Vastagbél biopsziás minták mRNS expressziós vizsgálata és klasszifikációja oligonukleotid és cDNS microarray technika segítségével Írta: Galamb Orsolya Témavezetı: Dr. Molnár Béla PhD. Programvezetı: Prof. Dr. Tulassay Zsolt Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Klinikai Orvostudományok Gasztroenterológia alprogram
Szigorlati bizottság tagjai:
Prof. Dr. Falus András egyetemi tanár Prof. Dr. Kopper László egyetemi tanár Prof. Dr. Oláh Edit egyetemi tanár
Opponensek:
Dr. Garami Miklós egyetemi docens Dr. Ponyi Tamás PhD.
Bíráló bizottság tagjai:
Prof. Dr. Matolcsy András egyetemi tanár Prof. Dr. Bálint András egyetemi tanár Prof. Dr. Banai János egyetemi tanár Dr. Barna Gábor PhD.
Budapest 2007
1
TARTALOMJEGYZÉK 1.0. ÖSSZEFOGLALÁS – Magyar
5
Összefoglalás – Angol
6
2.0. RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK
7
3.0. BEVEZETÉS
11
3.1. A vastagbélrák klinikai jelentısége
11
3.2. A vastagbélrák molekuláris alapú csoportosítása
12 12
3.2.1. A csoportosítás szempontjai 3.2.1.1. CpG sziget metilátor fenotípus (CIMP) státusz
12
3.2.1.2. Genetikai instabilitás
13
3.2.2. A vastagbélrák molekuláris típusai
14
3.3. A colorectális adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia
17
3.4. Egyéb colorectális rákmegelızı állapotok
20
3.5. Génexpressziós vizsgálati módszerek
22
3.5.1. Microarray technológia
22
3.5.1.1. Kétcsatornás cDNS chiprendszer (Clontech)
24
3.5.1.2. Egycsatornás oligonukleotid microarray rendszer
25
(Affymetrix) 3.5.2. Az mRNS expressziós microarray eredmények megerısítésére
28
szolgáló módszerek 3.5.2.1. Valós idejő RT-PCR
28 29
3.5.3. Fehérje expresszió vizsgálata
3.6. A vastagbélrák és a vastagbélrákot megelızı állapotok génexpressziós háttere 31 a korábbi microarray vizsgálatok tükrében 3.7. A vastagbélrák microarray alapú diagnosztikai és prognosztikai lehetıségei
36
4.0. CÉLKITŐZÉSEK
38
5.0. BETEGEK ÉS MINTÁK
39
6.0. MÓDSZEREK
41
6.1. Teljes RNS izolálása Qiagen RNeasy Mini Kittel
41
6.2. Atlas cDNS microarray analízis
41
2
6.3. Affymetrix oligonukleotid microarray vizsgálat
42
6.4. Statisztikai kiértékelés
43
6.4.1. cDNS microarray adatok kiértékelése
43
6.4.2. Affymetrix oligonukleotid microarray adatok kiértékelése
43
6.5. A microarray adatok megerısítése valós idejő RT-PCR-rel
45
6.5.1. Light Cycler elemzés
45
6.5.2. Taqman RT-PCR
46
6.7 A potenciális marker molekulák fehérjeszintő vizsgálata
46
6.7.1. EGFR immunhisztokémia
46
6.7.2. Szöveti microarray vizsgálat
47
7.0. EREDMÉNYEK
49
7.1. A vastagbél betegségekben csökkenten vagy fokozottan mőködı gének
49
azonosítása 7.1.1. Clontech kétcsatornás cDNS microarray rendszer
49
7.1.2. Affymetrix egycsatornás oligonukleotid microarray rendszer
50
7.2. A colorectális adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia génexpresszió
53
markerei 7.2.1. Az adenoma-dysplasia-carcinoma átmenet folyamán szekvenciálisan
53
változó expressziójú gének meghatározása Affymetrix microarray vizsgálattal 7.2.2. A szekvenciális gének megerısítése Taqman valós idejő PCR-rel
54
7.2.3. Kiválasztott markerek fehérje expressziójának és szöveti
57
lokalizációjának vizsgálata szöveti microarray technikával 7.3. A vastagbélbetegségek altípusainak megkülönböztetése
59
7.4. Az elkülönítı mRNS expressziós markercsoportok leszőkítése
62
7.4.1. Clontech kétcsatornás cDNS microarray rendszer
62
7.4.1.1. Varianciaelemzés (ANOVA)
62
7.4.1.2. Faktorelemzés
64
7.4.1.3. Diszkriminancia elemzés
64
7.4.2. Affymetrix egycsatornás oligonukleotid microarray rendszer
65
7.4.2.1. Átfedı diszkriminátor gének meghatározása
65
7.4.2.2. Diszkriminancia elemzés
66
3
7.5. A microarray eredmények megerısítése 7.2.1. A Clontech microarray adatok validációja EGFR és TOP1
67 67
RT-PCR-rel és EGFR immunhisztokémiával 7.2.2. Az Affymetrix microarray vizsgálat eredményeinek
69
megerısítése Taqman valós idejő PCR-rel 8.0. MEGBESZÉLÉS
72
8.1. A biopsziák microarray vizsgálatra való alkalmazhatósága,
72
az oligonukleotid és cDNS microarray rendszerek összevetése 8.2. A microarray vizsgálatok eredményeinek megerısítése
76
8.3. A vastagbél betegségekben megváltozott expressziójú markergének
77
szerepe, károsodott útvonalak 8.4. A colorectális adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia
80
génexpressziós markerei 8.5. A vastagbélbetegségek osztályozására alkalmas mRNS expressziós
84
mintázatok 8.5.1. Clontech cDNS microarray rendszer
84
8.5.2. Affymetrix oligonukleotid microarray rendszer
86
8.6. Következtetések
89
9.0. LEGFONTOSABB ÚJ MEGFIGYELÉSEK ÉS MEGÁLLAPÍTÁSOK
90
10.0. IRODALOM
91
11.0. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK
110
12.0. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
114
4
1.0. ÖSSZEFOGLALÁS – magyar A vastagbél daganatok korai diagnosztikája, terápiája, követése napjainkban sem teljesen megoldott. A vastagbél daganatok magas incidenciája és máig nem teljesen ismert patogenetikai háttere, eredete, molekuláris biológiája szükségessé teszi ennek a betegségnek a további kutatását. PhD dolgozatomban a vastagbél daganatok kialakulásának biomarker vizsgálatát, génexpressziós elemzését és osztályozását végeztem teljes genom oligonukleotid és cDNS microarray technika segítségével, vastagbél biopsziás minták felhasználásával. Megállapítottam, hogy a biopsziás minták teljes
genom
oligonukleotid
oligonukleotid
microarray
microarray minıségi
vizsgálati
kritériumoknak
módszere
az
Affymetrix
messzemenıen
megfelelı,
standardizált és jól reprodukálható. Megállapítottam, hogy a Taqman Mikrofolyadék Kártyarendszer, amellyel párhuzamosan akár 96 gén expresszióját lehet vizsgálni 10100 mintán különösen alkalmas a chipen mért génexpressziós változások nagy teljesítményő, gyors és költséghatékony valós idejő PCR-es megerısítésére. Kimutattam, hogy az oszteopontin és az oszteonektin fokozatosan emelkedı mRNS és fehérje expressziója erısen korrelál a vastagbél adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia
elırehaladásával.
Tíz,
a
colorectális
adenoma-dysplasia-carcinoma
átmenettel párhuzamosan fokozódó mRNS expressziójú, valós idejő PCR-rel is megerısített szöveti markert azonosítottam, amelyet még nem írtak le az irodalomban. Ezek a következık: szöveti metalloproteináz gátló-1 és -3, von Willebrand faktor, interleukin-8, melanoma sejtadhéziós molekula, trombospondin-2, kollagén-4A1, mátrix
GLA
fehérje,
interleukin-1
receptor
antagonista
és
a
kalumenin.
Megállapítottam, hogy a prosztaglandin receptor-2 és az amnionless homológ a colorectális adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia fokozatosan csökkenı mRNS expressziójú, validált, eddig még le nem írt markerei. Vizsgálataim során 27, 13, illetve 10 „top” gént azonosítottam, melyek mRNS expressziós mintázata a vastagbél adenomával, a colorectális carcinomával, illetve a gyulladásos bélbetegségekkel asszociálódik. Teljes genom microarray vizsgálattal azonosítottam a korai (Dukes A és B stádiumú) és elırehaladott (Dukes C és D stádiumú) vastagbélrákok molekuláris alapú megkülönböztetésére alkalmas, 100 leginkább eltérı mRNS expressziójú gént.
5
Summary mRNA expression analysis and classification of colonic biopsy samples using oligonucleotide and cDNA microarray techniques Despite tremendous progress in the past few decades, certain important aspects regarding the diagnosis, therapy, and follow-up of CRC still remain unsolved. The high incidence and not completely known pathogenetic background, origin, molecular biology of CRC necessitate further research of this disease. In my PhD thesis I searched for biomarkers of the development of colorectal carcinoma, and performed gene expression analysis for colorectal disease classification using whole genomic oligonucleotide and cDNA microarray technology and colonic biopsy samples. I have established that the oligonucleotide whole genomic microarray analyses of biopsy samples wholly fulfill the Affymetrix quality requirements, are highly standard and reproducible. I have established that the Taqman Microfluidic Card System which offers an opportunity for the analysis of the expression levels of 96 genes on 10-100 samples, is particularly suitable for high-throughput, quick and cost efficient RT-PCR validation of gene expression changes detected by microarrays. I have shown, that the sequential overexpression of osteopontin and osteonectin mRNAs and proteins significantly correlates with the progression of the colorectal adenoma-dysplasiacarcinoma sequence. I have identified and validated by RT-PCR ten novel tissue markers which show continuously increasing mRNA expression in line with the colorectal adenoma-dysplasia-carcinoma transition. These are the following: tissue inhibitor of metalloproteinases-1 and -3, von Willebrand factor, interleukin 8, melanoma cell adhesion molecule, thrombospondin 2, collagen 4A1, matrix Gla protein, interleukin 1 receptor antagonist and calumenin. I have established that the prostaglandin D2 receptor and the amnionless homolog are novel, validated sequentially downregulated markers of the colorectal adenoma-dysplasia-carcinoma sequence. During my analyses, I have identified the top 27, 13 and 10 genes associated with adenoma, CRC, and IBD, respectively. Using whole genomic microarrays I have also determined the top100 most differentially expressed discriminatory genes which are suitable for molecular-based discrimination of early (Dukes A and B stage) and advanced (Dukes C and D) colorectal cancer.
6
2.0. RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK ABCA8 = ATP-kötı kazetta-alcsalád A, 8.tag ADAM12 = ADAM metallopeptidáz domén 12 AMN = amnionless homológ APC = adenomatosis polyposis coli AQP8 = akvaporin 8 AXL = AXL receptor tirozin kináz BAX = Bcl2-asszociált X BCAT1 = citoszolikus elágazó láncú aminotranszferáz 1 BCL6 = B-sejtes CLL/limfóma 6 BIRC4 = bakulovirális IAP ismétlıdés-tartalmú 4 BSA = szarvasmarha szérum albumin (bovine serum albumin) CALU = kalumenin CAV1 = kaveolin 1 CD = Crohn-betegség (Crohn’s disease) CDK4 = ciklin-dependens kináz 4 cDNS = komplementer dezoxiribonukleinsav CEACAM1 = karcinoembrionális antigénszerő sejtadhéziós molekula CIMP = CpG sziget metilátor fenotípus (CpG island methylator phenotype) CIN = kromoszomális instabilitás CK20 = citokeratin 20 COL4A1 = kollagén 4α1 COLEC12 = kollektin alcsalád 12. tagja COX-2 = ciklooxigenáz 2 CRC = vastag- és végbélrák (colorectal cancer) CREM = cAMP érzékeny elem modulátor cRNS = komplementer ribonukleinsav CXCL = kemokin (C-X-C motívum) ligandum DAF = bomlást gyorsító faktor (decay accelerating factor) DCC = deleted in colorectal cancer DNS = dezoxiribonukleinsav
7
DTT = ditiotreitol ECM = extracelluláris mátrix EDG1 = endoteliális differenciációs szfingolipid G-protein-kötött receptor 1 EDTA = etiléndiamin-tetraecetsav EGFR = epidermális növekedési faktor receptor FAP = familiáris adenomatosus polyposis FRET = fluoreszcens rezonancia energia transzfer FUT8 = fukoziltranszferáz 8 G6PDH = glükóz-6-foszfát dehidrogenáz GADD45 = növekedést megállító és DNS károsodás hatására indukálódó transzkriptum (growth arrest and DNA-damage-inducible) GAPDH = glicerinaldehid-3-foszfát GEP = génexpressziós mintázat (gene expression pattern) GITC = guanidin-izotiocianát GM-CSF = granulocita-makrofág növekedési faktor GUCA2A = guanilát-cikláz aktivátor 2A HAPLN1 = hialuronán- és proteoglikán-kötı fehérje 1 HMGA1 = nagy mobilitású csoport AT-hurok 1 (high mobility group AT-hook 1) HNPCC = herediter nem-polyposus colorectális carcinoma HSF1 = hısokk transzkripciós faktor 1 HSP60 = hısokk fehérje 60 IBD = gyulladásos bélbetegség (inflammatory bowel disease) ICAM1 = intercelluláris adhéziós molekula 1 IFITM = interferon indukálta transzmembrán molekula IGF2 = inzulinszerő növekedési faktor 2 IGFBP3 = inzulinszerő növekedési faktor receptor kötı fehérje 3 IGFR1 = inzulinszerő növekedési faktor receptor 1 IL8 = interleukin 8 IL1RN = interleukin 1 receptor antagonista INDO = indolamin-pirrol 2,3 dioxigenáz LCN2 = lipokalin 2 LOH = heterozigozitás elvesztése (loss of heterozigosity)
8
MAPK = mitogén aktivált protein kináz MCAM = melanoma sejtadhéziós molekula MDM2 = egér double minute 2 homológ MES = morfolinetán-szulfonsav MET = met protoonkogén MGP = mátrix Gla fehérje MICAL2 = kalponin és LIM-domén tartalmú mikrotubulus-asszociált monooxigenáz 2 MLH1 = MutL homológ 1 MMP = mátrix metalloproteináz MMR = DNS hibajavító (mismatch repair) mRNS = hírvivı ribonukleinsav (messenger RNS) MSI = mikroszatellita instabilitás MSI-H = magas szintő mikroszatellita instabilitás MSI-L = alacsony szintő mikroszatellita instabilitás MSH2 = MutS homológ 2 MSS = mikroszatellita stabilitás NKκB = nukláris faktor κB NOTCH3 = Notch homológ 3 (Drosophila) NOXA = forbol-12-mirisztát-13-acetát-indukált protein 1 (PMAIP1) O-6-MGMT = O-6-metilguanin-DNS metiltranszferáz OLFM4 = olfaktomedin 4 PAM = Prediction Analysis of Microarrays PBGD = porfobilinogén deamináz PBS = foszfátsó puffer (Phosphate Buffer Saline) PCR = polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction) PECAM1 = vérlemezke/endotélsejt adhéziós molekula PI3K = foszfatidil-inozitol-3 kináz PIDD = leucin-gazdag ismétlıdéseket és haláldomént tartalmazó fehérje (LRDD) PP2A = protein foszfatáz 2A PTEN = foszfatáz és tenzin homológ PTGDR = prosztaglandin D2 receptor PUMA = BCL2-kötı komponens 3 (BBC3)
9
RB1 = retinoblastoma 1 REG1A = regenerációs sziget eredető molekula 1α RHOH = ras homológ géncsalád H tagja RT = reverz transzkripció RT-PCR = valós idejő polimeráz láncreakció illetve reverz transzkripciós polimeráz láncreakció SOCS3 = citokin jelátvitel gátló 3 (suppressor of cytokine signaling 3) SPARC = ciszteinben gazdag, savas szekretált fehérje (oszteonektin) SPP1 = szekretált foszfoprotein 1 (oszteopontin) STAT1 = jelátvivı és transzkripciós aktivátor 1 TCF4 = transzkripciós faktor 4 THBS2 = trombospondin 2 TGF-β = transzformláó növekedési faktor-β TGFβIIR = transzformáló növekedési faktor-β II receptor TGM2 = transzglutamináz 2 TIMP = szöveti metalloproteináz gátló TMA = szöveti microarray (tissue microarray) TNFRSF = tumor nekrózis faktor szupercsalád TOP1 = DNS topoizomeráz 1 TRAF6 = tumor nekrózis faktor receptor-asszociált faktor 6 TRPM6 = átmeneti receptorfeszültség kationcsatorna-alcsalád M 6. tagja UC = colitis ulcerosa VEGF = vaszkuláris endoteliális növekedési faktor VWF = von Willebrand faktor
10
3.0.BEVEZETÉS A vastagbél daganatok korai diagnosztikája, terápiája, követése napjainkban sem teljesen megoldott. A vastagbél daganatok magas incidenciája és máig nem teljesen ismert patogenetikai háttere, eredete, molekuláris biológiája szükségessé teszi ennek a betegségnek a további kutatását. A korábbi években elérhetı és alkalmazott kutatási módszerek a betegség okainak, markereinek egy kiválasztott génjére, géncsoportjára koncentrálódhatott, a teljes molekuláris biológiai háttér vizsgálata nem volt lehetséges. Erre csak az elmúlt években megjelent microarray technikák adtak lehetıséget. A microarray technikák azonban nemcsak új információt adhatnak a betegség okaira vonatkozóan, hanem új diagnosztikus, differenciál-diagnosztikus lehetıséget jelentenek. PhD munkám során ezért a vastagbél daganatok kialakulásának biomarker vizsgálatát, molekuláris biológiai hátterének további tisztázását tőztem ki célul az új teljes genom mRNS expressziós microarray technikák segítségével. Dolgozatomban a vastagbélrák klinikai jelentıségének bemutatása, a már megismert molekuláris biológiai alapok, a szövettani, makroszkópos kialakulás, a rákmegelızı állapotok részletezése után a microarray technikák ismertetésén keresztül mutatom be azokat az új molekuláris adatokat, génexpressziós mintázatokat, amelyek colorectális daganatok kialakulásának magyarázatán túl diagnosztikai jelentıségőek is lehetnek. 3.1. A vastagbélrák klinikai jelentısége A vastagbélrák az egyik leggyakoribb ráktípus a világon, és az általa okozott mortalitás is jelentıs (1). Az Egészségügyi Világszervezet becslései alapján éves szinten világszerte 945 000 új vastagbélrákos beteget diagnosztizálnak, és 492 000-en halnak meg a betegségben (2). Magyarországon a colorectális rák mindkét nemben a második leggyakrabban halált okozó daganatos betegség. Hazánkban évente közel 8000 új vastag- és végbélrákos beteget regisztrálnak, és évi közel 5000 a colorectális rák miatti halálesetek száma. Emiatt válik szükségessé a korai felismerés, a genetikailag eltérı daganatok elkülönítése és ennek ismeretében a terápiás eljárások javítása. A
11
vastagbélrák korai felismerésének fontosságára világítanak rá az 5 éves túlélési adatok. A korai stádiumban 80-90%-os, nyirokcsomó áttétek esetén 60%-os, míg elırehaladott, távoli szervi áttéttel rendelkezı vastagbélráknál 10% alatti az 5 éves túlélési arány (3). 3.2. A vastagbélrák molekuláris alapú csoportosítása 3.2.1. A csoportosítás fı szempontjai A vastagbélrák-típusok molekuláris pathológiai csoportosításának az alapja a CpG sziget metilátor fenotípus megléte vagy hiánya, valamint a genetikai instabilitás típusa (4, 5).
3.2.1.1. CpG sziget metilátor fenotípus (CIMP) státusz A DNS metiláció a vastagbélrák kialakulásáért felelıs epigenetikai változás. A megváltozott citozin metiláció általános jelenség a daganatok keletkezése során, és fontos szerepet játszik a carcinogenezisben (6, 7). A daganatokban elıforduló metilációs változások magukba foglalják a genomiális DNS általános hipometilációját, másrészt a CpG szigeteket érintı regionális hipermetilációt. A globális hipometiláció a genomiális instabilitással függ össze és növeli a mutációs rátát (8), míg a gének 5’ végén elhelyezkedı
CpG
szigetek
hipermetilációja
általában
meghatározott
gének
transzkripciójának inaktivációját eredményezi (9). A vastagbélrák sejtekben többféle gén promótere mutathat metilációt. Ezek egy része az ép nyálkahártya sejtekben is megtalálható, ún. A-típusú (age-related) metiláció (7). A daganatképzıdéssel összefüggı metiláció a C-típusú (cancer-related) metiláció, amely kizárólag a tumoros sejtekre jellemzı. Azok a vastagbél daganatok, ahol a CpG szigetek C-típusú metilációja elıfordul, az ún. „CpG island methylator phenotype” (CIMP+) típusú daganatok (10). A CpG hipermetiláció csökkent transzkripciós aktivitást eredményez, ezzel jelentısen befolyásolja a sejt viselkedését. Ezen kívül a mikroszatellita stabil és instabil tumorok egymástól eltérı fejlıdésmenetét okozza. A mikroszatellita instabil tumorok kulcsgénje, a hMLH1 hipermetiláció általi mőködés-gátlása a DNS hibajavító rendszer hibás mőködését eredményezi, amely a növekedést szabályozó génekben mutációk felhalmozódásához vezet (5). Más gének (pl. a tumor szuppresszor p16) metilációja a mikroszatellita stabil tumorok kialakulásában játszik szerepet (11). Más, a
12
vastagbélrák keletkezésében közrejátszó tumor szuppresszor gén (RB1, E-cadherin) inaktivációjáról is leírták, hogy a CpG promóter hipermetilációjának következménye (12, 13). A
CIMP+
fenotípuson
belül,
a
C-típusú
metiláció
mértéke
alapján
megkülönböztethetünk CIMP-magas és CMIP-alacsony fenotípusokat. A két típus közti különbség azonban nem pusztán mennyiségi (4). A CIMP-magas fenotípusú vastagbéldaganatokra a BRAF mutáció gyakori elıfordulása, és nagyszámú marker metilációja jellemzı. Utóbbi a de novo metiláció mértékének általános növekedését jelzi (14). A CIMP-alacsony fenotípushoz a K-ras mutáció igen nagy gyakorisága (92%) társul. Ezekben a tumorokban kisebb számú gén metilálódik (14).
3.2.1.1. Genetikai instabilitás A genetikai instabilitás két szintjét ismerjük: a DNS egy kis területét érintı mikroszatellita instabilitást (MSI) és a kromoszómarészeket vagy teljes kromoszómákat érintı kromoszomális instabilitást (CIN) (4). A kétféle instabilitás közül egyszerre csak egy fordul elı: a kromoszomálisan instabil vastagbélrákok mikroszatellita stabilak (MSS) és fordítva. A mikroszatelliták bázis-ismétlıdésekbıl álló, változó hosszúságú DNS-szakaszok, amelyek a humán genomban több ezer helyen elszórtan fordulnak elı (15). Mikroszatellita instabilitás (MSI) akkor áll fenn, ha a mikroszatellita ismétlıdések száma DNS replikációs hiba következtében megváltozik. A DNS hibajavító rendszer (mismatch repair (MMR) rendszer) hibás mőködése okozza a MSI létrejöttét. A nem megfelelıen mőködı MMR hozzájárul a daganatok kialakulásához, mivel megnöveli a mutációk számát, amelyek sok sejtfunkcióban fontos szerepet betöltı gén mőködését károsítják (15). Rövid ismétlıdı szekvenciák bizonyos tumor szuppresszor gének (például a TGFβRII, az IGF2R és a BAX) kódoló régióban is elıfordulnak, ezért az MSI ezeknek a géneknek a mutációját és inaktivációját is okozhatja (16-18). Háromféle mikroszatellita státuszt különböztetünk meg. Alacsony szintő az instabilitás (MSI-L), ha a vizsgált mikroszatellita lókuszok kevesebb, mint 40%-a mutat instabilitást; magas szintő az instabilitás (MSI-H), ha a vizsgált mikroszatellita lókuszok 40%-nál nagyobb arányban mutatnak instabilitást. Mikroszatellita stabilitásról akkor beszélünk, ha nem áll fenn MSI (5, 19). Vastagbélrákban legalább 5 mikroszatellita lókusz (a BAT25, a
13
BAT26 mononukleotid, valamint a D5S346, a D2S123 és a D17S250 dinukleotid lókuszok) vizsgálatával határozzák meg a mikroszatellita státuszt (19). 3.2.2. A vastagbélrák molekuláris típusai Az 1. ábra a vastagbélrák kialakulásának egyik lehetséges modelljét mutatja be.
1. ábra A vastagbélrák kialakulásának lehetséges útjai (Jass (4) és Szentirmay (5) alapján) Az életkorral összefüggı (A-típusú) metiláció hatására az ép nyálkahártya hyperproliferatívvá alakul, ami megnöveli a daganat kockázatát. Ezt követıen daganattal összefüggı (C-típusú) metiláció léphet fel, CIMP+ (CpG sziget metilátor metilátor) fenotípust eredményezve. Attól függıen, hogy a C-típusú metiláció milyen géneket érint, mikroszatellita stabil vagy instabil tumorok jönnek létre. A C-típusú metiláció hiányában CIMP- fenotípus alakul ki, itt a daganat-kialakulás irányát és a mikroszatellita státuszt kulcsgének mutációi határozzák meg. A kétféle fejlıdésmenet kombinációjának tekinthetık a CIMP+ MSI-L carcinomák, mivel alacsony szintő promóter metiláció és az MSS rákokra jellemzı génmutációk egyaránt elıfordulnak bennük.
14
A colorectális daganatok molekuláris osztályozása tehát a CpG sziget metilátor fenotípus státusz és a genetikai instabilitás típusa alapján történik. A molekuláris alapú felosztás csoportjai nem mindig feleltethetık meg egyértelmően a hagyományos morfológiai és klinikai típusoknak. Például az öröklött vastagbélrák két fı típusa, a HNPCC és a FAP eltérı molekuláris tulajdonságokkal rendelkeznek, így más molekuláris csoportokba sorolhatók. A vastagbél daganatok molekuláris típusai, ezek legfontosabb morfológiai és klinikai tulajdonságai a következık:
1. CIMP negatív, MSS vastagbélrákok A vastagbélrákok többsége, mintegy 57%-a tartozik ebbe a csoportba. Legnagyobb részük sporadikus, típusos adenomák talaján kialakuló daganat (4). Ezek a vastagbéldaganatok fıleg a bal colonfélben fordulnak elı, és általában 65 éves kor felett diagnosztizálják. Elsısorban jól differenciált daganatok, amelyek ritkán mucinózusak, és a daganatos mirigyek lymphocytás infiltrációja nem jellemzi ıket (5, 15). Aneuploidia vagy poliploidia gyakori. Nagy gyakorisággal APC, p53 és K-ras mutációkat hordoznak, míg a BRAF mutáció elıfordulása ritka (4). Ezen vastagbélráktípus kialakulása az adenoma-dysplasia szekvencia modellel írható le, amelynek molekuláris történéseit a következı fejezetben részletezem. A MSS vastagbél daganatok, szemben a mikroszatellita instabilakkal, rosszabb prognózist mutatnak (20). Az örökletes vastagbélrákok közé tartozó familiáris adenomatosus polyposis (FAP) is ennek a molekuláris csoportnak a tagja (4). A FAP-ot az APC (Adenomatosis Polyposis Coli) autoszómális kulcsgén dominánsan öröklıdı mutációja okozza. A vastagbélrákok mintegy 1%-a vezethetı vissza familiáris adenomatosus polyposisra. A gyomor-bélrendszerben, illetve más szervekben jellegzetes klinikai képet mutató tünetegyüttes jellemzi (5). A FAP-os betegek vastagbelében igen nagyszámú, akár több száz adenoma helyezkedhet el, ehhez társulhatnak vékonybél polypok, desmoid tumorok, osteomák és csontcysták (21).
2. CIMP negatív, MSI-H vastagbélrákok Ebbe a csoportba a HNPCC (herediter nem-poliposis colorectális carcinoma) vagy más néven Lynch-szindróma tartozik. A HNPCC a leggyakoribb örökletes
15
vastagbélrák típus, elıfordulási gyakoriságát 3 %-ra becsülik (4). Elsısorban a jobb colonfélben jelenik meg, már fiatal korban (átlagéletkor: 45 év) (22). Gyakori a szinkron vastagbél carcinomák elıfordulása, amelyek sikeres kezelést követıen kiújulhatnak. Gyakran fordulnak elı egyéb carcinomák is. A HNPCC tumorok morfológiája és kórlefolyása nagyon hasonlít a sporadikus MSI-H daganatokéhoz: gyakran mucinózusak, rosszul differenciáltak, jellegzetes lymphocyta infiltráció és diploidia jellemzi ıket (4). A HNPCC kialakulásához a DNS-hibajavító rendszer károsodása vezet. Elsısorban az MLH1 és az MSH2 MMR-gének mutációja jellemzi, míg az MSH6 mutációja a HNPCC-s betegek mintegy 10%-ában mutatható csak ki (23, 24). Ezekhez a molekuláris változásokhoz társulnak a sporadikus vastagbélrákra is jellemzı APC és K-ras mutációk, illetve a kódoló szekvenciájukban mikroszatellita ismétlıdéséket hordozó gének (többek között a TGFβRII, a TCF4, a BAX és az IGF2R gének) frameshift mutációi (23).
3. CIMP-magas, MSS vastagbélrákok Fogazott polypokból kialakuló colorectális daganatok tartoznak ebbe a csoportba. Elıfordulási gyakoriságukat 8%-ra becsülik (4). A hMLH1 gén részleges metilációja, és a BRAF gén mutációja jellemzi ıket. A p16 és trombospondin-1 gének hipermetilációja is gyakori. Általában jobb oldali, alacsonyan differenciált, lymphocytákkal kis mértékben infiltrált, diploid, mucinózus tumorok (4).
4. CIMP-magas, MSI-H vastagbélrákok Ezek a sporadikus vastagbélrákok az összes vastagbéldaganat 12%-át teszik ki (4). Familiáris elızmény nélkül, többnyire a jobb colonfélben alakulnak ki. Nıkben gyakoribbak, átlagosan 70 éves kor felett. Ezekre a tumorokra diploidia, alacsony differenciáltság, gócos nyáktermelés és jellegzetes lymphocyta infiltráció jellemzı (5, 15). A hagyományos adenoma-carcinoma szekvenciával leírható vastagbélrákoktól eltérıen, a sporadikus MSI-H vastagbél daganatokban az APC mutáció vagy deléció, valamint a K-ras mutáció kis gyakorisággal fordul elı (25). Ezzel szemben a BRAF mutáció és a hMLH1 hipermetiláció gyakori jelenség (26). Ez utóbbi molekuláris változások inkább a fogazott (serrated) adenomákra jellemzıek, így a sporadikus MSI-
16
H vastagbélrákok kialakulását az ún. serrated polyp-dysplasia-carcinoma útvonallal magyarázzák (4, 26).
