VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY
STANOVENÍ ENZYMOVÝCH AKTIVIT V KOMPOSTU
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR'S THESIS
AUTOR PRÁCE AUTHOR
BRNO 2014
IVA PERNICOVÁ
VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY
STANOVENÍ ENZYMOVÝCH AKTIVIT V KOMPOSTU THE STUDY OF ENZYME ACTIVITIES IN COMPOST
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR'S THESIS
AUTOR PRÁCE
IVA PERNICOVÁ
AUTHOR
VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR
BRNO 2014
Mgr. STANISLAVA VOBĚRKOVÁ, Ph.D.
Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12
Zadání bakalářské práce Číslo bakalářské práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce Konzultanti:
FCH-BAK0830/2013 Akademický rok: 2013/2014 Ústav chemie potravin a biotechnologií Iva Pernicová Chemie a technologie potravin (B2901) Potravinářská chemie (2901R021) Mgr. Stanislava Voběrková, Ph.D.
Název bakalářské práce: Stanovení enzymových aktivit v kompostu
Zadání bakalářské práce: 1. Vypracujte literární přehled k dané problematice 2. Popište použité metody hodnocení 3. Zpracujte naměřené výsledky z experimentů 4. Zhodnoťte získané výsledky formou diskuze
Termín odevzdání bakalářské práce: 23.5.2014 Bakalářská práce se odevzdává v děkanem stanoveném počtu exemplářů na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu bakalářské práce. Toto zadání je přílohou bakalářské práce.
----------------------Iva Pernicová Student(ka)
V Brně, dne 31.1.2014
----------------------Mgr. Stanislava Voběrková, Ph.D. Vedoucí práce
----------------------doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. Ředitel ústavu ----------------------prof. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty
ABSTRAKT Tato bakalá ská práce se zabývá stanovením enzymových aktivit v kompostu a posuzuje jejich zm ny v průb hu kompostování. Zm ny aktivity jednotlivých enzymů slouží jako ukazatele činnosti mikroorganismů, které se v kompostu nacházejí. V praktické části práce byly stanoveny zm ny aktivity proteáz, celuláz, lipáz, dehydrogenáz a ureáz b hem Ň1 dnů kompostování za laboratorních podmínek. Sledována byla také zm na pH. Zm ny hodnot pH a všech aktivit enzymů krom ureáz vykazovaly v prvním týdnu stejný trend související s využíváním dostupných substrátů. Zm ny aktivit klíčových enzymů v kompostu za laboratorních podmínek byly srovnány se zm nami aktivit v kompostu za reálných podmínek, což je ukazatelem rozdílného průb hu kompostování za daných podmínek.
ABSTRACT This thesis deals with the determination of enzyme activities in compost for consideration their changes during the composting. The changes in the activity of particular enzymes serve as the indicators of the activity of microorganisms, which are found in the compost. In the practical part of the work the changes in activity of proteases, cellulases, lipases, dehydrogenases and ureases within 21 days of composting under laboratory conditions were determined. The change in pH was observed as well. The changes in the pH-values and all enzyme activities except ureases present in the first week the same trend associated with the use of available substrates. The changes in the activities of the key enzymes in compost under laboratory conditions were compared with the changes in activities in compost under real conditions, which is the indicator of the different composting process under the given circumstances.
KLÍČOVÁ SLOVů Kompost, enzymová aktivita, celulázy, proteázy, lipázy, ureázy, dehydrogenázy
KEYWORDS Compost, enzyme activity, cellulase, protease, lipase, urease, dehydrogenase
3
PERNICOVÁ, I. Stanovení enzymových aktivit v kompostu. Brno: Vysoké učení technické v Brn , Fakulta chemická, Ň014. 41 s. Vedoucí bakalá ské práce Mgr. Stanislava Vob rková, Ph.D.
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalá skou práci vypracovala samostatn a že všechny použité literární zdroje jsem správn a úpln citovala. Bakalá ská práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brn a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalá ské práce a d kana FCH VUT.
…………………………… podpis studenta
Poděkování: Ráda bych poděkovala paní Mgr. Stanislavě Voběrkové, Ph.D. za odborné konzultace, cenné rady a pomoc při vypracování mé bakalářské práce. Dále bych chtěla poděkovat paní Bc. Ing. Daně Adamcové, Ph.D. a paní Mgr. Ing. Magdaléně Vaverkové, Ph.D. z Ústavu aplikované a krajinné ekologie Mendlovy univerzity v Brně za poskytnutí vzorků kompostu.
4
OBSAH: 1.
ÚVOD ..................................................................................................................... 7
2.
TEORETICKÁ ČÁST ................................................................................................ 8 2.1. KOMPOST A JEHO VÝZNAM ................................................................................. 8 Ň.1.1. Význam kompostování ............................................................................... 8 Ň.1.Ň. Stav kompostování v České republice ........................................................ 9 2.2. MIKROORGANISMY V KOMPOSTU ..................................................................... 10 2.3. ENZYMY V KOMPOSTU ...................................................................................... 11 Ň.ň.1. Názvosloví enzymů .................................................................................. 11 Ň.ň.Ň. Původ a význam enzymů v kompostu ...................................................... 12 2.4. ENZYMOVÁ AKTIVITA ....................................................................................... 13 Ň.4.1. Aktivita proteáz ........................................................................................ 13 Ň.4.Ň. Aktivita celuláz ......................................................................................... 14 Ň.4.ň. Aktivita ureáz ........................................................................................... 14 Ň.4.4. Aktivita lipáz ............................................................................................ 15 2.4.5. Aktivita dehydrogenáz .............................................................................. 15
3.
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ...................................................................................... 16 3.1. POUŽITÉ P
ÍSTROJE ........................................................................................... 16
3.2. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE ....................................................................................... 16 3.3. POUŽITÉ ROZTOKY A JEJICH P
ÍPRAVA .............................................................. 17
ň.ň.1. Roztoky pro stanovení aktivity proteáz .................................................... 17 ň.ň.Ň. Roztoky pro stanovení aktivity celuláz .................................................... 18 ň.ň.ň. Roztoky pro stanovení aktivity ureáz ....................................................... 19 ň.ň.4. Roztoky pro stanovení aktivity lipáz ........................................................ 19 ň.ň.5. Roztoky pro stanovení aktivity dehydrogenáz ......................................... 20 3.4. METODY STANOVENÍ ENZYMOVÝCH AKTIVIT ................................................... 20 ň.4.1. Stanovení enzymové aktivity proteáz ....................................................... 20 ň.4.Ň. Stanovení enzymové aktivity celuláz ....................................................... 21 ň.4.ň. Stanovení aktivity ureáz ........................................................................... 22 ň.4.4. Stanovení aktivity lipáz ............................................................................ 24 ň.4.5. Stanovení aktivity dehydrogenáz ............................................................. 25 ň.4.6. Kompostování........................................................................................... 26 5
4.
VÝSLEDKY ů DISKUZE ........................................................................................ 27 4.1. M
ENÍ PH V KOMPOSTU .................................................................................. 27
4.2. AKTIVITA CELULÁZ .......................................................................................... 28 4.3. AKTIVITA PROTEÁZ ........................................................................................... 30 4.4. AKTIVITA LIPÁZ ................................................................................................ 31 4.5. AKTIVITA DEHYDROGENÁZ ............................................................................... 33 4.6. AKTIVITA UREÁZ .............................................................................................. 34
6
5.
ZÁV
R ................................................................................................................. 36
6.
SEZNAM POUŽITÉ LITERůTURY ......................................................................... 37
7.
SEZNůM POUŽITÝCH ZKRůTEK A SYMBOL ...................................................... 41
1.
ÚVOD
Kompostování je p evážn aerobní biologický proces rozkladu odpadu. B hem kompostování jsou organické látky degradovány prost ednictvím mikroorganismů na jednodušší sloučeniny a huminové látky. Kompostování se hojn používá v zem d lství za účelem zlepšení vlastností půdy, mezi které pat í vodostálost, úrodnost či snižování chorob rostlin [1]. Vznik kompostu je dán hlavn mikrobiální činností. V kompostu najdeme p evážn bakterie, houby a Actinomycetes. Mikroorganismy vyskytující se v jednotlivých fázích kompostování se liší p edevším teplotou, p i které se vyskytují, můžeme je rozd lit na mezofilní a termofilní mikroorganismy [2]. Pomocí mikroorganismů, ale i rostlin či exkrementů se do kompostu a do půdy dostávají enzymy, které degradují organické látky a navrací do půdy živiny důležité pro správný růst rostlin. Podílí se také na kolob hu dusíku a uhlíku. Enzymy katalyzují biochemické reakce a jsou tudíž nedílnou součástí našeho sv ta [3][4]. Sledování zm n aktivit enzymů v kompostu slouží jako ukazatel kvalitního a správného kompostování. Použití nesprávn p ipraveného kompostu do půdy může mít fytotoxické účinky a neblahý vliv na životní prost edí [5].
7
2.
