonatkozóan ellentmondást találtunk, kísérletsorozatunk első célkitűzése az volt, hogy megvizsgáljuk e rostok és a gyulladáskeltő szenzoros neuropeptidek funkcióját endotoxinnal kiváltott akut interstíciális légúti gyulladásban és következményes bronchiális hiperreaktivitásban egérben.

2.2. A TRPV1 génhiányos egerekkel végzett előzetes kísérleteink alapján e receptor komplex szabályozó molekulának bizonyult bőr és ízületi gyulladás, valamint neuropátia modellekben. Ezért következő célunk az volt, hogy tanulmányozzuk ezen ioncsatorna reguláló szerepét endotoxin-indukálta légúti gyulladásban és gyulladásos válaszkészség fokozódásban.

2.3. Előző kísérletsorozatunkban kapott eredményeink azt bizonyították, hogy a tüdő TRPV1 receptorainak aktivációjával szomatosztatin szabadul fel, amely gátolja a gyulladásos folyamatokat és a hiperreaktivitást. Feltételeztük, hogy e gátló hatásokat az sst4 receptor

17

közvetíti, de e receptor lokalizációjára és funkciójára vonatkozóan kevés irodalmi adat állt rendelkezésre. Ezért munkánk harmadik célja az volt, hogy megvizsgáljuk az sst4 mRNS és a receptor fehérje expresszióját és gyulladás hatására történő változását egértüdőben, továbbá a receptor funkcióját endotoxinnal kiváltott légúti gyulladásban sst4 génhiányos egerek segítségével.

2.4. Mivel az sst4 receptor expresszióját molekuláris biológiai és immunhisztokémiai módszerekkel bizonyítottuk az egér tüdőben, illetve szelektív sst4 receptor agonisták gyulladásgátló hatását más modellekben is igazoltuk, kísérletsorozatunk következő célja, hogy a heptapeptid analóg TT-232 és a peptidomimetikum J-2156 vegyületeket endotoxinnal kiváltott akut, és ovalbuminnal előidézett krónikus légúti gyulladás egérmodellekben is megvizsgáljuk.

18

3.

KÍSÉRLETI MODELLEK, VIZSGÁLATI MÓDSZEREK

3.1.

KÍSÉRLETI MODELLEK

3.1.1. Állatok A kísérleteket nőstény CD1, Balb/c illetve C57Bl/6 egereken (20-25 g) végeztük. Két kísérletsorozatban a C57Bl/6 törzsből előállított TRPV1 receptor-gén hiányos (TRPV1-/-; Dr. J.B. Davis, GlaxoSmithKline, Harlow, U.K.) illetve sst4 receptor knock out (sst4-/-; Dr. Piers Emson, Laboratory of Molecular Neuroscience, The Babraham Institute, Cambridge, U.K.) egereket és vad típusú megfelelőiket (TRPV1+/+, sst4+/+) használtuk.

3.1.2. Endotoxinnal kiváltott akut légúti gyulladás modell Kísérleteink nagy részében az endotoxinnal (lipopoliszacharid, LPS) kiváltott akut interstíciális pneumonitis modellt használtuk. Az LPS a Gram negatív baktériumok sejtfalának alkotója, amely a környezetünkben is megtalálható, emiatt ez egy jelentős kockázati tényező asztmában és az asztmás roham súlyossága nagymértékben függ az endotoxin koncentrációjától (Lapa e Silva és mtsai, 2000; Thorne és mtsai, 2005). Intranazálisan adott lipopoliszacharid egerekben egy általánosan használt kísérleti modell, amellyel a tüdőben lokalizáltan váltható ki gyulladásos reakció anélkül, hogy más szervekben szisztémás károsodást okoznánk (Chignard és Balloy, 2000; Okamoto és mtsai, 2004; Savov és mtsai, 2002). Az endotoxin aktiválja a makrofágokat (Lapa e Silva és mtsai, 2000), melynek hatására belőlük különböző gyulladásos citokinek (IL-1β, TNF-α) szabadulnak fel. Ezek más egyéb mediátorokkal együtt gyulladást idéznek elő a tüdőben neutrofil beáramlással,

a

plazmafehérjéknek

következményes

extravazációjával,

amely 19

perivaszkuláris/peribronchiális ödéma formájában nyilvánul meg (Chignard és Balloy, 2000; Savov és mtsai, 2002), továbbá a nyáktermelő goblet sejtek számának felszaporodása is látható. A szubakut légúti gyulladást éteres altatásban 60 μl Escherichia coli (serotype: 083) lipopoliszacharid (LPS; 167 μg/ml; Sigma, St. Louis, USA) intranazális alkalmazásával idéztük elő 24 órával a légúti hiperreaktivitás mértékének meghatározása előtt.

3.1.3. Ovalbuminnal kiváltott krónikus légúti gyulladás modell Egerekben az egyik legáltalánosabb krónikus légúti gyulladás modell az ovalbuminnal (OVA) kiváltott asztma modell. Balb/c egereket az 1. és a 14. napon 20 μg i.p. ovalbuminnal szenzitizáltunk (30 μl AlumImject-et tartalmazó 100 μl volumenben, az egyenletes antigén felszívódás érdekében). Az első szenzitizáló injekciót követően a 28. 29. és a 30. napon 5 %os OVA oldat 20 perces inhaláltatásával (4 ml/5 állat, 0.2 ml/perc) váltottuk ki a légúti gyulladást. A szenzitizáció során az OVA immunválaszt indukál, amelyben a T helper-2 (Th2) limfociták száma megemelkedik, citokin termelésük fokozódik, és OVA-specifikus IgE antitestek termelődnek. A gyulladást granulocita, elsősorban eozinofil infiltráció, fokozott nyáktermelés és a légutak válaszkészségének fokozódása jellemzi (Penn és mtsai, 2007).

3.1.4. Előkezelések, kezelések Az első kísérletsorozatban a kapszaicin-érzékeny idegvégződések tartós inaktiválására egy állatcsoportot előkezeltünk a TRPV1 receptor agonista resiniferatoxin (RTX (Sigma, St. Louis, MO, USA)) nagy dózisainak ismételt adásával (deszenzitizálás). Az RTX-et kevés 96 %-os alkoholban oldottuk, majd steril, fiziológiás sóoldattal higítottuk a megfelelő koncentrációkra (3, 7, 10 μg/ml). Három egymást követő napon, a nyaki régióba s.c. adtuk 30, 20

70, 100 μg/kg dózisokban, altatott állatoknak. Az így deszenzibilizált egereket 14 nappal a kezelés után vontuk be a kísérletekbe (Helyes és mtsai, 2004; Szolcsányi és mtsai, 1990). Más csoportokat NK1 receptor antagonistával (SR 140333; Sanofi-Synthelabo, France; 160 μg/kg s.c.), NK2 receptor antagonistával (SR 48968; Sanofi-Synthelabo, France; 160 μg/kg s.c.), illetve CGRP1 receptor antagonistával (CGRP(8-37); Sigma, St. Louis, MO, USA; 160 μg/kg s.c) kezeltünk háromszor, 30 perccel az LPS beadása előtt, illetve 8 és 23 órával utána. A második kísérletsorozatban a TRPV1 receptor aktivációval felszabaduló SOM hatásának gátlására a szomatosztatin receptor antagonista ciklo-szomatosztatinnal (C-SOM; 250 μg/kg i.p.; Sigma, St. Louis, MO, USA) kezeltük a TRPV1+/+ egereket. Az exogén szomatosztatin hatásának vizsgálata céljából mindkét állatcsoportban szomatosztatin-14 (SOM-14; 100 μg/kg i.p.; Sigma, St. Louis, MO, USA) kezelést végeztünk. A C-SOM és a SOM-14 injekciókat is négyszer adtuk, 30 perccel az LPS beadása előtt, majd 6 óránként a 24 órás kísérleti periódus során. A negyedik kísérletsorozatban a két sst4 receptor agonista vegyületet (TT-232, J-2156) 500 μg/kg i.p. dózisban adtunk mindkét modellben a légzésfunkciós mérés előtt 20 perccel. Más csoportokban, ahol a vegyületek gyulladásgátló hatását is vizsgálni kívántuk, a gyulladásos folyamatok kialakulása alatt háromszor adtuk: az LPS modellben 20 perccel az endotoxin beadása előtt, majd 8 és 24 órával később; az OVA modellben az ovalbumin inhalációval párhuzamosan mindhárom nap, az inhaláltatás előtt 20 perccel, majd 6 és 12 órával később, valamint a mérés előtt 20 perccel.

3.1.5. Etikai elvek Az összes alkalmazott kísérleti eljárás megfelelt a Helsinki Nyilatkozatban foglalt ajánlásoknak és eleget tett az állatkísérletek végzéséről szóló 243/1998 (XII. 31.) számú

21

kormányrendelet előírásainak. A kísérleti protokollokat a Pécsi Tudományegyetem állatkísérletekkel foglalkozó Etikai Bizottsága engedélyezte (licence No.: BA02/2000-162006).

3.2.

MÓDSZEREK

3.2.1. Légzésfunkciós változások mérése A légzésfunkciós változásokat 24 órával az LPS kezelést követően, illetve ovalbuminos kezelés esetén a 32. napon, Buxco teljes test pletizmográffal (Buxco Europe Ltd, Winchester, UK, 3. ábra) éber, szabadon mozgó állatokon mértük. A hörgőgörcsöt a muszkarin receptor agonista carbachol (50 μl/egér; 5.5; 11; 22.0 mM) növekvő koncentrációinak 1.5 perces inhaláltatásával váltottuk ki. Az inhaláltatást koncentrációnként 15-15 perces mérési periódus követte, melynek végére a megfigyelt paraméterek visszatértek az alaphelyzetbe.

3. ábra. Buxco teljes test pletizmográf készülék 22

A mért paraméter a következményes légúti ellenállás fokozódással egyenesen arányos Penh (enhanced pause) (5. ábra). A Penh a következő képlet alapján számított érték:

⎛ te ⎞⎛ PEF ⎞ − 1⎟⎟⎜ ⎟ ⎝ tr ⎠⎝ PIF ⎠

Penh = ⎜⎜

Ahol te a kilégzési, tr a relaxációs idő; PEF a kilégzés, PIF pedig a belégzés alatt mért maximális áramlás (4. ábra). Minden carbachol stimulusra az alapvonal feletti százalékos Penh változásokat számoltuk.

4. ábra. Penh képletében szereplő változók 50

Intakt

LPS

45

45

40

40

35

35

30

30 Penh

Penh

50

25

25

20

20

15

15

10

10

5

5

0

0 = 1 min

A.

Base 5,5

11

= 1 min

Base 5,5

22

Carbachol koncentráció (mM)

B.

11

22


5. ábra. Penh regisztrátumok. Egy intakt (A.) és egy LPS-sel kezelt C57Bl/6 egér (B.) Penh görbéinek változása carbachol hatására

23

Mivel a Penh mérésével kapcsolatban az irodalom ellentmondásos, altatott, tracheotomizált és mesterségesen lélegeztetett (150 lélegzet/perc és egy VT =0.2 ml) egerekben direkt módon is megmértük a légúti ellenállást (Rl: ΔcmH2O*sec/ml). A tracheába egy 18G kanült vezettünk, amelyet szorosan rögzítettünk és egy kétágú csatlakozót kapcsoltunk hozzá. A lélegeztető készülék (MiniVent Type 845, Hugo Sachs Electronic, Harvard Apparatus, Germany) belégzési és kilégzési oldalát ehhez csatlakoztattuk. Az áramlási volumenek digitális differenciálásával folyamatosan mértük a légúti ellenállást (Rl). A carbachol aeroszolt az éber méréssel azonos protokoll szerint, direkt módon a tracheába porlasztottuk. Minden carbachol stimulusra az alapvonal feletti százalékos Rl változásokat számoltuk. Ezzel a kísérlettel bizonyítottuk, hogy a Penh mértékének változása valóban az alsó légútak hiperreaktivitását mutatja. A légzésfunkciós méréseket követően az állatokat ketamin (100 mg/kg i.p.; Richter-Gedeon Ltd., Budapest, Magyarország) és xylazine (10 mg/kg i.m.; Phylaxia-Sanofi, Állatorvosi Biológia Co. Ltd., Budapest, Magyarország) anesztéziában cervikális diszlokációval leöltük. A tüdőket kimetszettük, az egyik felét 4%-os pufferolt formaldehidbe helyeztük szövettani feldolgozás céljából. A másik felét kettő darabba vágtuk, lemértük a nedves súlyukat, és mindkét mintát lefagyasztottuk folyékony nitrogénben és -80 ºC tároltuk neuropeptid, mieloperoxidáz és IL-1β meghatározás céljából. A plazma szomatosztatin meghatározás esetén a kísérlet végén (25 órával az LPS kezelés után) szívpunkcióval vért vettünk.

3.2.2. Szövettani vizsgálatok és szemikvantitatív morfológiai értékelés A 4 %-os pufferolt formalinban fixált, paraffinba ágyazott tüdőmintákból mikrotommal 5-7 μm vastagságú metszeteket készítettünk, majd hematoxilin-eosin (HE, hematoxylin: Sigma St Louis, MO, USA, eosin: Molar Chemicals Ltd., Budapest, Hungary), illetve a nyáktermelő sejtek láthatóvá tételéhez perjódsav-Schiff (PAS, Sigma St Louis, MO, USA) festést 24

végeztünk. Az így készült metszeteket fénymikroszkóppal szemikvantitatív pontrendszer alapján értékeltük. Minden tüdőmintából 3 mélységből készítettünk metszeteket, és ezeket átlagoltuk. A következő paraméterek kerültek pontozásra LPS-kiváltotta légúti gyulladásban: perivaszkuláris ödéma (0-3 (0: hiányzik; 1: enyhe vagy mérsékelt, a perivaszkuláris tereknek kevesebb, mint 25 % érintett; 2: fokozott, a perivaszkuláris tereknek 25 %-nál több de 75 %nál kisebb része érintett; 3: súlyos, a perivaszkuláris tereknek több, mint 75 %-a érintett)); perivaszkuláris/peribronchiális granulocita infiltráció (0-3 (nagy nagyítással; 0: hiányzik; 1: enyhe akut gyulladás, a perivaszkuláris térben kevesebb, mint 5 neutrofil; 2: mérsékelt akut gyulladás a perivaszkuláris térben, kiterjed a peribronchiális terekre és több, mint 5 neutrofil ezekben a régiókban; 3: súlyos gyulladás a perivaszkuláris és peribronchiális terekben, a legtöbb neutrofil a bronchiolusok körül)); nyáktermelő kehelysejtek (goblet-sejtek) hiperpláziája (0-2 (0: hiányzik; 1: néhány goblet sejt a bronchiolusokban; 2: nagy száma a goblet sejteknek)); alveoláris makrofág infiltráció (0-2 (0: hiányzik; 1: kevesebb, mint 25 %ában az alveoláris tereknek; 2: több, mint 25 %-ában az alveoláris tereknek)) (Zeldin és mtsai, 2001). Az ovalbumin-indukálta asztma modellben a gyulladás okozta változások a következőképp kerültek pontozásos értékelésre: a peribronchiális/perivaszkuláris terekbe való eozinofil sejtek infiltrációja (0-4 (0: hiányzik, 1: kismértékű infiltráció, 2: mérsékelt infiltráció, kismértékű szövetkárosodással, 3: mérsékelt infiltráció, jelentős szövetkárosodással, 4: nagymértékű infiltráció és jelentős szövetkárosodás)), nyálkahártya ödéma/nyáktermelés (0-3 (0: normál, 1: enyhe ödéma, 2: mérsékelt ödéma mérsékelt nyáktermeléssel, 3: kifejezett ödéma túlzott nyáktermeléssel)) és hámsejtek károsodása (0-3 (0: normál, 1: kismértékű hámsejt károsodás, 2: mérsékelt hámsejt károsodás, 3: nagy arányú sejtkárosodás, a hám metapláziája)) (Underwood és mtsai, 1995; Xie és mtsai, 2002).