5. CIMP-alacsony, MSI-L vastagbélrákok Az MSI-L vastagbélrákok MSS vastagbélrákoktól való megkülönböztetése, és külön csoportként való kezelése vitatott, de egyre több kutatási eredmény alátámasztja ezek fontosságát (4). A DNS-javító O-6-MGMT gén metiláció útján történı inaktivációja leggyakrabban az MSI-L vastagbél daganatokban fordul elı, és enyhe mikroszatellita mutátor fenotípust eredményez. Elıfordulási gyakoriságukat 20%-ra becsülik (4, 5). Ezt a vastagbélrák típust a K-ras mutáció gyakori elıfordulása, és kromoszomális instabilitás jellemzi. A bal colonfélben való megjelenésük, a jól differenciáltsági fokuk, a lymphocyta infiltráció hiánya, valamint a rossz prognózis alapján az MSS colon tumorokhoz
hasonlítanak.
Az
MSI-L
vastagbélrákok
többsége
sporadikus
hyperplasztikus polyp vagy serrated (fogazott) adenoma talaján alakul ki (25, 27). 3.3. A colorectális adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia A vastagbélrák kialakulásával kapcsolatos legfontosabb elmélet az adenomadysplasia-carcinoma szekvencia modell (28). Napjainkban is elfogadott álláspont, hogy a vastagbélben elıforduló jóindulatú daganatból, adenomából colorectalis carcinoma fejlıdhet ki (29). A felmérések szerint az átlag populáció 10-24%-ában igazolható adenoma, közülük 5%-ban alakul ki vastagbélrák. Az adenoma-carcinoma szekvencia azt a folyamatot jelenti, amelynek keretében az adenomából (a dysplasia különbözı fokozatain keresztül) in situ carcinoma alakul ki. Az adenoma kialakulása és átmenete rosszindulatú daganattá hosszú idıt, akár 15 évet vehet igénybe (30). Ép szövetbıl carcinoma kialakulásával kapcsolatban elsıként Vogelstein és mtsai végeztek kutatásokat (31). Az
ép
elırehaladásával
vastagbél
nyálkahártya
szaporodó
környezeti
promoter
metiláció
mutagének hatására
és
az
életkor
hyperproliferatív
nyálkahártyává alakul. Ezekbıl a karcinogén hatásokra fokozottan érzékeny osztódó sejtcsoportokból további mutációk (mint az APC gén mutációja) hatására enyhe dysplasiát mutató, 1 cm-nél kisebb, tubuláris adenoma jöhet létre (31). A Wntútvonalhoz tartozó APC gén mutációja a colorectális carcinogenezis egyik legkorábbi
17
molekuláris eseménye, amely a sporadikus vastagbél daganatok 75-80%-ára jellemzı. A mutáns APC génterméke nem tudja megkötni a β-katenint, amely így felszaporodik a citoplazmában,
és
a
sejtmagba
jutva
szabályozatlan,
kóros
TCF/LEF-függı
transzkripció aktiválódást okoz. Ezáltal fokozódik - többek között - a ciklin-D1, a c-myc és a c-jun sejtproliferációért felelıs gének, valamint az antiapoptotikus survivin gén expressziója. Ezek elısegíthetik a colorectális carcinoma kialakulását (31). Az APC gén mutációján kívül szintén a colorectális carcinogenezis korai eseménye a genom globális hipometilációja, amely számos gén aktivációját és fokozott expresszióját okozza. A colorectális carcinogenezis korai szakaszában a ciklooxigenáz-2 (COX-2) génnek is szerepe lehet. Erre utalhat, hogy a vastagbélrákok 85%-ában COX-2 túlmőködést mutattak ki az ép nyálkahártyához képest, és ez az expressziós változás már adenomák egy részében (50%-ában) is jelentkezett (32). A COX-2 az arachidonsav metabolizmus és
a
prosztaglandin
szintézis
kulcsenzime.
Fokozott
aktivációja
számos
tumorképzıdéssel kapcsolatos biológiai útvonalon keresztül (hipoxia és gyulladás hatására az NFκB-útvonalon, a Wnt-szignálúton, valamint az onkogén Ras-útvonalakon keresztül) megvalósulhat (33). Az emelkedett COX-2 szint az apoptotikus folyamatok gátlásához, az immunrendszer legyengüléséhez, az érképzıdés és a tumor invázió fokozódásához vezet. A preklinikai vizsgálatok azt mutatják, hogy a vastagbél adenomában szenvedı betegek szelektív COX-2 inhibitorokkal való kezelése a vastagbélrák kemoprevenciójának része lehet (33). Az enyhén dysplastikus adenomából 1-2 cm-es tubulovillózus közepes dysplasztikus adenoma alakul ki. E folyamatban fontos szerepet tulajdonítanak a K-ras onkogén mutációinak, amelyek fokozzák a géntermék aktivitását és a vastagbélrákok mintegy 40-50%-ában fordulnak elı (34, 35). A ras onkogéncsalád tagjai membránhoz kötött fehérjék, amelyek központi szerepet töltenek be a proliferációs és mitogén jelátviteli utakban (36). A p16 tumor szuppresszor gén hipermetilációját és expressziójának csökkenését tapasztalták a colorectális carcinogenezis folyamán. A p16 gén terméke a sejtciklus elırehaladásában szerepet játszó CDK4 ciklin dependens kinázt gátolja, ezen kívül stabilizálja a p53 tumor szuppresszor fehérjét, amely a sejtciklus G0/G1 átmenetének ellenırzésében alapvetı szerepet tölt be. A p16 hipermetilációnak és inaktivációnak a gyakoriságáról különbözı kutatócsoportok eltérı eredményeket írtak le (37, 38). A p16 expresszió csökkenését elsısorban idısebb betegek jobb oldali,
18
mikroszatellita instabil, alacsonyan differenciált vastagbél daganataiban tapasztalták (37), míg Yi és mtsai. a Dukes stádium elırehaladásával párhuzamosan a p16 metiláció fokozódását mutatták ki (38). A következı lépcsı a 2 cm-nél nagyobb villosus, súlyosan dysplasztikus adenoma, amelynek létrejöttében a 18. kromoszóma hosszú karján lévı gének allélvesztése játszik szerepet a vastagbélrákok 70%-ában. A DCC (deleted in colon carcinoma) tumor szuppresszor gén deléciója legkorábban súlyos dysplasiában mutatható ki. A DCC gén terméke egy membránhoz kötött fehérje, amely az axonképzıdésben,
az
apoptózis
indukciójában
és
a
sejproliferáció
negatív
szabályozásában vesz részt (28, 39). A DCC hiánya tehát elısegíti a tumorképzıdést. Szintén ebben a kromoszóma régióban helyezkedik el további két tumor szuppresszor gén, a SMAD2 és a SMAD4/DPC4. Mindkét fehérje a TGF-β jelátviteli úthoz tartozik (40), amely számos sejtfolyamatot (sejtosztódás, apoptózis, sejtdifferenciáció) szabályoz. A SMAD2 és a SMAD4 mutációit is azonosították többféle humán daganatban, köztük vastagbélrákban és vastagbélrák sejtvonalakban (41, 42). A súlyosan dysplasztikus adenomából carcinoma kialakulását elsısorban a p53 tumor szuppresszor mutációja és inaktivációja segíti elı. A p53 a humán daganatokban leggyakrabban károsodott gén (43), amely mutációja 70%-os gyakorisággal következik be az adenoma-carcinoma szekvenciában, közvetlenül az invazív növekedési fázis elıtt. A p53 gén terméke egy DNS-kötı fehérje, amely transzkripciós faktorként számos gén expresszióját szabályozza (44, 45). A p53 indukálhat géneket, amelyek aktiválhatják az apoptózist (BAX, PIDD, NOXA, PUMA), valamint szerepet játszanak a túlélési szignál gátlásában (inzulinszerő növekedési faktor kötı fehérje 3, PTEN), a sejtciklus megállításban és DNS-javításban (ciklin-dependens kináz inhibitor 1A, p53-indukált ribonukleotid-reduktáz, B-sejt transzlokációs gén 2, GADD45), az angiogenezis és a daganatos invázió folyamatában (trombospondin-1, GD-AIF, mátrix metalloproteináz-2, maspin), végül a p53 hatásnak a szabályozásában (MDM2, ciklin-G1, tumor protein 73, tumor protein 63) (5, 44, 45). A p53 fehérjét a „genom ırének” is nevezik, mivel a sejtciklus G1 és G2 ellenırzéspont fehérjéjeként blokkolja a sejtproliferációt DNSkárosodás esetén, és aktiválni képes a DNS-javító mechanizmusokat, illetve az apoptotikus sejthalált, ha a javítás nem megfelelı (46). A p53 elvesztése, illetve mutáció miatti funkcióvesztése miatt lehetetlenné válik a sejtciklus megállítása, ez növeli a
19
mutációs gyakoriságot, valamint a genomiális instabilitást. Az in situ carcinoma állapotot a valódi invázió követi (invazív rák), ennek jele a lamina basalis mucosae áttörése (30, 47, 48).
2. ábra A colorectális adenoma-carcinoma szekvencia (Fearon, Vogelstein (31) alapján) 3.4. Egyéb colorectális rákmegelızı állapotok A huzamosabb ideig fennálló gyulladásos bélbetegségek (IBD) talaján a vastagbélrák kialakulásának fokozott a kockázata, amely a betegség kiterjedésével és fennállásának idıtartamával függ össze (49, 50). A colitis ulcerosa carcinoma-kockázata jobban ismert, mint a Crohn-colitis esetén fennálló. A colitis ulcerosás betegek 5-10%ában fejlıdik ki CRC, míg a Crohn-betegségben szenvedık 0.4-0.8%-ában. A colitis
20
ulcerosa 8-10 éves fennállása során még nem vagy alig növekszik a malignus transzformáció esélye, míg 20 éves betegségtartam után 5-10%-os, 30 évet követıen 1220%-os (51). A vastagbélrák kialakulása gyakoribb olyan esetekben, ha az IBD kezdete fiatal korra esik, vagy ha a colitis kiterjedt, különösen, ha a gyulladás ez egész vastagbelet érinti. A CRC rizikó proctitis ulcerosa esetén nem nagyobb az átlagpopulációhoz képest, míg baloldali UC esetén négyszeres, pancolitis esetén pedig 20-szoros (52). Hosszú ideig fennálló kiterjedt Crohn-betegség a pancolitishez hasonló vastagbélrák kockázatot jelent (52). IBD talaján a vastagbélrák polypoid léziókból és ún. flat mucosából egyaránt kialakulhat enyhe, majd súlyos dysplasiás állapoton keresztül (53). A colitis talaján kialakuló vastagbélrák molekuláris patológiai szempontból többnyire a MSS típusba tartoznak. Ezeknek a daganatoknak a kifejlıdése során is a sporadikus vastagbélrákokra jellemzı molekuláris eltérések jelentkeznek: hasonló arányban fordul elı a kromoszóma instabilitás (80%), illetve a mikroszatellita instabilitás (20%) (53). Az APC gén funkcióvesztése sporadikus vastagbélrákok esetén iniciáló lépés, míg a colitis-asszociált tumorokban a malignus transzformáció késıi történése (54). Ezzel szemben a p53 gén mutációja, amely a sporadikus vastagbél carcinomák nagy részében csak közvetlenül az invazív növekedési fázis kialakulása elıtt következik be, a colitis ulcerosa talaján létrejövı vastagbélrákok esetén a carcinogenezis korábbi stádiumában kimutatható (55).
3. ábra A colitis ulcerosával összefüggı vastagbélrák kialakulásának molekuláris folyamata (Itzkovitz (54) nyomán)
21
3.5. Génexpressziós vizsgálati módszerek A betegségek többsége nem monogénes, hanem számos gén mőködésének egyidejő megváltozásával függ össze. Ha molekuláris hátterüket komplex módon szeretnénk elemezni, szükségessé válik sok paraméter párhuzamos vizsgálata. A nagy genom projektek szekvencia adatbázisaira támaszkodva a 90-es évek elején megjelent, és azóta széles körben elterjedt microarray technológia ezt lehetıvé teszi. A következıkben az mRNS expressziós microarray technika alapjait, fı típusainak mőködési elvét, és a microarray vizsgálatokkal kapott eredmények mRNS- és fehérjeszintő megerısítésének legfontosabb lehetıségeit mutatom be. 3.5.1. Microarray technológia A nagy teljesítményő biochip technológia drámai fejlıdése segíti a biológiai kutatásokat és a betegségek molekuláris hátterének feltárását. Már korábban is léteztek olyan array-k, amelyek különbözı molekulákat tartalmaztak szilárd felszínhez kötve. Erre klasszikus példa a Southern blot (56), különösen a „dot blotnak” és „gridded librarynak” nevezett változatai. A DNS microarray-k esetén – szemben a Southern blot és más hagyományos szilárd fázisú hibridizáción alapuló vizsgálattal – az ismert nukleotid-szekvenciák találhatók a szilárd hordozón, meghatározott elrendezésben, és az ismeretlen nukleinsav van szolubilis (és jelzett) formában. A microarray-k nagyobb elemsőrőséggel rendelkeznek (100 próba elem/cm2), mint a hagyományos array-k. Egyik fı különbség az, hogy a porózus hibridizációs membránokat nem-porózus üveg vagy szilikon alapúak váltották fel, melyek jelentısen csökkentik a reakciótérfogatot, és megnövelik a reakció sebességét, ezáltal jelentısen csökkentik a reakcióidıt. A felismerést segítı fluoreszcens festékek, melyek a porózus membránok esetében erıs aspecifikus hátteret okoznak, a microarray-knél kiváló és érzékeny jelfeldolgozást biztosítanak, lehetıséget teremtve a mennyiségi kiértékelésre, sıt két vagy több fluorofor egyidejő alkalmazásával kettı vagy több minta egy microarray-n való összehasonlítása is elérhetı (57). A miniatürizált biochipek - melyek alatt leginkább a DNS microarray-ket értik – több ezertıl több százezer molekuláris analízis gyors, egyidejő, azonos körülmények között történı lebonyolítására használhatók, ezáltal
22
alkalmassá váltak a nagy genomikai, farmakogenetikai és proteomikai kutatási programok folyamatosan növekvı igényeinek kielégítésére (58). Az ún. globális array-k több ezer-tízezer gén expressziós szintjének párhuzamos vizsgálatát teszik lehetıvé. A legutolsó generációs microarray-k segítségével a genom jelentıs részérıl vagy akár a teljes genomról kaphatunk információt. Az ún. útvonal-specifikus array-k a genom kisebb része - közös jelátviteli útvonalhoz, géncsaládhoz tartozó vagy adott sejtfunkció megvalósításában részt vevı néhány tíz-száz gén - expressziós profiljának jellemzésére alkalmasak. Útvonalspecifikus
array-ket
angiogenezissel
és
fejlesztettek
ki
onkogének,
metasztázissal
tumor
kapcsolatos
szuppresszor
gének
gének,
komplementer
oligonukleotidjainak felhasználásával tumorok vizsgálatára. Szintén az útvonalspecifikus array-k segítségével szerezhetünk rövid idı alatt széles körő információt az apoptózis, a sejtciklus, a különbözı jelátviteli utak, számos citokin és kemokin, valamint receptoraik, nukleáris hormonreceptorok és regulátoraik, homeobox fehérjék, transzkripciós faktorok, transzportfehérjék és ioncsatornák stb. génjeinek expressziós szintjérıl. A fenti array technika alkalmas a fehérje/DNS és fehérje/fehérje kapcsolatok, valamint az ECM alkotók és sejtadhézió, a stressz és toxicitás hatásának molekuláris szintő vizsgálatára (57). Az mRNS expressziós microarray-k segítségével lehetıvé vált nagyszámú gén expressziójának összehasonlítása különbözı sejtekben, szövetekben, ugyanazon típusú sejtek/szövetek eltérı állapotaiban (pl. fiziológiás és pathológiás állapot; adott drog adagolásával, illetve anélkül) Az mRNS expressziós microarray technika lényege az, hogy a vizsgálatban szereplı génekkel komplementer ún. target oligonukleotidokat szilárd hordozóhoz kötik. Ezekhez hibridizáltatják például az adott sejttípusból származó RNS-rıl készített jelölt egyszálú cDNS vagy cRNS molekulákat, a próbákat. A hibridizáció mértékébıl következtetnek a vizsgált gének expressziós szintjére. A nagyszámú gén kifejezıdésének gyors vizsgálata útján szerzett óriási tömegő információ lehetıséget nyújt arra, hogy a microarray-k segítségével újabb és újabb diagnosztikai és terápiás célpontokat térképezzünk fel. A legnagyobb kihívást a legígéretesebb targetek kiválasztása jelenti. Többféle stratégia létezik. Egyik a szövetvagy tumor-specifikus géneltérések azonosítása, melyek specifikusabb terápia kidolgozásának kiinduló pontjai lehetnek. „Összegyőjthetjük” az adott betegség esetén
23
túlexpresszált géneket, melyek membránhoz kötött vagy szekretált fehérje termékeket kódolnak, így célpontjául szolgálhatnak a szérum alapú diagnosztikai eljárásoknak, valamint immunterápia és vakcinák kifejlesztéséhez. Különösen fontosak a tumor progresszióval összefüggı gének, amelyek szintén ígéretes terápiás célpontok (59). 3.5.1.1. Kétcsatornás cDNS chiprendszer (Clontech) A cDNS chipek esetén „target”-nek a szilárd felszínre rögzített molekulákat cDNSkomplementer molekulákat nevezzük, „próba”-ként pedig az array-re analízis céljából rávitt, jelölt, a komplementer target molekulákhoz hibridizáló cDNS-t hívjuk. A kétcsatornás microarray vizsgálat a kontroll (például ép) és a vizsgált (pl. beteg) mintából való teljes RNS állomány izolálásával indul. A teljes RNS-rıl ún. reverz transzkripcióval (RT-vel) egy szálú komplementer DNS-t (cDNS-t) szintetizálunk. Ha elegendı mennyiségő kiindulási anyag (sejt/szövet) áll rendelkezésünkre, az RT során keletkezett cDNS közvetlenül a hibridizációs array membránra vihetı. Ha azonban a minta kevés és nem nyerhetı belıle elegendı mennyiségő RNS, amplifikációs lépést kell alkalmazni a nukleinsav megsokszorozására. A hibridizációban felhasználandó próbák jelölése az RT során történik jelölt nukleotidok vagy ribonukleotidok beépítésével. A kétféle próbát kétféle fluoreszcens festékkel (az egyiket Cy3-mal, a másikat Cy5-tel) jelöljük. A microarray hibridizáció elıtt a jelölt próbákat meg kell tisztítani, azaz a nem beépült jelölt nukleotidokat el kell távolítanunk, majd a hibridizációs elegy (mix) összeállítása következik. A cDNS próbát denaturálják, mielıtt a microarray-re viszik. A hibridizációs eljárást megelızıen elıhibridizációt végeznek az egyenletes háttér biztosítására. Erre a célra hering sperma DNS-t használnak humán RNS eredető próbák esetén. A hibridizáció hibridizációs kamrában történik, amely megfelelı páratartalmat és hımérsékletet biztosít. A jelölt próbákból a microarray-re azonos mennyiségeket hibridizálunk. A jelölt cDNS molekulák a velük komplementer, a microarray-n rögzített célmolekulákkal kapcsolódnak össze. Ez a folyamat a hibridizáció. A folyamat 42-65°C-on zajlik, természetesen egy rendszernél azonos körülmények között. A humán RNS eredető próbák hibridizációjakor általános és specifikus blokkoló reagenseket alkalmaznak: a CoT-1 DNS a humán repetitív DNS-t blokkolja, az élesztı DNS a nem-specifikus hibridizációt gátolja. A hibridizációt követıen az array-re nem kötıdött próbákat lemossák. A hibridizáció mértéke a próba
24
molekulák jelölésének megfelelıen detektálható fluoreszcens chip leolvasó készülékkel. A fluoreszcens jeleket a kétcsatornás rendszereknél két hullámhosszon 532nm-en (Cy3) és 635nm-en (Cy5) rögzítik. Az adatok feldolgozása és az eredmények kiértékelése számítógépes elemzı programok segítségével történik. 3.5.1.2. Egycsatornás oligonukleotid microarray rendszer (Affymetrix) Az
oligonukleotid
microarray-k
esetén
oligonukleotid
célszekvenciákat
rögzítenek szilárd felszínhez. Az Affymetrix rendszer esetén az mRNS 3’ végétıl számított 11-féle 25mer oligonukleotid reprezentál egy transzkriptumot. Az egycsatornás microarray esetén egy array-re csak egy minta vihetı fel, és a különbözı array-kre felvitt mintákat tudjuk összehasonlítani. Ezt az teszi lehetıvé, hogy az ilyen rendszerek zártak és a hibridizációs és mosási körülmények állandóak. Az egycsatornás microarray-nél szintén teljes RNS-bıl indulunk ki, amelynek mRNS részérıl egy speciális, csak mRNS-eket polyA-farok alapján felismerı T7(oligodT) primert felhasználva, reverz transzkripcióval cDNS-t szintetizálunk. A cDNS-mRNS hibridrıl RNáz H enzimmel leemésztjük az mRNS-t, majd DNS-polimeráz enzimmel megszintetizáljuk a második szál cDNS-t. Ez is tartalmazni fogja a T7 RNS polimeráz enzim kötıhelyét. A második szál cDNS szintézisét követıen az így kapott dupla szálú cDNS-t használjuk templátként az ún. in vitro transzkripcióhoz, mely során a dupla szálú cDNS-rıl a T7 RNS polimerázzal nagy mennyiségő, az eredeti mRNS szekvenciával komplementer RNS-t (cRNS-t) tudunk készíteni. Ezt a sokszorosító lépést T7 RNS amplifikációnak nevezzük, amely nevét a T7 RNS polimeráz enzimrıl kapta. Az Affymetrix rendszerben is alkalmazott T7 RNS amplifikáció, amely a PCR reakcióval szemben lineáris amplifikációt jelent, a kiindulási mRNS állományt az eredeti
génexpressziós mintázat torzulása nélkül képes megsokszorozni. Az
oligonukleotid microarray vizsgálatokat általában 1-15µg kiindulási teljes RNS-bıl végzik az ún. egykörös amplifikáció segítségével. A T7 RNS amplifikációs módszert kétszer egymás után alkalmazva azonban 10-100ng teljes RNS-bıl is lehetıségünk van teljes genom expressziós vizsgálatot végezni (60). Az in vitro transzkripció során biotinnal jelölt ribonukleotidokat is beépítünk a cRNS szálakba. Ezután a biotinnal jelölt cRNS-eket hibridizáljuk a microarray-re. A cRNS-t azonban a hibridizációt megelızıen fragmentálni (feldarabolni) kell. A mintákat hibridizációs oldatban a chipre
25
visszük és 16 órán át 45-50ºC-on hibridizáltatjuk a microarray-re. Közben a jelölt próbáinkat is tartalmazó folyadékot áramoltatjuk a microarray felszínén, elısegítve ezzel a komplementer szálak kötıdését. Ezután mosási lépések következnek, amelyek során a nem kötıdött próbát eltávolítjuk. Az Affymetrix microarray esetén egy elıhívó festést végzünk a mosások közé ékelve, ekkor kötjük a biotinilált nukleotidokhoz a fluoreszcens fikoeritrint, biotin-sztreptavidin kapcsolaton keresztül. Lézerrel gerjesztjük a fluoreszcens festéket, és a kibocsátott fluoreszcens fényt mérjük meghatározott hullámhosszon. Így kapjuk meg minden egyes microarray pontra a fluoreszcencia intenzitási értéket, ami információt ad a hibridizáció mértékérıl. A 4. ábra az Affymetrix oligonukleotid microarray vizsgálat legfontosabb lépéseit foglalja össze.
26
4. ábra Az Affymetrix microarray vizsgálat legfontosabb lépései forrás: www.affymetrix.com
27
3.5.2. Az mRNS expressziós microarray eredmények megerısítésére szolgáló módszerek Az expressziós microarray technika egyik problémája, hogy szemikvantitatív. A microarray-re rögzített target szekvenciák megválasztása, és a hibridizáció körülményei egyaránt befolyásolják azt, hogy az adott microarray rendszerrel milyen pontossággal lehet egy adott génexpressziós változást detektálni. A fenti okok miatt, annak megerısítésére, hogy a chipen kapott jelintenzitás valóban korrelál-e a gén expressziós szintjével, független vizsgálati módszert kell alkalmaznunk. A leginkább elfogadott megerısítı módszer a microarray vizsgálat során alul-, illetve túlexpresszáltnak mutatkozó kiválasztott gének real-time PCR-es vizsgálata. A továbbiakban valós idejő PCR vizsgálat mellett a génexpressziós markerek nagy teljesítményő fehérjeszintő verifikációjának lehetıségét is bemutatom. 3.5.2.1. Valós idejő PCR A real-time PCR lehetıvé teszi a PCR termék mennyiségének valós idıben történı detektálását, azaz fluoreszcens jelölés segítségével ciklusról ciklusra nyomon követhetı a végtermék sokszorozódása. A SYBR Green I fluoreszcens DNS-festék a kettısszálú DNS-molekulákba épül be, lehetıvé téve ezzel annak fluorimetriás detektálását. Speciális fluoreszcens próbákkal - például hibridizációs próbákkal vagy úgynevezett fluorogén 5’ nukleáz-, más néven TaqMan próbákkal - a PCR-termék szekvenciaspecifikus kimutatása is megvalósítható. A hibridizációs próbapár két különbözı fluoreszcens festékkel jelölt oligonukleotid, amely egymástól 1-3 nukleotid távolságban hibridizál a PCR-termékre. A gerjesztett donor festék fluoreszcens rezonancia energia transzfer (FRET) révén gerjeszti az acceptor festéket, melynek fényemissziója észlelhetı. A TaqMan próba pedig egy olyan oligonukleotid, amelyet egy reporter és egy quencher festékkel jelöltek. A reporter festék emissziója csak akkor detektálható, amikor a DNS-polimeráz lehasítja azt az extenziós lépésben. A real-time PCR-ek különbözı hullámhosszú gerjesztési fényforrást (LED vagy lézer) tartalmaznak és különbözı hullámhosszú fluoreszkáló jelet képesek felfogni egyes esetekben nagy érzékenységő
fotoelektron-sokszorozó
(PMT) detektorral
vagy digitális
CCD
kamerával. A hagyományos fémblokkal rendelkezı berendezéseken kívül manapság már léteznek ultragyors készülékek is. Ezek légbefújásos technológiával rendelkeznek,
28
melynek segítségével akár 20°C/sec főtési-hőtési sebesség is megvalósítható (Light Cycler) (61). A real-time PCR az amplifikációs görbék elemzése útján a vizsgált nukleinsav kvantitatív elemzését is lehetıvé teszi. A PCR termék mennyiségét az ún. áttörési ponttal jellemezhetjük (Ct), amely azt a ciklusszámot jelenti, amelynél a ciklusonként mért fluoreszcencia exponenciálisan növekedni kezd. A Ct érték annál kisebb, minél nagyobb a kiindulási templát nukleinsavról keletkezı amplikon mennyisége. A PCR termék mennyisége – bizonyos koncentráció határok között – arányos a kiindulási nukleinsav mennyiséggel, így a Ct értékek végsı soron a kiindulási nukleinsav mennyiségrıl adnak információt. Az ismeretlen mennyiségő célnukleinsavat tartalmazó mintára jellemzı áttörési pont mérésével meghatározható annak koncentrációja. Az amplifikálandó nukleinsavat ismert koncentrációkban tartalmazó standard sor segítségével felvehetı egy kalibrációs görbe, amely az áttörési ciklusszámokat a koncentrációk logaritmusának függvényében mutatja (61). Két mintacsoport közötti génexpresszió összehasonlítása pedig úgy történhet, hogy a vizsgált célgén expressziós szintje mellett belsı kontrollként valamilyen állandó expressziót mutató ún. háztartási gén mRNS szintjét is mérjük. 3.5.3. Fehérje expresszió vizsgálata Az mRNS expressziós microarray-k a gének mőködésérıl, aktivitásáról adnak felvilágosítást, a fenotípus azonban közvetlenül a fehérjeszinten keresztül nyilvánul meg. Ezt a képet a fehérjék poszttranszlációs módosításai, sejten belüli lokalizációjuk változása tovább árnyalja. A chipvizsgálattal azonosított mRNS expressziós markerek fehérjeszintő vizsgálata ezért nagymértékben hozzájárul a vizsgált betegség molekuláris hátterének pontosabb megismeréséhez és olcsón kimutatható diagnosztikus markerek megtalálásához. A következıkben a fehérje expresszió nagy teljesítményő vizsgálatára alkalmas két modern módszert, a fehérje chip analízist és az immunhisztokémiai festéssel kombinált szöveti microarray technikát mutatom be. A proteinchipek egyidejőleg akár több száz fehérje minıségi és mennyiségi mérését teszik lehetıvé a fluoreszcensen jelölt minta-fehérjék és az üveglemezhez rögzített ellenanyagok közötti antigén/antitest kötıdés kimutatásával. Ez a rendszer a cDNS microarray-k analógiájaként mőködik és kompatibilis is az ehhez szükséges
29
eszközökkel (jelölés, hibridizáció, azonosítás). A fehérje mintákat két különféle fluoreszcens festékkel (Cy-3-mal illetve Cy-5-tel) jelöljük, ami lehetıséget ad két minta egyidejő, egy chipen történı vizsgálatára (62). Az antigén/antitest kötıdés következtében kapott fluoreszcens jel csak a bekötıdött fehérjék mennyiségétıl függ. A leolvasó készülék lézerrel gerjeszti a két fluoreszcens festéket és az általuk kibocsátott kétféle hullámhosszú fényt detektáljuk (63, 64). A fehérje chip elınye, hogy több száz fehérje expressziójának egyidejő kimutatását teszi lehetıvé, ugyanakkor a két fluoreszcens festék eltérı mértékő kötıdése miatt keresztjelölést igényel és segítségével csak olyan fehérjék vizsgálhatók, amelyek ellen létezik szilárd felszínhez rögzíthetı, a többi, szintén rögzített antitesttel nem keresztreagáló ellenanyag. A módszer további hátránya a magas költség. Az mRNS expressziós microarray vizsgálatok eredményeként kapott expressziós markerek további, fehérjeszintő vizsgálatánál fontos szempont a fehérje expresszió kimutatásán túl a fehérjék szöveti elhelyezkedésének feltárása, valamint a nagy számú szövetmintán való tesztelés, különösen, ha diagnosztikai alkalmazás kidolgozása, illetve adott betegség pathomechanizmusával összefüggı általános fehérjeváltozások feltárása a cél. A szöveti microarray (Tissue Microarray = TMA) vizsgálat alkalmas ezen szempontok érvényesítésére és költséghatékony módszer. A
TMA vizsgálat az
immunhisztokémia elvén alapszik. Nevét onnan kapta, hogy a tárgylemezre nem egy, hanem több szövet korongot rögzítenek a microarray-ken ismert elrendezésben, majd ezt a megfelelı ellenanyaggal kezelik. Így akár több tíz mintán is egyszerre vizsgálható egy bizonyos fehérje expressziója és szöveti lokalizációja (63). A formalinban fixált paraffinba ágyazott szövetblokkból szövethengereket (ún. core-okat) helyeznek közös paraffin blokkokba, majd ezekbıl 5 µm-es vastagságú szövettani metszeteket készítenek hagyományos tárgylemezre. A hengerek átmérıje néhány millimétertıl 1 cm-ig terjedhet. A core-ok átmérıje szabja meg azt, hogy hány minta kerül végül is a tárgylemezre. Itt kompromisszumot kell kötni az egyszerre vizsgálandó mintaszám, valamint a vizsgált metszeti terület között. Leggyakrabban a 4x6-os, 6x10-es, 8x12-es vagy 10x24-es elrendezést alkalmazzák (65). A TMA lemezek immunhisztokémiai jelölésére tetszılegesen kiválasztott fehérje ellenes antitesteket alkalmaznak.
