UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta Studijní program: Chemie Studijní obor: Chemie životního prostředí prost
Vliv porozity filtrace vzorku na hodnocení hodnocení ekotoxicity vodného výluhu odpadů
Bakalářská práce Eva Picková
Vedoucí bakalářské bakalá práce: Doc., Ing. Vladimír Kočí, čí, Ph.D. Konzultant: Ing. Jaroslav Tošner Praha 2012
Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. Jsem si vědoma toho, že případné využití výsledků, získaných v této práci, mimo Univerzitu Karlovu v Praze je možné pouze po písemném souhlasu této univerzity.
V Praze dne 29. srpna 2012
………………………….
2
Poděkování: Ráda bych poděkovala svému konzultantovi Ing. Jaroslavovi Tošnerovi za velkou trpělivost, čas a vstřícné vedení při vytváření této práce. Také bych chtěla poděkovat svému školiteli Doc., Ing. Vladimíru Kočímu, Ph.D., za možnost uskutečnit bakalářskou práci. Dále bych ráda poděkovala spolužákům, spolubydlícím a zejména své rodině za podporu během studia.
3
Souhrn Filtrace je separační proces mající vliv na složení filtrátu. Dle metodik Evropské unie se při separaci suspendovaných pevných částic od kapalné fáze výluhu odpadu využívají především membránové filtry o průměru pórů 0,45 µm, zatímco v ČR je používán filtr o průměru pórů 5 µm. Během práce byl vodný výluh odpadu filtrován přes membránové filtry různých porozit . Pro srovnání byl vytvořen vzorek který byl separován centrifugací. Cílem bylo zjistit a zhodnotit vliv separačního procesu na výslednou toxicitu permeátu získaného různým postupem z pohledu řasového biotestu. Pro práci byly využity sladkovodní řasy Desmodesmus subspicatus. Bylo zjištěno, že vliv velikosti pórů membránových filtrů nemá významný vliv na výsledky hodnocení toxicity vzorku. Separace vodného výluhu odpadu pomocí centrifugace se ukázala jako nevhodná.
Abstract Filtration is a process of separation that affects the filtrate composition. According to the methods of European Union, within the separation of the suspended solid particles from the liquid phase of the waste extract mostly the membrane filters with 0,45 µm pore diameter, however in the Czech Republic the size of the filter is 5 µm. Aquatic waste extract was filtered through membrane filters of various porosities during the thesis. Another sample was created through the process of centrifuge separation for the purposes of comparison. The aim was to determine and valorize the effect of the filtration process of separation on the result of permeate toxicity gained through the various procedures from the perspective of algal bio-test. The thesis used freshwater algae Desmodesmus subspicatus. The outcome is that the pore size of the membrane filters does not have any influence on the score results of the final toxicity of the sample. Separation of the aquatic waste extract by centrifugation proved to be inappropriate.
4
Klíčová slova: ekotoxicita, porozita filtrace, pevné odpady, akvatická ekotoxicita Keywords: ecotoxicity, filter porosity, solid wastes, aquatic ecotoxicity
5
Seznam symbolů a zkratek: ................................................................ 8 1. Úvod ................................................................................................ 9 2. Teoretická část ............................................................................... 11 2.1. Akvatické testy ekotoxicity výluhu .............................................. 11 2.2. Řasové testy .............................................................................. 12 2.2.1. Faktory ovlivňující průběh testu ........................................... 15 2.2.2. Validace .............................................................................. 15 2.3. Separace kapalné fáze výluhu ................................................... 15 2.3.1 Filtrace ................................................................................. 16 2.3.2. Centrifugace ........................................................................ 17 2.4. Řasový kmen ............................................................................. 18 3. Experimentální část ....................................................................... 19 3.1. Materiál a použité přístroje......................................................... 19 3.1.1. Vzorek a jeho předúprava ................................................... 21 3.1.2. Živné médium ...................................................................... 23 3.2. Metodika .................................................................................... 25 3.2.1. Stanovení sušiny ................................................................. 25 3.2.2. Příprava vodného výluhu..................................................... 25 3.2.3. Řasový biotest ..................................................................... 26 3.3. Hodnocení ................................................................................ 27 3.3.1.Stanovení v počítací komůrce Cyrus II ................................. 27 3.3.2.Spektrofotometrické stanovení ............................................. 28 4. Výsledky .......................................................................................... 31 4.1.Stanovení pro vzorky uzavřené parafilmem ................................ 31 4.2.Stanovení pro vzorky uzavřené buničinou .................................. 33 4.3.Spektrofotometrické stanovení ................................................... 36 5. Diskuze ......................................................................................... 39
6
6. Závěr ............................................................................................. 41 Informační zdroje: .............................................................................. 42 Přílohy ................................................................................................. 46
7
