:

7

\ KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI UNIVERSITAS I]DAYANA

UPT PERPUSTAKAAN Alamat : Kampus Unud Bukit Jimbaran Badung, Bali - 80364 Telepon (0361) 702772, Fax (0361) 701907 E-mai I : oernustakaanudavan [email protected] ahoo.co. i d Laman : www. e-lib. unud. ac. i d

SURAT KETERANGAN NO :0022/UN.14.I.2. 1/Perpus/0 0.09

12016

Yang bertanda tangan dibawah ini Kepala UPT Perpustakaan Universitas Udayana menerangkan bahwa:

Nama

: I Nyoman Sulabda

NIP.

:

195912311989031011

Fakultas/Program Studi

:

Kedokteran Hewan

Memang benar telah menyerahkan 1 eksemplar Karya Perpustakaan Universitas Udayana, dengan judul

Ilmiah

dan

I

keping CD di UPT

:

Lokus Mikrosatelit Gen Bbovine Leukosit Antigen (bola) Pada Sapi Demikian surat pernyataanini dibuat untuk dapat dipergunakan sebagaimana mestinya.

Bukit Jimbaran,03 Februari 2016 Universitas Udayana dan Pengolahan Koleksi

Astuti.

S.

l 20050 1200

-\

1

LOKUS MIKROSATELIT GEN BOVINE LEUKOSIT ANTIGEN (BoLA) PADA SAPI

Oleh : I NYOMAN SULABDA SISWANTO

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS UDAYANA 2016

1

KATA PENGANTAR

Puji syukur saya panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa, karena berkat rahmatNYa pembuatan paper ini dapat saya selesaikan dengan baik. Penulisan paper yang berjudul : Lokus Mikrosatelit Gen Bovine Leukosit Antigen (gen BoLA) Pada Sapi, bertujuan untuk mengetahui atau mengungkap pemanfaatan DNA mikrosatelit

gen BoLA sebagai marka perbaikan mutu genetik

pada sapi. Saya menyadari substansi dan tehnik penulisan paper ini masih sangat jauh dari sempurna, oleh karena itu kritik dan saran yang sifatnya kearah perbaikan sangat saya harapkan. Semoga paper ini bermanfaat bagi pembaca.

Penulis

i2

DAFTAR ISI KATA PENGANTAR ........................................................................

i

DAFTAR ISI ....................................................................................

ii

BAB I. PENDAHULUAN .............................................................

1

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ......................................................

3

2.1 Mikrosatelit ……………………………………..……….

3

2.2 Lokus Mikrosatelit Gen Bovine Leukosit Antigen (BOLA)

4

2.3 Penggunaan Marka Mikrosatelit Gen BoLA Sebagai Penanda Polimorfisme ...............................................................

5

BAB III. KESIMPULAN ..................................................................

10

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................

11

ii3

I.

PENDAHULUAN

Mayor histocompatability kompleks (MHC) atau Antigen histokompatibilitas mayor adalah antigen yang terdapat pada sel leukosit yang bersifat lebih imunogenik dibandingkan antigen lainnya. Antigen ini ditemukan pertama pada leukosit darah, oleh karenanya ditandai dengan huruf L (leukosit) yang didahului dengan jenis hewan dimana antigen tersebut ditemukan. MHC adalah salah satu faktor yang menentukan ketahanan individu terhadap penyakit. Disamping itu MHC menjadi sangat bermanfaat dalam memahami proses seleksi dengan pendekatan mikrosatelit dan dapat memberikan informasi penting tentang polimorfisme dan kekerabatan dalam populasi. MHC pada sapi disebut Bovine Leukosit Antigen (BoLA) (Rupp et al., 2007). BoLA merupakan glikoprotein, yang dibedakan atas tiga klas yaitu : klas I, klas II dan klas III, dan setiap klas mempunyai peranan yang berbeda-beda. Peranan keseluruhan antigen BoLA adalah menentukan kemampuan individu untuk membedakan self dan non-self, mengatur interaksi fungsi imunitas, sehingga disebut dengan immune response associated antigen. Sifat polimorphisme gen BoLA menyebabkan kemampuan setiap individu untuk bereaksi terhadap antigen berbeda-beda dan sangat spesifik pada setiap individu, seperti kerentanan sapi bali terhadap penyakit jembrana. Sekarang ini, mikrosatelit merupakan marka genetik yang menyediakan informasi mengenai keragaman alel pada lokus gen. Keragaman ini memungkinkan kita menganalisis dan mengevaluasi secara detail dan juga mendeteksi gen yang mempengaruhi sifat-sifat dari individu terutama dalam responnya terhadap antigen. Tujuan penulisn paper ini adalah untuk mendapatkan informasi dasar mengenai struktur genetik pada sapi menggunakan marka melokuler DNA mikrosatelit gen BoLA. 1

