8. Měření kinetiky dohasínání fluorescence v časové doméně
Kinetika dohasínání fluorescence
F
N
Prointegrováním a uvážením, že měřená intenzita je úměrná počtu částic, dostaneme I(t) = I0 e – t / τ kde doba života τ = (kF + kN)-1 Střední doba života je rovna (pro jednoexponenciální dohasínání)
∫ tI (t )dt ∫ t. exp(− t τ )dt
∞
t =
0 ∞
∫ I (t )dt 0
7500*exp(-t/5.5)+2500*exp(-t/8) 2500*exp(-t/4.5)+7500*exp(-t/6.7)
8000
6000
4000
2000
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
čas (ns)
∞
=
0 ∞
( τ)
∫ exp − t dt 0
τ2 = =τ τ
Střední doba života není závislá na koncentraci, proto bývají informace o mikrookolí fluoroforu spolehlivější než pouhé měření intenzity. Problémem je analýza složitějších systémů I (t ) = I 0 ∑ α i exp − t τi i
10000
7500*exp(-t/5.5)+2500*exp(-t/8) 2500*exp(-t/4.5)+7500*exp(-t/6.7)
1000
počet fotonů
dt
10000
počet fotonů
Po excitaci vzorku δ-pulsem se hladina S1 depopuluje podle dn(t ) = −(k + k )n(t )
100
10
1 0
5
10
15
20
25
30
čas (ns)
35
40
45
50
Střední doba života Více-exponenciální kinetika dohasínání fluorescence
D = ∑α i e
−
t
τi
Střední doba života - vážená amplitudami
τm
∑α τ = ∑α
i i
i
i
i
Střední doba života - vážená steady-state intenzitou
τm
∑ fτ = ∑f
i i
i
i
i
∑α τ = ∑α τ
2 i i
i
i i
i
Příklad 8.1: Spočítejte střední dobu života váženou (a) amplitudami, (b) intenzitami pro znázorněný příklad.
Hradlovaná detekce (gated detection) Pulsní (časová) doména – excitace δ-pulsem
n * (t ) = n * (0)e
I (t ) = I (0)e
−
−
t
τ
t
τ
Hradlovaná (gated) detekce
intenzita
exc. pulz fluorescence otevření hradla
čas
Historicky nejstarší metoda pro měření kinetiky dohasínání fluorescence v časové doméně Hradlování může být zajištěno buď tím, že je detektor zapnut jen na velmi krátkou dobu, nebo tím, že detektor je zapnut po celou dobou měření, ale elektrický signál je snímán stroboskopicky. Intenzita je proměřena pro časové intervaly s různě dlouhou prodlevou po excitačním pulzu Díky horšímu rozlišení (IRF~3 ns) a systematickým artefaktům prakticky opuštěna, nyní se v některých aplikacích začíná vracet Výhody: - relativně levná - možnost rychlého načtení celé dohasínací křivky - s výhodou využívána např. v mikroskopii nebo pro měření pomalejších kinetik
Metoda časově-korelovaného čítání fotonů (time-correlated single-photon counting, TCSPC) Intenzita ~ Pravděpodobnost emise Vzorek ozařujeme sérií pulzů Po každém pulzu detekujeme nejvýše jeden emitovaný foton, pro nějž přesně změříme čas, ve kterém přiletěl na detektor Údaje o časech příletu shromažďujeme v histogramu Pro velký počet zaznamenaných fotonů histogram rekonstruuje dohasínací křivku Výhody: - vysoké rozlišení (běžné přístroje τ > 50 ps) - analýza více-exponenciálního dohasínání - malá náchylnost k systematickým artefaktům - směrodatná odchylka počtu detekovaných fotonů v každém kanálu (Ni) je dána Poissonovskou statistikou (Ni)1/2 - možnost porovnání fitovaného modelu s teoretickou předpovědí
Becker&Hickel, The bh TCSPC handbook
U
Princip měření TCSPC START
reverzní mód TAC
STOP
t
Rychlost měření chceme načíst co nejvíce fotonů (alespoň 5.106) opakovací frekvence je limitována
hardwarově kinetikou dohasínání
t účinnost detekce - čím větší, tím lepší ... ... ale jen do určité míry
„pile-up“ efekt
EXC
Statistika musí být úplná ! OK OK NE
DET 0
t
0
t
I
Eliminace „pile-up“ efektu: „Count-rate“ musí být < 1%. Tzn. při opakovací frekvenci 10 MHz můžeme detekovat max. 105 fotonů za 1s. Příklad 8.2: Za jak dlouho jsme schopni za optimálních podmínek nasbírat histogram z 5.106 fotonů ?
Přesnost měření log I
t
Becker&Hickel, The bh TCSPC handbook
tvar excitačního pulsu nestabilita elektroniky (time-jitter) časový interval pro 1 kanál při ukládání dat transit-time spread počet detekovaných fotonů stabilita vzorku
Analýza dat Funkce přístrojové odezvy není δ-funkce
M = IRF ⊗ D Časový posun (shift) mezi detekcí IRF a M Dohasínání nemusí být monoexponenciální
D = ∑α i e D=
−
∞
t
τi
∫ α (τ ).e
τ =0 β t − τ
D=e
D=e
t − −2b t
τ
−
více komponent t
τ
distribuce „natažená“ exponenciála přechodové jevy
Je velmi užitečné, mít představu o tom, jak má vypadat dohasínání
Metody vyhodnocování Metoda nejmenších čtverců (LSA) zadáme model dohasínání zadáme parametry, které chceme najít hledáme minimum funkce N
χ =∑ 2
i =1
(X
EXP i
− X iFIT
σ i2
)
2
N
=∑ i =1
(X
− X iFIT X iEXP
EXP i
)
2
Použitelnost LSA 1. Neurčitost v experimentálních datech se týká pouze závislé proměnné (y-osa) 2. Neurčitosti v závislé proměnné mají Gaussovskou distribuci 3. Závislá (y) ani nezávislá (x) proměnná není zatížena systematickou chybou 4. Funkce použitá pro fitování je správným matematickým popisem systému. Nesprávné modely dávají nesmyslné parametry. 5. Všechny body v souboru jsou navzájem nezávislé. 6. Máme dostatečné množství dat, takže hledané parametry jsou přeurčené.