Seznam symbolů a zkratek: EN
Evropská norma
ČSN
Česká technická norma
ISO
Mezinárodní norma (Mezinárodní organizace pro normalizaci)
OECD
Organisation for Economic Co-operation and Development
A
absorbance
c
koncentrace
λ
vlnová délka
Ai
plocha pod růstovou křivkou pro danou koncentraci
c0
počáteční koncentrace buněk [ks/ml]
c1
změřená koncentrace buněk v čase t1 [ks/ml]
cn
změřená koncentrace buněk v čase tn [ks/ml]
tn
doba n-tého měření od počátku testu [hod]
LC50
letální koncentrace 50 %
EC50
efektivní koncentrace 50 %
IC50
inhibiční koncentrace 50 %
NOEC
nejvyšší pozorovatelná účinná koncentrace
LOEC
nejnižší pozorovatelná účinná koncentrace
pF
rozdíl tlaku
MF
microfiltrace
UF
ultrafiltrace
NF
nanofiltrace
PE
polyetylen
PS
polystyren
Vz0,45
vzorek, část výluhu filtrován přes membránu porozity 0,45 µm
Vz1,2
vzorek, část výluhu filtrován přes membránu porozity 1,2 µm
Vz5
vzorek, část výluhu filtrován přes membránu porozity 5 µm
Vzc
vzorek, část výluhu získaný centrifugací
8
1. Úvod Nakládání s odpady zaujímá v rámci environmentálních problémů přední místo. Má velký význam pro uchovávání kvality životního prostředí Země, zejména pak pro dosažení environmentálně šetrnějšího a udržitelného rozvoje. [1] Uvolnění rozpustných složek z odpadu při kontaktu s vodou je považováno za hlavní mechanismus vyluhování, což představuje možné nebezpečí pro životní prostředí, pokud se odpad dále ukládá či využívá.[2] Příkladem může být využití kalů pro zemědělství. Ekotoxicita odpadů se dle legislativy hodnotí vyluhováním pevného odpadu do vodného roztoku s následným filtrováním a stanovením ekotoxicity filtrátu. Cílem biotestů je určení ekotoxicity vyluhovaných složek jako nebezpečné vlastnosti H14, která představuje akutní či pozdní nebezpečí pro jednu či více složek životního prostředí. [3] Dle standarizované normy (ČSN EN 12457-4) [2] se u vzorku pevného odpadu nejprve upraví zrnitost a následně se vyluhuje ve vyluhovací kapalině. Pevný zbytek je odstraněn filtrací. Současným trendem je postupné nahrazování papírových filtrů filtry membránovými. Vzhledem k tomu, že se v jednotlivých normách liší předepisované porozity filtrů a také vzhledem k navrhovaným změnám hodnocení ekotoxicity odpadu v české legislativě [4], bylo úkolem práce zhodnotit vliv filtrace na toxicitu filtrátu získaného přes filtry s různou velikostí pórů. Během práce byl proveden vodný výluh vzorku pevného odpadu, který byl následně centrifugován, nebo filtrován na membránových filtrech porozity 0,45 µm, 1,2 µm a 5 µm. Získané jednotlivé permeáty a centrifugovaný vzorek byly testovány pomocí akvatických testů toxicity na řasovém kmenu Desmodesmus subspicatus. Byly vytvořeny koncentrační řady s blankem a kontrolou ve třech replikacích. První sada testů probíhala v Erlenmayerových baňkách uzavřených parafinem, druhá sada byla uzavřená buničinou a třetí
9
probíhala na mikrodestičkách. Jednotlivá hodnocení probíhala pravidelně po 24 hodinách a to po dobu 96 hodin počítací komůrkou Cyrus II (pro testy v Erlenmayerovýcb b.), paralelně byly spektrofotometricky proměřeny absorbance při vlnové délce λ = 681 nm (pro test na mikrodestičce). Dle naměřených hodnot byly sestrojeny růstové křivky a byla zhodnocena inhibice. Následně byly porovnány výsledky pro jednotlivé metody separace.
10
2. Teoretická část 2.1. Akvatické testy ekotoxicity výluhu V roce 1969 René Truhaut definoval ekotoxikologii jako interdisciplinární obor toxikologie, který se zabývá studiem toxických účinků látek přirodního nebo antropogenního původu na složky ekosystému a jejich ekologického dopadu. [5] Využívá tedy monitorování cizorodých látek v životním prostředí k predikci účinků potenciálně toxických látek s cílem ochrany ekosystémů. [6] Na konci 20. století byla ekotoxikologie definována jako věda zahrnující biosféru a její vliv na celé ekosystémy nikoliv pouze na jejich jednotlivé složky. [7] První standardizovaná metoda pro určení míry znečištění byla založena na sledování přítomnosti či absenci druhů v daných vodních ekosystémech. Tyto informace slouží jako citlivější a spolehlivější ukazatel kvality prostředí než samotné fyzikální a chemické měření. [8] Míra reakce organismů na expozici toxických látek je závislá na velikosti dávky, proto lze pomocí zmíněného principu sestavit křivky popisující velikost dávky – odpověď organismu. Testování toxického účinku vodného výluhu různorodých matric na organismy vodních ekosystémů patří mezi nejrozšířenější ekotoxikologické metodiky. Vzorek pevného odpadu je za definovaných podmínek vyluhován vodou. Pevný podíl je odstraňován filtrací. Vzhledem k charakteru testu jsou výsledné hodnoty ekotoxicity interpretovatelné pouze pro polutanty rozpustné ve vodě. [16] Principem je připravit koncentrační řadu testovaného výluhu. Do každé koncentrace je umístěn stejný počet organismů (testy se provádějí na zástupcích ryb, zooplanktonu, fytoplanktonu a vyšších rostlin). Po uplynutí doby expozice se odečte stav populace poukazující na odpověď organismu na účinky testované látky. [14] Česká legislativa předepisuje akvatické testy s využitím dafnií (Daphnia magna Atraus), ryb (Brachydanio rerio, Poecilia
11
reticulata ), řas (Pseudokirchneriella subcapitata, Desmodesmus subspicatus) a semen hořčice bílé (Sinapis alba). Pro stanovení ekotoxicity jsou rozhodující výsledky testu nejcitlivěji reagujícího organismu. [3]
Využití testů [28] •
Hodnocení akutního stavu vodních toků při haváriích.
•
Stanovení znečištění a toxického účinku podzemních, povrchových, odpadních a pitných vod.
•
Stanovení akutní toxicity chemických přípravků vzhledem k dopadu na životní prostředí.
•
Kategorizace a určení rizikovosti průmyslových odpadů.
•
Posouzení dlouhodobého vlivu chemických látek ve stopových koncentracích v pitných a povrchových vodách na reprodukční cyklus vodních organismů.
•
Obecné hodnocení ekotoxikologického dopadu zkoumaného vzorku.