25

3.2.3. Szenzoros neuropeptidek kvantitatív meghatározása tüdőszövetből és plazmából A fagyasztás után kiolvasztott tüdőmintákat aprítottuk és homogenizáltuk 4 ml 20 mM nátrium-foszfát pufferben (pH 7.4). A homogenizátumot lecentrifugáltuk (10000 g 4 ºC 10 min), az üledéket használtuk a mieloperoxidáz aktivitás meghatározásához, a felülúszót pedig a

közvetlen

radioimmunoassay-vel

(RIA)

történő

SP,

CGRP

és

szomatosztatin

meghatározáshoz (Németh és mtsai, 1996; Németh és mtsai, 1998; Németh és mtsai, 1999). A plazma szomatosztatin meghatározás céljából a szívpunkcióval vett 1 ml vért EDTA-t (2 mg) és Trasylolt (350 U) tartalmazó jégben hűtött Eppendorf csövekbe tettük, majd lecentrifugáltuk (2200 rpm, 10 min, 4°C). A peptidek kivonása a plazmából 3-szoros térfogatnyi tömény alkohollal történt. A kicsapódás után a mintát másodjára is lecentrifugáltuk (2000 rpm, 10 min, 4 °C), folyékony nitrogénben bepároltuk, majd RIA pufferben visszaoldottuk (Németh és mtsai, 1996; Németh és mtsai, 1998; Németh és mtsai, 1999).

3.2.4.

Mieloperoxidáz (MPO) aktivitás mérése a tüdőben

A granulociták, különösen a neutrofilek, felhalmozódásának meghatározásához a -80 ºC-ra fagyasztott tüdőmintából mértük az MPO aktivitást. A tüdődarabokat olvadás és aprítás után homogenizáltuk 4 ml 20 mM nátrium-foszfát pufferben (pH 7.4), majd lecentrifugáltuk (10000 g, 4 ºC, 10 min). Az üledéket reszuszpendáltuk 4 ml 50 mM nátrium-foszfát pufferben, mely 0.5 % hexadecil-trimetil-ammonium-bromidot (pH 6.0) tartalmazott, és újra centrifugáltuk. A felülúszó MPO aktivitásának vizsgálatához H2O2-3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB/H2O2) (Sigma, St. Louis, MO, USA) reagenst használtunk, 96-lyukú lemezen, szobahőmérsékleten. A minták optikai denzitását (OD) mikrolemez leolvasóban, 620 nm-en mértük, 5 perces időközönként, 30 percen keresztül. A mintában a neutrofil felhalmozódás

26

megállapítható az MPO enzim aktivitás mértéke és egy humán standard MPO preparátum összehasonlításával (Sigma, St. Louis, MO, USA).

3.2.5. Gyulladásos citokinek kvantitatív meghatározása A lefagyasztott tüdőmintákat felolvasztás után homogenizáltuk 450 μl RPMI 1640 pufferben (Biochrom Ltd., Berlin, Germany), mely 50 μl fenil-metil-sulfonil-fluoride-ot (PMSF, Sigma, St. Louis, MO, USA) tartalmazott. A homogenizátumot lecentrifugáltuk (10 min, 10 000 rpm és 4 °C). A gyulladásos citokinek, IL-1β és egyes kísérletekben a TNF-α, koncentrációját specifikus ELISA módszerekkel (BD Sciences Eastern Europe, Heidelberg, Germany) határoztuk meg.

3.2.6. Az sst4 receptor fehérje immunlokalizációja a tüdőben Tüdőmintákat 4 % formaldehid oldatban tároltuk 24 órán keresztül, paraffinba ágyaztuk és 57 μm metszeteket készítettünk mikrotommal. A tárgylemezeken az antigéneket savas (pH 6) citrát-pufferes, a mikrohullámú sütőben történő 3x5 perces (750W) inkubálással tártuk fel. A szövet endogén peroxidáz aktivitását 20 perces 3 % hidrogén-peroxidos inkubációval gátoltuk. A nem-specifikusan kötődő másodlagos antitestek kapcsolódását normál kecske szérummal történő 20 perces inkubálással előztük meg. A tárgylemezeket 1:50 hígítású nyúl poliklonális anti-sst4 antitestekkel (ASR-004, Lot.:AN-01; Alomone Labsystems, Izrael) 1 órán keresztül inkubáltuk és utána torma peroxidázzal (HRP)-konjugált En Vision rendszerű anti-nyúl másodlagos antitestekkel (Dako-Cytomation, Dako North America Inc., Carpinteria, USA) további 1 órán keresztül kezeltük. Végül az sst4 receptor immunlokalizációját 10 perces diaminobenzidines (DAB) kezeléssel tettük láthatóvá, a magfestést hematoxylinnal végeztük.

27

3.2.7. Az sst4 receptor mRNS meghatározása tüdőben A tüdőmintákat -80 °C-on tároltuk 1 ml RNAlater oldatban további feldolgozás céljából. Az összes RNS izolálásához GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit-et (Sigma, USA) és proteináz K-t (Fluka-Biochemica, Switzerland) használtunk, a gyártó utasításai szerint. Az RNS mennyiségét és tisztaságát spektrofotometriásan határoztuk meg (Nanodrop), illetve elemeztük elektroforézis útján 1 %-os agarózgélen. Az mRNS mennyiségeit a “LightCycler RNA Master SYBR Green I”-val (Roche) adtuk meg, ami egy kvantitatív, valós idejű reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakció RT-PCR próba egy Lightcycler rendszeren. Az sst4 receptor mRNS (Genebank #NM) erősítve volt sense 5' 3' helyzetben és antisense 5' 3' helyzetben. Kontroll háztartási génként β2 mikroglobulin mRNS-t (Genebank # BC085164.1) használtunk, amelyet sense 5' GCAGTGGCAAAGTGGAGATT 3' primerrel a 122 pozícióban, és antisense 5' TCTCCATGGTGGTGAAGACA 3' primerrel a 370 pozícióban erősítettünk. A 20 μl reakció keverék tartalmazta a következőket: 250 ng a teljes RNS-ből, 5 mM MgCl2, 0.5 μM primerek plusz pufferek. A Lightcycler PCR program iniciáló reverz transzkripciós lépése 63 °C-on 20 percig tart, majd következik egy denaturációs lépés 95 °Con 30 másodpercig és 45 ciklusos erősítés: 10 másodperc 95 °C-on, 5 másodperc 56 °C-on és 15 másodperc 72 °C-on. Azért, hogy ellenőrizzük a termékek tisztaságát, melting görbe analízist végeztünk a kísérlet végén. Csak akkor végeztük el a mennyiségi analízist, amikor csak egy domináns csúcsérték volt jelen a melting görbében. Továbbá a tisztasági fok és a méret megerősítése céljából a PCR termékeket elektroforézissel 1 % agaróz gélen megfuttatva is elemeztük. Az eredményeket LightCycler3 Data Analysis szoftverrel (vers. 3.5.28) értékeltük ki. Először a sst4 mRNS expresszióját számszerűsítettük a háztartási gén β2 mikroglobulin mRNS-hez képest. Ugyanazon mintából számítva a korrigált ΔCt érték a következő képlet szerint: ΔCt = Ctsst4-Ct β2 mikroglobulin (Radonic és mtsai, 2004).

28

3.2.8. Statisztikai értékelés Minden kísérleti adat csoportonként 8-14 egér átlagát mutatja az átlag standard hibájával (+ SEM). A Penh, MPO, szenzoros neuropeptid és citokin eredmények statisztikai értékelésére egyutas variancia analízist (ANOVA), majd Bonnferroni-féle módosított t-tesztet használtunk. A szövettani pontszámokat Kruskal-Wallis (nem parametrikus ANOVA), majd Dunn-féle poszt teszttel analizáltuk.

29

4.

EREDMÉNYEK

4.1.

KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY

ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEK

ÉS

A

GYULLADÁSKELTŐ SZENZOROS NEUROPEPTIDEK SZEREPE AKUT LÉGÚTI GYULLADÁSBAN (Elekes és mtsai, Reg. Pept. 14: 44-54, 2007.)

4.1.1. A tüdő SP és CGRP koncentrációjának változása LPS-sel kiváltott gyulladás hatására LPS intranazális adása után 25 órával az SP és CGRP koncentráció a tüdőben szignifikánsan, 28 illetve 30%-kal növekedett az intakt csoporthoz képest. A nem gyulladt tüdő peptid tartalma az RTX-szel előkezelt egerekben nem tért el a kezeletlen egerekétől. Mindkét peptid endotoxin-indukálta emelkedését kivédte az RTX deszenzitizáció, ami arra utal, hogy a SP és a

CGRP

koncentrációjának

LPS-sel

kiváltott

emelkedése

a


idegvégződéseknek köszönhető (6. ábra).

30

a.

Kezeletlen LPS

SP koncentráció (fmol/mg tüdõ)

100

*

RTX deszenz. LPS, RTX deszenz.

80

60

40

20

0

CGRP koncentráció (fmol/mg tüdõ)

b.

Kezeletlen LPS

10

RTX deszenz.

**

LPS, RTX deszenz.

8

6

4

2

0

6. ábra. A szenzoros neuropeptidek koncentrációjának változása a tüdőben endotoxin intranazális adásának hatására, előkezeletlen és RTX-szel előkezelt egerekben. Az SP (a) és CGRP (b) koncentrációkat a tüdőben RIA-val mértük. Az oszlopok n= 8-14 egér átlag eredményeit mutatják + S.E.M. *p<0.05 és **p<0.01 kezeletlen csoport LPS-kezelt csoporthoz viszonyítva; +p<0.05 és

++

p<0.01 nem-deszenzitizált állatok RTX-deszenzitizált

állatokhoz viszonyítva (egyutas ANOVA-t követő Bonnferroni-féle módosított t-teszt).

4.1.2. Endotoxinnal kiváltott légzésfunkciós változások A muszkarin receptor agonista carbachol növekvő koncentrációinak belélegzése (5.5 – 22 mM)

koncentrációfüggő

bronchokonstrikciót

idézett

elő.

A

kezeletlen

csoporttal

31

összehasonlítva 24 órával az intranazális LPS kezelést követően a carbachol hatására történő Penh és Rl növekedés is szignifikánsan nagyobb mértékű volt, amely azt igazolja, hogy a kialakult gyulladás bronchiális hiperreaktivitást okoz (1. táblázat). Ezen eredmények azt is bizonyítják, hogy a Penh változásai jól korrelálnak az Rl változásokkal és a carbachol kiváltotta Penh növekedés elsősorban a bronchokonstrikciónak köszönhető, és a nazális ellenállás nem járul hozzá jelentős mértékben. Carbachol koncentráció

Fiziológiás sóoldat

5.5 mM

11 mM

22 mM

Kezeletlen

3.2±0.7

14.2±1.3

53.9±4.5

146.3±10.9

LPS

8.5±1.3 *

58.5±9.3 **

Kezeletlen

5.5±0.4

15.5±3.22

LPS

9.2±0.9 *

Paraméter

Penh változás (%)

126.77±3.3 ** 282.31±14.4 *

Rl változás (%) 67.7±20.6

153.1±25.2

63.8±19.5 ** 192.6±34.8 ** 410.1±79.4 **

1. táblázat. Az átlag Penh és az átlag direkt légúti ellenállás (Rl) százalékos értékei. Az adatokat a megfelelő alapértékekre normalizáltuk: [(adott carbachol koncentrációnál mért válasz - a megfelelő alapérték)/ a megfelelő alapérték] x 100; az eredmények n= 8-14 kísérlet átlagai + S.E.M.. A Penh-et éber, szabadon mozgó állatokon teljes test pletizmográffal, a légúti ellenállást közvetlen módon, altatott, tracheotomizált és mechanikusan lélegeztetett állatokban mértük, hogy összehasonlítsuk a légúti funkciók mérésének e két módját és bizonyítsuk, hogy a Penh jól korrelál a bronchokonstrikció mértékével. *p<0.05, **p<0.01 kezeletlen

csoport

LPS-kezelt

csoporthoz

viszonyítva

(egyutas

ANOVA-t

követő

Bonnferroni-féle módosított t-teszt).

32

A légúti hiperreaktivitás a legmagasabb carbachol koncentráció esetén teljesen megszűnt az RTX-szel előkezelt egerekben, de kisebb carbachol koncentrációknál is 70-80 %-ban alacsonyabb volt, mint az előkezeletlen csoportokban. Az NK1 receptor antagonista SR 140333, vagy a CGRP1 receptor antagonista CGRP(8-37) kezelés nem befolyásolta a hiperreaktivitás mértékét az NK2 antagonista SR 48968 azonban szignifikáns (kb. 35-50 %os) gátlást idézett elő, amely a két tachykinin receptor antagonista kombinációjával történő kezelés után sem növekedett (7. ábra).

500 450 400

Kezeletlen LPS RTX deszenz. LPS, RTX deszenz. LPS, SR140333 LPS, SR48968 LPS, SR140333 + SR48968 LPS, CGRP8-37

Penh AUC

350 300

*

*

250

* **

200 150 100

*

*

**

**

50 0

5.5

11

22

Carbachol koncentráció (m M )

7. ábra. LPS által kiváltott gyulladásos légúti hiperreaktivitás. A bronchokonstrikciót carbachol növekvő dózisainak inhaláltatásával váltottuk ki és éber, szabadon mozgó egerekben teljes test pletizmográffal mértünk. Az oszlopok az egyes koncentrációkhoz tartozó Penh görbék alatti területeket (AUC) mutatják, melyekből a fiziológiás sóoldat inhaláltatásával nyert alapértékeket levontuk. Az oszlopok n= 8-14 kísérlet átlag eredményeit mutatják + S.E.M.. *p<0.05 és **p<0.01 LPS-kezelt csoporthoz viszonyítva (egyutas ANOVA-t követő Bonnferroni-féle módosított t-teszt).

33

4.1.3. Szövettani vizsgálatok és pontozás Összehasonlítva az ép és a gyulladt tüdő szerkezetét, jól látható, hogy az LPS peribronchiális/perivaszkuláris ödémát, interstíciális granulocita felhalmozódást, az alveoláris terekbe mononukleáris sejtek (elsősorban makrofágok) invázióját, és a nyáktermelő kehely sejtek (goblet sejtek) felszaporodását idézi elő (8. ábra). Az ezekből a paraméterekből kiszámított összetett gyulladásos pontszámok jelentősen magasabbak voltak az RTX-szel előkezelt egerekben (9. A. ábra). Összehasonlítva a négy paramétert, látható, hogy bár az RTX deszenzitizáció esetén az ödéma nagysága és a makrofágok infiltrációja nem változott, a kehelysejtek száma és a peribronchiális granulociták mennyisége jelentősen megnövekedett az RTX-előkezelt állatokban (9. B. ábra). Sem az NK1 receptor antagonista SR 140333-nak, sem az NK2 receptor antagonista SR 48968-nak nem volt hatása egyik endotoxin-kiváltotta gyulladásos paraméterre sem. Azonban e kettő kombinációja vagy a CGRP1 receptor antagonista CGRP(8-37) szignifikánsan csökkentette a bronchiolusok körül felhalmozódott granulociták számát. Egyik antagonistával történő kezelés sem befolyásolta az ödéma képződést, a mononukleáris sejtek alveoláris terekbe történő áramlását és a kehely sejtek hiperpláziáját. Ezek az adatok azt jelzik, hogy az LPS-indukálta légúti gyulladás modellben a neurogén gyulladást közvetítő szenzoros neuropeptidek nem játszanak jelentős szerepet a gyulladásos szövettani elváltozásokban (9. A. ábra).

34

v b a

b

a

A.

B.

öd

a

b

v

b öd a

C.

D.

8. ábra. Szövettani metszetek, melyek bemutatják (A) egy kezeletlen egér, (B) egy RTXdeszenzitizált egér, (C) egy intranazális LPS-kezelt egér, (D) RTX-deszenzitizált és LPS-sel kezelt egér tüdejének metszetét. A minták hematoxylin-eozinnal lettek megfestve és 200szoros nagyításúak; alveolus [a], bronchiolus [b], vérerek [v], ödéma [öd].

Kezeletlen LPS RTX deszenz. LPS, RTX deszenz. LPS, SR140333

6,5

Összetett szövettani pontszám

6,0 5,5

LPS, SR48968

*

LPS, SR140333 + SR48968 LPS, CGRP(8-37)

5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

A. 35

LPS 2,2 2,0

LPS, RTX deszenz. LPS, SR 140333 LPS, SR 48968

*

Szövettani pontszám

1,8

LPS, SR 140333 + SR 48968

1,6

LPS, CGRP(8-37)

1,4 1,2 1,0

*

0,8

* *

0,6 0,4 0,2 0,0 Peribronchiális granulocita akkumuláció

Goblet sejt hiperplázia

B. 9. A., B. ábra. LPS által kiváltott gyulladásos változások szemikvantitatív szövettani értékelése a tüdőben. (a) Összetett szövettani pontszámok értékei a tüdőmintákban a perivaszkuláris ödémából, perivaszkuláris/peribronchiális granulocita felhalmozódásból, a goblet sejt hiperpláziából, és az alveoláris térbe való mononukleáris sejtek infiltrációjából tevődik össze. (b) A granulocita felhalmozódás és a goblet sejt hiperplázia szövettani pontszám értékeit különválasztva rávilágít, hogy jelentős különbségek vannak e szövettani paraméterekben. Mindegyik oszlop n= 8-14 egér átlagértékeit ábrázolja + S.E.M.; *p<0.05 összehasonlítva az LPS-kezelt csoporttal (Kruskal-Wallis (nem-parametrikus ANOVA) és ezt követően Dunn próba).