TEORETICKÁ ČÁST
2.1. Kompost a jeho význam Kompost je sm s složená z organických látek a zeminy, která je obohacena mikroflórou a ve které probíhají nebo již prob hly humusotvorné procesy. Organická hmota podléhá v kompostu mnoha zm nám. Rychlost tohoto rozpadu závisí na podmínkách, p i kterých rozklad probíhá. Rozklad organické hmoty může probíhat buď za anaerobních podmínek, což se využívá p i zrání hnoje nebo v silážích, za t chto podmínek dochází k biochemické p em n látek bez p ístupu kyslíku. Rozklad organické hmoty také může probíhat p i aerobních podmínkách, teda za p ístupu kyslíku. Zde je klíčovým procesem mineralizace, která se skládá ze dvou fází. První fáze je karbonizační, dochází p i ní k oxidaci uhlíku, druhá fáze je nitrifikační, kdy probíhá oxidace dusíkatých látek [6][7]. Kompostování je p irozený aerobní rozkladný proces, dochází k odbourání organických látek. Celkový proces d líme do čty fází. V první fázi dochází k velkému pomnožení mikroorganismů, které odbourávají snadno rozložitelné látky, což způsobuje, že teplota stoupá až do rozmezí hodnot 60 – Ř0°C. V této fázi jsou likvidovány semena plevelů a choroboplodné zárodky. Druhá fáze pokračuje rozkladem hů e rozložitelných látek. T etí fáze je ve znamení látkových p em n a začíná probíhat mineralizace. Ve čtvrté fázi jsou produkovány složit jší organické látky humusové povahy [7]. Proces kompostování umož uje kolob h živin v p írod . Vhodným materiálem pro kompostování jsou organické odpady ze zem d lství, jedná se hlavn o zbytky rostlin jako je plevel, sláma, bramborová nať, znehodnocená krmiva či listí ze stromů apod. a d evní hmota, zejména piliny. Do kompostu se p idává i anorganická hmota, nejčast ji zemina, popel či rybniční bahno, dále se p idává hnůj či močůvka jako mikrobiáln bohatý substrát [6][7]. Pro proces správného kompostování musí být dodrženo pár základních pravidel. Mezi nejhlavn jší pat í optimální vlhkost, homogenizace zakládky a udržování aerobních podmínek v zakládce pomocí provzduš ování. Kompostování nesmí způsobit znečišt ní podzemních ani povrchových vod. Jednou z variant kompostování je tzv. stabilní kompostárna. Jedná se o zpevn nou plochu, která má zajišt ný odvod dešťové vody. Nejčast ji se setkáváme s polní kompostárnou, která je charakterizována jednorázovým založením nap íklad na okraji pozemku [7]. Kompost je stabilizované organické hnojivo s obsahem ň0 – 50 % organických látek, obsahuje nejen živiny důležité pro růst rostlin, ale i mikroorganismy, které jsou důležité pro správné fungování půdního ekosystémů. Důležitou roli v kompostu hraje také množství vody a celková vlhkost půdy. Ta by se m la v kompostu pohybovat mezi 50 až 70 %. Požadovaná vlhkost závisí na charakteru kompostu, u zemitých kompostů by se vlhkost m la pohybovat v rozmezí 50 – 55 %, za to u kompostů, které obsahují více d evných št pů nebo kůru by m la být vlhkost vyšší a to 65 – 70 % [6][7][8]. 2.1.1. Význam kompostování Význam kompostu a kompostování spočívá zejména ve zlepšení fyzikálních, chemických i biologických vlastností půdy. Současn je považován za zdroj humusových látek, které jsou 8
důležité pro správný růst rostlin. Aplikace kompostu do půdy zlepšuje zpracovatelnost a drobivost půdy a zvyšuje kationovou vým nnou kapacitu půdy. Kompost je důležitý i pro kolob h a zadržování vody v půd , zvyšuje totiž polní vodní kapacitu, pórovitost a vodostálost půdních částic. Kompost navrací do půdy organické látky a živiny, napomáhá rozkládat škodlivé látky obsažené v půd , likviduje patogenní mikroorganismy. B hem kompostování se zužitkovávají odpadní suroviny nejen ze zem d lství ale i z lesnictví či d evozpracujícího nebo z potraviná ského průmyslu. Kompost je také hojn užíván v zem d lství pro p stování rostlin s vysokými nároky na organické látky, ale používá se také v zeliná ství, kv tiná ství, vinohradnictví nebo ovocná ství. Jeho blahodárné účinky jsou využívány také p i obnov travnatých porostů, v lesních školkách a p i různých opat eních vedoucích ke zlepšení kvality půd k tzv. melioraci půdy [8][9][10]. Další úlohou kompostu je snižování chorob rostlin. Rostlinné patogeny napadají rostliny a ovliv ují jejich růst či další použití rostlin a jejich plodů, čímž dochází k ekonomickým ztrátám. Chemické ošet ení, které pat í dnes k nejb žn jším metodám ochrany rostlin p ed chorobami, má však nežádoucí vliv na životní prost edí a navíc často vzniká rezistence vůči t mto post ikům. Aplikace kompostu je velmi vhodnou metodou pro omezení ší ení nežádoucích patogenů vyvolávajících onemocn ní rostlin. Kompost působí p ízniv na životní prost edí, navíc je vyráb n z biologicky rozložitelného odpadu a vrací důležité živiny nazp t do půdy [1]. 2.1.2. Stav kompostování v České republice Již od roku 1ř15, kdy bylo v Praze vybudováno za ízení na kompostování čistírenských kalů, popele a rašeliny, se průmyslov vyrábí na našem území kompost. Rozvoj kompostování probíhal až do roku 1987, v tomto roce byla zaznamenána maximální produkce kompostu a to 2,8 mil. t v českých zemích. V letech 1řř0 až 1řřŘ zájem o kompostování klesá a roční výroba průmyslového kompostu činí 0,Ň5 – 0,3 mil. t. Od roku 1998 znovu roste zájem o kompostování odpadů zejména z údržby ve ejné zelen , a proto se rozrůstá i počet kompostáren v České republice ĚObrázek 1). Výroba průmyslových kompostů je usm rn na legislativou odpadů, vodohospodá skou legislativou a legislativou hnojiv. V současné dob se snížila roční výroba kompostů na 200 – 250 tis. t [11].
9
Obrázek 1 Kompostárny v České republice [12]
2.2. Mikroorganismy v kompostu Na procesu kompostování se podílejí mikroorganismy, které se v kompostu vyskytují. Jedná se p edevším o bakterie, plísn a rod grampozitivních bakterií Actinomycetes ĚObrázek 2). Z hlediska výskytu mikroorganismu v kompostu, se kompostovací proces může rozd lit do t í fází. První fáze je ve znamení mezofilních mikroorganismů. Teplota se pohybuje do 40°C. Mezofilové jsou zodpov dní za rychlou degradaci snadno rozložitelných nebo rozpustných sloučenin. Tato degradace je p íčinou zvýšení teploty a nastává druhá fáze (termofilní). V této fázi teplota neklesá pod 40°C. P i t chto teplotách se oslabuje činnost mezofilů a aktivn jšími se stávají termofilové. Ti rozkládají hů e rozložitelné látky, degradují bílkoviny, tuky či polysacharidy jako jsou celulóza a hemicelulóza. Vysoká teplota také ničí patogenní mikroorganismy. S vyčerpáváním složit jších sloučenin postupn klesá teplota a nastává t etí fáze. Poslední fáze vzhledem k mikrobiální účasti v kompostu se vyznačuje op t nástupem mezofilních mikroorganismů, tato fáze je označována jako fáze zrání [1]. V první mezofilní fázi p evážn p evládají bakterie a houby. Z bakterií jsou to hlavn Pseudomonas, Bacillus, Flavobacterium,Clostridium, Serratia Enterobacter a Klebsiella. Mezi zástupce hub pat í Alternaria, Cladosporium, Mucor, Aspergillus, Humicola a Penicillium. V termofilní fázi pat í mezi zástupce bakterií p edevším Bacillus a Thermus. Zástupci hub jsou Aspergillus, Mucor, Chaetomium, Humicola, Absidia, Sporotrichum, Thermoascus a Torula (kvasinka). V termofilní fází se také objevují Actinomycetes a jeho zástupci Streptomyces, Thermoactinomyces a Thermomonospora. V poslední fázi kompostování v tzv. zrání pat í mezi zástupce bakterií Bacillus, Flavobacterium, Pseudomonas a Cellulomonas. Ze zástupců hub jsou to Alternia, Aspergillus, Bipolaris a Fusarium. I v této fázi se vyskytují Actinomycetes, p edevším Streptomyces a Thermopolyspora [1][2].
10
Obrázek 2 Další mikroorganismy v kompostu [2]
2.3. Enzymy v kompostu Život, tak jak ho známe, je založen na nespočtu chemických reakcí. Urychlení nebo dokonce umožn ní n kterých reakci způsobuje pestrá škála biokatalyzátorů. Nejv tší a nejznám jší skupinu tvo í enzymy. Enzymy pat í k nejvýznamn jším biomolekulám a najdeme je ve všech živých organismech. Enzymy bývají nejčast ji tvo ené bílkovinnou částí, ale poslední výzkumy ukazují, že i části RNA mohou fungovat jako vysoce aktivní enzymy. Enzymy mohou být jednoduché nebo složené. Složené enzymy se skládají z bílkovinné části Ěapoenzymě a nebílkovinné části Ěkofaktorě. Enzymy se vyznačují specifitou, ať už se jedná o specifitu katalyzované reakce Ěúčinková specifitaě nebo o specifitu struktury p em ovaného substrátu Ěsubstrátová specifita) [3][1][10]. 2.3.1. Názvosloví enzym V d ív jších dobách se enzymy pojmenovávali triviálními názvy s koncovku "-in" Ěpepsině. Pozd ji byla zavedena koncovka "-asa" a název byl odvozen od substrátu, který byl enzymem katalyzován Ěamylasa, lipasaě, nebo podle typu katalyzované reakce Ěoxidasa, hydrolasaě. Toto názvosloví však nebylo dostačující, proto v roce 1ř61 enzymová komise Mezinárodní unie biochemie zavedla nové názvosloví. Enzymy jsou rozd leny do šesti hlavních t íd podle typu katalyzované reakce, t ídy jsou dále d leny do podt íd. Dnes se enzymy označují čty místnými číselnými kódy. Název enzymu se skládá ze zkratky "EC", což znamená Enzyme Commission, první číslo udává číslo t ídy, druhé pak číslo podt ídy, která je charakterizována chemickou vazbou, na kterou enzym působí, t etí číslo je skupinou a čtvrté je číslo enzymu uvnit skupiny nap . EC 1.11.1.7. pro peroxidasu [3].
11
Hlavní t ídy klasifikace enzymů: 1. Oxidoreduktasy 2. Transferasy 3. Hydrolasy 4. Lyasy 5. Isomerasy 6. Ligasy První t ídu tvo í oxidoreduktasy, které katalyzují intramolekulové oxidačn redukční p em ny. Tyto d je probíhají buď p enosem elektronů nebo atomu vodíku, p ípadn vestav ním atomárního kyslíku do substrátu. Jedná se o jednu z nejpočetn jších t íd a všechny enzymy jsou složené. Druhá t ída transferasy realizuje p enos skupin Ěmetylových, amidových, zbytek glukosy apod.ě v aktivované form z jejich donoru na akceptor. Hydrolasy št pí vazby, které vznikly kondenzací Ěesterové, peptidovéě, za vzniku vody. Nejčast ji se jedná o jednoduché enzymy. Čtvrtá t ída pak zajišťuje št pení a vznik energeticky nenáročných vazeb mezi uhlíky nebo uhlíkem a vodíkem apod. bez vzniku vody. Isomerasy umož ují vnitromolekulové p esuny atomů a jejich skupin, tudíž dochází ke zm nám izomerie. Enzymy poslední t ídy katalyzují vznik energeticky náročn jších vazeb za použití rozkladu látek, které energii uvol ují ĚATPě [3][4]. 2.3.2. P vod a význam enzym v kompostu V kompostu najdeme velké množství mikroorganismů jako jsou bakterie, plísn či kvasinky. V p ípad , že je kompost součástí půdy jsou jeho dalšími obyvateli i v tší hmyz jako jsou žížaly, stonožky, červi nebo i menší obratlovci jako jsou hraboši či krtek. Enzymy, které se nacházejí v kompostu, jsou produkovány práv živými nebo mrtvými bu kami mikroorganismů, rostlinami nebo rostlinnými residui a exkrementy půdních živočichů. Enzymy v kompostu mohou být extracelulární nebo endocelulární. Endocelulární enzymy se nacházejí uvnit bu ky, zato extracelulární enzymy jsou produkovány do okolí. Enzymy se v kompostu mohou vyskytovat jako volné enzymy nebo vázané do komplexu s anorganickými, organickými nebo smíšenými látkami, nejčast ji jsou to jílové minerály nebo humusové látky. Takto navázané enzymy již nejsou spojeny se životem bun k a jejich aktivita nemusí korelovat s obsahem mikrobiální biomasy [4]. Význam enzymů v kompostu je veliký a nenahraditelný. Enzymy mají důležitou roli v rozkládání organické hmoty a kolob hu živin. P em ují nedostupné živiny na dostupnou formu, podílejí se na procesu nitrifikace a denitrifikace, takže zp ístup ují rostlinám dusík. Jsou ukazatelem mikrobiální aktivity v kompostu, je podle nich sledován průb h kompostování. Podílí se na degradaci biodegradovatelného odpadu. Napomáhají ničit škodlivé mikroorganismy a nep irozené látky jako jsou pesticidy či různé průmyslové odpady [9][10].
