Základy biochemie KBC / BCH
Fotosyntéza Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu CZ.04.1.03/3.2.15.3/0407
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Osnova • Úvod • Chloroplasty • Světlo absorbující pigmenty • Světelná reakce • Calvinův - Bensonův cyklus (RUBISCO) • Fotorespirace • Rostliny C4 a CAM
Fotosyntéza - úvod • Fotosyntéza fixuje ročně asi 1011 tun uhlíku, což reprezentuje 1018 kJ energie. • Fotosyntéza u rostlin je dvoustupňový proces při kterém se světelná energie využívá k oxidaci H2O: 2 H2O → O2 + 4 [ H·] • Současně získané elektrony se využívají k redukci CO2: 4 [ H·] + CO2 → (CH2O) + H2O • Dva stupně fostosyntézy se tradičně uvádí jako světelná fáze a temnostní fáze. • Místem fotosyntézy u eukaryot (vyšší rostliny a řasy) jsou chloroplasty. Buňky obsahují 1 až 1000 chloroplastů tvaru elipsoidu o rozměrech asi 5 μm délky.
Chloroplast kukuřice
Vnější membrána Lamela Vnitřní membrána Mezimembránový prostor Grana Stroma
Prostor thylakoidu
Fotosyntetizující kyanobakterie Anabaena (zvětšení 450 x). Předkové se evolučně přetvořili na současné chloroplasty.
Světlo absorbující pigmenty • • • • • • •
Chlorofyl - cyklický tetrapyrrol s centrálním atomem Mg2+. Prekurzorem je stejně jako u hemu protoporfyrin IX. Hlavní formy chlorofylu u rostlin a cyanobakterií jsou: Chlorofyl a (Chl a) a chlorofyl b (Chl b), u fotosyntetizujících bakterií jsou to bakteriochlorofyl a (BChl a) a bakteriochlorofyl b (BChl b). Chlorofyly jako vysoce konjugované sloučeniny silně absorbují viditelné světlo. Malé rozdíly v chemické struktuře silně ovlivňují jejich spektra. Fotosystémy I a II jsou lokalizovány v thylakoidní membráně chloroplastů. Fotosystém I (PS 700) je transmembránový multipodjednotkový komplex (10), absorbuje světlo kratší vlnové délky než 700 nm. Vytváří NADPH. Fotosystém II (PS 680), transmembránový komplex 20 podjednotek, přenos elektronů z vody na plastochinon (plastochinol). Absorbuje světlo vlnových délek kratších než 680 nm. Cytochrom bf (obdoba komplexu III mitochondrií !!!). Cytochrom bf generuje protonový gradient přes thylakoidní membránu což vede ke tvorbě ATP.
Struktury chlorofylů
CH2
R1
H3C
R2 3
I
N
N +
IV
H3C
CH
Mg
R3
II 4
+
H3C
N
III
CH3
CH
CH2
CH
O
CH2
CH2
CH3
COO
R4
O
CH2
Bakteriochlorofyl a
CH3
CH3
Bakteriochlorofyl b
C
CH3
CH3
a
a a
COO
-
R4 CH3
P P=
C O
O
-
(Fe-protoporfyrin IX)
R3
H
CH3
O
C
C
N
CH2
O
CH2
2+
Fe
CH2
C
O
Chlorofyl b
CH2
V
CH2 O
CH3
+
H3C
Chlorofyl
Chlorofyl a
N
N +
N
N
R2
CH
2+
CH2
R1
CH3
CH2
CH3
CH2
CH3
CH
CH3
a
H2C
P P nebo G
a
značí, že mezi C3 a C4 se nevyskytuje dvojná vazba.
P
Fytylový postranní řetězec G=
H2C
Geranylový postranní řetězec
Absorpční spektra různých fotosyntetických pigmentů.
Sluneční spektrum
Chlorofyl b Chlorofyl a Absorbance
Karotenoidy Fykoerythrin
Fykocyanin
400
500 Vlnová délka (nm)
600
700
Světlosběrné komplexy • Světlosběrné komplexy obsahují fotosyntetická reakční centra – místa kde se odehrává primární reakce světelné fáze fotosyntézy a anténní komplex obsahující další chlorofyly a přídavné pigmenty jako jsou karotenoidy, např. β-karoten.
H3C
CH3
CH3
CH3
H3C
CH3
CH3
β-Karoten
CH3
H3C
CH3
Fotosyntetický anténní komplex. Zachycené fotony náhodně migrují anténním komplexem až vstoupí do reakčního centra (tmavě zelené). Foton
Foton
Foton
Foton
Možnosti uvolnění excitační energie excitovaných molekul
• Elektrony excitovaná molekula může uvolnit excitační energii několika způsoby: • a) Vnitřní konverze – na kinetickou energii, pohyb molekul, teplo. U molekul chlorofylu k těmto stavům nedochází. • b) Fluorescence, je emitován foton o vyšší vlnové délce (nižší energie). U rostlin jen asi 3 až 6 % absorbované světelné energie. • c) Excitační transfer, excitovaná molekula přenáší excitační energii na sousední molekuly chlorofylu s nižším excitační energií než anténní chlorofyly. • d) Fotooxidace, světlem excitovaná donorová molekula je oxidována přenosem elektronu na akceptorovou molekulu. Takovým donorem je excitovaný chlorofyl. Fotooxidovaný chlorofyl, kationtový radikál, se vrací do původního stavu oxidací jiné molekuly.
Excitační stavy chlorofylu a jejich převod.