4.1.4. Mieloperoxidáz aktivitás változása a tüdőben Intranazális endotoxin kezelés következményeképpen a gyulladt tüdőszövetben az akkumulált granulociták mennyiségét jelző MPO aktivitás 2-szeresére emelkedett, RTX előkezelés után azonban LPS hatására ennél szignifikánsan nagyobb, mintegy háromszoros növekedés volt tapasztalható. Sem az NK1 receptor antagonista SR 140333, sem az NK2 receptor antagonista

36

SR 48968 nem változtatta meg az LPS-sel kiváltott MPO aktivitásnövekedést, azonban a CGRP(8-37) vagy SR 140333 és SR 48968 kombinációja szignifikánsan csökkentette (10. ábra).

Kezeletlen

**

LPS RTX deszenz.

MPO aktivitás (Units/mg tüdõ)

1,4

LPS, RTX deszenz. LPS, SR140333

1,2

LPS, SR48968 LPS, SR140333 + SR48968

1,0

LPS, CGRP(8-37)

0,8 0,6 0,4

*

*

0,2 0,0

10. ábra. Tüdőminták mieloperoxidáz aktivitása. Az MPO aktivitás mennyiségi jelzője az akkumulálódott granulocita számnak, amelyet homogenizált tüdőmintákból határoztunk meg. Az eredmények n= 8-14 egér átlag értékeit ábrázolják + S.E.M.; *p<0.05, **<0.01 összehasonlítva az LPS-kezelt csoporttal (egyutas ANOVA-t követő Bonnferroni-féle módosított t-teszt).

4.1.5. IL-1β koncentrációjának változása a tüdőben Az LPS kezelés a gyulladásos citokin IL-1β tüdőbeli koncentrációjának több, mint 7-szeres növekedését idézte elő, ami RTX-szel előkezelt egerekben szignifikánsan magasabb volt. Sem az NK1 antagonista SR 140333, sem az NK2 antagonista SR 48968 önmagában nem befolyásolta szignifikánsan az endotoxin-kiváltotta Il-1β emelkedést, kombinációjuk ezzel

37

szemben 53 %-os gátlást eredményezett. Figyelemre méltó továbbá, hogy a CGRP1 receptor

IL-1β koncentráció (ng/g tüdõ)

antagonista CGRP(8-37) teljesen kivédte az LPS-indukálta IL-1β szintézist (11. ábra).

340 320 300 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

**

Kezeletlen LPS RTX deszenz. LPS, RTX deszenz. LPS, SR140333 LPS, SR48968 LPS, SR140333 + SR48968 LPS, CGRP(8-37)

* **

11. ábra. A tüdőminták interleukin-1β koncentrációja. Az eredmények n= 8-14 egér átlag értékeit ábrázolják + S.E.M.; *p<0.05, **<0.01 összehasonlítva az LPS-kezelt csoporttal (egyutas ANOVA-t követő Bonnferroni-féle módosított t-teszt).

4.1.6. A tüdő szomatosztatin koncentrációjának változása LPS-sel kiváltott gyulladás hatására A nem deszenzitizált egerek intranazális LPS kezelése a tüdő és a plazma szomatosztatin szintjének kétszeres emelkedését idézte elő, amely növekedést a kapszaicin-szenzitív afferensek RTX előkezeléssel történő inaktiválása gátolta. A nem gyulladt tüdő szomatosztatin tartalma az RTX deszenzitizáció után enyhe, nem szignifikáns mértékű csökkenést mutatott (12. A., B. ábra).

38

Tüdõ szomatosztatin (fmol/mg)

** Kezeletlen LPS-kezelt

120 100 80 60 ++

40 20 0

Nem deszenz.

RTX-deszenz.

Plazma szomatosztatin (fmol/ml)

A.

30

**

25

Kezeletlen LPS-kezelt

20 15 ++

10 5 0

Nem deszenz.

RTX-deszenz.

B. . 12. ábra. A szomatosztatin koncentrációja (A) a tüdőben és (B) a plazmában. A minták szomatosztatin koncentrációját RIA-val mértük. Az oszlopok n= 6-8 egér átlag eredményeit mutatják + S.E.M.; **p<0.01 a kezeletlen csoporthoz viszonyítva;

++

p<0.01 LPS kezelt nem-

deszenzitizált állatokhoz viszonyítva (egyutas ANOVA-t követő Bonnferroni-féle módosított t-teszt).

39

4.2.

A TRPV1 RECEPTOR SZEREPE AKUT LÉGÚTI GYULLADÁSBAN

(Helyes és mtsai Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 292: L1173-1181, 2007.)

4.2.1. Endotoxinnal kiváltott légúti hiperreaktivitás TRPV1+/+ és TRPV1-/- egerekben Az alap Penh és légúti ellenállás (Rl) értékek mindkét állatcsoportban jelentősen megnövekedtek az intranazális LPS kezelés után a kezeletlen egerekkel összehasonlítva: TRPV1+/+ (2.42+0.43 vs 0.85+0.08 és 3.23+0.45 vs. 0.69+0.06) és a TRPV1-/- (2.41+0.67 vs 0.95+0.15 és 2.69+0.23 vs. 0.86+0.09). A muszkarin receptor agonista carbachol belélegeztetése koncentráció-függő bronchokonstrikciót idézett elő, amit mind a Penh, mind az Rl értékeinek változásai mutattak. A Penh és Rl alapérték feletti százalékos növekedése szignifikánsan nagyobbak voltak az LPS-kezelt csoportokban a nem gyulladt csoportokhoz viszonyítva, ami a gyulladásos bronchiális hiperreaktivitás kialakulását igazolta. Ezek az eredmények az előző kísérletsorozatban tapasztaltakhoz hasonlóan további bizonyítékokat szolgáltattak arra, hogy a számított Penh paraméter és a direkt módon mért Rl változásai ebben a modellben jól korrelálnak egymással. Jelentős különbség a carbachollal-kiváltott válaszok között intakt (nem gyulladt) TRPV1+/+ és TRPV1-/- állatok esetén (p=0.75) nem volt tapasztalható. A TRPV1 receptor hiánya esetén az LPS-indukálta gyulladásban a maximális Penh értékek magasabbak voltak és a bronchokonstrikció időtartama is hosszabb volt, ezért az átlag Penh alapvonal feletti százalékos növekedése mindhárom carbachol koncentráció esetén szignifikánsan nagyobb volt TRPV1 -/- egerekben, mint vad típusú megfelelőikben (13. ábra).

40

+/+

TRPV1 , Intakt +/+ TRPV1 , LPS -/TRPV1 , Intakt -/TRPV1 , LPS

Penh %-os változása

800

+ * + **

600

+ *

400

* *

200

*

** ** 0 5.5

11

22

44

Carbachol koncentráció(mM)

13.

ábra.

Endotoxin

által

kiváltott

gyulladásos

légúti

hiperreaktivitás.

A

bronchokonstrikciót carbachol növekvő dózisainak inhaláltatásával váltottuk ki és éber, szabadon mozgó egerekben teljes test pletizmográffal mértünk. Az átlag Penh változásokat százalékos

formában

ábrázoltuk,

az

alapértékekre

korrigálva:

[(adott

carbachol

koncentrációnál mért válasz - a megfelelő alapérték)/ a megfelelő alapérték]x 100; az értékek n= 8-14 egér százalékos eredményeit mutatják + S.E.M., kétutas ANOVA-val elemezve; *p<0.05 és **p<0.01 kezeletlen TRPV1+/+ vagy TRPV1-/-csoport LPS-kezelt TRPV1+/+ vagy TRPV1-/-csoporthoz viszonyítva; +p<0.05 és

++

p<0.01 LPS-kezelt TRPV1-/- csoport az LPS-

kezelt TRPV1+/+ csoporthoz viszonyítva.

41

4.2.2. Endotoxinnal kiváltott gyulladásos változások a tüdőben TRPV1+/+ és TRPV1-/egerekben A szövettani vizsgálatok és a pontozás azt mutatták, hogy az LPS-sel kiváltott peribronchiális/ perivaszkuláris ödéma, a bronchusok körüli granulocita felhalmozódás, a mononukleáris sejtek alveoláris terekbe történő beáramlása és a nyáktermelő kehely sejtek hiperpláziája alapján meghatározott összetett gyulladásos pontszám szignifikánsan magasabb volt a TRPV1 receptor génhiányos egerekben, mint azok vad típusaiban (14. ábra).

v b b a v

A.

a

B. Intakt LPS

a b


8.0

*

6.0

*

5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0

v

C.

+

7.0

D.

TRPV1+/+

TRPV1-/-

14. ábra. A tüdőminták szövettani vizsgálata. LPS által kiváltott gyulladásos szövettani elváltozások a TRPV1+/+ (B) és TRPV1-/- egerek (C) tüdőmintáiban összehasonlítva az ép tüdő szerkezetével (A). A metszetek hematoxylin-eozinnal lettek megfestve és 200-szoros nagyításúak; alveolus [a], bronchiolus [b], vérerek [v]. (D): Szemikvantitatív szövettani értékelés, mely a perivaszkuláris ödémából, perivaszkuláris/peribronchiális granulocita felhalmozódásból, a goblet sejt hiperpláziából, és az alveoláris térbe való mononukleáris sejtek infiltrációjából tevődik össze. Mindegyik érték n= 8-14 egér átlagértékeit ábrázolja + S.E.M.; +p<0.01 intakt csoport összehasonlítva LPS-kezelt csoporttal, -/-

+/+

TRPV1 csoport összahasonlítva az LPS-kezelt TRPV1

*

p<0.05 LPS-kezelt

csoporttal (Kruskal-Wallis (nem-

parametrikus ANOVA) és az ezt követő Dunn próba). 42

4.2.3. MPO aktivitás a tüdőben TRPV1+/+ és TRPV1-/- egerekben TRPV1+/+

egerek

tüdejében

az

endotoxin

kezelés

körülbelül

kétszeres

MPO

aktivitásemelkedést idézett elő az intakt csoporthoz viszonyítva. A TRPV1 receptor génhiányos állatokban ez az érték szignifikánsan nagyobb, csaknem négyszerese volt a

MPO aktivitás (U/mg nedves tüdõ)

megfelelő intakt csoportban mért aktivitásnak (15. ábra).

0,30

Kezeletlen LPS-kezelt

+

*

0,25 0,20 0,15

*

0,10 0,05 0,00

+/+

TRPV1

-/-

TRPV1

15. ábra. A tüdőminták mieloperoxidáz aktivitása. Az MPO aktivitást TRPV1+/+, illetve TRPV1-/- egerek homogenizált tüdőmintáiból határoztuk meg és intakt egerek mieloperoxidáz aktivitásával hasonlítottuk össze. Az eredmények n= 8-14 egér átlag értékeit ábrázolják + S.E.M.; *<0.01 intakt csoport összehasonlítva LPS-kezelt csoporttal és +p<0.01 TRPV1-/egerek összehasonlítva a TRPV1+/+ egerekkel (egyutas ANOVA-t követő Bonnferroni-féle módosított t-teszt).

4.2.4. Szomatosztatin koncentráció változása a tüdőben és a plazmában TRPV1+/+ és TRPV1-/- egerekben endotoxin hatására A szomatosztatin-szerű immunreaktivitás alapszintje körülbelül 4-5-ször magasabb a tüdőben, mint a plazmában. LPS kezelés hatására a szomatosztatin-szerű immunreaktivitás a tüdőben 43

és a plazmában is szignifikánsan növekedett TRPV1+/+ egerekben. Ezzel szemben a TRPV1-/csoportban a szomatosztatin koncentráció LPS-indukálta emelkedése a tüdőben sokkal kisebb mértékű volt, a plazmában pedig teljesen elmaradt. Ezen eredményeink arra utaltak, hogy a szomatosztatin gyulladás során TRPV1 receptor aktiváción keresztül szabadul fel a tüdő kapszaicin-érzékeny rostjaiból és a szisztémás keringésbe kerül (16. ábra).

Intakt

*

Tüdõ szomatosztatin (fmol/mg)

120 100

LPS

+

80 60 40 20 0

+/+

TRPV1

-/-

TRPV1

16. A.

44

Plazma szomatosztatin (fmol/ml)

Intakt

**

30

LPS

25 20 ++

15 10 5 0 TRPV1

+/+

TRPV1-/-

16. B.

16. ábra. A tüdő és a plazma szomatosztatin koncentrációja. TRPV1+/+ és TRPV1-/- egerek tüdejében (A) és plazmájában (B) a szomatosztatin koncentrációját RIA-val mértük. Az oszlopok n= 8-14 egér értékeit ábrázolják + S.E.M.; *p<0.05, **<0.01 intakt csoport összehasonlítva az LPS-kezelt csoporttal és

+

p<0.05,

++

p<0.01 TRPV1-/- egerek

összehasonlítva a TRPV1+/+ egerekkel (kétutas ANOVA-t követő Bonnferroni-féle módosított t-teszt).

4.2.5. A szomatosztatin szerepe az endotoxinnal kiváltott légúti hiperreaktivitásban, gyulladásos szövettani elváltozásokban és a mieloperoxidáz aktivitásban Ismételt szomatosztatin-14 (3 x 100 μg/kg i.p.) kezelés a TRPV1-/- és TRPV1+/+ egerekben is szignifikánsan gátolta a carbachollal előidézett bronchokonstrikciót, de a hatás mértéke a receptor génhiányos csoportban nagyobb volt. Ezzel párhuzamosan TRPV1+/+ egerekben a

45

ciklo-szomatosztatin (3 x 250 μg/kg i.p.), amely antagonizálja a szomatosztatin hatásait mind az 5 receptor altípuson, jelentősen növelte a bronchiális hiperreaktivitást. Az LPS-sel kezelt TRPV1+/+ csoportban a carbachol koncentráció-Penh változás görbe alatti terület (AUC) értéke 503.9+4.6 egység volt, amely szignifikánsan nagyobb volt C-SOM kezelést követően (1676.5+12.4; p=0.0062) és csökkent SOM-14 injekciók esetén (323.5+2.6; p=0.012). A megfelelő AUC értékek LPS-kezelt TRPV1-/- egerekben 1211.0+19.8 (p=0.0085 vs. LPSkezelt TRPV1+/+ egerek), amely szignifikánsan csökkent SOM-14 hatására (370.8+3.4; p=0.0014) (17. ábra).

TRPV1 TRPV1

, LPS

-/-

, LPS +/+ TRPV1 , LPS + C-SOM -/TRPV1 , LPS + SOM-14 +/+ TRPV1 , LPS + SOM-14

800


+/+

600

400

200

+

0 5,5

11

22

44

Carbachol koncentráció (mM )

17. ábra. Szomatosztatin-14 (SOM-14) és a szomatosztatin receptor antagonista cycloszomatosztatin (C-SOM) hatása TRPV1+/+ és TRPV1-/- egerekben, LPS által kiváltott gyulladásos légúti hiperreaktivitásban. Az átlag Penh-eket százalékos formában ábrázoltuk, az alapértékekre korrigálva [(adott carbachol koncentrációnál mért válasz - a megfelelő alapérték)/ a megfelelő alapérték]x 100. Az értékek n= 8-14 egér százalékos eredményeit mutatják + S.E.M. (kétutas ANOVA). (p=0.0085 LPS-kezelt TRPV1+/+ vs. LPS-kezelt TRPV1-/- egerek; p=0.012 TRPV1+/+, LPS vs. TRPV1+/+, LPS+SOM-14; p=0.0062 TRPV1+/+, LPS vs. TRPV1+/+, LPS+C-SOM és p=0.0014 TRPV1-/-, LPS vs. TRPV1-/-, LPS+SOM-14).

46

A SOM-14 kezelés szignifikánsan csökkentette az endotoxin-indukálta gyulladásos változásokat mind a KO, mind a vad típusú egerek tüdejében, de a gátlás mértéke itt is nagyobb volt a TRPV1 receptor génhiányos csoportban. A C-SOM injekció TRPV1+/+ állatokban súlyosbította e paramétereket, különösen a peribronchiális ödémát, a granulocita infiltrációt és a kehely sejtek hiperpláziáját (18. ábra, 19. ábra).

b

a

b

v v

a

A.