12
2.4. Enzymová aktivita Aktivita enzymů vyjad uje katalytickou účinnost za určitých podmínek. Od roku 1961 se pro vyjád ení aktivity používala standardní Ěmezinárodníě jednotka aktivity 1 U. Tato jednotka p edstavuje množství enzymu katalyzující za standardních podmínek p em nu 1 μmol substrátu za jednu minutu. Od roku 1ř7Ň, po zavedení jednotek SI, se novou jednotkou pro vyjád ení enzymové aktivity stala jednotka katal. Jeden katal p edstavuje množství enzymu katalyzujících za standardních podmínek 1 mol substrátu za 1 sekundu. Pro vysoké hodnoty enzymatických aktivit se nejčast ji používá mikrokatal -6 ( μkat 110 kat ) nebo nanokatal ( nkat 110-9 kat ě. Rychlost p em ny substrátu se také může vyjad ovat jako koncentrace katalytické aktivity Ějednotka kat dm 3 ě, specifická 1 katalytická aktivita Ějednotka kat kg , vztažená na hmotnost enzymuě nebo molární katalytická aktivita Ějednotkaě. Často se také používá reakční rychlost enzymové reakce (jednotka mol dm3 s-1ě, protože p i stanovení aktivity se m í zm na koncentrace substrátu nebo produktu za určitý časový interval [3][4]. Rychlost enzymové aktivity je ovliv ována různými faktory, nejčast jšími faktory jsou teplota a pH prost edí, ale katalytickou aktivitu také mohou ovliv ovat různé látky, které se nazývají efektory nebo modifikátory. Efektory se d lí do dvou skupin, ty které zvyšují aktivitu pat í mezi positivní efektory neboli aktivátory, ty které naopak aktivitu snižují, pat í do skupiny negativních efektorů neboli inhibitorů [3]. Všeobecn aktivita enzymových reakcí roste se zvyšující se teplotou, avšak s růstem teploty dochází i k částečné nebo úplné denaturaci bílkovinné části enzymu a tím dochází k inaktivaci enzymu. Maximální teplota je dána termolabilitou enzymu, ale také je ovliv ována dobou působení [3][4]. Hodnota pH ovliv uje katalytickou aktivitu enzymů, protože enzymy pat í mezi polyamfolyty. V tšina enzymů působí jen v určité oblasti pH. Nejv tší aktivita je v tzv. optimálním pH, mimo tuto hodnotu aktivita klesá [3][4]. 2.4.1. ůktivita proteáz Proteázy jsou velmi významné enzymy, protože bílkoviny se ve velkém počtu vyskytují v bu kách, tvo í dokonce až 50 % bun čné sušiny. Proteázovou aktivitu najdeme jak v mikroorganismech, tak v rostlinných či živočišných bu kách. Proteázy katalyzují hydrolýzu proteinů na peptidy nebo hydrolýzu oligopeptidů na aminokyseliny. Bílkoviny mají vysokou molekulovou hmotnost a nemohou p echázet do bu ky, proto se první krok jejich degradace uskuteč uje mimo mikrobiální bu ku. Aminokyseliny a jiné sloučeniny s nízkou molekulární hmotností mohou být transportovány dovnit bu ky, kde probíhá jejich deaminace [13]. Tém všechny mikroorganismy, které se nacházejí v půd , jsou schopny degradovat bílkoviny, s čímž je spojené uvol ování amoniaku. Proteázy se v půd nacházejí v živých a aktivních bu kách, v mrtvých bu kách či jako volné enzymy absorbované na anorganické nebo organické částice. Aktivita proteáz v půd se m ní se zm nou ročních období a s hloubkou se aktivita snižuje [13][14].
13
Pro stanovení proteáz lze použít různé substráty, nejčast jší jsou kasein, azokasein, želatina, peptidy nebo albumin. Od použitého substrátu se liší i doba inkubace, která se pohybuje mezi dv ma až šestnácti hodinami. Optimální teplota pro stanovení proteáz se nachází okolo 55°C, p i teplot okolo 60°C již dochází k denaturaci bílkovinné části enzymu. Optimální hodnota pH se pohybuje okolo osmi [13][14]. 2.4.2. ůktivita celuláz Celulóza pat í mezi nejrozší en jší biopolymery, protože je strukturní polysacharid st n rostlinných bun k. Její degradace je velmi důležitý proces v p írod , protože zajišťuje rozklad rostlinných zbytků. Celulóza je tvo ena D-glukózovými jednotkami s βĚ1,4ěglykosidickými vazbami, které tvo í lineární polymer. Celulóza je ve vod nerozpustná, ale k vod má vysokou afinitu [15]. Celuláza katalyzuje hydrolytické št pení celulózy na její jednotky a je tvo ena nejmén t emi enzymy. β-glukosidáza uvol uje z celulooligosacharidů glukózu. Exo-β-1,4-glukanáza se váže na krystalickou celulózu a št pí celulooligosacharidy od neredukujícího konce molekuly. Endo-β-1,4-glukanáza št pí glykosidické vazby mezi nekrystalickými částmi molekuly celulózy [14][15][14][16]. Rozklad celulózy v půd je pomalý proces. Stupe krystalizace celulózy ovliv uje podmínky hydrolýzy, tento proces je také ovliv ován koncentrací, lokací a pohybem enzymů. Rychlost katalytické aktivity závisí na teplot , pH, koncentraci substrátu či množství vody. Nejoptimáln jší podmínky aktivity se pohybují v teplotním rozmezí mezi ň0°C až 50°C a pH mezi 5 a 7 [15]. V půd je celuláza nejvíce produkována houbami. Pouze n které druhy gram-pozitivní bakterie Actinomyces jsou schopny využívat celulózu jako zdroj uhlíku. Mezi producenty celulázy p i anaerobních podmínkách pat í grampozitivní bakterie Clostridium [16]. Metody stanovení aktivity celuláz jsou založeny na determinaci vznikajícího redukujícího cukru nebo uvol ovaného oxidu uhličitého [14][15]. 2.4.3. ůktivita ureáz Ureáza je velmi rozší ený enzym v p írod , je obsažen v mikrobiálních, rostlinných a živočišných bu kách. Tento enzym katalyzuje hydrolytické št pení močoviny na oxid uhličitý a amoniak, který je důležitý pro správný růst rostlin. Ureáza také katalyzuje hydrolýzu 1-hydroxymočoviny, 1,3-dihydroxymočoviny nebo N-aminomočoviny [17][4][18]. Existuje mnoho metod na stanovení ureázové aktivity v půd . V tšina metod je založena na determinování uvoln ného amoniaku p i inkubaci. Ostatní metody jsou založeny na stanovení zbylé močoviny či uvoln ného oxidu uhličitého p i inkubaci. Optimální podmínky pro aktivitu ureáz nejsou jednotné, n které zdroje uvád jí optimální pH mezi 6 až 7, jiné zdroje považují za optimální alkalické pH v rozmezí Ř,Ř až 10. Teplotní optimum se nachází okolo 60°C, denaturace enzymu nastává okolo 70°C. Vhodná teplota pro inkubaci se pohybuje v rozmezí 15°C až 40°C. Ureázová aktivita je velmi stabilní a není ovlivn na skladováním. Aktivita nezáleží na množství biomasy, ale ovliv uje ji koncentrace 14
kyslíku, t žké kovy nebo obsah dusíku. Inhibitory ureázové aktivity jsou významné pro zem d lství, kde zpomalují degradaci močoviny po hnojení [17][18]. 2.4.4. ůktivita lipáz Lipidy pat í mezi heterogenní sloučeniny, jejich společnou vlastností je nerozpustnost ve vod , ale rozpustnost v nepolárních rozpoušt dlech jako jsou chloroform nebo alkoholy. Jen z ídka se lipidy vyskytují v organismu ve volné form , čast ji jsou vázány s proteiny (lipoproteinyě nebo sacharidy Ělipopolysacharidyě. Významnou součástí půdních lipidů jsou triacylglyceroly, které jsou zásobní látkou rostlin a živočišných tkání [14][19]. První krok degradace lipidů je št pení tuků na mastné kyseliny a glycerol. Mastné kyseliny jsou uhlovodíkové et zce s karboxylovou skupinou. Mnoho p írodních mastných kyselin jsou cis-mononenasycené nebo polynenasycené deriváty. Za normálních podmínek se mastné kyseliny degradují v postupných krocích tzv. β-oxidaci s finálními produkty oxidu uhličitého a vody [14][19]. Lipázy pat í mezi karboxylesterázy, které št pí acylglyceroly, a d lí se do t í skupin. Lipázy první skupiny št pí ze všech t í pozic acylglycerolu a kompletn hydrolyzují triacylglyceroly. Druhá skupina lipáz uvol uje mastné kyseliny z vn jších pozic triacylglycerolu. T etí skupina lipáz hydrolyzuje pouze určité mastné kyseliny. V tšina lipáz produkována bakteriemi se adí mezi extracelulární enzymy, tedy enzymy produkované do prost edí. Tuto produkci ovliv uje ada faktorů, nejvíce pak teplota či pH prost edí, obsah dusíku, tuku nebo koncentrace kyslíku [14]. Lipázy lze stanovovat titračn , fotometricky či fluorescenčními metodami [14][19]. 2.4.5. ůktivita dehydrogenáz Dehydrogenázy pat í mezi oxidoreduktázy, katalyzující p enos vodíku v dýchacím et zci. Existují dva typy t chto enzymů, které se od sebe liší koenzymem, první typ enzymu má dinukleotid jako koenzym, který obsahuje nikotinamid. U druhého typu je koenzymem flavin. Dehydrogenázy se vyskytují u mikroorganismů, rostlin i živočichů a jsou pojmenovány podle substrátu, na kterém katalyzují dehydrogenaci [20].
15
3.