•
•
Fotosyntéza je proces při kterém elektrony z excitovaného chlorofylu prochází řadou akceptorů, které převádí energii elektronů na chemickou energii. Klikaté šipky reprezentují absorpci fotonů nebo jejich emisi ve formě fluorescence. Excitační energie může být také proměněna v produkci tepla a chemické reakce.
Druhý excitovaný stav
ENERGIE
•
Vnitřní konverze (nezářivá produkce tepla)
Absorbce
Absorbce
světla
světla
hν modrého hν červeného hν
První excitovaný stav
Fotooxidace (chemické reakce)
Základní stav
Reakční centrum • Jakmile některá z molekul „antény“ pohltí foton, je energie předávána z jedné molekuly barviva na druhou, až dosáhne jedné určité molekuly chlorofylu a. Na této molekule není zvláštní molekulární stavba, ale její postavení. Pouze tato molekula chlorofylu a je totiž umístěna v oblasti fotosystému nazývané reakční centrum. • Zde probíhá fotoindukované oddělení nábojů. • Světlo vybudí elektron na vyšší energetickou hladinu a tento elektron je příjemcem zachycen ještě dříve , než se stačí vrátit do svého základního stavu v molekule chlorofylu. • Elektrony extrahované z počáteční sloučeniny jsou excitované a představují redukční sílu – mohou redukovat další sloučeniny a skladovat tak světelnou energii ve formě chemických sloučenin.
Struktura fostosystému II. D1 a D2 podjednotky (32kd) navázány dva chlorofyly (speciální)-přenos elektronů na feofytin poté na plastochinony. Centrum Mn –fotolýza vody. D2
D1
Stroma
Dutina thylakoidu Specifický pár chlorofylů
Manganové centrum
Struktura fotosystému I. Dvě podjednotky psaA a psaB (červeně a modře), chlorofyly včetně speciálního páru, klastry Fe-S. Fotoindukované oddělení nábojů.
4Fe-4S klastry Stroma
Dutina thylakoidu
Specifický pár chlorofylů Pohled shora
Dva fotosystémy. NADP+ SVĚTLO (λ<680 nm)
+
NADPH
SVĚTLO (λ<700 nm)
PS II
PS I
eH 2O
CYTOCHROM O2
b6f
Fotolýza vody – tvorba kyslíku • Součástí PS II (P680, fotosystém II) je centrum uvolňující kyslík (oxygen evolving center-OEC). • V tomto komplexním útvaru dochází působením světelných kvant (fotonů) k rozkladu molekul vody na kyslík, čtyři protony a čtyři elektrony. 2 H2O → O2 + 4 H+ + 4 e• Elektrony uvolněné z vody vstupují do PSII, kde jsou světelnými kvanty uvedeny excitací do vyšších energetických hladin označený P680* a posléze putují řetězcem přes QH2.
Pravděpodobné schéma uvolnění kyslíku v Mn centru. Hlavní roli hrají 4 ionty Mn v různém oxidačním stavu a jeden Ca2+. S0 až S4 – vždy jednoelektronová oxidace.
H +
O
H
-
Cl
+
e, H
+
+
+
H O
Ca
H
S0 H H 2+
Mn
O
O
O
H
3+
Mn O
O
4+
Mn
O O
O 4+
Mn
H O
Ca
+
S1
Cl
+
+
H 3+
Mn
O
O
3+
Mn O
O
4+
Mn
O O
O 4+
Mn
Pravděpodobné schéma uvolnění kyslíku v Mn centru.
H O
+
H
-
e
+
Cl
+
+
H O
Ca
H
S1 H 3+
Mn
O
O
H
3+
Mn O
O
4+
Mn
O O
O 4+
Mn
H O
Ca O
S2
Cl
+
+
H 3+
Mn
O
O
4+
Mn O
O
4+
Mn
O O
O 4+
Mn
Pravděpodobné schéma uvolnění kyslíku v Mn centru.
H O
+
H
-
Cl
+
e, H
+
+
+
H O
Ca
H
S2 H 3+
Mn
O
O
H
4+
Mn O
O Mn
O O
4+
O 4+
Mn
H O
Ca O
S3
Cl
+
4+
Mn
O
O
4+
Mn O
O
4+
Mn
O O
O 4+
Mn
Pravděpodobné schéma uvolnění kyslíku v Mn centru.
H O
H
H
S3
+
-
H
e, H
O
Ca Cl
+
+
O
H O
Ca 4+
Mn
O
O
4+
Mn O
O Mn
O O
4+
O 4+
Mn
S4
Cl
+
5+
Mn
O
O
+
4+
Mn O
O
4+
Mn
O O
O 4+
Mn
Pravděpodobné schéma uvolnění kyslíku v Mn centru.
H O
+
S4
H
S4 H+
O
Ca Cl
+
5+
Mn
O
O
O H O
Ca
+
4+
Mn O
O
4+
Mn
O O
O 4+
Mn
Cl
+
5+
Mn
O
O
+
4+
Mn O
O
4+
Mn
O O
O 4+
Mn
Pravděpodobné schéma uvolnění kyslíku v Mn centru. K uvolnění O2 je nutná oxidace 2 H20.
H
S4
+
2 H20
O H O
Ca Cl
+
5+
Mn
O
O
02
O
H
4+
Mn O
O
4+
Mn
O O
O 4+
Mn
H O
Ca
+
S0
Cl
+
+
H H 2+
Mn
O
O
+
3+
Mn O
O
4+
Mn
O O
O 4+
Mn
Plastochinon (Q) – plastochinol (QH2) O H3C
H
H3C
CH2
CH3
O
CH
C
CH2
H n
CH2
H n
Plastochinon 2[H ]
OH H3C
H
H3C
CH2
CH3
OH
CH
Plastochinol
C
Z-schéma světelné fáze fotosyntézy •
Elektrony mohou dosáhnout na ferredoxin-NADP+ reduktasu (FNR), která katalyzuje redukci NADP+.