2.2. Řasové testy Řasy jsou primárním článkem potravinového řetězce. Jedná se o producenty biomasy a z toho důvodu mají řasy nezastupitelný význam v hodnocení ekotoxicity. Díky rychlému množení řasových buněk lze test uspořádat s akutní, subchronickou i chronickou expozicí. Dále je třeba rozlišovat typ testovaného ekosystému (testy na řasách mořských, sladkovodních). [9,10] Během testů se sledují inhibiční i stimulační efekty, založené na nárůstu biomasy. Dále změna růstové rychlosti ve vztahu ke kontrolám rostoucích za stejných podmínek. [11,12] Kontrolní vzorky obsahují směs vody a živin inukolovanou řasami bez zkoušeného vzorku výluhu. Řasový kmen se kultivuje v definovaném živném médiu, jehož výběr má vliv na relevanci výsledků. Řasové kultury jsou velmi citlivé na vzdušnou kon-
12
taminaci, proto je vhodné pracovat sterilně. Populace se v médiu během 24 hodin znásobí. [13] Součástí biotestů je stanovení koncentrace buněk v zásobní kultuře. Následně je připravena koncentrační řada zkoumaného vzorku, přidán objem média a inokula řas. V kontrolní sadě se řasa kultivuje pouze v živném médiu. Zkouška je standardizována metodikou ČSN EN ISO 8692 a OECD 201 [14,15]. Testové sady se inkubují v termoluminostantu. Ve zvolených intervalech se měří nárust biomasy v jednotlivých testovaných koncentracích a kontrolách na jehož základě jsou sestrojeny růstové křivky. Vyhodnocení odpovědi testované sady lze stanovením růstové rychlosti testovaného organismu (vhodné pouze za fáze exponenciálního růstu, hodnoty ve fázi poklesu zatěžují výsledek chybou) nebo jeho konečné populační hustoty. Inhibici růstu lze vyhodnotit pomocí integrační metody, jež je založena na porovnání nárůstu biomasy v jednotlivých koncentracích vzhledem ke kontrolám. Plochy pod růstovými křivkami jednotlivých vzorků jsou porovnány se vzorky bez přidaného toxikantu. O stimulaci růstu se jedná v případě záporné hodnoty výsledku. Pro výpočet plochy pod růstovou křivkou je používán vztah č.1. [28]
Ai =
(c1 − c 0 ) ⋅ t1 2
+
(c1 + c 2 − 2c0 ) ⋅ (t 2 − t1 ) + … 2
(1)
Kde je: Ai
plocha pod růstovou křivkou pro danou koncentraci [ks·h·ml-1]
c0
počáteční koncentrace buněk [ks/ml]
c1
změřená koncentrace buněk v čase t1 [ks/ml]
cn
změřená koncentrace buněk v čase tn [ks/ml]
t1
doba prvního měření od počátku testu [h]
tn
doba n-tého měření od počátku testu [h]
13
Průběžná koncentrace řas se stanovuje pomocí mikroskopu v počítací komůrce, spektrofotometricky nebo fluorescenčním měřením. Cílem testů bývá stanovit míru účinku tj. hodnotu LC50, EC50 nebo IC50, případně hodnotu NOEC, LOEC. Při nízkých koncentracích může být v důsledku hormese sledována negativní inhibice (tj stimulace růstu). [16]
Normy a legislativa •
OECD 201: Alga, Growth Inhibition Test. Norma předepisující metodiku testu na řasách
•
ČSN EN ISO 8692 Jakost vod - Zkouška inhibice růstu sladkovodních zelených řas. Metodika je zaměřená na látky snadno rozpustné ve vodě.
•
ČSN ISO 14442 Jakost vod – Návod na provedení zkoušek inhibice růstu řas s málo rozpustnými materiály, těkavými sloučeninami, kovy a odpadní vodou
•
Zákon č. 356/2003 Sb., o chemických látkách a chemických přípravcích
a
o
změně
některých
zákonů
v platném
znění.
V hodnocení ekotoxicity se předepisuje membránový filtr o velikosti pórů 5 µm •
Zákon 185/2001 Sb., o odpadech a o změně některých dalších zákonů, v úplném znění, definující pomocí prováděcích právních předpisů použití testů ekotoxicity, kde je k teparaci výluhu používán filtr o porozitě 5 µm
•
ČSN EN 12457-4 Charakterizace odpadů- Vyluhování- Ověřovací zkouška
vychovatelnosti
zrnitých
odpadů
a
kalů.
Část
4:Jednostupňová vsádková zkouška při poměru kapalné a pevné fáze 10l/kg pro materiály se zrnitostí menší než 10 mm (bez zmenšení velikosti částic nebo s ním). Norma předepisuje membránové filtry s průměrem pórů 0,45 µm.
14
2.2.1. Faktory ovlivňující průběh testu Růst řas je limitován mnoha faktory (teplota, světlo, CO2, živiny). [17] V průběhu testu je potřeba dodržovat konstantní podmínky, které podporují exponenciální růst. Jakákoliv výchylka může pro organismy představovat nežádoucí stres a tím pádem vést k nestandardnímu chování. Teplota je normována dle ČSN EN ISO 8692 na 23 ± 2 °C. Světelná intenzita je podmíněna použitým druhem řas. Se světelnou intenzitou se růstová rychlost zvyšuje dle saturační křivky. Vzorek je třeba během celého testu míchat, čímž je redukován vliv absorbování světla samotnou kulturou. Optimální pH živného média pro zajištění dostatku CO2 je 8,1 ± 0,2,. Pro testování se využívají různá kultivační média, která obsahují micro /makronutrienty v takových koncentracích, které převyšují přirozené zastoupení v přírodních vodách.[18] Řasové inokulum, vnášené do testovacích nádob, musí být adaptované na standardizované podmínky. Odebírá se po předkultivaci ve fázi exponenciálního růstu. V 1 ml se musí vyskytovat 10 000 ± 2 000 řasových buněk. [19] 2.2.2. Validace Pro validaci testu je nutné, aby byly splněny následující podmínky: změna pH by měla být co nejmenší, což lze dosáhnout například kontinuálním promícháváním během zkoušky. Konkrétně se tedy během testu
pH nesmí
změnit o více než 1,5 jednotky. Hustota buněk se v průběhu testu zvýší v kontrole minimálně 67 x za 72 h dle ČSN EN ISO 8692 (2005). OECD umožňuje validaci testu již po šestnáctinásobném znásobení populace. Jestliže kritéria nejsou splněna, prověří se postup zkoušky, případně se použije inokulum z jiných zdrojů, je-li nezbytné. [14], [15]
2.3. Separace kapalné fáze výluhu Po vyluhování vzorku na třepačce, která zajišťuje plynulé převracení vzorkovnic ve stylu „hlava-pata“, se pevné části nechají usadit. Další postupy v oddělování pevné a kapalné fáze zahrnují centrifugaci a filtraci.
15
2.3.1 Filtrace Filtrace je založena na vedení suspenze přes porézní přepážku, která zachytí částice a propustí filtrát. Pro filtraci částic větších než 10-5 m se využívají porézní materiály ve formě filtračního papíru, desky z porézní keramiky apod. Hybnou silou je rozdíl tlaku mezi filtračním koláčem a spodní částí filtrační přepážky. Jestliže vzorek obsahuje suspendované pevné částice mikroskopických rozměrů (menší než 10-5 m) používají se mikroporézní filtrační materiály tzv. membrány. Důležitou roli u membránových procesů mají velikost a tvar pórů membrán, v některých případech je významná smáčivost separovaných částic a membrány. [20] Porézní membrány se na základě původu materiálu dělí na anorganické a organické, dle morfologie pórů na symetrické a asymetrické. [21] Na membrány jsou kladeny následující požadavky: mechanická pevnost, vysoká schopnost selektivity a permeability. [22] Vzhledem k schopnosti membrán separovat částice na základě jejich velikostí rozlišují se na mikrofiltrace (MF), ultrafiltrace (UF) a nanofiltrace (NF). Jednotlivé membrány se od sebe liší velikosti svrchní aktivní vrstvy a její tloušťky. •
MF – oddělení pevných částic velikosti 0,01 µm – 10 µm (např. buňky kvasinek, bakterií).