Informasi molekuler ini sangat bermanfaat selain mencerminkan keanekaragaman hayati breed sapi pada tingkat genetik dan juga menggambarkan hubungan struktur antar breed sapi dengan kerentanan atau ketahanannya terhadap penyakit.

2

II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Mikrosatelit Dalam memahami karakter genetik suatu bangsa ternak dan keunikan karakter genetic dalam suatu populasi dapat ditentukan dengan analisis molekuler khususnya mikrosatelit. Mikrosatelit sangat baik digunakan untuk identifikasi suatu bangsa karena mikrosatelit tidak dipengaruhi oleh lingkungan (Thilagam et al.,2006). Mikrosatelit atau dikenal juga dengan short tandem repeats adalah urutan nukleotida pendek secara berurutan dalam genom eukariota. Pemberian nama ini didasarkan pada kandungan nukleotida yang biasanya terdiri dari 1 sampai 5 pasang. Mikrosatelit mempunyai motif urutan sederhana dan panjangnya tidak lebih dari 6 (enam) pasang basa. Motif urutan terulang yang sering dijumpai pada genom eukariota adalah (dC-dA)n - (dC-dA)n (Missohou et al.,2006). Mikrosatelit ini telah diketahui sangat polimorfik pada suatu populasi, karena keragaman jumlah nukleotida yang terulang. Penyebarannya sangat acak di dalam genom sehingga menyebabkan mikrosatelit sangat berguna untuk pemetaan genom (Yang et al, 1999)

. Saat ini

mikrosatelit merupakan penanda genetik yang banyak dipilih untuk keperluan pemeriksaan molekuler. Beberapa pemeriksaan molekuler yang menggunakan mkrosatelit diantaranya untuk analisis struktur populasi (Arora et al.,2004), memperkirakan keragaman genetik dan inbreeding (Hedrick et al., 2001; Mateus et al., 2004), catatan silsilah (Talbot et al., 1996), dan identitas individu (Maudet et al., 2004). Mikrosatelit sangat cocok untuk analisis populasi karena berbagai alasan yaitu, (1) tersebar secara acak melalui gen dan umumnya merupakan noncoding region, (2) memperlihatkan tingkat mutasi yang tinggi, (3) menurun secara kodominant sehingga

3

sangat mudah dihitung secara langsung, dan (4) sangat efisien karena diperlukan jumlah template DNA yang sangat sedikit (Weber and Wong, 1993). 2.2 Lokus Mikrosatelit Gen Bovine Leukosit Antigen (BoLA) Polimorfisme Mayor Histocompatability Complex (MHC) menciri dengan terdapatnya sejumlah besar alel pada masing-masing lokus dan adanya perbedaan jumlah asam amino pada setiap alelnya. Variabilitas ini berkorelasi dengan keragaman reseptor sel T, yang memberikan kontribusi untuk perbedaan respon kekebalan dan resistensi terhadap penyakit disetiap individu (Sommer 2005). MHC pada sapi, dikenal dengan sebutan Bovine Leukosit Antigen (BoLA), terdiri dari gen-gen yang dikelompokkan menjadi 3 kelas yaitu kelas I, kelas II dan kelas III. Gen BoLADRB3, merupakan gen yang paling polimorfik yang terletak pada daerah kelas II, yang mana gen ini yang berhubungan dengan kejadian penyakit ( Kulberg et al. 2007) dan berhubungan dengan produktivitas ( Nascimento et al. 2006). MHC klas II telah pula diketahui berhubungan dengan ketahanan dan kepekaan sapi dengan penyakit Bovine leukaemia virus (Juliarena et al.,2008)

4

Gambar : Lokus Gen Mayor Histocompatibility Complex (MHC) pada manusia dan mencit.