•
Oxidace vody a tok elektronů přes Q cyklus generuje transmembránový protonový gradient s vyšší koncentrací protonů na straně thylakoidní dutiny (lumen - uvnitř). Energie gradientu se uplatňuje při tvorbě ATP.
•
Různé prosthetické skupiny fotosyntetického aparátu rostlin mohou být seřazeny podle redukčního potenciálu v diagramu zvaném Z-schéma.
•
Elektrony uvolněné z P680 po absorpci fotonů jsou nahrazovány elektrony z fotolýzy vody. Každý elektron prochází řetězcem přenašečů do hotovosti plastochinonových molekul. Vytvořený redukovaný plastochinol redukuje cytochrom b6f komplex, za současného transportu protonů do thylakoidů. Cytochrom b6f přenáší elektrony na plastocyanin (PC) a ten regeneruje fotooxidovaný P700 v PSI. Elektrony emitované z PSI redukují přes řetězec přenašečů NADP+ na NADPH. Necyklický proces. V cyklickém procesu se elektrony vrací zpět na cytochrom b6f a přitom se přenášejí další protony do thylakoidu.
PSI
Diagram Z-schéma P700*
-1.4
A
0
A
1
F
-1.2
F
-1.0 -0.8
P680*
-0.6
hν +
A
Q
B
Δξ°´(V) 0
hν
+0.2
+0.8 +1.0 +1.2
8 H (stroma)
cyt b
6
QPOOL
Q +
8 H (thylakoid)
+0.4
eO2 + 4 H+ (thylakoid)
0
4
PC 6
S S
[4Fe-4S] cyt f
Cytochrom b f
Manganový 2 H2O komplex
Z
P680
B
2 NADP+ + 2 H+
e-
Cyklická cesta
-0.4
Q
Necyklická cesta
Fd
Chl a Pheo a
-0.2
A
F
PSII
+0.6
X
P700
FNR (stroma) 2 NADPH
Cytochrom b6f komplex a plastocyanin (PC) • Cytochrom b6f komplex je integrální membránový proteinový komplex obsahující řadu složek analogicky jako např. mitochondriální komplex III a cytochrom bc1. Elektrony z cytochrom b6f komplexu putují Q cyklem. Při transportu jednoho elektronu se translokují dva protony do thylakoidu. Tedy čtyři elektrony z 2 H2O vedou k translokaci 8 protonů. • Plastocyanin (PC) – periferní membránový protein (99 aminokyselin) - člen skupiny modrých měďnatých proteinů lokalizovaný na vnitřní straně thylakoidů. Oxidační stavy redoxních center cyklují mezi Cu2+ a Cu+ stavy.
Lokalizace systémů PSII, PSI, cytochromu b6f a ATP-synthasy na thylakoidech
Volná membrána (stromatální lamela)
Převrstvená membrána (granum)
Fotosystém PSI
ATP-synthasa
Fotosystém PSII
Cytochrom b f 6
Lokalizace systémů PSII, PSI, cytochromu b6f a ATP-synthasy
• PSI se nachází na neuzavřených stromatálních lamelách v dotyku se stromatem, kde je k dosažení NADP+. • PSII je lokalizován většinou mezi uzavřenými složenými grany, mimo přímý kontakt se stromatem. • Cytochrom b6f je rovnoměrně distribuován v celé membráně. • ATPasa je lokalizována na vnější straně membrány.
Směr protonového gradientu fotosystému II
Stroma
4 H+
(vysoké pH)
2 Q2 2 H2O
2 QH2 O2 + 4 H
Lumen thylakoidu
+
(nízké pH)
Cytochrom bf
V každém Q cyklu jsou přes cytochrom bf transportovány 4 protony.
1. čás: QH2 + 2 Pc(Cu2+) = Q + 2 Pc (Cu+) + 2 H+ (v thylakoidu) 2. část: Cyt.bf (redukuje) + Q (z poolu) = QH2 (protony ze stromatu). Po reoxidaci QH2 se protony uvolní do thylakoidu.
2 H+
QH2 2 Pcox
Q2
4 H+
2 Pcred
Jagedorfův pokus. Syntéza ATP jako důsledek pH gradientu
Membrána thylakoidu ATP ADP + Pi pH 4
pH 7 pH 4
H+
pH 8
Náhlá změna externího pH po přídavku ADP a Pi
Inkubace po dobu několika hodin pH 4 pH 4
Srovnání světelné fáze fotosyntézy a oxidativní fosforylace NADP+
FOTOSYNTÉZA
H+
QH2
2 H2O
O2
ADP + Pi
H+
H+
Q2
NADPH ATP + H2O
Q2
Pcox
Pcox
Pcred
H+
OXIDATIVNÍ FOSFORYLACE Cyt cox
Q2
Cyt cred
QH2
H+
H+
Q2
NAD+
NADH
Cyt cox
2 H2O
O2 H+
H+
SVĚTLO
ADP (λ<700 ATPnm) + Pi + H2 O
Fotosystém I využívá světelnou energii ke tvorbě redukovaného ferredoxinu – silného redukčního činidla (obsahuje 2Fe-2S). Elektrony jsou přenášeny na ferredoxin-NADP reduktasu.
