2.5 Porfyriny a buněčné heminy Pyrrol a pyrrolová barviva K nejvýznamnějším biologickým pigmentům patří tzv. pyrrolová barviva. Pyrrol je nenasycená pětičlenná heterocyklická sloučenina (systematickým názvem 1-aza-2,4cyklopentadien) obsažená např.v kamenouhelném dehtu.
Redukcí, tj. postupným nasycením jeho nenasycených vazeb, z něj vzniká pyrrolin a pyrrolidin. Od pyrrolidinu lze odvodit struktury aminokyselin prolinu a hydroxyprolinu. V přírodních pyrrolových barvivech se vyskytují vždy 4 pyrrolová jádra spojená navzájem jednouhlíkovými můstky, a proto se nazývají tetrapyrroly. Jádra mohou být uspořádána lineárně nebo kruhově (cyklické tetrapyrroly). Deriváty pyrrolu jsou součástí takových významných biochromů, jako je hemoglobin, myoglobin, žlučová barviva, chlorofyl a vitamin B12. Tetrapyrroly představují dále nebílkovinnou složku (prostetickou skupinu) cytochromů a enzymů cytochromoxidasy, katalasy a peroxidasy. Cyklické tetrapyrroly Základem struktury cyklických tetrapyrrolů jsou 4 pyrrolová jádra (I až IV) navzájem spojená methinovými můstky ═CH─ označovanými α, β, γ a δ, tj. sloučenina zvaná porfin. Tento tetrapyrrolový kruh obsahuje pravidelně se střídající nasycené a nenasycené vazby. Tento systém konjugovaných dvojných vazeb umožňuje volný tok elektronů podle okamžité situace molekuly; útvar leží v jedné rovině (je planární), a díky velkému počtu konjugovaných dvojných vazeb absorbuje část viditelného spektra a jeví se jako tmavě červený.
Jestliže jsou některé z osmi vnějších vodíkových atomů porfinu v polohách 1 až 8 substituovány postranními řetězci, pak se taková struktura obecně nazývá porfyrin.
V hemu a jeho prekurzorech se jako substituenty vyskytují methyl (M), vinyl (V), 2acetyl (A) a 3-propionyl (P). Podle typu, počtu a střídání substituentů v polohách 1 až 8 nesou polohové izomery porfyrinů různé názvy a různá číselná označení. Porfyriny nesoucí dva různé substituenty v počtu 4 + 4 tvoří čtyři polohové izomery označované jako typ I – IV. Jestliže se v porfyrinu dva druhy substituentů pravidelně střídají, řadí se výsledná struktura k porfyrinům I. typu. Prekurzory hemu patří k porfyrinům III. typu, které mají pořadí substituentů na IV. pyrrolovém jádře (polohy 7 a 8) obrácené nežli na jádrech I až III. Porfyriny nesoucí tři různé druhy substituentů v počtu 4, 2 a 2 tvoří více než 10 polohových izomerů. Přímý prekursor hemu, protoporfyrin, je porfyrinem typu IX. Porfyriny se v živé přírodě vyskytují zejména jako metaloporfyriny, obsahující mezi dusíky pyrrolových jader komplexně vázaný atom kovu a vázané na bílkoviny. V hemoglobinu, myoglobinu, katalase a dalších je tímto kovem železo, v chlorofylu je to hořčík.