•
UF – separace makromolekul na základě jejich různých molárních hmotností. Neprochází bílkoviny, tuky, polysacharidy a mikroorganismy. Velikost pórů 1 nm – 100 nm.
•
NF – pracuje na principu reverzní osmózy, s rozdílem že vyžaduje nižší zvýšení tlaku. Porozita < 2 nm. Separace polyvalentních iontů.
Materiály filtrů Membrány je třeba rozlišovat zejména podle materiálu, ze kterého jsou zhotoveny. Jednotlivé materiály ovlivňují chemickou i tepelnou odolnost. V některých případech filtrovaný vzorek obsahuje hrubé částice, které mohou
16
vést k zanesení drahých filtrů. Proto je vhodné odfiltrovat tyto částice levnějším předfiltrem. K tomuto účelu se nejčastěji využívají předfiltry ze skleněných vláken. •
Anorganické membrány se převážně vyrábějí z křemičitanových materiálů.
Filtry
ze
skleněných
vláken
jsou
vyrobeny
z borosilikátového skla bez organických pojiv. Jsou hygroskopické, biologicky zcela inertní a tepelně velmi odolné (až 550 °C). Porozita filtrů je 0,4 – 2,7 µm. Využívají se převážně pro MF, UF. •
Organické membrány se na rozdíl od anorganických vyznačují nižší odolností vůči vysokým teplotám. Nejčastěji se používají membrány ze směsi acetát nitrát celuózy, které se využívají pro sterilní filtraci vodných roztoků a mají široké využití v mikrobiologii. Dále polyvinylfluoridová membrána, která má nejmenší velikost pórů (0,1- 5 µm) s využitím pro sterilní filtraci proteinových roztoků a roztoků obsahujících alkohol. Vynikající chemickou odolnost naopak vykazují teflonové a nylonové membrány.[23]
Pro akvatické zkoušky ekotoxicity se dle platné vyhlášky č 294/2005 Sb. pro oddělení kapalné a pevné fáze vodného výluhu odpadu, který se upraví dle ČSN EN 12457-4, využívají papírové filtry se střední velikosti pórů 5 µm. Dle navrhovaných změn je možné použít vodný výluh, který se připraví podle ČSN EN 12457-2, tzn.že se velikost částic odpadu upraví na méně než 4 mm místo původních 10 mm a vodný výluh se filtruje přes membránové filtry 0,45 µm. [29] [4] 2.3.2. Centrifugace Centrifugace je separační proces, který využívá vystavení vzorku působení odstředivé síly v centrifuze. Principem je pohyb částic v médiu pod vlivem odstředivého pole, jež vzniká otáčením rotoru centrifugy. Na částice tak pů-
17
sobí odstředivá síla, v opačném směru síla odporu prostředí a síla vztlaková. Rychlost sedimentace závisí na velikosti částic, jejich tvaru, hustotě a na vlastnostech prostředí. [24] S využitím vysokých otáček v centrifugách lze výrazně urychlit proces sedimentace výluhu.
2.4. Řasový kmen Dle metodiky ČSN EN ISO 8692:2004 byla využita kultura Desmodesmus subspicatus (dříve Scenedesmus subpicatus), řád Chlorococcales. Desmodesmus subspicatus patří do skupiny planktonních sladkovodních řas. V kultuře se vyskytují jako jednobuněčné a obvykle jednotlivě. Po určité době růstu se objevuje typické sdružování buněk do coenobií po 4 a 8. Coenobia mohou nabývat různých tvarů (válečkovité, vejčité, vřetenovité, protáhlé). [25] Řasy žijí ve vodním prostředí a vyživují se autotrofně. Jejich přítomnost je ovlivněna ročním obdobím a charakterem biotypu. [26]
18
3. Experimentální část V experimentální části byl vytvořen vodný výluh vzorku odpadu. Následně byl centrifugován a filtrován přes čtyři různé membránové filtry velikostí 0,45 µm, 1,2 µm a 5 µm, čímž vznikly 4 dílčí vzorky vzc, vz0,45, vz1,2 a vz5 . Vzniklé vzorky byly testovány pomocí řasového biotestu v koncentracích 50 % a 99 %. Při prvním stanovení byl jako uzávěr Erlenmayerových baněk během kultivace v termoluminostatu použit parafilm. Následné odečty buněk byly hodnoceny v počítací komůrce. Při druhém stanovení byly baňky uzavřeny buničinou a hodnocení opět proběhlo v počítací komůrce. Třetí stanovení bylo provedeno v kultivačních kyvetách na mikrodestičkách. Test byl hodnocen spektrofotometricky.
3.1. Materiál a použité přístroje Pro řasové biotesty byla použita zásobní kultura Desmodesmus subspicatus původem z Botanického ústavu Akademie věd ČR v Třeboni. Veškeré pomůcky které v průběhu zkoušky přicházely do styku s řasovou kulturou (pasteurovi pipety, testovací nádoby, zábrusové kultivační baňky, zátky z buničiny) byly před použitím sterilizovány vypálením v sušárně (170°C, 10min), nebo autoklávováním.
19
Tab. I. Použité přístroje: Přístroj
Výrobce
Typ
analytické váhy
Ohaus (281)
Adventurer AR 3130
předvážky
Kern (281)
PCB 2500-2 Adventurer
sušárna
Memmert
Une 300, 39 l
centrifuga
Hettich
Rotanta 460 R
pH-metr
WTW
Multikině P4
digitální zrcadlovka, objektiv Sigma
Canon
EOS 20D
elektromagnetické míchadlo
Hanna instruments
HI 190 M
kultivátor
Sanyo
MLR 351
UV-VIS Spetofotometr
Bio-tek
PowerWave XS
orbitální třepačka
Heidolph
Unimax 2010
automatické pipety
Nich Iryo
Nichipet ex
mikroskop Ob: 20x Ok: 10x s počítací komůrkou Cyrus II
Lambda Praha
DN 45
laminární flow-box
Kötterman
20
Tab. II. Použité chemikálie Chemikálie dusičnan stříbrný p.a. dusičnan vápenatý tetrahydrát p.a. hydrogenfosforečnan draselný p.a. síran hořečnatý heptahydrát p.a. uhličitan sodný p.a. chlorid železitý p.a. Gaffronův roztok (složení viz Tab.IV.) destilovaná voda
3.1.1. Vzorek a jeho předúprava Vzorkem byl tmavě hnědý čistírenský kal, obsahující kousky dřeva (Obr.I.). Předúprava probíhala dle ČSN EN 14735:2005. Po dobu 24 hodin byl kal sušen v digestoři při teplotě 23 °C. Větší agregáty vzorku byly podrceny. Vzorek byl následně přesítován přes síto s velikostí ok 4 mm . Podsítná frakce představovala jen 85,6 % vzorku. Nadsítná frakce byla znovu rozdrcena ve třecí misce z důvodu zvýšení podílu použitého vzorku a opět přesítována. Nadsítná frakce již nepřesahovala 5% hm. laboratorního vzorku. Podsítná (Obr.II) byla následně homogenizována. Vzorek byl uskladněn v množství 3,7 kg v lednici při teplotě 3 °C ve 2 PE vzorkovnicích o objemu 2 l.
