4. SZÉRUMFEHÉRJÉK MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA ÉS FRAKCIONÁLÁSA (BGY:15-18 old.)

Biokémia Gyakorlatok 2011

Név:

Gyakorlati jegyzőkönyv

4. gyakorlat

Csoport:

Dátum:

4. SZÉRUMFEHÉRJÉK MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA ÉS FRAKCIONÁLÁSA (BGY:15-18 old.) A GYAKORLAT CÉLJA: .……………………………………………………………………………………………………………………………………. .……………………………………………………………………………………………………………………………………. .………………………………………………………………………………………………………….........................................

Meghatározások: Elméletileg a szérum 60-80 mg/ml fehérjét tartalmaz: 60% (30-50mg/ml) albumin, 40% (20-30mg/ml) globulin Szérum: ……………………………..………………………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………………………………………………………………………………… Plazma: .....…………………………………………………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………………………………………………………………………………… Albumin: ..…………………………………………………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………………………………………………………………………………… Globulin: ……………………………………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… Kisózás: …………….......………………………………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… Gélszűrés: ……………………………...………………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………

1


Gyakorlati jegyzőkönyv 2+

-

Zavarosodási teszt: Ba + Cl + SO4

2-

4. gyakorlat

+

+ NH4 =…………………+………..+…… (melyik anyag a csapadék, húzza alá!)

Fehérje meghatározás Biuret-reagenssel ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… Fehérje meghatározás brómkrezolbíborral:………………………….…………………..………....…………………………. ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… Hatásfok, hozam (általánosan): …...………………..........……………………………………………………………………. ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… Elektroforézis: ………………..………………………….............………………………………………………………………. ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………

A GYAKORLATOK RÖVIDEN: (Részletek a gyakorlati

Jegyzetben: 15-18 old.)

1. Globulin kisózás: (Röviden) 3 ml telített ammóniumszulfát-oldatot adunk 3 ml szérumhoz = 6 ml felülúszó = albumin frakció; kb. 5,5 ml csapadék = globulin frakció; 3 ml 0,9 % NaCl oldatban feloldva.

MEGFIGYELÉS: Felülúszó térfogata …………………..ml .

2. Albumin sómentesítése Sephadex G-25 oszlopon: Pipettázzon 1.5 ml albumin frakciót az oszlop tetejére! (ha a felülúszó 5,5ml volt akkor: 5,5 ml/1,5 ml=3,33 , tulajdonképpen 3 ml szérum 1/3-ad albumin része) Szedjen 20 x 3 ml frakciót 20 kémcsőbe.(Ezek a csövek az 1,.5 ml albumin felülúszóból származó albumint tartalmazzák.) Mérje meg a fehérje koncentrációt (minden egyes frakcióból) majd figyelje meg a zavarosodás mértékét minden egyes frakció esetén!

2



4. gyakorlat

3. Fehérje koncentráció meghatározása a szérumban és a szérumfrakciókban biuret-reakcióval MÉRÉSEK/ADATOK/ SZÁMÍTÁSOK:

A, referencia sor standard oldattal: 10 mg/ml humán szérum albumin oldat. 10 mg/ml fehérje standard oldat (ml)

1. 0,050

*fehérje tartalom (mg)

2. 0,100 1

3. 0,150

4. 0,200

5.vak 0

A540 (30 perc inkubálás után!!) A540-A540 vak

-

*Számítsa ki minden kémcső fehérje tartalmát az ismert koncentrációjú standard oldat (10mg/ml) és a hozzáadott térfogat (0.1ml) és a végső térfogat (1ml) segítségével. E.g #2 kémcső: 0,1ml/1ml x 10mg/ml = 1mg és így tovább

Ábrázolja: A540-A540vak (y) vs. mg fehérje a kémcsőben (x), és számítsa ki a meredekséget! Meredekség =……………………

(GRAFIKON)

3



4. gyakorlat

B. összegyűjtött frakciók Készítsen elő 22 megszámozott kémcsövet! Pipettázzon 0,2 ml a korábban összegyűjtött 20 frakcióból (pl. #1-es frakcióból pipettázzon 0,2 ml-t egy új #1-es számú csőbe, a #2-es frakcióból egy új #2-es kémcsőbe…. stb.). Adjon hozzájuk 0,8ml Biuret reagenst, keverje össze, és 30 perc állás (szobahőn) után 540 nm–en mérje le az abszorbanciát!

