Vol. 9, No.2 Desember 2013 Enzyme-Linked lmmunosorbe.nt Assay for Detection of lnfecrious Bronchitis Antibody in
159
. Chickens using Local Isolate of PTS II1 Risa Indriani & NLP. Indi Dharmayanri Karakterisasi Genetik Ternpuyung (Sonchus arvemis L.) Berdasarkan Penanda Molekuler
167
Sequence-Related Amplified Polymorphism Dyah Subosiri & Rohiuat Mujabid Karakteristik Populasi Labi-Iabi Amyda cartilaginea (Boddaerr, 1770) yang Tenangbp di
175
Sumatera Selatan Agus Arifin Senrosa, Danu Wijaya & Asrri Suryandari Pengarnh Jalan Terhadap Keragaman Jenis Tumbllhan Bawah dao Habitarnya cli Koridor
18~
Taman Nasiona! Gunung Halimun Salak, Jawa Barat Jyan Robiansyah & Danang W. Purnomo lso.lar Bakreri Indigenous Penghasil Milk-CLotting Protease Llntllk Fermenrasi Kejll
199
Nanik Rabmani, Yana Nurita Sari, Nurheni Sri Palupi & Yopi Preferensi Ekologis Jenis-Jenis Tllmbuhan Dominan di Gunung Endur Barnen
209
EN. Sambas, C. Kllsmana, LB. Prasetyo & T. Partomihardjo Perrumbuhan dan Procluksi Jagung PlIlur Loka! Sulawesi Selatan yang Ditanam di Polibag
219
Pada Berbagai K.ornbinasi Perlakuan Pupuk Organik Tid Juhaeti, N Hidayati & M Rahmansyah Kajian Pemilihan Jenis Twnbuhan Unrllk Restorasi Huran Berclasarkan Beberapa
Parameter FO[Qsinresis Tinia ley!! Shofia Ahmad, Dede Seriadi, & Diclik Widyannoko
Diterbitkan olcb:
PERHlMPUNAN BIOLOG[ INDONESIA Bekcrjasama (Iengan
PUSUT BlOLOGI - UPI
23.3
Jurnal Biologi Indonnesia 9(2): 199-208 (2013)
Isolats Bakteri Indigenous Penghasil Milk-Clotting Protease untuk Fermentasi Keju (Isolates of Indigenous Bacteria Producing Milk-Clotting Protease for Cheese Fermentation) Nanik RahmanP, Yana Nurita Sari2 , Nurheni Sri Palupi2 & YopP ILaboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Bidang Bioproses Puslit Bioteknologi-LIPI, JI. Raya Bogor Km. 46, Cibinong 169011, E-mail:
[email protected] 2Departemen Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pangan , Insriwt Pertanian Bogor
Memasukkan: Februari 2013, Diterima: April 2013
ABSTRACT The aims of this research is to isolation of bacteria that potential to produce of milk clotting protease enzymes from fermented food that will be used as a substitute for rennet in cheese making. 1here are five food fermentations such as tauco, tempeh, red oncom, sticky tape, and pickled mustard greens that are used as a source for isolation of bacteria that could produce milk clotting protease. 1he results obtained four isolates proteolytic bacteria from two fermented food samples, three isolates bacteria from tauco (TeN 1, TeN 2, TeN 3) and one isolate from pickled mustard greens (DSN I). Based on 16S rONA, these isolates were identified as Bacillus sp. Bacterial isolate TeN 1 has a milk clotting activity of29.17 U/mL, whereas bacteria isolates of TeN 2, TeN 3 and DSN 1 have activities of 70 U/mL achieved at the 24 hours incubation, respectively. 1he proteolytic activities of bacteria isolates TeN 1, TeN 2, TeN 3 and DSN 1 at the 24 hours fermentation process were 0.0117 U/mL, 0.0021 U/mL, 0.0150 U/mL, and 0.200 U/mL , respectively. The ratio of milk clotting protease activity and the proteolytic activity for bacteria isolates TeN 1, TeN 2, TeN 3 and DSN respectively were 5402, 175000, 7292, and 3333. 111is showed that the enzyme from bacterial isolates TeN 2 can be used as an alternative to rennin in cheese making.
Keywords: milk clotting protease, cheese, calf rennet, fermentation food ABSTRAK Penelitian ini bertujuan untuk melakukan isolasi bakteri penghasil enzim milk clotting protease dari pangan fermentasi yang akan dimanfaatkan sebagai pengganti rennin dalam pembuatan keju. Ada lima pangan fermentasi yaitu tauco, tempe, oncom merah, tape ketan, dan asinan sawi yang digunakan sebagai sumber bakteri penghasil enzim milk clotting protease. Dari hasil isolasi diperoleh em pat isolat bakteri proteolitik dari dua sampel pangan fermentasi , yakni tiga isolat bakteri dari tauco (TeN 1, TeN 2, TeN 3) dan saw isolat bakteri dari asinan sawi (DSN I). Berdasarkan analisa 16S rONA, keempat isolate tersebut diidentifikasi termasuk dalam kelompok Bacillus sp. Isolat bakteri TeN 1 memiliki aktivitas penggumpalan susu sebesar 29.17 U/mL sedangkan isolat bakteri TeN 2, TeN 3 dan DSN 1 memiliki aktivitas masing-masing 70 U/mL yang seluruhnya dicapai pada jam ke-24 inkubasi. Isolat bakteri TeN 1, TeN 2, TeN 3 dan DSN 1 memiliki aktivitas protease pada jam ke-24 berturut-turut sebesar 0.0117 U/mL, 0.0021 U/mL, 0.0150 U/mL, dan 0.200 U/mL. Rasio aktivitas penggumpalan susu terhadap protease untuk isolat bakteri TeN 1, TeN 2, TeN 3 dan DSN 1 secara berturut-turut adalah 5402, 175000, 7292, dan 3333. Dari keempat isolat yang diperoleh menunjukkan bahwa enzim dari isolat bakteri TeN 2 dapat digunakan sebagai alternatif pengganti renin dalam pembuatan keju.