21
Obr.I. Kal před sušením (foto: Ing. Jaroslav Tošner)
Obr.II. Vzorek po přesítování (foto: Ing. Jaroslav Tošner)
22
3.1.2. Živné médium Růstové médium vhodné pro autotrofní organismy bylo připraveno přesným nadávkováním předepsaných solí tak, aby jejich výsledná koncentrace v médiu odpovídala koncentraci v Tab.III.. Byl přidán 0,08 ml roztoku stopových prvků dle Gaffrona Tab.IV. do objemu 1 l média. Po důkladném promíchání a usavení rovnováhy se vzduchem bylo nutné upravit pH na hodnotu 8,1 použitím 1 M HCl. Poté byl skladován ve tmě při 4 °C.
Tab.III. hmotnostní koncentrace živin růstového média koncentrace chemikálie [mg·l-1] NaNO3
467
Ca(NO3)2· 4H2O
59
K2HPO4
31
MgSO4 · 7H2O
25
Na2CO3
21
FeCl3
1
23
Tab.IV. hmotností koncentrace stopových prvků v roztoku dle Gaffrona koncentrace chemikálie [mg ·l-1] H3BO3
3100
MnSO4 · 4H2O
2230
(NH4)6Mo7O24 ·4H2O
88
KBr
119
KI
83
ZnSO4 · 7H2O
287
Cd(NO3)2 ·4H2O
154
CuSO4. ·5H2O
125
NiSO4(NH4)SO4·6H2O
198
Cr(NO3)3·16H2O
37
Al2(SO4)3.K2SO4·24H2O
474
Na2VO4·2H2O
33
Co(NO3)2·H2O
146
V2O4(SO4)3·16H2O
35
24
3.2. Metodika 3.2.1. Stanovení sušiny Procentuálního zastoupení sušiny ve vzorku bylo stanoveno dle kritérií ČSN EN 12880 sušením v sušárně při 105 ± 5 °C. Podíl sušiny je tedy počítán dle vztahu (2). Vysušený analytický vzorek byl vážen s přesností 0,1 mg. Hodnoty navážek jsou uvedeny v Tab V. (viz kapitola 4.). DR =100 ·Mo/ Mw
(2)
Kde je: DR
podíl sušiny [%]
Mo
hmotnost vysušeného analytického vzorku [kg]
Mw
navážka analytického vzorku [kg]
3.2.2. Příprava vodného výluhu Do prachovnice byla navážena vypočítaná hmotnost analytického vzorku. Byl přidán takový objem vyluhovací kapaliny, aby poměr kapalné (l) a pevné fáze (s) při vyluhování odpovídal : l / s = 10 l / kg ± 2 %. [28] množství vyluhovací kapaliny lze určit dle vztahu (3). Jako vyluhovací kapalina bylo použito médium pro kultivaci řas.
L = (10 – Mc /100) · Md
(3)
Kde je: L
objem vyluhovacího média [l]
Mc
vlhkost vzorku [%]
Md
hmotnost vysušeného vzorku [kg]
25
Při laboratorní teplotě byly prachovnice umístěny na třepačku typu „hlavapata“ po dobu 24 h ± 0,5 h při 7,5 otáčkách za minutu. Po uplynutí stanové doby, tj. po 24 hodinách, byly prachovnice sundány a pevné částice se nechaly volně usazovat po dobu 15 minut. Následně bylo odlito 250 ml výluhu a umístěno na centrifugu po dobu 5 minut při 3500 otáčkách a teplotě 20 °C . Na aparatuře pro podtlakovou filtraci byly jímány permeáty výluhu po filtraci na membránách různé porozity (0,45 µm, 1,2 µm a 5µm) – na každé bylo najímáno zhruba 250 ml permeátu. Výsledně byly získány tři roztoky filtrací a jeden centrifugací. 3.2.3. Řasový biotest Předkultivace Čtyři dny před zahájením zkoušky byla započata samotná předkultivace řasové kultury. Do vysterilizované zábrusové 250ml baňky bylo nalito připravené živné médium, které bylo inokulováno malým množstvím buněk řas. Za stálé aerace, kdy byl vzduch přiváděn přes bakteriální filtr, byla baňka ponechána ve skříňovém termoluministantu. Byly nastaveny normované podmínky, a to teplota 23 ± 2 °C s kontinuálním osvětlením 6 000 – 10 000 lux. Řasové inokulum bylo pro test odebráno ve fázi exponenciálního růstu.
Průběh testu Byla zjištěna koncentrace buněk v zásobní kultuře řas (s pomocí počítací komůrky Cyrus II). Následně bylo vypočítáno potřebné množství inokula řas tak, byla počáteční koncentrace 50 000 ks/ml. Pro test byly použity vysterilizované Erlenmayerovy baňky o objemu 25 ml nebo PS mikrodestičky s 24 jamkami, dodávané sterilní pro jedno použití. Dávkované objemy média, výluhu
a
inokula
do
kultivačních
baněk
pro
jednotlivá
stanovení
v Erlenmayerových baňkách jsou uvedeny v Tab.VI. Pro spektrofotometrické stanovení bylo dávkováno 2,5 ml roztoku do kultivačních kyvet (jamek)
26
na mikrodestičkách. Tento roztok byl předem připraven v odměrných baňkách smísením odpovídajících podílů inokula řas, živného média a vzorku výluhu. Byly připraveny tři replikáty pro jednotlivé koncentrace. Stejným způsobem byly připraveny kontroly pouze bez přidaného množství výluhu (koncentrace 0 %). Uzavřené baňky byly umístěny do termoluministantu s podmínkami 23 ± 2 °C, 6 000 – 10 000 lux a při třepání na orbitální třepačce cca 175 otáček za minutu.