Miután kivett 0,2 ml-t minden frakcióból, pipettázzon 0,2 ml BaCl2-oldatot a megmaradt frakciókhoz.. Jelölje X-ekkel a zavarosodás mértékét. Kémcső Albumin frakciók ( ml) Absz

1 0,2

2 0,2

3 0,2

4 0,2

5 0,2

6 0,2

7 0,2

8 0,2

9 0,2

10 0,2

(30 perc inkubálás után!)

Absz-Avak

(ref. sorból származó vak)

Zavarosodás x-xxxxx *Albumin tartalom 0.2ml - ben (Xmg) **Albumin tartalom 3ml -ben (15x X mg)

Kémcső Albumin frakciók ml

11 0,2

12 0,2

13 0,2

14 0,2

15 0,2

16 0,2

17 0,2

18 0,2

19 0,2

20 0,2

Absz (30 perc inkubálás után!) Absz-Avak Zavarosodás x-xxxxx Albumin tartalom 0,2ml -ben (Xmg) * Albumin tartalom 3ml-ben (15x X mg)** A 20 kémcső össz. Ʃ 1+2+…..stb albumin tartalma ***

……………………mg

*Számolja ki a fehérje tartalmat: (A-Avak)/meredekség **A teljes fehérje tartalom kiszámítás :(pl. ha 0.2 ml X mg-ot tartalmaz, akkor, 3ml 3/0,2=15 x X mg fehérjét tartalmaz frakciónként ***Adja össze = ez fogja megadni a gélszűrés során összegyűjtött teljes albumin tartalmat

4



4. gyakorlat

C, Szérum minták Készítsen elő 2 megszámozott kémcsövet! (21, 22. minta). Pipettázzon 0,02 mlt a szérumból a csövekbe! Adjon hozzájuk 0.180 ml NaCl-t és 0,8ml Biuret reagenst, keverje össze, és 30 perc állás (szobahőn) után 540 nm–en mérje le az abszorbanciát!

szérum (ml)

#21 0,02

#22 0,02

Absz (30 perc inkubálás után!) Absz-Avak *Fehérje tartalom 0,02ml-ben (Y mg) ** Fehérje tartalom 3ml szérumban (150 x Y mg) A két párhuzamos átlaga A szérum fehérje tartalma (mg/ml): *A fehérje tartalom kiszámítása: (A-Avak)/ meredekség; **A teljes fehérje tartalom kiszámítása 3 ml szérumban: ha 0,02ml szérum Y mg fehérjét tartalmaz, akkor 1ml szérum 1:0,02=50-szer több mg-ot tartalmaz, akkor 3ml szérum 3/0,02=150xYmg fehérjét tartalmaz.

D, globulin minták Készítsen elő 2 megszámozott kémcsövet! (23, 24. minta). Pipettázzon 0,04 mlt a visszaoldott globulinból a csövekbe! Adjon hozzájuk 0.160 ml NaCl-t és 0,8ml Biuret reagenst, keverje össze, és 30 perc állás (szobahőn) után 540 nm–en mérje le az abszorbanciát!

globulin (ml)

#23 0,04 -

#24 0,04 -

Absz (30 perc inkubálás után!) Absz-Avak *Fehérje tartalom 0,02ml-ben (Z mg) ** Fehérje tartalom 3ml szérumban (75 x Z mg) A két párhuzamos átlagértéke (mg) A szérum globulin tartalma (mg/ml): *A fehérje tartalom kiszámítása:: (A-Avak)/meredekség; **A tiszta globulin frakció fehérje tartalma: (3ml oldatban feloldott csapadék): ha 0.04ml Z mg globulint tartalmaz, akkor 1ml 1/0,04=25-ször több mg-ot tartalmaz így 3ml - 3/0,04=75xZmg globulin.