Při biosyntéze hemu nebo chemickou redukcí porfyrinů vznikají porfyrinogeny, u kterých jsou pyrrolová jádra spojena methylenovými můstky (─ CH2 ─). U porfyrinogenů tedy není přítomen konjugovaný systém dvojných vazeb a tyto sloučeniny jsou proto na rozdíl od porfyrinů bezbarvé a nefluoreskují. Methinové můstky se tvoří enzymovou nebo spontánní oxidací porfyrinogenů. Roztoky porfyrinů intenzivně absorbují viditelné světlo v úzkém pásu s maximem kolem 400 nm (tzv. Soretův pás). Další charakteristickou vlastností porfyrinů je červená fluorescence jejich kyselých nebo organických roztoků po excitaci ultrafialovým světlem. Na těchto vlastnostech jsou založeny četné metody důkazu nebo stanovení porfyrinů. Hem Čtyři dusíky porfinového cyklu, z nichž dva mají odštěpitelné protony, splňují ideální podmínky pro tvorbu chelátu s kovovým iontem. Dvojmocné železo s koordinačním číslem 6 se může za těchto okolností stát centrálním atomem komplexu, který je uspořádán do tvaru osmistěnu. Vazby železa s dusíkovými atomy jsou velmi pevné a dvě zbývající koordinační vazby mohou být obsazeny různými substituenty. Protoporfyrin IX poskytuje s atomem dvojmocného železa hem (viz kapitola 3.4). Plně funkční molekula schopná slabé vazby s kyslíkem, tj. oxygenace, však vzniká teprve po vazbě hemu s globinem. Děje se to pomocí volného elektronového páru dusíkového atomu imidazolového jádra aminokyseliny histidinu z polypeptidového řetězce globinu. Tento elektronový pár obsadí pátou pozici atomu železa, čímž se šestá pozice stává labilní v míře právě potřebné pro vazbu molekuly kyslíku. Myoglobin a hemoglobin Molekula myoglobinu obsahuje jediný globin, tj. jediný polypeptidový řetězec (MR 17000, 153 aminokyselin), navázaný na jediný hem. Molekula má kulovitý tvar a polypeptidový řetězec obsahuje vysoký podíl α-šroubovice. Křivka nasycení myoglobinu kyslíkem má na rozdíl od hemoglobinu tvar hyperboly. Pro funkci myoglobinu z toho vyplývá, že uvolňuje kyslík až při nízkém pO2, jak odpovídá podmínkám pracujícího svalu (0,67 kPa). Naproti tomu molekula hemoglobinu je tetramerem, složeným vždy ze dvou dvojic polypeptidových řetězců, z nichž každý nese jeden hem. Polypeptidové řetězce, které se označují písmeny (α, β, γ, δ), jsou kódovány různými geny a mají odlišnou strukturu. Řetězce α obsahují 141 aminokyselin, řetězce β obsahují 146 aminokyselin. Normální lidský
hemoglobin A (HbA) má strukturu α2β2, lidský fetální hemoglobin F (HbF) má strukturu α2γ2, minoritní lidský hemoglobin A2 (HbA2) = α2δ2. Podobně jako jiné bílkoviny našeho organismu, nesou i molekuly hemoglobinu určité množství navázaných sacharidů (glukosy). Hemoglobin je glykován neenzymovou cestou a podíl glykovaného hemoglobinu (HbA1c) z celkového hemoglobinu je přímo úměrný dlouhodobé glykémii. Za normálních okolností tento podíl nepřesahuje 4 %. Stanovení glykovaného hemoglobinu se využívá diagnosticky, aby nás informovalo o stavu glykémie před 6 až 8 týdny, tj. před dobou odpovídající poločasu životnosti erytrocytu. Mutace genů kódujících globinové řetězce jsou příčinou vzniku několika set forem hemoglobinů. Některé mutace jsou neškodné, jiné však podmiňují změnu biologické funkce hemoglobinu (např. změnu afinity vůči kyslíku) a označují se jako hemoglobinopatie. Příkladem je hemoglobin S (HbS). V