Tab.VI. dávkované objemy pro jednotlivé koncentrace koncentrace
0%
50%
99%
inokula řas [ml] 0,25
0,25
0,25
výluh [ml]
0
12,5
24,75
médium [ml]
24,75
12,25
0
3.3. Hodnocení 3.3.1.Stanovení v počítací komůrce Cyrus II Po 24, 48, 72 a 96 hodinách expozice a po důkladném promíchání baněk bylo kapátkem (pasteurovou pipetou) odebráno malé množství vzorku a v mikroskopu byla určena koncentrace řasové suspenze. Do tabulek se zaznamenávaly hodnoty naměřených hustot buněk, případně jiných parametrů, souvisejících se vzorky po dobu jejich měření. Pro zkoušené permeáty jednotlivých koncentrací byly sestaveny růstové křivky jako hodnoty hustoty buněk v závislosti na čase. Inhibiční efekt je možné taky stanovit na základě vztahu (4) [26]: Ii =
Hk − Hi ⋅ 100[%] Hk
(4)
27
Kde je: Ii
Inhibiční efekt v procentech koncentrace i
Hk
Hodnota měřeného znaku (počet buněk) u kontrolního vzorku
Hi
Hodnota měřeného znaku v testovaném vzorku
3.3.2.Spektrofotometrické stanovení Design testu (Obr. III.) a výpočtu inhibice se oproti stanovení v počítací komůrce Cyrus II nezměnil, avšak namísto vyhodnocování koncentrace řasových buněk mikroskopicky byla použita metoda UV/VIS Spektrofotometrie. Pro účely zjištění vhodné vlnové délky pro spektrofotometrické vyhodnocení bylo proměřeno absorpční spektrum řasové suspenze a spektra jednotlivých vzorků (vzc, vz
0,45,vz1,2,
vz5) viz přílohy. Z měření vyplývá, že pro zjiš-
ťování koncentrací řasové suspenze v roztocích vzorku bude vhodná vlnová délka λ = 681 nm, kde absorbance chlorofylu neinterferuje s absorbancí vzorků. Dále byla sestavena kalibrační závislost (viz Graf.I.) absorbance na koncentraci řasové suspenze proměřením roztoků řas o známé koncentraci (viz Tab VII). Vztah byl vyjádřen také matematicky pomocí regresní rovnice na jejímž základu je později přepočítána absorbance na koncentraci řas při samotném testu toxicity. Absorbance vzorků byla měřena pravidelně po 24 hodinách. Byly sestrojeny růstové křivky na základě nárůstu biomasy v jednotlivých koncentracích a kontrolách. Na spektrofotometru bylo nejdříve proměřeno živné médium, které sloužilo jako base-line.
28
Obr.III. Design biotestů
1 0,9
y = 0,069x + 0,040 R² = 0,996
0,8 0,7 0,6 A
0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0
5
10
c [mil. b/ml] Graf.I.: Závislost absorbance na koncentraci řasové biomasy
29
15
Tab.VII: Hodnoty koncentrace řasové suspenze a její absorbance c [mil.b. /ml]
A
0,00
0,032
0,63
0,078
0,66
0,091
0,79
0,098
0,99
0,120
1,25
0,122
1,32
0,148
1,88
0,164
1,98
0,202
2,51
0,211
3,13
0,261
3,76
0,300
4,39
0,340
5,01
0,398
5,64
0,426
6,26
0,480
6,89
0,524
7,52
0,547
8,14
0,591
8,77
0,644
9,40
0,688
10,02
0,732
10,65
0,846
11,28
0,820
11,90
0,884
12,53
0,907
30
4. Výsledky Tab V. Stanovení sušiny vzorku nádoba [g]
vlhký vzorek [g] sušina [g]
sušina [%]
40,788
47,837
46,956
87,5
50,345
56,242
55,362
85,1
53,467
57,962
57,338
86,1
koncentrace buněk [b/µl]
4.1.Stanovení pro vzorky uzavřené parafilmem
Kontrola 0,45 µm 50% 5 µm 50% 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
centrifugace 50% 1,2 µm 50%
0
24
48
72
96
5 µm 50%
50
600
1500
1883
1508
1,2 µm 50%
50
1583
1583
1417
1550
0,45 µm 50%
50
708
1158
1450
958
centrifugace 50%
50
592
2292
1100
1158
Kontrola
50
345
850 čas [h]
825
855
Graf II. Růstové křivky pro vzorky uzavřené parafilmem, koncentrace 50%
31
koncentrace buněk [b/µl]
Kontrola 0,45 µm 99% 5 µm 99% 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
centrifugace 99% 1,2 µm 99%
0
24
48
72
96
5 µm 99%
50
317
317
525
533
1,2 µm 99%
50
225
425
600
863
0,45 µm 99%
50
400
808
925
683
centrifugace 99%
50
117
392
308
217
Kontrola
50
345
850 čas [h]
825
855
Graf III. Růstové křivky pro vzorky uzavřené parafilmem, koncentrace 99%
TabVII. Hodnoty inhibice pro vzorky uzavřené parafilmem vzorek\čas [h] koncenvzorek trace[%] 50 vzc 99 50 vz0,45 99 50 vz1,2 99 50 vz5 99
24
48
72
96
-71% 66% -105% -16% -359% 35% -74% 8%
-170% 54% -36% 5% -86% 50% -76% 63%
-33% 63% -76% -12% -72% 27% -128% 36%
-35% 75% -12% 20% -81% -1% -76% 38%
32
koncentrace buněk [b/µl]
4.2.Stanovení pro vzorky uzavřené buničinou kontrola 0,45 µm 50% 5 µm 50% 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0
centrifugace 50% 1,2 µm 50%
24
48
72
96
kontrola
50
387
2625
4380
7500
centrifugace 50%
50
842
2675
7250
8642
0,45 µm 50%
50
550
1933
4275
6142
1,2 µm 50%
50
2742
2742
3683
9167
5 µm 50%
50
900
2575 čas [h]
4808
8733
Graf IV: Růstové křivky vzorků uzavřených buničinou, koncentrace 50%
33
kontrola
centrifugace 99%
1,2 µm 99%
5 µm 99%
045 µm 99%
koncentrace buněk [b/µl]
8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
0
24
48
72
96
kontrola
50
387
2625
4380
7500
centrifugace 99%
50
558
475
633
442
045 µm 99%
50
575
567
500
575
1,2 µm 99%
50
267
500
600
525
5 µm 99%
50
533
533 čas [h]
867
1117
Graf V.: Růstové křivky vzorků uzavřených buničinou, koncentrace 99%
34
Tab. VIII. Hodnoty inhibice nárůstu řas v průběhu testu pro vzorky uzavřených buničinou vzorek\čas [h] vzorek
24
48
72
96
50
-117%
-2%
-66%
-15%
99
-44%
82%
86%
94%
50