30
3.6. A vastagbélrák és a vastagbélrákot megelızı állapotok génexpressziós háttere a korábbi microarray vizsgálatok tükrében A 3.2 és a 3.3. fejezetben már részletesen volt szó arról, hogy meghatározott génekben környezeti karcinogének hatására kialakult, vagy örökletesen meglévı génmutációk indítják meg a vastagbélrák kialakulásának több lépéses folyamatát. A tumorokban felhalmozódó genetikai mutációkhoz gyakran társulnak egyéb genetikai és epigenetikai károsodások, mint például a heterozigótaság elvesztése (LOH), kulcsgének hipermetiláció általi inaktivációja (66, 67), az imprinting elvesztése (68) és a génamplifikáció. A fenti jelenségek végsı soron a gének mRNS és fehérjeszintő kifejezıdésének megváltozását, ezáltal a tumoros fenotípus létrejöttét eredményezik. A vastagbélrák nagyfokú heterogenitása, magas incidenciája és korai diagnózisának nehézségei miatt szükségessé vált a betegség fenotípusára utaló, mRNS szinten bekövetkezı változások nagy teljesítményő monitorozása. A vastagbélrák génexpressziós microarray vizsgálatának viszonylag kiterjedt irodalma van, azonban a kutatócsoportok által használt mintakezelési eljárások, microarray rendszerek, jelölési és hibridizációs technikák és elemzı módszerek nagy különbségeket mutatnak. Mindez megnehezíti az eddigi eredmények komplex megjelenítését. Napjainkig elsısorban vastagbélrákos szöveti mintákat használtak mRNS expressziós microarray elemzésekre (69, 70). Az adenoma és az IBD, mint vastagbélrákra hajlamosító elıállapotok génexpressziós mintázatát kevésbé vizsgálták. A közlemények jelentıs része a vastagbélrák és az ép vastagbélnyálkahártya génexpressziós
mintázatának
összevetését
tartalmazza
(71-86).
A
microarray
vizsgálatok során vastagbélrákban fokozottan, illetve csökkenten mőködı legfontosabb géneket az 1. táblázat foglalja össze.
31
Funkció Onkogének, tumor szuppresszor gének, apoptózis Sejtciklus szabályozás, DNS szintézis Transzkripció, transzláció Növekedési faktorok, citokinek
Jelátvitel
CRC-ben fokozott expresszió GRO1 [71,72,73,79,80,82], GRO2 [73], GRO3 [72,73], v-myc [73,75,79,82], bcl-2 [77,79], CAS [72,78], survivin[73,79] cyclin E [83], CDC25B [71,72,73,78,79] interferon-indukált protein-1 [71,73,79], -2[71,73] általános transzkripciós faktor IIIA[72,78] IGF-2 [85], TGF-β [71,74,76,81] TGF-β1 [71,73,78,81], PLAB [79,80] TGF-β-indukált gén [75,81,85], IFNindukált protein 9-27 [71] nm23 [77,82,83] nitrogén-oxid szintáz 2A [71] HEK2 [71]
Metabolikus enzimek, transzport fehérjék
homocisztein-hidroláz (ACHY) [72,73,78] Transzport: lipokalin 2 [73,78]
Sejtváz, sejtadhézió, ECM
filamin, fibronektin [75,85], biglikán [73,79], katepsin H [71], kollagén I α2 [73,75,77], kollagének (III,IV,V,X) [73,74,77,79,81,82], laktadherin [78], HME [72], TIMP-1 [77,83], MMP-1,2-3,-7,-11 [73,77,81]-13 [77]-10 [81], oszteonektin [72,73,75,77,79,86] interleukin-8 [73], trombospondin-2 [73,81], VEGF [83,86] oszteopontin [75,81]
Angiogenezis Immunszabályozás, gyulladásos válasz
CRC-ben csökkent expresszió MXI1[71] p53, SIVA, TOSO [83], 14-3-3σ [71], kaszpáz-10 [71]TRAIL[71,79] p21[84], WEE1 [84], TP1 [71] DNS-topoizomeráz-2α [84] CUTL1[84], transzkripciós faktor IIH [84] ERF1, cinkujj protein 139 [71], DRA [78]
CSF2Rβ [71], TNF-R [72] GM-CSFR α chain precursor [71] vitamin D receptor [71] pancreas polypeptid receptor [71] ERK1-kináz [78], DAG-kinase [72] foszfoenolpiruvát-karboxikináz (PCK1) [78] guanilát-cikláz aktivátor 1B [72,73,78] kreatin-kináz [71,73,78,81] Lipid anyagcsere: zsírsav-kötı fehérje 1 [73,78,86], karboxil-észteráz-2 [73,78] Szénhidrát anyagcsere: alkoholdehidrogenáz-3 [71,72,73,75], -2 [73,75] és -1 [75,81] karbon-anhidráz I, II [73,79,81,86] és IV [72,73,75,77,78,81] Transzport: szelén-kötı fehérje-1 [73,78] metallotionein [73,75,78,79,83] keratin-19 [78], citokeratin 20 [72,81] β-katenin [83], dinein nehéz lánc[71] CEACAM1[78,79] CEACAM7 [78] szialoforin (CD43) [71] trombospondin-4 prekurzor [72] IgG Fc-kötı protein [78], MHC-III HLA-RP, IgE Fc-fragment I-típusú receptor [71], adipszin [72,78]
1. táblázat Vastagbélrákban az ép nyálkahártyához képest fokozott, illetve csökkent mRNS expressziójú legfontosabb gének – 15 microarray study eredményei alapján
32
A gének besorolása a fı funkciójuk alapján történt annak ellenére, hogy bizonyos géntermékek több funkcionális csoportba is besorolhatók. A rövidítésjegyzékben nem szereplı rövidítések magyarázata: CAS = sejtbeli apoptózis érzékenységi protein; CSF2R = kolónia stimuláló faktor 2 receptor; DAG = diacil-glicerol; DRA = colon nyálkahártya asszociált protein; ERK = protein Ser/Thr kináz; GM-CSFR = granulocita-monocita kolónia stimuláló faktor receptor; GRO = növekedéssel összefüggı onkogén; HLA = humán leukocita antigén; HME = humán metalloproteináz; IFN = interferon;
MHC = fı
hisztokompatibilitási komplex; MXI: = MAX-protein asszociált protein; PLAB = prosztata differenciációs faktor; TRAIL: TNF- rokon apoptózis indukáló ligand
A vastagbélrák kialakulásának génexpressziós hátterét, az adenoma-dysplasiacarcinoma átalakulást microarray segítségével kevéssé kutatták. Újabban megjelentek a vastagbél jó- és rosszindulatú elváltozásainak microarray-vizsgálatával kapcsolatos közlemények, amelyekben 36 (87), 32 (88) 10 (75), 9 (89, 90) illetve 4 (72) colon adenoma
mintát
hasonlítottak
össze
adenocarcinomával
és
ép
vastagbél
nyálkahártyával. Nosho és mtsai az adenoma-carcinoma átmenettel összefüggı releváns génexpressziós eltéréseket (többek között emelkedett IGF2, Ki-67 expressziót és csökkent p21, HSP90, kaszpáz-7 expressziót) azonosítottak lokálisan malignus transzformációt mutató adenomás eset cDNS microarray (550 target szekvencia) vizsgálatával (91). Ugyanez a kutatócsoport, szintén a fenti kis denzitású cDNS microarray-vel mőtétileg eltávolított colorectális adenoma és invazív carcinoma között szignifikáns TIMP1, endotélsejt növekedési faktor-1, c-jun expresszió növekedést, illetve csökkent glutation-S-transzferáz, mucin-2 expressziót tapasztalt (87). Agrawal és mtsai közepes oligonukleotid microarray (12000 target szekvencia) vizsgálattal 107 fokozódó vagy csökkenı expressziójú transzkriptumot azonosítottak az adenoma-korai CRC-késıi CRC-áttét szekvencia elırehaladásával párhuzamosan (75). A témában legszéleskörőbb vizsgálatot van der Flier és mstai végezték: adenomás biopsziás mintákon, teljes genom oligonukleotid microarray rendszerrel végzett vizsgálataikkal elsısorban a Wnt/TCF jelátviteli út expressziós változásait térképezték fel az adenomacarcinoma átmenet során (88). Gyulladásos bélbetegségek expressziós chip elemzésébıl meghatározták az IBD-s betegek nyálkahártya mintáinak az ép, kontrollhoz viszonyított teljes (globális) génexpressziós profilját (92). A mintázatot a colitis ulcerosára (UC) és/vagy a Crohnbetegségre (CD) hajlamosító genetikai állapot lehetséges új markereinek azonosítására
33
(93, 94), az IBD-asszociált karcinogenezis markergénjeinak felderítésére (95), egy teljes kemokin család expressziójának IBD-s és ép minták közötti összehasonlítására (96), valamint IBD-s betegekben a perifériás vér mononukleáris sejtjeiben fellépı génexpressziós változások kimutatására használták fel (97). Eddig mRNS expressziós elemzést elsısorban nagymérető, mőtétileg eltávolított szövetmintákon végeznek. Az endoszkópos vizsgálat során a gyomor-bélrendszerbıl rutinszerően, minimális beavatkozással biopsziás minta vehetı, amely génexpressziós vizsgálata már korábbi betekintést enged a gyulladásos, a rákot megelızı és a tumoros megbetegedések hátterébe, és ezen minták alkalmasak a korai diagnosztikus célmolekulák azonosítására is. A vastagbél biopsziákat eddig csak néhány esetben vizsgálták expressziós microarray-kkel (88, 92, 94, 96, 98, 99), mivel az array technológia nagyobb mennyiségő kiindulási RNS-t igényel, mint amennyi a kis biopsziás mintákból nyerhetı. Ezen probléma áthidalására szolgálnak az újabban hozzáférhetıvé váló, megbízható, az elızıekben említett mRNS sokszorosító (amplifikációs) technikák, amelyek az eredeti génexpressziós mintázat megváltoztatása nélkül sokszorozzák meg az mRNS állományának a mennyiségét (100). A colorectális betegségek vizsgálataiban eddig használt microarray-k, és a felhasznált minták típusát foglaltam össze a 2. táblázatban. A génexpresszió microarray technikával való vizsgálatára többféle megközelítési mód létezik. A biológiai útvonalak részben ismert funkciójú génjeinek kifejezıdését vizsgálhatjuk kis, illetve közepes mérető array-ken. A megközelítıleg 1000 célszekvenciát tartalmazó cDNS array-hez nem szükséges különleges hibridizációs, mosási és leolvasó készülék. Ezek a nyitott-rendszerő jó minıségő és reprodukálható array-k hozzájárultak a microarray technológia elterjedéséhez. A kis, illetve közepes mérető, ún. általános microarray-ken a legfontosabb sejtfolyamatokkal kapcsolatos cél cDNS szekvenciák találhatók. Ezért ezek az array-k lehetıséget adnak különbözı, az egyes betegségekkel összefüggı sejtmőködések vizsgálatára (98, 107). A teljes genomszintő expressziós elemzést a betegségek kialakulását, progresszióját jellemzı vagy a gyógyszeres kezelés hatására történı génexpressziós változások nagy teljesítményő elemzésére, génexpressziós markerek, mintázatok azonosítására használhatjuk. A potenciális expressziós markerek validálásával és független betegcsoporton való tesztelésével a teljes genom microarray elemzések
34
hozzájárulhatnak az emberi tumorok és más betegségek diagnosztikájához és kezeléséhez. Microarray típus cDNS
Target denzitás kis (<3000)
Vastagbélrák Backert [84] Okuno [83]
közepes (8000-20 000)
oligonukleotid
Vastagbélrák és adenoma Nosho [87, 91]
globális (>20000) közepes (8000-20 000) globális (>20000) HGU133 Plus 2.0 teljes genom
Bertucci [77] Chiu [82] Kitahara [71] Kwon [74] Takemasa [86] Williams [79] Yanagawa [101] Zou [80] BirkenkampDemtroder [78, 81] Frederiksen [102] Croner [73] Wang [103] Gardina [104] Borthakur [105] Mansilla [106]
-
Li [89] Lin [90] Notterman [72] Agrawal [75]
IBD Okahara [94] Puleston [96] Uthoff [95] -
Lawrance [93]
-
Langmann [92]
van der Flier [88]
Csillag [99]
2. táblázat A vastagbélrák és megelızı állapotainak microarray vizsgálata A tanulmányok többségében mőtéti mintákat, a vastagon szedett kutatócsoportok biopsziás mintákat, míg a vastagon dılt betővel szedett kutatócsoportok lézer mikrodisszektált sejteket használtak a microarray vizsgálatokhoz.
A fenti szempontok figyelembe vételével, vizsgálataimban a még kevésbé elterjedt felhasználású, de a korai diagnosztikus markerek azonosítására alkalmas biopsziás mintákat alkalmaztam. A kisebb ráfordítást igénylı és laborunk számára hamarabb elérhetı vált kétcsatornás cDNS array rendszer mellett a késıbbiekben a teljes genom szintő elemzést lehetıvé tevı egycsatornás oligonukleotid rendszerrel szintén vastagbél biopsziás mintákat vizsgáltam, csoportonkénti nagyobb mintaszám mellett. Az általam használt HGU133 Plus 2.0 teljes genom microarray rendszerrel vastagbél betegségekben kapott eredményeit eddig mindössze öt munkacsoport publikálta (88, 99, 104-106), és közülük ketten alkalmaztak biopsziás mintákat (88, 99). A
dysplasia
nélküli,
dysplasztikus
adenoma,
colorectális
rák,
IBD
és
ép
vastagbélnyálkahártya minták párhuzamos, széleskörő összehasonlító microarray
35
vizsgálatára – amelyet PhD dolgozatomban szeretnék bemutatni - az irodalomban nem találtam példát.
3.7. A vastagbélrák microarray alapú diagnosztikai és prognosztikai lehetıségei A nagy teljesítményő microarray módszerek elterjedése lehetıvé teszi a primer és a metasztatikus vastagbél daganatok vizsgálatát. Segítségükkel azonosíthatóvá válnak olyan gének, amelyek a daganatképzıdésért, a helyi, infiltratív terjedésért, az angiogenezis folyamatának lokális felülmőködéséért, a helyi immuntolerancia kialakulásáért, valamint az áttétképzésért, az áttétes daganatsejtek megtelepedéséért és aktivációjáért
felelısek.
Kulcsfontosságú
gének
megtalálása
segíthet
olyan
diagnosztikus miniarray-k létrehozásában, amelyek segítségével egy szövetminta segítségével információkhoz jutunk a betegség aktuális stádiumáról és a prognózisról. A microarray vizsgálatok nem helyettesíthetik a szövettani vizsgálatot, de kiegészíthetik azt számos olyan információval, ami befolyásolhatja a klinikus döntését a terápia megválasztásában, illetve annak módosításában. Microarray vizsgálatok segítségünkre lehetnek új terápiás molekulák funkcionális vizsgálatában is, mind in vitro, mind in vivo kísérletekben. A jól beállított, standardizált microarray diagnosztika esetén lehetıség nyílik a minta feldolgozás és kiértékelés automatizációjára, ezzel a rutin számára elérhetıbbé és széles körben alkalmazhatóvá tehetık ezek a vizsgálatok. A microarray vizsgálatok nyújtotta mRNS expressziós adatok diagnosztikai célú hasznosítása már megkezdıdött. Megjelentek olyan tanulmányok, amelyek a vastagbélrák progressziójával és az áttétképzés génexpressziós hátterével (74-79, 89, 90 101, 102), a colorectális rák altípusainak mRNS expressziós profil (GEP) alapján történı meghatározásával (77, 80, 102), génexpressziós mintázatok és klinikopatológiai paraméterek összehasonlításával (77, 80, 81, 82) és az mRNS expresszión alapuló kockázatbecslés kifejlesztésével foglalkoznak (103). A mőtéti és biopsziás szövetminták mellett a perifériás vér mRNS expressziós vizsgálata is kulcsfontosságú lehet a daganatos megbetegedések korai, molekuláris alapú, diagnosztikai és prognosztikai lehetıségeinek megteremtésében (108-112).
36
A teljes genom microarray elemzések által szolgáltatott óriási adathalmaz kezelése és feldolgozása széleskörő bioinformatikai hátteret igényel. Az automatikus diagnosztikus célú betegség-osztályozási módszerek kifejlesztéséhez - a méhnyakrák képanalízis alapú szőréséhez hasonlóan - többváltozós statisztikai elemzés szükséges (113, 114).
37
4.0.CÉLKITŐZÉSEK Vizsgálataim célja •
a vastagbél biopsziás minták microarray vizsgálatra való alkalmazhatóságának igazolása,
•
az oligonukleotid és cDNS microarray rendszerek összevetése, elınyeik, hátrányaik, felhasználhatóságuk és korlátaik vizsgálata,
•
a microarray vizsgálatok eredményeit igazoló (validációs) assay rendszer kifejlesztése és tesztelése,
•
a vastagbél adenoma – dysplasia - carcinoma szekvencia génexpressziós hátterének kutatása: azon gének meghatározása, amelyek megváltozott expressziója indikátora lehet a colorectális karcinogenezisnek,
•
a
génexpressziós
eredmények
alapján
a
vastagbélbetegségek
patomechanizmusával összefüggı károsodott biológiai útvonalak keresése, •
valamint
a
vastagbélbetegségek
fı
diagnosztikus
csoportjainak
megkülönböztetését lehetıvé tevı elkülönítı gének azonosítása, génexpressziós alapú kapcsolat keresése volt a vastagbél különbözı szövettani elváltozásai között.
38
5.0.BETEGEK ÉS MINTÁK A diagnosztikus célzatú rutin colonoscopia elıtt a betegek a Tudományos Kutatásetikai Bizottság által jóváhagyott betegtájékoztató és beleegyezı nyilatkozatot írtak alá, melyben beleegyeztek a biopsziás minták kutatási célú felhasználásába. Egyik beteg sem részesült a késıbbiekben diagnózisra került vastagbélbetegségére vonatkozó gyógyszeres kezelésben a colonoscopia idıpontjában, illetve azt megelızıen 3 hónappal. Az RNS izolálás céljából vett mintákat azonnal RNAlater stabilizáló reagensbe helyeztem és -80°C-on tároltam felhasználásukig. A fehérje szintő vizsgálatra a szövettani diagnosztika céljából készült paraffinos blokkokból készített metszeteket használtam. A 3. táblázatban a vizsgálataimba bevont betegcsoportokat és a csoportonkénti legfontosabb adatokat tüntettem fel.
Esetszám
Nı/Férfi
Életkor (év, átlag)
Ép, egészséges
33
16/17
Colitis ulcerosa
12
8/4
Crohn-betegség
8
6/2
Vastagbélrák Dukes A, B Vastagbélrák Dukes C, D Adenoma dysplasia nélkül Dysplasztikus adenoma Összesen
31
11/20
37
17/20
31
12/19
30
14/16
182
84/98
26-83 55.7 26-75 45.3 18-70 34.9 53-90 70.7 34-87 64.8 21-89 70.2 52-95 72.7 59.2
Minta helye jobb colonfél/bal colonfél 4/29 0/12 6/2 10/21 5/32 10/21 11/19 46/136
3. táblázat A vizsgálatokba bevont betegek betegségcsoportonkénti száma és a betegek legfontosabb adatai A Clontech microarray elemzés céljából a biopsziás mintát a vastagbél kóros és ép részébıl vettük. A vastagbél biopsziás minták szövettani elemzését, ill. a gyulladás szövettani aktivitásának meghatározását a Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti
Rákkutató
Intézet
tapasztalt
patológusa
végezte.
A
gyulladásos
bélbetegségekbıl származó minták mind endoszkóposan, mind szövettanilag aktívak
39
voltak. A vastagbélrákos eseteket korai és elırehaladott csoportra osztottuk. A korai rák csoportba a Dukes A és B stádiumú (nyirokcsomó és távoli szervi áttét hiánya), az elırehaladott csoportba a Dukes C és D (nyirokcsomó és/vagy távoli szervi áttét megléte) stádiumú vastagbéldaganatok kerültek. Szöveti microarray (Tissue MicroArray = TMA) elemzésre 16 olyan beteg paraffinos mintáját alkalmaztam, akiknek az RNS mintáját Affymetrix microarray-n vizsgáltam, valamint 113 független betegmintát is teszteltem. A 4. táblázat az egyes vizsgálatokban felhasznált biopsziás minták számát jeleníti meg. Betegcsoport [betegszám]
Affymetrix
Clontech b/n
EGFR RT-PCR b/n 0 0
Taqman RT-PCR
TMA
0 3/3
TOP1 RT-PCR b/n 0 0
Normális [33] Colitis ulcerosa [12] Crohn-betegség [8] Vastagbélrák Dukes A, B [31] Vastagbélrák Dukes C, D [37] Adenoma dysplasia nélkül [31] Dysplasztikus adenoma [30] Összesen [182]
8 9
5 7
62 0
5
3/3
0
0
1
0
7
2/2
3/3
3/3
6
89
8
4/4
6/6
6/6
4
57
6
9/9
0
0
6
37
9
1/1
0
0
6
44
52
44
18
18
35
289
4. táblázat A vizsgálatokban módszerenként felhasznált biopsziás minták számszerinti bontása
40
6.0.MÓDSZEREK 6.1. Teljes RNS izolálása Qiagen RNeasy Mini Kittel A friss fagyasztott biopsziás minták lizálása és homogenizálása 300µl GITC-tartalmú és 3µl β-merkaptoetanolt tartalmazó lízis pufferben történt, Polytron homogenizátorral 3040 másodpercig. A lizált minták emésztése 55ºC-on 10 percig proteináz K oldatban történt. Szilika membrános tisztítást követıen a genomiális DNS teljes eltávolítására DNÁz I kezelést végeztem. A teljes RNS-t 50µl RNáz-mentes vízben eluáltam. Az izolált RNS mennyiségi és minıségi vizsgálatát abszorbancia méréssel, real-time RTPCR-rel (Light Cycler G6PDH Housekeeping Gene Set, Roche) és RNáz mentes agaróz gélen való futtatással végeztem. A microarray analízis csak olyan intakt RNS-bıl történt, amely az agaróz gélen szabályos 18S és 28S riboszómális RNS mintázatot mutatott és pozitív real-time RT-PCR reakciót adott. 6.2. Atlas cDNS microarray analízis Mivel a biopsziás mintákból 10 µg-nál kevesebb teljes RNS vonható ki - amely hibridizációs reakcióhoz nem elegendı -, az mRNS frakció sokszorozása T7-módszerrel történt (MessageAmp I aRNA Kit, Ambion Inc., USA). Fluoreszcensen jelölt próbák szintézisét amino-allil UTP-k, valamint Cy-3 és Cy-5 monoreaktív festékek (Amersham Biosciences, Anglia) felhasználásával végeztem. Az mRNS expressziós profil meghatározása Atlas Glass microarray-ken (BD Clontech, USA, 1081 gén) történt. A fluoreszcensen jelölt próba 200µl-ét (egyenlı mennyiségő Cy3-, illetve Cy5-jelölt próba keverékét) elımelegített hibridizációs keverékbe pipettáztam és a chipekre 50ºC-on 16 órán át hibridizáltam. A mosást szobahımérsékleten végeztem 0.75mM DTT tartalmú mosóoldatokban. A lemezeket szén-dioxidos lefújással szárítottam, majd a fluoreszcens jelek észlelése Axon GenePix4000B leolvasó készülékkel történt 532nm (Cy3) és 635nm (Cy5) hullámhosszon.
41
6.3. Affymetrix oligonukleotid microarray vizsgálat A teljes RNS-bıl biotinnal jelölt cRNS próbákat szintetizáltam GeneChip cDNS szintézis reagensek, mintatisztító kit és Enzo BioArray HighYield RNA Transcript Labeling Kit felhasználásával. 5-8µg teljes RNS-rıl reverz transzkripciót végeztem 100pmol T7-oligo(dT) primer, DTT (10mM végkoncentrációban), négyféle dNTP (egyenként 500µM végkoncentrációban), 200U SuperScript II reverz transzkriptáz enzim felhasználásával 1X elsı-szál szintézis pufferben 42°C-on 1 óráig. A teljes RNS mintához még a reverz transzkripció elıtt e teljes jelölési folyamat ellenırzése céljából bakteriális PolyA kontroll RNS-eket kevertem alacsony koncentrációban (lys, phe, thr, dap). A második szál cDNS szintézise 10U/minta E.coli DNS-ligáz, 40U/minta E.coli DNS-polimeráz I, 2U E.coli RNáz-H enzimek, 1X második-szál reakció puffer, valamint négyféle dNTP (egyenként 200µM végkoncentrációban)
alkalmazásával
történt 2 óráig 16°C-on. A duplaszálú cDNS oszlopos tisztítását követıen biotinnal jelölt cRNS szintézise következett biotinnal-jelölt ribonukleotidok és T7 RNSpolimeráz segítségével 37°C-on 4 órán át. A be nem épült ribonukleotidok eltávolítása céljából a jelölt cRNS oszlopos tisztítását végeztem, majd a tisztított cRNS minták koncentrációját abszorbancia méréssel határoztam meg. A jelölt cRNS mintákat 94°Con 35 percig inkubáltam fragmentációs pufferban (40mM Tris-acetát, pH 8.1, 100mM kálium-acetát és 30mM magnézium-acetát), hogy fém-indukált hidrolízissel 35-200 ribonukleotid hosszúságú cRNS fragmenteket nyerjek. Hibridizációs pufferrel (100mM MES, 1M [Na+], 20mM EDTA és 0.01% Tween 20) elıhibridizáltam a HGU133 Plus2.0 microarray-ket 45°C-on 10-15 percig. Az elıhibridizációnál használt oldatot eltávolítottam és 200µl mintánként 10µg fragmentált cRNS-t tartalmazó hibridizációs mixet vittem a microarray-kre. A hibridizációs mix a fragmentált cRNS-en (0.05µg/µl) és a hibridizációs pufferen kívül hering sperma DNS-t (0.1mg/ml Promega, Wisconsin, USA), az aspecifikus hibridizáció gátlására acetilált BSA-t (0.5mg/ml, Invitrogen), valamint négy, a hibridizáció belsı kontrolljaként használt bakteriális és bakteriofág cRNS-t (1.5pM BioB, 5pM BioC, 25pM BioD és 100pM Cre) és 50pM orientációs B2 oligonukleotid kontrollt tartalmazott. A hibridizáció 45ºC-on 16 órán át hibridizációs kamrában történt. A chipeket Fluidic Station 450 berendezéssel mostam, és antitest amplifikációs festési módszerrel festettem (EukGE_Ws_2v4 mosási protokoll és
42
10µg/ml sztreptavidin-fikoeritrin (Molecular Probes) felhasználásával). A fluoreszcens jeleket GeneChip 3000 szkennerrel detektáltam. 6.4. Statisztikai kiértékelés 6.4.1. cDNS microarray adatok kiértékelése A leolvasott array-ket GenePix Pro 4.1 szoftverrel értékeltem ki. A pontok (spotok) és a helyi háttér automatikus leolvasása után meghatároztam a mediánok és az átlagok hányadosát (Cy3/Cy5). A nem homogén hátterő, illetve nem teljes háztartási géncsoportú microarray-ket kizártam a további elemzésbıl. Azért, hogy a chipek összehasonlíthatóak legyenek, az észlelt pontok mediánjai hányadosainak átlagát 1-re állítottam be (normalizáció). Az eredményeket az Acquity 3.1 programba vittem és adatcsoportokat határoztam meg. Az adatcsoportokat osztályozási kategória szerint soroltam be. Meghatároztam minden paraméter átlagát, mediánját és a standard deviációkat. Egy gént csökkent mőködésőnek akkor tekintettem, ha a mediánok hányadosa ± SD <0.5, fokozott mőködésőnek, ha a mediánok hányadosa ± SD >2.0. Egyutas (csoport) ANOVA-t és többváltozós módszereket (diszkriminancia analízist, faktorelemzést és hierarchikus cluster analízist) SAS 6.12 statisztikai programmal, a hierarchikus cluster analízist Ward módszerrel végeztem (euklidészi távolságok). Az esetek
génexpressziós mintázat
alapján
való
clusterezése
a szőrt
ANOVA
eredményeken alapult. A gén annotációja és mőködésének besorolása az Atlas Gene List Version 4.0 felhasználásával történt. A funkcionális elemzést és az érintett biológiai útvonalakat Pathway Assist 2.53 programmal jelenítettem meg. 6.4.2. Affymetrix oligonukleotid microarray adatok kiértékelése Elıfeldolgozás és minıségi elemzés. A minıségi elemzést a Tumour Analysis Best Practices Working Group ajánlásai alapján végeztem (115). A beszkennelt arrayképeket mőtermékek keresése céljából átvizsgáltam, továbbá megállapítottam present %-ot (>25%) és az RNS degradáció mértékét. Valamennyi biopsziás mintából készült microarray megfelelt a minıségi követelményeknek. A fenti ajánlásokat
43
követve, két független normalizációs módszert alkalmaztam: a MAS5.0-t és az RMA-t (116). A kiváló specificitású és megfelelı szenzitivitású MAS5.0 módszerrel chipen belüli normalizálást végeztem. Ezzel szemben az RMA módszer, amely megfelelı specifitással és kiváló szenzitivitással bír, chipek közötti normalizálást jelent (115). Az összes mérés legjobb összehasonlítása és normalizációja céljából a további adat elemzést és interpretációt mindkét elıfeldolgozó módszer után elvégeztem. Eltérı expressziójú gének kiválogatása (feature selection). Az 52 expressziós mérést tartalmazó teljes adathalmazt osztályokba rendeztem a minták szövettani tulajdonságai alapján. Ez a szelekciós folyamat 6 új adathalmazt eredményezett (CRC vs. ép, adenoma vs. ép, IBD vs. ép, CRC DukesB vs. CRC DukesC-D, dysplasia nélküli adenoma vs. dyplasztikus adenoma, UC vs. CD), amelyeket a továbbiakban egyedi osztályozási feladatokként kezeltem. A karakterisztikus expressziós mintázatok meghatározására PAM módszert (“Prediction Analysis for Microarrays” módszert) alkalmaztam (117). A PAM finom küszöbérték megállapítást (soft tresholding) alkalmaz annak érdekében, hogy olyan minimális génlista jöjjön létre, ami a két csoport közötti erıs elkülönítı tulajdonsággal rendelkezı géneket tartalmazza. A Tumour Analysis Best Practices Working Group 5-9 mintapár egy mintahalmazban való elemzését javasolja (115). A maximális predikciós pontossággal bíró minimális génlista keresésére az egyes elemzések során magában hordozza azt a hátrányt, hogy csak nagyon rövid génlistával különböztethettem volna meg a két csoportot. Ezért úgy döntöttem, hogy mindkét feldolgozás során a PAM határérték csökkentésével kiválasztjuk a különbségeket jelzı elsı 100 gént. Végezetül a két elemzési módszer során nyert mindkét génlistán megtalálható géneket elemeztem. Szintén PAM módszerrel hoztam létre az ún. hibás klasszifikációs errort-t megjelenítı individuális cross-validációs plotot minden csoport esetében. Egyéb elemzések. Az elkülönítı génexpressziós mintázatok szemléltetésére hierarchikus cluster elemzést végeztem Genesis szoftver segítségével (118). Az eredmények annotációja (a kapott gének nevesítése az azonosító alapján) az Affymetrix Netaffx analízis központjával történt (http://www.affymetrix.com /analysis/index. affx). Az adathalmazok további elemzés céljából elérhetık a Gene Expression Omnibus adatbankban (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), a GSE4183 hivatkozási számon.
