UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2008-2009
IMMUNO-EVASIE VAN HET FELIENE INFECTIEUZE PERITONITIS VIRUS
door
Lowiese DESMARETS
Promotor: Prof. Dr. Hans Nauwynck Medepromotor: Dr. ir. Hannah Dewerchin
Studieproject in het kader van de Masterproef
INHOUDSOPGAVE Samenvatting 1. Inleiding ............................................................................................................................................... 2 1.1. Literatuurstudie ............................................................................................................................. 2 1.1.1. Etiologie en viruseigenschappen ........................................................................................... 2 1.1.2. Epidemiologie ........................................................................................................................ 3 1.1.3. Pathogenese en ontstaan van de letsels .............................................................................. 3 1.1.4. Letsels en symptomen........................................................................................................... 4 1.1.5. Immuniteit en evasie van FIPV-geïnfecteerde cellen aan de humorale immuniteit .............. 4 1.2. Probleem en doelstelling .............................................................................................................. 6 2. Materiaal en methoden ........................................................................................................................ 7 2.1. Verzamelen van weefsels van FIP-katten .................................................................................... 7 2.2. Reagentia ..................................................................................................................................... 7 2.3. Kleuringen .................................................................................................................................... 8 2.3.1. Kleuring van FIPV-geïnfecteerde cellen in coupes ............................................................... 8 2.3.2. Kleuring van kattenantistoffen en FIPV-geïnfecteerde cellen in coupes ............................... 8 2.3.3. Kleuring van p-ERK en FIPV-geïnfecteerde cellen in coupes............................................... 8 2.3.4. Kleuring van kattenantistoffen, FIPV-geïnfecteerde cellen en myosine 1 in coupes ............ 8 2.3.5. Kleuring van kattenantistoffen, FIPV-geïnfecteerde cellen en p-ERK in coupes .................. 9 2.4. Testen van verdunningen van geit anti-kat FITC ......................................................................... 9 2.5. Confocale laser scanning microscopie ......................................................................................... 9 3. Resultaten.......................................................................................................................................... 10 3.1. FIPV-geïnfecteerde cellen komen voor onder de vorm van pyogranuloma’s ............................ 10 3.2. Kattenantistoffen komen voor in FIPV-geïnfecteerde cellen ...................................................... 10 3.3. De N-proteïne lijkt geassocieerd te zijn met p-ERK ................................................................... 11 3.4. Myosine 1 is niet geassocieerd met antistoffen in FIP-weefsels ................................................ 11 3.5. Een colokalisatie tussen p-ERK en antistoffen kon teruggevonden worden in FIP-weefsels .... 12 4. Discussie ........................................................................................................................................... 12 5. Literatuurlijst ...................................................................................................................................... 14
De auteur geeft de toelating deze studie voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotor. Het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren, blijft daarbij gevrijwaard. De auteur en de promotor zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.
SAMENVATTING Feliene infectieuze peritonitis (FIP) is een veelvuldig voorkomende en meestal fataal verlopende virale ziekte, veroorzaakt door het feliene infectieuze peritonitis virus (FIPV), een felien coronavirus (FCoV). Geïnfecteerde monocyten, de FIPV-targetcellen, worden ondanks de hoge anti-FCoV antistoffentiters bij FIP-katten niet geëlimineerd. De virale proteïnen, die in vitro bij vijftig procent van de geïnfecteerde monocyten tot expressie komen op de celmembraan, worden geïnternaliseerd bij binding van antistoffen op deze proteïnen, wat een mogelijke verklaring zou kunnen zijn waarom de hoge antistoffentiters de kat niet kunnen beschermen. Dit internalisatiemechanisme werd in vitro reeds ontrafeld. In deze studie werden een aantal van deze in vitro bevindingen opgespoord in pyogranuloma’s uit aangetaste organen van geëuthanaseerde FIP-katten. Hiervoor werd gebruik gemaakt van primaire en secundaire antistoffen om geïnfecteerde cellen, kattenantistoffen, myosine 1 en p-ERK in coupes van deze weefsels te kunnen kleuren. Een opregulatie van het myosine 1 in de geïnfecteerde cellen kon net zoals in vitro worden aangetoond. De associatie tussen myosine 1 en de kattenantistoffen bleek echter niet aanwezig te zijn in deze weefsels. Aangezien de associatie in vitro slechts
vastgesteld
werd
tot
tien
minuten
na
de
internalisatie,
ligt
de
verklaring
hier
hoogstwaarschijnlijk in het feit dat de cellen in deze weefsels al langere tijd geïnfecteerd waren voordat de katten werden geëuthanaseerd. Een associatie tussen p-ERK en de antistoffen kon wel worden teruggevonden maar was zeker niet overmatig in deze coupes aanwezig. Eenzelfde verklaring als bij myosine 1 kan hier opnieuw naar voren gebracht worden. P-ERK leek in de coupes gecolokaliseerd te zijn met de N-proteïne, maar een associatie kon niet met zekerheid worden aangetoond. Uit deze studie kan besloten worden dat het gebruik van coupes van pyogranuloma’s niet optimaal is om in vivo aanwijzingen te zoeken voor de antistoffengemedieerde internalisatie van virale proteïnen door FIPV-geïnfecteerde monocyten.
1. INLEIDING 1.1. LITERATUURSTUDIE 1.1.1. Etiologie en viruseigenschappen Het feliene enterisch coronavirus (FECV) en het feliene infectieuze peritonitis virus (FIPV) zijn twee virulentievarianten van het feliene coronavirus (FCoV). Deze virussen behoren tot de orde Nidovirales, de familie Coronaviridae, genus Coronavirus (de Groot-Mijnes et al., 2005; Addie en Jarrett, 2006). Feliene infectieuze peritonitis (FIP) is een progressief, fataal verlopende aandoening die voorkomt bij zowel gedomesticeerde als wilde leden van de familie der Felidae en wordt veroorzaakt door het virulente FIPV. Het FECV daarentegen veroorzaakt hoogstens een milde enteritis (Pedersen, 1987; Hartmann, 2005; Addie en Jarrett, 2006). Het FIPV spreidt niet maar ontstaat na mutatie vanuit het FECV. Aangezien de exacte mutatie nog niet gekend is, zijn beide varianten antigenisch en genetisch niet van elkaar te onderscheiden (Vennema et al., 1998; Hartmann, 2005). Coronavirussen zijn sferische partikels met een grootteorde variërend van 60 tot 200 nm, die een positief,
enkelstrengig
RNA-genoom
bevatten
en
omgeven
zijn
door
een
envelop.
