rl
Původce lymeskéborrelióry ve vybraném revíru u lovné zvéÍea myslivců. Dagmar Hulínská, Jiří a Jan Vot.-ipkovi Národní referenčnílaboratoř pro lymeskou boneliózu Cenffa epidemio|ogie a mikrobiologie Státníhozdravotníhoústavuv Praze,
Cí|e. Cílenéhledání původcůlymeskéboneliózy u lovné zvěře mělo ověřit moŽnost parenterálního přenosu virulentních bonelií bez účastiklíšťat.Předpokládanoucestou byl průnik spirochét drobný.rnioděrkami na rukou při ošetřenízvěřiny bezprostředně po u|ovení.Byli jsme inspirováni případem laboratorníinfekce vzniklé po pětiminutovéexpozici narostlékultury Borrelia garinii v kultivačnímmediu při kontaktu s kůžína rukou díky prasklégumovérukavici.Během několika dnůdošlona exponovanéruce ke klinickým projevůmonemocněnís bolestíkloubůa proximálním šířením.Zkrve postiženéhobyl pomocí polymerázovétetězovéreakce (PCR) identifikován shodný Y'rnenBorrelia garinii.Po intenzivní léčbě,klinicképrojely ustaly. Deoxyribonukleová kyselina (DNA) kmene byla prokazatelná v krvi postiŽenéhoještě 6 měsíců po expozici. Předpokládali jsme ýznamný podíl na perenterálnímpřenosu při manipulaci s ulovenými savci.Předevšímproto,Že k vyvrženízvěřiny se přistupuje bezprostředně po ulovení.Myslivecká etika a tradice přímo zakazuje použitígumov.ýchrukavic,dokonce vykasání rukávu nebo převleěení.Navícna místě ulovení není k dispozici nezávadná voda k om}tí ani případnádesinfekce.VyvrŽenia ošetřeníúlovku se provádí
,,zatepla,,tedyv době ,kdy i případné
pathogennízárodkyjsou plně vitální a schopnéinvadovat narušenoupokoŽku rukou.I přes časý vyskyt původcůlymeskéboneliózy v tkiíníchptáků není zde nebezpečípřenosu tak l"famé,neboť se většinou úlovek necháváuleŽet a to je pro borrelie letální úkon,stejnějako případnézmraŽeni a jiné úpravy.
Místo a čas. Pro toto sděleníjsme lybrali ýsledky získanévyšetřenímzvířat v jedné příměstskéhonitbě a doplni|i je o vyšetřeníkrve myslivců hospodařícíchna stejnémízemí a ve stejnémčasovém období.odběr vzorků byl prováděn na územíhonitby Zemědělského družstvaVelké Přílepy, mysliveckého sdruŽeníHoroměřice-Roztokry.Honitba patří do okresu Praha-západ.ÚzemileŽina severozápadnímokraji Prahy aje Vymezeno katastry následujícíchobcí: Velké Přílepy,Holičky,Levy Hradec,Roztoky u Prahy,obcemi patřícímido územíměstskéčástiPrahy 6 vůl a Kopanina) dále Statenice,Černý (Suchdol,Výhledy'Lysolaje,DolníŠárka,Nebušice,Přední je opět Velké Přílepy.Roz|ohahonitby byla 1900 helČaru.Sintravilánem zde|eŽicíchobcí o 300 les se hektarůvíce.Na uzemije 1280 ha polí, z toho l0 ha neobdělávanéornépůdy.Smíšený rozprostírána 100 ha, ovocnésady na 250 ha.Skály , skalnatéstráněa lomy tvoří l00 ha, vodní plochy (4 rybnky,2 potoky,2 bystřiny a částřeky Vltaly) 20 ha'cesty a silnice a podobnéplochy lokality ležíod 200 do 344 metrůnad mořem. 50 ha.Bonitnítřídahonitby je třetí..Jednotlivé První částpráce byla provedenav letech l 998-2000,druháčástprobíhádodnes.LaboratořNárodní referenčnílaboratoře Státníhozdravotního ústavuy Praze rozšířila uýzkum promořenosti naší zvěře ve spolupráci se Státnímveterinárnímústavemv Praze v rámci udělenéhoGrantu IGA. Historie a současnýstav. Ve Spojených státechamerickýchbyla v roce 1982 popsána Willi Burgdorferem příčimá souvislostmezi nově izolovaným druhem spirochéryz klíštěte]xodes dammini a děts(ým k1oubnímonemocněním-epidemickoujuvenilní o|igoartritidou v městě old Lyme ve státě Connecticut .V roce 1984 byla nová spirochétapopsána skupinou vědcůvedených R.C.Johnsonema označenajako nový druh Bonelia burgdorferiToto onemocněníse zde vyskyovalo