Kata Kunci : protease penggumpal susu, keju, rennet anak sapi, produk pangan fermentasi
PENDAHULUAN
rna yang banyak digunakan dalam produksi keju sebagai reagen milk-clotting (Isam et
at.
2009).
Penggumpalan susu merupakan tahap
Renet tidak hanya berfungsi sebagai penggumpal
kunci dalam industri pembuatan keju dan enzim
susu tetapi juga memainkan peran penting selama
milk-clotting protease memainkan peran utama
proses pematangan keju yang merupakan proses
dalam proses tersebut. Calf rennet yang mengan-
utama dan komplek dalam pembentukan cita rasa
dung chymosin (EC 3.4.23.4) termasuk aspartate
dan tekstur dari keju (Vioque et
protease yang merupakan komponen enzim uta-
Makata 2002, Kumar et
at. 2000, Sausa &
at. 2005).
Beberapa studi 199
Rahmani, dkk.
telah dilakukan berkaitan dengan enzim milk clot-
red kojic rice, salah satu makanan tradisional Chi-
ting yang berasal dari mikroorganisme untuk ap-
na (Zhang et aL. 2011).
likasi dalam pembuatan keju (Poza et aL. 2003; Oini et aL. 2010).
Penelitian isolasi mikroba penghasil protease dan karakternya sudah banyak dilakukan di
Oalam industri pembuatan keju secara
Indonesia, sedang untuk isolasi protease jenis milk
tradisional banyak menggunakan renet dari anak
clotting sebagai pengganti rennet masih sedikit
sapi. Penggumpalan susu oleh renet dari anak sapi
(Nunuk et aL. 2001) . Untuk tujuan produksi keju
terjadi akibat pemecahan ikatan Phe 105-Met 106
diperlukan penggunaan renin yang memiliki ak-
pada ikatan K-casein menghasilkan glikopeptida
tivitas milk clotting tinggi (MCA) dan PA yang
hidrofilik rantai pendek (106-169 residll) yang
rendah untuk meminimalkan larutnya curd (Wu
dilepas ke dalam whey. Para- K -casein menj adi
et al. 2008) . Oleh karena itu, dalam penelitian ini
bermuatan positif pada pH netral dan menyebab-
dipaparkan satu usaha untuk mencari pengganti
kan penurunan ikatan diantara micelle casein yang
renet, dengan melakukan proses isolasi enzim
menyebabkan agregasi (Green 1973).
milk clotting protease yang berasal dari produk
Penggunaan renet yang berasal dari anak sapi berkaitan dengan masalah etika, sehingga
pangan fermentasi yang ban yak terdapat di Indonesia.
diperlukan usaha mencari alternatif substitusi renet yang berasal dari mikroorganisme yaitu enzim
BAHAN DAN CARA KERJA
milk clotting protease (Tubesha & Al-Oelaimy,
2003; Cavalcanti et aL. 2004) .
Sampel yang digunakan sebagai sumber
Produksi enzim milk clotting protease telah
isolat adalah produk pangan fermentasi antara
dilaporkan dari beberapa mikroorganisme seperti
lain sawi asin, oncom, tauco, tempe, dan tape
Penicillium oxalium (Hashem 2000), Nocardiopsis
ketan. Sampel dihancurkan hingga homogen, lalu
sp (Cavalcanti et aL. 2004) , Mucor circinelloides
diukur pH-nya. Masing-masing sam pel ditimbang
(Sathya et aL. 2009) dan Bacillus amyloliquefaciens
sebanyak 0.25 g dan disimpan pada suhu refriger-
04 (He at aL. 2011) . Beberapa mikroba yang po-
ator. Untuk sawi asin, diambil juga sampel airnya
tensial menghasilkan enzim milk clotting protease
untuk isolasi bakteri sebanyak 0.25 mL. Proses
dan potensial sebagai subtitusi calf rennet, yaitu
persiapan sampel dilakukan secara aseptis.