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
Cílem experimentální části této práce bylo stanovení enzymových aktivit Ěproteáz, celuláz, lipáz, dehydrogenáz a ureázě v kompostu a monitorování průb hu zm n t chto aktivit b hem Ň1 dnů kompostování za laboratorních podmínek. Průb h zm n aktivit klíčových enzymů byl porovnán s průb hem aktivit v kompostu za reálných podmínek a byla sledována rozdílnost procesu kompostování v laboratorních a reálných podmínkách.
3.1. Použité přístroje Analytické váhy – AND GR-202-EC Váhy – Scaltec SAS 50 Centrifuga – Eppendorf microcentrifuge 5417R Spektrofotometr – UV/VIS HELIOS DELTA Kuchy ský va ič – ETA pH meter – inoLab pH 720, Merci .s.r.o, Brno T epačka – IKA KS 130 basic Chladicí box Vortex – Heidolph, REAX top Termostat – LTE SCIENTIFIC LTD Magnetická míchačka a oh evem – Lavat
3.2. Použité chemikálie D-glukóza – Lachema, Brno Dihydrogenfosforečnan draselný p.a. – Lach Ner, Neratovice Dichloroisokyanurát sodný - Sigma-Aldrich, Nem cko Ethanol – Merci s.r.o., Brno Folin-Ciocaulteovo činidlo - Penta, Ing. Petr Švec Hydrogenarseničnan sodný heptahydrát – Lachema, Brno Hydrogenfosforečnan draselný – Lachema, Brno Hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát – Lach Ner, Neratovice Hydrogenuhličitan sodný – Lachema, Brno Hydroxid sodný p.a. – Lach Ner, Neratovice Chlorid amonný – Lach Ner, Neratovice Chlorid draselný – Lach Ner, Neratovice Kasein – Serva, N mecko 16
Karboxylmethylcelulóza – Serva, N mecko Kyselina boritá – Lach Ner, Neratovice Kyselina chlorovodíková p.a. – Lach Ner, Neratovice Kyselina octová p.a. – Lachema, Brno Kyselina sírová – Merci s.r.o., Brno Kyselina trichloroctová – Lach Ner, Neratovice Methanol – Merci s.r.o., Brno Močovina – Sigma-Aldrich, N m cko Molybdenan amonný tetrahydrát – Lachema, Brno Nitroprussid sodný – Lach Ner, Neratovice Octan sodný – Lachema, Brno p-nitrofenol – Lach Ner, Neratovice p-nitrofenylbutyrát – Sigma-Aldrich, N m cko p-nitrofenyllaureát – Sigma-Aldrich, N m cko Salicylát sodný – Sigma-Aldrich, N m cko Síran m ďnatý pentahydrát – Lach Ner, Neratovice Síran sodný – Lachema, Brno Tetraborát disodný dekahydrát – Sigma-Aldrich, N m cko Tetrafenyltetrazolium chlorid – Merck KGaA, N mecko Tyrosin – Serva, N mecko Uhličitan sodný – Lachema, Brno Vinnan draselno-sodný tetrahydrát – Lachema, Brno
3.3. Použité roztoky a jejich příprava 3.3.1. Roztoky pro stanovení aktivity proteáz 50 mM fosfátový pufr s hodnotou pH 7,5 Ve 400 ml destilované vody bylo rozpušt no ň,57 g K 2 HPO4 , poté bylo pH upraveno kyselinou octovou. Roztok 0,65% kaseinu 1,ň g kaseinu bylo rozpušt no ve Ň00 ml 50 mM fosfátového pufru. Roztok byl míchán a pomalu zah íván až na teplotu Ř0°C po dobu 10 minut. V průb hu zah ívání byl roztok promícháván až do docílení homogenní suspenze.
17
110 mM roztok kyseliny trichloroctové (TCA) Ve Ň00 ml destilované vody bylo rozpušt no 3,63 g TCA. 0,5 M roztok uhličitanu sodného Ve 100 ml destilované vody bylo rozpušt no 5,Ňř g Na2CO3. Standardní roztok tyrosinu 0,004 g tyrosinu bylo rozpušt no ve Ň0 ml 50 mM fosfátovém pufru. 3.3.2. Roztoky pro stanovení aktivity celuláz Substrát karboxymethylcelulóza (CMC) 1 g CMC byl rozpušt n v 50 ml destilované vody, po rozpušt ní bylo p idáno asi 40 ml základního roztoku octanového pufru. Poté bylo pH upraveno kyselinou octovou na hodnotu 5,4. Nakonec byl objem upraven na 100 ml. Octanový pufr pH 5,4 2,7 g bezvodého octanu sodného bylo rozpušt no ve 100 ml destilované vody. U zbylého roztoku, který nebyl použit pro p ípravu substrátu, bylo pH upraveno kyselinou octovou na pH 5,4. Somogyi činidlo I Za mírného zah ívání a míchání bylo 144 g Na2SO4 rozpušt no v destilované vod . V další kádince bylo rozpušt no 1Ň g C 2 H 4 O 4 KNa 4 H 2 O , 16 g NaHCO3 a 18 g Na2CO3 ve 200 ml destilované vody. Po rozpušt ní všech látek byly roztoky smíchány a objem byl dopln n destilovanou vodou na 800 ml. Somogyi činidlo II Ve Ň00 ml destilované vody bylo rozpušt no ň6 g Na2SO4 a 4 g CuSO 4 5 H 2 O . Nelsonovo činidlo V 450 ml destilované vody bylo rozpušt no Ň5 g NH 4 6 Mo7 O 24O 4 4 H 2 O , poté bylo p idáno Ň1 ml koncentrované kyseliny sírové, po promíchání byl p idán roztok p ipravený rozpušt ním ň g Na HAsO4 7 H 2 O ve Ň5 ml. Nakonec byl roztok promíchán a uložen na 48 hodin do termostatu p i teplot ň7°C. Základní roztok glukózy 0,2 g/l 0,00Ň g glukózy bylo rozpušt no v 10 ml destilované vody.
18
3.3.3. Roztoky pro stanovení aktivity ureáz Roztok močoviny 0,48 g močoviny bylo rozpušt no asi v Ř0 ml destilované vody a poté byl objem dopln n na 100 ml destilovanou vodou. Roztok chloridu draselného 74,6 g KCl bylo rozpušt no asi v 500 ml destilované vody, p idáno 10 ml 1 M roztoku kyseliny chlorovodíkové a destilovanou vodou byl objem dopln n na 1 000 ml. 0,3 M roztok hydroxidu sodného 12 g NaOH bylo rozpušt no v 1 000 ml destilované vody. Roztok salicylátu sodného 17 g salicylátu sodného bylo rozpušt no ve vod , poté bylo p idáno 1Ň0 mg nitroprussidu sodného a po rozpušt ní byl objem dopln n na 100 ml destilovanou vodou. 0,1% roztok dichloroisokyanurátu sodného 0,1 g dichloroisokyanurátu sodného bylo rozpušt no ve 100 ml destilované vody. Borátový pufr pH 10 50 ml 0,2 M roztoku kyseliny borité bylo smícháno se 115 ml 0,2 M roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Objem byl dopln n 0,05M roztokem tetraborátu sodného na celkový objem Ň00 ml a pH bylo upraveno na hodnotu 10 p ídavkem 0,Ň M roztoku NaHCO3. Roztok amonných standardů I 0,ňŘŇ g chloridu amonného bylo rozpušt no v destilované vod a byl dopln n na celkový objem 100 ml. Roztok amonných standardů II Roztok I byl rozpipetován do 100 ml odm rných ban k po 0,0; 1,0; 1,5; Ň,0; Ň,5 ml a dopln n po značku roztokem chloridu draselného. 3.3.4. Roztoky pro stanovení aktivity lipáz 2,5 mM substrát p-nitrofenyllaureát (p-NFL) 0,04 g p-NFL bylo rozpušt no asi ve Ň0 ml ethanolu, poté byl roztok dopln n ethanolem na celkový objem 50 ml. 2,5 mM substrát p-nitrofenylbutyrát (p-NFB) 0,026 g p-NFB bylo rozpušt no asi ve Ň0 ml ethanolu, po rozpušt ní byl objem dopln n ethanolem na 50 ml. 19
Hydrogenfosforečnanový pufr s pH 7,1 1,43 g Na 2 HPO4 12 H 2 O a 0,55 g KH2PO4 bylo rozpušt no v Ň40 ml destilované vody, po rozpušt ní bylo pH upraveno 1 M roztokem hydroxidu sodného. Standardní roztok 1 mM p-nitrofenolu (p-NF) 13,9 mg p-NF bylo rozpušt no ve 100 ml destilované vody. 0,1 M roztok uhličitanu sodného 1,06 g Na2CO3 bylo rozpušt no ve 100 ml destilované vody. 3.3.5. Roztoky pro stanovení aktivity dehydrogenáz 3% roztok trifenyltetrazolium chloridu (TTC) 0,ň g TTC byly rozpušt ny v 10 ml destilované vody. Standardní roztok trifenylformazanu (TFF) 0,125 μg TFF bylo rozpušt no ve 100 ml destilované vody.
3.4. Metody stanovení enzymových aktivit 3.4.1. Stanovení enzymové aktivity proteáz M ení aktivity proteáz probíhalo metodou podle Ladda a Butlera za využití kaseinu jako substrátu. Proteázy št pí peptidové vazby a z kaseinu jsou uvol ovány aminokyseliny, nejdůležit jší je však tyrosin. Tyrosin reaguje s Folin-Ciocalteuovým činidlem za vzniku mod e zbarveného chromoforu, ten je vhodný pro spektrofotometrické stanovení [13]. Čím více se v kompostu nachází proteáz, tím více se z kaseinu uvolní tyrosinu a tím roste i hodnota absorbance. Aktivita proteáz je poté p epočítána podle kalibrační k ivky a je udávána v jednotkách hmotnosti uvoln ného tyrosinu na jeden gram suchého kompostu za dv hodiny Ěmg tyr/g sušiny/2 hod). Do erlenmayerových ban k byl navážen 1 g p irozen vlhkého kompostu, do ba ky bylo p idáno 5,0 ml 0,65% roztoku kaseinu a 5,0 ml 50 mM fosfátového pufru. Ba ky byly vloženy na Ň hodiny do termostatu vyh átého na 50°C. Kontrolní vzorek neobsahoval substrát, pouze bylo k 1 g kompostu p idáno 5,0 ml 50 mM fosfátového pufru. Po inkubaci byl do kontrolního vzorku p idán substrát a reakce byla zastavena p idáním 5,0 ml roztoku TCA do všech ban k. Obsah ban k byl centrifugován 10 minut p i 4°C a 10 000 rpm. Následné stanovení aktivity proteáz probíhalo podle metody Ladda a Butlera [13]. Výsledná absorbance byla m ena proti kontrolnímu vzorku p i vlnové délce 660 nm.