44
Diszkriminancia elemzés. Az adatkezelést és a változók dimenziójának csökkentését a SAS 8.2 statisztikai programcsomaggal végeztem. A redukált változók diszkriminancia elemzésére az SPSS 15.0 programot használtam. A diszkriminancia eljárás során lépésenkénti eljárást használtam, amelynek egyes lépéseiben mindig a legalkalmasabb változót írtam a modellbe. A vizsgált változókról feltételeztem, hogy többdimenziós normál eloszlásúak közös kovariancia mátrix-szal. A modellépítés végén megkaptam a legjobban diszkrimináló modellt (a Wilks’ Lambda szignifikáns volt), amelyben a legerısebben diszkrimináló gének szerepeltek. A klasszifikáció helyességét megerısítve elkészítettem az. ún. Leave-one-out klasszifikációs táblát is. Az
adenoma-dysplasia-carcinoma
szekvenciára
jellemzı
gének
meghatározása. A microarray adatok elıfeldolgozására RMA háttér korrekciót, quantile normalizációt és ún. „median polish summarizationt”-t alkalmaztam. Az elıfeldolgozott microarray adatokból meghatároztam az egyes betegségcsoportokra (ép, dysplasia nélküli adenoma, dysplastikus adenoma, korai és késıi vastagbélrák) jellemzı mRNS expressziós értékeket minden egyes transzkriptum esetében. Az expressziós értékek és a betegség stádium közötti összefüggést Kendall rangkorrelációs módszerrel határoztam meg (119). A két változó összefüggését a Kendall tau-val jellemeztem, amely értéke -1-tıl 1-ig terjedhet, és minél közelebb van a szélsı értékekhez, annál erısebb a két változó összefüggése. Az mRNS expresszió és a betegség elırehaladása között akkor állapítottam meg összefüggést, ha a tau abszolút értéke ≥ 0,4 volt mind a microarray adatok, mind a Taqman RT-PCR adatok esetében. A p-érték azt fejezi ki, hogy mi a valószínősége annak, hogy a talált korreláció a véletlenbıl származik. Az elemzések kivitelezéséhez az R-környezetet használtam (120). 6.5. A microarray adatok megerısítése valós idejő RT-PCR-rel 6.5.1. Light Cycler elemzés A microarray eredmények megerısítésére real-time RT-PCR elemzést használtam (Roche
LightCycler).
Egy
lépéses
RT-PCR-t
végeztünk
különbözı
kitek
felhasználásával (LightCycler h-β2M Housekeeping Gene Set és RNA Master Hybridization Probes Kit). A relatív számszerősítéshez referenciaként a kereskedelmi forgalomban elérhetı β-2-mikroglobulint (142bp hosszú fragment), célgénként az
45
általam tervezett és szintetizáltatott epidermális növekedési faktor receptort (EGFR) (227bp hosszú fragment) vagy DNS topoizomeráz I-et (Top1) (184bp hosszú fragment) használtam. A primer és hibridizációs próba szekvenciák a következıek voltak: EGFR9 S primer : 5'- atc-ctg-ccg-gtg-gca-tt, EGFR12 A primer : 5'-gtt-cag-gct-gac-gac-tgc-a, EGFR-FL probe: 5'-cag-gac-gga-cct-cca-tgc-ctt-tga--FL, EGFR-LC probe: 5'-LC Red 640--cct-aga-aat-cat-acg-cgg-cag-gac-c--PH az EGFR esetében, és Top1-fw primer: 5'aca-tca-tgc-tta-acc-cta-gtt-cac, Top1-as primer: 5'- cag-agc-aag-ctt-gtc-gat-g, TOP1-FL probe: 5'-cgg-atc-ttg-tcc-aca-cat-ttt-ttc-agc--FL, TOP1-LC probe: 5'-LC Red 640--ccgagc-agt-ctc-gta-ttt-ctg-cca-g a DNS topoizomeráz I esetében. A relatív hányadosok (beteg minta/ép minta ugyanabból a betegbıl) meghatározása RelQuant programmal történt. 6.5.2. Taqman RT-PCR 52 kiválasztott gén expresszióját TaqMan valós idejő PCR-rel mértem meg, Applied Biosystems Mikrofolyadék Kártyarendszer felhasználásával. A chipvizsgálatokba bevont 52 mintából 35 esetén tette lehetıvé a microarray vizsgálatok után maradt RNS izolátum mennyisége a valós idejő PCR elvégzését. 400ng/minta teljes RNS-t cDNS-sé írtam át Taqman Reverse Transcription Kit felhasználásával (Applied Biosystems). A cDNS minıségét CK20 és PBGD real-time PCR-rel ellenıriztem Roche Light Cycleren. Az 52 gén expressziós vizsgálatát TLDA-n végeztem (Taqman Low-Density Array for Gene Expression: Format 96a) 100ng/minta cDNS-t templátként használva és Taqman Universal PCR Master Mix alkalmazásával. A méréseket ABI PRISM® 7900HT szekvencia detektáló rendszerrel kiviteleztem a gyártó elıírásait követve (http:// www.appliedbiosystems.com). Az adatelemzés SDS 2.2 szoftverrel történt. A delta Ct értékeket (amelyek a riboszomális 18S RNS expresszióhoz normalizált expressziót jelentik) a szövettani csoportoknak megfelelıen csoportosítottam, majd Student t-tesztet végeztem az expressziós értékek csoportok közötti összehasonlítására.
46
6.6. A potenciális marker molekulák fehérjeszintő vizsgálata 6.6.1. EGFR immunhisztokémia Formalinban fixált, paraffinba ágyazott 4 µm vastag colon biopsziákból készített metszeteket deparaffináltam és rehidráltam. Az antigén feltárást nukleázmentes proteináz K-s emésztéssel végeztem 20 percig szobahımérsékleten. Kétszeri PBS-ben történı mosást követıen, az endogén peroxidáz aktivitást a metszetek 30 perces szobahımérsékleten végzett 3%-os hidrogén-peroxidos inkubációjával gátoltam. 3x3 perces PBS mosás után, az aspecifikus kötıdés megakadályozására a metszeteket 1%-os BSA-PBS oldatban 10 percig szobahımérsékleten inkubáltam. Ezután a metszeteket 37°C-on 60 percig nedves kamrában hígított EGFR kultúra felülúszó antitesttel (1 µl EGFR antitest és 40 µl PBS) (Clone: H-11, DAKO) inkubáltam. Háromszori PBS mosást követıen LSAB2 rendszer (DAKO) felhasználásával jelkonverzió, majd haematoxylin-magfestés történt.
6.6.2. Szöveti microarray vizsgálat Összesen 119 betegbıl származó, 37 vastagbél adenoma, 44 dysplasztikus adenoma, 89 korai vastagbélrákos (Dukes A és B stádiumú), 57 elırehaladott vastagbélrákos (Dukes C és D stádiumú) és 62 ép vastagbél mintából készült, formalinban fixált paraffinba ágyazott blokkból, elızetes mikroszkópos orientáció alapján 1 mm-es szövethengereket (ún. core-okat) helyeztem közös blokkokba, majd ezekbıl 5 µm-es vastagságú szövettani metszeteket készítettem hagyományos tárgylemezre. Ezek az ún. TMA lemezek. A mintákat random módon elosztva helyeztem fel, a felhelyezést és a kiértékelést nem ugyanaz a személy végezte. A TMA lemezek immunhisztokémiai jelölésére
az
alábbi
CRC-progresszió
asszociált
fehérje
ellenes
antitesteket
alkalmaztam: poliklonális nyúl anti-human oszteopontin antitestet (Chemicon, Temecula, USA) 1:2000 hígításban, a nyúl anti-oszteonektin antitestet (Chemicon, AB1858) 1:1000 hígításban 1 órán át szobahımérsékleten. A markerek expresszióját EnVision+ polimer torma-peroxidáz konjugáttal (Dako) és DAB-hidrogén-peroxidáz kromogén-szubsztrát
kit
(Dako)
felhasználásával
mutattam
ki.
Az
immunhisztokémiailag festett TMA lemezeket Mirax Desk szkenner segítségével nagy felbontásban, digitálisan rögzítettem (Zeiss, Göttingen, Germany), a TMA lemezek
47
digitális kiértékelését Mirax TMA Module programmal végeztem (Zeiss). A kiértékelés során - mind az oszteopontin, mind az oszteonektin festés esetén - a daganatos hámban jelentkezı fehérje expressziót intenzitás és sejten belüli lokalizáció alapján score-okkal jellemeztem: -2: nincs jelölıdés; 0: a hámsejtek apikális cytoplazmájában jelentkezik jelölıdés; 1: az apikális és a bazális cytoplazma is jelölıdött; 2: diffúz, intenzív cytoplazmatikus jelılıdés. A fehérje markerek expressziója és a betegség stádiuma közötti összefüggés statisztikai elemzésére Pearson khi-tesztet és Fischer exact tesztet használtam. A két kategorikus változó felhasználásával (csoport és score) kontingencia táblázatot készítettem. A két változó összefüggésének mérésére khi2-teszt statisztikai elemzést – a Pearson reziduumok négyzetének összegzését - végeztem. A statisztikailag szignifikáns esetekben (p<0,05) a részletesebb elemzés eredményét a Pearson reziduumok segítségével tettem láthatóvá. Grafikai módszerek, mint például az asszociációs plot, alkalmasak az összefüggés szemléltetésére (121).
48
7.0. EREDMÉNYEK 7.1. A vastagbél betegségekben csökkenten vagy fokozottan mőködı gének azonosítása 7.1.1. Clontech kétcsatornás cDNS microrray rendszer Azokat a géneket, amelyek a colorectális rák, illetve az adenoma, illetve az IBD minták legalább 2/3-ában fokozott, illetve csökkent mőködésőek, az adott betegségben általánosan felül- illetve alulszabályozott géneknek tekintettem. A vastagbélrákban a DNS replikációban, a sejtciklusban, extracelluláris mátrix átépítésben, az átírás (transzkripció) szabályozásában, az onkogenezisben és a növekedési faktor irányította sejtproliferációban közrejátszó gének fokozott mőködését észleltem (5. táblázat). A DNS javításban és bizonyos apoptózis szabályozásban szerepet betöltı gének mőködése viszont mérséklıdött.
Génnév DNS replikáció és javítás RAD52 homológ RAD51 homológ tankiráz DNS topoizomeráz 2α DNS topoizomeráz 1 replikációs fehérje A1 Sejtciklus szabályozás ciklin-A1 ciklin-dependens kináz 10 „clear” homológ gátló cinkujj doménes sejtnövekedés szabályozó NIMA-kölcsönható fehérje 1 ECM átépítés keratin-5 perlekán enaktin (nidogén 1) Transzkripció szabályozás interferon regulátor faktor 5 interferon regulátor faktor 6 E74-szerő faktor 2 Sejtproliferáció, onkogenezis pleiotrofin efrin-B2 vaszkuláris endoteliális növekedési faktor B hepatocita növekedési faktor transzformáló növekedési faktor β2
49
Gén szimbólum
T/N hányados
RAD52 RAD51 TNKS TOP2A TOP1 REP1A
0,45 0,49 2,10 3,06 9,89 11,16
CCNA1 CDK10 SHOC2 CGRRF1 PIN1
2,65 2,66 2,82 3,71 3,85
KRT5 HSPG2 NID1
2,44 2,72 2,85
IRF5 IRF6 ELF2
2,37 3,66 7,70
PTN EFNB2 VEGFB MET TGFB2
2,01 2,20 2,21 2,31 2,39
Génnév epidermális növekedési faktor receptor breast cancer 2 v-jun onkogén Apoptózis protein foszfatáz-2α BCL2-kölcsönható killer molekula dizintegrin és metalloproteináz domén 17 TNF receptor szupercsalád 10c tagja (TRAILR3) TNF receptor-asszociált faktor 6 kaszpáz-4 TNF receptor szupercsalád 6 tagja (Fas)
Gén szimbólum EGFR BRCA2 JUN
T/N hányados 2,44 4,61 14,67
PP2A BIK ADAM17 TNFRSF10C TRAF6 CASP4 TNFRSF6
0,39 0,47 2,03 2,50 3,92 4,56 6,93
5. táblázat A Clontech cDNS microarray vizsgálat szerinti legfontosabb gének, amelyek vastagbélrákban az ép nyálkahártyához képest megváltozott expressziót mutatnak A T/N hányados a daganatos és az ép minták fluoreszcencia intenzitásainak hányadosát jelenti. Ha értéke 0.5 alatti, a gén CRC-ben csökkent mőködéső; ha 2 feletti, akkor vastagbélrákban fokozottan expresszálódott.
Az adenomában az ép nyálkahártyához képest eltérı, károsodott génexpresszió igazolható az apoptózis (TNF receptor-asszociált faktor 6, BAX), a növekedési faktorok és receptoraik és a hozzá kapcsolódó jelátviteli utak (kalgranulin A, KIT ligand, Ran GTPáz aktiváló protein 1), valamint az onkogenezis és a tumor szuppresszió (növekedési faktor receptor kötı protein 10, p53-indukált protein 11 és a bétaglikán) funkcionális csoportokhoz tartozó génekben. Az IBD-ben az immunszabályozásban (GM-CSF2, CXCL13, MMP-3, MMP-12 és az interleukin 1 receptor antagonista), a transzport folyamatokban és a növekedési faktorok szabályozta sejtproliferációban (B-sejt növekedési faktor 1, GM-CSF) szerepet játszó gének expressziós változásai voltak jellemzıen kimutathatók. 7.1.2. Affymetrix egycsatornás oligonukleotid microarray rendszer A leginkább eltérı mőködéső gének funkcionális csoportosítása minden fı diagnózis csoportban az ép kontrollhoz viszonyítva az RMA-val normalizált „top” 100 gén elemzésével történt.
50
Vastagbélrákban a sejtproliferációval, a sejtadhézióval és a transzport folyamatokkal kapcsolatos gének expressziója tért el elsısorban a normálistól. Számos transzkriptum megváltozott expressziója az immunszabályozás megváltozását jelzi. Ezekhez az mRNS expressziós változásokhoz társul több, a sejtproliferáció szabályozásában közrejátszó jelátviteli utakhoz, valamint az érképzıdéshez kapcsolódó gén károsodott kifejezıdése is (6. táblázat). Adenomában az ép nyálkahártyától eltérı, károsodott génexpressziót igazoltam a transzport- (ABCA8, TRPM6, akvaporin-8), a sejtadhézió- (CXCL12, CD44, ADAMszerő decizin 1, klaudin-1, α6-integrin), a metabolizmus- (karbon-anhidráz I, foszfodiészteráz-3A) és a sejtproliferáció (MET, CXCL2, CXCL3 onkogének, tumorasszociált kalcium jelátvivı 2) funkcionális csoportokhoz tartozó génekben. IBD-ben viszont az immunszabályozással (IFITM3, IFITM1, proteaszóma β9 alegység, ubikvitin D, indolamin-pirrol 2,3 dioxigenáz), a sejtproliferációval (REG1A, triptofanil-tRNA szintetáz, interferon stimulált gén 20kDa, CXCL1, CDC25B) és az anyagcserével (kitináz 3-szerő molekula 1, karbon-anhidráz I, zinkujj fehérje 91) kapcsolatos gének mRNS szintjének változását tapasztaltam. Szintén észleltem az extracelluláris mátrix átépülésben (MMP1, MMP3, MMP9, MMP12, TIMP1), és a sejten belüli jelátviteli utakban (STAT1, CXCL6) szerepet játszó gének károsodott mőködését.
51
Génnév Sejtproliferáció inzulinszerő növekedési faktor kötı fehérje 5 kemokin (C-X-C motívum) ligandum 1 A-típusú endotelin receptor 5 kemokin (C-X-C motívum) ligandum 2 regenerációs sziget-eredető 1α WNT1 indukálható fehérje 1 szöveti metalloproteináz gátló 1 oszteonektin Sejtadhézió, ECM átépítés kadherin-5 kollagén-18A1 kollagén-4A2 kollagén-12A1 kollagén-6A3 kollagén-1A2 melanoma sejtadhéziós molekula kollagén-1A1 kollagén-15A1 nidogén (enaktin) γ1-laminin kollagén-5A2 Transzport kollagén-4A1 lipokalin-2 kettıs oxidáz-2 akvaporin-8 ATP-kötı kazetta A alcsalád 8 tagja Immunszabályozás kemokin (C-X-C motívum) ligandum 6 kalgranulin A lebomlást gyorsító faktor Jelátvitel G-fehérjéhez kötött receptor 116 kemokin (C-X-C motívum) ligandum 5 prosztaglandin D2 receptor citokin jelátvitel szuppresszor 3 Érképzıdés von Willebrand faktor kináz inszerciós domén receptor (VEGFR2) interleukin-8
Affymetrix azonosító
Gén szinbólum
Hányszoros változás CRC vs ép
211959_at 204470_at 204464_s_at 209774_x_at 209752_at 229802_at 201666_at 200665_s_at
IGFBP5 CXCL1 EDNRA CXCL2 REG1A WISP1 TIMP1 SPARC
5,3 13,4 5,0 9,5 18,8 5,1 3,4 2,9
204677_at 209081_s_at 211964_at 225664_at 201438_at 202404_s_at 210869_s_at 202311_s_at 203477_at 202007_at 200770_s_at 221729_at
CDH5 COL18A1 COL4A2 COL12A1 COL6A3 COL1A2 MCAM COL1A1 COL15A1 NID1 LAMC1 COL5A2
2,7 2,9 2,9 6,5 3,4 5,0 3,5 5,5 3,0 2,3 2,0 3,1
211981_at 212531_at 219727_at 206784_at 204719_at
COL4A1 LCN2 DUOX2 AQP8 ABCA8
6,7 7,7 9,7 0,1 0,2
206336_at 202917_s_at 201925_s_at
CXCL6 S100A8 DAF
10,9 17,3 4,5
212950_at 214974_x_at 215894_at 227697_at
GPR116 CXCL5 PTGDR SOCS3
3,7 26,7 0,2 5,9
202112_at 203934_at 202859_x_at
VWF KDR IL8
4,2 2,3 20,2
6. táblázat Az Affymetrix teljes genom oligonukleotid microarray vizsgálat szerinti legfontosabb gének, amelyek vastagbélrákban az ép nyálkahártyához képest megváltozott expressziót mutatnak
52
7.2. A colorectális adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia génexpressziós markerei 7.2.1. Az adenoma-dysplasia-carcinoma átmenet folyamán szekvenciálisan változó expressziójú gének meghatározása Affymetrix microarray vizsgálattal Az elıfeldolgozott microarray adatokból minden egyes transzkriptum esetében meghatároztam az egyes betegségcsoportokra (ép, dysplasia nélküli adenoma, dysplasztikus adenoma, korai és késıi vastagbélrák) jellemzı mRNS expressziós értékeket. Az expressziós értékek és a betegség stádium közötti összefüggést Kendall rangkorrelációs módszerrel határoztam meg 0,4 határérték mellett (a tau abszolútértéke ≥ 0,4). A vastagbél adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia elırehaladásával párhuzamosan 918 gén folyamatosan fokozódó (p<0,002), míg 392 gén folyamatosan csökkenı (p<0,002) mőködését tapasztaltam. A vastagbél adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia szerint fokozatosan növekedı mRNS expressziójú gének leginkább a következı sejtfolyamatokhoz kapcsolódnak: - a sejtproliferáció (transzformációs növekedési faktor-β2, vérlemezke eredető növekedési faktor receptor-α, hepatocita növekedési faktor, vaszkuláris endoteliális növekedési faktor C, inzulinszerő növekedési faktor kötı fehérje 7, VEGF receptor, oszteopontin, v-ets, szöveti metalloproteináz gátló-1, kemokin (C-X-C motívum) ligand-1 és -5, BCAT1, elı-B-sejt kolónia erısítı faktor-1), - az apoptózis-gátlás (BCL6, BCL2A1, BCL2-asszociált athanogén 3, SOCS3, ELKS/RAB6-közremőködı/CASTcsalád 1. tagja, prokineticin-2, hısokk fehérje-A5 és -90B1, oszteopontin, hepatocita növekedési faktor, kaszpáz-8 és FADD-szerő apoptózis szabályozó molekula, azonnali korai válasz-3), - a jelátvitel (WISP1 és WNT5A Wnt-jelátviteli úthoz tartozó gének, G-fehérjéhez kötött receptor 116 és 176, RAB31 Ras onkogén családhoz tartozó fehérje, RAS-szerő molekula 12, STAT3), - az érképzés (VEGF-C, EDG1, interleukin-8, angiopoietin-2), a sejtadhézióhoz (von Willebrand faktor, protokadherin-7, kadherin-11, MCAM, ESAM, ICAM1, PECAM1, γ1-laminin, α1-integrin, β1-integrin, ADAM12, nidogén-1, trombospondin-2, CD54, CD93, tenascin-C, verzikán),
53
- és a transzkripció szabályozása (LIM homeobox-6, v-ets, ELK3, NOTHC3, biglikán, cinkujj fehérje-281, NFKBIE, βA-inhibin, CREM) kapcsolódnak. A colorectális karcinogenezissel és progresszióval folyamatosan csökkenı mőködéső gének elsısorban - a transzkripció szabályozásában (cinkujj fehérje-219, -563 és-765, Castor homológ-1, adducin-1, KRAB-A domént tartalmazó-2), - a lipid anyagcserében (acil-CoA dehidrogenáz, β-kolin-kináz, zsírsav amid-hidroláz, karnitin O-oktanoiltranszferáz), - a transzport folyamatokban (SLC család 23 3. tagja nukleotid transzporter, MICAL2, exociszta komponens-7 ) - és az apoptózis elısegítésében (BCL2-szerő apoptózis facilitátor-14, mitokondriumasszociált apoptózis indukáló faktor-3, szomatikus citokróm C) játszanak szerepet. Számos proteoíizishez és ubikvitin ciklushoz kötıdı gén (ubikvitin-konjugáló enzimE2J2, ubikvitin-specifikus peptidáz-22, szárnyasujjú fehérje-167) fokozatosan csökkenı expresszióját is kimutattam. Néhány, fokozatosan változó expressziójú transzkriptumot több próbszetet is reprezentál, és ezek az egy transzkriptumhoz tartozó próbaszetek különbözı tau- és pértékkel rendelkeznek (például MCAM, kollagén-4α1, biglikán, interleukin-8, szöveti metalloproteináz gátló-3, kalumenin, SERPIN-1). 7.2.2. A szekvenciális gének megerısítése Taqman valós idejő PCR-rel 20 kiválasztott gén (18 fokozatosan emelkedı és 2 fokozatosan csökkenı expressziójú gén) expressziós változásainak megerısítésére Taqman valós idejő PCR-t végeztem. Az RT-PCR–re való kiválasztás kritériumai a microarray vizsgálat során az adenomadysplasia-carcinoma szekvenciával összefüggı szignifikánsan emelkedı vagy csökkenı expresszió és a Taqman validált assay-k elérhetısége voltak. Egy gén, a VEGF a microarray vizsgálatban kapott 0,4-nél alacsonyabb tau érték ellenére a megerısítendı gének közé került, mivel a colorectális karcinogenesisben szerepét széleskörően leírták. A 20 vizsgált génbıl 17 mRNS expressziója erıs korrelációt mutatott a betegség elırehaladásával (a tau abszolútértéke ≥ 0,4 volt az RT-PCR kiértékelése során is) (p<0,01). Részletes eredmények a 7. táblázatban láthatók.
54
A vastagbélrák kialakulást és progressziót jelzı géneknek azok tekinthetık, amelyek expressziója az ép vastagbél szövet – adenoma – dysplasia - carcinoma szekvenciával párhuzamosan folyamatos emelkedést, illetve csökkenést mutat. A Kendall rangkorreláció esetén akkor állapítottam meg a két változó, az mRNS expresszió és a colorectális karcinogenezis között összefüggést, ha a tau abszolút értéke ≥ 0,4 volt, mind a microarray, mind a valós idejő RT-PCR esetén. Ezzel a módszerrel 15 olyan gént azonosítottam, amely az adenoma-dysplasia-carcinoma szekvenciát követve szignifikánsan emelkedı tendenciájú génexpressziót mutatott mindkét mRNS expressziós
vizsgálatban
(p<0,05)
(7.
táblázat).
Szignifikánsan
csökkent
expressziójúnak 2 gén (PTGDR és AMN) bizonyult (p<0,05) (7. táblázat). Gén szimbólum
Affymetrix azonosító
Taqman tau
Taqman p-érték
210869_s_at 211980_at 213905_x_at 202859_x_at 202291_s_at 203083_at
-0,604 -0,604 -0,586 -0,505 -0,499 -0,493
0 0 0 0 0,001 0,001
0,571 0,631 0,549 0,407 0,584 0,455
0 0 0 0,001 0 0
202112_at 209875_s_at
-0,481 -0,47
0,001 0,001
0,653 0,467
0 0
210513_s_at
-0,47
0,001
0,376
0,027
201150_s_at 200665_s_at
-0,464 -0,44
0,001 0,002
0,411 0,543
0,001 0
204470_at 214845_s_at
-0,429 -0,411
0,003 0,005
0,467 0,48
0 0
201666_at
-0,4
0,006
0,492
0
212657_s_at
-0,4
0,006
0,47
0
PTGDR
von Willebrand faktor oszteopontin vaszkuláris endoteliális növekedési faktor szöveti metalloproteináz gátló 3 oszteonektin kemokin (C-X-C motívum) ligand 1 kalumenin szöveti metalloproteináz gátló 1 interleukin 1 receptor antagonista prosztaglandin D2 receptor
215894_at
0,579
0
-0,423
0,001
AMN
amnionless homológ
223587_s_at
0,44
0,002
-0,42
0,001
MCAM COL4A1 BGN IL8 MGP THBS2 VWF SPP1 VEGF TIMP3 SPARC CXCL1 CALU TIMP1 IL1RN
Génnév melanoma sejtadhéziós molekula kollagén 4α1 biglikán interleukin 8 mátrix Gla fehérje trombospondin 2
Affymetrix Affymetrix tau p-érték
7. táblázat Az adenoma-dysplasia-vastagbélrák szekvenciát követve növekvı, illetve csökkenı expressziós tendenciát mutató gének
55
A vastagbélrák kialakulását és progresszióját elsısorban sejtproliferáció (vaszkuláris endoteliális növekedési faktor, CXCL1 kemokin ligandum, szöveti metalloproteináz gátló 1), az apoptózis (oszteopontin, vaszkuláris endoteliális növekedési faktor, szöveti metalloproteináz gátló 3), az érképzıdés (vaszkuláris endothéliáli növekedési faktor, von Willebrand faktor, interleukin-8), a sejtadhézió (melanoma sejtadhéziós molekula, trombospondin-2, von Willebrand faktor, oszteopontin) és a transzportfolyamatok szabályozásával (kollagén-4α1) kapcsolatos gének fokozott expressziója jellemzi. Bizonyos immunszabályozásban szerepet játszó gének kifejezıdése is megváltozott (interleukin-8, CXCL1, interleukin receptor 1 antagonista). Az ép-adenoma-dysplasiacarcinoma szekvencia elırehaladásával párhuzamosan fokozott mőködést tapasztaltunk olyan, eredetileg a csontfejlıdésben leírt gének esetén is (oszteopontin, oszteonektin, mátrix Gla fehérje), amelyek szerepet játszanak a vastagbél tumorok kialakulásában és progressziójában. Az oszteopontin és az oszteonektin mRNS expresszió és a vastagbélrák kialakulás és progresszió összefüggését az 5. ábrán tüntettem fel.
Oszteopontin 13
Fluoreszcencia intenzitás
12 11 10 9 8 7 6 Ép
Adenoma Ø dysplasia
Adenoma + dysplasia
56
Dukes A,B
Dukes C,D
Oszteonektin 13,5
Fluoreszcencia intenzitás
13 12,5 12 11,5 11 10,5 10 Ép
Adenoma Ø dysplasia
Adenoma + dysplasia
Dukes A,B
Dukes C,D
5. ábra Az oszteopontin és az oszteonektin mRNS ép-adenoma-dysplasiacarcinoma szekvenciát követı fokozatosan emelkedı expressziója A színes pontok a biopsziás mintákban Affymetrix microarray-n mért mRNS expressziós értékeket jelentik. A színek a különbözı betegségcsoportokra utalnak. A pontokra illesztett egyenes meredeksége utal a szekvenciálisan fokozódó oszteopontin és oszteonektin génexpresszióra.
7.2.3. Kiválasztott markerek fehérje expressziójának és szöveti lokalizációjának vizsgálata szöveti microarray technikával Fehérjeszinten
két,
az
adenoma-dysplasia-carcinoma
szekvencia
elırehaladásával párhuzamosan emelkedı mRNS expressziójú gént, az oszteopontint (SPP1) és az oszteonektint (SPARC) vizsgáltam. Mindkét vizsgált protein expressziója fokozatosan emelkedett az adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia elırehaladásával párhuzamosan (6. ábra).
57
6. ábra Az oszteopontin és az oszteonektin fehérjék szöveti microarray vizsgálattal mért expressziója Az asszociációs plotokon a Pearson reziduumok segítségével tettem láthatóvá a két fehérje expressziós elemzés eredményeit. Az elemzés során 0-2 score-okat adtam az egyes mintákban tapasztalt
58
immunhisztokémiai festıdés jellemzésére. A kék oszlopok mutatják, hogy az adott betegségcsoportra mely score volt jellemzı. AD = adenoma, AD (dyspl) = dysplasztikus adenoma, CRC-B = korai vastagbélrák, CRC-CD = elırehaladott vastagbélrák.
A szöveti microarray vizsgálattal az ép hámból származó mintákon az epithelsejtek apikális citoplazmája mutatott mérsékelt intenzitású citoplazmatikus oszteopontin ill. oszteonektin festıdést. A luminális felszín felé haladva a jelölıdött sejtek száma fokozatosan növekedett. Az adenoma mintákban a hámsejtekben az apikális festıdés mellett enyhe-mérsékelt intenzitású bazális citoplazmatikus jelölıdés is megjelent. A jelölés intenzitása a dysplasztikus hámban fokozódott. A vastagbélrákos mintákban a daganatos hámsejtek mérsékelten és erısen intenzív, diffúz cytoplazmatikus festıdést mutattak (7. ábra).
7. ábra Oszteopontin és oszteonektin szöveti microarray immunhisztokémia Oszteopontin/Oszteonektin fehérje expresszió ép colon nyálkahártyában (A/D), dysplasztikus adenomában (B/E) és vastagbélrákban (C/F). A fehér nyilak az A és D ábrán az ép vastagbélhámsejtek apikális citoplazmatikus festıdését jelölik. A fehér nyilak a B és az E ábrán a mérsékelt bazális citoplazmatikus festıdést mutatják.