Penicillium oxalicum (Hashem, 2000) dan Nocar-
Media pertumbuhan bakteri menggunakan
diopsis sp (Cavalcanti et al. 2004). Untuk saat ini
medium Nutrient
produksi keju di dunia menggunakan sepertiga
penghasil enzim penggumpal susu menggunakan
renet dari mikroba yang berasal dari mikroorgan-
skim milk agar. Sample dari 5 produk fermentasi
isme jenis kapang (Preetha & Boopathy, 1994).
sebanyak 0.25 g dan 0.25 mL sample cair produk
Banyak peneliti telah memfokuskan untuk melakukan isolasi kllngan
tertentu
mikroorganisme dari linguntuk
mendapatkan
enzim
Broth
dan
isolasi bakteri
fermentasi sawi, masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 2.5 mL medium Nutrient Broth untuk pertumbuhan bakteri.
dengan aktivitas milk clotting protease yang tinggi
Inkubasi
dan aktivitas protease yang rendah at au per-
menggunakan shaker incubator dengan kecepatan
bandingan aktivitas milk clotting protease terhadap
150 rpm. Oari media pertumbllhan bakteri selan-
protease yang tinggi (He et aL. 2011) . Salah satu
jutnya dibuat pengenceran bertingkat (l0-QO-5)
diantaranya isolasi enzim milk clotting protease dari
masing-masing sebanyak 1 mL dan di inoku-
200
selama 24
jam
pada suhu
ruang
Isolat Baktcri lruJigenous Pcnghasil Mille-Clotting Protease
lasikan kedalam media padat. Bakteri penghasil
Aktivitas penggumpalan susu ditentukan ber-
enzim milk clotting protease diskrining dengan
dasarkan uji visual dari pembentukan gumpalan
menggunakan media skim milk agar. Isolat yang
susu pertama kali akibat penambahan enzim yang
memberikan zona bening selanjutnya diukur in-
dinotasikan dalam Soxhlet Unit (SU) . Satu SU
dek proteolitiknya dan selanjutnya diuji poten-
didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat
sinya sebagai penghasil enzim milk clotting prote-
menggumpalkan 1 mL campuran yang mengan-
ase.
dung 0.1 g susu skim dan 0.001 g CaCl 2 dalam Identifikasi bakteri dilakukan secara mole-
40 menit pada suhu 35"C (Arima et al. 1970).
kuler dengan menganalisis sebagian gen 16S
Sebanyak 0.5 mL enzim ditambahkan ke dalam 5
rDNAnya. Gen 16S rONA diamplifikasi dengan
mL susu skim (10 g susu skim/100 mL 0.01 M
menggunakan primer 9F (5'-AGRGTTTGAT
CaCl 2) yang telah diinkubasi pada suhu 40°C sela-
CMTGGCTCAG-3') and 1492R (5'-ACGGYTA
rna 5 menit. Campuran tersebut diaduk hingga
CCTTGTTAYGACTT-3').
dil-
terbentuk gumpalan. Pengukuran aktivitas enzim
akukan dengan campuran reaksi yang mengan-
milk-clotting menggunakan persamaan berikut ini:
dung DNA bakteri, primer 9F dan 1492R mas-
(MCA)
ing-masing 10 pmol 2
~I,
Amplifikasi
=
2400 x 5 x 0
T x 0,5
larutan Go T aq
(promega) 26 ~I serta ddH20 20 ~1. Adapun
Kctcrangan:
kondisi reaksi PCR ialah 95 oC, 2 menit (1 si-
MCA= aktivitas enzim milk-clotting (SU)
klus); 95 °C, 30 detik, 65 oC, 1 menit, 72 oc, 2
T
=
waktu pertama kali terbentuk gumpalan susu (detik)
o = faktor pengenceran
menit (10 siklus); 95 oc, 30 detik, 55 oc, 1 men-
Aktivitas
protease ditentukan
melalui
it, 72 oC, 2 menit (30 siklus) serta 72 oC, 2 menit
metode standar Lowry yang dimodifikasi (Meloan
(1 siklus) . PCR produk disequensing di First Base
& Pomeranz 1973). Sebanyak 0.2 ml substrat
Malaysia. Hasil sekuen selanjutnya dibandingkan
kasein
dengan database di Gen Bank menggunakan
dengan 0.1 mL larutan enzim kasar, kemudian
BLAST algorithm.
dicampur dan diinkubasi di shaker incubator sela-
Produksi enzim dilakukan dengan metode
dengan
konsentrasi
rna 20 menit pada suhu
0.1 % direaksikan
3rc. Setelah diinkubasi
fermentasi cair. Isolat bakteri dikulturkan pada
selama 20 men it, larutan reaksi tersebut ditambah
media Nutrient Broth yang telah ditambahkan
0.24 mL 0.4 M TCA, dicampur dan diinkubasi
substrat kasein lalu diinkubasi menggunakan
pada shaker incubator selama 20 menit pada suhu
shaker incubator pada 150 rpm, suhu ruang sela-
3rc. Setelah disentrifugasi selama 10 menit pada
rna 5 hari dan dilakukan sampling setiap 24 jam.
kecepatan 10.000 rpm, 0.1 mL supernatan diam-
Hasil sampling kemudian diukur pertumbuhan
bil dan disimpan pada tabung reaksi baru.
selnya menggunakan spektrofotometer pada A
Kemudian ditambahkan 0,5 mL 0.4 M Na2C03
660 nm. Hasil sampling tersebut disentrifugasi
dan 0.1 mL fenol folin, dihomogenkan dengan
pada 10.000 rpm selama 10 men it, kemudian
vorteks dan diinkubasi pada suhu
diambil supernatannya sebagai ekstrak enzim
menit. Larutan reaksi diukur absorbansinya pada
kasar untuk dianalisa aktivitas milk clotting prote-
A 660 nm dan diukur aktivitas proteasenya
ase (Milk clotting activity: MCA), aktivitas proteo-
dengan menggunakan rum us dibawah ini. Satu
litiknya (Proteolytic activity: PA) serta rasio aktivi-
unit (U) aktivitas protease didefinisikan sebagai
tas milk clotting protease terhadap protease
jumlah enzim yang dapat mengkatalisis reaksi
3rC selama 20
(MCNPA). 201
Rahmani, dkk.
pelepasan 1 ~lmol tirosin per menit
Analisis sebagian gen 16S rDNA Bakteri
Aktivitas protease (PA) = X x FP x _IN x T
Amplifikasi
Keterangan :
sebagian
gen
165
rONA menghasilkan produk sekitar 1500 bp
PA
=
Protease activity (U/mL)
X
=
Konsentrasi enzim (mg/mL)
FP
=
Fakror pengenceran
V
=
Volume enzim yang dianalisis (mL)
=
waktu inkubasi (menit)
T
daerah
(Gambar 3). Analisis homologi untuk masingmasing isolat bisa dilihat pada Tabel 3.