20
Aktivita proteáz byla vypočtena ze vztahu: a proteáz
C 15 mg tyr/gsušiny/Ň hod , sušina
kde C je nam ená koncentrace tyrosinu [mg/ml], 15 je celkový objem p idaných roztoků a sušina je suchá hmotnost 1 g p irozen vlhkého kompostu. Kalibrační k ivka tyrosinu (Graf 1) byla sestavena z nam ených absorbancí základního roztoku tyrosinu o koncentraci 0,2 mg/ml. Kalibrační ada byla p ipravena napipetováním roztoku do zkumavek v objemu 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 ml. Zkumavka do které nebyl napipetován základní roztok tyrosinu sloužila jako kontrolní vzorek. Objem ve všech zkumavkách byl dopln n na Ň ml destilovanou vodou. Do každé zkumavky bylo p idáno 5 ml 0,1 mM roztoku uhličitanu sodného a 1 ml Folin-Ciocalteuového činidla. Po ň0 minutách inkubace p i laboratorní teplot byla zm ena absorbance p i 660 nm.
Graf 1 Kalibrační křivka tyrosinu
3.4.2. Stanovení enzymové aktivity celuláz Aktivita celuláz byla stanovena metodou Somogyiho-Nelsona. Tato metoda je založená na stanovení redukujících cukrů. Celuláza št pí substrát carboxylmethylcelulózu na redukující cukry, ty redukují m ďnatou sůl obsaženou v Somogyiho činidle na m ďnou sůl. Ta následn reaguje s Nelsonovým činidlem za vzniku modrozeleného komplexu, který je vhodný pro spektrofotometrické stanovení [15][21]. Absorbance je potom úm rná množství uvoln ného redukujícího cukru. Jednotka celulázové aktivity je vyjád ena množstvím glukózy, která byla uvoln na činností celuláz ze substrátu na jeden gram suchého kompostu za 24 hodin (mg glukózy/g sušiny/24 hod). Do erlenmayerových ban k byl navážen 1 g p irozen vlhkého kompostu, dále bylo p idáno 1,5 ml substrátu ĚCMCě a 1,5 ml octanového pufru pH 5,4. Kontrolní vzorek 21
neobsahoval substrát, pouze octanový pufr a navážku kompostu. Ba ky byly po dobu 24 hodin inkubovány v termostatu vyh átém na 50°C. Po inkubaci byl do kontrolního vzorku p idán substrát a všechny vzorky byly centrifugovány 10 minut p i 4°C a 10 000 rpm. Další postup stanovení byl podle metody Somogyi–Nelson [22][23]. Nakonec byla zm ena absorbance proti kontrolnímu vzorku p i 5ň0 nm. Aktivita celuláz byla vypočtena ze vztahu: aceluláz
C3 mg glukózy/g sušiny/Ň4 hod , sušina
kde C je nam ená koncentrace glukózy [mg/ml], ň je celkový objem p idaných roztoků ke kompostu a sušina je suchá hmotnost 1 g p irozen vlhkého kompostu. Kalibrační k ivka pro celulázovou aktivitu (Graf 2) byla p ipravena za pomocí základního roztoku glukózy o koncentraci 0,Ň mg/ml. Kalibrační ada byla p ipravena tak, že byl základní roztok rozpipetován do zkumavek o objemech 0,Ň; 0,4; 0,6; 0,Ř; 1 ml a objem ve zkumavkách byl dopln n destilovanou vodou na 1 ml. Kontrolní vzorek obsahoval 1 ml destilované vody. Do všech zkumavek byl p idán 1 ml roztoku Smogyiho činidla I a Smogyiho činidla II, smíchaných v pom ru 1:4. Zkumavky byly 10 minut pova eny. Po zchladnutí byl do zkumavek p idán 1 ml Nelsnova činidla a 7 ml destilované vody. Následn byla m ena absorbance p i 5ň0 nm proti kontrolnímu vzorku.
Graf 2 Kalibrační křivka glukózy
3.4.3. Stanovení aktivity ureáz Metoda stanovení aktivity ureáz podle Kendelera a Gerbera je založena na kolorimetrickém stanovení uvoln ného amoniaku [17]. Inkubací vzorku kompostu s roztokem močoviny se uvol uje amoniak, ten je následn extrahován do roztoku KCl. Analyzovaný indofenol vzniká reakcí roztoku salicylátu sodného s amoniakem v p ítomnosti 22
dichloroisokyanurátu sodného, vzniká zelen zbarvený komplex, který je vhodný pro spektrofotometrické stanovení ĚObrázek ň). Tato metoda se vyznačuje vysokou citlivostí a stabilitou barevného komplexu. Jednotka aktivity ureáz udává množství NH4–N na 1 g suchého kompostu za Ň hodiny Ěmg NH4–N/g sušiny/2 hod). Do uzavíratelných ban k byl navážen 1 g p irozen vlhkého kompostu, dále bylo p idáno 0,5 ml roztoku močoviny, 4 ml borátového pufru a uzav ené ba ky byly Ň hodiny inkubovány p i ň7°C. Kontrolní vzorek byl p ipraven z 0,05 ml destilované vody a 4 ml borátového pufru. Po inkubaci byl do kontrolního vzorku p idán roztok močoviny. Do všech ban k bylo p idáno 6 ml roztoku KCl a na ň0 minut byly ba ky umíst ny do t epačky. Po centrifugaci bylo stanovení provedeno podle metody Kendelera a Gerbera [18]. Výsledná absorbance byla m ena proti kontrolnímu vzorku p i 690nm. Aktivita ureáz byla vypočítána podle vzorce: aureáz
C 10,5 10 mg NH 4 N/g sušiny/Ň hod , sušina
kde C je nam ená koncentrace NH4–N [mg/ml], 10,5 je celkový objem p idaných roztoků ke kompostu, 10 je faktor ed ní a sušina je suchá hmotnost 1 g p irozen vlhkého kompostu.
Obrázek 3 Barevná přem na při ureázové aktivit
Kalibrační k ivka (Graf 3) byla p ipravena z kalibrační ady roztoků, které byly p ipraveny za pomoci roztoků amonných standardů I a II. Z roztoku amonných standardů II bylo 0,5 ml pipetováno do zkumavky, dále byly p idány 4,5 ml destilované vody, Ň,5 ml roztoku Na–salicylát/NaOH a 1 ml roztoku dichloroisokyanurátu sodného. Takto p ipravené roztoky se nechaly stát p i laboratorní teplot ň0 minut a poté byla zm ena absorbance proti slepému vzorku p i 6ř0 nm.
23
Graf 3 Kalibrační křivka pro NH4–N
3.4.4. Stanovení aktivity lipáz Metoda stanovení aktivity lipáz závisí na št pení substrátu, mezi nejčast jší substráty pat í p-nitrofenyl estery mastných kyselin. Št pením substrátu vzniká p-nitrofenol (p-NF), který lze díky žlutému zbarvení stanovovat spektrofotometricky. Intenzita zbarvení závisí na koncentraci p-nitrofenolu. Jednotka aktivity lipáz udává množství p-nitrofenolu v 1 g suchého kompostu za jednu hodinu Ěmg p-NF /g sušiny/1 hod) [19]. P ibližn ze 2 g p irozen vlhkého kompostu a z 10 ml destilované vody byl p ipraven výluh. 1 ml extraktu z výluhu byl následn z ed n destilovanou vodou v pom ru 1:1. 1Ň5 μl z ed ného extraktu bylo pipetováno do zkumavky, bylo p idáno 1Ň5 μl substrátu, do jedné zkumavky byl použit substrát p-NFL a do druhé zkumavky se stejným vzorkem byl použit substrát p-NFB. Nakonec bylo p idáno 1,625 ml hydrogenfosforečnanového pufru. Kontrolní vzorek obsahoval 125 μl destilované vody, 1Ň5 μl substrátu a 1,6Ň5 ml hydrogenfosforečnanového pufru. Takto p ipravené zkumavky byly 20 minut inkubovány p i teplot ň7°C. Po inkubaci byla zm ena absorbance proti kontrolnímu vzorku p i 4Ň0 nm [24]. Aktivita lipáz byla vypočtena ze vzorce: alipáz
C 1,875 10 3 2 mg p - NF/g sušiny/1 hod , sušina
kde C je nam ená koncentrace p-nitrofenolu [mg/ml], 1,Ř75 je celkový objem p idaných roztoků ke kompostu, 10 je faktor ed ní, ň je p epočet na 1 hodinu, Ň je faktor ed ní a sušina je suchá hmotnost 1 g p irozen vlhkého kompostu. Kalibrační k ivka (Graf 4) pro aktivitu lipáz byla p ipravena ze základního roztoku p-nitrofenolu. Základní roztok byl napipetován do zkumavek v objemu 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 a 0,5 ml. Objem byl dopln n vodou na celkový objem 0,5 ml. Kontrolní vzorek obsahoval 24
0,5 ml vody. Do všech zkumavek bylo p idáno ň,Ň5 ml hydrogenfosforečnanového pufru. Zkumavky byly vloženy na ň0 minut do termostatu vyh átého na ň7°C. Po inkubaci bylo p idáno 0,5 ml 0,1 M uhličitanu sodného a byla zm ena absorbance p i 4Ň0 nm.
Graf 4 Kalibrační křivka p-nitrofenolu
3.4.5. Stanovení aktivity dehydrogenáz Metoda stanovení aktivity dehydrogenáz je založena na p ijímání vodíku. Jako substrát byl použit trifenyltetrazolium chlorid, což je bezbarvá látka, avšak pomocí dehydrogenáz akceptuje vodík a je redukován na červen zbarvený trifenylformazan (TFF), který je vhodný pro spektrofotometrické stanovení [20]. Intenzita zbarvení roztoku závisí na množství dehydrogenáz v kompostu. Obsah dehydrogenáz vypovídá o množství živých mikroorganismů v půd . Jednotka aktivity udává množství trifenylformazanu na jeden gram suchého kompostu za 24 hodin (μg TFF/g sušiny/24 hod). Do erlenmayerových ban k bylo naváženo 0,75 g p irozen vlhké půdy. K navážkám bylo p idáno 1,5 ml destilované vody a 1,5 ml ň% roztoku TTC. Blank obsahoval Ň,Ň5 ml vody a 1,5 ml ň% roztoku TTC. Ba ky byly ve tm inkubovány Ň4 hodin v termostatu p i ň7°C. Následné stanovení aktivity dehydrogenáz bylo podle Tabatabai [25] a byla m ena absorbance p i 4Ř5 nm. Aktivita dehydrogenáz byla vypočte podle vzorce : a dehydrogenáz
C8 g TFF/g sušiny/Ň4 hod, sušina
kde C je nam ená koncentrace trifenylformazanu [μg/ml], Ř je celkový objem p idaných roztoků ke kompostu a sušina je suchá hmotnost 1 g p irozen vlhkého kompostu.