Tok elektronů fotosystémem I na ferredoxin. Pozitivní náboj P700 se doplňuje z plastocyaninu. Ferredoxin
4Fe-4S
Chinon (A1) Chlorofyl (A0) P700
Plastocyanin
Dráha elektronů z vody na NADP+ při fotosyntéze. FOTOSYSTÉM II
FOTOSYSTÉM I P700* A
REDUKČNÍ POTENCIÁL (V)
-1.0
A
P680*
0
Fd
Foton 2 A
Q
B
PC P700
H 2O +1.0
Manganový komplex
P680
Fd-NADP+ reduktasa
NADPH Cytochrom b6f
Foton 1
1
4Fe-4S
Ph Q
0
Struktura ferredoxin-NADP+reduktasy Flavin
Vazebné místo NADP+ Ferredoxin
Ferredoxin NADP+reduktasa - mechanismus +
H + Fdred
FAD
+
H + Fdred
Fdox
FADH2
FADH Semichinonová forma
NADPH + H
+
Fdox
+
NADP
Energetický výtěžek světelné fáze fotosyntézy • • • • • • • • •
Absorpce 4 fotonů PSII generuje 1 molekulu O2 a uvolní se 4 protony do dutiny thylakoidu. Dvě molekuly plastochinolu jsou oxidovány komplexem bf za uvolnění 8 protonů do dutiny thylakoidu. Elektrony ze 4 molekul redukovaného plastocyaninu jsou za účasti dalších 4 absorbovaných fotonů předány na ferredoxin. Čtyři molekuly redukovaného ferredoxinu generují 2 molekuly NADPH. Celková reakce tvorby NADPH: 2 H2O + 12 NADP+ + 10 H+stroma = O2 + 12 NADPH + 12 H+thylakoid Dvanáct protonů v thylakoidu vstupuje do ATPsynthasy. Tvoří se celkem 3 molekuly ATP. Celková reakce fotofosforylace: 2 NADP+ + 3 ADP + 3 Pi + H+ = O2 + 2 NADPH + 3 ATP + H2O
Cyklická fotofosforylace. • Cyklická fotofosforylace je alternativní drahou fotosyntézy. • Elektrony redukovaného ferredoxinu mohou být převedeny na cytochrom bf komplex namísto na NADP+. • Elektrony prochází zpět bf komplexem, redukují plastocyanin, který je posléze reoxidován P700+. Cyklus se uzavírá. • Výsledkem je pumpování protonů komplexem bf. Vzniklý protonový gradient pohání syntézu ATP. • Tvoří se jen ATP a ne NADPH ! Proces je aktivní za situace, kdy je nadbytek NADPH. • Cyklická fotofosforylace je produktivnější ve smyslu zisku ATP než necyklická. Dva absorbované fotony poskytují 1 molekulu ATP • Na procesu se nepodílí fotosystém II, netvoří se kyslík fotolýzou vody.
Temnostní fáze fotosyntézy Calvin – Bensonův cyklus. • • • • •
•
Metabolická dráha ve které rostliny inkorporují CO2 a tvoří sacharidy byla objasněna mezi léty 1946 až 1953 M. Calvinem a A. Bensonem. Pracovali s buňkami řas a zkoumali produkty vstupu značeného 14CO2. Analýzou buněk řas po 5 s po expozici značeným 14CO2 zjistili, že jediným produktem je 3-fosfoglycerát (3PG) s označeným karboxylem. Dále zjistili, že akceptorem CO2 je pentosa – ribulosa-1,5-bisfosfát a enzymem podílejícím se na reakci je ribulosa-1,5-bisfosfátkarboxylasa (RUBISCO). Calvin-Bensonův cyklus probíhá ve stromatu chloroplastů a lze ho rozdělit na dvě části: Produkční – ve které tři molekuly ribulosa-5-fosfátu přes ribulosa-1,5bisfosfát reagují se třemi molekulami CO2 za tvorby šesti molekul glyceraldehyd-3-fosfátu (GAP) za spotřeby 9 molekul ATP a 6 molekul NADPH. Cyklický charakter procesu činí dráhu ekvivalentní tvorbě jedné molekuly GAP ze tří molekul CO2. GAP se může využít k biosyntéze. Regenerační – ve které uhlíkové atomy zbylých pěti GAP jsou přeměněny v procesu podobném pentosafosfátové dráze na tři ribulosa5-fosfáty, které proces zahajovaly.