Perhitungan rasio aktivitas penggumpalan susu terhadap protease
Pengukuran Aktivitas Enzim dan Seleksi Isolat Bakteri Kurva Pertwnbuhan Isolat Bakteri
menggunakan rumus
Hasil pengukuran pertumbuhan sel pada
perhitungan pada persamaan berikut ini (Arima et
A 660 nm ditunjukkan pada Gambar 4. Empat
aL. 1%7) :
isolat bakteri memiliki profil pertumbuhan yang
R=MCA
sarna dengan pertumbuhan sel tertinggi pada jam
PA
ke-24.
Keterangan : R: Rasio aktivitas penggumpulan susu terhadap protease
MeA : Milk Clotting Activity; Aktivitas penggumpalan
Data aktivitas milk clotting protease dari
susu (SU/mL) PA
Aktivitas Enzim Penggumpal Susu keempat isolat bakteri bisa dilihat pada Gambar
: Protease Activity ; Aktivitas protease (U/mL)
5. Pembentukan gumpalan susu oleh adanya ak-
HASIL
tivitas enzim milk clotting protease bisa dilihat pada Gambar 6. Tiga isolat bakteri dari produk fer-
Isolasi Bakteri dari Pangan Fermentasi
mentasi tau co memiliki aktivitas penggumpalan
Isolasi dilakukan terhadap lima sampel pangan
susu lebih tinggi dibanding isolat bakteri D5N
fermentasi yaitu tauco, tempe, oncom merah, tape
dari produk fermentasi sawi, meskipun proses
ketan, dan asinan sawi (Gambar 1).
penggumpalan susu optimum diperoleh setelah 24 jam.
Tabe11.
Ciri morfologi 4 bakteri hasil isolasi dari 5 produk fermentasi
No.
holat Bakteri
Sumber
TeN 1
Tauco
2
TeN 2
Tauco
3
TeN 3
Tauco
4
DSN 1
Asinan saw i
A B C
Gambar 1.
Ciri Koloni benruk bulat. ukuran medium. berwarna putih opaqu e. tepian entire bentuk tidak b e raturan. ukuran large. berwarna putih opaque. tepian undulate ben tuk tidak ber a turan . ukuran large. berwarna translusens. tepian undulate bentuk bulat. ukuran large. berwarna putih opaque. tepian undulate
0
E
Sampel pangan fermentasi yang digunakan sebagai sumber isolat: oncom merah (a), tempe (b), tape ketan (c), tau co (d), asinan sawi (e)
202
Isolat Bakteri Indigenous PenghasU Milk-Clotting Protease
Aktivitas protease dan rasio aktivitas penggumpulan susu Hasil uji aktivitas proteolitik terhadap 4
i isolat Zona
-...;;.;;=......
-+.~
isolat bakteri menunjukkan hasil yang berbeda dengan profil aktivitas penggumpalan susu. Satu isolat bakteri produk fermentasi tauco yaitu TCN2 menunjukkan aktivitas proteolitik paling
Gambar 2. Contoh zona bening dari isolat bakteri
kecil dibanding 3 isolat bakteri lainnya. Aktivitas
TCN 2 pada medium skim milk agar
tertinggi di peroleh oleh isolat bakteri TCN 1 dengan aktivitas sekitar 0.02 U/mL (Gambar 7).
penggumpalan susu tertinggi dibanding 3 isolat
Isolat yang telah diuji aktivitas penggumpalan
bakteri lainnya.
susu dan proteasenya kemudian dihitung rasio aktivitas penggumpalannya terhadap protease.
PEMBAHASAN
Hasil perhitungan rasio enzim penggumpal susu terhadap protease dari keempat isolat bakteri dapat dilihat pada Tabel4. Tabel4 menunjukkan bahwa
isolat
bakteri
TCN2
memiliki
rasio
Medium isolasi untuk memperoleh koloni tunggal menggunakan medium selektif susu skim agar yang umum digunakan untuk memperoleh
Tabel 2. Indeks Protease 4 bakteri hasil isolasi dari 5 produk fermentasi No. 1
TeN 1
2
TeN 2
3 4
TeN 3
Diameter zona bening (em) 1.30 1.60 1.20 1.40
D lam eter i.olate bakteri (em) 0.40 0.40 0.40 0.40
Isolat B abed
DSN 1 2.0
2.0
.:;; 1.5 c
1.5
. ~
'-
1.0
"----r
Indeks Protease 3.25 4.00 3.00 3.50
[~
1.0
'----->
.Q
0.5
0.5
0.0 0
24
48
72
96
0
120
24
lama inkubasi (jam)
2.0
.:;;
.