Het
coronavirusgenoom is met zijn lengte van 30 kilobasen het langste van alle RNA-virussen. Het FCoVgenoom
M-glycoproteïne S-glycoproteïne E-proteïne
vormt
zeven
verschillende
subgenomische
messenger RNA’s. Het nucleokapsied heeft een helicale symmetrie (Siddell, 1995; Hartmann, 2005; Haijema et al.,
CAP 5’
2007). Het FCoV-virion is samengesteld uit vier belangrijke structurele proteïnen: de nucleokapsied (N-) proteïne, de membraan (M-) glycoproteïne, de peplomeer- of spike (S-)
3’ AAAA
Envelop
glycoproteïne en de envelop (E-) proteïne (de Groot en Horzinek, 1995). De S-glycoproteïne staat in voor de N-proteïne
RNA
Fig. 1: Het feliene coronavirus.
herkenning en binding aan gastheerreceptoren en bepaalt dus het celtropisme. Samen met de M-glycoproteïne
induceert de S-glycoproteïne virusneutraliserende antistoffen (Cavanagh, 1995; Haijema et al., 2007). De M-proteïne speelt een rol in de budding van het virus (Rottier, 1995). De N-proteïne is geassocieerd met het virale genoom (Laude en Masters, 1995). De E-proteïne is een integrale membraanproteïne die helpt bij de vorming van nieuwe viruspartikels (Fischer et al., 1998). Op basis van de antigenische verwantschap met het caniene coronavirus (CCoV) worden FCoVstammen ingedeeld in 2 serotypes (serotype I en serotype II). FCoV serotype II stammen zijn ontstaan na recombinatie tussen FCoV serotype I stammen en CCoV en hebben hierdoor een FCoV-genoom dat het S-gen en aanpalende sequenties van het CCoV bevat. Daarnaast verschillen serotype I en serotype II stammen ook in hun groeikarakteristieken en cytopathogeniciteit in vitro. Zo zijn FCoV serotype I stammen moeilijker te kweken in celculturen en vertonen ze een geringer cytopathogeen effect (Addie et al., 2003; Hartmann, 2005; Addie en Jarrett, 2006). Toch kunnen beide serotypes zowel FIP als een klinisch weinig duidelijke FCoV-infectie veroorzaken. De meeste geïsoleerde FCoVstammen die voorkomen onder veldomstandigheden behoren tot serotype I (Hartmann, 2005).
2
1.1.2. Epidemiologie In vele kattenpopulaties komt FCoV enzoötisch voor (Gaskell en Bennett, 1996). Ongeveer 25 procent van de individueel gehouden katten hebben anti-FCoV antistoffen, terwijl het percentage seropositieve katten in catteries 75 tot 100 procent bedraagt (Pedersen, 1995). FIP wordt echter slechts bij 5 tot 10 procent van de FCoV-seropositieve katten gezien (Gunn-Moore en Addie, 2001; Hartmann, 2005; Addie en Jarrett, 2006). De transmissie van FECV gebeurt ofwel indirect door contact met virushoudende feces of oronasale secreten bij gemeenschappelijk gebruik van kattenbakken en voeder- en drinkbakken, ofwel door direct contact bij likken of vechten (Norsworthy, 1993; Addie en Jarrett, 2006). Belangrijk in de transmissie zijn de aanwezigheid van: 1) virusuitscheiders; 2) gevoelige dieren of m.a.w kittens na het verlies van de maternale immuniteit, naïve katten die in een endemisch besmette omgeving worden geplaatst of katten die reeds geïnfecteerd zijn geweest maar hun immuniteit verloren hebben en 3) slechte hygiënische omstandigheden die de orofecale transmissie bevorderen (Pedersen, 1995). 1.1.3. Pathogenese en ontstaan van de letsels
Orale opname of inhalatie van FECV
Replicatie van FECV in enterocyten (en orofarynx)
Geen mutatie tot FIPV
Mutatie tot FIPV ?
Monocyt-geassocieerde viremie
Geen monocyt-geassocieerde viremie (ongevoelige monocyt?)
Weinig efficiënte virusreplicatie/ efficiënte eliminatie van het virus
Pesisterende viremie/dragers?
Geen ontwikkeling van FIP
Monocyt-geassocieerde viremie
Efficiënte virusreplicatie/ verminderde capaciteit tot eliminatie van het virus
Eerste golf van virusreplicatie met koorts, gewichtsverlies en acute T-cel lymfopenie
Schijnbaar herstel
Herstel?
Tweede golf van virusreplicatie met koorts, gewichtsverlies en verdere afname van T-cellen
Ontwikkeling van FIP: aanhechting van geïnfecteerde monocyten aan het endotheel van venulen, emigratie uit de bloedvaten en periveneuze infiltratie met vrijstelling van vaso-actieve en chemotactische factoren. Dit leidt tot het ontstaan van vasculitis en (pyo)granulomateuze letsels. Fig. 2: Schematische weergave van de pathogenese van FIP en het ontstaan van de letsels.