B. v

a v

a

b

b

C.

D.

18. ábra. Szomatosztatin szerepe az endotoxin által kiváltott gyulladásos szövettani változásokban. LPS által kiváltott gyulladásos szövettani elváltozások a TRPV1+/+ (A), TRPV1-/- (B), C-SOM kezelt TRPV1+/+ (C) és SOM-14 kezelt TRPV1-/- (D) egerekben. A metszetek PAS-sal lettek megfestve a nyáktermelő kehely sejtek jobb azonosítása érdekében és 200-szoros nagyításúak; alveolus [a], bronchiolus [b], vérerek [v].

47

+/+ TRPV1 -/TRPV1 +/+ TRPV1 , C-SOM -/TRPV1 , SOM-14 +/+ TRPV1 , SOM-14 Összetett szövettani pontszám

8.0

*

7.0 6.0 5.0

#

+

4.0

+

3.0 2.0 1.0

19. ábra. Szomatosztatin szerepe az endotoxin által kiváltott gyulladásos szövettani változásokban: összetett szövettani pontszámok. Szemikvantitatív szövettani értékelés, mely

a

perivaszkuláris

ödémából,

perivaszkuláris/peribronchiális

granulocita

felhalmozódásból, a goblet sejt hiperpláziából, és az alveoláris térbe való mononukleáris sejtek infiltrációjából tevődik össze. Mindegyik oszlop n= 8-14 egér átlagértékeit ábrázolja + S.E.M.; *p<0.05 LPS-kezelt TRPV1-/- csoport összehasonlítva az LPS-kezelt TRPV1+/+ csoporttal, #p<0.05 C-SOM kezelt TRPV1+/+ összehasonlítva a TRPV1+/+ csoporttal, +p<0.05 SOM-14 kezelt csoportok összehasonlítva a megfelelő kontroll csoporttal (Kruskal-Wallis (nem-parametrikus ANOVA) és az ezt követő Dunn próba).

A szövettani eredményekkel összhangban a SOM-14 mindkét csoportban szignifikánsan csökkentette az LPS-sel kiváltott tüdőbeli MPO aktivitásnövekedést, de a csökkenés mértéke ennél a paraméternél is nagyobb volt a TRPV1-/- egerek esetén. A TRPV1+/+ csoportban az sst receptor antagonistával való kezelés több mint kétszeresére növelte az endotoxin hatására létrejött MPO aktivitást (20. ábra).

48

MPO aktivitás (U/mg nedves szövet)

TRPV +/+

20.

ábra.

0,25

TRPV -/-

#

0,30

TRPV +/+, C-SOM TRPV -/-, SOM-14

*

TRPV +/+, SOM-14 0,20 0,15

++ 0,10

+

0,05 0,00

Szomatosztatin

szerepe

az

endotoxin

által

kiváltott

granulocita

felhalmozódásban. Mindegyik oszlop n= 8-14 egér átlagértékeit ábrázolja + S.E.M.; *p<0.01 LPS-kezelt TRPV1-/- csoport összehasonlítva az LPS-kezelt TRPV1+/+ csoporttal, #p<0.01 CSOM kezelt TRPV1+/+ összehasonlítva a TRPV1+/+ csoporttal, +p<0.05 ill.

++

p<0.01 SOM-14

kezelt csoportok összehasonlítva a megfelelő kontroll csoporttal (Kruskal-Wallis (nemparametrikus ANOVA) és az ezt követő Dunn próba).

TRPV1-/- egerek C-SOM kezelése nem okozott változást sem az LPS-sel kiváltott gyulladásos paraméterekben, sem a bronchiális hiperreaktivitásban. Intakt TRPV1+/+ és TRPV1-/egerekben nem tapasztaltunk változást a carbachol-indukálta bronchokonstrikcióban, a szövettani paraméterekben és az MPO aktivitásban ismételt SOM-14 kezelés hatására.

49

4.3.

AZ SST4 RECEPTOR EXPRESSZIÓJA A TÜDŐBEN ÉS SZEREPE AKUT

LÉGÚTI GYULLADÁSBAN (Elekes és mtsai, Eur. J. Pharmacol. in press, 2007.)

4.3.1

Az sst4 receptor expressziója ép és gyulladt tüdőben

Ép tüdőben sst4 receptor immunpozitivitás volt látható a bronchiális epithel sejtek lumen felőli felszínén (21. A., C. ábra). Gyulladt tüdőszövetben azonban 24 órával az intranazális LPS kezelés után a megvastagodott epithel rétegben fokozódott az sst4 festődés és az akkumulálódott mononukleáris sejtek (elsősorban makrofágok) is jellegzetes, erős sst4 pozitivitást mutattak. A peribronchiális terekben nagy mennyiségben felhalmozódó neutrofil sejteken nem tapasztaltunk immunfestődést (21. B., D. ábra).

A

B

C

D

21. ábra. Szomatosztatin receptor immunhisztokémiai vizsgálata sst4+/+ egér tüdejében. (A) kezeletlen sst4+/+ egér tüdejének metszete 200x és (C) 400x nagyításban, valamint (B) intranazális LPS-kezelt sst4+/+ egér tüdejének metszete 200x és (D) 400x nagyításban.

50

Molekuláris biológiai eredményeink azt mutatták, hogy az sst4 receptor mRNS jelen van a tüdőben, de a koncentrációja összehasonlítva a β2 mikroglobulin háztartási gén mRNS szintjével, nem változott meg a gyulladás hatására az endotoxinnal kiváltott pneumonitisz modellben (22. ábra).

Intakt LPS

7 6 5

ΔCT

4 3 2 1 0

22. ábra. Szomatosztatin receptor mRNS meghatározása RT-PCR-ral. Az sst4 mRNS expresszióját a háztartásigén β2 mikroglobulin mRNS-hez képest számszerűsítettük. Ugyanazon mintából a korrigált ΔCT érték: ΔCT = CTsst4-CTβ2 mikroglobulin (Radonic és mtsai, 2004). Mindkét oszlop n= 6-8 egér értékeit ábrázolja + S.E.M. (ANOVA-t követő Bonnferroni-féle módosított t-teszt).

4.3.2. Endotoxinnal kiváltott légúti hiperreaktivitás sst4+/+ és sst4-/- egerekben A Penh alapértéke az intranazális LPS kezelést követően jelentősen megnövekedett a kezeletlen egerekéhez viszonyítva mind az sst4+/+ (4.83+0.1 vs. 0.73+0.1), mind az sst4-/csoporban

(4.26+0.5

vs.

0.74+0.1).

Carbachol

inhaláltatása

koncentráció-függő

bronchokonstrikciót idézett elő, amit Penh értékek növekedése mutatott. A Penh alapérték 51

feletti százalékos növekedései szignifikánsan nagyobbak voltak az LPS-kezelt csoportokban, mint az intakt megfelelőikben, ami azt igazolja, hogy ebben a kísérletsorozatban is gyulladásos bronchiális hiperreaktivitás alakult ki. Az intakt sst4+/+ és sst4-/- állatok carbacholindukálta válaszai között nem volt jelentős különbség tapasztalható (p=0.75). LPS-sel kiváltott gyulladásban azonban az sst4-/- egerekben a carbachol inhaláltatást követően a maximális Penh értékek nagyobbak voltak és a bronchokonstrikció időtartama is hosszabb volt, ezért az átlag Penh értékek alapvonal feletti százalékos növekedései a receptor génhiányos csoportban szignifikánsan nagyobbnak bizonyultak, mint a vad típusú állatokban (23. ábra).

+/+

sst4 , Intakt

*

-/-

sst4 , Intakt +/+

sst4 , LPS

600


-/-

sst4 , LPS 500

*

400

* 300

200

100 5.5

11

22


23. ábra. Endotoxinnal kiváltott légúti hiperreaktivitás sst4+/+ és sst4-/- egerekben. A bronchokonstrikciót carbachol növekvő dózisainak inhaláltatásával váltottuk ki és éber, szabadon mozgó egerekben teljes test pletizmográffal mértünk. Az átlag Penh-eket százalékos formában ábrázoltuk, az alapértékekre korrigálva [(adott carbachol koncentrációnál mért válasz - a megfelelő alapérték)/ a megfelelő alapérték] x 100. Az értékek n= 6-10 egér

52

százalékos eredményeit mutatják + S.E.M; *p<0.05 és **p<0.01 összehasonlítva az LPS kezelt csoporttal (ANOVA-t követő Bonnferroni-féle módosított t-teszt).

4.3.3. Endotoxinnal kiváltott gyulladásos változások sst4+/+ és sst4-/- egerek tüdejében A szövettani vizsgálatok és a szemikvantitatív értékelés azt mutatták, hogy az LPS hatására az sst4-/- egerek tüdejében jelentősen súlyosabb intenzitású gyulladás alakult ki, mint a vad típusúakban: kifejezettebb peribronchiális/ perivaszkuláris ödéma és bronchusok körüli granulocita felhalmozódás, fokozottabb mononukleáris sejt infiltráció és goblet sejt hiperplázia volt megfigyelhető (24. ábra). Intakt

*

LPS

+

b

v


10.0

a

7.5

+

5.0 2.5 0.0

A

B

sst4+/+

sst4-/-

v öd

v

öd

b

b

a a C

D

24. ábra. Endotoxinnal kiváltott gyulladásos változások sst4+/+ és sst4-/- egerek tüdejében. Szövettani képek, melyek bemutatják (A) egy kezeletlen egér, (C) egy intranazális LPS-kezelt sst4+/+ és (D) egy sst4-/- egér tüdejének metszetét. A minták PAS-sal lettek megfestve és 200szoros nagyításúak; alveolus [a], bronchiolus [b], vérerek [v], ödéma [öd]. (B): Szemikvantitatív szövettani értékelés endotoxin indukálta akut légúti gyulladásban, mely a perivaszkuláris ödémából, perivaszkuláris/peribronchiális granulocita felhalmozódásból, a goblet sejt hiperpláziából, és az alveoláris térbe való mononukleáris sejtek infiltrációjából 53

tevődik össze. Mindegyik oszlop n= 6-10 egér értékeit ábrázolja + S.E.M.; **p<0.05, *p<0.01 összehasonlítva az LPS kezelt csoporttal (Kruskal-Wallis (nem-parametrikus ANOVA) és az ezt követő Dunn próba).

4.3.4. Mieloperoxidáz aktivitás a tüdőben sst4+/+ és sst4-/- egerekben Az endotoxin kezelés mindkét csoportban többszörösére emelte a gyulladt szövetben felhalmozódott granulociták mennyiségét jelző MPO aktivitást a megfelelő intakt kontrolljaikhoz hasonlítva. Ez az emelkedés azonban az sst4-/- csoportban szignifikánan, közel

MPO aktivitás (U/g nedves tüdõ)

2.5-szer nagyobb volt, mint a vad típusú egerekben (25. ábra).

++

45

Intakt

40

LPS

**

35 30 25 20

**

15 10 5 0

+/+

sst4

-/-

sst4

25. ábra. A tüdőminták mieloperoxidáz aktivitása. Az MPO aktivitást sst4+/+, illetve sst4-/egerek homogenizált tüdőmintáiból határoztuk meg és intakt egerek mieloperoxidáz aktivitásával hasonlítottuk össze. Az eredmények n= 6-10 egér átlag értékeit ábrázolják + S.E.M.; *<0.01 LPS-kezelt csoport összehasonlítva az intakt csoporttal és +p<0.01 sst4-/egerek összehasonlítva a sst4+/+ egerekkel (egyutas ANOVA-t követő Bonnferroni-féle módosított t-teszt).

54

4.3.5. Gyulladásos citokinek koncentrációja sst4+/+ és sst4-/- egerek tüdejében Az LPS kezelés hatására mindkét csoportban sokszorosára emelkedett az IL-1β és a TNF-α koncentrációja. Ez a növekedés azonban sst4-/- egerekben mindkét gyulladásos citokin esetében kb. duplája volt az sst4+/+ állatokban mért értékeknek (26. ábra).

A Tüdõ IL-1β (ng/g nedves szövet)

++

65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

**

In ta k t

LPS

**

s s t4

+ /+

s s t4

-/-

B

+

Tüdõ TNF-α (ng/g nedves szövet)

25

**

In ta k t

LPS

20

**

15 10 5 0 s s t4

+ /+

s s t4

-/-

26. ábra A tüdőminták IL-1β és TNF-α koncentrációja. Az eredmények n= 6-10 egér átlag értékeit ábrázolják + S.E.M.; *p<0.05, **<0.01 összehasonlítva az LPS-kezelt csoporttal (egyutas ANOVA-t követő Bonnferroni-féle módosított t-teszt).

55

4.4.

SST4

RECEPTOR

AGONISTA

VEGYÜLETEK

HATÁSA

AKUT

ÉS

KRÓNIKUS LÉGÚTI GYULLADÁSOKBAN

4.4.1. J-2156 és TT-232 hatása az endotoxinnal kiváltott gyulladásos légúti hiperreaktivitásra Carbachol növekvő koncentrációinak (5.5 - 22 mM) belélegeztetése koncentráció-függő bronhokonstrikciót okozott, amelyet 500 μg/kg i.p. J-2156 és TT-232 szignifikánsan gátolt. A légúti hiperreaktivitást gátló hatás nem csak a 24 óra alatti háromszori injekciót követően volt megfigyelhető, hanem a gyulladás kialakulása után adott egyszeri dózis esetén is, amely arra utal, hogy az sst4 agonisták fokozott légúti válaszkészséget csökkentő hatása elsősorban nem a gyulladásos reakció gátlásának köszönhető (27. ábra).

Kezeletlen LPS + fiziológiás só LPS + J-2156 1x LPS + TT-232 1x LPS + J-2156 3x LPS + TT-232 3x

2700 2400


2100 1800 1500 1200

* *

900 600 300

* * **

* * *

**

**

0

5,5

11

22


27. ábra. 500 μg/kg i.p. J-2156 és TT-232 gátló hatása endotoxin által kiváltott gyulladásos légúti hiperreaktivitásra. A bronchokonstrikciót carbachol növekvő dózisainak inhaláltatásával váltottuk ki és éber, szabadon mozgó egerekben teljes test pletizmográffal 56

mértünk. Az átlag Penh-eket százalékos formában ábrázoltuk, az alapértékekre korrigálva [(adott carbachol koncentrációnál mért válasz - a megfelelő alapérték)/ a megfelelő alapérték]x 100. Az egerek egy csoportját J-2156 vagy TT-232 (500 μg/kg i.p.) kezeltük, 20 perccel a mérés előtt, egy másik csoportban pedig az állatok 24 óra alatt háromszor kapták az i.p. injekciót. Az értékek n= 6-12 egér százalékos eredményeit mutatják + S.E.M; *p<0.05 és **p<0.01 összehasonlítva az LPS kezelt csoporttal (ANOVA-t követő Bonnferroni-féle módosított t-teszt).

4.4.2. J-2156

és

TT-232

hatása

ovalbuminnal

kiváltott

gyulladásos

légúti

hiperreaktivitásban A szenzitizált állatokban OVA belélegeztetésével kiváltott légúti gyulladásban jelentősen fokozódott a bronchiális válaszkészség carbachol növekvő koncentrációival (5.5 - 22 mM) szemben az intakt állatokkal összehasonlítva. A hiperreaktivitást a J-2156 és a TT-232 is körülbelül 50 %-kal gátolta, mind az ismételt (3x500 μg/kg i.p. naponta 3 napon keresztül) injekciók esetén, mind az egyszeri adás után. Figyelemre méltó, hogy a TT-232-t ismételt alkalmazása után a légúti hiperreaktivitás teljesen megszűnt és a carbachol-indukálta bronchokonstrikció még kisebb volt, mint az intakt egerekben (28. ábra).