48
72
96
1 20
96
120
lama inkubasi (jam)
2.0
ffi- - -<1i
1.5
!Ii
-IT:
..
'1lI
r::
1.5
r::
~ 1.0
~ 1.0
..Q
..Q
c(
c(
0.5
0.5
0.0
0.0 0
24
48
72
lama Inkubasl (jam)
96
120
0
24
48
72
lama inkubasl (jam)
Gambar 3. Profil pertllmbllhan isolat bakteri TCN 1 (a), TCN 2 (b), TCN 3 (c), dan DSN 1 (d) selama 5 hari masa fermentasi pada 150 rpm dan suhu ruang. Konsentrasi sel diukur pada abs. 660 nm.
203
Rahmani, dkk.
_.,..-...............
-
90 80
-
---- ~ -
--
-
hol.11 T{. N l
gumpalan susu
I')ol.:at l e N l
'...... 1:\1 l( N " l '>O ld tO ~
l
Gambar 5. Pembentukan gumpalan susu pertama oleh aktivitas enzim isolat bakteri
lama Inkub .....i (Jam)
kedekatan dengan jenis bakteri asam laktat. 1n-
Gambar 4. Aktivitas enzim penggumpal susu isolat bakteri
dentifikasi molecular untuk melihat jenis bakteri sedang dalam proses saat ini. 1ndeks protease adalah perbandingan diam-
bakteri penghasil protease (Nunuk et al. 2001)
eter zona bening koloni dengan diameter koloni
termasuk enzim milk clotting protease. Koloni bak-
isolat. Semakin besar zona bening yang dihasilkan
teri akan membentuk zona bening sebagai hasil
berarti semakin besar pula kemampuan isolat ter-
perubahan kasein menjadi senyawa nitrogen yang
sebut
larut (Hidayat et al. 2006). Dari kelima sampel
(Yusmarini et al. 2009) . Pada penelitian ini, isolat
produk fermentasi diperoleh 38 isolat bakteri dan
yang memiliki indeks protease paling tinggi ada-
setelah analisa lebih lanjut dipilih 4 isolat bakteri
lah isolat bakteri TCN 2 sebesar 4.
positif dengan ciri koloni berbeda. Tiga isolat
untuk
Empat
menghasilkan
isolat
bakteri
enzim
(TCN1,
protease
TCN2,
bakteri tersebut merupakan hasil isolasi dari
TCN3 dan DSN1) yang diuji menggunakan ana-
produk tauco dan 1 is 01 at bakteri dari prod uk
lisa 16S rONA diidentifikasi termasuk dalam ke-
asinan sawi, yang kemungkinan merupakan bak-
lompok
teri yang berperan dalam proses fermentasi bahan
menggunakan BLAST, keempat isolate tersebut
pangan itu sendiri. Proses fermentasi tauco ada
memiliki sekuen homologi 99% : isolate TCN 1
dua tahap, yaitu fermentasi oleh kapang dan fer-
dengan Bacillus Bacillus cereus, ATCC 14579;
mentasi dalam larutan garam oleh bakteri asam
isolate TCN2 dengan Bacillus amyloliquefaciens,
laktat dan khamir. Bakteri dominan yang tumbuh
NBRC 15535, isolate TCN3 dengan Bacillus sub-
selama fermentasi garam pada pembuatan tauco
tilis, NRRL B-23049 dan isolate DSN1 dengan
adalah Lactobacillus delbrueckii (Nurwitri et al.
Bacillus amyloliquefaciens, NBRC 15535.
Bacillus
sp.
Berdasarkan
analisis
2007). Pada pangan fermentasi berbasis sayuran
Kurva pertumbuhan pada Gambar 3 di-
seperti asinan sawi, proses fermentasi umumnya
tunjukkan bahwa pada jam ke-O belum terlihat
dilakukan dalam larutan garam dan fermentasi
adanya kekekeruhan pada medium yang berisi
berlangsung secara spontan dengan memanfaat-
inokulum. Pada tahap ini terjadi fase adaptasi.
kan mikroba-mikroba yang telah ada pada sayur-
Pada pengamatan ini, terlihat bahwa semua isolat
an itu sendiri. Beberapa jenis bakteri yang ber-
bakteri memiliki kekeruhan inokulum yang paling
peran dalam fermentasi sayuran antara lain Leuco-
tinggi pada jam ke-24. Pada tahap ini isolate bak-
nostoc mesenteroides, Lactobacillus brevis dan Pedio-
teri sudah mencapai fase log sehingga untuk pem-
coccus cerevisiae (Nurwitri et al. 2007). Empat
anenan
isolat bakteri hasil isolasi dari produk tauco dan
Penurunan jumlah sel ini mulai terjadi setelah
sawi dalam penelitian ini diprediksi memiliki
inkubasi jam ke-24 hingga jam ke-120 . Profil per-
204
enzim
dilakukan
pada
jam
ke-24 .