na území Spojených státůameric}oýchnejméněod začátkuosmdesáých let
minuléhostoletí..Roku|917 by|o onemocnění klinicky popsáno .Následnéstudie nalezly dalši
klinické formy postihující mimo k|ouby i nervoqý systém,srdcea kůži'vzácně i jiné orgány. infekcíBorrelia Sympozium odbomílď v roce l985 se dohodlo,žeklinické projevy způsobené burgdorferi se budou ozračovatjako lymeská bonelióza.Následný ýzkum objevil i jinde na světě dalšídruhy rodu Borrelia kterémohou způsobovatstejnéonemocnění . Všechny uvedené slova druhy byly zahmuty do skupiny ďruhuBorrelia burgdorJ.erisensu lato ('tj.v ŠirŠím smyslu).Do skupiny patří mimo původníamerick.ýdruh omačenýBorrelia burgdorferi sensu stricto -(tj. v uŽšímslova smyslu), i ryze ewopské druhy Borrelia garinii a Borrelia afzelii, Borreliavalaisiana,Borrelia
lusitaniae.Da|šÍmidruhy uvedenéskupině jsou asijskédruhy
Borrelia japonica, Borrelia tanuki a Borrelia turdi, a\e i dalšíamerickédruhy Borrelia bissettii, Borrelia lonestari a Borrelia andersonii. Prukazný vztah k onemocnění lymeskou borreliózou mají genomospeciés Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii, Borrelia garinii ,Borrelia japonica a Borrelia "-alaisiana.IJ ostatníchze skupiny sensu lato neníještěotázkajejich patogenityuzavřena.Lymeská boneliózajerozšíŤenaprakticky po všech kontinentech světa uýjimkou snad ztlstává Antarktida. Role živočichů. Již při prukazu o přenosu Borrelia burgdorferi klíštětemse uvažovalo o rezervoárech této spirochétyve volně Žijícíchzvířatech. Jen u evropskéhoklíštěteIxodes ricinus se uvádí,Žesaje na více než dvoustech druzích zvíÍatPrtlkaz spirochéryzpůsobujícíu lidí lymeskou borreliózu se podaři| u řady volně Žljícich savcůi ptáků .Mimo izo|ace Borrelia burgdorferi zk]íšťat,uvádí se ojediněle iná|eztéto bakteriei u jinéhokrevsajícíhohmyzu.muchničky,(Simulidae),kočičí blecha (Ctenocephalides feliýovádi (Tabanidae).Patrně jen u klíšťatdocházi k pomnoŽení v jejich tělech v e velkémmnoŽství.Tozvyšuje bonélií v jejich tkánícha proto se na|ézají
pravděpodobnost pruniku borrelií do tkání hostitele.U americkéhok|íštětelxodes scapularis a
Ixodespacifikzs by|o zjištěnožev infikovaných larvách je pruměrnýpočet16 000 bore|ií, v přisáých nymfách 55 000..Během sánínymf klesl početbonelií na polovinu původníhopočtu v souvislosti s nákazou hostitele. To znamená,Žeod jednoho klíštětedostává hostitel dávku kolem 20 000 bonelií coŽ je jistě dostatečnáinfekčnídávka.Věrohodnostpřenosu u jiného krevsajícíhohmyzu kde takovépomnoženíbonelií nebylo zanarnenánoje i z tohoto hlediska problematická. Prtkaz bakterie nebo její DNA z homogenátu tohoto hmyzu není důvodem povaŽovatjej za přenašeče( vektor)původců lymeskéboneliózy.Mn ohénáIezy původcůlymeské je prukaz původcelymeskéborreliózy u boneliózy uzyiŤatmají častoslabá místa.Příkladem l00% potkanův městskýchparcích.Napřil<|adv tkáni ušníchboltcůpotkanův Magdeburku byla prokazována DNA Borrelia burgdorferi..potékdyŽ těla potkanůbyla máčenave vodě aŽ do doby vezmeme v úvahuvlastnízkušenosts izolací pokud je neopustilavšechnaklíšťata.Když specifické DNA Borrrelia burgdorferl v odpadníchvodách a metodiku autoru můŽememít pochybnost o hodnotě takového prťlkazu.Zároveňje třeba opatrně přistupovat k izolacím DNA Žijícíchkolem vody. Borrelia burgdorferi u vodníchptákůa živočichů