57

Kezeletlen OVA + fiziológiás só OVA + J-2156 1x OVA + TT-232 1x OVA + J-2156 3x OVA + TT-232 3x


1500

1200

* * *

900

* * * **

600

300

0

* ** ** 5,5

11

**

22


28. ábra. 500 μg/kg i.p. J-2156 és TT-232 gátló hatása ovalbumin által kiváltott krónikus gyulladásos légúti hiperreaktivitásra. A bronchokonstrikciót carbachol növekvő dózisainak inhaláltatásával váltottuk ki és éber, szabadon mozgó egerekben teljes test pletizmográffal mértünk. Az átlag Penh-eket százalékos formában ábrázoltuk, az alapértékekre korrigálva [(adott carbachol koncentrációnál mért válasz - a megfelelő alapérték)/ a megfelelő alapérték] x 100. Az egerek egy csoportját J-2156 vagy TT-232-vel (500 μg/kg i.p.) kezeltük, 20 perccel a mérés előtt. Egy másik csoportban az állatok a J-2156-ot, ill. a TT-232-t napi 3-szor - 28, 29 és 30 nappal az első i.p. ovalbumin injekció után - és 20 perccel az 5 % ovalbumin inhaláció előtt kapták. Az értékek n= 6-10 egér százalékos eredményeit mutatják + S.E.M; *p<0.05 és **p<0.01 összehasonlítva az OVA kezelt csoporttal (ANOVA-t követő Bonnferroni-féle módosított t-teszt).

58

4.4.3. J-2156 és TT -232 hatása endotoxin-kiváltotta akut légúti gyulladásra Ebben a kísérletsorozatban használt CD1 egerekben is más egértörzsekhez hasonlóan az intranazális LPS alkalmazás peribronchiális/perivaszkuláris ödémát, bronchusok körüli granulocita felhalmozódást, alveoláris terekbe történő mononukleáris sejt (főleg makrofágok) infiltrációt és goblet sejt felszaporodást okozott (29. B. ábra; 28. ábra). Ismételt J-2156 és TT232 kezelés gátló hatása a makrofág infiltráción kívül a másik három gyulladásos paraméter esetében szignifikánsnak bizonyult (29. C., D. ábra; 30. ábra). A homogenizált tüdőkből mért MPO aktivitás CD1 egerekben LPS hatására kb. ötszörösére növekedett az intakt mintákkal összehasonlítva. Ezt a fokozódást a J-2156-tal és a TT-232-vel történő ismételt kezelés is szignifikánsan gátolta (2. táblázat).

v a a b

b

B.

A. v

a

v

b b a

C.

D.

29. ábra. 500 μg/kg i.p. (C) J-2156 és (D) TT-232 (napi 3-szori kezelés) gyulladáscsökkentő hatása LPS által kiváltott légúti gyulladásban. (A) Intakt tüdő szerkezete, (B) LPS indukálta gyulladás fiziológiás sóval kezelt kontroll egér, (C) J-2156 és (D) TT-232-vel kezelt egér tüdeje. A metszetek hematoxylin-eozinnal lettek megfestve és 200-szoros nagyításúak; a: alveoláris terek, b: bronchiolus, v: vérér. 59

LPS + fiziológiás só LPS + J-2156 3x i.p. LPS + TT-232 3x i.p.


3,0

2,5

*

2,0

**

1,5

**

**

1,0

*

*

0,5

0,0

perivaszk. ödéma

perivaszk./ peribronch. granul.

alveoláris macrophag infiltr.

goblet sejt hiperpl.

30. ábra. Szemikvantitatív szövettani értékelés endotoxin indukálta akut légúti gyulladásban, mely a perivaszkuláris ödémából, perivaszkuláris/peribronchiális granulocita felhalmozódásból, a goblet sejt hiperpláziából, és az alveoláris térbe való mononukleáris sejtek infiltrációjából tevődik össze. Mindegyik oszlop n= 8-12 egér értékeit ábrázolja + S.E.M.; *p<0.05, **p<0.01 J-2156 vagy TT-232 kezelt csoport összehasonlítva a fiziológiás sóoldattal kezelt kontroll csoporttal (Kruskal-Wallis (nem-parametrikus ANOVA) és az ezt követő Dunn próba).

4.4.4. J-2156 és TT-232 hatása ovalbuminnal kiváltott krónikus légúti gyulladásra Szenzitizált Balb/c egerek tüdejében az ép tüdővel (31. A. ábra) összehasonlítva OVA hatására a bronchusok lumenében és a bronchusok körül is jelentősen felszaporodtak a

60

granulociták (elsősorban eozinofil sejtek), a bronchus nyálkahártya megduzzadt és megnövekedett a nyáktermelés, valamint több helyütt az epithel sejtek pusztulása volt látható (31. B. ábra, 32. ábra). Míg ismételt TT-232 kezelés mindhárom gyulladásos paramétert szignifikánsan gátolta, a J-2156 a nyálkahártya ödémát és a nyáktermelést jelentősen csökkentette, de ez a különbség statisztikailag nem bizonyult szignifikánsnak (31. C., D. ábra, 32. ábra). A felhalmozódott granulociták mennyiségét jelző MPO aktivitás a tüdőben e krónikus modellben

csaknem tízszeresére emelkedett az intakt szövettel összehasonlítva. Ezt a

növekedést mindkét sst4 agonistával történő ismételt kezelés szignifikánsan csökkentette (2. táblázat).

a v a

v ÖD

b

b

B.

A.

a

b v a

b

C.

D.

31. ábra. 500 μg/kg i.p. (C) J-2156 és (D) TT-232 kezelés gyulladáscsökkentő hatása OVA által kiváltott krónikus légúti gyulladásban. A J-2156-ot/TT-232-t napi 3-szor 28, 29 és 30 nappal az első i.p. ovalbumin injekció után és 20 perccel az 5 % ovalbumin belélegzés előtt adtuk. (A) Intakt tüdő szerkezete, (B) OVA indukálta gyulladás fiziológiás sóval kezelt kontroll, (C) J-2156 és (D) TT-232 kezelt egér tüdeje. A metszetek hematoxylin-eozinnal lettek megfestve és 200-szoros nagyításúak; a: alveoláris terek, b: bronchiolus, v: vérér, öd: ödéma. 61

Fiziológiás só OVA + J-2156 OVA + TT-232


3,5 3,0 2,5

*

2,0 1,5

*

*

*

1,0 0,5 0,0

eozinofil inf.

nyálkah. ödéma + nyák termelés

Epithel sejtek károsodása

32. ábra. Szemikvantitatív szövettani értékelés ovalbumin indukálta krónikus légúti gyulladásban, mely az alveoláris térbe való eozinofil sejtek infiltrációjából, nyálkahártya ödémából/ nyáktermelésből és a hám károsodásából tevődik össze. Mindegyik oszlop n= 8-10 egér értékeit ábrázolja + S.E.M.; *p<0.05, **p<0.01 J-2156 vagy TT-232 kezelt csoport összehasonlítva a fiziológiás sóoldattal kezelt kontroll csoporttal (Kruskal-Wallis (nemparametrikus ANOVA) és az ezt követő Dunn próba).

62

LPS

Ovalbumin

(CD1 egér)

(Balb/c egér)

MPO U/g nedves tüdő Intakt

72.6 ± 4.3

84.2 ± 6. 7

Fiziológiás só

373.4.4 ± 54.1

797.7 ± 71.6

TT-232

216.2 ± 38.4*

505.8 ± 34.1**

J-2156

132.7 ± 14.4**

463.6 ± 58.0**

2. táblázat. A tüdőminták mieloperoxidáz aktivitása. Az MPO aktivitást CD1, illetve Balb/c egerek homogenizált tüdőmintáiból határoztuk meg és az LPS/OVA kezelt kontroll csoportok mieloperoxidáz aktivitásával hasonlítottuk össze. Az eredmények n= 6-12 egér átlag értékeit ábrázolják + S.E.M.; *p<0.05,

**

<0.01 J-2156 vagy TT-232 kezelt csoport

összehasonlítva az LPS/OVA-kezelt kontroll csoporttal (egyutas ANOVA-t követő Bonnferroni-féle módosított t-teszt).

63

5.

MEGBESZÉLÉS, KÖVETKEZTETÉSEK

Számos korábbi irodalmi adat igazolta, hogy a légutak kapszaicin-érzékeny peptiderg afferensekkel való szenzoros innervációja (Barnes, 1990; Lundberg, 1995; Watanabe és mtsai, 2005) nemcsak az érző/fájdalomérző működésekben játszik fontos szerepet, hanem a belőlük felszabaduló neuropeptideken keresztül bronchokonstrikciót (Szolcsányi J és Barthó L, 1982) és gyulladást is kiváltanak (Lundberg, 1995; Maggi, 1995; Szolcsányi, 1996). Több faj légútjaiban a gyulladásos neuropeptidek, mint pl. a P-anyag, a neurokinin A és a CGRP a kapszaicin-szenzitív nem mielinizált és a vékonyan mielinizált szenzoros rostokban (C- és Aδ rost) lokalizálódnak (Kraneveld és mtsai, 2000), felszabadulásuk ezen idegvégződésekből és részvételük a gyulladásos reakciók vaszkuláris és sejtes fázisának a növekedésében több oldalról alátámasztott (Bloom és Polak, 1985; Lundberg, 1995; Uddman és mtsai, 1997). Az endotoxin intranazális alkalmazása jól definiálható, akut interstíciális gyulladást okoz a tüdőben, amely következményes bronchopulmonáris hiperreaktivitással jár (Lefort és mtsai, 2001). Az LPS a monociták/macrofágok elsődleges aktivátora, a belőlük felszabaduló gyulladáskeltő citokineken (elsősorban TNF-α, IL-1β és IL-6) keresztül a granulociták, főleg a neutrofil sejtek, infiltrációját, aktivációját és további citokin termelését okozza (Rocksen és mtsai, 2003; Savov és mtsai, 2002). A neutrofilek aktivitása központi szerepet játszik az LPSsel kiváltott gyulladásért és fokozott légúti válaszkészségért, mivel hiányuk esetén az endotoxin gyulladáskeltő hatása nem valósul meg (Savov és mtsai, 2002). A peribronchiális, perivaszkuláris területeken felszaporodott neutrofil sejtekből felszabaduló reaktív oxigén gyökök, proteázok, citokinek és kemokinek szöveti károsodást okoznak, valamint tovább fokozzák a mononukleáris sejtek beáramlását és aktivációját (Kraneveld és Nijkamp, 2001). A gyulladásos és immunsejtekből számos gyulladáskeltő mediátor - mint például leukotriének, prosztaglandinok, bradikinin, protonok, stb. - szabadul fel, amelyek sokféle sejteken, illetve a 64

szenzoros idegvégződéseken található receptort, pl. a TRPV1 receptort is képesek aktiválni és/vagy szenzitizálni (Barnes, 1990; Lundberg, 1995). Ennek következményeképpen az afferens idegvégződésekből felszabaduló szenzoros neuropeptidek, pl. CGRP, SP vazodilatációt, plazmafehérje kiáramlást és további gyulladásos sejt aktivációt okoznak és ezzel súlyosbítják a gyulladásos reakciót (Barnes, 1990). Jelen kísérleteink szolgáltatták az első bizonyítékot arra, hogy egérben endotoxin indukálta akut légúti gyulladásban a kapszaicin-szenzitív érzőideg-végződésekből felszabaduló neurogén mediátorok, mint az SP és a CGRP tüdőbeli koncentrációja megnövekedik, ezen afferensek resiniferatoxin előkezeléssel történő inaktivációja után LPS kezelés hatására azonban nem fokozódik e peptidek mennyisége. Ezzel szemben az RTX előkezelés e mediátorok alapmennyiségét nem változtatta meg, ami arra utal, hogy a SP és a CGRP jelentős mennyisége található egyéb sejtekben is, mint például a légutak epithel sejtjeiben (Hastings és Hua, 1995; Li és mtsai, 2004; Rennick és mtsai, 1992), a tüdő neuroendokrin sejtjeiben és immunsejtjeiben (Nelson és Bost, 2004; Springer és mtsai, 2003), melyek nem depletálódnak az RTX előkezelés hatására (Szállási és Blumberg, 1989; Szállási és Blumberg, 1999; Szolcsányi és mtsai, 1990), és ezekhez viszonyítva e peptidek alapkoncentrációja nem gyulladt

tüdőben

a


idegvégződésekben

alacsony.

Gyulladásos

körülmények között ezen idegvégződéseket gyulladásos mediátorok (protonok, leukotriének, prosztaglandinok, bradikinin, stb.) stimulálják, mely fokozza a neuropeptid szintézist a hátsó gyöki ganglionokban, növeli a periféria felé történő axonális transzportjukat és feltehetően fokozza felszabadulásukat (Baluk és mtsai, 1999; Belvisi, 2003; Dinh és mtsai, 2004). Mivel ép tüdőben a nem neuronális SP, CGRP mennyiséghez képest a neuronális tartalom elenyésző, a gyulladás hatására tapasztalt 30 %-os koncentrációnövekedés jelentős mértékű. Az RTX előkezelés, mely a kapszaicin-szenzitív érzőideg-végződések degenerációját idézte elő, szignifikánsan súlyosbította a légúti gyulladás szövettani paramétereit, a granulocita

65

akkumulációt jelző MPO aktivitást és az IL-1β termelést is. Több korábbi irodalmi adat arra utal, hogy patkányban a kapszaicin-szenzitív rostoknak védő szerepe van különböző légúti gyulladásos modellekben (Bowden és mtsai, 1996; Franco-Penteado és mtsai, 2005; Hashiba és mtsai, 1989; Long és mtsai, 1996). Az újszülöttkori kapszaicin-kezelés, amely irreverzibilisen károsítja az afferens C-rostokat, megnövekedett neutrofil számot, fehérje és TNF-α mennyiséget eredményez a bronchoalveoláris mosófolyadékban intratracheális LPS kezelést követően (Long és mtsai, 1996). Ilyen előkezelés után továbbá jelentősen növekedett az ovalbumin-indukálta allergiás légúti gyulladás (Franco-Penteado és mtsai, 2005), illetve a Mycoplasma pulmonis okozta idült tüdőgyulladás (Bowden és mtsai, 1996). A mi eredményeinkkel összhangban tehát ezek az adatok is a kapszaicin-szenzitív rostok gyulladásgátló hatását bizonyítják a légutakban, de a gátló mediátorra vonatkozóan nem szolgáltattak kísérletes bizonyítékokat. Más modellekben kapott előzetes eredményeink és az LPS modellben a tüdőben, illetve a plazmában mért adataink alapján feltételezhető, hogy e gátló hatásért elsősorban a tüdő kapszaicin-szenzitív érző-idegvégződéseiből felszabaduló és a keringésbe jutó szomatosztatin a felelős, bár egyéb inhibitoros neuropeptidek, pl. opioid peptidek, hipofízis adenilát-cikláz aktiváló polipeptid (PACAP) vagy a galanin szerepe sem zárható ki. A tachykininek és a CGRP szerepét az LPS-sel kiváltott légúti gyulladásban specifikus receptor antagonistáik segítségével vizsgáltuk. Funkcionális jelentőségüket a peribronchiális granulocita akkumulációban, MPO aktivitásban és IL-1β termelésben sikerült igazolnunk. E gyulladásos paraméterek endotoxin hatására létrejövő növekedését az NK1 és az NK2 receptor antagonisták kombinációjával, illetve a CGRP1 receptor antagonistával történő kezelés csökkentette szignifikánsan. A CGRP immunmodulátor hatású, így serkenti a granulocita felhalmozódást és a T-sejt adhéziót patkányban, és tengeri malacban. Fokozza a gyulladásos citokinek (IL-6, IL-8 és TNF-α) felszabadulását humán bronchus epithel

66

sejtekből. Az endothel sejtek és granulociták külső felszínén lévő NK1, NK2 receptorok és CGRP1 receptorok aktivációja részt vesz az adhéziós molekulák expressziójában és a következményes leukocita adhézióban és akkumulációban (DeRose és mtsai, 1994). Az MPO aktivitás és az IL-1β szorosan összefüggő gyulladásos paraméterek, több adat azt bizonyítja, hogy az IL-1β erősen befolyásolja a neutrofil felszaporodást. Ezenkívül, a granulociták mellett sok egyéb gyulladásos sejt képes szintetizálni IL-1β-t (Ahluwalia és mtsai, 1998; Pintér és mtsai, 2002). Egyik vizsgált antagonista, sőt kombinációjuk sem befolyásolta jelentősen az összetett gyulladásos pontszámot, feltehetően azért, mert ennek az értéknek a kiszámításához négy különböző jellemzőt veszünk alapul, melyek között a leukocita felhalmozódás csak az egyik paraméter. A többi három paramétert, a perivaszkuláris ödémát, a makrofág infiltrációt és a nyáktermelő kehely sejtek hiperpláziáját nem változtatta meg egyik kezelés sem. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a gyulladásos szenzoros neuropeptidek csak kisebb szerepet játszanak az endotoxin-indukálta légúti gyulladásban. Az RTX-szel előkezelt egerekben a súlyosabb gyulladás ellenére a bronchiális hiperreaktivitás jelentősen csökkent. Ennek a látszólagos ellentmondásnak a feloldásául az szolgálhat, hogy a gyulladásos folyamat kialakulásában döntő jeletőségű a kapszaicinérzékeny rostokból felszabaduló gátló hatású szenzoros neuropeptidek, elsősorban a szomatosztatin védő szerepe, míg a bronchiális válaszkészség fokozódásában priméren a proinflammatorikus szenzoros mediátorok játszanak közvetlenül szerepet (Lundberg, 1995). A bronchusok simaizom sejtjein kifejtett direkt hatás mellett, a SP közvetett neurális mechanizmussal is fokozhatja a bronchokonstrikciót: a kolinerg idegvégződésen lokalizálódó NK1 receptor aktivációján keresztül acetilkolin felszabadulást okoz (Colasurdo és mtsai, 1995; Ladenius és mtsai, 1995). Az endotoxin-kiváltotta légúti gyulladásban az NK2 receptor antagonista SR 48968 gátolta szignifikánsan a carbachollal kiváltott választ, amely bizonyítékot szolgáltatott arra, hogy e modellben az NK2 receptoroknak van döntő

67

jelentősége a bronchiális hiperreaktivitásban. A CGRP1 receptor antagonista CGRP(8-37), valamint az NK1 receptor antagonista SR 140333 nem okozott szignifikáns gátlást, sőt ez utóbbi kombinációban sem fokozta az NK2 receptor antagonista hatását, amely arra utal, hogy a CGRP1 és az NK1 receptorok minimális szerepet játszanak e válaszban. A kapszaicin-érzékeny idegvégződéseken lokalizálódó TRPV1 receptor légúti gyulladásban betöltött szerepét receptor génhiányos egerek (Davis és mtsai, 2000) segítségével vizsgáltuk. Intranazális LPS kezelést követően TRPV1 KO egerekben súlyosabb légúti gyulladásos reakciót és fokozódó bronchiális hiperreaktivitást figyelhettünk meg a tüdőben. E védő hatás hátterében a tüdő kapszaicin-érzékeny afferensein található TRPV1 ioncsatorna gyulladásos mediátorokkal (lipoxigenáz termékek, protonok, prosztaglandinok, bradikinin, stb.) történő aktivációja/szenzitizációja áll, melynek következményeképpen ezen idegvégződésből szomatosztatin szabadul fel, amely a szisztémás keringésbe jut.