Tyto podmínky bývají v TCSPC splněné
Metody vyhodnocování Metoda maximální entropie (MEM) vybereme interval, ve kterém očekáváme, že se doby života budou nacházet rozdělíme tento interval na n částí fitujeme podle modelu −
n
t
∑ α .e τ i =1
i
i
přičemž τi jsou dána rozdělením intervalu a hledáme pouze αi, přičemž hledáme maximum funkce X fit (t ) ∫0 dt X fit (t ) − X exp (t ) − X fit (t )log X exp (t )
∞
Výhodné při analýze složitých systémů Nepředpokládáme a priori počet komponent ani jejich distribuce
Kvalita fitu nejdůležitějšími kritérii jsou:
χR2 náhodnost rozložení residuí
(
1 N X iEXP − X iFIT 2 χR = ∑ N − p i =1 σ i2
)
2
(
1 N X iEXP − X iFIT = ∑ N − p i =1 X iEXP
)
2
Autokorelační funkce udává, nakolik koreluje odchylka v k-tém bodě s odchylkou v (k+j)-tém bodě
1 m ∑ Dk Dk + j m k =1 C (t j ) = 1 n 2 Dk ∑ n k =1
Dk ... odchylka v k-tém bodě n ... celkový počet kanálů m ... počet kanálů přes který se počítá autokorelace
Provázanost parametrů
Detektory Fotonásobiče (PMT) - levné, transit-time-spread > 100 ps, after-puls
Mikrokanálové destičky (MCP PMT) transit-time-spread ~ 30 ps menší intenzita afterpulsů dražší
Lakowicz – Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2.ed., Kluwer/Plenum, 1999
Fotodiody (PD) velmi levné, ale nemají potřebné zesílení
Lavinové fotodiody (APD) rostoucí popularita, pro některé aplikace nejpoužívanější detektor problémem velmi malá aktivní plocha (typicky 10 µm x 10 µm) FWHM pulsu od 20 ps
Rozmítací kamera (streak camera) současně zaznamenaná informace o časových charakteristikách a o vlnové délce výhodné pro současné zaznamenání celého spektra
Upconversion Umožňuje detekci velmi krátkých časů < 2 ns Rozlišení je dáno šířkou laserového pulsu (> 10 fs)
excitace
vzorek
zpožďovací linka
detektor
„cut-on“ filtr „cut-off“ filtr
emise
hradlovací pulz
generace druhé harmonické frekvence pulzní Ti:Sapph laser, 800 nm
sčítání frekvencí
I (t,λ) = I0 Σ αi(λ) exp (-t/τi) Globální analýza Možnost rozlišení komponent, jejichž emisní spektra se překrývají, ale lifetimy jsou různé.
Lakowicz – Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2.ed., Kluwer/Plenum, 1999
DAS (decay-associated spectra)
TRES (time-resolved emission spectra) S2 kR
S1 absorpce
S0
kA hνA
kN
relaxace
v3 v2 v1 v0
kE emise hνE v3 v2 v1 v0
Energie
v2 v1 v0
TTTR (time-tagged-time-resolved) Je zaznamenáno zpoždění emitovaného fotonu vůči excitačnímu pulzu, ale také doba příletu v absolutní časové škále To umožňuje sledovat kompletní časový vývoj systému - intenzity i kinetiky dohasínání
Becker&Hickel, The bh TCSPC handbook
FluoTime 200 (PicoQuant) Zdroje: pulsní LED 298 nm (10 MHz, 1,8 µW) pulsní LED 308 nm (10 MHz, 0,9 µW) pulsní laserová LED 445 nm (40 MHz, 1,8 mW) Excitační a emisní polarizátor Motorizovaný monochromátor (λblaze=450 nm) Fotonásobič PMA-182-P-M (185-820 nm) PicoHarp 300 (rozlišení 4 ps) Software: FluoFit Pro 4.2.1 (LSA) Flame5 (MEM)
SHRNUTÍ Měření doby života excitovaného stavu v časové doméně Excitace pulzním zdrojem světla (ideálně δ-pulz) Způsob záznamu kinetiky dohasínání - hradlovaná detekce, korelované čítání jednotlivých fotonů (TCSPC), záznam TTTR (time-tagged-time-resolved) Analýza dat - dekonvoluce přístrojové funkce, použití správného modelu, problémy při analýze složitějších systému, metoda nejmenších čtverců (LSA), metoda maximální entropie Identifikace správného fitu - χR2, rozložení reziduí, autokorelační funkce Detektory - fotonásobiče, MCP, fotodiody, lavinové fotodiody, rozmítací kamery, metoda „up-conversion“ Metody se spektrálním rozlišením - TRES, DAS