Metodika. je V úvodujsme uvedli Že nás zajímalapředevšímskupina lovnézvěře z lymezenéhoúzemí,které jsme se jednoho mysliveckéhosdružení.Museli shodnés místemýkonu práva myslivosti členů podřídit ustanovením zákona o myslivosti a tak jsme vzorkf získávali z řádného odlovu v době povolenéholow.od roku 1995jsme měli jedinečnoumoŽnostpři retrospektivnístudii vyšetření desetitisícevzorků lidslcých tkání a tě]rríchtekutin, ryšetřit stejnýrni metodami i stovky zvířecích tkání.Navícve specializovanéNárodní referenčnílaboratoři pro lymeskou borreliózu CEM v Praze jsme měli moŽnost srovnat i využítdalšímetody prukazu přítomnosti agens lymeské borreliózy.Jednalo se předevšímo moŽnost kultivace,příméhoprůkazu imunoelektroopticky a
izo|aci geonomové i plastidové deoxyribonukleové kyseliny a vyšetřenívzorků pomoc polymerázové řetězové reakce (PCR). Velmi cenná bylatéŽ moŽnost identifikovat produkt PCR hybridizací a sekvenací.U lryšetřenískupiny myslivců jsme vl.uŽili průkazu speciťrckých protilátek v sérupomocí ELISA
a imunoblotem Přímý prukaz mikroskopicky je možný
pozorováním nativních preparátu v zástinu , za pomoci imunofluorescence ielektronopticky.stříbřenímnebo negativnímbarvením.Borrelia burgdorferi se velmi špatně barví Pouze 24 hodinové barvení ďeděným Giemsou.ýmbarvivem dává přijatelné ýsledky.U imunofluorescence jsou problémy se specifitou. Imunoelektronoptickémetody jsou pro rutinní vyšetřenítkání zdlouhavé a náročné.Metodaidentifikace borrelií mikroskopií v zástinu dobře identifikuje podle waru a pohybu tuto bakterii.BohuŽel neodlišívelmi podobnéa hojnédruhy u nepatogenníchspirá|oviých bakterií od původcůlymeskéboneliózy. Kultivace se daří z k|íšťat lidí z bíopsííkůŽe v místě zákusu infikovaného k|íštěte.Zlidské krve a dalšíchtělních tekutin je Při našichpokusech se ani v jednom případěnepodďila pozitivníkultivace izolacejiž obtíŽnější. zde jistě byl malý početrustuschopnýchborrelií v kultivačním ze savcůani z ptáků.Důvodem BSK mediu.Problémembyla i kontaminacevzorku dalšímidruhy bakterií\yslc}tujícíchse ve vyšetřovanýchtkáních.Většinouse jednalo o nutričněméněnáročné,rychlerostoucíbakÍerie, kterérychle nevhodnězměnily kultivačnímedium. I kdyby se pár pomalu rostoucíchbonelií do část vzorkůbyla vyšetřena media dostalo nemělo by šanciv soutěŽis kontaminací..Největší byly pouze pomocíPCR.odběru pro toto lryšetření bylo nutnévěnovat největšípéči.PouŽite|né vzorky tkáni z čerstvěulovených zvíŤata odebíranév ohni lyŽíhanými nástroji na čistém, hlubokémřezu tkání.odběr byl prováděn do pufi:u s ochranou před působenímnukleáz,část konzervována zmraŽenim..Izo|acebyla prováděna komerčnědodávanými soupravami pro izolaci genomovéDNA podle protokolu na izolaci bakteriální DNA. I pro vlastní amplifikaci
specifického produktu DNA byl použit postup akreditovanélaboratoře s využitímkomerčních směsís horwm Startempro zýšení specifiky omezenímoŽnékontaminace. Pro identifikaci byla lybrána geneticky stabilní částgenu 16SrRNA s konfirmací dalšímičástmigenomovéi plasmidové DNA .K určení genomospeciésjsme pouŽívali sety primeru odvozených téŽz genu l6SrRNA.l
při vyšetřenívzorků metodou PCR se setkáváme s řadou problémů.Problémem