Ezt a magyarázatot

alátámasztják azon eredményeink, hogy intranazális endotoxin kezelés szignifikánsan megnövelte a szomatosztatin koncentrációját vad típusú egerek tüdejében és a plazmában, azonban a TRPV1 receptor génhiányos csoportban ez az emelkedés elmaradt. A TRPV1 receptor aktivációja tehát nem csak a gyulladásos neuropeptidek (SP, NKA, CGRP) felszabadulását,

hanem a

tüdő

kapszaicin-szenzitív rostjaiban szintén jelen lévő

szomatosztatin (Hökfelt és mtsai, 1976) kiáramlását is eredményezi. Immunohisztokémiai tanulmányok azt a feltevést bizonyítják, hogy a szomatosztatin és a P-anyag/CGRP különböző idegvégződésekben találhatók és csak kis mértékben mutatnak kolokalizációt (Hökfelt és mtsai, 1976; Maggi, 1995). A felszabaduló szomatosztatin funkcionális jelentőségére a szomatosztatin receptor antagonista ciklo-szomatosztatinnal nyert adataink szolgáltattak bizonyítékot. A C-SOM, amely mind az öt receptor altípuson (sst1-sst5) (Hoyer és mtsai, 1995; Pintér és mtsai, 2006) gátolja a szomatosztatin hatásait, jelentősen megnövelte a gyulladást és a bronchiális

68

hiperreaktivitást vad típusú egerekben, megszüntette a szignifikáns különbséget a KO egerekhez viszonyítva. A szomatosztatin-14 kezelés mindkét csoportban szignifikánsan csökkentette a gyulladásos reakciót és a megnövekedett bronchokonstrikció hajlamot valószínűleg a gyulladáskeltő neuropeptidek felszabadulásának (Pintér E és mtsai, 2007; Pintér és mtsai, 2006), a monocitamacrofág funkciók (Krantic, 2000) és a limfocita proliferáció/ citokin termelés (Kolasinski és mtsai, 1992; Pintér és mtsai, 2006) gátlásán keresztül. A TRPV1 receptor génhiányos egereken végzett korábbi vizsgálataink azt mutatták, hogy a gyulladásos folyamatokat és a fájdalomreakciókat a patomechanizmustól függően eltérő módon befolyásolja a TRPV1 receptor aktivációja. Knockout (KO) egerekben akut gyulladás modellekben csökkent termális hiperalgéziát tapasztaltak (Davis és mtsai, 2000), valamint a Freund adjuvánssal kiváltott krónikus arthritis és következményes mechanikai hiperalgézia is szignifikánsan kisebb volt

(Szabó és mtsai, 2005).

Ezen eredményekkel ellentétben a

légutakban tapasztaltakhoz hasonlóan e receptor védő szerepet tölt be diabéteszes és toxikus polineuropátia modellekben (Bölcskei és mtsai, 2005), oxazolonnal kiváltott késői típusú hiperszenzitív reakcióban a bőrben (Szabó és mtsai, 2005), valamint bleomycinnel kiváltott szkleroderma modellben (Szabó és mtsai, 2007). Mindezek alapján a TRPV1 receptor komplex

integrátor

molekulának

tekinthető,

amely

funkciója

a

betegségek

patomechanizmusától függ. Számos korábbi adatunk (Helyes és mtsai, 2001; Pintér és mtsai, 2002; Szolcsányi és mtsai, 2004) alapján feltételeztük, hogy a tüdő kapszaicin-szenzitív rostjaiból felszabaduló szomatosztatin gyulladást és hiperreaktivitást gátló hatását az sst4 receptoron keresztül fejti ki. Elsőként mutattuk ki az sst4 receptorok expresszióját egér tüdőben immunhisztokémiai és molekuláris biológiai módszerekkel. Az ép, nem gyulladt tüdőben az sst4 receptor a bronchiális epithel sejtek lumen felőli oldalán lokalizálódtak. Gyulladás hatására azonban a 69

nagy számban beáramló mononukleáris sejtek jelentős sst4 immunpozitivitást mutattak. Ezzel szemben a peribronchiális/perivaszkuláris térben akkumulálódó neutrofil granulociták a receptort nem expresszálták, amely összhangban áll a humán perifériás vérben lévő granulocitákon tapasztaltakkal (Hiruma és mtsai, 1990). Az sst4 receptor mRNS-ének jelenlétét a tüdőben RT-PCR módszerrel ugyancsak sikerült igazolnunk, azonban az ép és a gyulladt szövetekben mért mRNS koncentrációk között nem volt különbség. Mindezek alapján feltételezhető, hogy az LPS hatására a mononukleáris sejtek már a kész receptorral a felszínükön áramlanak a tüdőbe és a receptor fehérje nem a gyulladt szövetben szintetizálódik. Ebben a modellben az sst4 receptor sem a makrofágokon, sem az epithel sejteken nem upregulálódik. Bár

korábbi

adatainkat

ezekkel

az

immunhisztokémiai

és

molekuláris

biológiai

eredményekkel kiegészítve méginkább valószínűsíthető volt, hogy a SOM gátló hatása modellünkben az sst4 receptorokon keresztül valósul meg, direkt bizonyítékokat csak az sst4 receptor génhiányos egereken végzett kísérleteink szolgáltattak. Mivel ezekkel az egerekkel még nem végeztek vizsgálatokat, a légúti gyulladás modellben nyert adataink az elsők, amelyek az sst4 receptor funkcionális jelentőségére utalnak. Az sst4 receptor hiányában az endotoxinnal kiváltott tüdőgyulladásban a mieloperoxidáz aktivitás, a gyulladásos citokinek mennyisége és a következményes bronchiális hiperreaktivitás nagymértékben fokozódtak, valamint a szövettani paraméterek is súlyosbodtak. Az sst4 KO egerekben a nyáktermelő kehelysejtek megnövekedett száma összhangban áll a szomatosztatin azon a hatásával, hogy csökkenteni képes a nyák szekrécióját patkányban (Wagner és mtsai, 1995). Az akkumulálódott mononukleáris sejtek száma nem volt szignifikánsan nagyobb az sst4-/csoportban, azonban aktivitásuk valószínűleg fokozódott, amire a megnövekedett IL-1β és TNF-α termelés is utalhat. Mivel a granulocita és bronchiális simaizomsejtek nem mutattak sst4 immunopozitivitást, a receptor génhiányos egerekben megfigyelhető megnövekedett

70

neutrofil invázió és a légutak fokozott reakciókészsége valószínűleg annak köszönhető, hogy fokozódott a szenzoros idegvégződésekből a gyulladásos neuropeptidek, valamint a mononukleáris sejtekből származó mediátorok felszabadulása. Az sst4 a többi négy sst receptorhoz hasonlóan a Gi-proteinhez kapcsolt receptorcsaládba tartozik (Hoyer és mtsai, 1995), aktivációja gátolja az adenilát cikláz aktivitást, következményképpen a cAMP szintézist és a protein kináz A működését (Patel és mtsai, 1995; Tentler és mtsai, 1997). Az sst4 receptor aktiválása megnyitja a K+ csatornákat és gátolja

a

feszültségvezérelt

Ca2+

csatornákat

(Koch

és

mtsai,

1988),

amely

neurotranszmitterek felszabadulásának gátlását eredményezi (Weckbecker és mtsai, 2003). Egyúttal, az sst4 receptor agonisták erősítik a mitogén-aktivált fehérje kináz (MAPK), a foszfolipáz C-n és a foszfolipáz A2-n keresztül megvalósuló jelátviteli utakat és aktiválják/gátolják a foszfotirozin-foszfatáz enzimet (Weckbecker és mtsai, 2003). Utolsó kísérletsorozatunkban morfológiai, biokémiai és légzésfunkciós bizonyítékokat szolgáltattunk arra, hogy az sst4/sst1 receptor agonista, heptapeptid TT-232 (Helyes és mtsai, 2005) és az sst4 szelektív peptidomimetikum J-2156 hatékonyan gátolja a légúti gyulladást és a következményes hiperreaktivitást az endotoxinnal kiváltott akut és az ovalbuminnal kiváltott krónikus egérmodellekben. A két vizsgált agonista mindkét modellben hasonló mértékű gyulladásgátló hatást okozott. Ebben szerepet játszhat a gyulladáskeltő neuropeptidek (SP és CGRP) felszabadulásának gátlása a perifériás kapszaicin-szenzitív érzőideg-végződésekből, amelyet izolált patkány trachea perfúziós modellben korábban igazoltunk (Helyes és mtsai, 2005; Helyes és mtsai, 2001; Helyes és mtsai, 2006). Az sst4 agonisták továbbá a neurogén gyulladás csökkentésén túl a nem neurogén komponenst is képesek gátolni direkt módon a gyulladásos sejteken, illetve a hízósejteken hatva (Helyes és mtsai, 2001; Helyes és mtsai, 2006; Pintér és mtsai, 2002; Pintér és mtsai, 2006), ahogy azt a fentiekben már ismertettem. Bár a granulocitákon magunk és az irodalomban mások (Hiruma

71

és mtsai, 1990; Lichtenauer-Kaligis és mtsai, 2000) sem találtak sst4 receptor expressziót, a TT-232 és a J-2156 granulocita akkumulációt gátló hatása más sejtekből (makrofágok, limfociták) történő kemotaktikus és gyulladáskeltő mediátorok, citokinek, valamint a szenzoros neuropeptidek felszabadulásának csökkentésén keresztül valósulhat meg. Ezt az elméletet támasztja alá az is, hogy a J-2156 csökkenti izolált peritoneális makrofágokban az LPS hatására történő IL-1β termelést és in vivo az endotoxin modellben a tüdőben mért IL-1β koncentrációt (Helyes és mtsai, 2006). A krónikus légúti gyulladásban a TT-232 nagyobb mértékben csökkentette a fokozott légúti válaszkészséget, melynek magyarázatául szolgálhat, hogy a TT-232 az sst4 mellett az sst1 receptort (Helyes és mtsai, 2005), valamint mindkét foszfotirozin-foszfatázt és néhány fehérje-kinázt, mint például az extracelluláris szignálok által regulált kinázokat (ERK2/ MAPK) is aktiválja (Vantus és mtsai, 1995; Vantus és mtsai, 2001). A lassan kifejlődő tirozin-kináz gátlás a TT-232 tumorellenes hatásában játszhat fontos szerepet (Kéri és mtsai, 1993; Kéri és mtsai, 1996). A gyulladásos reakciók kialakulása után történő egyszeri kezelések is jelentősen gátolták a carbachollal kiváltott bronchokonstrikciót, amely azt jelzi, hogy a hiperreaktivitást csökkentő hatásuk – legalábbis részben - a gyulladásgátló hatástól függetlenül alakult ki. Mindezek alapján stabil, endokrin hatásoktól mentes, szelektív sst4 receptor agonisták új perspektívákat jelenthetnek a légúti gyulladások és a következmények hiperreaktivitás kezelésében.

72

A DOLGOZATBAN BEMUTATOTT ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA

1. Eredményeink igazolták, hogy egérben endotoxin indukálta akut légúti gyulladásban a kapszaicin-szenzitív érzőideg-végződésekből felszabaduló neurogén mediátorok (pl. SP és a CGRP) tüdőbeli koncentrációja megnövekedik. Bizonyítottuk, hogy ezen afferensek resiniferatoxin előkezeléssel történő inaktivációja után LPS kezelés hatására nem fokozódik e peptidek mennyisége, azonban az előkezelés e mediátorok alapmennyiségét nem változtatta meg, ami arra utal, hogy a SP és a CGRP jelentős mennyisége található egyéb sejtekben is, melyek nem depletálódnak az RTX előkezelés hatására. Továbbá receptor specifikus antagonistáik segítségével igazoltuk, hogy a gyulladásos szenzoros neuropeptidek csak kisebb szerepet játszanak az endotoxin-indukálta légúti gyulladásban. 2. Eredményeink azt mutatták, hogy endotoxin által kiváltott légúti gyulladásban az NK2 receptor gátlása szignifikánsan csökkentette a carbachollal kiváltott választ, amely bizonyítékot szolgáltatott arra, hogy e modellben az NK2 receptoroknak van döntő jelentősége a bronchiális hiperreaktivitásban. 3. Igazoltuk, hogy intranazális LPS kezelést követően TRPV1 KO egerekben súlyosabb légúti gyulladásos reakció és fokozódó bronchiális hiperreaktivitás alakul ki, melynek hátterében az áll, hogy e receptor hiányában a gyulladásgátló hatású szomatosztatin felszabadulása elmarad. Ezt a megfigyelést szomatosztatin antagonista C-SOM, illetve szomatosztatin agonista SOM14 segítségével is alátámasztottuk. 4. Immunhisztokémiai és molekuláris biológiai módszerekkel elsőként sikerült bizonyítani a tüdőben sst4 receptor jelenlétét. Szomatosztatin 4 receptor-génhiányos egerek segítségével, morfológiai és funkcionális vizsgálatokkal ugyancsak elsőként igazoltuk, hogy a kapszaicinérzékeny afferensekből felszabaduló szomatosztatin a tüdőben az sst4 receptorokon keresztül fejti ki gyulladásgátló hatását. 73

5. Biokémiai és légzésfunkciós bizonyítékokat szolgáltattunk arra, hogy az sst4/sst1 receptor agonista heptapeptid TT-232 és az sst4 szelektív peptidomimetikum J-2156 hatékonyan gátolja a légúti gyulladást és a következményes hiperreaktivitást az endotoxinnal kiváltott akut, és az ovalbuminnal kiváltott krónikus egérmodellekben, melynek alapján új terápiás lehetőséget nyújthatnak a tüdő gyulladásos betegségeinek kezelésében. .