-42%
26%
2%
18%
99
-48%
78%
89%
92%
50
-608%
-4%
16%
-22%
99
31%
81%
86%
93%
50
-132%
2%
-10%
-16%
99
-38%
80%
80%
85%
koncentrace [%]
vzc vz0,45 vz1,2 vz5
Tab. IX. Celkové hodnoty inhibice pro vzorky uzavřené buničinou získané integrační metodou vzorek vzc vz0,45 vz1,2 vz5
koncentrace [%]
inhibice [%]
50
-35
99
88
50
12
99
84
50
-24
99
87
50
-14
99
79
35
4.3.Spektrofotometrické stanovení
Kontrola
centrifugace 50%
0,45 µm 50%
1,2 µm 50%
5 µm 50%
počet buněk [mil b./ml]
14 12 10 8 6 4 2 0
kontrola centrifugace 50% 0,45 µm 50% 1,2 µm 50% 5 µm 50%
0
24
48
72
96
<0,661
0,662
3,417
9,306
11,894
<0,661
1,217
4,553
6,273
4,868
<0,661 <0,661 <0,661
1,465 0,644 1,035
1,706 1,010 1,339 čas [h]
2,763 1,463 2,276
3,099 3,101 3,349
Graf VI: Růstové křivky spektrofotometrického stanovení, 50 % koncentrace
36
Kontrola 0,45 µm 99% 5 µm 99%
centrifugace 99% 1,2 µm 99%
počet buněk [mil b./ml]
14 12 10 8 6 4 2 0 0
24
48
72
96
Kontrola centrifugace 99 % 0,45 µm 99 %
<0,661
<0,661
3,417
9,306
11,894
<0,661
4,003
<0,661
<0,661
<0,661
<0,661
0,961
1,166
2,206
2,449
1,2 µm 99 %
<0,661
<0,661
0,662
0,708
2,167
5 µm 99 %
<0,661
<0,661
0,663
1,276
2,263
čas [t] Graf VII: Růstové křivky spektrofotometrického stanovení, 99 % koncentrace
Tab. X. Hodnoty inhibice nárůstu řas v průběhu testu pro vzorky hodnocené spektrofotometricky vzorek\čas [h] 24 48 koncentrace vzorek [%] 50 * -33% centrifugace 99 * >99% 50 * 50% 0,45 µm 99 * 66% 50 * 70% 1,2 µm 99 * 66% 50 * 61% 5 µm 99 * 81% ∗ Nelze hodnotit kvůli mezím stanovitelnosti
37
72
96
33% >99% 70% 76% 84% 92% 76% 86%
59% >99% 74% 79% 74% 79% 72% 81%
Tab. XI. Hodnoty celkové inhibice nárůstu řas pro vzorky hodnocené spektrofotometricky získané integrační metodou vzorek centrifugace 0,45 µm 1,2 µm 5 µm
koncentrace [%] inhibice [%] 50 29 99 90 50 62 99 78 50 86 99 95 50 76 99 92
38
5. Diskuze Výsledky u vzorků uzavřených parafinem nejsou dále vyhodnocovány, protože neprošly procesem validace. Nedošlo k požadovanému nárůstu řasové kultury v průběhu 72 hodin. Pravděpodobně z důsledku nedostatečného umožnění vstupu CO2, které je pro řasy zdrojem uhlíku. U vzorků uzavřených buničinou o koncentraci 50 % jsou obecně pozorovány jen mírné efekty přítomnosti vzorku na růst řasové kultury, podle shodného průběhu křivek tedy lze usoudit, že přítomnost částic do velikosti 5 µm nemá vliv na průběh a výsledek ekotoxikologického testu ani v případě nezaznamenané toxicity směsi. U centrifugovaného vzorku byly po celou dobu hodnocení pozorovány v počítací komůrce shluky cenobií. Po 96 hodinách i výskyt prvoků. Je tedy evidentní, že ze vzorku nebyly odstraněny mikroorganismy, a je velmi pravděpodobná přítomnost látek, které mají nižší hustotu podobnou vodě, jsou centrifugací neodstranitelné a pravděpodobně způsobují agregaci řasových buněk do cenobií. Pro koncentraci 99 % vykazují všechny vzorky vysokou inhibici. Která je způsobena vysokou koncentrací toxikantu. Vzhledem k míře toxického efektu u filtrů s nejjemnější porozitou (0,45 µm) lze usoudit, že ani inhibice v jiných roztocích není způsobována přítomností částic, ale toxicitou samotného roztoku a v něm obsažených rozpustných látek. U spektrofotometrického stanovení na mikrodestičkách je pozorován inhibiční efekt pro celý expoziční čas vzorku vodného výluhu na jednotlivé koncentrace vzc, vz0,45, vz1,2 a vz5. V počátcích testu byla u některých vzorků naměřena příliš nízká absorbance, kdy po přepočtu z regresní rovnice (Graf I.) byla stanovena hodnota koncentrace pod mezí stanovitelnosti tj 662 b/µl viz Tab X. Rozhodla jsem se proto u vzorků, kde byla počáteční hodnota koncentrace pod mezí stanovitelnosti počítat s mezní hodnotou.
39
U centrifugovaného vzorku jsou pozorované značné výkyvy hodnot inhibice. Domnívám se, že výkyvy jsou způsobené absrobcí částic, které nelze pomocí centrifugace odstranit (drobné plovoucí částice). Centrifugace byla zařazena jako jiná separační metoda pro srovnání. Bylo prokázáno, že je velmi nevhodná pro testy se spektofotometriskou koncovkou, avšak ve specifických případech může být použita, neboť je jedinou metodou separace, která ze vzorku neodstranila živé organismy. Vhodným nastavením podmínek centrifugace by pak bylo možné zjišťovat i vliv bioty přítomné ve vzorku na zkušební organismus. Spektrofotometrické stanovení vykazuje menší rozptyl v rámci paralelních stanovení. Zároveň vykazuje menší kolísání trendu výsledného efektu v průběhu expozice (růst / úhyn), což může být způsobeno nepřesností v průběhu hodnocení počtu řas v počítací komůrce. Spektrofotometrické měření tedy lze považovat za přesnější, ale pouze v případech, kdy si můžeme být jisti homogenitou testovaného roztoku. Za nevýhodu lze považovat i fakt, že spektrofotometricky nelze zaznamenat shlukování buněk do cenobií a případná výskyt jiných organismů v testovacím roztoku. Spektrofotometrická stanovení, na rozdíl od stanovení s počítací komůrkou vykázala vysoké hodnoty inhibice již pro koncentraci 50 %. Příčina není známa a její hledání může být předmětem dalšího výzkumu.