můŽebý u polymerázové řetězovéreakce nevhodný ýběr identifikovanéhogenu například pro podobnost se sekvencí DNA ko|iformních bakterií ,kterése hojně vys$tují například v odpadníchvodách. Tuto skutečnostjsme měli moŽnost si sami ověřit při testování specifiry pouŽívanýchprimerůpro PCR k identifrkaci lymeskéboneliózy. Při pouŽitíDNA především koliformníchbakterií při lyššíkoncentracizpůsobujes|abounespecifickoupozitivitu. Jedná se hlavně o DNA sbírkových kmenů rodu Escherichia,Proteus a Pseudomonas' Vezmeme.li v úvahu'Žese někdy k prukazu DNA agens lymeskéboneliózy používaji kadavery zviřat, nanichž se mnoŽívelmi rychle právně koliformní bakterie ,a Že zvlÍatapocházejí navíc z kontaminovanéhoprostředí můžebý ýsledek nejméněproblematicloý.Sama .lysoká citlivost reakce můŽeovlivnit lyššípočetfalešněpozitivních rnýsledku.Naopak přítomnost nadbytku inhibitorureakce PCR v materiálu zase sniŽujecitlivost reakce.Využilijsme létylyzkoušené schéma erudovanélaboratořepři vyšetřeníPCR, abychom zaručilispolehlivosta reprodukovatelnost ýs ledlai. Výsledky. V první etapějsme vyšetřili na tomto území153 jedincůpatřícíchk 26 druhům Živočichů Srovnání ce]koých počtupozitivních v,ýsledlcuu lovných savcůa ptákůjasně ukazuje převahu ve skupině lovných ptákn @7%).U lovných savců byla DNA Borrelia burgdorferi sensu lato byla
Graf č.l.: Výsledky vyšetřenítkání |ovnézvěře na přítomnost DNA Borrelia burgdorferi sensu lato
pozitivní v 32oÁlyšetřenýchvzorků.U myslivcůztéhoŽúzemíbylo provedenovyšetřeníkrve na přítomnost protilátek proti agens lymeskéboneliózy a přímý průkaz specifické DNA pomocí PCR V obou případech byla pozitivity kolem čtyřiceti procent. V kontrolní skupině vybranéze vzorkůpacientů s klinicky nesouvisejícídiagnózou azjiné oblasti byla pozitivita necelých l0 procent.Souborjsme doplnili o lyšetřenípřisáých klíšťatna kuži myslivců.'zde byla nejvyšší pozitivita ato 68 %!V jednom případějsme obdrŽeli i klíšťákaLipoptoma cervikteý téŽúdajně poštípaljednu osobu. Vyšetřili jsme takékrev dalšíchobratlovcůa několika bezobratlých pozitivních živočichůve sledovanéoblasti..Při ídentifikacigenomspeciésBorrelia šedesátišesti vzorkůjsme konstatovalipřevahu Borrelia garinii (60 % ) následovalaBorrelia aJzelii (35 %)a v nejmenšímíře byla ZastoupenaBorrelia burgdorferi sensu stricto. (5 %) U lyšetřované Borreliagarinii(9z14 skupinymyslivcůjednoznačněpřevaŽuje
)'cožjevsouhlasesnejčastěji
identifikovaným genomospeciésu lryšetřovanýchpacientů.Také u přisátych klíšťatze sledovanéhoúzemíbyl identifikován v absolutnívětšiněgenomspeciésBorrelia garinii (5 ze
6 pozitivních). Tabulka č.l: Vyšetřená lovná zvěř - savci PoZitivní
Vvšeřeno
Druh
Capreolus capreolus - srnec Lepus europaneus - zaiíc Sus strofa -prlse divoké Vulpes vulpes - liška Celkem
1 2
A
l1 ll
A
5 31
J
10
Tabulkač.2:Vyšetřenálovná zvěř - ptáci Pozitivni 8
Vvšetřeno
Druh
t5
Anas olathvrvnchos - kachna divokti Columba livia v.domest.- holub domácí zdiv. Columba palumbus - holub hřivnáč Corvus frusilegus - haýran Fulica atra - lvska Garrulus glandarius - soika Larus ridibundus - racek chechtatý Phasianus colchicus - bažant Phalacrocorax carbo - kormorón Pica pica - straka Streptopelia decaocto - hrdlička zahradní
Á
A
A
5
15 I
7 8 6
10 9
.)Á
Celkem
J
I z
5 9l
2 43
Tabulka č.3:Výsledky vyšetřenímys|ivců
druh wšetření
Vyšetřeno
Pozitilni (-)
Negativní (-)
% í+)
Seroloeické PCR Celkem
1',l
7 T4 2l
l0
4l 45 43
JI
48
t7 an
Graf č.:2:Určený genospeciésBorrelia burgdorferi ze všechpozitivních vzorků
14 12 10 I 6 4 2 0 savcl
ptáci
rÍTysIiVci