25
Kalibrační k ivka pro aktivitu dehydrogenáz (Graf 5) byla sestavena ze standardního roztoku trifenylformazanu. Roztok byl rozpipetován do zkumavek tak, aby jeho koncentrace ve zkumavkách byla 0,001Ň5; 0,00Ň5; 0,005; 0,01 a 0,0Ňμg/ml. Po hodin byla m ena absorbance p i 4Ř5 nm proti kontrolnímu vzorku, který obsahoval destilovanou vodu.
Graf 5 Kalibrační křivka trifenylformazanu
3.4.6. Kompostování Kompost, byl po odebrání z kompostárny zamražen. Na začátku experimentu byly zm eny enzymové aktivity celuláz, proteáz, lipáz, dehydrogenáz a ureáz. Poté bylo do plastové uzavíratelné krabičky naváženo 56 g p irozen vlhkého kompostu. Ve víku byly ud lány otvory, aby byl zajišt n p ístup vzduchu ke kompostu a nedocházelo k anaerobním d jům. Uzav ená krabička s kompostem byla uchovávána t i týdny v termostatu vyh átého na 55°C. Po 4, 7, 14 a Ň1 dnech byly zm eny enzymové aktivity v kompostu. Kompost byl pravideln zvlhčován definovaným množstvím destilované vody. Současn bylo m eno pH kompostu. Pro srovnání byla stanovena aktivita klíčových enzymů na počátku kompostování a po 21 dnech ve stejném kompostovém vzorku, ale v reálných podmínkách. Kompost v reálných podmínkách podléhal procesu kompostování v kompostárn , kde byl kompost provzduš ován, ale nebyla um le udržována teplota. V kompostu se vyskytovala i první mezofilní fáze.
26
4.
VÝSLEDKY ů DISKUZE
Kompost je využíván nejen k užitečnému zpracování biologicky degradovatelného odpadu, ale také navrací do půdy živiny nezbytné pro správný růst rostlin. Současn pomáhá v zatrav ování poškozených ploch nap . po t žb d eva nebo je využíván místo chemických post iků na ochranu rostlin proti různým chorobám. Stanovování enzymů v kompostu slouží jako ukazatel kvality kompostu nebo určení fáze kompostování. Aktivita jednotlivých enzymů závisí na složení kompostů a způsobu kompostování, ale také na hloubce, ze které je vzorek odebírán. Experimentální část byla zam ena na sledování m nící se aktivity enzymů v laboratorních podmínkách. Pro srovnání s reálným prost edím byla aktivita klíčových enzymů m ena na počátku a na konci experimentu p ímo v kompostu v kompostárn .
4.1. M ření pH v kompostu Hodnota pH hraje v kompostu důležitou roli, jeho hodnota ovliv uje činnost enzymů a průb h chemických reakcí. Na začátku experimentu byla hodnota pH neutrální tedy 7,0ň. Hodnota pH kompostu na začátku může být rozdílná podle složení kompostu, ale optimální pH pro degradaci se pohybuje okolo neutrální hodnoty tedy 6 až Ř, protože v tšina mikroorganismů vykazuje nejp ízniv jší nárůst a enzymatickou aktivitu v tomto rozmezí [26]. V první fázi experimentu došlo ke zvýšení hodnoty pH (Graf 6), což mohlo být způsobeno velkou produkcí amoniaku, který zvyšuje alkalitu kompostu. Následný pokles pH mohl být vlivem produkce organických kyselin vzniklých degradací esterů či lipidů. Organické kyseliny jsou velmi t kavé, a protože bylo zajišt no provzduš ování, tak se po 7 dnech experimentu pH kompostu op t začalo zvyšovat.
Graf 6 Zm na pH
27
Podle studie Justyny Bohacz a Teresy Korniłłowicz-Kowalsky hodnota pH v prvních t ech týdnech u kompostu s nižším pom rem uhlíku a dusíku spíše rostla, poté však následoval pokles pH vlivem zvýšení koncentrace NH4–N a SO4–S iontů, což indikuje tvorbu kyselého síranu amonného [27]. Avšak maximální hodnota pH p i jejich experimentu dosáhla pouze hodnoty Ř. Vyšší hodnota pH v m eném kompostu může být dána složením kompostu a také způsobem kompostování nebo malým vzorkem kompostu v experimentálním laboratorním kompostovacím procesu.
4.2. ůktivita celuláz Celulázy degradují celulózu a jejich činnost závisí zejména na typu celulolytických mikroorganismů, které se nacházejí v kompostu [28]. Hodnota udávající aktivitu celuláz v grafu byla vypočtena prům rem osmi hodnot, které byly nam eny p i jednotlivých odb rech. Aktivita je vyjád ena v množství glukózy v mg na 1 g suchého kompostu za 24 hodin inkubace. V grafickém znázorn ní ĚGraf 7ě lze v prvních 4 dnech sledovat nárůst celulolytické aktivity, což může být způsobeno degradací lehce p ístupných a rozložitelných sloučenin jako jsou nap íklad jednodušší polysacharidy nap . polyglukan. Po prvním týdnu experimentu aktivita výrazn klesla pravd podobn díky vyčerpání t chto sloučenin. Poté aktivita až do konce experimentu op t mírn rostla, začaly se totiž rozkládat i hů e degradovatelné sloučeniny, mezi které pat í celulóza, hemicelulóza, pektin či lignin.
Graf 7 Pr b h aktivity celuláz
M ený kompost v laboratorních podmínkách byl uchováván p i teplot 55°C po celou dobu experimentu. Lze tedy p edpokládat, že probíhala pouze termofilní fáze kompostování. Tato fáze je klíčová, protože v ní probíhá v tšina degradace biologického odpadu a jsou v ní 28
hubeny patogenní mikroorganismy, semena plevelů a další nežádoucí látky. V reálném kompostu probíhají všechny fáze kompostování, od pomalého zah ívání kompostu Ěmezofilní fázeě, která trvá n kolik dní. Po zvýšení teploty nad 40°C nastává termofilní fáze, která muže trvat v ádu dnů, týdnů či m síců. Nakonec nastává fáze zrání, kdy teplota op t klesá, tato fáze je nejdelší a trvá n kolik m síců. Počáteční hodnoty aktivity celuláz v kompostu za laboratorních a reálných podmínek jsou srovnatelné (Graf 8). Aktivita na konci experimentu je již rozdílná. Za laboratorních podmínek probíhala degradace celulózy po celou dobu experimentu, avšak nejvíce v prvních dnech. Mikroorganismy, které produkují celulázy, pat í spíše mezi termofilní mikroorganismy, tudíž se vyskytují až v termofilní fázi kompostování. V kompostu za reálných podmínek probíhalo kompostování pomaleji a lze p edpokládat, že termofilní fáze nastala až po n kolika dnech. V reálném kompostu díky jiným teplotním podmínkám a v tšímu množství kompostu se mohlo vyskytovat více mikroorganismů produkující celulázy, proto je nam ená aktivita vyšší, než maximální aktivita celuláz v kompostu za laboratorních podmínek.
Graf 8 Porovnání aktivity celuláz v reálném a laboratorním kompostu
Jistou podobnost průb hu aktivity celuláz můžeme sledovat v experimentu Justyny Bohacz a Teresy Korniłłowicz-Kowalsky, které se zabývaly enzymatickými zm nami v kompostu obsahující ku ecí pe í. Z experimentu bylo zjišt no, že aktivita celuláz souvisí s pom rem uhlíku a dusíku v kompostu. Komposty s nižším pom rem vykazovaly vyšší aktivitu celuláz než komposty s vyšším pom rem [27]. Spot eba uhlíku a dusíku se b hem kompostování liší, m ní se jejich pom r, což ovliv uje aktivitu celuláz. Pom r uhlíku a dusíku ĚC:Ně se m ní s různým složením kompostu, správný pom r v čerstvém kompostu by se m l pohybovat v rozmezí ň0–35:1 (C:N) [6].
29
4.3. ůktivita proteáz Aktivita proteáz úzce souvisí s kolob hem dusíku, protože proteázy katalyzují hydrolýzu bílkovin. Aktivita proteáz vynášená do grafu je dána prům rem devíti hodnot aktivity zm ené p i každém odb ru a je vyjád ena množstvím uvoln ného tyrozinu v mg na 1 g suchého kompostu za Ň hodiny inkubace. V prvních dnech byl pozorován nárůst proteázové aktivity (Graf 9). P íčinou růstu aktivity by mohla být p ítomnost snadno rozložitelných oligopeptidů či polypeptidů v testovaném kompostu. Kolem 7. dne experimentu došlo k výraznému poklesu proteolytické aktivity. Aktivita proteáz může být potlačena vysokou koncentrací konečných produktů, mezi které pat í aminokyseliny, amonné ionty nebo snadno metabolizovatelné zdroje uhlíku [29]. V druhém týdnu byl op t zaznamenán nárůst proteolytické aktivity, což pravd podobn souviselo s degradací hů e rozložitelných látek, mezi které pat í nap íklad dlouhé bílkovinné et zce. Na konci experimentu však aktivita proteáz výrazn klesla, p íčinou mohlo být vyčerpání substrátu či op tovné nahromad ní konečných produktů, které inhibují sekreci proteáz.
Graf 9 Pr b h aktivity proteáz
P i srovnání aktivity proteáz (Graf 10) v laboratorních a reálných podmínkách byly počáteční aktivity velmi podobné, avšak aktivita proteáz za laboratorních podmínek byla mírn vyšší. Tato rozdílnost mohla vzniknout p i odb rech vzorků, protože aktivita proteáz se s hloubkou v kompostu snižuje [13]. Aktivita proteáz v kompostu za laboratorních a reálných podmínek po 21 dnech se od sebe výrazn liší. Za laboratorních podmínek byl kompost udržován p i teplot 55°C a po celý průb h experimentu probíhala termofilní fáze. Zato v reálných podmínkách kompost procházel i mezofilní fází, takže průb h kompostování byl pomalejší. Aktivita proteáz nam ená po Ň1 dnech v reálném kompostu je velmi podobná 30
aktivit proteáz po čty ech dnech v kompostu za laboratorních podmínek. Tato skutečnost je dána rozdílnou rychlostí kompostování.
Graf 10 Porovnání aktivity proteáz v reálném a laboratorním kompostu
Počáteční průb h protázové aktivity v tomto experimentu koreluje se studií Castaldiho a kol., kdy p i kompostování tuhého komunálního odpadu byl pozorován nárůst aktivity proteáz v prvních dnech experimentu v důsledku dostupnosti lehce rozložitelných polypeptidů. Od t etího týdne experimentu aktivita klesala, v posledních p ibližn 50 dnech experimentu zůstala aktivita stabilní [5].