Isolat Bakteri InJigmous PenghasU Mille-Clotting Protease
mikroba penghasil enzim penggumpal susu antara
tumbuhan 4 isolat bakteri tidak berbeda. Penggumpalan susu merupakan pnnSlp
1-8 hari; 1 hari untuk Bacillus subtilis (Shieh et al.
dasar pada pembuatan keju. Dalam pembuatan
2009), 4 hari untuk Mucor miehei (Escobar &
keju, renet biasanya ditambahkan ke dalam susu
Barnett, 1990), 3 hari untuk Mucor pusillus
Proses
(Arima et al. 1970), 3 hari untuk Amylomyces
penggumpalan susu oleh renin terjadi melalui dua
rouxii (Yu & Chou, 2005), 3-4 hari untuk Mucor
tahap. Tahap pertama merupakan perubahan kap-
baciliformis (Areces et al. 1992), dan 8 hari untuk
pa-kasein menjadi para-kasein oleh enzim dan
Penicillium oxalicum (Hashem 1999). M ulai pada
tahap kedua para-kasein digumpalkan oleh proses
jam ke-48 aktivitas penggumpalan susu mulai
pemanasan dengan adanya ion kalsium. Renin
menu run hingga jam ke-120. Hal ini disebabkan
bekerja pada substrat kappa-kasein yang berfungsi
oleh penurunan jumlah substrat sehingga pem-
sebagai koloid yang merupakan lapisan luar
bentukan kompleks enzim-substrat juga ikut
kasein, sehingga dengan menghidrolisis kappa-
menurun. Pada gambar 4 ditunjukkan bahwa
kasein, kasein lebih mudah tergumpalkan secara
isolat
sempurna dengan syarat ion kalsium tersedia da-
penggumpalan susu sebesar 29.17 U/mL, se-
lam larutan tersebut (Winarno 2010) . Dalam
dangkan isolat bakteri TCN 2, TCN 3 dan DSN
penggunaannya, renin dapat digunakan dalam
1 memiliki aktivitas masing-masing 70 U/mL.
dua bentuk yakni renet cair dan renet dalam ben-
Isolat bakteri TCN 2, TCN 3 dan DSN 1 mem-
tuk padatan seperti bubuk atau pelet. Bentuk re-
iliki aktivitas yang paling tinggi, artinya semakin
net yang ditambahkan dapat mempengaruhi ak-
tinggi aktivitas penggumpalannya semakin singkat
tivitas enzim penggumpal susu. Renet dalam ben-
waktu yang dibutuhkan enzim tersebut untuk
tuk cair memiliki aktivitas penggumpalan susu
menggumpalkan susu hingga whey terpisah.
setelah
penambahan
kultur
starter.
bakteri
TCN
1
memiliki
aktivitas
sebesar 9600 U/mL (Thakur et al. 1990) se-
Isolat bakteri yang mampu menggumpal-
dangkan dalam bentuk padatan memiliki aktivitas
kan susu selanjutnya diuji aktivitas proteasenya.
6200
Enzim
Pengukuran aktivitas protease ini bertujuan untuk
penggumpal susu dari mikroba memiliki aktivitas
mengetahui kemampuan isolat bakteri dalam me-
penggumpalan susu yang berbeda tergantung ben-
mecah protein menjadi peptida dan asam amino.
tuk penggunaannya. Enzim penggumpal susu dari
Kemampuan protease dalarn memecah protein
Mucor pusillus var. Lindt dalam bentuk cair mem-
akan mempengaruhi flavor atau citarasa akibat
iliki aktivitas penggumpalan susu sebesar 800 UI
terbentuknya peptida dan asam amino tersebut.
mL sedangkan dalam bentuk padatan memiliki
Pada pengukuran aktivitas ini diharapkan isolat
aktivitas 100 U/mg (Winarno 2010) . Hal ini
bakteri terpilih memiliki aktivitas protease yang
menunjukkan bahwa proses pembuatan dan pem-
rendah , hal ini dikarenakan aktivitas protease
urnian enzim mempengaruhi aktivitas enzim ter-
(aspartat
sebut.
imbulkan citarasa yang pahit pada produk keju
U/mg
(Nerud
et al.
1989).
Gambar 4 ditunjukkan bahwa keempat
protease)
yang
tinggi
dapat
men-
yang akan dihasilkan (Channe & Shewale, 1998).
isolat bakteri memiliki aktivitas penggumpalan
Aktivitas protease masing-masing isolat
susu yang paling tinggi pada waktu inkubasi jam
bakteri dapat dilihat pada Gambar 6. Hasil pen-
ke-24. Beberapa penelitian melaporkan bahwa
gukuran aktivitas protease pada keempat isolat
waktu
bakteri menunjukkan bahwa isolat bakteri TCN
fermentasi
optimum
untuk
beberapa
205
r Rahmani,
dkk.
1, TeN 3, dan DSN 1 memiliki aktivitas protease
yang
paling
tinggi
sebesar
paling tinggi pada jam ke-48 yakni berturut-turut
penelitian ini, isolat bakteri TeN 2 merupakan
0.0117 U/mL, 0.0150 U/mL, 0.0200 U/mL, se-
isolat terpilih yang dapat dijadikan altematif un-
dangkan isolat bakteri TeN 2 memiliki akivitas
tuk produksi enzim penggumpal susu pada fer-
protease paling tinggi pada jam ke-9G yakni sebe-
mentasi keju. Isolat bakteri TeN 2 memiliki rasio
sar 0.0021 U/mL. Aktivitas protease ini tergolong
aktivitas
sangat rendah. Hal ini sesuai dengan harapan bah-
dibandingkan
wa isolat yang diinginkan memiliki aktivitas pro-
penggumpal susu dari bakteri lain (Tabel 5).
tease yang rendah sehingga tidak menimbulkan
Selain itu, ketiga isolat bakteri lainnya juga mem-
cita rasa yang pahit pada keju yang dihasilkan.