s.stricto D B.burgdorferi l B€ a rinii i B'afze|ii Zdáseproti předpokladu,Že parenterálnípřenos krví ulovených zvířatje velmi vzácný'je-li malý početvirulentníchspirochétv krvi a tělních bude předevŠím vůbecmožný.Důvodem tekutinách ulovených zvířat.Hlavní úlohupři infikování hrají i u zpracovatelůzvěřiny promořená klíšťata.Jakozajímavostuvádíme nález specifické DNA v povrchové i podzemní vodě a prukaz přítomnosti genomu Borrelia garinii a afzelii u klíštětez entomologickésbírky pocházejíci z šířilau nás původcelymeské roku 1963 ze stejnéhoúzemí.Jeto průkaz toho,Žeklíšťata borre\iózy jlŽdvacet let pred uznánim onemocněníZa Samostatnounosologickou jednotku.od roku l995 téŽpátrámev materiálu pacientu a zviŤatpo infekčnímagens rodu Anaplasma (dříve klíšťata.S ohledem na rozsah studiebudou vysledky samostatným Ehrlichia)' kterétéžpřenášejí sdělením. Co dá|? V řádu Spirochaetales jsou zahrnuty ruzré skupiny spirálovit'ých a aklivně pohybliqých bakterií. Klasifikace spiráloviých bakrerií byla prováděna předevšímna morfologickém podkladě'tím se sta|o,žeskupina obsahuje mimo tvarově podobnéorganismy i velmi biologicky od1išnédruhy. Jedna čeleď v.ýšeuvedenéhoÍádu Spirochaetaceae zahrnuje několik rodů
vodě ,v bahně a v písku.Druháčeleď nepatogenníchspirochétŽijícíchve stokách,kontaminované Treponemataceae obsahuje rody Treponema, Leptospira a Boruelia.Treponemy i leptospiry jsou organismy jak primárně sapro!,.tické,tak primárně patogennípro člověka i zvířata. Rod jsou Borrelia zahrnuje řadu patogenníchdruhů pro člověka i zvířata.Přesto některédruhy součástínormální bakteriální flóry člověka. Přftladem můŽebý Borrelia refringens na|ézanáu č|ověkana patrolých mandlích,v ústech,v dolní části zaŽívacíhotraktu , i ve stolici , Borrelia burgdorferi je podobně jako ostatnídruhy rodu velmi starobylý organismus.Tento druh obsahuje čtyřikrát menšímnoŽstvíDNA v chromozómu neŽ má běŽná střevní bakterie Escherichia coli Navíc má vzácně se lyskytující jeden ]ineárníchromozom.Skladba stěny Borrelie burgdorferi nese archaické ma|q.Zdáse,žemáme co do činěnís organismem,kteryprošeldlouhým v'ývojema je velmi dobře adaptovánna Život v tkáníchhostitele.Při dlouholetémlyšetřovaníjsme si všimli opakujícíchse cyklů při prukazu tohoto organismu u lidí.Předpokládáme,žeby mohla Borrelia burgdorferi prodělávat částŽivotního cyklu v lidském a zvítecímorganismu.Studiu této problematikybude třeba věnovat většípozornost.Stejnětak bude nutnévíce odlišovatv rámci druhu patogennía nepatogennísérotypyu lidí i u zvířat.Nakonec bude nutnéobjasnit nález DNA patogenníchborreliív powchov}Ícha spodníchvodách.
obraz č.|.Borrelia garinii I(men M 792 izolovaný zmozkomíšníhomoku člověka,kultivacev BSK mediu
20 000 x mikroskopu, zvětšení Snímekz elektronového Autor Dr.D.Hulínská
Souhrn. Na území2200 hektaru v příměstskéoblasti byl sledován ..yskyt původcelymeskéboneliózy u zvířat(26druhůl53 jedinců),předevšímu lovné zvěŤea u myslivců(31 1id0 zde lykonávajících oÁ právo myslivosti.U zvířat byla prokázán a v 55 přítomnost DNA Bonelia burgdorferi sensu lato. Z 60 pozitivních vzorků u kteqich se podařila identifikace genospeciéspatřilo 60%k Bonelia garinii' 35 %kBorrelia afzelii a jen 5% k Bonelia burgdorferi sensu stricto.U myslivcůse specifických protilátek av 45 %opřítomnostborreliové podďi1o prokázatv 4| %opřítomnost DNA.Během sledovanéhoobdobíSe na toto onemocněníléčilidva lidéze sledovanéskupiny.U dalšíchdvou bylo podezření na chronicképrojevy lymeskéboneliózy. U myslivcůse podařilo prokázatpouze Borreilía garn1i.Ze sbírkovéhopreparátu klíštětesebranéhove sledovanémúzemí v roce 1963 se podařila prokázatDNA Borrelia garinii a Borrelia afzelii. Nepodařilo se prokázat Že docházík parenterálnímupřenosu lymeskéborreliózy při zpracování zvěřiny průnikem oděrkami v kuŽi rukou.