4.4. ůktivita lipáz Lipolytické enzymy Ělipázy a esterázy) katalyzují hydrolýzu triacylglycerolů nebo esterů a uvol ují volné organické kyseliny [30]. Lipázy jsou unikátní svým chemicko-fyzikálním charakterem reakcí, které katalyzují na rozhraní tuk–voda. Mezi nejv tší producenty lipáz v kompostu pat í Actinomycetes. Lipázy ale také produkují bakterie či houby [31]. Hodnota aktivita lipáz, která byla použita do grafu, byla získána jako prům r dvou paralelních stanovení v jednom odb ru. Chybové úsečky jsou hodnoty sm rodatných odchylek. Jednotka aktivity lipáz je dána jako množství uvoln ného p-nitrofenolu z 1 g suchého kompostu za 1 hodinu. Jako substrát byl použit Ň,5 mM p-nitrofenylbutyrát a Ň,5 mM p-nitrofenyllaureát. Tyto substráty se od sebe liší délkou postranního et zce mastné kyseliny. Substrát p-NFB má kratší et zec, proto je i snadn ji degradován. Průb h t chto k ivek je rozdílný. Lipázy vykazují selektivitu vůči st edn dlouhým nebo dlouhým et zcům, jako je nap íklad p-NFL. Esterázy naopak p ednostn št pí krátké et zce, mezi které pat í nap íklad p-NFB [30]. Z průb hu k ivek aktivit (Graf 11) za použití obou substrátů lze p edpokládat, že se 31
v kompostu na začátku experimentu vyskytovalo více p irozených substrátů s krátkými et zci, které byly v kompostu p ítomné nebo mohly vzniknout nap íklad jako důsledek působení jiných enzymů a proto byla na počátku vyšší aktivita vůči p-NFB. Na konci experimentu byla aktivita naopak vyšší vůči p-NFL, proto lze p edpokládat, že po vyčerpání snadn ji dostupných substrátů se začaly št pit i p irozené substráty s delšími et zci a tudíž byla zaznamenaná i v tší produkce lipáz. Rozdílnost průb hu k ivek také může být dána rozdílností vyskytujících se mikroorganismů v průb hu experimentu, ale také rozdílnými podmínkami pro dané enzymy.
Graf 11 Pr b h aktivity lipáz
Také v kompostu za reálných podmínek (Graf 12) je průb h aktivit za využití p-NFB a p-NFL jako substrátů rozdílný. Hodnota aktivity za použití rozdílných substrátu se liší jak na počátku tak na konci experimentu. Lze p edpokládat, že v obou p ípadech se v kompostu za reálných podmínek vyskytovalo více p irozených substrátů s dlouhými et zci, proto je aktivita vyšší vůči p-NFL. Na základ srovnání aktivit za reálných a laboratorních podmínek lze p edpokládat, že v reálném kompostu, kde byly aktivity výrazn vyšší, byly vhodn jší podmínky pro život mikroorganismů produkujících lipázy či esterázy díky vyšší koncentraci p irozených substrátů.
32
Graf 12 Porovnání aktivity lipáz v reálném a laboratorním kompostu
Lipázy jsou dnes velmi využívanými enzymy v průmyslu, nejžádan jší jsou práv lipázy produkované termofilními mikroorganismy. Lipázy našly využití nap íklad p i výrob bionafty, v léka ství, v kosmetice, p i čišt ní odpadních vod apod. Mezi producenty lipáz, které se používají v průmyslu, pat í nap íklad Bacillus subtilis, který se vyskytují také v kompostu [2][32]. Lipázy se také využívají p i kompostování. Očkováním Thermoactinomyces vulgaris A31, které produkují termotolerantní lipázy, do potraviná ského odpadu se výrazn snižuje obsah surového tuku a také se snižuje doba zrání kompostu [33].
4.5. ůktivita dehydrogenáz Aktivita dehydrogenáz pat í mezi nejčast ji sledované aktivity enzymů v kompostu, protože koreluje s celkovým množstvím mikroorganismů. Aktivita dehydrogenáz byla stanovena jako hmotnost uvoln ného trifenylformazanu vyjád ená v μg na 1 g suchého kompostu za 24 hodin inkubace. Pro každý odb r byly stanoveny čty i hodnoty aktivity dehydrogenáz, do výsledného grafu byl použit prům r t chto hodnot, chybové úsečky byly sestrojeny z jejich sm rodatné odchylky. S p ítomností snadno rozložitelných substrátů, které jsou zdrojem uhlíku, narůstá počet mikroorganismů, což bylo p íčinou počátečního nárůstu aktivity dehydrogenáz (Graf 13). Lze p edpokládat, že degradací lehce rozložitelných sloučenin Ěoligopeptidy, polyglukaně došlo ke zvýšení teploty a s rychlým nárůstem koncentrace mikroorganismů se v kompostu zvýšila i koncentrace již degradovaných sloučenin a produktů z metabolických drah, což m lo za následek zvýšení pH. V kompostu nastaly nep íznivé podmínky pro činnost mikroorganismů, proto aktivita dehydrogenáz do konce prvního týdne op t klesá. 33
S optimálními podmínkami pro rozvoj op t roste činnost mikroorganismů a tím i aktivita dehydrogenáz. Do konce experimentu byl trend aktivity dehydrogenáz vzrůstající.
Graf 13 Pr b h aktivity dehydrogenáz
Aktivita dehydrogenáz je také ovlivn na stylem kompostováním a materiálem, který je kompostován. P i srovnání aktivity dehydrogenáz v kompostu, který obsahoval ku ecí pe í a slámu nebo ku ecí pe í bez p ídavku slámy, byla aktivita dehydrogenáz výrazn vyšší u kompostu, který obsahoval slámu. Nárůst biomasy byl pravd podobn způsoben snadno dostupným zdrojem uhlíku [27]. P i kompostování selektivn sbíraného tuhého komunálního odpadu a rostlinného odpadu v trapézových hromadách o velikosti Ř m3, kde byla hromada provzduš ována, byl průb h aktivity dehydrogenáz podobný. Aktivita dehydrogenáz v prvních dvou týdnech významn rostla, poté až do konce experimentu spíše klesala [5]. Nárůst aktivity dehydrogenáz byl spjat s nárůstem mikrobiální činnosti v termofilní fázi kompostování. Ve fází zrání aktivita dehydrogenáz klesá což potvrzuje i studie provedená R. Barrenem a kol. [34]. Aktivita dehydrogenáz vykazuje v termofilní fázi korelaci s teplotou a je také vhodná k popisu biologické aktivity b hem celého procesu kompostování. Z literatury je známo, že aktivita dehydrogenáz dosahuje nejvyšší hodnoty ke konci termofilní fáze [34]. Toto tvrzení koreluje s nam enými hodnotami aktivity dehydrogenáz v tomto experimentu, protože aktivita dehydrogenáz na konci experimentu dosahovala nejvyšší hodnoty.
4.6. ůktivita ureáz Ureázy se také podílí na kolob hu dusíku, št pí močovinu na oxid uhličitý a amoniak, který v závislosti na pH může tvo it amonné soli. Aktivita ureáz je vyjád ena jako hmotnost 34
NH4–N v mg vztažené na 1 g suchého kompostu za Ň hodiny inkubace. Hodnota vynesená do grafu je dána prům rem devíti nam ených hodnot z každého odb ru. Aktivita ureáz (Graf 14) má zcela odlišný charakter než ostatní aktivity m ené v kompostu. Hodnota aktivity v prvním týdnu rapidn klesala, od sedmého dne až do konce experimentu zůstala tém nezm n ná. Aktivita ureáz je závislá na množství mikrobiální biomasy, také ji může inhibovat nahromad ní NH4–N. S postupující dobou kompostování aktivita ureáz klesá pravd podobn vzhledem k vyčerpání dostupných dusíkatých sloučenin [27].
Graf 14 Pr b h aktivity ureáz
Podle studie Paola Castaldiho a kol. ureázová aktivita úzce souvisí s cyklem dusíku, protože se podílí na hydrolýze močoviny na amonné ionty a oxid uhličitý. Na počátku experimentu aktivita ureáz rostla díky velké dostupnosti ve vod rozpustného dusíku. Ve čtvrtém týdnu aktivita ureáz klesá se zvyšující se koncentrací ve vod rozpustných dusičnanů, které aktivitu ureáz snižují. V tomto období lze také p edpokládat rozvoj autotrofních nitrifikačních bakterií [5].
35
5.
ZÁV R
Kompostování je velice známý proces sloužící k biologické stabilizaci pevného organického odpadu. Monitorování enzymových aktivit poskytuje cenné informace o průb hu kompostovacího procesu a o jeho zm nách. Srovnání produkce klíčových enzymů v průb hu kompostování p i kontrolovaných laboratorních podmínkách a v reálné kompostové zakládce p ímo v kompostárn slouží k porovnání kompostovacího procesu za různých podmínek a vlivu na činnost mikroorganismů a aktivitu enzymů. Experiment byl veden tak, aby v jeho průb hu byl zajišt n p ístup vzduchu ke kompostu a aby degradace materiálů probíhala pomocí aerobních mikroorganismů. Zm ny enzymových aktivit v kompostu byly sledovány b hem t í týdnů, kdy byl kompost umíst n do termostatu vyh átého na 55°C. Byly také sledovány zm ny v pH. Zm ny pH a aktivit celuláz, proteáz, lipáz a dehydrogenáz spolu výrazn korelují p edevším v prvním týdnu experimentu, kdy u všech zmi ovaných enzymů nastává první čty i dny nárůst aktivity a do konce prvního týdne pokles hodnot. Lze p edpokládat, že tento průb h je dán p edevším rychlým nárůstem aktivity mikroorganismů, po vyčerpání lehce rozložitelných zdrojů uhlíku nastává pokles v činnosti mikroorganismů. V dalších dnech nastává znovu nárůst činnosti mikroorganismů a také enzymových aktivit, začíná probíhat degradace i hů e rozložitelných sloučenin. Avšak u lipáz a proteáz nastává na konci experimentu znovu pokles aktivit, který může být zap íčin n vyčerpáním substrátu nebo p ítomností potenciálního inhibitoru, nejčast ji se jedná o finální produkty degradace. Výjimku tvo í aktivita ureáz, která v prvním týdnu experimentu klesá s vyčerpáním dusíkatých substrátů a poté je až do konce experimentu tém nem nná. Vzorek kompostu b hem experimentu v laboratorních podmínkách prošel termofilní fází kompostování, kdy byly zničeny patogenní mikroorganismy, semena plevelu a nežádoucí látky. Krom snadno rozložitelných látek byly postupn degradovány i hů e rozložitelné látky. Po ukončení zah ívání vzorku kompostu, by v kompostu došlo k poklesu teploty, rozvoji mezofilních mikroorganismů a nastala by poslední fáze kompostovacího procesu tzv. zrání. Průb h aktivit v kompostu v reálných a laboratorních podmínkách je různý. Je to dáno p edevším rozdílnými teplotními podmínkami a množstvím kompostu. Kompost v reálných podmínkách prošel nejprve mezofilní fází, kde teplota nep esahuje 40°C. Poté nastala termofilní fáze a po ukončení experimentu lze očekávat, že termofilní fáze p ešla do období zrání kompostu. Sledování zm n aktivit v kompostu je velmi důležité, protože monitoruje zm ny, které se d jí b hem kompostovacího procesu. Z průb hu enzymových aktivit, lze vyčíst zda kompostování probíhá správným způsobem, jestli nedochází k anaerobní degradaci či k zastavení činnosti mikroorganismů nap íklad vlivem toxických látek z odpadů. Sledováním zm n aktivit lze také určit fázi kompostovacího procesu. Současn je pom rn málo studií na porovnání aktivit b hem kompostování v reálných podmínkách a v laborato i, kde je umožn no sledovat produkci enzymů po kratších časových úsecích a porovnat vliv jednotlivých faktorů jako je teplota, vlhkost, složení kompostu apod. na zm ny aktivit jednotlivých enzymů i celkovou biologickou aktivitu mikroorganismů.