iliki rasio penggumpalan susu terhadap protease
Rasio aktivitas penggumpalan susu ter-
yang juga lebih tinggi dibandingkan beberapa
penggumpalan
yang
beberapa
175000.
lebih
enzlm
Pada
tinggi
penghasil
hadap protease merupakan faktor yang menen-
sumber lain. Hal ini menunjukkan bahwa isolat
tukan apakah bakteri tersebut dapat digunakan
bakteri lainnya
sebagai penghasil altematif enzim penggumpal
DSN 1 juga memiliki potensi untuk menjadi al-
susu. Isolat bakteri yang terpilih merupakan isolat
tematif pengganti renin dalam pembuatan keju.
seperti TeN 1, TeN 3, dan
bakteri yang memiliki aktivitas penggumpalan tinggi dengan aktivitas protease rendah sehingga
KESIMPULAN
menghasilkan rasio yang tinggi. Isolat yang telah Pada penelitian ini diperoleh em pat isolat
diuji aktivitas penggumpalan susu dan proteasenya kemudian dihitung rasio aktivitas
bakteri proteolitik potensial sebagai penghasil en-
penggumpalannya terhadap protease. Aktivitas
zim milk clotting protease dari dua sampel pangan
enzim yang dipilih adalah aktivitas enzim pada
fermentasi, yakni tiga isolat bakteri dari tau co
jam ke-24 karena pada waktu tersebut semua iso-
(TeN 1, TeN 2, TeN 3) dan satu isolat bakteri
lat bakteri menunjukkan aktivitas penggumpalan
dari asinan sawi (DSN 1). Keempat bakteri terse-
susu yang paling tinggi dengan aktivitas protease
but diidentifikasi secara molekuler menggunakan
yang rendah.
analisa 16S rONA diidentifikasi sebagai Bacillus
Hasil perhitungan rasio enzim penggumpal
sp. Isolat bakteri TeN 1 memiliki aktivitas
susu terhadap protease pada Tabel 4 menunjuk-
penggumpalan susu sebesar 29.17 U I mL se-
kan bahwa isolat bakteri TeN 2 memiliki nilai
dangkan isolat bakteri TeN 2, TeN 3 dan DSN
Tabd 5. Perbandingan rasio aktivitas penggumpalan susu terhadap protease isolat bakteri TeN 2 dengan beberapa enzim penggumpal susu dari mikroba lain Sumberenzim
Aktivitas penggumpalan susu
(U/mL)
Rasio
Isolar bakreri TCN 2
70
0.0004
175000
AspergiLLus niger MC4 (Channe & Shewale, 1998) Mucor renin
400
0.01
40000
511
0.11
4650
B. SubtiLis natto (Shieh et aL. 2009)
685
0.23
2981
Pfizer mikrobial renin
750
0.29
2590
56
0.6
93
Thermomucor indicae-seudaticae N31 (Dini et aL. 2010)
206
Aktivitas protease (U/mL)
Isolat Bakteri Indigenous PenghasU Mi/Je-Clotting Protease
1 memiliki aktivitas masing-masing sebesar 70.00
Channe PS. & Shewale JG. 1998. Influence of
U/mL yang seluruhnya dicapai pada jam ke-24
culture conditions on the formation of milk-
masa inkubasi. Isolat bakteri TCN 1, TCN 2,
clotting protease by Aspergillus niger MC4.
TCN 3 dan OSN 1 memiliki aktivitas protease
World] Microb Biot 14(1):11-15
pada jam ke-24 berturut-turut sebesar 0.0117 UI
Oini CB, Gomes E, Boscolo M. & Silva R. 2010.
mL, 0.0021 U/mL, 0.0150 U/mL, dan 0.200 UI
Production and characterization of a milk-
mL.
clotting protease in the crude enzymatic exRasio aktivitas penggumpalan susu ter-
tract from the newly isolated Therrnomucor
hadap protease untuk isolat bakteri TCN 1, TCN
indicae-seudaticae N 31. Food Chemistry 120:
2, TCN 3 dan OSN 1 secara berturut-turut ada-
87-93
lah 5402, 175000, 7292, dan 3333. Hasil terse-
Green ML. 1973. Studies on the mechanism of
but menunjukkan bahwa enzim dari isolat bakteri
clotting of milk. Neth Milk Dairy] 27:278-
TCN 2 dapat digunakan sebagai alternatif peng-
285 Hashem, A. M. 1999. Optimization of milk-
ganti renin dalam pembuatan keju.
clotting enzyme productivity by Penicillium
UCAPAN TERIMA KASIH
oxalicum. Bioresour. Technol. 70: 203-207.
Hashem, A.M. 2000. Purification and properties Penelitian ini didanai oleh dana OIPA MEAT-
of a milk-clotting enzymes produced by Pen-
PRO Puslit Bioteknologi LIPI tahun 2012.
icillium oxalicum. Bioresour. Techno!. 75:219-
222.
DAFTAR PUSTAKA
He, X., Weibing Z., Fazheng R., Bozhong G & Huiyuan G. 2011. Screening fermentation
Areces LB, Bonino MB, Parry MA, Fraile ER, Cascone O.
duced by Bacillus amyloliquefaciens 04 from
1992. Purification and characterization of a
the Tibetan Plateau in China. Ann Microbiol.
milk-clotting protease from Mucor bacilli-
Publish online 15 May 20 II.