polypeptidovém řetězci β HbS je glutamová kyselina nahrazena valinem. Tato změna způsobuje tzv. srpkovitou anémii, onemocnění spojené se změnou tvaru a zkrácení životnosti erytrocytu. Nadměrná hemolýza potom působí řadu nepříjemných klinických příznaků této choroby. Reverzibilním dějem, oxygenací, vzniká z hemoglobinu oxyhemoglobin. Jeden tetramer Hb přitom přenáší 4 molekuly kyslíku. Křivka sycení Hb kyslíkem má sigmoidní průběh. Různé hemoglobiny však mají rozdílnou afinitu ke kyslíku. Oxygenace je provázena změnami konformace celé hemoglobinové molekuly. Deoxygenovaná forma se označuje jako T forma (napjatá, taut) a oxygenovaná jako R forma (relaxovaná, R). Deoxygenovanou formu hemoglobinu stabilizuje sloučenina 2,3bisfosfoglycerát, která se tvoří při nedostatku kyslíku v periferních tkáních z 1,3bisfosfoglycerátu vznikajícího glykolýzou. 2,3-bisfosfoglycerát se váže na β-řetězce a podporuje na periferii uvolnění kyslíku a jeho předání tkáním. Kromě transportu kyslíku z plic do periferních tkání přenáší hemoglobin také produkovaný oxid uhličitý z tkání do plic. Děje se to vazbou mezi CO2 a N-terminálními skupinami aminokyselin globinových řetězců za uvolnění dvou protonů. Další část CO2 v krvi reaguje s kyselinou uhličitou a vzápětí disociuje na proton a hydrouhličitanový anion v reakci katalyzované karbonátdehydratasou. Poslední díl CO2 se transportuje krví v rozpuštěné formě. Deoxygenovaný hemoglobin váže namísto 4 molekul kyslíku 2 protony. S opětovnou vazbou kyslíku na deoxygenovaný hemoglobin nastává uvolnění protonů. Ty znovu reagují s hydrouhličitanem za vzniku kyseliny uhličité a z ní vzniká (opět za katalýzy karbonátdehydratasou) voda a CO2, který se vydýchá. Vazba kyslíku na hemoglobin tedy podporuje uvolňování CO2 – Bohrův efekt.
Deriváty hemoglobinu Hem i celé hemoglobinové molekuly mohou podléhat řadě dalších reakcí. Šestá pozice hemoglobinu může být obsazena molekulárním kyslíkem, molekulou vody nebo jiným imidazolovým jádrem globinu. Může být však obsazena i např. oxidem uhelnatým za vzniku karbonylhemoglobinu. Tato vazba je sice reverzibilní, avšak je asi 250x pevnější než vazba s kyslíkem. Proto i při relativně malých koncentracích oxidu uhelnatého ve vdechovaném vzduchu rychle vzrůstá koncentrace karbonylhemoglobinu v krvi a klesá schopnost transportu kyslíku, což může být příčinou udušení. Účinkem oxidačních činidel se reverzibilně oxiduje dvojmocné železo v hemoglobinu na trojmocné a vzniká methemoglobin, který také není schopen přenášet kyslík. K tomuto ději dochází v malé míře i za normálních okolností. Enzymový methemoglobinreduktasový systém v erytrocytech však s využitím redukovaných nikotinamidadenindinukleotidových koenzymů obrací tuto reakci zpět. Při zvýšeném přívodu dusitanů pocházejících např. z dusičnanů v pitné vodě, nebo při toxickém či terapeutickém podávání nitrosloučenin, může koncentrace methemoglobinu v krvi stoupat a vést k závažnému poškození organismu (hlavně u kojenců). Obsazením šesté pozice methemoglobinu kyanovou skupinou CN- vzniká pevný komplex kyanmethemoglobinu. Jeho vzniku a stability se využívá při stanovení hemoglobinu v krvi. Denaturací bílkovinné složky, tj. rozrušením kvarterní struktury (rozpad tetrameru) a terciární struktury globinu, přechází hemoglobin nevratně na hemochromogen