2.3. Penggunaan Marka Mikrosatelit Gen BoLA Sebagai Penanda Polimorfisme Sampai saat ini, penggunaan marka mikrosatelit gen BoLA telah banyak dilakukan untuk mempelajari keragaman genetik suatu populai. Ammer et al. (1992) melaporkan bahwa polimorfisme ditemukan di daerah ekson maupun intron dari gen BoLA-DRB. Ellegren et al. (1993) juga menemukan adanya hubungan yang kuat antara urutan polimorfisme daerah ekson BoLA-DRB3.2 dan polimorfisme mikrosatelit berulang

sederhana

(simple reapet) di daerah intron 2 dari gen ini. Telah pula

dilaporkan bahwa adanya mikrosatelit polimorfik pada daerah intron 2 yakni pseudogene BoLA-DRB1 ( DRBP1) dan gen ini tidak berhubungan secara genetik dengan mikrosatelit BoLA-DRB3 ( DRB3)

( Gwakisa et al. 1994).

Dengan

menggunakan dua marka molekuler mikrosatelit BM1815 dan RM185, dilaporkan bahwa ada hubungan antara lokus mikrosatelit gen BoLA klas II dengan resistensi atau kerentanan terhadap infeksi caplak Boophilus microplus pada sapi (Acosta-Rodriguez et al., 2005).

5

Bastos-Silveira et al. (2008) melaporkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan pada keragaman alel pada lokus mikrosatelit region gen BoLA pada sapi di Portugal. Perbedaan ini dihubungkan dengan posisinya pada kromosom. Lebih lanjut dilaporkan dua belas jenis sapi asli Portugal digunakan untuk menyelidikan polimorfisme lokus mikrosatelit gen BoLA dan lokus mikrosatelit non-BoLA sebagai data tambahan untuk membandingkan variasi genetik /polimorfisme yang ditemukan di kedua gen tersebut. Lokus mikrosatelit non-BoLA adalah lokus mikrosatelit yang terletak di luar region gen BoLA, selanjutnya dinamakan lokus mikrosatelit non-BoLA. DNA genomik diekstraksi menggunakan Kit Puregene (Gentra Systems, Inc). Empat marka molekuler mikrosatelit dipetakan sepanjang segmen gen BoLA (BoLA mikrosatelit) yang terletak pada kromosom 23 (DRBP1, DRB3, BM1815 dan RM185) dan empat lainnya (non-BoLA) mikrosatelit

yang terletak pada kromosom 11

(ILSTS028), 18 (TGLA227), 21 (TGLA122) dan 26 (BM1314). Reaksi amplifikasi pada PCR dilakukan pada PCT 100 (MJ Research, Inc, Watertown, Mass,USA). Hasil amplifikasi dipisahkan dengan gel bis-Acrylamide 6% dan visualisasi dilakukan dengan pewarnaan perak. DNA typing dilakukan dengan mengukur jarak migrasi masing-masing pita DNA pada gel dibandingkan dengan pita-pita DNA standar 100 bp leader. Frekuensi alel, jumlah alel, Ho (observed heterozygosities), dan He (expected

heterozigosities)

dihitung

dengan

menggunakan

program

MICROSATELLITE TOOLKIT V.3.1 (Park, 2001). Pengujian penyimpangan dari kesetimbangan Hardy-Weinberg (HWE) dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak GENEPOP 3.4 (Raymond & Rousset 1995), dengan menerapkan exact test dari rantai metodologi Markov Monte Carlo (Guo & Thompson 1992).