5



4. gyakorlat

4. Albumin meghatározása brómkrezolbíborral Röviden írja le a lépéseket! ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………

A, referencia sor 10 mg/ml humán szérum albumin oldat. fehérje standard (ml)

1. 0,050

2. 0,0750

fehérje (mg)

3. 0,10

4. 0,150

1

5. 0,200

6.vak 0

A620 A620-A620 vak

-

Számolja ki minden cső albumin koncentrációját.pl.: 3-as cső 0,1 ml x10mg/ml=1mg,

Ábrázolja: A-Avak (y) vs. mg fehérje/cső (x), Meredekség =…………………………………………

(GRAFIKON)

B, Albumin meghatározása szérumban brómkrezolbíborral: Cső szérum (ml)

1. 0,10

2. 0,10

A620 A620-A620vak *mg albumin/0,1ml szérumban (W mg) mg albumin/3ml szérum (30x W mg) A két párhuzamos átlagértéke (mg) A szérum fehérje tartalma: (mg/ml): *Határozza meg az albuminkoncentrációt a szérumban. (A-Avak)/meredekség)

6



4. gyakorlat

KÉRDÉSEK: 1. Ábrázolja a fehérje koncentrációt (3 ml-ben) (y1) és a frakciók zavarosodását (1-20) (y2) vs. frakciók száma (x)!

(grafikon)

2. A fenti ábra alapján milyen következtetést lehet levonni? Mennyire volt sikeres a kisózás (fehérje tisztítás)? Magyarázat! ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………….…………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………….…………………………………………………………………………………… 3. Az összegyűjtött frakció hány százaléka az oszlopra felvitt fehérjének? (A gélszűrés hatásfoka, hozama): 100% a gélre felvitt albumin = 1.5 ml felülúszóban található albumin. A kérdés az, hogy mennyi albumint kaptunk a 20 frakcióból? Mindig van veszteség, tehát a hozam nem lehet 100 % vagy több. 3ml szérum albumin tartalma = (150xYmg)-(75xZmg) (korábbi adatok; röviden: szérum mínusz globulin). Mivel a 3 ml szérum albumin tartalmának 1/3-át vittük fel az oszlopra (5.5 ml-ből cask 1.5 ml-t). A felvitt albumin: (150xY-75xZ)/3 A gélszűrés hozama: % ((a fehérje frakciók összege) /150xY-75xZ)/3))x100

Hatásfok, hozam:…………………………………………………………………………………………………………….% 4. Mennyi az albumin és a globulin koncentrációja a szérumban? Számolja ki a szérum összetételét a brómkrezolbíborral történő meghatározás alapján (mg fehérje /1ml): 1ml szérum teljes fehérje tartalma:.........................mg 1ml szérum albumin tartalma:...................….. ………mg…………………………….% (albumin mg/teljes szérum mg) x100 1ml szérum globulin tartalma:...............................mg……………………………..% (100% - albumin%)

5. Hasonlítsa össze a brómkrezolbíborral és a biuret-reakcióval kapott albumin tartalmat! Melyik módszer jobb, specifikusabb? Miért? ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………….……………………………………………………………………………………

7



4. gyakorlat

5. Szérumfehérjék elektroforézise cellulózacetát-membránon (BGY 17-18.old) demonstráció

Minták: human szérum, albumin, gamma globulin, brómfenolkékkel festett albumin (marker). Rajzolja le az eredményt és tüntesse fel az ábrán az alábbiakat: (+, -) pólus, kezdő vonal, meghatározott albumin, globulin frakciók. Összegezze az eredményt egy rövid következtetésben.

Következtetések/megfigyelések: ……………………………………………………………………………………………………………………………………… .…………………………………………………………………………………………………………………………………… ….………………………………………………………………………………………………………………………………… ….………………………………………………………………………………………………………………………………… ….………………………………………………………………………………………………………………………………… ….………………………………………………………………………………………………………………………………… …….……………………………………………………………………………………………………………………………….

8



4. gyakorlat

Albumin és globulin elválasztása (kisózás és sómentesítés)

? ml felülúszó (albumin+só)

3ml (NH4)2SO4

1.5 ml

RT 5 min, centrifugálás max rpm/ 20 min Gélszűrés/ sómetesítés

+3ml szérum +üledék (globulin)

serum +3ml fiz só (Beoldás)

Fehérjemérés: (RT 30 min, A 540nm) Szérum (21#;22 #) 0.02ml szérum+0.180mldv+0.8ml Biuret

20x3ml frakció

0,2 ml kivétele után a maradékhoz adunk 0.2ml BaCl2 -t (turbidity aassay x-xxxxx)

üledék/globulin (23#; 24#) 0.04ml globulin+0.160ml dv+0.8ml Biuret Fraciók/albumin( 1-20#) 0.2ml fració+0.8ml Biuret

9

4. SZÉRUMFEHÉRJÉK MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA ÉS FRAKCIONÁLÁSA (BGY:15-18 old.)

Recommend Documents