A C és az F ábrán lévı nyilak a diffúzan festıdı daganatos
epitéliumot mutatják. (A, B, C, F 250x, D, E 300x nagyítás, hematoxilin magfestés. A felvételek virtuális mikroszkóp segítségével készültek)
59
7.3. A vastagbélbetegségek altípusainak megkülönböztetése Az Affymetrix microarray vizsgálatnál alkalmazott mintaszám lehetıvé tette a fı diagnosztikus csoportok alcsoportjaira jellemzı osztályozó gének azonosítását is. A vastagbélrák két alcsoportja (korai; Dukes-B és kései; Dukes-CD) között leginkább a metabolikus- és transzportfolyamatokkal összefüggı gének (DnaJ homolog alcsalád C 10. tagja, coatomer protein komplex β-alegység) expressziója tért el. Elırehaladott vastagbélrákban az apoptózissal (TIA1 citotoxikus granulum-asszociált RNS-kötı protein, forkhead box O3A) és az immunválasszal (immunglobulin nehéz lánc konstans µ, 2'-5'-oligoadenilát szintetáz-2) kapcsolatos gének mőködése csökkent. A szénhidrátés zsírsav anyagcseréért (glutamin-fruktóz-6-foszfát transzamináz-1, GDP-mannóz-4,6dehidratáz, szterol-C4-metil oxidáz-szerő molekula, lanoszterol-szintáz), valamint az energiaháztartásért felelıs gének mRNS expressziója (ATPáz-gátló faktor-1) a vastagbélrák progressziójával szignifikánsan fokozódott. Az alcsoport-elkülönítı gének többségének szerepe még ismeretlen. Az RMA normalizáció után kapott leginkább eltérıen kifejezıdı 100 génen alapuló hierarchikus cluster diagram a korai és késıi vastagbélrákok elkülönítését szemlélteti (8. ábra). Adenomában a dysplasztikus átalakulás során a sejtproliferáció (interferon γindukált fehérje 16, aminopeptidáz A, D52-szerő tumor protein 2), a DNS replikáció és a transzkripció (IGF1, nukleáris faktorszerő molekula 3, cinkujj fehérje 452) fokozódott, míg az immunválaszban szerepet játszó gének (immunglobulin nehéz lánc konstans µ, γT-sejt receptor 9, interferon regulációs faktor 4, α-triptáz) mőködése csökkent. Crohn-betegségre egyes szénhidrátanyagcsere gének (α-galaktozidáz fruktóz2,6-bifoszfatáz
4,
maltáz-glukoamiláz),
colitis
ulcerosára
pedig
számos
sejtproliferációhoz (szeptin 10, vérlemezke-eredető növekedési faktor D, ciklin G2), apoptózishoz (BCL10, BIRC4, egl nine homolog 3), immunszabályozáshoz (DAF, CD24, CEACAM1), transzport- (kettıs oxidáz-2, citokróm P450 oxidoreduktáz, lipokalin-2) és katabolikus folyamathoz (tripartite motívum-tartalmazó 31, ubikvitinkonjugáló enzim E2, J1, ubikvitin-specifikus proteáz 53) kapcsolódó gén fokozott mőködése jellemzı.
60
8. ábra A korai és elırehaladott vastagbélrákok elkülönítése A korai és elırehaladott vastagbélrákot elkülönítı gének hierarchikus cluster diagramja RMA normalizált “top 100” gén alapján. Az ún. heat map-en vízszintesen a vastagbélrákos esetek (crc_ab = korai
61
colorectális daganat, crc_cd = elırehaladott colorectális daganat) láthatók, míg függılegesen az elkülönítı expressziós markerek szimbólumai találhatók. A zöld szín csökkent, a piros szín fokozott mRNS expressziót jelöl.
7.4. Az elkülönítı mRNS expressziós markercsoportok leszőkítése 7.4.1. Clontech kétcsatornás cDNS microarray rendszer 7.4.1.1. Varianciaelemzés (ANOVA) A Clontech cDNS chipen szereplı 1081 gén expressziós különbségeit elemeztem ANOVA-val. Azokat a géneket, amelyek génexpressziós értéke kellı számú mintában nem volt értékelhetı, a továbbiakban nem vettem figyelembe. A 3 kórisme között a szőrt ANOVA módszerrel 17 gén esetén találtam szignifikánsan eltérı expressziót (p<0,05) (8. táblázat). Név
bisztinszerő fehérje tumor nekrózis faktor receptor szupercsalád, 10c tagja
BYSL
Különbséget mutató mintacsoportok 1--3 2--3
TNFRSF10C
1--2 2--3
0,0044 0,0046
haláldomén receptorok
mátrix metalloproteináz 13
MMP13 UBC
0,0395 0,0325 0,0227
metalloproteinázok
ubikvitin C urokináz plazminogén aktivátor
2--3 1--3 2--3
PLAU
1--3
0,0089
AXL tirozin kináz receptor ras homológ géncsalád, H tagja RAB5A, a RAS onkogéncsalád tagja
AXL
1--2
0,0209
RHOH
1--2
0,0076
RAB5A
1--3
0,0151
kis indukálható citokin A5 (RANTES)
CCL5
1--2
0,0087
PTN
1--2 1--3 2--3
0,0373 0,0043 0,0058
1--2 1--2 2--3
0,01755 0,0096 0,0066
pleiotrofin (heparin-kötı növekedési faktor 8) patched (Drosophila) homológ ıssejt növekedési faktor; limfocita szekretált C-típusú lektin interleukin-7 receptor
Gén szimbólum
PTCH1 CLEC11A IL7R
62
p érték
Sejtfunkció
0,0005 0,0008
egyéb sejtadhéziós proteinek
protein turnover szerin proteázok onkogének és tumor szuppresszorok onkogének és tumor szuppresszorok általános trafficking növekedési faktorok, citokinek és kemokinek növekedési faktorok, citokinek és kemokinek növekedési faktor és kemokin receptorok növekedési faktorok, citokinek és kemokinek interleukin és interferon receptorok
miotonikus disztrófia protein kináz-szerő protein
CDC42BPG
1--2 1--3
0.0253 0.0131
hısokk transzkripciós faktor 1
HSF1
1--2
0.0136
IER2
2--3 1--3 2--3
0.0209 0.0003 0.0011
azonnali korai protein nagy mobilitású csoport protein I és Y izoformája
HMGA1
intracelluláris kináz hálózat transzkripciós aktivátorok és represszorok transzkripciós faktorok kromatin fehérjék
8. táblázat Eltérı expressziójú gének a különbözı szövettani szerkezetekben 1 = adenoma , 2 = vastagbélrák , 3 = gyulladásos bélbetegség
Az esetek génexpressziós mintázat alapján való clusterezése a szőrt ANOVA eredményeken alapult. Az expressziós eredményeket hierarchikus cluster ábrán szemléltetem. Ezzel az elemzéssel 4 különbözı clustert tudtam azonosítani (9. ábra). Az elsı clusterbe csak IBD esetek voltak besorolhatók. A másodikba döntıen vastagbélrák esetek kerültek, a 6 daganatból 5 ugyanis ide volt sorolható, valamint még egy colitis ulcerosa és egy adenoma is. A harmadik clusterbe 3 IBD és 1 carcinoma eset tartozott. Negyedikként olyan cluster volt megállapítható, amelybe csak adenoma volt besorolható.
9. ábra A vastagbélbetegségek eset-cluster diagramja
63
Négy cluster különíthetı el: az 1. és a 3. IBD-vel összefüggı cluster, amely egy vastagbélrákos esetet is tartalmaz, a 2. a carcinoma csoport, amelybe egy adenoma és egy colitis ulcerosa esete is tartozik, a 4. az adenoma cluster kilenc adenomas esettel. AD=adenoma, CD=Crohn-betegség, CRC=colorectális carcinoma, UC=colitis ulcerosa
7.4.1.2. Faktorelemzés A faktorelemzést a varianciaelemzés eredményei alapján végeztem, amelyben két faktor különült el. A faktor súlya az exploratív variancia értékkel arányos, amely mindkét faktor esetében igen jelentısnek mutatkozott (1. faktor: 6.331196; 2. faktor: 4.710563). A faktoranalízis adatot nyújt azokról a funkcionális géncsoportokról, amelyek expressziós szintje alapján a vizsgált betegségcsoportok megkülönböztethetıek egymástól (9. táblázat). Génnevek ıssejt növekedési faktor pleiotrofin kemokin ligand 5 (RANTES) interleukin-7 receptor tumor nekrózis faktor receptor szupercsalád 10c tagja transzkripciós aktivátor és jelátvivı 2 (STAT2, 113kD)
1. faktor
2. faktor
Sejtfunkció
0,896313 0,882657 0,802949 0,835349
-0,053631 0,006966 0,169587 -0,151447
növekedési faktorok, citokinek növekedési faktorok, citokinek növekedési faktorok, citokinek interleukin és interferon receptorok
0,742897
-0,145755
0,820315
0,066954
0,745691
0,032620
hısokk transzkripciós faktor 1 -0,113082
0,768421
patched (Drosophila) homológ RAB5A, a RAS onkogéncsalád tagja ubikvitin C nagy-mobilitású csoport protein I és Y izoformája
-0,044311 -0,045668 -0,029882
0,834146 0,719247 0,943945
Exploratív variancia
6,331196
haláldomén receptorok transzkripciós aktivátorok és represszorok transzkripciós aktivátorok és represszorok növekedési faktor és kemokin receptorok általános trafficking protein turnover kromatin fehérjék
4,710563
9. táblázat A faktorelemzés eredményei 7.4.1.3. Diszkriminancia elemzés A diszkriminancia analízissel kiválogatott gének expressziós szintje alapján a 3 diagnózis csoport egyértelmően elkülöníthetı (10. ábra). Ezek a gének a következık: a
64
HSF1 (p=0.012537), a bisztinszerő molekula (p=0.001027), a kalgranulin A (p=0.043831) és a TNFR szupercsalád 10c tagja (p=0.037888).
10. ábra Colon biopsziák diszkriminancia elemzése – Clontech cDNS microarray vizsgálat A fı diagnosztikus csoportok elkülönülnek az eredmények 7.4.1.3. fejezetében leírt diszkrimináló gének alapján.
7.4.2. Affymetrix egycsatornás oligonukleotid rendszer 7.4.2.1. Átfedı diszkriminátor gének meghatározása Minden diagnózis esetén meghatároztam az elkülönítéshez leginkább segítséget nyújtó 100 gént, és azonosítottam a két különbözı normalizációs módszer alkalmazása után elıállított génlistákban egyaránt szereplı géneket (átfedı gének). A vastagbélrákot, az adenomát, illetve az IBD-t az ép nyálkahártyától elkülönítı géneket (ún. diszkriminátor gének) az adott betegségcsoportra jellemzı mRNS expressziós markercsoportoknak neveztem. Eredményeimet a hierarchikus cluster elemzéssel nyert ún. heat map ábrán szemléltetem (11. ábra).
65
11. ábra Az IBD-re, az adenomára illetve a colorectális rákra jellemzı legfontosabb diszkriminatív transzkriptumok kombinált cluster diagramja A betegmintákat normalizációt követıen az ép nyálkahártyából származó mintákhoz hasonlítottam. A minták, amelyek nem tartoznak az adott betegség klasszifikációjához, árnyékoltan láthatók. Az ismétlıdı transzkriptumokat kék nyilak jelölik.
7.4.2.2. Diszkriminancia elemzés A mintákat a lépésenkénti diszkriminancia elemzéssel nyert 7 elkülönítı gén expressziója alapján csoportosítottam (indolamin-pyrrol-2,3-dioxigenáz, ektodermálisneurális
kortex,
TIMP3,
fukoziltranszferáz-8,
kollektin
alcsalád
12.
tagja,
karboxipeptidáz D és transzglutamináz 2) (12. ábra.). Az egyéneket 96.2%-os pontossággal tudtam a diagnosztikus csoportba besorolni. A kereszt-validálás révén az egyének 94.3%-át helyesen, az eredeti csoportba soroltam be.
66
12. ábra Vastagbél biopsziák diszkriminancia elemzése – Affymetrix microarray vizsgálat Az egyes klasszifikációs csoportok biztosan elkülöníthetık egymástól az Eredmények 7.4.2.2. fejezetében részletezett gének expressziója alapján. Group 1= ép, Group 2 = adenoma, Group 3 = vastagbélrák, Group 4 = gyulladásos bélbetegségek
7.5. A microarray eredmények megerısítése 7.5.1. A Clontech microarray adatok validációja EGFR és TOP1 RT-PCR-rel és EGFR immunhisztokémiával Azokat a mintákat, amelyekbıl a chip analízist követıen még teljes RNS maradt (9 carcinoma és a környezı ép területrıl vett 9 minta) egy lépéses EGFR és TOP1 realtime RT-PCR-rel is vizsgáltam. Az EGFR és a TOP1 mRNS szintjét mértem meg, és a β-2-mikroglobulin szinthez viszonyítottam (β-2-mikroglobulin referencia). Ezeket az értékeket diagnózisonként az ép nyálkahártya adataihoz viszonyítottam, és így ún. relatív hányadosokat kaptam (beteg minta/ép minta ugyanabból a betegbıl). A vastagbélrákos minták EGFR mRNS szintje nagyobb, mint az ép párjuké (relatív
67
hányados: 3,008, p=0,0487). A vastagbélrákban 2,8-szoros TOP1 mRNS szintet mértem az ép colon nyálkahártyához viszonyítva (p=0,0492). A vastagbélrákos minták tumor sejtjeiben az EGFR expresszió enyhe vagy mérsékelt volt. Minden carcinoma mintában diffúz citoplazmatikus EGFR festıdést tapasztaltunk. Az ép colon szövetekben ugyan néhány epithelsejtben látható volt közepes vagy erıs EGFR festıdés, a teljes szövet EGFR expressziója azonban mérsékeltebb volt, mint a carcinoma mintáké (13. ábra). Az EGFR fehérje expressziós szintek korrelálnak mind a microarray vizsgálatokban, mind a RT-PCR során kapott EGFR mRNS expressziós adatokkal.
13. ábra EGFR immunhisztokémia vastagbélrákos mintákon A. colon adenocarcinoma: diffúz citoplazmatikus, közepes EGFR festıdés látható a vastagbél daganatos mirigyeiben. Enyhe, fıleg perinukleáris vagy bazolaterális citoplazmatikus EGFR festıdés látható az egészséges mirigyekben (200x nagyítás, hematoxylin magfestés). B. ép colon: enyhe, közepes bazolaterális intracitoplazmatikus EGFR festıdés látható az ép colon hámrétegben. A kripták alsó 2/3-a nem mutat EGFR pozitivitást (100x nagyítás, hematoxylin magfestés).
7.5.2. Az Affymetrix microarray vizsgálat eredményeinek megerısítése Taqman valós idejő PCR-rel Az Affymetrix teljes genom expressziós vizsgálat során a Clontech vizsgálathoz képest nagyságrendekkel nagyobb adathalmazt elemeztem és az eredmények megerısítéséhez nagyobb számú gént választottam ki. 52 kiválasztott gén expressziós szintjét Taqman valós idejő RT-PCR-rel is meghatároztam. Az igazolni kívánt gének kiválogatása során
68
a microarray elemzéssel tapasztalt expressziós változást és a Taqman próbák kereskedelmi elérhetıségét vettem figyelembe. Még további tíz, az irodalomban vastagbélrákkal összefüggınek tartott gént is beválogattam. Az 52 vizsgált génbıl 46 expressziója
szignifikánsan
összefüggött
az
Affymetrix
microarray-ken
mért
expresszióval (p <0,05). A kiválasztott gének expressziós változásai a 10. táblázatban láthatók.
Taqman azonosító Hs00153304_m1 Hs00157859_m1
Gén szimbólum CD44 GUCA2A
Génnév
Hs00205545_m1
CD44 antigén guanilát-cikláz aktivátor 2A CXCL12 kemokin (C-X-C motívum) ligand 12 MET met protoonkogén ABCA8 ATP-kötı kazetta alcsalád A (ABC1) 8. tagja ADAMDEC1 ADAM-szerő decizin 1
Hs00214306_m1
TRPM6
Hs00171022_m1 Hs00179845_m1 Hs00200350_m1
Hs00153408_m1
MYC
Hs00163869_m1
CA2
Hs00171558_m1
TIMP1
Hs00236937_m1
CXCL1
Hs00236966_m1
CXCL2
Hs00266139_m1 Hs00605175_m1 Hs00154124_m1
CA1 ADH1B AQP8
Hs00194353_m1
LCN2
Hs00197437_m1
OLFM4
Minta csoportok AD vs ép AD vs ép CRC vs ép AD vs ép CRC vs ép AD vs ép AD vs ép UC vs ép
1,82E-07 0,000411 0,00871 0,00305 0,00735 1,41E-06 0,000610 8,07E-05
1,90 -4,34 -3,17 -2,04 -1,95 2,17 -3,35 -2,70
AD vs ép CRC vs ép UC vs ép AD vs ép CRC vs ép
1,16E-05 9,18E-05 0,00439 5,79E-05 0,00827
-3,69 -2,74 -1,21 -4,73 -3,09
0,000385
-4,63
5,99E-06
2,35
0,000494 0,00193 3,90E-07 0,00153 0,000219 1,66E-05 0,0114 1,11E-05 1,24E-05 0,00204 0,000592 0,000930 0,00382 0,000378 0,0315 2,67E-07 0,000509 2,15E-06 2,57E-07 0,000179 4,99E-05
-3,75 -3,17 2,58 2,74 2,36 3,55 3,84 4,04 3,98 3,70 3,68 -6,13 -3,49 -6,10 -5,33 6,13 4,83 5,06 7,04 6,20 5,68
átmeneti receptor feszültség kation csatorna alcsalád M, 6. UC vs ép tagja v-myc myelocitomatózis AD vs ép virális onkogén homológ karbon-anhidráz II AD vs ép CRC vs ép szöveti metalloproteináz AD vs ép gátló 1 CRC vs ép UC vs ép kemokin (C-X-C AD vs ép motívum) ligand 1 CRC vs ép UC vs ép kemokin (C-X-C AD vs ép motívum) ligand 2 CRC vs ép UC vs ép karbon-anhidráz I AD vs ép alkohol-dehidrogenáz IB AD vs ép akvaporin 8 AD vs ép CRC vs ép lipokalin 2 AD vs ép CRC vs ép UC vs ép olfaktomedin 4 AD vs ép CRC vs ép UC vs ép
69
p érték
ddCt
Taqman azonosító Hs00154230_m1 Hs00169795_m1
Gén szimbólum CALU VWF
Hs00229558_m1 Hs00235003_m1
AMN PTGDR
Hs00266237_m1 Hs00156076_m1 Hs00169777_m1
COL4A1 BGN PECAM1
Hs00174103_m1
IL8
amnionless homológ prosztaglandin D2 receptor kollagén 4α1 biglikán vérlemezke/endotélsejt adhéziós molekula interleukin 8
Hs00204187_m1
DUOX2
kettıs oxidáz 2
Hs00160066_m1
PI3
Hs00195812_m1 Hs00197374_m1 Hs00829485_sH
LIPG UBD IFITM2
Hs00171061_m1
CXCL3
Hs00194145_m1
HMGCS2
Hs00234579_m1
MMP9
Hs00277299_m1
IL1RN
Hs00165949_m1
TIMP3
Hs00234160_m1
SPARC
bır eredető proteáz inhibitor 3 (SKALP) endoteliális lipáz ubikvitin D interferon indukált transzmembrán fehérje 2 (1-8D) kemokin (C-X-C motívum) ligand 3 3-hidroxi-3metilglutaril-Coenzim A szintáz 2 mátrix metalloproteináz 9 interleukin 1 receptor antagonista szöveti metalloproteináz gátló 3 ciszteinben gazdag, savas szekretált fehérje (oszteonektin) transzkripciós faktor 4 inzulinszerő növekedési faktor kötı fehérje 3 kaldezmon 1 SPARC-szerő 1 (hevin) RNS-kötı motívum, egyszálúval kapcsolódó fehérje 1 tenzin
Hs00162613_m1 Hs00181211_m1
TCF4 IGFBP3
Hs00189021_m1 Hs00190740_m1 Hs00249930_s1
CALD1 SPARCL1 RBMS1
Hs00255962_m1 Irodalmi gének Hs00153350_m1 Hs00153353_m1
TNS
Hs00170248_m1 Hs00171257_m1
THBS2 TGFB1
BCL2 BIRC5
Génnév kalumenin von Willebrand faktor
B-sejtes CLL/limfóma 2 bakulovirális IAP ismétlıdés-tartalmú 5 (survivin) thrombospondin 2 transzformáló növekedési faktor β1
70
Minta csoportok CRC vs ép CRC vs ép UC vs ép CRC vs ép CRC vs ép
0,0145 0,551 0,000112 0,0499 0,997
CRC vs ép CRC vs ép CRC vs ép
0,0283 0,120 0,764
3,38
CRC vs ép UC vs ép AD vs ép CRC vs ép UC vs ép UC vs ép
0,0283 6,80E-06 5,77E-06 0,00363 7,84E-05 0,000257
7,21 5,77 5,25 4,91 6,35 4,26
UC vs ép UC vs ép UC vs ép
0,000588 0,000261 0,00287
1,35 3,20 1,66
UC vs ép
7,48E-05
3,58
UC vs ép
0,0104
-3,15
UC vs ép
0,00724
1,85
UC vs ép
1,10E-05
5,30
CRC vs ép CRC vs AD CRC vs ép CRC vs AD
0,274 0,000150 0,617 0,00176
1,36
CRC vs AD CRC vs AD
0,000982 0,000216
0,86 1,56
CRC vs AD CRC vs AD CRC vs AD
0,000188 0,000165 0,00566
1,24 1,29
CRC vs AD
0,000278
1,15
CRC vs ép CRC vs ép
0,33308
CRC vs ép CRC vs ép
p érték
ddCt 1,60 2,44 -2,32
1,14
1,51 0,02067 0,05582 0,47079
Taqman azonosító Hs00173626_m1
Gén szimbólum VEGF
Hs00181385_m1
IGFR1
Hs00193306_m1
EGFR
Hs00361600_m1
GUCA1B
Hs00426322_m1
ACHY
Hs00162669_m1
TERT
Génnév vaszkuláris endoteliális növekedési faktor inzulinszerő növekedési faktor receptor 1 epidermális növekedési faktor receptor guanilát-cikláz aktivátor 1B (retina) S-adenozilhomocisztein hidroláz telomeráz reverz transzkriptáz
Minta csoportok CRC vs ép
p érték
ddCt 1,69
0,04743 CRC vs ép 0,31769 CRC vs ép 0,53486 CRC vs ép 0,73175 CRC vs ép
1,32 0,00581
CRC vs ép 0,80232
10. táblázat 52 gén Taqman RT-PCR megerısítése A vastag betővel jelölt p értékekkel jellemzett expressziós változások bizonyultak szignifikánsnak (p<0,05) a negyedik oszlopban feltüntetett csoportok közötti összehasonlításban. CRC = colorectális carcinoma, AD = adenoma, UC = colitis ulcerosa
71
8.0. MEGBESZÉLÉS Munkám során az adenomás, vastagbélrákos és gyulladásos bélbetegségben szenvedı betegek colon biopsziás mintáinak génexpressziós mintázatát hasonlítottam össze 1081 target szekvenciát tartalmazó Human Atlas Glass 1.0 microarray-kel. Az ún. spotted microarray technológiából származó array-array variabilitás csökkentésére többszörös szőrı módszereket alkalmaztam, és az eredmények többváltozós statisztikai kiértékelésével
olyan,
a
colorectális
carcinogenezissel
kapcsolatos
géneket
azonosítottam, amelyek a hagyományos szövettani diagnózis megrısítéséhez is hozzájárulnak. A vastagbélbetegségek objektív osztályozására alkalmas betegségspecifikus génexpressziós markercsoportok azonosítása céljából további 52 vastagbél biopsziás minta génexpressziós mintázat meghatározását végeztem el teljes genom HGU133 Plus 2.0 microarray rendszeren. Olyan diagnosztikus mRNS expressziós mintázatokat írtam le, amelyek segítségével colorectális adenomák, valamint a vastagbélrák stádiumai azonosíthatók lehetnek. Vizsgálataim alapján elmondható, hogy dysplasia nélküli, illetve dysplasztikus adenoma, colorectális rák, IBD és ép vastagbélnyálkahártya minták párhuzamos vizsgálata alkalmas lehet betegség-specifikus génexpressziós
eltérések
kimutatására.
A
vastagbélbetegségek
széleskörő
összehasonlító microarray vizsgálatára az irodalomban nem találtam példát. A colorectális rák, a második leggyakoribb ráktípus hazánkban leggyakrabban villózus adenoma talaján alakul ki. Ezért az adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia génexpressziós hátterét is megvizsgáltam 38 vastagbél biopsziás mintán, teljes genom HGU133 Plus 2.0 microarray rendszeren. Olyan génexpressziós markereket azonosítottam, amelyek szekvenciálisan megváltozott expressziója indikátora lehet a colorectális karcinogenezisnek.
72
8.1. A biopsziák microarray vizsgálatra való alkalmazhatósága, az oligonukleotid és cDNS microarray rendszerek összevetése Az
endoszkópos
vizsgálat
során
a
korai
diagnosztikus
célmolekulák
azonosítására biopsziás minták vételére van lehetıség. A biopsziás minták teljes genom oligonukleotid microarray vizsgálati módszere megfelelıen standardizáltnak és jól reprodukálhatónak bizonyult. Biopsziás mintákat alkalmazva a szenzitivitást, az expresszálódott gének számát (present %), és a GAPDH 3’/5’ arányt egyaránt tekintve szigorú minıségi követelményeknek kiválóan megfelelı array-ek készíthetık. Az elemzı módszer elkülönítı mintázatok azonosítására is alkalmas, segítséget nyújt a colorectális betegségek molekuláris hátterének megismeréséhez, továbbá olyan génexpressziós adattár létrehozását is lehetıvé teszi, amely további elemzésekre használható fel. Az Atlas Glass Human 1.0 microarray platform egy ún. spotted microarray rendszer, ahol az egyes transzkriptumokat egyetlen, az üveglemezre kicseppentett ún. hosszú oligonukleotid (80mer) spot reprezentálja az array-n, azaz az Atlas Glass microarray-n a detektálás sikeressége egyetlen szekvencián múlik. Ha egy adott spot target szekvenciáján kereszthibridizáció következik be, akkor az adott gén leolvasása hibás lesz. Ez téves mRNS kvantifikációt eredményezhet (122, 123), valamint relative magas standard deviáció értékeket. A spotted micorarray technológia ezen fı hátránya a saját vizsgálataimnál is jelentkezett: a minıségi ellenırzést követıen több meghibridizált microarray-t (12-t a 34-bıl) kénytelen voltam kizárni a fent említett problémák miatt. A két általam használt microarray rendszer (az Affymetrix és a Clontech microarray rendszer) legfontosabb tulajdonságait a 11. táblázatban, ezen jellemzıikbıl és a használat során szerzett tapasztalataim alapján megállapított elınyeiket és hátrányaikat pedig a 12. táblázatban foglaltam össze.
73
Affymetrix microarray rendszer
Clontech microarray rendszer
Rögzített target szekvenciák Target rögzítés módja
25mer oligonukleotidok
80mer szekvenciák
in situ fotolitográfiás szintézis („on chip technológia”)
Reprezentált transzkriptumok száma Egy transzkriptumot reprezentáló szekvenciák száma
> 47 000
elıre megszintetizált szekvenciák felületre rögzítése cseppentéssel („off chip technológia”) 1081
11 pontosan illeszkedı 11 nem pontosan illeszkedı (mismatch)
1
Kiindulási teljes RNS mennyiség
1-10µg/minta (2 körös amplifikáció: 10100ng/minta) jelölési protokollba beépített T7 RNS amplifikáció egy szín jelöléses biotin/sztreptavidin fikoeritrin jelölési kontrollok (Poly A kontrollok) hibridizációs kontrollok - orientációs (B2 Oligo) - érzékenységi kontrollok (bioB, C, D, Cre) háztartási gén kontrollok (pl. GAPDH) negatív kontrollok hibridizációs kamra mosó-festı automata GeneChip leolvasó készülék 1
10-20µg/minta
Amplifikáció Jelölés/kimutatás Kontrollok
Speciális felszerelés Minta/chip
szükség esetén T7 amplifikáció vagy PCR-alapú amplifikáció két szín jelöléses Cy3 és Cy5 elıre rögzített Cy3 orientációs pontok lambda fág negatív kontroll háztartási gén kontrollok
hibridizációs kamra GenePix leolvasó készülék 2
11. táblázat Az Affymetrix és a Clontech microarray rendszerek legfontosabb jellemzıi
A különbözı microarray platformokon végzett génexpressziós vizsgálatok eredményei között jelentıs eltérések mutatkoznak (122-126). A különbözı típusú microarray-kkel kapott eredmények összevetése több szempont egyidejő mérlegelését igényli, mivel a jelészlelı technikák, az array típusa, a minta mennyisége, típusa, kezelése és tárolása eltérı lehet (124). A microarray rendszerek jellemzıibıl fakadó, az eredményeket befolyásoló tényezık közül a rögzített targetszekvenciák tulajdonságai (GC-tartalom, a
74
célszekvenciák közti homológia egy microarray rendszeren belül és a targetszekvenciák hossza) a leginkább meghatározóak (123).
Elınyök
Hátrányok
Affymetrix microarray rendszer
Clontech microarray rendszer
- teljes genom szintő vizsgálat - zárt rendszer: magas reprodukálhatóság - több szintő kontrollok - nagy megbízhatóság - pontos minıségellenırzési protokoll (present %, GAPDH3’/5’ arány, kontrollok) - kevesebb mintaigény - az amplifikáció tulajdonságait figyelembe vevı target szekvencia választás a chipen - 11 pár szekvencia – egy transzkriptum - custom chipek lehetısége - professzionális vevıszolgálat és szakmai tanácsadás - széleskörben elterjedt technológia – nagyobb összehasonlítási lehetıség - speciális költséges berendezések igénye - fajlagosan nagy reakcióköltség
- kisebb speciális berendezés igény - 1 chipen 2 minta vizsgálható - reakcióköltség alacsonyabb - nyomtatott saját chipek lehetısége
- nagyobb kiindulási minta igény - az amplifikáció tulajdonságait nem veszi figyelembe a target szekvencia választás a chipen - Cy3 és Cy5 nem egyforma kötıdése - nyílt rendszer: kisebb reprodukálhatóság - egy transzkriptum - egy szekvencia - kontrollok szők választéka
12. táblázat Az Affymetrix és a Clontech microarray rendszerek elınyei és hátrányai A
magasabb
GC-tartalom
fokozott
hibridizáció-stabilitást
eredményez.
A
célszekvenciák homológiája más célszekvenciákkal pontatlan expressziós méréseket okozhat, ez a probléma elsısorban a cDNS microarray-knél jelentkezik. A rögzített targetszekvenciák hossza szintén befolyásolja a kereszthibridizáció gyakoriságát. Az Affymetrix rendszer által alkalmazott pontosan és nem pontosan illeszkedı (perfect match és mismatch) célszekvenciák használata valószínőleg egyenletesebb hibridizációs körülményeket
eredményez
(123).