Fosforylce tří ribulosa-5-fosfátů, vstup tří CO2-karboxylace (RUBISCO), tvorba šesti 3-fosfoglycerátů a šesti 1,3 bisfosfoglycerátů. 2-
CH2 OPO 3 2-
ATP
CH2 OPO 3
ADP
H
Fosforibulosakinasa
H
C
O
C
OH
C
CO2
Ribulosabisfosfát karboxylasa RUBISCO
OH
CH2 OH
CH2 OH
C
O
C
O
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
Ribulosa-5-fosfát (Ru-5-P)
-
O H
C
+ C C
ATP O O OH
3-Fosfoglycerát (3-PG)
2-
CH2 OPO 3
Ribulosa-5-fosfát (Ru-5-P)
ADP
-
2CH2 OPO 3
Ribulosa-1,5-bisfosfát (Ru-1,5-BP)
2-
C
O
2CH OPO 3 CH 42
CH2 OPO 3
O
Fosfoglycerátkinasa
O H
2-
C C
OPO 3 OH
2-
CH2 OPO3
1,3-Bisfosfoglycerát (1,3-BPG)
Redukce šesti 1,3-bisfosfoglycerátů na glyceraldehyd-3-fosfát a start NADP + H NADPH regenerační fáze. +
+
2-
O
C
H
OPO 3
C
C HO
H
OH 2-
CH2 OPO3
C
Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa
1,3-Bisfosfoglycerát (1,3-BPG)
OH 2-
CH2 OPO 3
Glyceraldehyd-3-fosfát (GAP)
Triosafosfátisomerasa 2-
CH2 OPO 3
PRODUKTY
C
C HO
O
CH2OH
Dihydroxyacetonfosfát (DHAP) Aldolasa
H
C
OH
H
C
OH 2-
CH2 OPO 3
Erythrosa-4-fosfát (E-4-P) 2-
CH2 OPO 3
Aldolasa
C
O
HO
C
H
CH2 OPO 3
H
C
OH
C
O
H
C
OH
HO
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
2CH2 OPO 3
Fruktosa-1,6-bisfosfát (F-1,6-BP)
2-
2-
CH2 OPO 3
Sedoheptulosa-1,7-bisfosfát (S-1,7-BP)
Pokračování regenerační fáze 2-
CH2 OPO3 C
O
HO
C
H
CH2 OPO 3
H
C
OH
C
O
H
C
OH
HO
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
2-
2CH2 OPO3
C HO HO
C
Fruktosa-1,6-bisfosfát (F-1,6-BP)
CH2 OH C
H
O
H
C
OH
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
2-
CH2 OPO3
Ribosa-5-fosfát (R-5-P)
Fruktosabisfosfatasa
CH2 OH 2-
Sedoheptulosa-1,7-bisfosfát (S-1,7-BP) Sedoheptulosabisfosfatasa
C
O
HO
C
H
H
C
OH
CH2 OH
H
C
OH
C
O
HO
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
CH2 OPO3
Xylulosa-5-fosfát (Xu-5-P)
2-
CH2 OPO 3
Pi
2CH2 OPO3
Fruktosa-6-fosfát (F-6-P) Transketolasa
Pi
2-
CH2 OPO 3
Sedoheptulosa-7-fosfát (S-7-P) Transketolasa
Závěr regenerační fáze - tvorba ribulosa-1,5-bisfosfátu. C HO
CH2 OH
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
C
O
HO
C
H
H
C
OH
2CH2 OPO 3
Ribosa-5-fosfát (R-5-P) Ribosafosfátisomerasa
2-
CH2 OPO 3
Xylulosa-5-fosfát (Xu-5-P)
Fosfopentosaepimerasa
CH2 OH HO
C
H
H
C
H
C
CH2 OH HO
C
H
OH
H
C
OH
OH
H
C
OH
2CH2 OPO 3
Ribulosa-5-fosfát (Ru-5-P)
2-
CH2 OPO 3
Ribulosa-5-fosfát (Ru-5-P)
2-
ATP
CH2 OPO 3
ADP
Fosforibulokinasa
C
O
H
C
OH
H
C
OH 2-
CH2 OPO 3
Ribulosa-1,5-bisfosfát (Ru-1,5-BP)
Jednotlivé reakce Calvin – Bensonova cyklu •
Osm, z celkového počtu jedenácti reakcí Calvin-Bensonova cyklu, je zvratem glykolýzy nebo reakcí glukoneogeneze známé z biochemie živočichů.
•
Jediné tři reakce z jedenácti jsou katalyzovány enzymy, které se v živočišné říši nevyskytují:
•
Fosforibulosakinasa ribulosa-5-fosfátu.
•
Ribulosabisfosfátkarboxylasa katalyzující vstup CO2 do sacharidu.
•
Sedoheptulosabisfosfatasa (SBPasa) katalyzující odštěpení fosfátu ze sedoheptulosa-1,7-bisfosfátu na sedoheptulosa-7-fosfát.
katalyzující
tvorbu
ribulosa-1,5-bisfosfátu
z
Ribulosabisfosfátkarboxylasa (RuBP karboxylasa) •
RuBP karboxylasa je nejdůležitější enzym na Zemi. Vyznačuje se nízkou aktivitou (kcat = 3 s-1), ale jeho obsah v zeleném listu přesahuje 50 % všech proteinů. Je tedy i nejrozšířenějším proteinem biosféry.
•
RuBP karboxylasa z vyšších rostlin a většiny fotosyntetických mikroorganismů je složeno z osmi velkých podjednotek kódovaných chloroplastovou DNA (L je složena ze 477 aminokyselin) a osmi malých podjednotek (S složených z 123 aminokyselin) kódovaných jadernou DNA.
•
K aktivitě RuBP karboxylasa je nutný Mg2+ vázaný na katalyticky významnou karbamátovou skupinu (-NH-COO-), která se vytváří reakcí nesubstrátového CO2 s ε-aminoskupinou Lys 201.
•
Reakci in vivo katalyzuje RuBP karboxylasaaktivasa s účastí ATP.