De pathogenese van FIP is complex en bevat tot op heden nog een groot aantal hiaten, vooral door de nog grotendeels ongekende rol van het immuunsysteem in de ontwikkeling van de ziekte. De
3
mogelijke pathogenese van FIP en het ontstaan van de letsels zijn weergegeven in bovenstaand schema (Gunn-Moore et al., 1998; Meli et al., 2004; de Groot-Mijnes et al., 2005; Dewerchin et al., 2005; Kipar et al., 2005; Kipar et al., 2006; Haijema et al., 2007). 1.1.4. Letsels en symptomen Naargelang de beschadiging aan de bloedvaten door de monocyt-afhankelijke vasculitis al dan niet aanleiding geeft tot exsudaatvorming in de lichaamholtes, onderscheidt men 2 vormen van FIP: de vochtige of exsudatieve vorm en de droge of niet-exsudatieve vorm. De voornaamste letsels die bij FIP-katten kunnen worden vastgesteld, zijn een fibrineuze-granulomateuze serositis, -peritonitis, pleuritis en/of -pericarditis met vorming van eiwitrijk exsudaat in de lichaamsholten; granulomateuzenecrotiserende flebitis en periflebitis en (pyo)granulomateuze ontstekingshaarden in tal van organen (de Groot en Horzinek, 1995; Kipar et al., 2005; Kipar et al., 2006; Haijema et al., 2007). De initiële ziektetekens die optreden bij zowel de vochtige als de droge vorm zijn niet specifiek en bestaan uit een milde fluctuerende koorts die niet reageert op antibiotica, een verminderde eetlust tot anorexie, gewichtsverlies, depressie en lethargie (Pedersen, 1995; Gaskell en Bennett, 1996; Hartmann, 2005). Wijzigingen in het bloedbeeld worden bij beide vormen gezien en bestaan o.a. uit een toename van de totale proteïne- en globulinefractie in het serum, een daling in serumalbumine, leucocytose, neutrofilie, lymfopenie, anemie en een toename van bilirubine, leverenzymes, ureum en creatinine (Pedersen, 1995; Hartmann, 2005). Later optredende symptomen zijn vooral het gevolg van de exsudaatvorming in de verschillende lichaamsholtes (abdominale distensie, dyspnee, tachypnee, gedempte harttonen) of van de aantasting van specifieke organen zoals lever, nieren, longen, darm, omentum, milt, mesenteriale lymfeknopen, ogen en hersenen. Aandoeningen van het oog en het centraal zenuwstelsel worden vaker gezien bij de droge dan bij de vochtige vorm (Pedersen, 1987; Norsworthy, 1993; Gaskell en Bennett, 1996; Gunn-Moore en Addie, 2001; Addie en Jarrett, 2006; Kipar et al., 2006; Haijema et al., 2007). De incubatieperiode kan sterk variëren en kan maanden tot jaren duren. De vochtige vorm verloopt algemeen iets sneller progressief dan de droge vorm. Het is niet uitzonderlijk dat beide vormen samen voorkomen of dat de ene vorm overgaat in de andere (Norsworthy, 1993; Pedersen, 1995). 1.1.5. Immuniteit en evasie van FIPV-geïnfecteerde cellen aan de humorale immuniteit De interactie tussen het immuunsysteem en het FIPV is nog niet volledig opgehelderd. Het is onduidelijk hoe het komt dat slechts enkele FCoV-geïnfecteerde katten FIP ontwikkelen, terwijl andere duidelijk beschermd worden tegen de ontwikkeling van de ziekte (Hartmann, 2005; Addie en Jarrett, 2006). Aangezien katten bij natuurlijke infecties meestal met dezelfde FCoV-stam in contact komen, spelen mogelijk niet-virusgerelateerde factoren een rol. De efficiëntie van de T-cel respons (genetisch bepaald), de gevoeligheid van monocyten (genetisch bepaald en/of afhankelijk
van het
differentiatiestadium) en een onderdrukking van de immuniteit door tal van factoren zijn allemaal elementen die hierbij naar voren worden gebracht (Dewerchin et al., 2005; Haijema et al., 2007). FIPkatten vertonen in het eindstadium een sterke T-cel depletie en hypergammaglobulinemie. Dit beeld wijst op een erge viraalgeïnduceerde ontregeling van het immuunsysteem bij deze katten. Hierdoor is
4
een ongebreidelde replicatie van het virus mogelijk, met fatale afloop tot gevolg (de Groot-Mijnes et al., 2005). Bij de meeste virale infecties gaan antistoffen binden aan virale antigenen op het celoppervlak van geïnfecteerde cellen, waardoor deze cellen herkend en geëlimineerd kunnen worden door tussenkomst van het complementsysteem, fagocyten en NK-cellen (Goodman, 1994). Bij de ontwikkeling van FIP wordt echter vastgesteld dat noch anti-S-, anti-M- als anti-N-antistoffen de kat kunnen beschermen. Integendeel, vaccinatie-experimenten en experimentele infecties met FIPV wezen uit dat anti-FCoV antistoffen eerder het ziekteverloop gingen versnellen dan dat ze de ziekte gingen voorkomen (Cavanagh, 1995; Glansbeek et al., 2002; de Groot-Mijnes et al., 2005; Takano et al., 2007). Een mogelijke verklaring hiervoor werd gezocht in de zogenaamde antibody-dependent enhancement of infectivity of ADEI, die men ziet optreden in vitro. ADEI houdt in dat virusopname en replicatie in monocyten bevorderd wordt doordat viruspartikels geopsoniseerd worden door virusspecifieke antistoffen, die dan met hun Fc-gedeelte kunnen binden op de Fc-receptor van monocyten/macrofagen (Perlman en Dandekar, 2005). Zoals Dewerchin et al. (2006) naar voor brachten, verklaart deze theorie echter niet hoe het komt dat viraal geïnfecteerde cellen niet kunnen herkend en geëlimineerd worden door het imuunsysteem. Bovendien blijkt ADEI bij een natuurlijke infectie een minimale rol te spelen (Addie et al., 1995; Meli et al., 2004; Hartmann, 2005). Er is een alternatieve verklaring voor het falen van de humorale immuunrespons. Cornelissen et al. (2007) zagen dat geen enkele FIPV-positieve cel, afkomstig uit pyogranuloma’s en exsudaat, virale antigenen tot expressie bracht op het celoppervlak, wat dus een verklaring geeft voor het niet kunnen herkennen van deze geïnfecteerde cellen door antistoffen. Na het in cultuur brengen van deze cellen kwamen de virale antigenen slechts bij 50 procent van de monocyten terug tot expressie, waaruit kan aangenomen worden dat de helft van de geïnfecteerde cellen niet in staat is virale proteïnen tot expressie te brengen. Dit retentiefenomeen werd al eerder in vitro aangetoond. Slechts 50 procent van de feliene, FIPV 79-1146- en FECV 79-1683-geïnfecteerde monocyten brachten namelijk virale antigenen (S- en M-glycoproteïnen) tot expressie in de cytoplasmamembraan (Dewerchin et al., 2005). Na toevoegen van FCoV-specifieke antistoffen aan deze cellen werden de virale proteïnen geïnternaliseerd (Dewerchin et al., 2006). Samen met de retentie kan deze internalisatie verklaren waarom er in vivo geen virale antigeenexpressie wordt gezien en de cellen dus onherkenbaar blijven voor het immuunsysteem, waardoor geen antistoffengemedieerde eliminatie van de cellen kan optreden (Dewerchin et al., 2006; Cornelissen et al., 2007). Het door Dewerchin et al. (2008) vooropgestelde model van internalisatie is schematisch weergegeven in figuur 3 en wordt hieronder verder besproken. Reeds voor het toevoegen van antistoffen zijn myosine 1 (myo1) en geactiveerd (en dus gefosforyleerd) p38 (p-p38) geassocieerd met de virale proteïnen die tot expressie komen in de cytoplasmamembraan. Geactiveerd p38 blijkt nodig te zijn om de virale proteïnen op de plasmamembraan te houden, aangezien spontane internalisatie optreedt bij blokkeren van p38. Na toevoegen van antistoffen treedt onmiddellijk internalisatie op, gereguleerd door de serine/threoninekinases myosine light chain kinase (MLCK) en de mitogen-activated protein kinases (MAPKs). De internaliserende vesikels zijn geassocieerd met myo1, p-p38, geactiveerd extracellular signal regulated kinase (p-ERK) en geactiveerd c-Jun N5
terminale kinase (p-JNK). Na 30 seconden tot 1 minuut bevinden de antigeen-antistof complexen zich al in de vroege endosomen, waarbij nu ook myo6 zich associeert met de vesikel. Opdat de internaliserende vesikel zou kunnen passeren, moet het corticale actine netwerk eerst een lokale degradatie ondergaan. Samen met myo1, p-p38 en p-JNK speelt myo6 waarschijnlijk een rol in het overwinnen van dit netwerk. Op het ogenblik dat de vroege endosomen zich vormen, gaat de associatie met p-p38 verloren. De complexen verblijven slechts kort in het vroege endosoom aangezien ze 1 minuut na het toevoegen van antistoffen al in de late endosomen worden gevonden. Deze vesikels worden dan intracellulair getransporteerd over microtubuli. Tijdens dit transport werd een colokalisatie met myo1, p-ERK, p-JNK en actine vastgesteld. Na 10 minuten bevinden deze late endosomen zich ter hoogte van het microtubuli organiserend centrum (MTOC) waarbij p-p38 zich opnieuw met de vesikel associeert en samen met p-ERK voor minstens 60 minuten geassocieerd blijft met de vesikel. Deze vesikels blijken echter niet langer late endosomen te zijn.