Az
egyetlen
mRNS
szakaszra specifikus
célszekvenciák nem mindig hatékonyak a gén expressziójának mérésére, míg egyazon
75
transzkriptum több rövidebb szakaszával komplementer célszekvenciák alkalmazása növeli a szenzitivitást és a kereszthibridizáció elkerülésében is segíthet (125). Ugyanakkor, annak ellenére, hogy a rövidebb oligonukleotid célszekvenciák specifikusabb kötıdést biztosítanak, több napjainkban megjelent tanulmány beszámol arról, hogy az 50-70mer célszekvenciák is jó szenzitivitást biztosítanak, a rövidebb szekvenciák által nyújtott kiváló specificitás megırzése mellett (125, 127). Az eltérı microarray rendszerek eredményei közötti különbség oka lehet az is, hogy a különbözı rendszerekkel ugyanannak a transzkriptumnak más alternatív splice-variánsat detektáljuk (124). Ezen kívül gyakran eltérı kísérleti kontrollokat használnak a különbözı kutatócsoportok. Az eredményeket az is befolyásolja, hogy mőtétileg eltávolított vagy biopsziás mintából származó RNS-e a kiindulási anyag, illetve, hogy heterogén szöveti mintákat vagy homogén sejtes mintákat (lézer-mikrodisszektált sejtek) használnak-e (128, 129). Az alkalmazott kép- és adatelemzı módszerek sokfélesége szintén a heterogenitás egyik okozója lehet. A jelenlegi tudásunk szerint az oligonukleotid microarray rendszerek alkalmasabbak a génexpressziós változások globális monitorozására, mint a cDNS microarray-k (125). Általános tapasztalat, hogy a valós idejő PCR eredmények nagyobb arányban igazolják az Affymetrix eredményeket (85%), mint a Clontech array-rendszer eredményeit (33%) (122). A fehérjeszintő elemzések eredményei is jobban korrelálnak az Affymetrix eredményekkel (122). Mivel a különbözı microarray rendszerek génexpressziós eredményei kevés egyezést mutatnak, ez a tény fokozottan ráirányítja a figyelmet az eredmények független módszerrel való megerısítésének fontosságára (122, 124, 126). 8.2. A microarray vizsgálatok eredményeinek megerısítése Az expressziós microarray technika szemikvantitatív, ezért a chipen kapott expressziós változások megerısítése szükséges. Összesen 54 (Clontech rendszer validálására 2, az Affymetrix rendszer validálására 52), a microarray vizsgálatokban fokozott vagy csökkent mőködésőnek bizonyult gén expresszióját valós idejő PCR-rel erısítettük meg. A cDNS microarray vizsgálatban tapasztalt génexpressziós változások
76
az esetek többségében RT-PCR-rel is igazolhatók voltak. Néhány mintapár esetében azonban nem, amelynek egyik oka az is lehet, hogy a kis biopsziás mintákból csak korlátozott mennyiségő RNS nyerhetı. A jelenség magyarázataként azonban a két génexpressziós vizsgálati módszer különbözısége is felmerül. A microarray analízis és a RT-PCR során ugyanis ugyanazon transzkriptumok nem azonos szekvencia részletét észleljük. A teljes genom oligonukleotid microarray eredmények megerısítésekor individuális markerekre összpontosítottam és független marker validációt alkalmaztam (azaz nem csupán a génexpressziós mintázatok, hanem az egyes markerek csoportok közti elkülönítı szerepét vizsgáltam). Az Affymetrix teljes genom expressziós vizsgálat során a Clontech vizsgálathoz képest nagyságrendekkel nagyobb adathalmazt elemeztem és az eredmények megerısítéséhez nagyobb számú gént választottam ki. A kiválasztott 52, oligonukleotid microarray-en fokozott vagy csökkent mőködésőnek bizonyult gén 94%-át megerısítette a Taqman RT-PCR vizsgálat. A Taqman RT-PCR során a kiválasztott génekre specifikus, a gyártó által garantáltan mőködı, ún. validált assay-ket választottunk. Ezek az assay-k nem ugyanazt a szekvenciarészletet célozták meg, mint amit az Affymetrix oligonukleotid chipekkel észleltünk (11 darab 25mer oligonukleotid a poly-A faroktól számított 1000 ribonukleotidon belül). Az egy transzkriptumhoz tartozó, de eltérı szekvenciákra specifikus RT-PCR vizsgálatokkal tehát a transzkriptum expresszióját tudtuk megerısíteni, nem az Affymetrix rendszeren szereplı szekvencia expressziós szintjét. A Taqman Mikrofolyadék Kártyarendszer, amellyel párhuzamosan akár 96 gén expresszióját lehet vizsgálni 10-100 mintán különösen alkalmas a chipen mért génexpressziós
változások
nagy
teljesítményő,
gyors
és
költséghatékony
megerısítésére. Kiválasztott mRNS expressziós markereket fehérje szinten hagyományos immunhisztokémiával (az EGFR-t a cDNS microarray eredmények közül) és TMA immunhisztokémiával (oszteopontint és oszteonektint mint az adenoma-dysplasiacarcinoma átmenet szekvenciális markereit) erısítettünk meg. A szöveti microarray technikával végzett megerısítés lehetıvé teszi nagyságrendekkel nagyobb számú szövetminta párhuzamos vizsgálatát, és a microarray vizsgálatokban nem szereplı, ún. független minták nagyarányú bevonását.
77
8.3. A vastagbél betegségekben megváltozott expressziójú markergének szerepe, károsodott útvonalak A vastagbélrákra a DNS replikációban, a sejtciklusban, az extracelluláris mátrix átépítésében, az átírás szabályozásában, az onkogenezisben és a növekedési faktor irányította sejtproliferációban szerepet játszó gének fokozott mőködése, valamint a DNS javításban, a tumor szuppresszióban és az apoptózisban szerepet játszó gének csökkent mőködése a jellemzı. A sejtadhézióval, illetve transzport folyamatokkal kapcsolatos számos gén expressziója is eltért az ép nyálkahártyához viszonyítva. Ezekhez az mRNS expressziós változásokhoz társul több, az immunszabályozáshoz, valamint az érképzıdéshez kapcsolódó gén károsodott kifejezıdése. Eredményeimet szintén alátámasztják azok az adatok, amelyek microarray vizsgálatok során több onkogén (mint a BRCA2 (79), CXCL1 (73-75, 83, 85, 88), CXCL2 (75)), növekedési faktor gén (VEGF (83, 86), TGFβ (73, 75, 30, 87)), DNS replikációs és javítási gén (TOP2A (79), tankiráz (74)), sejtproliferációt szabályozó gén (SPARC (74, 75, 77, 79, 83), cinkujj doménes sejtnövekedés szabályzó (79), TIMP1 (79, 90)), transzport gén (lipokalin-2 (75, 80)) valamint transzkripciós faktor gén (több interferon regulátor faktor (79)) fokozott mőködését írták le colorectális daganatokban. Adenomában az ép nyálkahártyától eltérı, károsodott génexpressziót igazoltam a transzport- (ABCA8, TRPM6, akvaporin-8), a sejtadhézió- (CXCL12, CD44, ADAMszerő decizin 1, klaudin-1, α6-integrin), a metabolizmus- (karbon-anhidráz I, foszfodiészteráz-3A), a sejtproliferáció (MET, CXCL2, CXCL3 onkogének, tumorasszociált kalcium jelátvivı 2) és az apoptózis funkcionális csoportokhoz tartozó génekben. A microarray elemzés során számos olyan gén fokozott vagy csökkent expresszióját mutattam ki, amelyek az apoptózissal, a sejtproliferációval és a sejt túléléssel kapcsolatosak. Ezek a sejtfolyamatok és egyensúlyuk fontosak a carcinogenezisben és a tumor progressziójában. Funkcionális elemzést végeztem és vizsgáltam a biológiai összefüggés-hálózatokat is. Az apoptózishoz és a sejt túléléshez kapcsolódó útvonalakat a Pathway Assist 2.53 programmal jelenítettem meg. A 14. ábra ad áttekintést a legfontosabb fokozott, illetve csökkent mőködéső apoptózis gének szerepérıl. Vizsgálatomban több olyan eltérı expressziójú gént találtam, amelyek több, emlıs sejtekben ismert apoptotikus útvonalhoz kapcsolódnak, vagy befolyásolják
78
azokat. Ezek a következıek: a TNFRSF10c (tumor nekrózis faktor receptor szupercsalád 10c tagja), az ún. TRAILR3, a TRAF6 (TNF receptor-asszociált faktor 6), a TNFRSF6 (Fas) és a kaszpáz 4 (CASP4) gének, valamint a csökkent expressziójú apoptotikus BIK (Bcl-2 interacting killer molekula) és a PP2A (protein foszfatáz 2A). Két másik gén, a DNS topoizomeráz I (TOP1) és az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) szintén szerepet játszanak azokban a molekuláris folyamatokban, amelyek a vastagbélrák kialakulásában részt vesznek. Az EGFR fokozott expressziója összefügg a colorectális rák elırehaladásával és az áttétképzési hajlammal (130). Az EGFR aktivációja fokozza a sejtproliferációt és a sejt túlélést a MAPK (Ras/JNK), a Ras/ERK és a JAK/STAT jelátviteli utak aktiválásán keresztül. Ezen jelátviteli utak fokozott mőködése elısegítheti a tumor növekedését és az apoptózissal szembeni rezisztencia kialakulását. A humán TOP1 a malignus sejtekre jellemzı fokozott sejtosztódáshoz és DNS replikációhoz kapcsolódik.
14. ábra Vastagbélrákban génexpressziós vizsgálattal azonosított fı apoptotikus és sejt túlélési útvonalak A zölddel jelölt gének fokozottan, a pirossal jelölt gének csökkent mértékben mőködnek vastagbélrákban a cDNS microarray analízisem eredményei alapján. A kékkel jelölt gének a korábban leírt apoptotikus és
79
sejt túlélési útvonalakban szerepet játszó gének. A zöld nyilak a pozitív, a piros nyilak a negatív szabályozást (gátlást) mutatják.
IBD-ben elsısorban az immunszabályozással, a sejtproliferációval, a transzport folyamatokkal és a metabolizmussal kapcsolatos gének mRNS szintjének változását tapasztaltam. Szintén észleltem az extracelluláris mátrix átépülésben, és a sejten belüli jelátviteli utakban szerepet játszó gének károsodott mőködését. Más irodalmi adatokkal összhangban, microarray elemzéssel növekedett kemokin (kemokin ligand 4, interleukin-1 receptor antagonista) és mátrix metalloproteináz (MMP-3, MMP-12) mRNS szintet mértem a környezı ép mucosához viszonyítva (93). IBD-ben a kemokin ligand 4 (small inducible cytokine A4) fokozottan expresszálódik és a gyulladás aktivitásának fokozódásával szintje egyre nı (131). Az IL-1 receptor antagonista gátolja az
interleukin-1
aktivitását
és
módosítja
az
interleukin-1-hez
kapcsolódó
immunfolyamatokat és gyulladásos választ. A mátrix metalloproteinázok szabályozott expressziója szorosan kapcsolódik a gyulladásos szövet átrendezıdéséhez, sıt az MMP12 szerepet játszhat a makrofágok mozgásának irányításában és az epiteliális sejtek leválásában is (132). Microarray vizsgálatomban számos egyéb növekedési faktor és kemoattraktáns fokozott expresszióját tapasztaltam. IBD-ben a gyulladt nyálkahártya GM-CSF (makrofág-granulocita kolónia stimuláló faktor 2) szekréciója nı. A T-sejtek által az antigén stimulust követıen felszabadított B-sejt növekedési faktor 1 elısegíti a B-sejtek
klonális
expanzióját,
proliferációját.
A
CXCL13
molekula
B-sejt
kemoattraktáns, amelyet UC-ben elsısorban a monocita/makrofág sejtvonal sejtjei termelnek (133). 8.4. A colorectális adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia génexpressziós markerei A
vastagbélrák
kialakulására
és
progressziójára
jellemzı
markerek
kiválasztásánál a valós idejő PCR-rel is megerısített géneket vettem figyelembe. A kiválasztott, vastagbélrákkal kapcsolatos gének expressziós szintjét nemcsak mRNS szinten, hanem független mintahalmaz bevonásával fehérjeszinten is vizsgáltam. A fehérjeszintő meghatározás szöveti microrarray technológiával történt, ami lehetıséget nyújt nagyobb számú minta gyors és standardizált vizsgálatára. Mindezen módszerek és
80
feltételek együttes alkalmazása biztosabbá teszi a betegség kialakulását elısegítı és a progressziót jelzı markerek azonosítását. Vastagbélrák progressziós markereket azonosítottam microarray technikával és 17 potenciális markert valós idejő PCR-rel is megerısítettem. Két marker (oszteopontin és oszteonektin) expresszióját szöveti microarray technológiával fehérje szinten is megvizsgáltam. Erıs korrelációt találtam mindkét fehérje fokozatosan emelkedı expressziója és a vastagbél adenoma-dysplasia-karcinóma szekvencia között. Az oszteopontin gén transzkripcióját a colorectális adenoma-dysplasia-carcinoma átmenetben közrejátszó gének közvetlenül vagy az általuk elindított jelátviteli utakon keresztül befolyásolják (134). Az APC mutáció miatt felszaporodó β-katenin számos gén,
köztük
az
oszteopontin
szabályozatlan
TCF/LEF-függı
transzkripcióját
eredményezi (134). A vastagbélrák kialakulása során mutáció miatt aktiválódik K-Ras onkogén és az AP1 (JUN és FOS dimer) transzkripciós faktor aktivációja útján az oszteopontin fokozott expresszióját okozza (135). A colorectális carcinogenezisben is szerepet játszó TGF-β jelátviteli útban szereplı SMAD2 és SMAD4 molekulák elısegítik a Runx transzkripciós faktorok sejtmagba jutását, ahol azok az oszteopontin promóteréhez kötıdve fokozzák annak transzkripcióját (136). Az oszteopontin ezenkívül a p53 tumor szuppresszor gén direkt transzkripciós célpontja is (137). Az integrineken és a CD44 molekulán keresztül kötıdik a sejtekhez és aktiválja a jelátviteli utakat (fokális adhéziós út, Ras/Raf út, PI3K/Akt út) (15. ábra). Bár az oszteopontin biológiai funkciói nem teljesen ismertek, szerepet játszhat a rosszindulatú daganatos átalakulásban, az áttétek létrejöttében, az immunszabályozásban, az érképzıdésben és a csontok átépülésében (138-140). Más microarray vizsgálatok során is fokozott oszteopontin mRNS szintet mértek vastagbélrákban az ép nyálkahártyához viszonyítva (72, 75, 81). A növekvı oszteopontin expresszió és a vastagbélrák elırehaladása közötti összefüggést Agrawal és mtsai írták le elıször (75). Eredményeim ezt alátámasztják és rávilágítanak továbbá arra, hogy az oszteopontin expressziójának növekedése a dysplasztikus elváltozással is korrelál adenomában.
81
15. ábra Az oszteopontin által aktivált jelátviteli utak (Furger (141) nyomán) Az oszteopontin (OPN) az integrinekhez kötıdve a fokális adhéziós komplex (FAK) fehérjéit aktiválja (1). Az oszteopontin több növekedési faktor receptor útvonalat is aktivál (Met, EGFR) (2). A proteolitikus aktivitást és a sejt invazivitását is fokozza, az urokináz plazminogén aktivátor (uPA) expressziójának megnövelésével (3). A CD44 molekulával való interakciója a sejtmozgást és a CD-44 függı kemotaxist segíti elı (4). Az oszteopontin által elindított jelátviteli utak számos gén (pl. NF-κB, VEGF, uPA, Met) expressziójára hatnak (5), és a malignus fenotípus fenntartását célzó változásokat indukálnak. Az oldalirányú nyilak a különbözı jelátviteli utak közti lehetséges kommunikációt mutatják (141).
Az
oszteonektin
(SPARC)
mátricelluláris
fehérjének
fontos
szerepet
tulajdonítanak a sejtadhézió és a sejtproliferáció szabályozásában, a tumor- és áttétképzésben. Az oszteonektin fokozott expresszióját tapasztalták számos emberi daganatban: melanomában, vastagbél-, nyelıcsı-, prosztata-, gyomor és májrákokban (142-147). Vastagbélrákban microarray vizsgálattal is az ép nyálkahártyához képest megnövekedett oszteonektin mRNS szintet mértek (73, 86). Porte és mtsai Northern blot és in situ hibridizáció módszerekkel kimutatták, hogy az oszteonektin transzkriptum szintje magasabb primer colorectális daganatokban és májáttétjeikben, mint az ép vastagbélben (143). Az oszteonektin mRNS és fehérje expressziónak a vastagbél
adenoma-dysplasia-carcinoma
emelkedését elıször kutatócsoportunk írta le.
82
szekvenciának
megfelelı
fokozatos
A többi megerısített mRNS expressziós marker funkciójukat tekintve fıként a sejtproliferációhoz (VEGF, CXCL1, TIMP1), az apoptózishoz (VEGF, TIMP3), az érképzéshez (VEGF, VWF, IL8), a sejtadhézióhoz (MCAM, THBS2, VWF), a transzport
folyamatokhoz
(COL4A1),
a
sejtdifferenciálódáshoz
(MGP),
az
immunválaszhoz (IL8, CXCL1, IL1RN), a jelátvitelhez (PTGDR) és az embrionális fejlıdés szabályozásához (AMN) köthetık. A biglikán és a kalumenin géntermékek pontos feladata, szerepe nem ismert. A CXCL1 kemokin ligandum (más néven növekedéssel kapcsolatos onkogén α) egy szekretált interleukinszerő molekula, amely elısegíti a daganatok kialakulását és növekedését. Az éphez képest szignifikánsan magasabb mRNS és protein szintet mutattak
ki
vastagbélrákból,
adenomából
és
vastagbélrák
áttétbıl
lézermikrodisszekcióval nyert mintákban oligonukleotid microarray technikával, valós idejő PCR-rel és immunhisztokémiával (148). Újabban megjelent más közlemények is arra utalnak, hogy a CXCL1 onkogén a vastagbélrák progressziójának klinikailag hasznos markere (71-73, 79, 80, 82). Eredményeimmel összhangban, más chipvizsgálatok is a kollagén-4α1, a biglikán, az interleukin-8, trombospondin-2, a VEGF, a von Willebrand faktor és a TIMP1 gének fokozott mőködését igazolták colorectális carcinomában (73, 81, 83). Az interleukin-8 elısegíti a humán vastagbélrák sejtek proliferációját és migrációját (149). A szérum IL-8 szint más interleukinokéval együtt az invazív vastagbélrák markere (150). A tumor progresszióban és az angiogenezisben szerepet játszó trombospondin-2 gén fokozott mőködése jellemzı SW480 colon carcinoma sejtvonalban (151). A tumorhoz kötött érképzıdés fontos szerepet tölt be a vastagbélrák progressziójában. Két angiogén fehérje, a VWF és a VEGF, plazma és/vagy szöveti szintjének emelkedése összefügg vastagbélrákos betegek áttétképzési hajlamával és a betegség kedvezıtlen prognózisával (152, 153). A VEGF a colorectális daganatok antitest terápiájának is fontos célpontja, mivel CRC-ben ez a legjelentısebb érképzıdést elısegítı faktor (153). Az extracelluláris mátrix összetevıi szintén hatással vannak a daganatok fejlıdésére és terjedésére. A szöveti metalloproteináz gátló-1 (TIMP1) plazmaszintje vastagbélrákos betegekben szignifikánsan emelkedett, már a betegség korai stádiumában is. A magas szenzitivitási és specificitási adatok azt erısítik, hogy a TIMP1 a colorectális daganatok korai felismerésének markerévé válhat (154). Bár a TIMP1 a mátrix metalloproteinázok aktivitásának gátlásán keresztül a
83
tumorok terjedését akadályozza, ugyanakkor gátolja az apoptózist is és stimulálja a malignus átalakulását és a sejtek növekedését. A melanoma sejtadhéziós molekula (MCAM) és a mátrix Gla fehérje (MGP) vastagbélrákban betöltött szerepe még ismeretlen. A fenti két gén más daganatokban (például prosztatarákban, melanomában, petefészek- és veserákban) való fokozott mőködését azonban kimutatták (155-159). Az MCAM szint közvetlenül korrelál a humán melanoma sejtek áttétképzési potenciáljával (156) és markere a petefészekrákos betegek korai recidivájának és a betegség kedvezıtlen kimenetelének (157). A vizsgálataimban fokozatosan csökkenı expressziót mutató gének colorectális karcinogenezisben betöltött szerepét még nem ismerik teljeskörően. A prosztaglandin D2 receptor (PTGDR) gátolja a humán vastagbélrák sejtek proliferációját in vitro. PTDGR mRNS expressziót észleltek ép felnıtt vastagbélben, míg több colorectális daganatos hámsejtvonal egyáltalán nem expresszálja (160, 161). Az amnionless homológ és a kalumenin gének adenomában és a tumor kialakulásban játszott szerepére nem található adat az irodalomban. Az oszteopontinon és az oszteonektinen kívül a biglikánról és a CXCL1-rıl is leírták,
hogy
mRNS
expressziójuk
fokozatosan
növekszik
a
vastagbélrák
elırehaladásával párhuzamosan (75). Más általam azonosított és RT-PCR-rel megerısített szekvenciális markerek CRC progressziós markerekként eddig még nem kerültek említésre. 8.5. A vastagbélbetegségek osztályozására alkalmas mRNS expressziós mintázatok 8.5.1. Clontech cDNS microarray rendszer A cDNS microarray vizsgálataink során azonosított betegség-specifikus mRNS expressziós markercsoportok leszőkítésére variancia-, faktor- és diszkriminancia elemzést végeztem. A varianciaelemzés eredményeképpen kapott 17 gén közül vastagbélrákban eddig 9 gén mőködésének megváltozását írták le (79, 88, 162-169). A megnövekedett expressziójú apoptózisgátló TRAILR3 mellett a sejtproliferációt, a tumorsejtek osztódását segíti elı az AXL protoonkogén és a pleiotrofin. Az extracelluláris mátrix átépítésében az MMP13 és az urokináz plazminogén aktivátor játszik szerepet, míg a
84
HSF1 és a HMGA1 a transzkripció szabályozásában vesznek részt. A patched homológ (PTCH1) gén tumorszuppresszor funkciójú (169). További 3 gén (interleukin-7 receptor, ıssejt növekedési faktor és a RHOH onkogén) szintén a daganatképzıdéssel kapcsolatos (170, 171). A CCL5 kemokin ligandum fokozott expressziója elsısorban colitis ulcerosában jellemzı (172). Az esetek génexpressziós mintázat alapján való clusterezése a varianciaelemzés eredményei alapján történt. A 22 vastagbél biopsziás mintát a hagyományos szövettani diagnózisnak megfelelıen csoportosítottam a cluster elemzés során. Egy kivételével az összes adenoma különálló clustert alkot. Az aktív IBD-s esetek clusterébe egy colon carcinoma eset is került a hasonló génexpressziós mintázat alapján. Ennek oka az lehet, hogy a génexpressziós vizsgálatra felhasznált vastagbélrákos biopsziás mintában a gyulladásos stróma reakcióhoz tartozó elemek száma meghaladta a tumorosok számát, így az IBD-hez hasonló expressziós mintázat dominált. A faktorelemzés azokról a funkcionális géncsoportokról ad felvilágosítást, amelyek expressziós szintje alapján a vizsgált betegségcsoportokat elkülöníthetjük egymástól. Vizsgálataimban az 1. faktor exploratív varianciája volt a legmagasabb, amelyhez tartozó hét génbıl ötöt (a HSF1, a TRAILR3, az ıssejt növekedési faktor, az interleukin-7 receptor és a pleiotrofin) a korábbi irodalmi adatok sejtproliferációval, illetve carcinogenezissel összefüggésben álló génekként említenek (162, 164, 167, 170, 171). A diszkriminancia elemzés során azokat a géneket határozzuk meg, amelyek expressziós szintjét figyelembe véve egy ismeretlen minta egyértelmően besorolható a diagnosztikai csoportok egyikébe. A következı négy gén expressziós változásai alapján a három fı diagnosztikus csoport egyértelmően megkülönböztethetı: a HSF1, a kalgranulin A, a TNFRSF10c (TRAILR3) és a bisztinszerő molekula. A HSF1 (hısokk transzkripciós faktor 1) gén expressziója az ép colon szövethez képest vastagbélrákban fokozott (167). Adenomában és IBD-ben a vastagbélrákban tapasztaltnál kisebb expressziós szintet mértem. A HSF1 gén expressziójának indukciója sporadikus vastagbélrákban aktiválja a HSF1 hısokk stressz jelátviteli utat. A hısokk stressz jelátviteli út szerepe kiemelt jelentıségő a carcinogenezisben. Ezek a fehérjék vesznek részt azon kulcs-onkogének konformációjának, stabilitásának és mőködésének fenntartásában, amelyek a sejtproliferációhoz, a sejtciklus elırehaladásához, az
85
apoptózishoz vezetı jelátviteli utakhoz tartoznak. Hozzájárulnak ezen kívül a malignus fenotípus (invázió, angiogenezis, áttét) kialakulásához is (173). A kalgranulin A (S100A8) kalcium-kötı fehérje, amelynek expressziós szintje IBD-ben magasabb, mint vastagbélrákban és adenomában. Az S100 családba tartozó fehérjék szerepe jelentıs számos sejtfolyamatban, így a sejtciklus és a sejtdifferenciáció szabályozásában és az immunválaszban (174). Szignifikánsan növekedett TRAILR3 (TRAIL 3 receptor) szintet tapasztaltam vastagbélrákban. Ez a szint viszont adenomában és IBD-ben nem fokozódott. A haláldomént nem tartalmazó TRAIL 3 receptor képes megkötni a TRAIL ligandot és gátolja a TRAIL-indukálta apoptózist úgy, hogy a TRAIL ligand proapoptotikus, haláldomént tartalmazó TRAIL receptorokhoz való kötıdését akadályozza (175). Microarray vizsgálataimban a bisztinszerő molekula mRNS-ének jelentıs, mintegy 7-szeres fokozott expresszióját mutattam ki IBD-ben. Suzuki és mtsai azonosították a bisztin nevő citoplazmatikus fehérjét, amely közvetlenül képes kötıdni a megtermékenyített petesejt beágyazódásában szerepet játszó trofinin és a tasztin adhéziós molekulákhoz (176). A bisztinszerő fehérje gyulladásban játszott szerepe eddig még nem ismert. 8.5.2. Affymetrix oligonukleotid microarray rendszer A teljes genom oligonukleotid microarray elemzés eredményeinek leszőkítésére, a mintacsoport elkülönítésre és betegség-osztályozásra alkalmas mRNS expressziós mintázatok azonosítására a MAS5.0 és RMA normalizáció utáni elemzéssel nyert mintázatok átfedı génjeinek meghatározását és diszkriminancia elemzést végeztem. A fı diagnosztikus csoportokat az ép kontroll mintákhoz viszonyítottam. 13 gén expressziós szintje alapján a vastagbélrákos esetek biztosan elkülöníthetık. Ezen markerek közül hatot Taqman valós idejő RT-PCR-rel is megerısítettem. Az elkülönítı gének közül kimutatták, hogy a lipokalin-2 (LCN2), a kollagén 4α1 (COL4A1) és az akvaporin-8 (AQP8) gének a vastagbélrákkal szorosan összefüggenek. Az LCN2 transzportmolekula kemotaktikus ágensként mőködik és a mátrix metalloproteináz 9 aktivitását szabályozza. Az akvaporin-8 vízcsatorna fehérje a nem osztódó vastagbélhámsejtek markere, adenomában és vastagbélrákban fehérje szinten nem jelenik meg. Fischer és mtsai eredményeivel összhangban, adenomában és colorectális rákban a vizsgálataimban is szignifikánsan csökkent az AQP8 mRNS szintje (86, 177).
86
Az érképzıdéssel összefüggı von Willebrand faktor (VWF) és a multidrug rezisztenciával kapcsolatos kaveolin-1 (CAV1) fokozott expresszióját, míg a prosztaglandin D2 receptor (PTGDR) csökkent mőködését szintén kimutatták már vastagbélrákban (161, 178, 179). Az elkülönítı transzkriptumok közül a fokozott expressziójú, ismeretlen funkciójú olfaktomedin-4 (OLFM4) és kalumenin (CALU), valamint a csökkent mőködéső amnionless homológ (AMN), SLC36A1 aminosav transzporter és két hipotetikus fehérje (FLJ21511 és 240157_at) vastagbélrákban játszott szerepérıl nincs adat az irodalomban, így ezek újonnan azonosított vastagbélrákkal kapcsolatos mRNS expressziós markereknek tekinthetık. Az adenomák 27 gén expressziós változásaival jellemezhetık és ezek alapján biztosan megkülönböztethetık. Közülük hetet (a fokozott mőködéső CD44-t és MET-t, valamint a csökkent mőködéső GUCA2A-t, CXCL12-t, TRPM6-t, ABCA8-t és ADAMDEC1-t) a Taqman RT-PCR is megerısített. A 27 elkülönítı transzkriptumból eddig hatról (a sejtproliferációt elısegítı CD44-rıl és MET-rıl, a HAPLN1 adhéziós molekuláról, a guanilin és a CXCL12 transzportfehérjékrıl, valamint a karbonanhidráz-1-rıl) írtak le, hogy a colorectális carcinogenezissel összefügg, illetve hogy expressziójuk az általam is tapasztalt módon változik adenomában az ép nyálkahártyához képest (72, 73, 78, 88, 180-183). A CD44 sejtfelszíni glikoprotein antigén a hialuronsav receptora, de megköti az osteopontint, az EGFR-t, a mátrix metalloproteinázokat és az IGFBP3-t is. A CD44 expressziós változásai számos különbözı intracelluláris jelátviteli útvonalat befolyásolnak, így például az EGFR-függı sejtproliferációt és tumorképzıdést, a tumorszövet újraépülését (remodeling) és az immunszabályozási folyamatokat. A colon adenomában és vastagbélrákban fokozottan mőködı hepatocita növekedési faktor receptor (MET) fontos szerepet játszik a vastagbél daganatos
átalakulásában.