Mechanismus katalýzy ribulosabisfosfátkarboxylasy
Reakce je silně exergonní (Δ Go´= - 35, 1 kJ.mol-1), dáno štěpením 2-oxokyseliny na dva stabilní 3-fosfoglyceráty. 2-
2-
CH2 OPO3
ENZYM
B
O
C
H
C
OH
H
C
OH
CH2 OPO3 O
-
2-
2-
CH2 OPO 3
C
C
H
O
C
O
C
OH
H
HO
O H
2-
CH2 OPO3
COO
C
O
C
OH 2-
CH2 OPO3
Ribulosa-1,5-bisfosfát
-
C
CH2 OPO 3
Endiolátová forma
2-Oxokyselina H
O H
2-
CH2 OPO 3 HO
C
-
COO
CH2 OPO 3
CH2 OPO 3 HO
H
3-Fosfoglycerát
2-
2-
H+
O H
C -
+ C C
-
COO
O
H+
-
HO
C
COO
HO
C
O
H
C
OH
-
2-
CH2 OPO 3
OH 2-
CH2 OPO3
3-Fosfoglycerát
Hydratovaný meziprodukt
Biosyntéza sacharidů •
Celková stechiometrie Calvin-Bensonova cyklu (GAP = glyceraldehyd-3-fosfát) 3 CO2 + 9 ATP + 6 NADPH → GAP + 9 ADP + 8 Pi + 6 NADP+
•
Vytvořený GAP může být využit k řadě biosyntéz, buď vně nebo uvnitř chloroplastu. Může být převeden na fruktosa-6-fosfát dalším postupem cyklu a poté na glukosa-1-fosfát (G1P) (fosfoglukosaisomerasa a fosfoglukosamutasa).
•
G1P je prekurzor všech dalších sacharidů rostlin.
•
Hlavní složka škrobu, α-amylosa, je syntetizována ve stromatu chloroplastu jako dočasná skladovatelná forma glukosy.
•
α-Amylosa je také syntetizována jako dlouhodobá skladovatelná forma v jiných částech rostlin jako jsou listy, semena a kořeny.
•
Celulosa tvořena dlouhými řetězci β(1→ 4)-vázanými glukosovými jednotkami je hlavním polysacharidem rostlin. Je syntetizována z UDP-glukos v rostlinné plasmové membráně a vylučována do extracelulárního prostoru.
Syntéza škrobu. Celkově je reakce poháněna hydrolýzou PPi. Syntéza škrobu je podobná syntéze glykogenu (Stroma). O O
-
O
γ
P
O
HO HO
O
-
O HOH2C
β
P
-
O
O
α
P
ADENOSIN
-
ATP
O
O O OH
O
Glukosa-1-fosfát
-
P O
O -
PPi
ADP-glukosafosforylasa HOH2C HO HO
Anorganická fosfatasa
2 Pi
O O OH
O
P
O O
-
P
ADENOSIN -
O
O
HOH2C
ADP-Glukosa HOH2C HO HO
Synthasa škrobu O
OH
O
α-Amylosa (n jednotek)
ADP
HO HO
+
O
OH
HOH2C O HO
O
OH
α-Amylosa (n + 1 jednotek)
O
První část syntézy α-amylosy. Aktivace (fosforylace) glukosa-1-fosfátu. O O
-
P O
HOH2C HO HO
O
γ
O
P
-
O
β
O
-
ATP
P O
α
ADENOSIN
-
O O OH
O
Glukosa-1-fosfát
P O
O
-
-
PPi
ADP-glukosafosforylasa HOH2C HO HO
O
Anorganická fosfatasa
O O OH
O
P
O O
-
O
ADP-Glukosa
P O
ADENOSIN -
2 Pi
Druhá část syntézy α-amylosy.
Prodlužování řetězce na neredukujícím konci molekuly α-amylasy. Enzym: Synthasa škrobu HOH2C HO HO
O O OH
O
O
P O
O -
P O
ADENOSIN -
HOH2C
ADP-Glukosa HOH2C HO HO
Synthasa škrobu O
OH
O
α-Amylosa (n jednotek)
ADP
HO HO
+
O
OH
HOH2C O HO
O
OH
α-Amylosa (n + 1 jednotek)
O
Sacharosa – hlavní transportní sacharid pro nefotosyntetizující buňky - nejdůležitější produkt fotosyntézy. •
•
•
Sacharosa je syntetizována v cytosolu a proto musí být její dvě komponenty (G3P a DHA) transportovány z chloroplastu systémem antiporter s fosfátem. Dvě triosy se kombinují za tvorby fruktosa-6-fosfátu, která se následně převede na glukosa-1-fosfát. G1P je aktivován UTP (uridintrifosfát) na UDP-glukosu. Sacharosa-6-fosfát se tvoří za katalýzy enzymem sacharosafosfátsynthasa. Odštěpení fosfátu se uskutečňuje sacharosafosfátfosafatasou.
UDP-Glukosa + Fruktosa-6-fosfát
UDP
Sacharosafosfátsynthasa
Sacharosa-6-fosfát H2O Sacharosafosfátfosfatasa Pi Sacharosa
Regulace Calvin – Bensonova cyklu. • •
Kontrolní body každé metabolické dráhy jsou na enzymových stupních vzdálených od rovnováhy (velká negativní hodnota Δ G). Enzymy, katalyzující reakce s velkou změnou volné energie:
• • •
Ribulosabisfosfátkarboxylasa; Δ G (kJ.mol-1) = - 41, 0 Fruktosabisfosfatasa; Δ G (kJ.mol-1) = - 27, 2 Sedoheptulosabisfosfatasa; Δ G (kJ.mol-1) = - 29, 7
•
Katalytická účinnost těchto enzymů je silně ovlivňována osvětlením!!
•
Aktivita RUBISCA je ovlivňována těmito třemi na světle závislými faktory: pH . Po osvětlení se zvyšuje pH ve stromatu z hodnoty ≈ 7, 0 na hodnotu ≈ 8, 0. Protony jsou pumpovány ze stromatu do dutin thylakoidů. RUBISCO má ostré pH optimum 8, 0 !! [Mg2+] Vstup protonů do thylakoidů je kompenzován transportem Mg2+ do stromatu.