a po úplném odštěpením globinu zbývá volný hem. Cytochromy a vitamin B12 Cytochromy jsou proteiny přítomné v buňkách všech aerobních organismů, kde se účastní na oxidačně redukčních pochodech v mitochondiálních membránách. Obsahují hem, jehož centrální atom železa během transportu elektronů mění mocenství z FeII na FeIII. Každá skupina cytochromů (cytochromy a, b a c) má na svém tetrapyrrolovém cyklu různou skladbu substituentů. Vitamin B12 – kyanokobalamin, má strukturu podobnou porfyrinům s tím rozdílem, že centrálním kovovým iontem je kobalt. Tato struktura se jmenuje korin a sloučeniny, které ji obsahují se nazývají korinoidy. Centrální kobalt kyanokobalaminu váže svými dalšími
koordinačními vazbami skupinu ─CN a 5,6-dimethylbenzimidazol. Vitamin B12 se účastní na přeměně aminokyselin, na tvorbě nukleotidů, při tvorbě a vývoji erytrocytů, aj. Chlorofyl Chlorofyl je tetrapyrrolovým barvivem zelených rostlin. Je to rovněž cyklický tetrapyrrol, který vzniká z protoporfyrinu IX, podobně jako hem. V centru molekuly chlorofylu však není Fe2+, ale Mg2+. Ve struktuře je dále na III. pyrrolovém jádru kondensovaný pětičlenný (cyklopentanonový) kruh, IV. jádro je částečně redukováno a propionylový postranní řetězec je esterifikován isoprenoidním alkoholem fytolem. Skladbou postranních řetězců se odlišují dva hlavní chlorofyly eukaryot (chlorofyly a, resp. b) a dva nejvýznamnější chlorofyly bakterií (bakteriochlorofyly a nebo b). Lineární tetrapyrroly K biologicky významným lineárním tetrapyrrolům náleží skupina látek označovaných jako žlučová barviva (viz kapitola 3.4). Vznikají rozštěpením cyklického tetrapyrrolu hemu. Patří sem bilirubin, biliverdin, urobilin a sterkobilin (urobilinogen a sterkobilinogen) a dále barviva vznikající z těchto sloučenin v průběhu pasáže střevem. Oxidačním rozštěpením α-methinového můstku hemu vznikne lineární tetrapyrrol biliverdin, jehož dvě krajní pyrrolová jádra jsou částečně oxidována a uhlík bývalého αmethinového můstku se oxidací přeměnil na oxid uhelnatý. Tato sloučenina získala svůj název podle zelené barvy.
Hydrogenací biliverdinu a přeměnou prostředního methinového můstku na methylenový, vznikne další žlučové barvivo – bilirubin. Jeho barva je žlutooranžová. Další hydrogenace postihne nejen methinové můstky, ale přemění i vinylové skupiny bilirubinu na ethylové, čímž vzniká urobilinogen (mesobilirubinogen). Hydrogenace krajních pyrrolových jader poskytne sterkobilinogen. Urobilinogen i sterkobilinogen jsou bezbarvé. Oxidací vzdušným kyslíkem se z nich tvoří urobilin a sterkobilin, které dávají charakteristické zbarvení stolici. Literatura: 1.
Masopust, J. Klinická biochemie, požadování a hodnocení biochemických vyšetření. Praha : Karolinum, 1998, 832 s., ISBN 80-7184-649-3.
2.
Murray, R.K., Granner, D.K., Mayes, P.A., Rodwell V.W. Harperova biochemie. Jinočany : Nakladatelství H&H, 1998, 872 s., ISBN 80-85787-38-5.
3.
Schneiderka, P., Jirsa, M., Kazda, A. et al. Kapitoly z klinické biochemie, Praha : Karolinum, 2004, 365 s., ISBN 80-246-0678-X.
4.
Schneiderka, P., Bezdíčková, D., Jirsa, M. et al. Stanovení analytů v klinické biochemii. I. část. Praha : Karolinum, 1999, 153 s., ISBN 80-7184-761-5.
5.
Voet, D., Voetová, J.G. Biochemie. Praha : Victoria Publishing, 1995, 1325 s., ISBN 80-85605-44-9.