36
6.
SEZNůM POUŽITÉ LITERATURY
[1]
MEHTA C.M., Uma PALNI, I.H. FRANKE-WHITTLE, A.K. SHARMA, Compost: Its role, mechanism and impact on reducing soil-borne plant diseases. Waste Management, Volume 34, Issue 3, March 2014, s. 607-6ŇŇ. Dostupné z:
. ISSN 0956053X, http://dx.doi.org/10.1016/j.wasman.2013.11.012. [2] JENKINS, Joe. Thermophillic Bacteria, Composting Stages, and the Sanitization of Compost. Agrowing culture [online]. [cit. 2014-05-04]. Dostupné z: [3] VODRÁŽKA, Zden k. Biochemie I: Živé systémy, jejich složení a organisace. Biopolymery - základ živých systémů. Obdivuhodné katalysátory - enzymy. 1. vyd. Praha: Academia, 1992. ISBN 80-200-0439-4. [4] ALEF, K. a P. NANNIPIERI. Methods in applied soil microbiology and biochemistry: Enzyme activities. London: Academic Press, 1995. ISBN 0125138407. [5] CASTALDI Paola, Giovanni GARAU, Pietro MELIS, Maturity assessment of compost from municipal solid waste through the study of enzyme activities and water-soluble fractions. Waste Management, Volume 28, Issue 3, 2008, s. 534-540. Dostupné z: ISSN 0956053X, http://dx.doi.org/10.1016/j.wasman.2007.02.002. [6] VÁ A, Jaroslav: Kompostování odpadů. Biom.cz [online]. 2002-01-14 [cit. 2014-0501]. Dostupné z: . ISSN: 1801-2655. [7] URBAN, Ji í a Bo ivoj ŠARAPATKA. Ekologické zemědělství: učebnice pro školy i praxi. 1. vyd. Praha: Ministerstvo životního prost edí ČR, Ň00ň, ŇŘ0 s. ISBN Ř0-7212274-6 [8] Multimediální učební texty - průmyslové komposty: Význam kompostování. [online]. [cit. 2014-05-01]. Dostupné z: [9] SHUKLA, Girish a A VARMA. Soil enzymology [online]. Springer, s. 125-128 [cit. 2014-05-01]. ISBN 978-3-642-14225-ň. Dostupné z: [10] Soil Quality for Environmental Health: Soil Enzymes. In: [online]. [cit. 2014-05-01]. Dostupné z: [11] VÁ A, Jaroslav: Kompostování biodegradabilních odpadů v České republice. Biom.cz [online]. 2002-02-13 [cit. 2014-05-01]. Dostupné z: . ISSN: 1801-2655
37
[12] Zera - zem d lská ekologická regionální agentura, a.s.: Databáze kompostáren. [online]. [cit. 2014-05-01]. Dostupné z: [13] ALEF, K. a P. NANNIPIERI. Methods in applied soil microbiology and biochemistry: Protease activity. London: Academic Press, 1995, s. 313-315. ISBN 0125138407. [14] HORÁKOVÁ, Dana a Miroslav N MEC: Laboratorní cvičení z fyziologie bakterií [online]. [cit. 2014-05-04]. Dostupné z: [15] ALEF, K. a P. NANNIPIERI. Methods in applied soil microbiology and biochemistry: Cellulase activity. Editor Kassem Alef, Paolo Nannipieri. London: Academic Press, 1995, s. 345-349. ISBN 01-251-3840-7. [16] JOHNSEN, Hanne a Kirsten KRAUSE. Cellulase Activity Screening Using Pure Carboxymethylcellulose: Application to Soluble Cellulolytic Samples and to Plant Tissue Prints. International Journal of Molecular Sciences [online]. 2014, vol. 15, issue 1, s. 830-838 [cit. 2014-05-04]. DOI: 10.3ňř0/ijms15010Řň0. Dostupné z: < http://www.mdpi.com/1422-0067/15/1/830/> [17] KANDELER, E. a H. GERBER. Short-term assay of soil urease activity using colorimetric determination of ammonium. [online]. [cit. 2014-05-01]. Dostupné z: [18] ALEF, K. a P. NANNIPIERI. Methods in applied soil microbiology and biochemistry: Urease activity. Editor Kassem Alef, Paolo Nannipieri. London: Academic Press, 1995, s.316-320. ISBN 01-251-3840-7. [19] ALEF, K. a P. NANNIPIERI. Methods in applied soil microbiology and biochemistry: Lipasse activity. Editor Kassem Alef, Paolo Nannipieri. London: Academic Press, 1995, s. 358-359. ISBN 01-251-3840-7. [20] PIOTROWSKA-CYPLIK A., CYPLIK P., 2008. Estimation of correlation between total microorganism counts and dehydrogenase activity measurement in compost from anaerobic sewage sludge. Nauka Przyr. Technol. Ň, ň, #1ň. Dostupné z: ISSN: 1897-7820 [21] KÁŠ, Jan, Milan KODÍČEK a Olga VALENTOVÁ. Laboratorní techniky biochemie. 1. vyd. Praha: VŠCHT, Ň005. ISBN Ř0-7080-586-2. [22] SOMOGYI, M., S. Notes of sugar determination. Journal of Biology and Chemistry, 1952. 19,195 [23] NELSON, N.J., A photometric adaptation of the Somogyi mothod for the determination of glukose. journal of Biology and Chemistry, 1994. 153: p.6 [24] FARNET, A.M., L. QASEMIAN, L. GOUJARD, G. GIL, D. GUIRAL, F. RUAUDEL, E. FERRE, A modified method based on p-nitrophenol assay to quantify hydrolysis activities of lipases in litters, Soil Biology and Biochemistry, Volume 42, Issue 2, February 2010, s. 386-ňŘř. Dostupné z: ISSN 00380717, http://dx.doi.org/10.1016/j.soilbio.2009.11.015. [25] TABATABAI, M.A., Methods of Soil Analysis, Part 2—Microbiological and Biochemical Properties, in Soil Enzymes, R.W. Weaver, Angel, J.S., Bottomley, P.S., Editor. 1994, Soil Science Society of America: Madison. p. 775-833. 38
[26] KÁRA, Jaroslav, PASTOREK, Zden k, JELÍNEK, Antonín: Kompostování zbytkové biomasy. Biom.cz [online]. 2002-01-31 [cit. 2014-05-06]. Dostupné z: . ISSN: 18012655. [27] BOHACZ Justyna, Teresa KORNIŁŁOWICZ-KOWALSKA, Changes in enzymatic activity in composts containing chicken feathers, Bioresource Technology, Volume 100, Issue 14, July 2009, s. 3604-ň61Ň. Dostupné z: ISSN 09608524, http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2009.02.042. [28] RAUT, M.P., S.P.M. Prince WILLIAM, J.K. BHATTACHARYYA, T. CHAKRABARTI, S. DEVOTTA. Microbial dynamics and enzyme activities during rapid composting of municipal solid waste – A compost maturity analysis perspective, Bioresource Technology, Volume 99, Issue 14, September 2008, s. 6512-6519. Dostupné z: ISSN 0960-8524, http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2007.11.030. [29] GEISSELER, Daniel, William R. HORWATH, Regulation of extracellular protease activity in soil in response to different sources and concentrations of nitrogen and carbon, Soil Biology and Biochemistry, Volume 40, Issue 12, December 2008, s. 30403048. Dostupné z: ISSN 00380717, http://dx.doi.org/10.1016/j.soilbio.2008.09.001. [30] DIVAKAR, K., Pennathur GAUTAM, A multisubstrate assay for lipases/esterases: Assessing acyl chain length selectivity by reverse-phase high-performance liquid chromatography, Analytical Biochemistry, Volume 448, 1 March 2014, s. 38-40. Dostupné z: ISSN 0003-2697, http://dx.doi.org/10.1016/j.ab.2013.11.031. [31] KO, W.H., I.T. WANG, P.J. ANN, A simple method for detection of lipolytic microorganisms in soils, Soil Biology and Biochemistry, Volume 37, Issue 3, March 2005, s. 597-5řř. Dostupné z: ISSN 00380717, http://dx.doi.org/10.1016/j.soilbio.2004.09.006. [32] HASAN, Fariha, Aamer Ali SHAH, Abdul HAMEED, Industrial applications of microbial lipases, Enzyme and Microbial Technology, Volume 39, Issue 2, 26 June 2006, s. 235-Ň51. Dostupné z : ISSN 01410229, http://dx.doi.org/10.1016/j.enzmictec.2005.10.016. [33] KE, Guang-Ruei, Chao-Ming LAI, Ya-Yin LIU, Shang-Shyng YANG, Inoculation of food waste with the thermo-tolerant lipolytic actinomycete Thermoactinomyces vulgaris A31 and maturity evaluation of the compost, Bioresource Technology, Volume 101, Issue 19, October 2010, s. 7424-74ň1. Dostupné z : ISSN 09608524, http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2010.04.051. [34] BARRENA, Raquel, Felícitas VÁZQUEZ, Antoni SÁNCHEZ. Dehydrogenase activity as a method for monitoring the composting process, Bioresource Technology, Volume 39
99, Issue 4, March 2008, s. 905-ř0Ř. Dostupné z: ISSN 09608524, http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2007.01.027.
40
7.
SEZNůM POUŽITÝCH ZKRATEK A SYMBOL CMC – carboxymethylcelulóza p-NF – p-nitrofenol p-NFB – p-nitrofenylbutyrát p-NFL – p-nitrofenyllaureát TCA – trichloroctová kyselina TFF – trifenylformazan TTC – trifenyltetrazolium chlorid Tyr – tyrosin rpm – otáčky za minutu
41