40
6. Závěr Pro vzorek kalu nebyly zaznamenány významně rozdílné výsledky u vzorků získaných přes membrány s různým poloměrem filtrů. Porozita tedy v tomto případě neměla vliv na výsledek testu ekotoxicity. Centrifugace, která byla využita jako zcela odlišný separační proces, se pro účely řasových biotestů ukázala jako nepříliš vhodná. Rozdíly mezi metodami využívající spektrofotometrické stanovení a stanovení s počítací komůrkou mohou být velmi odlišné. Tuto skutečnost je třeba prát v potaz. Veškeré závěry by bylo vhodné potvrdit i s jinými reálnými vzorky odpadů.
41
Informační zdroje: [1] Environmentálně šetrnější nakládání s pevnými odpady a otázky související s kapalnými odpady. Agenda 21. http://www.mzp.cz/osv/edice.nsf/B56F757C1507C286C12570500034BA6 2/$file/21.htm [cit.2012-05-07]. [2] ČSN EN 12457-4. Charakterizace odpadů -Vyluhování Ověřovací zkouška vyluhovatelnosti zrnitých odpadů a kalů Část 4: Jednostupňová vsádková zkouška při poměru kapalné a pevné fáze 10 I/kg pro materiály se zrnitostí menší než 10 mm (bez zmenšení velikosti částic, nebo s ním). 2003. 32 p.
[3] Metodický pokyn odboru odpadů ke stanovení ekotoxicity odpadů, 2007. Ministerstvo životního prostředí České republiky, Odbor odpadů [cit.2012-03-01].
[4] Vosáhlová, S., Sirotková, D., Hofman, J., Kočí, V,Návrh změn hodnocení ekotoxicity odpadů v české legislativě;., Eds.. Acta environmentalica Universitatis Comenianae (Bratislava), 2012
[5] Moriarity, F.,Ecotoxicology:The Study of Pollutants in Ecosystems, 2nd ed., Academic Press, San Diego, 1988.
[6] Cairns, J., Jr., Will the real ecotoxicologist please stand up?,Environ. Toxicol. Chem., 8, 843, 1989.
[7] Newman, M. C.,Fundamentals of Ecotoxicology, Sleeping Bear/Ann Arbor Press, Chelsea, Michigan,1998.4.
42
[8] Weigelt, C., Saare, O., and Schwab, L., Die Schädigung von Fischerei und Fischzueht durch Industrie und Hausabwasser, Archiv für Hygiene, 3, 39, 1885.
[9] Peters, C.; et al. A Marine Bioassay Test Set to Assess Marine Water and Sediment Quality–its Need, the Approach and First Results. Ecotoxicology. 2002, vol. 11, is. 5,p. 379–383. ISSN 0963-9292.
[10] Moreira-Santos, M.; Soares, A.; Ribeiro, R. An in situ bioassay for freshwater environments with the microalga Pseudokirchneriella subcapitata. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2004
[11]
Fletcher, J. S. Plants for toxicity assessment. Philadelphia : ASTM,
1990. Use of algae versus vascular plants to test for chemical toxicity, p. 33– 39. ISBN 0-8031-1397-8.
[12] VŠCHT v Praze, Ústav chemie ochrany prostředí. Obecná pravidla testování [online].[cit.2012-05-07].
[13] Hoffman, D. J.; et al. (eds). Handbook of Ecotoxicology. 2nd ed. Boca Raton : CRC Press, 2003. 1 290 p. ISBN 978-1-56670-546-2.
[14] ČSN EN ISO 8692 (2005): Jakost vod – Zkouška inhibice růstu sladkovodních zelených řas
[15] OECD Guidelines for the Testing of Chemicals Section 2: Effects on Biotic Systems Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test [online];OECD Publishing,[cit.2012-05-07].
[16] Kočí, V. Ekotoxikologie pro chemiky, 1.st ed.; VŠCHT: Praha, 2009.
43
[17] ČSN EN 14735 (2007): Charakterizace odpadů – Příprava vzorků odpadu pro testy ekotoxicity
[18]Hauser,V. Biotest [online];2010.http://www.recetox.muni.cz/sources/pred nasky/marsalek/EB_dalsi_mater/popis_rasy_rostliny_okrehek.pdf
[cit.2012-
05-07].
[19] Rojíčková, R.; et al. Environmental Toxicology and Water Quality.; John Wiley & Sons, Inc., 1998.
[20] Separační a analytické metody v ochraně životního prostředí, Sborník přednášek, Ústav makromolekulární chemie AV ČR 1996, Praha.
[21] Šnita, D. Chemické inženýrství I., 1.st ed.; VŠCHT: Praha, 2006.
[22] Mikulášek, P.: Aplikace tlakových membránových procesů při zpracování odpadních vod, EKO–Ekol. Spol. 6, 1995, č. 2.
[23] Filtrace. laboprag. http://www.laboprag.com/data/katalog/filtrace.pdf (accessed May 01, 2012).
[24] Káš, J.; Kodíček, M.; et al. Laboratorní techniky biochemie, 1st ed.; VŠCHT Praha: Praha, 2006.
[25] Blanck, H.; et al. Species-dependent variation in algal sensitivity to chemical compounds . Ecotoxicology and Environmental Safety [online]. 1984, vol. 8, is. 4 [cit. 2012-05-22].
[26] Špaček, J.: Hlenky, houby, řasy. Vydavatelstvi MU, Brno 1999.
44
[27] Kočí, T.; Rakovnický, T.; Švagr, A. Obecná pravidla testování. Ekotoxikgie,studijnímateriály. http://www.vscht.cz/uchop/ekotoxikologie/studijni\_mate rialy/Ekotox-Labo/CZverze/11\_\%20testovani.pdf [cit. 2012-05-22].
[28] Ambrožová, J.: Aplikovaná a technická hydrobiologie. 2. vydání, Skriptum VŠCHT,Praha, 2001. 226 s., ISBN 80-7080-521-8
[29] ČSN EN 12457-2. Charakterizace odpadů -Vyluhování Ověřovací zkouška vyluhovatelnosti zrnitých odpadů a kalů Část 2: Jednostupňová vsádková zkouška při poměru kapalné a pevné fáze 10 I/kg pro materiály se zrnitostí menší než 4 mm (bez zmenšení velikosti částic, nebo s ním). 2003.
45
Přílohy Příloha č.1. absorpční spektrum suspenze řas
Příloha č.2. absorpční spektrum centrifugovaného podílu výluhu
Příloha č.3. absorpční spektrum podílu výluhu filtrovaného přes filtr s velikostí pórů 0,45 µm
46
Příloha č.4. absorpční spektrum podílu výluhu filtrovaného přes filtr s velikostí pórů 1,2 µm
Příloha č.5. absorpční spektrum podílu výluhu filtrovaného přes filtr s velikostí pórů 5 µm
47