Fig. 3: Model voor het antistoffengeïnduceerde internalisatieproces in geïnfecteerde monocyten (uit Dewerchin, 2008). 1.2. PROBLEEM EN DOELSTELLING FIP is een belangrijke infectieuze doodsoorzaak bij katten waarvoor tot op heden nog geen afdoende behandeling voor gevonden kon worden (Hartman, 2005). Hoe het komt dat de meerderheid van deze katten er niet in slaagt het virus onder controle te krijgen, is echter nog grotendeels onopgehelderd. In vitro onderzoek ontrafelde een internalisatiemechanisme van virale proteïnen onder invloed antistoffen in geïnfecteerde monocyten (Dewerchin, 2008). Dit zou kunnen verklaren waarom geïnfecteerde monocyten onherkenbaar blijven voor de humorale tak van het immuunsysteem en deze cellen niet kunnen geëlimineerd worden door fagocyten, NK-cellen of complementgemedieerde lyse. Het blokkeren van de internalisatie zou nieuwe perspectieven kunnen bieden in de behandeling van FIP, aangezien op deze manier het immuunsysteem van de kat een handje kan geholpen worden bij het herkennen en opruimen van de geïnfecteerde cellen.
6
Het doel van deze studie is om in coupes van weefsels van FIP-katten op zoek te gaan naar aanwijzingen dat internalisatie ook in vivo optreedt. Aan de hand van kleuringen met primaire en secundaire antistoffen worden FIPV-geïnfecteerde cellen, kattenantistoffen, myosine 1 en p-ERK opgespoord in coupes van pyogranuloma’s, waarbij nagegaan wordt of er in de geïnfecteerde cellen een associatie kan gevonden worden tussen kattenantistoffen en myosine 1 en tussen kattenantistoffen en p-ERK, zoals dit ook in vitro werd gezien. 2. MATERIAAL EN METHODEN 2.1. VERZAMELEN VAN WEEFSELS VAN FIP-KATTEN Uit aangetaste organen van geëuthanaseerde FIP-katten werden pyogranuloma’s verzameld, in 1 cm methocel gebracht en ingevroren op droog ijs. Van dit stukje bevroren weefsel werden met een cryotoom coupes gemaakt van 6µm dik. 2.2. REAGENTIA In onderstaande tabel wordt een overzicht gegeven van de gebruikte reagentia, hun doel, de verdunning waaraan ze werden gebruikt en de incubatieduur en -temperatuur. Reagens
Doel
Verdunning
Incubatieduur en – temperatuur
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (FGZ)
Wassen; maken van verdunningen
1x in UP
2 maal 5 minuten bij kamertemperatuur (KT)
Fosfaat gebufferde 2+ zoutoplossing met Ca en 2+ + Mg (FGZ )
Maken van verdunningen
1x in UP
Paraformaldehyde
Fixatie
1/25 in FGZ
Triton X-100
Permeabiliseren van de cellen
10 minuten bij KT
1/1000 in FGZ +
Muis anti-N 10A12 antistoffen
Binding op de N-proteïne van FCoV
1/30 in FGZ
Fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-gemerkte geit antimuis antistoffen Negatief geitenserum
Kleuren van primaire muizenantistoffen
1/100 in FGZ
Achtergrondkleuring, die kan ontstaan door aspecifieke bindingen van geitenantistoffen, tot een minimum reduceren Anti-FCoV antistoffen kleuren
1/10 in FGZ
Geit anti-kat FITC
+
5 minuten bij KT 1 uur aan 37°C
+
1 uur aan 37°C
+
30 minuten aan 37°C
1/800 in FGZ
+
1 uur aan 37°C
+
1 uur aan 37°C
Geit anti-muis Texas Red
Kleuren van primaire muizenantistoffen
1/100 in FGZ
Muis anti-myosine 1
Binding op myosine 1
1/2000 in FGZ +
Muis anti-p-ERK
Binding op p-ERK
1/100 in FGZ
Geit anti-muis Alexa Fluor 350
Kleuren van primaire muizenantistoffen
1/50 in FGZ
Anti-muis Zenon reagent Alexa Fluor 594
Merken van muizenantistoffen
Anti-FIPV (serotype 1)
Binding op FIPV 1146
5 µl per µg antistof + 1/500 in FGZ
+
+
45 minuten aan 37°C 1 uur aan 37°C; 45 minuten aan 37°C als Zenon-gemerkt 1 uur aan 37°C 5 minuten merken en 5 minuten blokken bij KT 1 uur aan 37°C
Tabel 1: Overzicht van de gebruikte reagentia.