6

Lebih lanjut diperoleh hasil bahwa lokus mikrosatelit gen BoLA-DRB3 yang paling polimorfik. Keberagaman serupa ditemukan di lokus BM1815, DRBP1 dan RM185 . Untuk semua ras sapi, didapatkan jumlah rata-rata alel dan nilai-nilai polimorfisme lebih tinggi lokus mikrosatelit gen BoLA daripada lokus mikrosatelit gen non-BoLA. Dilaporkan pula bahwa lokus BM1815 dan RM185 terletak pada sisi BoLA—DRB gen. RM185 berlokasi pada ujung 5’ hulu dan BM1815 berloksai pada ujung 3’ hilir. Kedua lokus ini menunjukkan keragaman yang rendah. Sedangkan lokus DRB3 dan DRBP1 berloksai di daerah intron gen BoLA-DRB3 dan gen DRB3 merupakan gen yang paling polimorfik diantara gen BoLA (Baxter et al.,2008). Sifat polimorfisme yang tinggi ini menimbulkan variasi ekpresi yang berbeda-beda pada setiap individu. Sebagai contoh, banteng liar memiliki agresivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan agresivitas ternak domestikasi, karena ternak domestikasi dibesarkan

di peternakan yang memberlakukan isolasi reproduksi dimana terjadi

reproduksi antar kerabat (Mateus et al. 2004). Hal ini yang mungkin dapat menjelaskan kenapa polimorfisme disetiap lokus berkurang. Hasil statistik menunjukkan perbedaan yang signifikan antara Hardy-Weinberg, heterozigoties yang diamati (Ho) dengan expected heterozigositas (He), yang mana terdeteksi kecenderungan nilai yang lebih rendah Ho dibandingkan He. Ini menunjukkan netralitas nyata dari mikrosatelit gen BoLA dalam penurunan sifat. Tren ini juga ditemukan oleh van Haeringen et al. (1999) ketika menganalisis mikrosatelit DRBP1 dan DRB3 pada 23 sapi keturunan dari Eropa Utara dan Afrika. Dari hasil analisis didapatkan bahwa secara statistik terdapat perbedaan yang signifikan antara heterozigotes yang diamati (Ho) lebih rendah dari heterozigosites yang diharapkan (He). Hal ini kemungkinan disebabkan karena dalam perkembangbiakannya

7

tidak terdapat adanya aliran gen. Juga dilaporkan terdeteksi adanya perbedaan pada tingkat variabilitas alel dalam setiap lokus mikrosatelit gen BoLA, dan perbedaan ini berkaitan dengan posisi fisik dalam kromosom. Lokus mikrosatelit BM1815 dan lokus RM185 mengapit lokus gen BoLA –DRB. Lokus ini menunjukkan variabilitas yang rendah. Hal ini yang mungkin menyebabkan nilai Ho lebih rendah dibandingkan He. Di sisi lain, lokus DRB3 dan DRBP1 masing-masing terletak di dalam intron, namun DRB3 lokus mikrosatelit yang paling polimorfik diantara gen BoLA, teridentifikasi dari sejumlah besar alel pada urutan ekson 2, sementara pada daerah intron 2 lokus mikrosatelit gen BoLA-DRB1 (DRBP1) adalah pseudogen tersembunyi (Russell et. al., 1997) Pola serupa dilaporkan oleh Huang and Yu (2003) tentang hubungan antara tingkat polimorfisme lokus mikrosatelit Mouse Histocompatibility Complex (MHC) dan hubungan posisi lokus dengan gen MHC pada mouse Asia Tenggara. Didapatkan hasil yang serupa, bahwa terdapat alel yang lebih tinggi pada lokus DRB3 dibandingkan dengan jumlah alel dari lokus DRBP1. Hal senada juga dilaporkan oleh AcostaRodriguez et al., (2005). Perbedaan variabilitas mencerminkan keberagaman dari masing-masing lokus polimorfis gen MHC. Meskipun banyak referensi yang menunjang seleksi yang diperankan oleh gen MHC (gen BoLA pada sapi), namun permasalahan muncul pada uji statistik bahwa masih ada pengaruh demografi.

Menurut Schlotterer (2004), skrining test dengan

melibatkan MHC dapat mengatasi efek ini. Seperti yang diharapkan bahwa polimorfisme lokus mikrosatelit MHC mempunyai variasi lebih tinggi dibandingkan non-MHC.

Schlotterer (2004) menyarankan pendekatan efek demografi terhadap

genom domestic populasi masih layak untuk mengurangi kesalahan dalam seleksi

8

karena sifat struktur dan pengelolaan populasi. Sebagian besar peneliti melaporkan tentang domestik populasi bertujuan untuk mengakses keanekaragaman genetik dari populasi tersebut. Oleh karena itu strategi sampling memungkinkan dalam pengambilan sampel yang lebih besar dari jenis individu yang sama dapat mengurangi efek subpopulasi. Di masa depan, analisis lokus mikrosatelit gen BoLA dan non-BoLA dapat membantu menguraikan seleksi dan efek demografi.