• •
Standardní a fyziologické změny volné energie reakcí Calvin-Bensonova cyklu. •
Stupeň
Enzym
Δ Go´ (kJ.mol-1) Δ G (kJ.mol-1)
• •
1. Fosforibulokinasa 2. Ribulosabisfosfátkarboxylasa
- 21, 8 - 35, 1
- 15, 8 - 41,0
• • • • • • • • • • • •
3. + 4. Fosfoglycerátkinasa + glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasa 5. Triosafosfátisomerasa 6. Aldolasa 7. Fruktosabisfosfatasa 8. Transketolasa 9. Aldolasa 10. Sedoheptulosabisfosfatasa 11. Transketolasa 12. Fosfopentosaepimerasa 13. Ribosafosfátisomerasa
+ 18, 0 - 7, 5 - 21, 8 - 14,2 + 6, 3 - 23, 4 - 14,2 + 0, 4 + 0, 8 + 2, 1
- 6, 7 - 0, 8 - 1, 7 - 27,2 - 3, 8 - 0, 8 - 29,7 - 5, 9 - 0, 4 - 0, 4
Regulace Calvin – Bensonova cyklu - pokračování. •
Analog přechodového stavu 2-karboxyarabinitol-1-fosfát (CA1P). Tuto látku, která inhibuje RuBP karboxylasu, syntetizuje řada rostlin pouze za tmy. Blokuje se tak aktivita RUBISCA ve tmě.
•
Oba další enzymy jsou také aktivovány zvýšením pH a [Mg2+] . Navíc jsou ovlivňovány NADPH. To je druhý regulační systém závislý na redoxním potenciálu stromatu.
•
Thioredoxin, protein obsahující 105 aminokyselin, má redukovatelnou disulfidovou skupinu. Redukovaný thioredoxin aktivuje jak fruktosabisfosfatasu, tak sedoheptulosabisfosfatasu.
•
Redoxní hladina thioredoxinu závisí na systému ferredoxinthioredoxinreduktasy. Jeho redoxní stav závisí na osvětlení.
•
Thioredoxin deaktivuje fosfofruktokinasu – klíčový enzym glykolýzy.
• •
Závěr: Světlo stimuluje Calvin-Bensonův cyklus a deaktivuje glykolýzu, kdežto tma má opačný efekt.
Světlem indukovaná funkce ferredoxin-thioredoxinreduktasy PSI
red
PSI *
Ferredoxin
Ferredoxin-thioredoxin reduktasa SH
PSI
red
hν
ox
red
Ferredoxin
red
Ferredoxin-thioredoxin reduktasa S
SH
Thioredoxin S
ox
S
Bisfosfatasa SH
ox
SH
Thioredoxin SH
aktivní
S
red
SH
Bisfosfatasa S
S
inaktivní
ox
CA-1-P – inhibitor ribulosabisfosfátkarboxylasy (tma). 2CH2 OPO 3
HO
H
C
COO
C
O
C
OH
-
CH2 OH
2-Karboxyarabinitol-1-fosfát (CA-1-P)
Fotorespirace •
Od roku 1960 je známo, že osvětlené rostliny spotřebovávají kyslík a uvolňují CO2 drahou odlišnou od oxidativní fosforylace.
•
Při nízkých hladinách CO2 a vysokých O2 může proces fotorespirace převládnout nad fixací CO2.
• •
Překvapení: Kyslík kompetuje s CO2 jako substrát ribulosakarboxylasy. Přesnější název: ribulosabisfosfátkarboxylasa-oxygenasa (RUBISCO).
•
Při oxygenasové reakci se vytváří z RuBP 3-fosfogylcerát a 2fosfoglykolát. 2-Fosfoglykolát je hydrolyzován na glykolát a ten je oxidován za tvorby CO2 v sérii enzymových reakcí v peroxisomech a mitochondrii.
•
Fotorespirace je devastující proces jehož výsledkem je neužitečná spotřeba světlem vytvořeného NADPH a ATP !!
Pravděpodobný mechanismus oxygenasové reakce RUBISCA. 2-
2-
CH2 OPO 3
ENZYM
B
O
C
H
C
OH
H
C
OH
2-
CH2 OPO 3
CH2 OPO 3 O
-
O
C
H 2-
C
O
C
OH
H
HO
O H
2-
CH2 OPO 3
O
C
O
C
OH
OH
2-
CH2 OPO 3
Ribulosa-1,5-bisfosfát
C
CH2 OPO 3
Endiolátová forma
2-Oxokyselina H
O H
H+ 2-
O
2CH2 OPO 3 -
O
C
O
2-Fosfoglykolát
+
H
-
C C
CH2 OPO 3
O
H2O
OH 2-
CH2 OPO 3
3-Fosfoglycerát
HO
C
O
HO
C
O
H
C
OH
OH
-
2-
CH2 OPO 3
Hydratovaný meziprodukt
Oxygenasová reakce RUBISCA. Chloroplast – peroxisom (glyoxysom).