7
2.3. KLEURINGEN 2.3.1. Kleuring van FIPV-geïnfecteerde cellen in coupes FIPV-geïnfecteerde cellen werden zichtbaar gemaakt met muis anti-N 10A12 en geit anti-muis FITC. De coupes werden geanalyseerd via confocale laser scanning microscopie. 2.3.2. Kleuring van kattenantistoffen en FIPV-geïnfecteerde cellen in coupes De coupes werden geblokkeerd met negatief geitenserum. Kattenantistoffen werden gekleurd door toevoegen van geit anti-kat FITC. FIPV-geïnfecteerde cellen werden zichtbaar gemaakt door muis anti-N 10A12 en geit anti-muis Texas Red. De coupes werden geanalyseerd via confocale laser scanning microscopie. TR
FITC Geit anti-kat FITC
Geit anti-muis Texas Red Muis anti-N 10A12
Kat anti-FCoV antistof N-proteïne
Fig. 4: Schematische weergave van de kleuring van kattenantistoffen en FIPV-geïnfecteerde cellen.
2.3.3. Kleuring van p-ERK en FIPV-geïnfecteerde cellen in coupes De coupes werden geïncubeerd met muis anti-p-ERK (met 10% NGS) en vervolgens met geit antimuis Texas Red. FIPV-geïnfecteerde cellen werden zichtbaar gemaakt met muis anti-N 10A12 en geit anti-muis FITC. TR
FITC
Geit anti-muis Texas Red Geit anti-muis FITC Muis anti-p-ERK Muis anti-N 10A12
p-ERK
N-proteïne
Fig. 5: Schematische weergave van de kleuring van p-ERK en FIPVgeïnfecteerde cellen.
2.3.4. Kleuring van kattenantistoffen, FIPV-geïnfecteerde cellen en myosine 1 in coupes De coupes werden geblokkeerd met negatief geitenserum. Kattenantistoffen werden zichtbaar gemaakt met geit anti-kat FITC. Vervolgens werd er geïncubeerd met muis anti-N 10A12 en geit antimuis Alexa Fluor 350 om de FIPV-geïnfecteerde cellen te kleuren. Myosine 1 werd zichtbaar gemaakt door toevoegen van muis anti-myosine 1 antistoffen, die vooraf gemerkt werden met anti-muis Zenon reagent Alexa Fluor 594. De coupes werden gefixeerd en vervolgens geanalyseerd via confocale laser scanning microscopie.
8
FITC
AF Geit anti-muis Alexa Fluor 350
Geit anti-kat FITC
AF
Muis anti-N 10A12
Kat anti-FCoV antistof
N-proteïne
Muis anti-myo1 gecomplexeerd met Zenon Alexa Fluor 594 Myosine 1
Fig. 6: Schematische weergave van de kleuring van kattenantistoffen, FIPVgeïnfecteerde cellen en myosine 1.
2.3.5. Kleuring van kattenantistoffen, FIPV-geïnfecteerde cellen en p-ERK in coupes De coupes werden geblokkeerd met negatief geitenserum. Kattenantistoffen werden zichtbaar gemaakt met geit anti-kat FITC. Vervolgens werd geïncubeerd met muis anti-N 10A12 en geit antimuis Alexa Fluor 350 om de FIPV-geïnfecteerde cellen te kleuren. P-ERK werd zichtbaar gemaakt door toevoegen van muis anti-p-ERK antistoffen, die vooraf gemerkt werden met anti-muis Zenon reagent Alexa Fluor 594. De coupes werden gefixeerd en vervolgens geanalyseerd via confocale laser scanning microscopie. FITC Geit anti-kat FITC Kat anti-FCoV antistof
AF Geit anti-muis Alexa Fluor 350
AF Muis anti-p-ERK gecomplexeerd met Zenon Alexa Fluor 594
Muis anti-N 10A12 N-proteïne
p-ERK
Fig. 7: Schematische weergave van de kleuring van kattenantistoffen, FIPVgeïnfecteerde cellen en p-ERK.
2.4. TESTEN VAN VERDUNNINGEN VAN GEIT ANTI-KAT FITC Crandell feline kidney cells (CrFK cellen) werden geplant in een 24-well plaat aan 300.000 cellen/ml en in medium (1% penicilline-streptomycine, 1% kanamycine, 1% glutamine, 2% lactalbumine, 5% fetaal kalfserum en minimum essential medium (MEM)) gebracht. Vervolgens werden de cellen geïnoculeerd met 1 ml FIPV 1146, 1/5 verdund in medium, en in de broedstoof gebracht. Na 24 uur werden de cellen 2 maal gewassen met warme MEM en vervolgens gefixeerd met 1% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens werden de cellen gepermeabiliseerd met Triton-X gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. De cellen werden geïncubeerd met anti-FIPV (serotype 1) met 10% negatief geitenserum en werden zichtbaar gemaakt met geit anti-kat FITC waarbij verdunningen van 1/100, 1/200, 1/400 en 1/800 getest werden. 2.5. CONFOCALE LASER SCANNING MICROSCOPIE Een Leica TCS SP2 laser scanning spectraal confocaal systeem verbonden met een DM IRB omgekeerde fluorescentie microscoop (Leica microsystems) werd gebruikt om de gekleurde coupes te onderzoeken. FITC- en Texas Red fluorochromen werden geëxciteerd met Argon en Helium/Neon laserlicht. De beelden werden verwerkt met confocale software van Leica.
9
3. RESULTATEN 3.1. FIPV-GEINFECTEERDE CELLEN KOMEN VOOR ONDER DE VORM VAN PYOGRANULOMA’S Figuur 8 geeft de kleuring weer van FIPV-geïnfecteerde cellen in coupes van de milt van een FIP-kat. De geïnfecteerde cellen werden er georganiseerd als een beginnend pyogranuloom teruggevonden. In dit pyogranuloom is nog geen necrotisch centrum te zien.
Fig. 8: Beginnend pyogranuloom in de milt van een FIP-kat.
3.2. KATTENANTISTOFFEN KOMEN VOOR IN FIPV-GEINFECTEERDE CELLEN Kattenantistoffen (groene fluorescentie) konden worden aangetoond in FIPV-geïnfecteerde cellen (rode fluorescentie). A
B
Fig. 9: Kattenantistoffen (B) komen voor in FIPVgeïnfecteerde cellen (A) in longweefsel van een FIP kat.
Voor de kleuring van de kattenantistoffen werd gebruik gemaakt van de geit anti-kat FITC antistoffen aan een verdunning van 1/100. Onderstaande overlay toont de sterke achtergrondkleuring die met deze verdunning optrad. Bij het testen van de verdunningen van geit anti-kat FITC bleek een verdunning van 1/800 nog voldoende signaal te geven. Deze verdunning werd dan ook verder gebruikt.
10
Fig. 10: De geïnfecteerde cellen in longweefsel van een FIP-kat waren moeilijk terug te vinden door de sterke achtergrondkleuring die optrad bij het gebruik van geit anti-kat FITC antistoffen aan een verdunning van 1/100.