9

III. KESIMPULAN Pemetaan MHC berbasis mikrosatelit sangat bermanfaat di dalam proses seleksi dan dapat menyediakan informasi penting pada keragaman dalam suatu populasi. Keragaman MHC berkorelasi dengan kekebalan serta ketahanan terhadap penyakit. Mikrosatelit merupakan marka genetik yang menyediakan informasi mengenai keragaman alel pada lokus gen. Keragaman ini memungkinkan kita menganalisis dan mengevaluasi secara detail dan juga mendeteksi gen yang mempengaruhi sifatsifat

dari individu-individu

terutama

dalam

responnya

terhadap antigen.

Mikrosatelit telah diketahui sangat polimorfik pada suatu populasi, karena keragaman jumlah nukleotida yang terulang, penyebarannya sangat acak di dalam genom yang menyebabkan mikrosatelit sangat berguna untuk pemetaan genom. Sifat polimorfisme yang tinggi ini menimbulkan variasi ekpresi yang berbeda pada setiap individu. Lokus mikrosatelit gen MHC (yang pada sapi disebut gen BoLA/Bovine Leukosit Antigen) khususnya lokus DRB3 merupakan gen yang paling polimorfik diantara gen BoLA. Beberapa marka

molekuler mikrosatelit

dipetakan sepanjang segmen gen BoLA yang terletak pada kromosom 23 untuk mengetahui variabilitas genetik/polimorfisme yang ditunjukkan oleh jumlah dan ukuran alel yang terdapat pada masing-masing lokus.

Pada semua ras sapi,

didapatkan jumlah rata-rata alel dan nilai-nilai polimorfisme lebih tinggi lokus mikrosatelit gen BoLA daripada lokus mikrosatelit gen non-BoLA.

Saat ini

mikrosatelit merupakan penanda genetik yang banyak dipilih untuk keperluan pemeriksaan molekuler.

10

DAFTAR PUSTAKA Acosta-Rodriguez R., Alonso-Morales R., Balladares S., Flores-Aguilar H., GarciaVazquez Z. & Gorodezky C. 2005 Analysis of BoLA class II microsatellites in cattle infested with Boophilus microplus ticks: class II is probably associated with susceptibility. Veterinary Parasitology 127, 313–21 Ammer H., Schwaiger F.W., Kammerbauer C., Gomolka M., Arriens A., Lazary S. & Epplen J.T. (1992) Exonic polymorphism vs intronic simple repeat hypervariability in Mhc-Drb genes. Immunogenetics 35, 332–40. Arora, R.; and Bhatia, S.; 2004. Genetic structure of Muzzafarnagri sheep based on microsatellite analysis. Small Rum. Res. 54: 227-230. Bastos-Silveira C, Luís C , Ginja C, Gama LT and Oom MM, Genetic variation in BoLA microsatellite loci in Portuguese cattle breeds. Animal Genetic 40: 101-105. Baxter R, Hastings N, Law A and Glass EJ. 2008. A rapid and robust sequence-based genotyping method for BoLA-DRB3 alleles in large numbers of heterozygous cattle. Animal Genetic 39: 561-563. Ellegren H., Davies C.J. & Andersson L. (1993) Strong association between polymorphisms in an intronic microsatellite and in the coding sequence of the BoLA-DRB3 gene – implications microsatellite stability and PCR-based DRB3 typing. Animal Genetics 24, 269–75 Guo S.W. & Thompson E.A. (1992) Performing the exact test of Hardy–Weinberg proportions for multiple alleles. Biometrics 48, 361–72. Gwakisa P., Mikko S. & Andersson L. (1994) Close genetic-linkage between DRBP1 and CYP21 in the MHC of cattle. Mammalian Genome 5, 731–4 Hedrick, P.W.; Parker, K.M. and Lee, R.N. 2001. Using microsatellite and MHC variation to identify species, ESUs, and MUs in the endangered Sonoran topminnow. Mol.Ecol. 10:1399-1412. Huang S.W. & Yu H.T. (2003) Genetic variation of microsatellite loci in the major histocompatibility complex (MHC) region in the southeast Asian house mouse (Mus musculus castaneus). Genetica 119, 201–18. Juliarena MA, Poli M , Sala L, Ceriani C, Gutierrez S, Dolcini G, Rodríguez EM, Mariño B, Rodríguez-Dubra C and Esteban EN,2008. Association of BLV infection profiles with alleles of the BoLA-DRB3.2 gene. Animal Genetic 39: 432 – 438 Kulberg S., Heringstad B., Guttersrud O.A. & Olsaker I. 2007. Study on the association of BoLA-DRB3.2 alleles with clinical mastitis in Norwegian Red cows. Journal of Animal Breeding and Genetics 124, 201–7.