O
-
O
C
H
C
2-
CH2 OPO3
+
OH
2CH2 OPO3
3-Fosfoglycerát
-
O
2-
CH2 OPO3 C
H
C
H
C
O
Fosfoglykolátfosfatasa
CH2 OH -
O
2-Fosfoglykolát
O2
O
C
Pi
Ribulosa-1,5-bisfosfát
O2
H2O2
Katalasa
1/2 O2 + H2O2
C
O
O
Glyoxylát
Ribulosa-1,5-bisfosfát karboxylasa/oxygenasa
OH
2CH2 OPO3
-
O
Glykolát
O
OH
C
C HO
Glykolátoxidasa
H CO2
CHLOROPLAST
-
C C
-
O
O
Glycerátkinasa
OH 2-
CH2 OPO3
3-Fosfoglycerát
H
C C
O OH
CH2 OH
ADP
ATP
NAD+
NADH
Hydroxypyruvátreduktasa
Glycerát
O
-
C C
O O
CH2 OH
Hydroxypyruvát
PEROXISOM
Oxygenasová reakce RUBISCA. Peroxisom – mitochondrie.
-
O
C
H2C NH3 -
O
Glyoxylát
O
C C
O
C
Glycin
NH3 -
CO2
+
C HO
TRANSAMINACE
O
O H
-
C
O
C
+
NH3
CH2 OH
O
Serin
O
CH2 OH
Hydroxypyruvát
PEROXISOM
MITOCHONDRIE
Rostliny C4 koncentrují na povrchu listu CO2. •
•
Řada rostlin se evolučně přizpůsobila kolísání koncentrace O2 a CO2 tak, že koncentrují ve fotosyntetických buňkách CO2 a zabraňují fotorespiraci. Např. cukrovka, cukrová třtina, kukuřice a mnoho plevelných rostlin. Typické pro tropické oblasti. List má charakteristickou anatomii – pod vrstvou buněk tzv. mesofylu jsou soustředěny žilky cévních svazků. V mesofylových buňkách není ribulosabisfosfátkarboxylasa !! Kutikula Svrchní epidermis Palisádový mezofyl
Xylem Floem
Houbový mezofyl CO2
O2
Spodní epidermis Průduch (stoma)
Svěrací buňky
Cévní svazek
Cyklus C4 – M. Hatch a R. Slack (1960) •
V mesofylu reaguje vstupující CO2 ve formě HCO3- s fosfoenolpyruvátem za tvorby oxaloacetátu (čtyři uhlíky, proto C4). Oxaloacetát je redukován NADPH na malát, který je transportován do buněk cévních svazků, kde je oxidativně dekarboxylován na CO2, pyruvát a NADPH. Takto koncentrovaný CO2 vstupuje do Calvinova cyklu.
•
Pyruvát je transportován zpět do mesofylu, kde je fosforylován za katalýzy pyruvát-fosfátdikinasy za tvorby fosfoenolpyruvátu. Při aktivaci přechází ATP na AMP + PPi. PPi je posléze hydrolyzován všudepřítomnou pyrofosfatasou na 2 x Pi.
•
Oxid uhličitý je koncentrován v buňkách cevních svazků na úkor spotřeby 2 ATP / CO2.
•
Fotosyntéza C4 rostlin spotřebovává celkem 5 ATP na rozdíl od C3 rostlin, které spotřebují 3 ATP.
Schematický nákres metabolismu C4 rostlin Oxid uhličitý C
O
VZDUCH
O
Anorganický fosfát O O
-
O
P
O
-
O
-
-
C C
O
O
O
-
H2C
C C
Fosfoenolpyruvát (PEP) O
O
O P
NADPH
O
NADP+
CH2 C
O
Oxaloacetát
O O
H+
+
-
O
-
CH
HO
-
O
C
-
Malát CH2 C
O
Pyruvát
O O
P
O
O
-
O O P
-
C
-
+ O O
ADP O
-
Pyrofosfát
C
O
-
ATP
+ O
P
CH3
C
-
O O
-
Anorganický fosfát
-
MEZOFYLOVÁ BUŇKA
BUŇKA POCHVY CÉVNÍHO SVAZKU
O
-
O
O
O
Oxid uhličitý
CALVINŮV CYKLUS
Metabolická dráha C4 rostlin. Mezofyl – buňky pochvy cévních svazků. CO2 2 Pi
ATP + Pi
AMP + PPi
VZDUCH
Karbonátanhydrasa HCO3-
CH2
COO
Pi
Pyruvátfosfát dikinasa
COO
-
Fosfoenolpyruvát (PEP)
NADPH
CH2
2-
C OPO3
-
PEP karboxylasa
C
O
COO
-
Malátdehydrogenasa
Oxaloacetát
BUŇKA POCHVY CÉVNÍHO SVAZKU
C
Jablečný enzym
O
COO
-
Pyruvát
CO2 + NADPH
NADP+
CALVINŮV CYKLUS 3-Fosfoglycerát
-
CH2 H
C
OH
COO
-
Malát
MEZOFYLOVÁ BUŇKA
CH3
NADP
COO
+
CAM rostliny jako varianta rostlin C4. •
Dráha byl poprvé popsána u tučnolistých rostlin a odtud název CAM – crassulacean acid metabolism.
• •
U CAM rostlin je časově oddělen záchyt CO2 a Calvin-Bensonův cyklus. CAM rostliny otevírají stomata (póry v listech) v noci a zachycují CO2 drahou C4 ve formě malátu.
•
Pro zachycení CO2 je nutné velké množství fosfoenolpyruvátu. To se získává štěpením škrobu a glykolýzou.
•
Během dne je malát štěpen za tvorby CO2 vstupujícího do Calvin – Bensonova cyklu a pyruvátu použitého na resyntézu škrobu.
•
Celý tento proces je veden také z důvodu zabránění ztrátě vody !!!
•
Stejnou drahou probíhá fotosyntéza u sukulentů.