3.3. DE N-PROTEINE LIJKT GEASSOCIEERD TE ZIJN MET P-ERK De confocale laser scanning microscopiebeelden van de kleuring van FIPV-geïnfecteerde cellen (groene fluorescentie) en p-ERK (rode fluorescentie) zijn weergegeven in figuur 11. Hierbij is een duidelijke associatie te zien tussen de N-proteïne en p-ERK (witte pijlen). Bij deze dubbelkleuring werden echter beide primaire muizenantistoffen zichtbaar gemaakt met behulp van geit anti-muis secundaire antistoffen (zie figuur 5), waardoor de associatie zou kunnen te verklaren zijn door de binding van de anti-N secundaire antistoffen op de niet bezette muis anti-p-ERK antistoffen. Om dit te vermijden, werd in de volgende kleuringen gebruik gemaakt van Zenon-gemerkte antistoffen. Bij de drievoudige kleuring van kattenantistoffen, FIPV-geïnfecteerde cellen en p-ERK, waarbij p-ERK gekleurd
werd
met
Zenon-gemerkte
muis
anti-p-ERK
antistoffen,
werd
met
de
fluorescentiemicroscoop hetzelfde patroon gezien in de p-ERK positieve cellen als in de FIPVgeïnfecteerde cellen. De associatie tussen p-ERK en de N-proteïne kon echter niet met zekerheid worden aangetoond, aangezien de confocale microscoop geen laser voor de Alexa Fluor blauwe fluorescentie, waarmee de N-proteïne zichtbaar werd gemaakt, bevat.
Fig. 11: Associatie tussen de N-proteïne (groene fluorescentie) en p-ERK (rode fluorescentie) in geïnfecteerde cellen in longweefsel van een FIP-kat. De plaats van colokalisatie is weergegeven door de witte pijlen. 3.4. MYOSINE 1 IS NIET GEASSOCIEERD MET ANTISTOFFEN IN FIP-WEEFSELS Geïnfecteerde cellen bleken meer myosine 1 te bevatten dan andere cellen, wat kan wijzen op een opregulatie van dit myosine in deze cellen. Een associatie tussen het myosine 1 en de kattenantistoffen kon in deze weefsels echter niet worden aangetoond. 11
Fig. 12: Myosine 1-positieve plaatsen (witte pijlen) vallen niet samen met de antistof-positieve plaatsen (grijze pijlen) in geïnfecteerde cellen in miltweefsel van een FIP-kat.
3.5. EEN COLOKALISATIE TUSSEN P-ERK EN ANTISTOFFEN KON TERUGGEVONDEN WORDEN IN FIP-WEEFSELS In figuur 13 is een overlay weergegeven van de confocale laser scanning microscopiebeelden van de kleuring van kattenantistoffen (groene fluorescentie) en p-ERK (rode fluorescentie) in coupes van een darmlymfeknoop van een FIP-kat. De witte pijl geeft de plaats van colokalisatie tussen de antistoffen en p-ERK weer. De associatie tussen p-ERK en de antistoffen was echter niet overmatig aanwezig.
Fig. 13: Kattenantistoffen (groene fluorescentie) zijn geassocieerd met pERK (rode fluorescentie). De plaats van colokalisatie is weergegeven door de witte pijl.
4. DISCUSSIE Door de nog grotendeels ongekende interactie van het FIPV met het immuunsysteem van de kat, blijken preventie en behandeling van FIP een moeilijke klus om te klaren. In vitro onderzoek bracht aan het licht dat het FIPV-geïnfecteerde cellen er in slagen om via retentie en internalisatie van virale proteïnen aan de antistoffengemedieerde eliminatie te ontsnappen. In deze studie werden aanwijzingen voor de internalisatie in vivo opgespoord door kleuringen uit te voeren op coupes van FIP-weefsels, waarbij FIPV-geïnfecteerde cellen, kattenantistoffen, myosine 1 en p-ERK in beeld werden gebracht. Kattenantistoffen konden in FIPV-geïnfecteerde cellen worden aangetoond, wat erop wijst dat antistoffen geïnternaliseerd worden door de geïnfecteerde monocyten, zoals reeds eerder werd aangetoond (Dewerchin, 2008).
12
De N-proteïne en p-ERK leken in de geïnfecteerde cellen sterk met elkaar geassocieerd te zijn. De associatie is hier slechts enkel te vermoeden. Bij de dubbelkleuring van de N-proteïne en p-ERK werden namelijk beide primaire muizenantistoffen zichtbaar gemaakt met behulp van geit anti-muis secundaire antistoffen, waardoor de colokalisatie zou kunnen verklaard worden door de binding van de geit anti-muis FITC antistoffen (anti-N secundaire antistoffen) op de muis anti-p-ERK antistoffen. Om dit te vermijden werden in de volgende kleuringen Zenon Alexa Fuor 594-gemerkte antistoffen gebruikt, zodat er geen vals positieve kleuringen meer konden optreden. Bij de drievoudige kleuring van FIPV-geïnfecteerde cellen, kattenantistoffen en p-ERK werden de geïnfecteerde cellen gekleurd met muis anti-N 10A12 en geit anti-muis Alexa Fluor 350 en p-ERK met muis anti-p-ERK antistoffen, die vooraf gemerkt werden met anti-muis Zenon reagent Alexa Fluor 594. Ook in deze cellen leken de N-proteïne en p-ERK gecolokaliseerd te zijn. Het vermoeden dat p-ERK en de N-proteïne met elkaar geassocieerd zijn kon echter niet bevestigd worden, aangezien er in de confocale microscoop geen lasers aanwezig zijn om beelden van de Alexa Fluor blauwe fluorescentie, waarmee de N-proteïne gekleurd werd, te maken. Om de associatie met de confocale microscoop te kunnen bevestigen, zou een dubbelkleuring kunnen uitgevoerd worden waarbij p-ERK zichtbaar wordt gemaakt door muis antip-ERK antistoffen en geit anti-muis FITC-gemerkte antistoffen, en de N-proteïne door muis anti-N 10A12, gemerkt met Zenon Alexa Fluor 594. In elk geval is er een sterke opregulatie te zien van pERK in FIPV-geïnfecteerde cellen, aangezien in de drievoudige kleuring de FIPV-geïnfecteerde cellen onder de fluorescentiemicroscoop ook sterk p-ERK positief waren. Wat de opregulatie en een eventuele associatie zou kunnen verklaren is nog onduidelijk. Naast de structurele rol, namelijk het vormen van een ribonucleoproteïnecomplex met het genomisch RNA, is de N-proteïne ook