11

Missohou, A., E. Talaki and I. Maman Laminou. 2006. Diversity and genetic relationships among seven west African goat breeds. Asian-Aust. J. Anim. Sci. 19:1245-1251. Mateus, J.C.; Penedo, M.C.; Alves, V.C.; Ramos, M. and Rangel-Figueiredo, T. 2004).Genetic diversity and differentiation in Portuguese cattle breeds using microsatellites.Anim. Genet. 35:106-113. Maudet, C.; Beja-pereira, A.; Zeyl, E.; Nagash, H.; Kence, A.; Ozüt, D.; Biju-duval, S.; Boolormaa, S.; Coltman, D. W.; Taberlet, P. and Luikart, G. 2004. A standard set of polymorphic microsatellites for threatened mountain ungulates (Caprini, Artiodactyla). Molecular Ecology Notes 4: 49–55 Nascimento C.S., Machado M.A., Martinez M.L. et al. (2006) Association of the bovine major histocompatibility complex (BoLA) BoLA-DRB3 gene with fat and protein production and somatic cell score in Brazilian Gyr dairy cattle (Bos indicus). Genetics and Molecular Biology 29, 641–7. Park S.D.E. (2001) Trypanotolerance in West African Cattle and the Population Genetic Effects of Selection. PhD thesis, University of Dublin, Dublin. Raymond M. & Rousset F. (1995) GENEPOP (version 1.2): population genetics software for exact tests and ecumenicism. Journal of Heredity 86, 248–9. Rupp R.; Hernandez A. and B. A. Mallard B.A., (2007) Association of Bovine Leukocyte Antigen (BoLA) DRB3.2 with Immune Response, Mastitis, and Production and Type Traits in Canadian Holsteins. J. Dairy Sci. 90:1029-1038 Russell G.C., Davies C.J., Andersson L., Ellis S.A., Hensen E.J., Lewin H.A., Mikko S., Muggli-Cockett N.E. & van der Poel J.J. (1997) BoLA class II nucleotide sequences. Animal Genetics 28, 169–80. Schlotterer C. (2004) The evolution of molecular markers: just a matter of fashion? Nature Reviews Genetics 5, 63–9. Sommer S. 2005 The importance of immune gene variability (MHC) in evolutionary ecology and conservation. Frontiers in Zoology 2, 1 Talbot, J.; Haigh, J.; Plante, Y. 1996. A parentage evaluation test in North American Elk (Wapiti) using microsatellites of ovine and bovine origin. Anim. Genet. 27:117-119. Thilgam, K.; Ramamoorthi, J.; Sivasalevam, S. N.; Karthickiyan, S. M. K. and Thangaraja, P.2006. Kannaiadu goat of Tamil Nadu India: Genetic characterization through microsatellite. L. Res. Rural Devt. 8: 44-49.

Van Haeringen W.A., Gwakisa P.S., Mikko S., Eythorsdottir E., Helm L.E., Olsaker I., Outteridge P. & Andersson L. (1999) Heterozygosity excess at the cattle DRB

12

locus revealed by large scale genotyping of two closely linked microsatellites. Animal Genetics 30, 169–76. Weber, J.L. and Wong, C. 1993. Mutation of human short tandem repeats. Hum. Mol.Genet. 2: 1123-1128. Yang L, Zhao SH, Li K, Peng ZZ, Montgomery GW. (1999). Determination of genetic relationships among five indigenous Chinese goat breeds with six microsatellite markers. Anim. Genet. 30, 452-455.

13

i

14