Trovato
és
mtsai
eredményeinek
megfelelıen
vizsgálataimban növekedett c-met mRNS szintet tapasztaltam colorectális rákos és adenomás biopsziákban egyaránt. Vastagbélrákban azonban ez a növekedés kisebb mértékő volt mint adenomában. A c-met expresszió csökkenése az adenoma-carcinoma átalakulásra jellemzı (181). A GUCA2A (guanilin) a vastagbél iontranszportjának szabályozásában vesz részt. A guanilin expressziója csökkent humán intesztinális adenomákban. Újabb kutatási eredmények egyébként arra utalnak, hogy a guanilin aktivitás
teljes
elvesztése
elısegítheti
87
a
tumoros
átalakulást,
vagy
esetleg
következménye is lehet (184). A kemokin ligand 12 (CXCL12), amely vizsgálataim szerint adenomában mérsékeltebb expressziót mutatott, a cAMP termelıdését és a bélhámsejtek iontranszportját szabályozza. Errıl a génrıl korábban kimutatták, hogy különbözı tumorokban csökkent a mőködése (182, 185). Ezek az adatok azt az elméletet támasztják alá, hogy a vastagbél iontranszportjának károsodása szerepet játszik a colorectális rák kialakulásában. Szintén az iontranszporttal kapcsolatosak a TRPM6, az ABCA8 és a VMD2L2 colorectális adenomában még le nem írt, vizsgálataimban csökkent expressziót mutató gének. Az újonnan azonosított expressziós markerek az iontranszporton kívül, elsısorban a sejtproliferáció (S100P), a sejten belüli jelátvitel (statminszerő-2, tetraspanin-7, foszfodiészteráz-3A), a sejtadhézió (α6integrin), az immunválasz (ADAM-szerő decizin-1) és az érképzıdés (EDIL3) szabályozásában vesznek részt. Számos elkülönítı transzkriptum (pl. FLJ21511, MGC45780, MGC4172, 230204_at) génterméke, azok pontos funkciója, valamint az adenoma- és tumor kialakulásban betöltött szerepe még ismeretlen. Az IBD-s minták és az ép biopsziák között tíz elkülönítı transzkriptum segítségével tehetı különbség. Ezeknek a géneknek a többsége fokozott mőködéső interferon-indukált gén. Saját és más kutatócsoportok eredménye szerint az interferonindukált transzmembrán fehérje 3 (IFITM3) génje a colitis ulcerosás betegek súlyosan gyulladt vastagbél-nyálkahártyájában fokozottan expresszálódott (186). Az IFITM3-nak más típusú sporadikus rákokban, valamint UC-asszociált tumorokban is növekedett az mRNS szintje, ezért feltételezhetı, hogy a fokozott rákkockázatú colitis ulcerosás állapotok markere lehet. A PSMB9 és az UBE2L6 interferon-indukált elkülönítı gének a megnövekedett antigén feldolgozással és bemutatással állnak összefüggésben. A fokozott mőködéső CRC-asszociált gének között szereplı lipokalin 2 (LCN2) colitis ulcerosában a gyulladt területek bélhámsejtjeiben és a neutrofil granulocitákban is felülszabályozott. Microarray vizsgálatokkal más kutatócsoportok is jelentısen növekedett LCN2 mRNS szintet mértek UC-ben (93, 187). IBD-s mintáinkban a hám magnézium
felszívódásának
károsodását
a
TRPM6
szignifikánsan
csökkent
expressziója jelezte. Az UBE2L6 és a TRPM6 mellett további négy transzkriptum (IFITM1, ZNF91, 240389_at, és 213369_at) IBD-re jellemzı expressziós változását kutatócsoportunk írta le elıször. Taqman RT-PCR-es megerısítést csak az UC-s
88
mintákon végeztem kilenc, az egészségestıl eltérıen expresszálódó génre, mivel az aktív Crohn-betegek mintáinak száma nem volt elegendı. A diszkriminancia elemzés során kapott hét gén expressziós változásai alapján a három fı diagnosztikus csoport egyértelmően megkülönböztethetı. Az ENC1 egy p53 által indukált protein, a β-katenin/TCF komplex downstream célpontja, mely felülregulálódik vastagbél adenomában és vastagbélrákban (88, 188). A colorectális carcinogenezisben a vastagbélsejtek differenciálódásának gátlásán keresztül játszhat szerepet (188). A fukoziltranszferáz-8 (FUT8) gén termékérıl feltételezik, hogy a daganatsejtek malignussá válását segíti elı (189). A kollektin alcsalád 12. tagja (COLEC12) egy scavenger receptor, mely a szénhidrát antigének, mikroorganizmusok és apoptotikus sejtek felismerésében és eltávolításában vesz részt (190). A fenti három gén fokozott expresszióját észleltem adenomában. A diszkriminancia elemzésben elkülönítınek bizonyult gének közül az extracelluláris mátrix átépítésben közrejátszó TIMP3 és a proteolitikus karboxipeptidáz-D mőködése vastagbélrákban, míg az indoamin-pirrol-2,3-dioxigenáz (INDO) és a transzglutamináz-2 (TGM2) gének expressziója IBD-ben fokozott. Az INDO a T-sejt proliferációt és túlélést szabályozza, mRNS szintjének jelentıs növekedését mutatták ki IBD-ben (191). A magas INDO expresszió valószínőleg egy gyulladásellenes mechanizmus része, amely ellensúlyozza a vastagbélnyálkahártyát infiltráló T-sejtek szövetkárosító hatását (191). 8.6. Következtetések Eredményeimet expressziós
összefoglalva arra következtethetünk, hogy az
markerpanelek
vizsgálata
lehetıséget
nyújt
a
vastagbél
mRNS minták
osztályozására, még kismérető biopsziás minták esetén is. A kis beavatkozással nyerhetı biopsziás minták génexpressziós elemzésével az ép, az adenoma, a CRC és az IBD mintákon kívül a vastagbélrák különbözı stádiumai is osztályozhatók. Munkámban a colorectális adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia jellemzı progressziós markereit is azonosítottam. Az oszteopontin és az oszteonektin a legfontosabb progressziós markerek, amelyeket RT-PCR-rel és szöveti microarray vizsgálattal is megerısítettem, mind az eredeti, mind független mintaszeten. Az oszteopontin daganatképzésben, az érátrendezıdésben és immunszabályozásban való szerepe, és az oszteonektin
89
sejtadhézióra és proliferációra tett hatása e két molekulát a jövıben új rákellenes gyógyszerek kifejlesztésének célpontjává teheti. A szövettani diagnózisokhoz génexpressziós elemzéssel jellemzı molekuláris mintázat rendelésének hosszútávú elınye az, hogy betegség-specifikus génmintázatok segítségével megteremthetı a pontosabb diagnosztika lehetısége: a szövettanilag korlátozottan értékelhetı minták felhasználásával biztosabb diagnózis felállítása, a szövettani vizsgálattal bizonytalan kórisme, illetve a mélységi invázió, áttét vitatható jelenléte esetén a szövettani szerkezet megismerésének támogatása. Az elkülönítı gének listája még pontosabbá tehetı az egyes összehasonlításokban alkalmazott nagyobb mintaszámú vizsgálatokkal. Az mRNS expressziós mintázat alapú diagnosztika kifejlesztésének fontos feladatai közül alapvetı a független mintahalmazon való tesztelés. A diagnosztikus lehetıséget nyújtó elkülönítı géneket tartalmazó miniarray-k kereskedelmi forgalomba kerülésével a jövıben könnyebbé és gyorsabbá válhat a pontos kórisme megállapítása.
90
9.0. LEGFONTOSABB ÚJ MEGFIGYELÉSEK ÉS MEGÁLLAPÍTÁSOK - A biopsziás minták teljes genom oligonukleotid microarray vizsgálati módszere az Affymetrix oligonukleotid microarray minıségi kritériumoknak messzemenıen megfelelınek, standardizáltnak és jól reprodukálhatónak bizonyult. - A Taqman Mikrofolyadék Kártyarendszer, amellyel párhuzamosan akár 96 gén expresszióját lehet vizsgálni 10-100 mintán különösen alkalmas a chipen mért génexpressziós változások nagy teljesítményő, gyors és költséghatékony valós idejő PCR-es megerısítésére. - Az oszteopontin és az oszteonektin fokozatosan emelkedı mRNS és fehérje expressziója erısen korrelál a vastagbél adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia elırehaladásával. - Tíz, a colorectális adenoma-dysplasia-carcinoma átmenettel párhuzamosan fokozódó mRNS expressziójú, valós idejő PCR-rel is megerısített szöveti markert azonosítottam, amelyet még nem írtak le az irodalomban. Ezek a következık: szöveti metalloproteináz gátló-1 és -3, von Willebrand faktor, interleukin-8, melanoma sejtadhéziós molekula, trombospondin-2, kollagén-4A1, mátrix GLA fehérje, interleukin-1 receptor antagonista és a kalumenin. - A prosztaglandin receptor-2 és az amnionless homológ a colorectális adenomadysplasia-carcinoma szekvencia fokozatosan csökkenı mRNS expressziójú, validált, eddig még le nem írt markerei. - Vizsgálataim során 27, 13, illetve 10 „top” gént azonosítottam, melyek mRNS expressziós mintázata a vastagbél adenomával, a colorectális carcinomával, illetve a gyulladásos bélbetegségekkel asszociálódik. - Azonosítottam a korai (Dukes A és B stádiumú) és elırehaladott (Dukes C és D stádiumú) vastagbélrákok molekuláris alapú megkülönböztetésére alkalmas, 100 leginkább eltérı mRNS expressziójú gént.
91
10.0 IRODALOM
1. Cancer Research Campaign. Cancer statistics: Large bowel – UK. London: CRC, 1999. 2. Colorectal Cancer. In: Steward BW, Kleihues P. eds. World Cancer Report. Lyon: IARC Press, 2003: 198-202. 3. O'Connell JB, Maggard MA, Ko CY. Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J Natl Cancer Inst. 2004 Oct 6;96(19):1420-5. 4. Jass JR. Classification of colorectal cancer based on correlation of clinical, morphological and molecular features. Histopathology. 2007 Jan;50(1):113-30. 5. Szentirmay Z, Csuka O. A vastagbélrák molekuláris patológiája, A vastagbélrák megelızése és kezelése, szerkesztı: Tulassay Z, Springer Tudományos Kiadó, 2004 6. Baylin SB, Herman JG, Graff JR, Vertino PM, Issa JP. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia. Adv Cancer Res. 1998;72:141-96. 7. Jones PA, Laird PW. Cancer epigenetics comes of age. Nat Genet. 1999 Feb;21(2):163-7. 8. Chen RZ, Pettersson U, Beard C, Jackson-Grusby L, Jaenisch R. DNA hypomethylation leads to elevated mutation rates. Nature. 1998 Sep 3;395(6697):89-93. 9. Eden S, Cedar H. Role of DNA methylation in the regulation of transcription. Curr Opin Genet Dev. 1994 Apr;4(2):255-9. 10. Toyota M, Issa JP. CpG island methylator phenotypes in aging and cancer. Semin Cancer Biol. 1999 Oct;9(5):349-57. 11. Merlo A, Herman JG, Mao L, Lee DJ, Gabrielson E, Burger PC, Baylin SB, Sidransky D. 5' CpG island methylation is associated with transcriptional silencing of the tumour suppressor p16/CDKN2/MTS1 in human cancers. Nat Med. 1995 Jul;1(7):686-92. 12. Greger V, Debus N, Lohmann D, Hopping W, Passarge E, Horsthemke B. Frequency and parental origin of hypermethylated RB1 alleles in retinoblastoma. Hum Genet. 1994 Nov;94(5):491-6.
92
13. Lee S, Hwang KS, Lee HJ, Kim JS, Kang GH. Aberrant CpG island hypermethylation of multiple genes in colorectal neoplasia. Lab Invest. 2004 Jul;84(7):884-93. 14. Issa JP, Shen L, Toyota M. CIMP, at last. Gastroenterology. 2005 Sep;129(3):11214. 15. de la Chapelle A. Microsatellite instability. N Engl J Med. 2003 Jul 17;349(3):20910. 16. Markowitz SD, Roberts AB. Tumor suppressor activity of the TGF-beta pathway in human cancers. Cytokine Growth Factor Rev. 1996 Jun;7(1):93-102. 17. Souza RF, Appel R, Yin J, Wang S, Smolinski KN, Abraham JM, Zou TT, Shi YQ, Lei J, Cottrell J, Cymes K, Biden K, Simms L, Leggett B, Lynch PM, Frazier M, Powell SM, Harpaz N, Sugimura H, Young J, Meltzer SJ. Microsatellite instability in the insulin-like growth factor II receptor gene in gastrointestinal tumours. Nat Genet. 1996 Nov;14(3):255-7. 18. Rampino N, Yamamoto H, Ionov Y, Li Y, Sawai H, Reed JC, Perucho M. Somatic frameshift mutations in the BAX gene in colon cancers of the microsatellite mutator phenotype. Science. 1997 Feb 14;275(5302):967-9. 19. Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, Sidransky D, Eshleman JR, Burt RW, Meltzer SJ, Rodriguez-Bigas MA, Fodde R, Ranzani GN, Srivastava S. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res. 1998 Nov 15;58(22):5248-57. 20. Samowitz WS, Curtin K, Ma KN, Schaffer D, Coleman LW, Leppert M, Slattery ML. Microsatellite instability in sporadic colon cancer is associated with an improved prognosis at the population level. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2001 Sep;10(9):917-23. 21. Rozen P, Macrae F. Familial adenomatous polyposis: The practical applications of clinical and molecular screening. Fam Cancer. 2006;5(3):227-35. 22. Lynch HT, de la Chapelle A. Genetic susceptibility to non-polyposis colorectal cancer. J Med Genet. 1999 Nov;36(11):801-18. 23. Lynch HT, de la Chapelle A. Hereditary colorectal cancer. N Engl J Med. 2003 Mar 6;348(10):919-32.
93
24. Miyaki M, Konishi M, Tanaka K, Kikuchi-Yanoshita R, Muraoka M, Yasuno M, Igari T, Koike M, Chiba M, Mori T. Germline mutation of MSH6 as the cause of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Nat Genet. 1997 Nov;17(3):271-2. 25. Jass JR, Biden KG, Cummings MC, Simms LA, Walsh M, Schoch E, Meltzer SJ, Wright C, Searle J, Young J, Leggett BA. Characterisation of a subtype of colorectal cancer combining features of the suppressor and mild mutator pathways. J Clin Pathol. 1999 Jun;52(6):455-60. 26. Kambara T, Simms LA, Whitehall VL, Spring KJ, Wynter CV, Walsh MD, Barker MA, Arnold S, McGivern A, Matsubara N, Tanaka N, Higuchi T, Young J, Jass JR, Leggett BA.BRAF mutation is associated with DNA methylation in serrated polyps and cancers of the colorectum. Gut. 2004 Aug;53(8):1137-44. 27. Iino H, Jass JR, Simms LA, Young J, Leggett B, Ajioka Y, Watanabe H. DNA microsatellite instability in hyperplastic polyps, serrated adenomas, and mixed polyps: a mild mutator pathway for colorectal cancer? J Clin Pathol. 1999 Jan;52(1):5-9. 28. Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 1990 Jun 1;61(5):759-67. 29. Leslie A, Carey FA, Pratt NR, Steele RJ. The colorectal adenoma-carcinoma sequence. Br J Surg 2002;89:845-60. 30. Nagy F. A vastagbél betegségei. Klinikai Gasztroenterológia. szerkesztı: Lonovics J, Tulassay Z, Varró V., Budapest: Medicina Kiadó;2003. 197-266. 31. Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, Kern SE, Preisinger AC, Leppert M, Nakamura Y, White R, Smits AM, Bos JL. Genetic alterations during colorectal-tumor development. N Engl J Med. 1988;319:525-32. 32. Eberhart CE, Coffey RJ, Radhika A, Giardiello FM, Ferrenbach S, DuBois RN. Up-regulation of cyclooxygenase 2 gene expression in human colorectal adenomas and adenocarcinomas. Gastroenterology. 1994 Oct;107(4):1183-8. 33. Brown JR, DuBois RN. COX-2: a molecular target for colorectal cancer prevention. J Clin Oncol. 2005 Apr 20;23(12):2840-55. 34. Span M, Moerkerk PT, De Goeij AF, Arends JW. A detailed analysis of K-ras point mutations in relation to tumor progression and survival in colorectal cancer patients. Int J Cancer. 1996 Jun 21;69(3):241-5.
94
35. Ranaldi R, Gioacchini AM, Manzin A, Clementi M, Paolucci S, Bearzi I. Adenoma-carcinoma sequence of colorectum. Prevalence of K-ras gene mutation in adenomas with increasing degree of dysplasia and aneuploidy. Diagn Mol Pathol. 1995 Sep;4(3):198-202. 36. Barbacid M. Ras genes. Annu Rev Biochem. 1987;56:779-827. 37. Norrie MW, Hawkins NJ, Todd AV, Meagher AP, O'Connor TW, Ward RL. Inactivation of p16INK4a by CpG hypermethylation is not a frequent event in colorectal cancer. J Surg Oncol. 2003 Nov;84(3):143-50. 38. Yi J, Wang ZW, Cang H, Chen YY, Zhao R, Yu BM, Tang XM. p16 gene methylation in colorectal cancers associated with Duke's staging. World J Gastroenterol. 2001 Oct;7(5):722-5. 39. Hedrick L, Cho KR, Fearon ER, Wu TC, Kinzler KW, Vogelstein B. The DCC gene product in cellular differentiation and colorectal tumorigenesis. Genes Dev. 1994 May 15;8(10):1174-83. 40. Zhou S, Buckhaults P, Zawel L, Bunz F, Riggins G, Dai JL, Kern SE, Kinzler KW, Vogelstein B. Targeted deletion of Smad4 shows it is required for transforming growth factor beta and activin signaling in colorectal cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Mar 3;95(5):2412-6. 41. Riggins GJ, Kinzler KW, Vogelstein B, Thiagalingam S. Frequency of Smad gene mutations in human cancers. Cancer Res. 1997 Jul 1;57(13):2578-80. 42. Eppert K, Scherer SW, Ozcelik H, Pirone R, Hoodless P, Kim H, Tsui LC, Bapat B, Gallinger S, Andrulis IL, Thomsen GH, Wrana JL, Attisano L. MADR2 maps to 18q21 and encodes a TGFbeta-regulated MAD-related protein that is functionally mutated in colorectal carcinoma. Cell. 1996 Aug 23;86(4):543-52. 43. Caron de Fromentel C, Soussi T. TP53 tumor suppressor gene: a model for investigating human mutagenesis. Genes Chromosomes Cancer. 1992 Jan;4(1):1-15. 44. Oren M, Rotter V. Introduction: p53-the first twenty years. Cell Mol Life Sci. 1999 Jan;55(1):9-11. 45. May P, May E. Twenty years of p53 research: structural and functional aspects of the p53 protein. Oncogene. 1999 Dec 13;18(53):7621-36. 46. Lane DP. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 1992 Jul 2;358(6381):15-6.
95
47. Menke H. Gasztroenterológia. Belgyógyászat, szerkesztı: Herold G. Budapest: B+V Medical Kiadó; 2001. 347-485. 48. Fearnhead NS, Wilding JL, Bodmer WF. Genetics of colorectal cancer: hereditary aspects and overview of colorectal tumorigenesis. Br Med Bull. 2002;64:27-43. 49. Kewenter J, Ahlman H, Hultén L. Cancer risk in extensive ulcerative colitis. Ann Surg. 1978 Dec;188(6):824-8. 50. Hendriksen C, Kreiner S, Binder V. Long term prognosis in ulcerative colitis-based on results from a regional patient group from the county of Copenhagen. Gut. 1985 Feb;26(2):158-63. 51. Gyde SN, Prior P, Allan RN, Stevens A, Jewell DP, Truelove SC, Lofberg R, Brostrom O, Hellers G. Colorectal cancer in ulcerative colitis: a cohort study of primary referrals from three centres. Gut. 1988 Feb;29(2):206-17. 52. Gillen CD, Walmsley RS, Prior P, Andrews HA, Allan RN. Ulcerative colitis and Crohn's disease: a comparison of the colorectal cancer risk in extensive colitis. Gut. 1994 Nov;35(11):1590-2. 53. Zágoni T. A vastagbélrák, mint a gyulladásos bélbetegségek lehetséges szövıdménye. A vastagbélrák megelızése és kezelése, szerkesztı: Tulassay Z, Springer Tudományos Kiadó, 2004 54. Itzkowitz SH, Yio X. Inflammation and cancer IV. Colorectal cancer in inflammatory bowel disease: the role of inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2004 Jul;287(1):G7-17. 55. Brentnall TA, Crispin DA, Rabinovitch PS, Haggitt RC, Rubin CE, Stevens AC, Burmer GC. Mutations in the p53 gene: an early marker of neoplastic progression in ulcerative colitis. Gastroenterology. 1994 Aug;107(2):369-78. 56. Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol. 1975 Nov 5;98(3):503-17. 57. Galamb O, Molnár B, Tulassay Z. DNS chipek génexpressziós mintázatok vizsgálatára és alkalmazásuk a diagnosztikában. Orv Hetil. 2003 Jan 5;144(1):21-7. 58. Petrik J. Microarray technology: the future of blood testing? Vox Sang. 2001 Jan;80(1):1-11. 59. Kallioniemi OP. Biochip technologies in cancer research. Ann Med. 2001 Mar;33(2):142-7.
96
60. Nagy GR, Gyorffy B, Galamb O, Molnar B, Nagy B, Papp Z. Use of routinely collected amniotic fluid for whole-genome expression analysis of polygenic disorders. Clin Chem. 2006 Nov;52(11):2013-20. 61. Dezsı P, Nagy J. A polimeráz láncreakció (PCR) és gyógyszerkutatási alkalmazásai. Magyar Kémiai Folyóirat, 2005;111(4):153-7. 62. Haab BB, Dunham MJ, Brown PO. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biol. 2001;2(2):RESEARCH0004. 63. Spisák S, Molnár B, Galamb O, Sipos F, Tulassay Z. Fehérje chipek elméleti alapjai és alkalmazási lehetıségük az orvosi diagnosztikában és kutatásban. Orv Hetil. 2007 Aug 1;148(32):1511-20. 64. Spisák S, Tulassay Z, Molnár B, Guttman A. Protein microchips in biomedicine and biomarker discovery. Electrophoresis. 2007 (nyomtatásban) 65. Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, Barlund M, Schraml P, Leighton S, Torhorst J, Mihatsch MJ, Sauter G, Kallioniemi OP. Tissue microarrays for highthroughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 1998 Jul;4(7):844-7. 66. Jones PA, Laird PW. Cancer epigenetics comes of age. Nat Genet. 1999;21:163167. 67. Model F, Osborn N, Ahlquist D, Gruetzmann R, Molnar B, Sipos F, Galamb O, Pilarsky C, Saeger HD, Tulassay Z, Hale K, Mooney S, Lograsso J, Adorjan P, Lesche R, Dessauer A, Kleiber J, Porstmann B, Sledziewski A, Lofton-Day C. Identification and validation of colorectal neoplasia-specific methylation markers for accurate classification of disease. Mol Cancer Res. 2007 Feb;5(2):153-63. 68. Cui H, Horon IL, Ohlsson R, Hamilton SR, Feinberg AP. Loss of imprinting in normal tissue of colorectal cancer patients with microsatellite instability. Nat Med. 1998;4:1276-1280. 69. Galamb O, Sipos F, Fischer K, Tulassay Z, Molnár B. The results of the expression array studies correlate and enhance the known genetic basis of gastric and colorectal cancer. Cytometry B Clin Cytom. 2005 Nov;68(1):1-17. 70. Sipos F, Galamb O, Molnár B, Tulassay Z. Chiptechnikák alkalmazása vastagbélrákban. Orv Hetil. 2004; 145(19):993-9.
97
71. Kitahara O, Furukawa Y, Tanaka T, Kihara C, Ono K, Yanagawa R, Nita ME, Takagi T, Nakamura Y, Tsunoda T. Alterations of gene expression during colorectal carcinogenesis revealed by cDNA microarrays after laser-capture microdissection of tumor tissues and normal epithelia. Cancer Res. 2001 May 1;61(9):3544-9. 72. Notterman DA, Alon U, Sierk AJ, Levine AJ. Transcriptional gene expression profiles of colorectal adenoma, adenocarcinoma, and normal tissue examined by oligonucleotide arrays. Cancer Res. 2001;61:3124-30. 73. Croner RS, Foertsch T, Brueckl WM, Guenther K, Siebenhaar R, Stremmel C, Matzel KE, Papadopoulos T, Kirchner T, Behrens J, Klein-Hitpass L, Stuerzl M, Hohenberger W, Reingruber B. Common denominator genes that distinguish colorectal carcinoma from normal mucosa. Int J Colorectal Dis. 2005;20:353-62. 74. Kwon HC, Kim SH, Roh MS, Kim JS, Lee HS, Choi HJ, Jeong JS, Kim HJ, Hwang TH. Gene expression profiling in lymph node-positive and lymph node-negative colorectal cancer. Dis Col Rect. 2004;47:141-52. 75. Agrawal D, Chen T, Irby R, Quackenbush J, Chambers AF, Szabo M, Cantor A, Coppola D, Yeatman TJ. Osteopontin identified as colon cancer tumor progression marker. C R Biol. 2003,326:1041-3. 76. Bandres E, Catalan V, Sola I, Honorato B, Cubedo E, Cordeu L, Andion E, Escalada A, Zarate R, Salgado E, Zabalegui N, Garcia F, et al. Dysregulation of apoptosis is a major mechanism in the lymph node involvement in colorectal carcinoma. J Oncol Rep. 2004;12:287-92. 77. Bertucci F, Salas S, Eysteries S, Nasser V, Finetti P, Ginestier C, Charafe-Jauffret E, Loriod B, Bachelart L, Montfort J, Victorero G, Viret F, et al. Gene expression profiling of colon cancer by DNA microarrays and correlation with histoclinical parameters. Oncogene. 2004;23:1377-91. 78. Birkenkamp-Demtroder K, Christensen LL, Olesen SH, Frederiksen CM, Laiho P, Aaltonen LA, Laurberg S, Sorensen FB, Hagemann R, Orntoft TF. Gene expression in colorectal cancer. Cancer Res 2002;62:4352-63 79. Williams NS, Gaynor RB, Scoggin S, Verma U, Gokaslan T, Simmang C, Fleming J, Tavana D, Frenkel E, Becerra C. Identification and validation of genes involved in the pathogenesis of colorectal cancer using cDNA microarrays and RNA interference. Clin Cancer Res. 2003;9:931-46.
98
80. Zou TT, Selaru FM, Xu Y, Shustova V, Yin J, Mori Y. Application of cDNA microarrays to generate a molecular taxonomy capable of distinguishing between colon cancer and normal colon. Oncogene. 2002;21:4855-62. 81. Birkenkamp-Demtroder K, Olesen SH, Sorensen FB, Laurberg S, Laiho P, Aaltonen LA, Orntoft TF. Differential gene expression in colon cancer of the caecum versus the sigmoid and rectosigmoid. Gut. 2005;54:374-84. 82. Chiu ST, Hsieh FJ, Chen SW, Chen CL, Shu HF, Li H. Clinicopathologic correlation of up-regulated genes identified using cDNA microarray and real-time reverse transcription-PCR in human colorectal cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2005;14:437-43. 83. Okuno K, Yasutomi M, Nishimura N, Arakawa T, Shiomi M, Hida J, Ueda K, Minami K. Gene expression analysis in colorectal cancer using practical DNA array filter. Dis Colon Rectum. 2001 Feb;44(2):295-9. 84. Backert S, Gelos M, Kobalz U, Hanski ML, Böhm C, Mann B, Lövin N, Gratchev A, Mansmann U, Moyer MP, Riecken EO, Hanski C. Differential gene expression in colon carcinoma cells and tissues detected with a cDNA array. Int J Cancer. 1999 Sep 9;82(6):868-74. 85. Zhang L, Zhou W, Velculescu VE, Kern SE, Hruban RH, Hamilton SR, Vogelstein B, Kinzler KW. Gene expression profiles in normal and cancer cells. Science. 1997 May 23;276(5316):1268-72. 86. Takemasa I, Higuchi H, Yamamoto H, Sekimoto M, Tomita N, Nakamori S, Matoba R, Monden M, Matsubara K. Construction of preferential cDNA microarray specialized for human colorectal carcinoma: molecular sketch of colorectal cancer. Biochem Biophys Res Commun. 2001 Aug 3;285(5):1244-9. 87. Nosho K, Yamamoto H, Adachi Y, Endo T, Hinoda Y, Imai K. Gene expression profiling of colorectal adenomas and early invasive carcinomas by cDNA array analysis. Br J Cancer. 2005;92:1193-1200. 88. Van der Flier LG, Sabates-Bellver J, Oving I, Haegebarth A, De Palo M, Anti M, Van Gijn ME, Suijkerbuijk S, Van de Wetering M, Marra G, Clevers H. The Intestinal Wnt/TCF Signature. Gastroenterology. 2007 Feb;132(2):628-32. 89. Li M, Lin YM, Hasegawa S, Shimokawa T, Murata K, Kameyama M, Ishikawa O, Katagiri T, Tsunoda T, Nakamura Y, Furukawa Y. Genes associated with liver
99
metastasis of colon cancer, identified by genome-wide cDNA microarray. Int J Oncol. 2004;24:305-12. 90. Lin YM, Furukawa Y, Tsunoda T, Yue CT, Yang KC, Nakamura Y. Molecular diagnosis of colorectal tumors by expression profiles of 50 genes expressed differentially in adenomas and carcinomas. Oncogene 2002;21:4120-8 91. Nosho K, Yamamoto H, Takamaru H, Hamamoto Y, Goto A, Yoshida Y, Arimura Y, Endo T, Hirata K, Imai K. A case of colorectal carcinoma in adenoma analyzed by a cDNA array. Int J Colorectal Dis. 2005;20:287-91. 92. Langmann T, Moehle C, Mauerer R, Scharl M, Liebisch G, Zahn A, Stremmel W, Schmitz G. Loss of detoxification in inflammatory bowel disease: dysregulation of pregnane X receptor target genes. Gastroenterology. 2004;127:26-40. 93. Lawrance IC, Fiocchi C, Chakravarti S. Ulcerative colitis and Crohn's disease: distinctive gene expression profiles and novel susceptibility candidate genes. Hum Mol Genet. 2001;10:445-56. 94. Okahara S, Arimura Y, Yabana T, Kobayashi K, Gotoh A, Motoya S, Imamura A, Endo T, Imai K. Inflammatory gene signature in ulcerative colitis with cDNA macroarray analysis. Aliment Pharmacol Ther. 2005;21:1091-7. 95. Uthoff SM, Eichenberger MR, Lewis RK, Fox MP, Hamilton CJ, McAuliffe TL, Grimes HL, Galandiuk S. Identification of candidate genes in ulcerative colitis and Crohn's disease using cDNA array technology. Int J Oncol. 2001;19:803-10. 96. Puleston J, Cooper M, Murch S, Bid K, Makh S, Ashwood P, Bingham AH, Green H, Moss P, Dhillon A, Morris R, Strobel S, Gelinas R, Pounder RE, Platt A.A distinct subset of chemokines dominates the mucosal chemokine response in inflammatory bowel disease. Aliment Pharmacol Ther. 2005;21:109-20. 97. Mannick EE, Bonomolo JC, Horswell R, Lentz JJ, Serrano MS, Zapata-Velandia A, Gastanaduy M, Himel JL, Rose SL, Udall JN Jr, Hornick CA, Liu Z. Gene expression in mononuclear cells from patients with inflammatory bowel disease. Clin Immunol. 2004;112:247-57. 98. Galamb O, Sipos F, Dinya E, Spisák S, Tulassay Z, Molnár B. mRNA expression, functional profiling and multivariate classification of colon biopsy specimen by cDNA overall glass microarray. World J Gastroenterol. 2006;12:6998-7006.