74

Irodalomjegyzék

1. A Szabo, L.Czirjak, Z.Sandor, Z.Helyes, T.Laszlo, K.Elekes, T.Czompoly, A.Starr, S.Brain, J.Szolcsanyi and E.Pinter. Investigation of sensory neurogenic components in bleomycin-induced scleroderma model using TRPV1 receptor and CGRP knockout mice. Arthritis and Rheumatism. 2007 in press 2. Advenier, C., Lagente, V., Boichot, E., 1997. The role of tachykinin receptor antagonists in the prevention of bronchial hyperresponsiveness, airway inflammation and cough. Eur.Respir.J.10, 1892-1906. 3. Ahluwalia, A., De Felipe, C., O'Brien, J., Hunt, S.P., Perretti, M., 1998. Impaired IL-1beta-induced neutrophil accumulation in tachykinin NK1 receptor knockout mice. Br.J.Pharmacol.124, 1013-1015. 4. Baluk, P., Thurston, G., Murphy, T.J., Bunnett, N.W., McDonald, D.M., 1999. Neurogenic plasma leakage in mouse airways. Br.J.Pharmacol.126, 522528. 5. Banvolgyi, A., Pozsgai, G., Brain, S.D., Helyes, Z.S., Szolcsanyi, J., Ghosh, M., Melegh, B., Pinter, E., 2004. Mustard oil induces a transient receptor potential vanilloid 1 receptor-independent neurogenic inflammation and a non-neurogenic cellular inflammatory component in mice. Neuroscience125, 449-459. 6. Barnes, P.J., 1990. Neurogenic inflammation in airways and its modulation. Arch.Int.Pharmacodyn.Ther.303, 67-82. 7. Barnes, P.J., 2001a. Molecular mechanisms of corticosteroids in allergic diseases. Allergy56, 928-936. 8. Barnes, P.J., 2001b. Potential novel therapies for chronic obstructive pulmonary disease. Novartis.Found.Symp.234, 255-267. 9. Belvisi, M.G., 2003. Sensory nerves and airway inflammation: role of A delta and C-fibres. Pulm.Pharmacol.Ther.16, 1-7. 10. Bevan,S., Szolcsanyi,J., 1990. Sensory neuron-specific actions of capsaicin: mechanisms and applications. Trends Pharmacol.Sci. 11, 330-333. 11. Bloom SR., Polak, 1985. Regulatory peptides and the lung. Pediatr Pulmonol1, S30-S36. 12. Bolcskei, K., Helyes, Z., Szabo, A., Sandor, K., Elekes, K., Nemeth, J., Almasi, R., Pinter, E., Petho, G., Szolcsanyi, J., 2005. Investigation of the role of TRPV1 receptors in acute and chronic nociceptive processes using genedeficient mice. Pain117, 368-376. 13. Böszörményi, N. Gy., Balikó, Z., Bálint, B., Csekeő, A., Csontos, Z., Fónay, K., Karlóczai, K., Kovács, G., Komáromi, T., Magyar, P., Márk, Zs., 75

Prugberger, E., Simon, L., Somfay, A., Stauder, A., Strausz, J., Szilasi, M., Vastag, E., Várdi Visy, K. 2000. A krónikus obstruktív légúti betegség (chronic obstructive pulmonary disease - COPD)diagnosztikája és kezelése. (A Tüdőgyógyászati Szakmai Kollégium ajánlása, 2000.). Medicina Thoracalis, 53, 1-11. 14. Bowden, J.J., Baluk, P., Lefevre, P.M., Schoeb, T.R., Lindsey, J.R., McDonald, D.M., 1996. Sensory denervation by neonatal capsaicin treatment exacerbates Mycoplasma pulmonis infection in rat airways. Am.J.Physiol270, L393-L403. 15. Brazeau, P., 1986. Somatostatin: a peptide with unexpected physiologic activities. Am.J.Med.81, 8-13. 16. Caterina, M.J., Leffler, A., Malmberg, A.B., Martin, W.J., Trafton, J., PetersenZeitz, K.R., Koltzenburg, M., Basbaum, A.I., Julius, D., 2000. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science288, 306-313. 17. Caterina, M.J., Schumacher, M.A., Tominaga, M., Rosen, T.A., Levine, J.D., Julius, D., 1997. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature389, 816-824. 18. Chignard, M., Balloy, V., 2000. Neutrophil recruitment and increased permeability during acute lung injury induced by lipopolysaccharide. Am.J.Physiol Lung Cell Mol.Physiol279, L1083-L1090. 19. Colasurdo, G.N., Loader, J.E., Graves, J.P., Larsen, G.L., 1995. Modulation of acetylcholine release in rabbit airways in vitro. Am.J.Physiol268, L432L437. 20. Dakhama, A., Larsen, G.L., Gelfand, E.W., 2004. Calcitonin gene-related peptide: role in airway homeostasis. Curr.Opin.Pharmacol.4, 215-220. 21. Davis, J.B., Gray, J., Gunthorpe, M.J., Hatcher, J.P., Davey, P.T., Overend, P., Harries, M.H., Latcham, J., Clapham, C., Atkinson, K., Hughes, S.A., Rance, K., Grau, E., Harper, A.J., Pugh, P.L., Rogers, D.C., Bingham, S., Randall, A., Sheardown, S.A., 2000. Vanilloid receptor-1 is essential for inflammatory thermal hyperalgesia. Nature405, 183-187. 22. De Swert, K.O., Joos, G.F., 2006. Extending the understanding of sensory neuropeptides. Eur.J.Pharmacol.533, 171-181. 23. DeRose, V., Robbins, R.A., Snider, R.M., Spurzem, J.R., Thiele, G.M., Rennard, S.I., Rubinstein, I., 1994. Substance P increases neutrophil adhesion to bronchial epithelial cells. J.Immunol.152, 1339-1346. 24. Dinh, Q.T., Groneberg, D.A., Peiser, C., Mingomataj, E., Joachim, R.A., Witt, C., Arck, P.C., Klapp, B.F., Fischer, A., 2004. Substance P expression in TRPV1 and trkA-positive dorsal root ganglion neurons innervating the mouse lung. Respir.Physiol Neurobiol.144, 15-24.

76

25. Nagy, B. 2003. Az asztma definíciója és kórmechanizmusa. In: Dr.Rónai Z (Ed.), Az asztma ma, pp.31-32. 26. Engstrom, M., Tomperi, J., El Darwish, K., Ahman, M., Savola, J.M., Wurster, S., 2005. Superagonism at the human somatostatin receptor subtype 4. J.Pharmacol.Exp.Ther.312, 332-338. 27. Franco-Penteado, C.F., De Souza, I.A., Camargo, E.A., Teixeira, S.A., Muscara, M.N., De Nucci, G., Antunes, E., 2005. Mechanisms involved in the enhancement of allergic airways neutrophil influx by permanent C-fiber degeneration in rats. J.Pharmacol.Exp.Ther.313, 440-448. 28. Frossard, N., Advenier, C., 1991. Tachykinin receptors and the airways. Life Sci.49, 1941-1953. 29. Gunthorpe, M.J., Benham, C.D., Randall, A., Davis, J.B., 2002. The diversity in the vanilloid (TRPV) receptor family of ion channels. Trends Pharmacol.Sci.23, 183-191. 30. Hashiba, Y., Ishikawa, N., Sumita, T., Takagi, K., Hidaka, H., Satake, T., 1989. Capsaicin-sensitive nerves exert an inhibitory effect on the development of fibrin-induced pulmonary edema in rats. Am.Rev.Respir.Dis.140, 652-658. 31. Hastings, R.H., Hua, X.Y., 1995. Expression of calcitonin gene-related peptide by cultured rat alveolar type II cells. Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.13, 563-569. 32. Helyes Z, Pinter E., Nemeth J., Szolcsanyi J., 2003. Pharmacological targets for the inhibition of neurogenic inflammation. Curr.Med.Chem.2, 191-218. 33. Helyes Z, Pinter E., and Szolcsanyi J., 2005. TT-232. Somatostatin sst1/sst4 Agonist. Treatment of Neuropathic Pain. Treatment of Inflammation. Drugs of the Future . 30(6): 558 34. Helyes, Z., Pinter, E., Nemeth, J., Keri, G., Than, M., Oroszi, G., Horvath, A., Szolcsanyi, J., 2001. Anti-inflammatory effect of synthetic somatostatin analogues in the rat. Br.J.Pharmacol.134, 1571-1579. 35. Helyes, Z., Pinter, E., Nemeth, J., Sandor, K., Elekes, K., Szabo, A., Pozsgai, G., Keszthelyi, D., Kereskai, L., Engstrom, M., Wurster, S., Szolcsanyi, J., 2006. Effects of the somatostatin receptor subtype 4 selective agonist J2156 on sensory neuropeptide release and inflammatory reactions in rodents. Br.J.Pharmacol.149, 405-415. 36. Helyes, Z., Szabo, A., Nemeth, J., Jakab, B., Pinter, E., Banvolgyi, A., Kereskai, L., Keri, G., Szolcsanyi, J., 2004. Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in a Freund's adjuvant-induced chronic arthritis model in the rat. Arthritis Rheum.50, 1677-1685. 37. Helyes, Z., Than, M., Oroszi, G., Pinter, E., Nemeth, J., Keri, G., Szolcsanyi, J., 2000. Anti-nociceptive effect induced by somatostatin released from 77

sensory nerve terminals and by synthetic somatostatin analogues in the rat. Neurosci.Lett.278, 185-188. 38. Hiruma, K., Koike, T., Nakamura, H., Sumida, T., Maeda, T., Tomioka, H., Yoshida, S., Fujita, T., 1990. Somatostatin receptors on human lymphocytes and leukaemia cells. Immunology71, 480-485. 39. Hökfelt, T., Elde, R., Johansson, O., Luft, R., Nilsson, G., Arimura, A., 1976. Immunohistochemical evidence for separate populations of somatostatin containing and substance P-containing primary afferent neurons in the rat. Neuroscience1, 131-136. 40. Hoyer, D., Bell, G.I., Berelowitz, M., Epelbaum, J., Feniuk, W., Humphrey, P.P., O'Carroll, A.M., Patel, Y.C., Schonbrunn, A., Taylor, J.E., 1995. Classification and nomenclature of somatostatin receptors. Trends Pharmacol.Sci.16, 86-88. 41. Joos, G.F., De Swert, K.O., Pauwels, R.A., 2001. Airway inflammation and tachykinins: prospects for the development of tachykinin receptor antagonists. Eur.J.Pharmacol.429, 239-250. 42. Keri, G., Erchegyi, J., Horvath, A., Mezo, I., Idei, M., Vantus, T., Balogh, A., Vadasz, Z., Bokonyi, G., Seprodi, J., Teplan, I., Csuka, O., Tejeda, M., Gaal, D., Szegedi, Z., Szende, B., Roze, C., Kalthoff, H., Ullrich, A., 1996. A tumor-selective somatostatin analog (TT-232) with strong in vitro and in vivo antitumor activity. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A93, 12513-12518. 43. Keri, G., Mezo, I., Vadasz, Z., Horvath, A., Idei, M., Vantus, T., Balogh, A., Bokonyi, G., Bajor, T., Teplan, I., ., 1993. Structure-activity relationship studies of novel somatostatin analogs with antitumor activity. Pept.Res.6, 281-288. 44. Koch, B.D., Blalock, J.B., Schonbrunn, A., 1988. Characterization of the cyclic AMP-independent actions of somatostatin in GH cells. I. An increase in potassium conductance is responsible for both the hyperpolarization and the decrease in intracellular free calcium produced by somatostatin. J.Biol.Chem.263, 216-225. 45. Kolasinski, S.L., Haines, K.A., Siegel, E.L., Cronstein, B.N., Abramson, S.B., 1992. Neuropeptides and inflammation. A somatostatin analog as a selective antagonist of neutrophil activation by substance P. Arthritis Rheum.35, 369-375. 46. Kraneveld, A.D., James, D.E., de Vries, A., Nijkamp, F.P., 2000. Excitatory nonadrenergic-non-cholinergic neuropeptides: key players in asthma. Eur.J.Pharmacol.405, 113-129. 47. Kraneveld, A.D., Nijkamp, F.P., 2001. Tachykinins and neuro-immune interactions in asthma. Int.Immunopharmacol.1, 1629-1650. 48. Krantic, S., 2000. Peptides as regulators of the immune system: emphasis on somatostatin. Peptides21, 1941-1964. 78

49. Ladenius, A.R., Folkerts, G., van der Linde, H.J., Nijkamp, F.P., 1995. Potentiation by viral respiratory infection of ovalbumin-induced guineapig tracheal hyperresponsiveness: role for tachykinins. Br.J.Pharmacol.115, 1048-1052. 50. Lagente, V., V, Advenier, C., 1998. Tachykinins and Airway Function. Pulm.Pharmacol.Ther.11, 331-340. 51. Lapa e Silva JR, Possebon, d.S., Lefort, J., Vargaftig, B.B., 2000. Endotoxins, asthma, and allergic immune responses. Toxicology152, 31-35. 52. Lefort, J., Motreff, L., Vargaftig, B.B., 2001. Airway administration of Escherichia coli endotoxin to mice induces glucocorticosteroid-resistant bronchoconstriction and vasopermeation. Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.24, 345-351. 53. Li, W., Hou, L., Hua, Z., Wang, X., 2004. Interleukin-1beta induces betacalcitonin gene-related peptide secretion in human type II alveolar epithelial cells. FASEB J.18, 1603-1605. 54. Lichtenauer-Kaligis, E.G., van Hagen, P.M., Lamberts, S.W., Hofland, L.J., 2000. Somatostatin receptor subtypes in human immune cells. Eur.J.Endocrinol.143 Suppl 1, S21-S25. 55. Long, N.C., Frevert, C.W., Shore, S.A., 1996. Role of C fibers in the inflammatory response to intratracheal lipopolysaccharide. Am.J.Physiol271, L425-L431. 56. Lundberg JM, 1995. Tachykinins, sensory nerves, and asthma-an overview. Can.J.Physiol Pharmacol.73, 908-914. 57. Maggi, C.A., 1995. Tachykinins and calcitonin gene-related peptide (CGRP) as co- transmitters released from peripheral endings of sensory nerves. Prog.Neurobiol.45, 1-98. 58. Maggi, C.A., Santicioli, P., Giuliani, S., 1995. Role of cyclic AMP and protein kinase A in K+ channel activation by calcitonin gene-related peptide (CGRP) in the guinea-pig ureter. J.Auton.Pharmacol.15, 403-419. 59. McCormack, D.G., Mak, J.C., Coupe, M.O., Barnes, P.J., 1989. Calcitonin generelated peptide vasodilation of human pulmonary vessels. J.Appl.Physiol67, 1265-1270. 60. McDonald, D.M., 1987. Neurogenic inflammation in the respiratory tract: actions of sensory nerve mediators on blood vessels and epithelium of the airway mucosa. Am.Rev.Respir.Dis.136, S65-S72. 61. Nelson, D.A., Bost, K.L., 2004. Non-neuronal mammalian tachykinin expression. Front Biosci.9, 2166-2176. 62. Nemeth, J., Gorcs, T., Helyes, Z., Oroszi, G., Kocsy, T., Pinter, E., Szolcsanyi, J., 1998. Development of a new sensitive CGRP radioimmunoassay for neuropharmacological research. Neurobiology (Bp)6, 473-475. 79

63. Nemeth, J., Helyes, Z., Gorcs, T., Gardi, J., Pinter, E., Szolcsanyi, J., 1996. Development of somatostatin radioimmunoassay for the measurement of plasma and tissue contents of hormone. Acta Physiol Hung.84, 313-315. 64. Nemeth, J., Szilvassy, Z., Than, M., Oroszi, G., Sari, R., Szolcsanyi, J., 1999. Decreased sensory neuropeptide release from trachea of rats with streptozotocin-induced diabetes. Eur.J.Pharmacol.369, 221-224. 65. Okamoto, T., Gohil, K., Finkelstein, E.I., Bove, P., Akaike, T., van, d.V.A., 2004. Multiple contributing roles for NOS2 in LPS-induced acute airway inflammation in mice. Am.J.Physiol Lung Cell Mol.Physiol286, L198L209. 66. Olah, Z., Szabo, T., Karai, L., Hough, C., Fields, R.D., Caudle, R.M., Blumberg, P.M., Iadarola, M.J., 2001. Ligand-induced dynamic membrane changes and cell deletion conferred by vanilloid receptor 1. J.Biol.Chem.276, 11021-11030. 67. Patel, Y.C., 1999. Somatostatin and its receptor family. Front Neuroendocrinol.20, 157-198. 68. Patel, Y.C., Greenwood, M., Kent, G., Panetta, R., Srikant, C.B., 1993. Multiple gene transcripts of the somatostatin receptor SSTR2: tissue selective distribution and cAMP regulation. Biochem.Biophys.Res.Commun.192, 288-294. 69. Patel, Y.C., Greenwood, M.T., Panetta, R., Demchyshyn, L., Niznik, H., Srikant, C.B., 1995. The somatostatin receptor family. Life Sci.57, 1249-1265. 70. Penn, A.L., Rouse, R.L., Horohov, D.W., Kearney, M.T., Paulsen, D.B., Lomax, L., 2007. In utero exposure to environmental tobacco smoke potentiates adult responses to allergen in BALB/c mice. Environ.Health Perspect.115, 548-555. 71. Pinter E, Helyes Z, Nemeth J, Szolcsanyi J, 2007. Somatostatin as an antiinflammatory neuropeptide. In: Fischer A, Jancsó G (Eds.), Neurogenic Inflammation, Neuroimmune biology. Elsevier Science: The Netherlands. 72. Pinter, E., Helyes, Z., Nemeth, J., Porszasz, R., Petho, G., Than, M., Keri, G., Horvath, A., Jakab, B., Szolcsanyi, J., 2002. Pharmacological characterisation of the somatostatin analogue TT-232: effects on neurogenic and non-neurogenic inflammation and neuropathic hyperalgesia. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol.366, 142-150. 73. Pinter, E., Helyes, Z., Szolcsanyi, J., 2006. Inhibitory effect of somatostatin on inflammation and nociception. Pharmacol.Ther.112, 440-456. 74. Radonic, A., Thulke, S., Mackay, I.M., Landt, O., Siegert, W., Nitsche, A., 2004. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem.Biophys.Res.Commun.313, 856-862.