betrokken in de coronavirus RNA synthese (Schelle et al., 2005). Ook p-ERK blijkt een rol te spelen in de coronavirus RNA synthese (Cai et al., 2007). In hoeverre dit ook zo is bij feliene coronavirussen en of p-ERK en de N-proteïne hierbij samenwerken en de associatie hierdoor kan verklaard worden, is nog onduidelijk. Uit dit experiment is gebleken dat het kleuren van de FIPV-geïnfecteerde cellen in weefsels van FIPkatten niet de ideale manier is om internalisatie in vivo op te sporen. In tegenstelling tot de in vitro bevindingen kon hier geen associatie tussen myosine 1 en kattenantistoffen aangetoond worden. Een mogelijke verklaring ligt hier waarschijnlijk in het feit dat de antigeen-antistof complexen in de FIPweefsels al langer geïnternaliseerd zijn dan het tijdstip van associatie dat in vitro werd vastgesteld. De associatie werd namelijk slechts vastgesteld tot 10 minuten na de internalisatie. In vitro werd een verhoogde productie van myosine 1 vastgesteld. Deze opregulatie kon ook hier teruggevonden worden, wat de rol van myosine 1 in een FIPV-infectie bevestigt (Dewerchin, 2008). Een associatie tussen p-ERK en de antistoffen kon slechts op 1 plaats worden aangetoond. Net zoals bij myosine 1 is de verklaring hier hoogstwaarschijnlijk te zoeken in het feit dat deze cellen al gedurende langere tijd geïnfecteerd zijn dan de korte associatietijd zoals die in vitro werd vastgesteld. Een alternatieve manier om de internalisatie in vivo aan te tonen, zou een duidelijker beeld kunnen geven. Naar analogie met het onderzoek van Cornelissen et al. (2007) kunnen bijvoorbeeld cellen uit pyogranuloma’s of exsudaat geïsoleerd worden, opgekweekt worden tot de virale proteïnen tot expressie komen en dan kan de internalisatie bestudeerd worden door de cellen opnieuw in een 13
antistofrijke FIP-omgeving, zoals ascitesvocht, te brengen. De exacte functie van p-ERK in de internalisatie is nog onbekend maar uit in vitro onderzoek bleek p-ERK een negatieve regulator van de internalisatie te zijn (Dewerchin, 2008). In deze studie werd slechts een deel van de immuno-evasiestrategie van het FIPV beschreven, namelijk de ontsnapping van FIPV-geïnfecteerde cellen aan de antistoffengemedieerde eliminatie. FIP-katten vertonen echter ook een sterke T-cel depletie in het bloed en in lymfoïde organen. Aangezien de lymfocyten zelf niet geïnfecteerd worden door het virus, is de oorzaak van die lymfocytendepletie hoogstwaarschijnlijk gelegen in apoptose, geïnduceerd door bepaalde mediatoren die vrijkomen tijdens de infectie van monocyten (Haagmans et al., 1996; de Groot-Mijnes et al., 2005; Perlman en Dandekar, 2005). Er wordt gesuggereerd dat TNF-α een rol speelt in de apoptose van lymfocyten (Takano et al., 2007). Verder onderzoek naar de interactie van het virus met de cellulaire tak van het immuunsysteem zal een beter inzicht in de pathogenese en een mogelijk behandeling moeten verwerven. Algemeen
kan
uit
deze
studie
besloten
worden
dat
het
antistoffengemedieerde
internalisatiemechanisme van virale proteïnen door FIPV-geïnfecteerde monocyten in vivo zeer moeilijk aan te tonen is in coupes van pyogranuloma’s. De meeste cellen in deze weefsels zijn namelijk al gedurende lange tijd geïnfecteerd, waardoor de associatie van p-ERK en myosine 1 met de internaliserende antigeen-antistof complexen al lang verloren is gegaan. In elk geval blijkt uit in vitro onderzoek dat internalisatie van virale proteïnen een belangrijke immuno-evasiestrategie van het virus is. Verder onderzoek naar moleculen die deze internalisatie kunnen verhinderen, zou een belangrijke stap naar een efficiënte behandeling van het virus kunnen zijn.
5. LITERATUURLIJST 1.
Addie D., Jarrett O. (2006). Feline coronavirus infections. In: Greene G.E. (Editor). Infectious diseases of the dog and the cat, edition 3. Sauders Elsevier, Missouri, p. 88-102.
2.
Addie D.D., Schaap I. A. T., Nicolson L., Jarrett O. (2003). Persistence and transmission of natural type I feline coronavirus infection. Journal of General Virology 84, 2735-2744.
3.
Addie D.D., Toth S., Murray G.D., Jarrett O. (1995). Risk of feline infectious peritonitis in cats naturally infected with feline coronavirus. American Journal of Veterinary Research 56, 429-434.
4.
Cai Y., Liu Y., Zhang X. (2007). Suppression of coronavirus replication by inhibition of the MEK signaling pathway. Journal of Virology 81, 446-456.
5.
Cavanagh D. (1995). The coronavirus surface glycoprotein. In: Siddell S.G. (Editor). The Coronaviridae. Plenum Press, New York, p. 73-113.
6.
Cornelissen E., Dewerchin H.L., Van Hamme E., Nauwynck H.J. (2007). Absence of surface expression of feline infectious peritonitis virus (FIPV) antigens on infected cells isolated from cats with FIP. Veterinary Microbiology 121, 131-137.
7.
de Groot R.J., Horzinek M.C. (1995). Feline infectious peritonitis. In: Siddell S.G. (Editor). The Coronaviridae. Plenum Press, New York, p. 293-315.
8.
de Groot-Mijnes J.D.F., Van Dun J.M., Van der Most R.G., de Groot R.J. (2005). Natural history of a recurrent feline coronavirus infection and the role of cellular immunity in survival and disease. Journal of Virology 79, 1036-1044.
9.
Dewerchin H.L. (2008). Characterization of putative immune-evasion mechanisms of feline infectious peritonitis virus. doctoraatsthesis, Universiteit Gent, p. 93-159.
10. Dewerchin H.L., Cornelissen E., Nauwynck H.J. (2005). Replication of feline coronaviruses in peripheral blood monocytes. Archives of Virology 150, 2483-2500.