Fernandez-Lahore
HM.
parameters of the milk-clotting enzyme pro-
&
formis. Appl Biochem BiotechnoI37:283-294
Arima K, Iwasaki S & Tamura G. 1967. Milk
Hidayat N, Padaga MC & Suhartini S. 2006. Mikrobiologi Industri. Yogyakarta
clotting enzyme from microorganisms. 1.
Isam AMA, Isao M, Elfadil EB, & Nobuhiro M.
Screening tests and identification of the po-
2009 . Characterization of partially purified
tent fungus. Agric Boil Chem 31:540-545
milk-clotting enzyme from Solanum dubium
Arima K, Yu J. & Iwasaki S. 1970. Milk-clotting
Fresen seeds. Food Chem 116:395-400
enzyme from Mucor pusillus var. Lindt. In:
Kumar, S., Sharma, N.S., Saharan, M.R., &
Perlmann G, Lorand L (eds) Methods in
Singh, R. 2005 . Extracellular acid protease
enzymology, vol 19. Academic, New York,
from Rhizopus oryzae: purification and char-
pp 446-459
acterization. Procm Biochemistry, 40, 1701-
Cavalcanti MTH, Teixeira MFS, Lima FJL. &
1705.
Porto ALF. 2004. Partial purification of new
Meloan CE & Pomeranz Y. 1973. Food Analysis
milk-clotting enzyme produced by Nocardi-
Laboratory Experiments. New York: The
opsis sp. Bioresource Techno!. 93:29-35
AVI Publishing Company
207
Rahmani, dkk.
Neelakantan S, Mohanty AK. & Kaushik ]K.
1990. Production of fungal rennet by Mucor
1999. Production and use of microbial en-
miehei using solid state fermentation. Appl
zymes for dairy processing. Curr Sci 77:43-
Microbiol BiotechnoI32:409-413.
148
Tubesha ZA, & Al-Delaimy KS. 2003. Rennin-
Nerud F, Misurcova Z. & Musilek V. 1989. Pro-
like milk coagulant enzyme produced by a
duction of milk-clotting enzymes by Basidio-
local isolate of Mucor. Int} Dairy Sci 56:237
mycetes. Folia microbial 34: 310-315
-241
Nunuk W, Baity H , & Suminar S.A. 200l.
Vioque M, Gomez R, Sanchez E, Mata X, Tejada
Karakter protease ekstraseluler bakteri isolat
I., & Fernandez Saguero]. 2000. Chemical
P.1 yang diisolasi dari tuak lontar. }urnal
and microbiological characteristics of ewe's
Biologi Indonesia Vol. III, No. 1 : 80-89.
milk cheese manufactured with extracts from
Nurwitri Cc, Rahayu WP, Kusumaningrum HD.
Aowers of Cynara caradunculus and Cynara
& Nurjanah S. 2007. Prinsip Fermentasi
humilis as coagulants. } Agric Food Chem
Pangan. E-Learning Mikrobiologi Pangan.
48:451-6
Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, IPB.
Winarno FG. 2010. Enzim Pangan. Bogor : Mbrio Press
Poza M. , M. Prieto-Alcedo, C. Sieiro &
T.G.
Wu ] ., Hongbing c. , & Weiping C. 2008. Fer-
Villa. 2004. Cloning and expression of clt
mentation parameter and partial biochemical
genes encoding milk clotting proteases from
characterization of milk clotting enzyme
Myxococcus xanthus 422. Applied and environ-
from Chinese distiller's yeast. Annals of Mi-
mental microbiology, p. 6337-6341.
crobiology, 58 (4) 717-722.
Preetha S. & Boopathy R. 1994. InAuence of cul-
Yu P]. & Chou Cc. 2005. Factors affecting the
ture conditions on the production of milk-
growth and production of milk-clotting en-
clotting enzyme from Rhizomucor. World}
zymes by Amylomyces rouxii in rice liquid
Microbiol10(5):527-530
medium. Food Technol BiotechnoI43(3):283-
Sathya R., B.V Pradeep, ]. Angayarkanni &
M.
Palaniswamy. 2009. Production of mlik clot-
Yusmarini, Indarti R, Utami T, & Marsono Y.
ting protease by a local isolate of Mucor cir-
2009. Isolasi dan identifikasi bakteri asam
cinelloides under SSF using agro-industrial
laktat proteolitik dari susu kedelai yang ter-
waste. Biotechnology and Bioprocess Engineer-
fermentasi spontan. }urnal Natur Indonesia
ing,14:788-794.
12(1):28-33
CJ,
Ph an Thi LA, & Shih IL. 2009. Milk-
Zhang Z., Chenzhong W., Zhengying Y., ]unfeng
clotting enzymes produced by culture of Ba-
Z., Fengxia L., Gongming Y., Wenjun L &
cillus subtilis natto. Biochem Eng} 43 (1):85-
Zhaoxin L. 2011. Isolation and identifica-
91
tion of a fungal strain QY229 producing
Shieh
Sousa, M. ]. & F. X. Makata. 2002. Advances in the role of a plant coagulant (Cynara cardunculus) in vitro and during ripening of cheeses
from several milk species. Lait 82: 151-170. Thakur MS, NG Karanth &
208
288
Krishna Nand.
milk-clotting enzyme. Eur Food Res Technol, 232: 861-866.