80

75. Raynor, K., Reisine, T., 1992. Somatostatin receptors. Crit Rev.Neurobiol.6, 273289. 76. Regoli, D., Boudon, A., Fauchere, J.L., 1994. Receptors and antagonists for substance P and related peptides. Pharmacol.Rev.46, 551-599. 77. Reichlin, S., 1983. Somatostatin. N.Engl.J.Med.309, 1495-1501. 78. Rennick, R.E., Loesch, A., Burnstock, G., 1992. Endothelin, vasopressin, and substance P like immunoreactivity in cultured and intact epithelium from rabbit trachea. Thorax47, 1044-1049. 79. Rocksen, D., Ekstrand-Hammarstrom, B., Johansson, L., Bucht, A., 2003. Vitamin E reduces transendothelial migration of neutrophils and prevents lung injury in endotoxin-induced airway inflammation. Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.28, 199-207. 80. Savov, J.D., Gavett, S.H., Brass, D.M., Costa, D.L., Schwartz, D.A., 2002. Neutrophils play a critical role in development of LPS-induced airway disease. Am.J.Physiol Lung Cell Mol.Physiol283, L952-L962. 81. Springer, J., Geppetti, P., Fischer, A., Groneberg, D.A., 2003. Calcitonin generelated peptide as inflammatory mediator. Pulm.Pharmacol.Ther.16, 121130. 82. Szabo, A., Helyes, Z., Sandor, K., Bite, A., Pinter, E., Nemeth, J., Banvolgyi, A., Bolcskei, K., Elekes, K., Szolcsanyi, J., 2005. Role of transient receptor potential vanilloid 1 receptors in adjuvant-induced chronic arthritis: in vivo study using gene-deficient mice. J.Pharmacol.Exp.Ther.314, 111-119. 83. Szallasi, A., Blumberg, P.M., 1989. Resiniferatoxin, a phorbol-related diterpene, acts as an ultrapotent analog of capsaicin, the irritant constituent in red pepper. Neuroscience30, 515-520. 84. Szallasi, A., Blumberg, P.M., 1999. Vanilloid (Capsaicin) receptors and mechanisms. Pharmacol.Rev.51, 159-212. 85. Szolcsanyi J, 1996. Neurogenic inflammation: reevaluation of axon reflex theory. In: Geppetti, P., Holzer, P. (Eds.), Neurogenic Inflammation, pp.33-42. 86. Szolcsanyi J, Bartho L, 1982. Capsaicin-sensitive non-cholinergic excitatory innervation of the guinea-pig tracheobronchial smooth muscle. Neurosci.Lett.34, 247-251. 87. Szolcsanyi J, Pinter E, Helyes Z, 2004. Sensocrine function of capsaicin-sensitive nociceptors mediated by somatostatin regulates against inflammation and hyperalgesia. In: Handwerker H.O.and Brune K. (Ed.), Hyperalgesia: molecular mechanisms and clinical implications. IASP Press, Seattle, pp.113-128. 88. Szolcsanyi, J., 1996. Capsaicin-sensitive sensory nerve terminals with local and systemic efferent functions: facts and scopes of an unorthodox neuroregulatory mechanism. Prog.Brain Res.113, 343-359. 81

89. Szolcsanyi, J., 2004. Forty years in capsaicin research for sensory pharmacology and physiology. Neuropeptides38, 377-384. 90. Szolcsanyi, J., Bartho, L., Petho, G., 1991. Capsaicin-sensitive bronchopulmonary receptors with dual sensory-efferent function: mode of action of capsaicin antagonists. Acta Physiol Hung.77, 293-304. 91. Szolcsanyi, J., Helyes, Z., Oroszi, G., Nemeth, J., Pinter, E., 1998a. Release of somatostatin and its role in the mediation of the anti-inflammatory effect induced by antidromic stimulation of sensory fibres of rat sciatic nerve. Br.J.Pharmacol.123, 936-942. 92. Szolcsanyi, J., Jancso-Gabor, A., 1975. Sensory effects of capsaicin congeners I. Relationship between chemical structure and pain-producing potency of pungent agents. Arzneimittelforschung.25, 1877-1881. 93. Szolcsanyi, J., Pinter, E., Helyes, Z., Oroszi, G., Nemeth, J., 1998b. Systemic antiinflammatory effect induced by counter-irritation through a local release of somatostatin from nociceptors. Br.J.Pharmacol.125, 916-922. 94. Szolcsanyi, J., Szallasi, A., Szallasi, Z., Joo, F., Blumberg, P.M., 1990. Resiniferatoxin: an ultrapotent selective modulator of capsaicin-sensitive primary afferent neurons. J.Pharmacol.Exp.Ther.255, 923-928. 95. ten Bokum, A.M., Hofland, L.J., van Hagen, P.M., 2000. Somatostatin and somatostatin receptors in the immune system: a review. Eur.Cytokine Netw.11, 161-176. 96. Tentler, J.J., Hadcock, J.R., Gutierrez-Hartmann, A., 1997. Somatostatin acts by inhibiting the cyclic 3',5'-adenosine monophosphate (cAMP)/protein kinase A pathway, cAMP response element-binding protein (CREB) phosphorylation, and CREB transcription potency. Mol.Endocrinol.11, 859-866. 97. Than, M., Nemeth, J., Szilvassy, Z., Pinter, E., Helyes, Z., Szolcsanyi, J., 2000. Systemic anti-inflammatory effect of somatostatin released from capsaicin-sensitive vagal and sciatic sensory fibres of the rat and guineapig. Eur.J.Pharmacol.399, 251-258. 98. Thorne, P.S., Kulhankova, K., Yin, M., Cohn, R., Arbes, S.J., Jr., Zeldin, D.C., 2005. Endotoxin exposure is a risk factor for asthma: the national survey of endotoxin in United States housing. Am.J.Respir.Crit Care Med.172, 1371-1377. 99. Tominaga, M., Caterina, M.J., Malmberg, A.B., Rosen, T.A., Gilbert, H., Skinner, K., Raumann, B.E., Basbaum, A.I., Julius, D., 1998. The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli. Neuron21, 531-543. 100. Uddman R, Hakanson R, Luts A, Sundler F, 1997. Distribution of neuropeptides in airways. Harwood Academic Press, London, pp.21-37.

82

101. Underwood, S., Foster, M., Raeburn, D., Bottoms, S., Karlsson, J.A., 1995. Timecourse of antigen-induced airway inflammation in the guinea-pig and its relationship to airway hyperresponsiveness. Eur.Respir.J.8, 2104-2113. 102. Vantus, T., Csermely, P., Teplan, I., Keri, G., 1995. The tumor-selective somatostatin analog, TT2-32 induces a biphasic activation of phosphotyrosine phosphatase activity in human colon tumor cell line, SW620. Tumour.Biol.16, 261-267. 103. Vantus, T., Keri, G., Krivickiene, Z., Valius, M., Stetak, A., Keppens, S., Csermely, P., Bauer, P.I., Bokonyi, G., Declercq, W., Vandenabeele, P., Merlevede, W., Vandenheede, J.R., 2001. The somatostatin analogue TT232 induces apoptosis in A431 cells: sustained activation of stressactivated kinases and inhibition of signalling to extracellular signalregulated kinases. Cell Signal.13, 717-725. 104. Wagner, U., Fehmann, H.C., Bredenbroker, D., Yu, F., Barth, P.J., von Wichert, P., 1995. Galanin and somatostatin inhibition of neurokinin A and B induced airway mucus secretion in the rat. Life Sci.57, 283-289. 105. Watanabe N, Horie S, Michael GJ, Spina D, Page CP, Priestley JV, 2005. Imunohistochemical localization of vanilloid receptor subtype 1 (TRPV1) in the guinea pig respiratory system. Pulm Pharmacol Ther18, 187-197. 106. Weckbecker, G., Lewis, I., Albert, R., Schmid, H.A., Hoyer, D., Bruns, C., 2003. Opportunities in somatostatin research: biological, chemical and therapeutic aspects. Nat.Rev.Drug Discov.2, 999-1017. 107. Xie, Q.M., Chen, J.Q., Shen, W.H., Bian, R.L., 2002. Correlative changes of interferon-gamma and interleukin-4 between cortical layer and pulmonary airway of sensitized rats. Acta Pharmacol.Sin.23, 248-252. 108. Zeldin, D.C., Wohlford-Lenane, C., Chulada, P., Bradbury, J.A., Scarborough, P.E., Roggli, V., Langenbach, R., Schwartz, D.A., 2001. Airway inflammation and responsiveness in prostaglandin H synthase-deficient mice exposed to bacterial lipopolysaccharide. Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.25, 457-465. 109. Zsiray M., 2003. A tüdőfibrosisok osztályozása. Lege Artis Medicinae13(6), 42732.

83

A DISSZERTÁCIÓ ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ PUBLIKÁCIÓK

1. Elekes, K., Helyes, Z., Nemeth, J., Sandor, K., Pozsgai, G., Kereskai, L., Borzsei, R., Pinter, E., Szabo, A., Szolcsanyi, J.: Role of capsaicin-sensitive afferents and sensory neuropeptides in endotoxin-induced airway inflammation and consequent bronchial hyperreactivity in the mouse. Regul. Pept. 141, 44-54, 2007 (IF.: 2.442).

2. Helyes, Z., Elekes, K., Nemeth, J., Pozsgai, G., Sandor, K., Kereskai, L., Borzsei, R., Pinter, E., Szabo, A., Szolcsanyi, J.: Role of transient receptor potential vanilloid 1 receptors in endotoxin-induced airway inflammation in the mouse. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 292, L1173-L1181, 2007 (IF.: 3.939).

3. Elekes, K., Helyes Z., Kereskai L., Sándor K., Pintér E., Pozsgai G., Tékus V., Banvolgyi A., Németh J., Szűts T., Kéri G., Szolcsányi J.: Inhibitory effects of synthetic somatostatin receptor subtype 4 agonists on acute and chronic airway inflammation and hyperreactivity in the mouse. Eur. J. Pharmacol., 2007, in press ( IF.: 2.522).

84

A DISSZERTÁCIÓBAN NEM SZEREPLŐ EREDETI KÖZLEMÉNYEK

1. Szolcsányi J., Bölcskei K., Szabó Á., Pintér E., Pethő G., Elekes K., Börzsei R., Almási R., Szűts T., Kéri Gy., Helyes Zs., Analgesic effect of TT-232, a heptapeptide somatostatin analogue, in acute pain models of the rat and the mouse and in streptozotocin-induced diabetic hyperalgesia. Eur. J. Pharmacol., 498,103-109, 2004. (IF: 2.43; FC: 8)

2. Szabó Á., Helyes Zs., Sándor K., Bite A., Pintér E., Németh J., Bánvölgyi Á., Bölcskei K., Elekes K., Szolcsányi J., Role of TRPV1 receptors in adjuvant-induced chronic arthritis: in vivo study using gene-deficient mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 314, 111-119, 2005. (IF: 4.31; FC: 4)

3. Bölcskei K., Helyes Zs., Szabó, Á., Sándor, K., Pethő, G., Elekes, K., Almási, R., Pintér, E., Szolcsányi, J., Investigation of the role of TRPV1 receptors in acute and chronic nociceptive processes using gene-deficient mice. Pain 117, 368-376, 2005. (IF: 4.56; FC: 10 )

4. Varga A., Németh J., Szabó Á., McDougall J.J., Zhang C., Elekes K., Pintér E., Szolcsányi J., Helyes Zs.: Effects of the novel TRPV1 receptor antagonist SB366791 in vitro and in vivo in the rat. Neurosci. Lett. 385,137-142, 2005. (IF: 2.01; FC: 14 )

5. Jakab B., Helyes Zs., Varga, A., Bölcskei, K., Szabó, Á., Sándor, K., Elekes, K., Börzsei, R., Pintér, E., Pethő. G., Németh, J., Szolcsányi, J.: Examination of the novel TRPV1 receptor antagonist JYL1421 (SC0030) in vitro and in vivo in the rat. Eur. J. Pharmacol. 517, 35-44, 2005. (IF: 2.43; FC: 4)

6. Sándor K., Elekes K., Szabó Á., Pintér E., Engström M., Würster S., Szolcsányi J., Helyes Zs. Analgesic effects of the somatostatin sst4 receptor selective agonist J-2156 in acute and chronic pain models. Eur. J. Pharmacol. 539, 71-75, 2006. (IF: 2.43; FC: 2)

85

7. Helyes, Z., Pintér, E., Németh, J., Sándor, K., Elekes, K., Szabó, A., Pozsgai, G., Keszthelyi, D., Kereskai, L., Engström, M., Wurster, S., Szolcsányi, J.: Effects of the somatostatin receptor subtype 4 selective agonist J-2156 on sensory neuropeptide release and inflammatory reactions in rodents. Br. J. Pharmacol.149, 405-415, 2006. (IF: 3.41; )

8. Németh, J., Reglődi, D., Pozsgai, G., Szabó, A., Elekes, K., Pintér, E., Szolcsányi, J., Helyes, Z.: Effect of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-38 on sensory neuropeptide release and neurogenic inflammation in rats and mice. Neuroscience 143, 223230, 2006. (IF: 3.41)

9. Helyes Z., Pozsgai G., Börzsei R., Németh J., Bagoly T., Mark L., Pintér E., Tóth G., Elekes K., Szolcsányi J., Reglődi D.: Inhibitory effect of PACAP-38 on acute neurogenic and non-neurogenic inflammatory processes in the rat. Peptides. 2007.

10. Szabó Á., Czirják L., Sándor Z., Helyes Zs., László T., Elekes K., Czömpöly T., Starr A., Brain S., Szolcsányi J. and Pintér E.: Investigation of sensory neurogenic components in bleomycin-induced scleroderma model using TRPV1 receptor and CGRP knockout mice. Arthritis and Rheumatism 2007, in press

86

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönetemet szeretném kifejezni elsősorban Szolcsányi János akadémikus úrnak, aki a kezdetektől fogva támogatta a kutató munkámat és mindig teljes figyelemmel volt irántam. Köszönettel tartozom Helyes Zsuzsannának, akinek segítsége, útmutatása, töretlen hite és barátsága mindig óriási szerepet játszott előrehaladásomban, az időnként felmerülő nehézségek leküzdésében. Köszönettel tartozom Pintér Erikának, mert mindig volt néhány jó tanácsa, valamint köszönetemet szeretném kifejezni Szabó Árpádnak, Sándor Katalinnak, Pozsgai Gábornak és Bánvölgyi Ágnesnek, hogy munkájukkal hozzájárultak kísérleteim teljessé tételéhez, és a barátságos légkör megteremtéséhez, Hirné Perkecz Anikónak a mindig szép metszetekért. Köszönet Dr. Barthó Lóránd professzornak, a Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet vezetőjének a támogatásért, és az intézet valamennyi dolgozójának. Külön köszönetemet szeretném kifejezni a Sanofi Aventis Zrt-nek, hogy ösztöndíjam lejárta után sem maradtam támogatás nélkül.

87

MELLÉKLET: A dolgozat alapjául szolgáló eredeti közlemények

88

A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések, a TRPV1 és a. gyulladásmodellekben. Elekes Krisztián

Recommend Documents