100
99. Csillag C, Nielsen OH, Vainer B, Olsen J, Dieckgraefe BK, Hendel J, Vind I, Dupuy C, Nielsen FC, Borup R. Expression of the genes dual oxidase 2, lipocalin 2 and regenerating islet-derived 1 alpha in Crohn's disease. Scand J Gastroenterol. 2007 Apr;42(4):454-63. 100. Van Gelder RN, von Zastrow ME, Yool A, Dement WC, Barchas JD, Eberwine JH. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogenous cDNA. Proc Natl Acad Sci USA. 1990;87:1663-7. 101. Yanagawa R, Furukawa Y, Tsunoda T, Kitahara O, Kameyama M, Murata K, Ishikawa O, Nakamura Y. Genome-wide screening of genes showing altered expression in liver metastases of human colorectal cancers by cDNA microarray. Neoplasia. 2001;3:395-401. 102. Frederiksen CM, Knudsen S, Laurberg S, Orntoft TF. Classification of Dukes' B and C colorectal cancers using expression arrays. J Cancer Res Clin Oncol. 2003;129:263-71. 103. Wang Y, Jatkoe T, Zhang Y, Mutch MG, Talantov D, Jiang J, McLeod HL, Atkins D. Gene expression profiles and molecular markers to predict recurrence of Dukes' B colon cancer. J Clin Oncol. 2004;22:1564-71. 104. Gardina PJ, Clark TA, Shimada B, Staples MK, Yang Q, Veitch J, Schweitzer A, Awad T, Sugnet C, Dee S, Davies C, Williams A, Turpaz Y. Alternative splicing and differential gene expression in colon cancer detected by a whole genome exon array. BMC Genomics. 2006 Dec 27;7:325. 105. Borthakur A, Bhattacharyya S, Dudeja PK, Tobacman JK. Carrageenan induces interleukin-8 production through distinct Bcl10 pathway in normal human colonic epithelial cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2007 Mar;292(3):G829-38. 106. Mansilla F, Birkenkamp-Demtroder K, Kruhoffer M, Sorensen FB, Andersen CL, Laiho P, Aaltonen LA, Verspaget HW, Orntoft TF. Differential expression of DHHC9 in microsatellite stable and instable human colorectal cancer subgroups. Br J Cancer. 2007 Jun 18;96(12):1896-903. 107. Galamb O, Sipos F, Molnár B, Szıke D, Spisák S, Tulassay Z. Evaluation of malignant and benign gastric biopsy specimens by mRNA expression profile and multivariate statistical methods. Cytometry B Clin Cytom. 2007 Sep;72(5):299-309.
101
108. Burczynski ME, Twine NC, Dukart G, Marshall B, Hidalgo M, Stadler WM, Logan T, Dutcher J, Hudes G, Trepicchio WL, Strahs A, Immermann F, Slonim DK, Dorner AJ. Transcriptional profiles in peripheral blood mononuclear cells prognostic of clinical outcomes in patients with advanced renal cell carcinoma. Clin Cancer Res. 2005 Feb 1;11(3):1181-9. 109. Twine NC, Stover JA, Marshall B, Dukart G, Hidalgo M, Stadler W, Logan T, Dutcher J, Hudes G, Dorner AJ, Slonim DK, Trepicchio WL, Burczynski ME. Diseaseassociated expression profiles in peripheral blood mononuclear cells from patients with advanced renal cell carcinoma. Cancer Res. 2003 Sep 15;63(18):6069-75. 110. Martin KJ, Graner E, Li Y, Price LM, Kritzman BM, Fournier MV, Rhei E, Pardee AB.High-sensitivity array analysis of gene expression for the early detection of disseminated breast tumor cells in peripheral blood. Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Feb 27;98(5):2646-51. 111. Smirnov DA, Zweitzig DR, Foulk BW, Miller MC, Doyle GV, Pienta KJ, Meropol NJ, Weiner LM, Cohen SJ, Moreno JG, Connelly MC, Terstappen LW, O'Hara SM. Global gene expression profiling of circulating tumor cells. Cancer Res. 2005 Jun 15;65(12):4993-7. 112. Tóth K, Galamb O, Hevér-Pálfy T, Solymosi N, Miheller P, Müllner K, Spisák S, Sipos F, Molnár B, Tulassay Z. Vastagbél betegségben szenvedık perifériás vérének mRNS expressziós vizsgálata. Magyar Belorvosi Archivum, 2007 (nyomtatásban). 113. Sun XR, Wang J, Garner D, Palcic B. Detection of cervical cancer and high grade neoplastic lesions by a combination of liquid-based sampling preparation and DNA measurements using automated image cytometry. Cell Oncol. 2005; 27: 33-41. 114. Molnár B, Szentirmay Z, Bodó M, Sugár J, Fehér J. Application of multivariate, fuzzy set and neural network analysis in quantitative cytological examinations. Anal Cell Pathol. 1993; 5: 161-175. 115. Tumor Analysis Best Practices Working Group. Expression profiling-best practices for data generation and interpretation in clinical trials. Nat Rev Genet. 2004; 5: 229-37. 116. Irizarry RA, Gautier L, Cope LM. The Analysis of Gene Expression Data: Methods and Software, chapter 4. Springer Verlag, 2003.
102
117. Tibshirani R, Hastie T, Narasimhan B, Chu G. Diagnosis of multiple cancer types by shrunken centroids of gene expression. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99: 6567-72. 118. Sturn A, Quackenbush J, Trajanoski Z. Genesis: cluster analysis of microarray data. Bioinformatics. 2002;18:207-8. 119. Kendall, M.G. Rank Correlation Methods. 4th Ed. Griffin. 1976 120. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-90005107-0, URL http://www.R-project.org, 2006 121. Meyer D, Zeileis A, Hornik K. The strucplot framework: Visualizing multi-way contingency tables with ’vcd’. J Stac Software. 2006;17:1-48. 122. Rogojina AT, Orr WE, Song BK, Geisert EE Jr. Comparing the use of Affymetrix to spotted oligonucleotide microarrays using two retinal pigment epithelium cell lines. Mol Vis. 2003 Oct 6;9:482-96. 123. Kuo WP, Jenssen TK, Butte AJ, Ohno-Machado L, Kohane IS. Analysis of matched mRNA measurements from two different microarray technologies. Bioinformatics. 2002 Mar;18(3):405-12. 124. Tan PK, Downey TJ, Spitznagel EL Jr, Xu P, Fu D, Dimitrov DS, Lempicki RA, Raaka BM, Cam MC. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 2003 Oct 1;31(19):5676-84. 125. Li J, Pankratz M, Johnson JA. Differential gene expression patterns revealed by oligonucleotide versus long cDNA arrays. Toxicol Sci. 2002 Oct;69(2):383-90. 126. Modlich O, Prisack HB, Pitschke G, Ramp U, Ackermann R, Bojar H, Vogeli TA, Grimm MO. Identifying superficial, muscle-invasive, and metastasizing transitional cell carcinoma of the bladder: use of cDNA array analysis of gene expression profiles. Clin Cancer Res. 2004 May 15;10(10):3410-21. 127. Kane MD, Jatkoe TA, Stumpf CR, Lu J, Thomas JD, Madore SJ. Assessment of the sensitivity and specificity of oligonucleotide (50mer) microarrays. Nucleic Acids Res. 2000 Nov 15;28(22):4552-7. 128. Ladányi A, Sipos F, Szıke D, Galamb O, Molnár B, Tulassay Z. Laser microdissection in translational and clinical research. Cytometry A. 2006 Sep 1;69(9):947-60.
103
129. Sipos F, Szıke D, Galamb O, Molnár B, Tulassay Z. A lézer-mikrodisszekció jelentısége és gyakorlati alkalmazása a klinikai kutatásban és a diagnosztikai módszerfejlesztésben. Orv Hetil. 2004 Jun 27;145(26):1355-61. 130. Radinsky R, Risin S, Fan D, Dong Z, Bielenberg D, Bucana CD, Fidler IJ. Level and function of epidermal growth factor receptor predict the metastatic potential of human colon carcinoma cells. Clin Cancer Res. 1995 Jan;1(1):19-31. 131. Banks C, Bateman A, Payne R, Johnson P, Sheron N. Chemokine expression in IBD. Mucosal chemokine expression is unselectively increased in both ulcerative colitis and Crohn's disease. J Pathol. 2003;199:28-35. 132. Vaalamo M, Karjalainen-Lindsberg ML, Puolakkainen P, Kere J, Saarialho-Kere U. Distinct expression profiles of stromelysin-2 (MMP-10), collagenase-3 (MMP-13), macrophage metalloelastase (MMP-12), and tissue inhibitor of metalloproteinases-3 (TIMP-3) in intestinal ulcerations. Am J Pathol. 1998;152:1005-14. 133. Carlsen HS, Baekkevold ES, Morton HC, Haraldsen G, Brandtzaeg P. Monocytelike and mature macrophages produce CXCL13 (B cell-attracting chemokine 1) in inflammatory lesions with lymphoid neogenesis. Blood. 2004;104:3021-7. 134. El-Tanani MK, Campbell FC, Kurisetty V, Jin D, McCann M, Rudland PS. The regulation and role of osteopontin in malignant transformation and cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 2006 Dec;17(6):463-74. 135. Denhardt DT, Mistretta D, Chambers AF, Krishna S, Porter JF, Raghuram S, Rittling SR. Transcriptional regulation of osteopontin and the metastatic phenotype: evidence for a Ras-activated enhancer in the human OPN promoter. Clin Exp Metastasis. 2003;20(1):77-84. 136. Wai PY, Kuo PC. The role of osteopontin in tumor metastasis. J Surg Res. 2004 Oct;121(2):228-41. 137. Morimoto I, Sasaki Y, Ishida S, Imai K, Tokino T. Identification of the osteopontin gene as a direct target of TP53. Genes Chromosomes Cancer. 2002 Mar;33(3):270-8. 138. Sodek J, Zhu B, Huynh MH, Brown TJ, Ringuette M. Novel functions of the matricellular proteins osteopontin and osteonectin/SPARC. Connect Tissue Res. 2002;43:308-19.
104
139. Oates AJ, Barraclough R, Rudland PS. The role of osteopontin in tumorigenesis and metastasis. Invasion Metastasis. 1997;17:1-15. 140. Patarca R, Saavedra RA, Cantor H. Molecular and cellular basis of genetic resistance to bacterial infection: the role of the early T-lymphocyte activation1/osteopontin gene. Crit Rev Immunol. 1993;13:225-46. 141. Furger KA, Menon RK, Tuck AB, Bramwell VH, Chambers AF. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. Curr Mol Med. 2001 Nov;1(5):621-32. 142. Massi D, Franchi A, Borgognoni L, Reali UM, Santucci M. Osteonectin expression correlates with clinical outcome in thin cutaneous malignant melanomas. Hum Pathol. 1999;30:339-44. 143. Porte H, Chastre E, Prevot S, Nordlinger B, Empereur S, Basset P, Chambon P, Gespach C. Neoplastic progression of human colorectal cancer is associated with overexpression of the stromelysin-3 and BM-40/SPARC genes. Int J Cancer. 1995;64:70-5. 144. Porte H, Triboulet JP, Kotelevets L, Carrat F, Prevot S, Nordlinger B, DiGioia Y, Wurtz A, Comoglio P, Gespach C, Chastre E. Overexpression of stromelysin-3, BM40/SPARC, and MET genes in human esophageal carcinoma: implications for prognosis. Clin Cancer Res. 1998;4:1375-82. 145. Thomas R, True LD, Bassuk JA, Lange PH, Vessella RL. Differential expression of osteonectin/SPARC during human prostate cancer progression. Clin Cancer Res. 2000;6:1140-9. 146. Le Bail B, Faouzi S, Boussarie L, Guirouilh J, Blanc JF, Carles J, Bioulac-Sage P, Balabaud C, Rosenbaum J. Osteonectin/SPARC is overexpressed in human hepatocellular carcinoma. J Pathol. 1999;189:46-52. 147. Wang CS, Lin KH, Chen SL, Chan YF, Hsueh S. Overexpression of SPARC gene in human gastric carcinoma and its clinic-pathologic significance. Br J Cancer. 2004;91:1924-30. 148. Wen Y, Giardina SF, Hamming D, Greenman J, Zachariah E, Bacolod MD, Liu H, Shia J, Amenta PS, Barany F, Paty P, Gerald W, Notterman D. GROalpha is highly expressed in adenocarcinoma of the colon and down-regulates fibulin-1. Clin Cancer Res. 2006;12:5951-9.
105
149. Itoh Y, Joh T, Tanida S, Sasaki M, Kataoka H, Itoh K, Oshima T, Ogasawara N, Togawa S, Wada T, Kubota H, Mori Y, Ohara H, Nomura T, Higashiyama S, Itoh M. IL-8 promotes cell proliferation and migration through metalloproteinase-cleavage proHB-EGF in human colon carcinoma cells. Cytokine. 2005;29:275-82. 150. Berghella AM, Contasta I, Pellegrini P, Del Beato T, Adorno D. Peripheral blood immunological parameters for use as markers of pre-invasive to invasive colorectal cancer. Cancer Biother Radiopharm. 2002;17:43-50. 151. Kamochi J, Tokunaga T, Tomii Y, Abe Y, Hatanaka H, Kijima H, Yamazaki H, Watanabe N, Matsuzaki S, Ueyama Y, Nakamura M. Overexpression of the thrombospondin 2 (TSP2) gene modulated by the matrix metalloproteinase family expression and production in human colon carcinoma cell line. Oncol Rep. 2003;10:881-4. 152. Damin DC, Rosito MA, Gus P, Roisemberg I, Bandinelli E, Schwartsmann G. Von Willebrand factor in colorectal cancer. Int J Colorectal Dis. 2002;17:42-5. 153. Guba M, Seeliger H, Kleespies A, Jauch KW, Bruns C. Vascular endothelial growth factor in colorectal cancer. Int J Colorectal Dis. 2004;19:510-7. 154. Holten-Andersen MN, Christensen IJ, Nielsen HJ, Stephens RW, Jensen V, Nielsen OH, Sorensen S, Overgaard J, Lilja H, Harris A, Murphy G, Brunner N. Total levels of tissue inhibitor of metalloproteinases 1 in plasma yield high diagnostic sensitivity and specificity in patients with colon cancer. Clin Cancer Res. 2002;8:15664. 155. Wu GJ, Wu MW, Wang SW, Liu Z, Qu P, Peng Q, Yang H, Varma VA, Sun QC, Petros JA, Lim SD, Amin MB. Isolation and characterization of the major form of human MUC18 cDNA gene and correlation of MUC18 over-expression in prostate cancer cell lines and tissues with malignant progression. Gene. 2001;279:17-31. 156. Luca M, Hunt B, Bucana CD, Johnson JP, Fidler IJ, Bar-Eli M. Direct correlation between MUC18 expression and metastatic potential of human melanoma cells. Melanoma Res. 1993;3:35-41. 157. Aldovini D, Demichelis F, Doglioni C, Di Vizio D, Galligioni E, Brugnara S, Zeni B, Griso C, Pegoraro C, Zannoni M, Gariboldi M, Balladore E, Mezzanzanica D, Canevari S, Barbareschi M. M-CAM expression as marker of poor prognosis in epithelial ovarian cancer. Int J Cancer. 2006;119:1920-6.
106
158. Hough CD, Cho KR, Zonderman AB, Schwartz DR, Morin PJ. Coordinately upregulated genes in ovarian cancer. Cancer Res. 2001;61:3869-76. 159. Levedakou EN, Strohmeyer TG, Effert PJ, Liu ET. Expression of the matrix Gla protein in urogenital malignancies. Int J Cancer. 1992;52:534-7. 160. Sawyer N, Cauchon E, Chateauneuf A, Cruz RP, Nicholson DW, Metters KM, O'Neill GP, Gervais FG. Molecular pharmacology of the human prostaglandin D2 receptor, CRTH2. Br J Pharmacol. 2002;137:1163-72. 161. Hawcroft G, Gardner SH, Hull MA. Expression of prostaglandin D2 receptors DP1 and DP2 by human colorectal cancer cells. Cancer Lett. 2004;210:81-4. 162. Sheikh MS, Huang Y, Fernandez-Salas EA, El-Deiry WS, Friess H, Amundson S, Yin J, Meltzer SJ, Holbrook NJ, Fornace AJ Jr. The antiapoptotic decoy receptor TRID/TRAIL-R3 is a p53-regulated DNA damage-inducible gene that is overexpressed in primary tumors of the gastrointestinal tract. Oncogene. 1999 Jul 15;18(28):4153-9. 163. Craven RJ, Xu LH, Weiner TM, Fridell YW, Dent GA, Srivastava S, Varnum B, Liu ET, Cance WG. Receptor tyrosine kinases expressed in metastatic colon cancer. Int J Cancer. 1995 Mar 16;60(6):791-7. 164. Souttou B, Juhl H, Hackenbruck J, Röckseisen M, Klomp HJ, Raulais D, Vigny M, Wellstein A. Relationship between serum concentrations of the growth factor pleiotrophin and pleiotrophin-positive tumors. J Natl Cancer Inst. 1998 Oct 7;90(19):1468-73. 165. Roeb E, Arndt M, Jansen B, Schumpelick V, Matern S. Simultaneous determination of matrix metalloproteinase (MMP)-7, MMP-1, -3, and -13 gene expression by multiplex PCR in colorectal carcinomas. Int J Colorectal Dis. 2004 Nov;19(6):518-24. 166. Fujii T, Obara T, Tanno S, Ura H, Kohgo Y. Urokinase-type plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor-1 as a prognostic factor in human colorectal carcinomas. Hepatogastroenterology. 1999 Jul-Aug;46(28):2299-308. 167. Cen H, Zheng S, Fang YM, Tang XP, Dong Q. Induction of HSF1 expression is associated with sporadic colorectal cancer. World J Gastroenterol. 2004 Nov 1;10(21):3122-6. 168. Grade M, Hörmann P, Becker S, Hummon AB, Wangsa D, Varma S, Simon R, Liersch T, Becker H, Difilippantonio MJ, Ghadimi BM, Ried T. Gene expression
107
profiling reveals a massive, aneuploidy-dependent transcriptional deregulation and distinct differences between lymph node-negative and lymph node-positive colon carcinomas. Cancer Res. 2007 Jan 1;67(1):41-56. 169. Bian YH, Huang SH, Yang L, Ma XL, Xie JW, Zhang HW. Sonic hedgehog-Gli1 pathway in colorectal adenocarcinomas. World J Gastroenterol. 2007 Mar 21;13(11):1659-65. 170. Cosenza L, Gorgun G, Urbano A, Foss F. Interleukin-7 receptor expression and activation in nonhaematopoietic neoplastic cell lines. Cell Signal. 2002 Apr;14(4):31725. 171. Hiraoka A, Yano Ki K, Kagami N, Takeshige K, Mio H, Anazawa H, Sugimoto S. Stem cell growth factor: in situ hybridization analysis on the gene expression, molecular characterization and in vitro proliferative activity of a recombinant preparation on primitive hematopoietic progenitor cells. Hematol J. 2001;2(5):307-15. 172. Ansari N, Abdulla J, Zayyani N, Brahmi U, Taha S, Satir AA. Comparison of RANTES expression in Crohn's disease and ulcerative colitis: an aid in the differential diagnosis? J Clin Pathol. 2006 Oct;59(10):1066-72. 173. Ochel HJ, Gademann G. Heat-shock protein 90: potential involvement in the pathogenesis of malignancy and pharmacological intervention. Onkologie. 2002 Oct;25(5):466-73. 174. Roth J, Vogl T, Sorg C, Sunderkötter C. Phagocyte-specific S100 proteins: a novel group of proinflammatory molecules. Trends Immunol. 2003 Apr;24(4):155-8. 175. Ruiz de Almodovar C, Ruiz-Ruiz C, Rodriguez A, Ortiz-Ferron G, Redondo JM, Lopez-Rivas A. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) decoy receptor TRAIL-R3 is up-regulated by p53 in breast tumor cells through a mechanism involving an intronic p53-binding site. J Biol Chem. 2004 Feb 6;279(6):4093-101. 176. Suzuki N, Zara J, Sato T, Ong E, Bakhiet N, Oshima RG, Watson KL, Fukuda MN. A cytoplasmic protein, bystin, interacts with trophinin, tastin, and cytokeratin and may be involved in trophinin-mediated cell adhesion between trophoblast and endometrial epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U SA. 1998 Apr 28;95(9):5027-32. 177. Fischer H, Stenling R, Rubio C, Lindblom A. Differential expression of aquaporin 8 in human colonic epithelial cells and colorectal tumors. BMC Physiol. 2001;1:1.
108
178. Zanetta L, Marcus SG, Vasile J, Dobryansky M, Cohen H, Eng K, Shamamian P, Mignatti P. Expression of von Willebrand factor, an endothelial cell marker, is upregulated by angiogenesis factors: a potential method for objective assessment of tumor angiogenesis. Int J Cancer. 2000 Jan 15;85(2):281-8. 179. Patlolla JM, Swamy MV, Raju J, Rao CV. Overexpression of caveolin-1 in experimental colon adenocarcinomas and human colon cancer cell lines. Oncol Rep. 2004 May;11(5):957-63. 180. Wielenga VJ, Heider KH, Offerhaus GJ, Adolf GR, van den Berg FM, Ponta H, Herrlich P, Pals ST. Expression of CD44 variant proteins in human colorectal cancer is related to tumor progression. Cancer Res. 1993 Oct 15;53(20):4754-6. 181. Trovato M, Vitarelli E, Grosso M, Alesci S, Benvenga S, Trimarchi F, Barresi G. Immunohistochemical expression of HGF, c-MET and transcription factor STAT3 in colorectal tumors. Eur J Histochem. 2004 Jul-Sep;48(3):291-7. 182. Shibuta K, Begum NA, Mori M, Shimoda K, Akiyoshi T, Barnard GF. Reduced expression of the CXC chemokine hIRH/SDF-1alpha mRNA in hepatoma and digestive tract cancer. Int J Cancer. 1997 Nov 27;73(5):656-62. 183. Naishiro Y, Yamada T, Idogawa M, Honda K, Takada M, Kondo T, Imai K, Hirohashi S. Morphological and transcriptional responses of untransformed intestinal epithelial cells to an oncogenic beta-catenin protein. Oncogene. 2005 Apr 28;24(19):3141-53. 184. Cohen MB, Hawkins JA, Witte DP. Guanylin mRNA expression in human intestine and colorectal adenocarcinoma. Lab Invest. 1998 Jan;78(1):101-8. 185. Dwinell MB, Ogawa H, Barrett KE, Kagnoff MF. SDF-1/CXCL12 regulates cAMP production and ion transport in intestinal epithelial cells via CXCR4. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2004 May;286(5):G844-50. 186. Hisamatsu T, Watanabe M, Ogata H, Ezaki T, Hozawa S, Ishii H, Kanai T, Hibi T. Interferon-inducible gene family 1-8U expression in colitis-associated colon cancer and severely inflamed mucosa in ulcerative colitis. Cancer Res. 1999 Dec 1;59(23):5927-31. 187. Dooley TP, Curto EV, Reddy SP, Davis RL, Lambert GW, Wilborn TW, Elson CO. Regulation of gene expression in inflammatory bowel disease and correlation with IBD drugs: screening by DNA microarrays. Inflamm Bowel Dis. 2004 Jan;10(1):1-14.
109
188. Fujita M, Furukawa Y, Tsunoda T, Tanaka T, Ogawa M, Nakamura Y. Upregulation of the ectodermal-neural cortex 1 (ENC1) gene, a downstream target of the beta-catenin/T-cell factor complex, in colorectal carcinomas. Cancer Res. 2001 Nov 1;61(21):7722-6. 189. Ito Y, Miyauchi A, Yoshida H, Uruno T, Nakano K, Takamura Y, Miya A, Kobayashi K, Yokozawa T, Matsuzuka F, Taniguchi N, Matsuura N, Kuma K, Miyoshi E. Expression of alpha1,6-fucosyltransferase (FUT8) in papillary carcinoma of the thyroid: its linkage to biological aggressiveness and anaplastic transformation. Cancer Lett. 2003 Oct 28;200(2):167-72. 190. Nakamura K, Funakoshi H, Miyamoto K, Tokunaga F, Nakamura T. Molecular cloning and functional characterization of a human scavenger receptor with C-type lectin (SRCL), a novel member of a scavenger receptor family. Biochem Biophys Res Commun. 2001 Feb 2;280(4):1028-35. 191. Wolf AM, Wolf D, Rumpold H, Moschen AR, Kaser A, Obrist P, Fuchs D, Brandacher G, Winkler C, Geboes K, Rutgeerts P, Tilg H. Overexpression of indoleamine 2,3-dioxygenase in human inflammatory bowel disease. Clin Immunol. 2004 Oct;113(1):47-55.
110
11. 0 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK Az értekezés témájával összefüggı közlemények jegyzéke: Galamb O, Gyırffy B, Sipos F, Spisák S, Németh AM, Miheller P, Tulassay Z, Dinya E, Molnár B. Inflammation, adenoma and cancer: objective classification of colon biopsy specimens with gene expression signature. Dis Markers. 2007 (nyomtatásban) IF: 2.438 Galamb O, Gyırffy B, Sipos F, Dinya E, Krenács T, Berczi L, Szıke D, Spisák S, Solymosi N, Németh AM, Juhász M, Molnár B, Tulassay Z. Helicobacter pylori and antrum erosion specific gene expression patterns: the discriminative role of CXCL13 and VCAM1 transcripts. Helicobacter. 2007 (nyomtatásban). IF: 2,477 Galamb O, Gyırffy B, Sipos F, Spisák S, Németh AM, Miheller P, Dinya E, Molnár B, Tulassay Z. Vastagbél-adenoma, vastagbélrák és IBD-specifikus génexpressziós mintázatok meghatározása teljes genomszintő oligonukleotid microarray-rendszerrel. Orv Hetil. 2007 Nov 4;148(44):2067-79. Galamb O, Sipos F, Molnár B, Szıke D, Spisák S, Tulassay Z. Evaluation of malignant and benign gastric biopsy specimens by mRNA expression profile and multivariate statistical methods. Cytometry B Clin Cytom. 2007 Sep;72(5):299-309. IF: 2,065 Galamb O, Sipos F, Dinya E, Spisák S, Tulassay Z, Molnár B. mRNA expression, functional profiling and multivariate classification of colon biopsy specimen by cDNA overall glass microarray. World J Gastroenterol. 2006 Nov 21;12(43):6998-7006. Galamb O, Sipos F, Fischer K, Tulassay Z, Molnár B. The results of the expression array studies correlate and enhance the known genetic basis of gastric and colorectal cancer. Cytometry B Clin Cytom. 2005 Nov;68(1):1-17. IF: 1,742
111
Galamb O, Molnár B, Tulassay Z. DNS chipek génexpressziós mintázatok vizsgálatára és alkalmazásuk a diagnosztikában. Orv Hetil. 2003;144(1):21-7. Sipos F, Galamb O, Herszényi L, Molnar B, Solymosi N, Zagoni T, Berczi L, Tulassay Z. Elevated insulin-like growth factor 1 receptor, hepatocyte growth factor receptor and telomerase protein expression in mildly active ulcerative colitis. Scand J Gastroenterol. 2007 Oct 23;:1-10. (nyomtatásban) IF: 1,869 Tóth K, Galamb O, Hevér-Pálfy T, Solymosi N, Miheller P, Müllner K, Spisák S, Sipos F, Molnár B, Tulassay Z. Vastagbél betegségben szenvedık perifériás vérének mRNS expressziós vizsgálata. Magyar Belorvosi Archivum. 2007 (nyomtatásban). Spisák S, Molnár B, Galamb O, Sipos F, Tulassay Z. Fehérje chipek elméleti alapjai és alkalmazási lehetıségük az orvosi diagnosztikában és kutatásban. Orv Hetil. 2007; 148(32):1511-1520. Hagymási K, Molnár B, Sipos F, Galamb O, Tulassay Z. A colorectalis rák kialakulásának ôssejtelmélete és összefüggése a molekuláris biológiai adatokkal. Orv Hetil. 2007;148(17):779-85. Model F, Osborn N, Ahlquist D, Gruetzmann R, Molnár B, Sipos F, Galamb O, Pilarsky C, Saeger HD, Tulassay Z, Hale K, Mooney S, Lograsso J, Adorjan P, Lesche R, Dessauer A, Kleiber J, Porstmann B, Sledziewski A, Lofton-Day C. Identification and validation of colorectal neoplasia-specific methylation markers for accurate classification of disease. Mol Cancer Res. 2007 Feb;5(2):153-63. IF: 4,759 Nagy GR, Gyırffy B, Galamb O, Molnár B, Nagy B, Papp Z. Use of routinely collected amniotic fluid for whole-genome expression analysis of polygenic disorders. Clin Chem. 2006 Nov;52(11):2013-20. IF: 5,454 Ladányi A, Sipos F, Szıke D, Galamb O, Molnár B, Tulassay Z. Laser microdissection in translational and clinical research. Cytometry A. 2006 Sep 1;69(9):947-60. IF: 3,293
112
Miheller P, Müzes G, Galamb O, Molnár B, Tulassay Z. A gyulladásos bélbetegségek molekuláris háttere. Orv Hetil. 2006 Jul 30;147(30):1395-403. Sipos F, Szıke D, Galamb O, Molnár B, Tulassay Z. A lézer-mikrodisszekció jelentısége és gyakorlati alkalmazása a klinikai kutatásban és a diagnosztikai módszerfejlesztésben. Orv Hetil. 2004 Jun 27;145(26):1355-61. Sipos F, Galamb O, Molnár B, Tulassay Z.
Chiptechnikák
alkalmazása
vastagbélrákban. Orv Hetil, 2004; 145(19):993-9. Molnár B, Sipos F, Galamb O, Tulassay Z. Molecular detection of circulating cancer cells. Dig Dis. 2003;21:320-25. IF: 1,151 Egyéb közlemények: Galamb O, Sipos F, Molnár B, Tulassay Z. Chip technikák alkalmazásának szükségessége gyomor tumorokban. Orv Hetil. 2004; 145(18): 939-47. Galamb O, Molnár B, Sipos F, Tulassay Z. A humán szöveti (felnıtt) ıssejtek kutatása és klinikai alkalmazási lehetıségei. Orv Hetil. 2003;144(46):2263-70. Galamb O, Molnár B, Tulassay Z. A dendritikus sejtek immunbiológiája és felhasználásuk a klinikai gyakorlatban. Orv Hetil. 2003;144(38):1873-79. Fischer K, Galamb O, Molnár B, Tulassay Z, Szabó A. Az Idiopathias Nephrosis Syndroma kialakulásának, progressziójának RNS markerei. Orv Hetil. 2007 Jun 10;148(23):1067-75.
113
12.0. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetet szeretnék mondani mindazoknak, akik segítették PhD munkám elkészítését: - programvezetımnek, Prof. Dr. Tulassay Zsolt egyetemi tanárnak, és témavezetımnek, Dr. Molnár Béla tudományos fımunkatársnak, hogy lehetıvé tették és támogatták PhD munkám elkészítését a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinikáján; - Dr. Molnár Jeanette és Dr. Müllner Katalin házi opponenseimnek PhD dolgozatom alapos áttekintéséért; - Dr. Krenács Tibornak szakmai és a szöveti microarray vizsgálatokban nyújtott elengedhetetlen segítségéért; - Dr. Berczi Lajos egyetemi adjunktusnak a személyes konzultációk során nyújtott értékes és hasznos tanácsaiért; - Dr. Solymosi Norbertnek, Dr. Gyırffy Balázsnak és Dr. Dinya Eleknek a bioinformatikai elemzések professzionális kivitelezéséért; - Csorba Gézáné Marica és Kónyáné Farkas Gabriella szakasszisztenseknek a gyakorlati munkámban nyújtott segítségükért; - a Sejtanalitika Laboratórium összes dolgozójának támogatásukért; - Dr. Sipos Ferencnek szakmai támogatásáért és barátságáért. Végül, de nem utolsósorban köszönöm Férjemnek és Családomnak, hogy mindenben mellettem álltak és állnak.
114