14
11. Dewerchin H.L., Cornelissen E., Nauwynck H.J. (2006). Feline infectious peritonitis virus-infected monocytes internalize viral membrane-bound proteins upon antibody addition. Journal of General Virology 87, 1685-1690. 12. Fischer F., Stegen C. F., Masters P.S., Samsonoff W.A. (1998). Analysis of constructed E gene mutants of mouse hepatitis virus confirms a pivotal role for E protein in coronavirus assembly. Journal of Virology 72, 7885-7894. 13. Gaskell R.M., Bennett M. (1996). Feline and Canine Infectious Diseases. Blackwell science Ltd, London, p. 38-46. 14. Glansbeek H.L., Haagmans B.L., te Lintelo E.G., Egberink H.F., Duquesne V., Aubert A., Horzinek M.C., Rottier P.J.M. (2002). Adverse effects of feline IL-12 during DNA vaccination against feline infectious peritonitis virus. Journal of General Virology 83, 1-10. 15. Goodman J.W. (1994). The immune response. In: Stites D.P., Terr A.I., Parslow T.G. (Editors). Basic & Clinical Immunology, eight edition. Appleton & Lange, Norwalk, Connecticut, p 40-49. 16. Gunn-Moore D.A., Addie D. (2001). The peritoneal cavity. In: Ramsey I.K., Tennant B.J. (Editors). Manual of Canine and Feline Infectious Diseases. British Small Animal Veterinary Association, Gloucester, p. 151-166. 17. Gunn-Moore D.A., Gruffydd-Jones T.J., Harbour D.A. (1998). Detection of feline coronaviruses by culture and reverse transcriptase-polymerase chain reaction of blood samples from healthy cats and cats with clinical feline infectious peritonitis. Veterinary Microbiology 62, 193-205. 18. Haagmans B.L., Egberink H.F., Horzinek M.C. (1996). Apoptosis and T-cell depletion during feline infectious peritonitis. Journal of Virology 70, 8977-8983. 19. Haijema B.J., Rottier P.J.M., de Groot R.J. (2007). Feline coronaviruses: A tale of two-faced types. In: Thiel V. (Editor). Coronaviruses, molecular and cellular biology. Caister Academic Press, Norfolk, 183203. 20. Hartmann K. (2005). Feline infectious peritonitis. Veterinary Clinics Small Animal Practice 35, 39-79. 21. Kipar A., Baptiste K., Barth A., Reinacher M. (2006). Natural FCoV infection: cats with FIP exhibit significantly higher viral loads than healthy infected cats. Journal of Feline Medicine and Surgery 8, 6972. 22. Kipar A., May H., Menger S., Weber M., Leukert W., Reinacher M. (2005). Morphologic features and development of granulomatous vasculitis in feline infectious peritonitis. Veterinary Pathology 42, 321330. 23. Laude H., Masters P.S. (1995). The coronavirus nucleocapsid protein. In: Siddell S.G. (Editor). The Coronaviridae. Plenum Press, New York, p. 141-163. 24. Meli M., Kipar A., Müller C., Jenal K., Gönczi E., Borel N., Gunn-Moore D., Chalmers S., Lin F., Reinacher M., Lutz H. (2004). High viral loads despite absence of clinical and pathological findings in cats experimentally infected with feline coronavirus (FCoV) type I and in naturally FCoV-infected cats. Journal of Feline Medicine and Surgery 6, 69-81. 25. Norsworthy G.D. (1993). Feline infectious peritonitis. In: Norsworthy G.D. (Editor). Feline practice. J.B. Lippencott Company, Pennsylvania, p. 352-359. 26. Pedersen N.C. (1987). Coronavirus diseases (coronavirus enteritis, feline infectious peritonitis). In: Holzworth J. (Editor). Diseases of the cat, medicine & surgery. W.B. Saunders Company, London, p. 193-214. 27. Pedersen N.C. (1995). An overview of feline enteric coronavirus and infectious peritonitis virus infections. Feline Practice 23, 7-20. 28. Perlman S., Dandekar A.A. (2005). Immunopathogenesis of coronavirus infections: implications for SARS. Nature Reviews Immunology 5, 917-927. 29. Rottier P.J.M. (1995). The coronavirus membrane glycoprotein. In: Siddell S.G. (Editor). The Coronaviridae. Plenum Press, New York, p. 115-139. 30. Schelle B., Karl N., Ludewig B., Siddell S.G., Thiel V. (2005). Selective replication of coronavirus genomes that express nucleocapsid protein. Journal of Virology 79, 6620-6630. 31. Siddell S.G. (1995). The Coronaviridae: an introduction. In: Siddell S.G. (Editor). The Coronaviridae. Plenum Press, New York, p. 1-10. 32. Takano T., Hohdatsu T., Toda A., Tanabe M., Koyama H. (2007). TNF-alpha, produced by feline infectious peritonitis virus (FIPV)-infected macrophages, upregulates expression of type II FIPV receptor feline aminopeptidase N in feline macrophages. Virology 364, 64-72. 33. Vennema H., Poland A., Foley J., Pedersen N.C. (1998). Feline infectious peritonitis viruses arise by mutation from endemic feline enteric coronaviruses. Virology 243, 150-157.
15
DANKWOORD In eerste instantie wil ik graag mijn promotor Prof. Dr. Hans Nauwynck bedanken. U liet me op een aangename manier kennismaken met het wel en wee van de onderzoekswereld. U zette een aantal specialisten in het vak voor me klaar en durfde het aan om mijn onervaren handen in uw labo los te laten. Er valt nog heel veel te leren, maar het smaakt zeker en vast naar meer. Bedankt om mij die kans te bieden! Hannah, hopelijk had je begin van vorig schooljaar niet gehoopt om het wat rustiger aan te doen want ik besef dat ik heel veel van je kostbare tijd in beslag genomen heb. Ik wil jou dan ook uit de grond van mijn hart bedanken voor al de kennis die je met me hebt gedeeld, voor al de tips die je me gegeven hebt en voor al de tijd die je voor me uitgetrokken hebt om mij een beetje wegwijs in het labo te maken. Evelien, Leslie, Ben, Els, Sarah en Lennert, bedankt om me steeds weer verderop te helpen wanneer ik weer eens ergens haperde. Dan zijn er nog mijn ouders. Bedankt om mij de kans en de middelen te geven om te doen wat ik al altijd graag had willen doen, diergeneeskunde studeren. Tom, lieve schat, ik weet dat je me graag ieder vrij moment achter je op de quad ziet zitten. Maar geef toe, die momenten waar ik al vloekend op de steeds weer verspringende figuren achter mijn computer zat, en jij mij vervolgens als redder in nood kwam toegesneld, mochten er best wel zijn. Bedankt om voor me klaar te staan!
